EP4419642A1 - Procédé de production d'alcools par fermentation - Google Patents

Procédé de production d'alcools par fermentation

Info

Publication number
EP4419642A1
EP4419642A1 EP22802527.6A EP22802527A EP4419642A1 EP 4419642 A1 EP4419642 A1 EP 4419642A1 EP 22802527 A EP22802527 A EP 22802527A EP 4419642 A1 EP4419642 A1 EP 4419642A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microorganisms
fermentation
reaction section
support
immobilized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22802527.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Maxime CARRIE
Helene VELLY
Jean-Christophe GABELLE
Mohamed Fadhel BEN CHAABANE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP4419642A1 publication Critical patent/EP4419642A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/12—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing fuels or solvents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of alcohols by continuous fermentation with immobilized cells of a culture medium containing a sugary carbonaceous substrate.
  • Alcohols from fermentation processes e.g. isopropanol and n-butanol are among
  • ABE Acetone - Butanol - Ethanol
  • IBE fermentation carried out by microorganisms belonging to the genus Clostridium, is one of the oldest fermentations to have been industrialized, and has since been widely studied.
  • IBE fermentation Isopropanol - Butanol - Ethanol producing a mixture of isopropanol, butanol and ethanol and also carried out by micro-organisms
  • a continuous process with cells in suspension in a homogeneous reactor can also be envisaged. But the productivity is also quite low and can hardly be increased significantly.
  • a technical problem is the concentration of cells in the fermentation medium, mainly controlled by the dilution rate applied in the process. This cannot be raised to avoid cell washing (“wash out” according to the
  • Patent FR-3 086 670 has thus proposed a process in which at least part of the biomass is fixed in the fermentation reactor. bacteria by adsorption in the form of a biofilm on a porous material based on polymeric foam, of the foam type
  • microorganisms are immobilized in the form of a biofilm on the solid support.
  • This biofilm is composed of a mixture of cells of microorganisms and extracellular polymers. The process of biofilm formation is difficult to control and depends on many factors.
  • butanol which is a compound that inhibits the growth of microorganisms, which leads to having to increase the volume flow rate of entry of the fluid containing the sugars to be fermented (and exit of the fluid containing the fermentation products).
  • the object of the invention is therefore to remedy these drawbacks. Its main purpose is to develop fermentation processes using microorganisms immobilized on supports that are easier to control. It aims in particular to quantify more easily and/or more precisely the evolution of the activity of these microorganisms.
  • the invention firstly relates to a process for the production of alcohol(s), according to which a culture medium containing a sugary carbonaceous substrate is introduced into a reaction section comprising a support on which microorganisms are immobilized, in order to
  • reaction section means at least one bioreactor with all the equipment
  • reaction section 20 allowing fermentation to take place.
  • the reaction section comprises several bioreactors, they can be operated in parallel and/or in series. Some may be in operation while one or more others are in maintenance, in particular to change the immobilization supports, so as not to interrupt production.
  • support means a material, for example of the type described in patent FR-
  • microorganisms on the walls of which the microorganisms can be deposited (and gradually form biofilms), one then speaks of immobilized microorganisms.
  • It is generally a porous material, which can be polymeric in nature, such as a polyurethane-based foam-type foam, or mineral in nature, such as a ceramic-type porous material... It can be in the form of a monobloc, or in the form of several
  • the bioreactors that comprise the reaction section knowing that in the field of fermentation the reaction sections (the bioreactor(s)) operate by being closed, sealed, without entry of an external atmosphere.
  • Micro-organisms are understood to mean organisms capable of converting molecules into other molecules of interest by fermentation. In the following description, we can also
  • micro-organisms are micro-organisms that are considered active with respect to fermentation.
  • the first step consists, in the bioreactor, in placing supports, for example porous such as polymer foams, then in depositing the microorganisms thereon by injecting into the bioreactor a fluid containing microorganisms called a preculture.
  • supports for example porous such as polymer foams
  • a preculture a fluid containing microorganisms called a preculture.
  • bioreactors generally operate under sterile and anoxic conditions: any opening of the reactor, any removal of support in particular, is very complex to achieve in order to maintain these sterile and anoxic conditions, or even impossible, particularly on an industrial scale. .
  • the quantity of living microorganisms is monitored.
  • the invention has thus developed an indirect monitoring of the quantity of immobilized living microorganisms, by coupling:
  • the invention makes it possible to modulate (increase) the incoming/outgoing flow rates in a very precise manner to take into account and counter, as precisely as possible, the formation of inhibitor butanol.
  • Estimation can also make it possible to control production according to criteria other than the formation of inhibiting compounds: it can, for example, make it possible to evaluate the saturation of supports by microorganisms. Indeed, beyond a certain period of time, the support is largely colonized by microorganisms, and clogging phenomena appear: when the support material is in the form of blocks or particles, the
  • the invention thus makes it possible to evaluate the progressive reduction of living microorganisms, therefore the increase in the quantity of dead microorganisms, and thus to help in the decision to change the supports, in whole or in part.
  • the analysis on the liquid phase of the reaction section comprises a measurement of the viability of the microorganisms in suspension in the liquid phase of the reaction section.
  • the viability of the microorganisms in suspension in the liquid phase of the reaction section is measured by flow cytometry on a sample of said phase.
  • FCM Flow cytometry
  • This analysis technique is very interesting in the context of the invention, insofar as, on the one hand, it is capable of targeting the measurement of the quantity of living microorganisms, and on the other hand because it makes it possible to obtain the results quickly, in particular in less than 1 hour (15 or 30 minutes for example).
  • the sample analyzed is taken from the reaction section or from the flow of fermentation broth leaving the reaction section, the samples being preferably taken at a fixed or changing frequency. It is thus possible to choose a higher frequency at the start of production, and lower thereafter.
  • the frequency of sampling and associated measurements can, for example, be of the order of ten
  • the analysis can also be carried out continuously, in line, on the flow of fermentation must leaving the reaction section, and be automated.
  • the analysis of the fermentation gas(es) produced preferably includes a measurement of their flow rate at the outlet of the reaction section. Indeed, in a bioreactor, it is generally
  • the analysis is therefore carried out on the liquid phase of the reaction section to determine the concentration of viable microorganisms in said liquid phase, the analysis is carried out (in particular the flow rate analysis) on the fermentation gases produced to evaluate the concentration of total viable microorganisms in the reaction section, and one deduces
  • Concentration is understood as the amount of cells/microorganisms per ml of reaction volume in the bioreactor.
  • the microorganisms form a gradually growing biofilm on the support, and the growth of said biofilm on the support can be evaluated according to the monitoring of the quantity of living microorganisms immobilized on the support, which can give of the
  • a fermentation must is produced comprising
  • the invention also relates to a system for producing alcohol(s) from a fluid containing a sugary carbonaceous substrate, in order to produce, by fermentation under the action of microorganisms, a wort enriched in alcohol(s) and a /fermentation gases implementing the
  • the invention also relates to a system for producing alcohol(s) from a sugary fluid, in order to produce, by fermentation under the action of micro-organisms, a must enriched in alcohol(s) and one or more fermentation gas, such that said system comprises:
  • reaction section comprising a support, in particular in the form of foam
  • reaction section being provided with an inlet for the sugary fluid and an outlet for the wort,
  • the tracking means include:
  • - calculation means any means of electronic/computer type deducing from cytometry and gas flow measurements the quantity of living microorganisms immobilized on the support.
  • the reaction section according to the invention preferably comprises one or more bioreactors operating under sterile and anoxic conditions.
  • FIG. 1 very schematically represents a bioreactor implementing the invention.
  • FIG. 2 very schematically represents the block diagram of the process according to the invention.
  • FIG. 3 is a graph representing the flow rate of (fermentation) gas as a function of the concentration of living microorganisms (in so-called active cells).
  • Figure 4 is a graph representing the evolution of the concentration of microorganisms
  • FIG. 5 is a graph representing the concentration of living microorganisms (in active cells) estimated as a function of the same concentration measured experimentally.
  • FIG. 6 is a graph representing the variation in concentration of living microorganisms immobilized on a support as a function of time, as deduced according to the method of
  • the invention relates more particularly to fermentations of the IBE or ABE type with immobilized cells, an example of which is described in the aforementioned patent FR-3 086670 to which reference may be made.
  • IBE or ABE continuous immobilized cell fermentation processes are used to produce isopropanol and butanol from renewable resources.
  • the bacteria used in these processes are in fact capable of degrading certain simple sugars in order to form butanol, isopropanol and gas in the form of a
  • the bacteria are immobilized in the form of a biofilm on a solid support.
  • This biofilm is composed of a mixture of cells and extracellular polymers.
  • the process of biofilm formation is difficult to control, and depends on many factors. Indeed, the
  • the active biomass is found both in suspension in the liquid medium and on the solid supports.
  • the control of the total quantity of active cells of the biofilm within the bioreactor is a key parameter to be known in order to control the process in an optimal manner.
  • viable immobilized cells produce butanol, a compound that inhibits bacterial growth. Therefore, the inlet and outlet volume flow
  • 25 output of the process must be increased as the growth of the biofilm within the supports, in the following examples based on polyurethane foams.
  • the implementation of the invention described below is therefore a method of online gas flow measurements coupled with measurements of the concentration of active cells in suspension by flow cytometry, in order to estimate the quantity of active cells immobilized on the solid support (biofilm).
  • the present invention thus makes it possible to estimate the development of the biofilm during fermentation launches, without however taking solid supports, which represents an advantage for the management of the start-up of this process.
  • the invention can be implemented during a continuous IBE or ABE fermentation with immobilized cells.
  • the cells are adsorbed on a porous support, preferably polyurethane foams.
  • the cells multiply within this porous support as the fermentation continues.
  • FIG. 1 represents in a very simplified way a bioreactor 1 able to implement the invention. It does not detail all conventional bioreactor equipment, and is not necessarily to scale.
  • Bioreactor 1 delimits an interior volume substantially in the form of a vertical cylinder, breaking down into a lower volume V1 filled with a liquid phase and an upper volume V2, which is the gas overhead of the reactor.
  • the bioreactor 1
  • the 20 comprises an inlet fed by a flow of fluid containing the sugary carbonaceous substrate_2, and an outlet 3 from which the fermentation must 3 enriched in alcohols is extracted.
  • the volume V1 is provided with support(s) made of polyurethane foam 4.
  • the bioreactor 1 is provided with means 5 for stirring the liquid phase, with an outlet 5 making it possible to take samples of the liquid phase in order to carry out on it flow cytometry analyses, and an output 6 in the volume
  • the method of the invention can be synthesized in the form of a block diagram shown in Figure 2.
  • step A the flow of gas (fermentative) leaving the gas headspace V2 is measured (outlet 6, provided with
  • a gas flow meter or volumetric meter is used, giving a gas volume flow value of an H2/CO2 mixture.
  • the flow rates measured can vary between 0 and 5 L.Lreactor 1 .h -1 but are preferably between 0.5 and 3 L.Lreactor 1 .h -1 ,
  • step B an estimate of the total active cells (suspended in the liquid phase and immobilized on supports 4 in volume V1) is deduced therefrom, as detailed below
  • step C the viability of the cells in suspension in the liquid phase V1 is analyzed by
  • step E from the results of steps C and D an estimate of the concentration of active cells immobilized on the supports 4 is deduced
  • stage E the results of stage E are used to carry out the fermentation process (choice of the flow rates entering 2 and leaving 3 in particular).
  • This process is iterative, at a given frequency which may change during the fermentation process.
  • sugary carbon flux The type of sugary carbon flux, the type of microorganism and the type of support that can be used are described below.
  • the fluid containing the sugary carbonaceous substrate comprises an aqueous solution of sugars derived from C5 and/or C6 lignocellulose, and/or sugars derived from sacchariferous plants (for example glucose, fructose and sucrose). ), and/or sugars derived from starchy plants (for example dextrins, maltose and other oligomers, or even starch).
  • the renewable source is of the lignocellulosic biomass type which may in particular include ligneous substrates (for example hardwood and softwood), agricultural by-products (for example straw) or those of industries generating lignocellulosic waste ( from food industries, paper mills).
  • the source is of the lignocellulosic biomass type which may in particular include ligneous substrates (for example hardwood and softwood), agricultural by-products (for example straw) or those of industries generating lignocellulosic waste ( from food industries, paper mills).
  • the aqueous solution of C5 and/or C6 sugars can also come from a mixture of different renewable sources. According to one operating mode, this solution is sterilized for 20 minutes at 120°C.
  • the bacterial biomass is mainly adsorbed in the form of a biofilm on a solid support.
  • the bacteria are strains belonging to the species Clostridium beijerinckii and/or Clostridium acetobutylicum.
  • the bacteria used in the process can be genetically modified strains or not and naturally producing
  • Clostridium beijerinckii DSM 6423 is Clostridium beijerinckii DSM 6423.
  • polyurethane foam is suitable for being immobilized by immersion in a reactor.
  • a foam based on ceramic material(s) can be used.
  • the polyurethane foam has:
  • volumetric cavities (Le., pores or cells) whose equivalent sphere diameter is between 0.1 and 5 mm, preferably between 0.25 mm and 1.1 mm, preferably between 0.55 and 0. .99mm, and/or
  • an apparent density (Le., mass on apparent volume) measured in the air comprised between 10 and 90 g/L, preferably between 10 and 80 g/L, preferably between 15 and 45 g/L, such as between 20 and 45 g/L or between 25 and 45 g/L.
  • Figure 3 is a graph which represents the abscissa the concentration of active cells in cells. mL -1 , and on the ordinate the flow of gas leaving the bioreactor in Lh -1 .
  • the spores are activated by a thermal shock at 100° C. for one minute, and an inoculation of the medium at 2% is carried out.
  • the preculture is then incubated at 34° C., anaerobically and with stirring at 100 rpm for 24 h.
  • a second preculture in GAPES medium is then carried out before the final inoculation of the fermenter.
  • An inoculation of the GAPES medium is this time carried out at 10% then the preculture incubated at 34° C., anaerobically and with stirring at 100 rpm for 24 h.
  • the fermentation in the reactor is carried out with previously reduced GARES medium and with a 10% inoculation.
  • the culture conditions used are: temperature at 34°C, stirring at 200 rpm, without nitrogen bubbling and without pH regulation.
  • the measurement protocol is as follows:
  • Chemchrome V8 marketed by Biomérieux cFDA: carboxyfluorescein diacetate: 0.217 ⁇ M in acetone - store at -20°C
  • Figure 3 is a graph representing the gas flow (of fermentation) as measured, expressed in Lh -1 , as a function of the concentration of living microorganisms (in so-called active cells), expressed in number of viable cells per ml of volume V1 (useful volume) of bioreactor. This figure demonstrates that a linear relationship between gas flow and concentration of active cells measured by flow cytometry is obtained. The latter thus allows
  • the value of the parameter q G indeed corresponds to the directing coefficient of the regression line: 5.54.10 -10 ⁇ 3.5.10 -11 L.cells -1 .h -1 . Assuming that the cell specific productivity q G is constant over time, this same relationship can then be
  • FIG. 20 - Figure 4 is a graph representing on the abscissa the time expressed in hours, and on the ordinate the concentration of active cells during an IBE fermentation at 34° C. with free cells expressed in active cells. mL -1 .
  • FIG. 5 is a graph representing on the abscissa the concentration of active cells estimated during an IBE fermentation at 34°C with free cells expressed in cells
  • the solid lines represent the estimate of the concentration of active cells over time from the measured gas flow.
  • the advantage of this invention is that it makes it possible to operate the dilution rate of the fermentation, so that the concentration of immobilized active cells is maximal, without invasive sampling in the bioreactor during production.
  • the method developed in the context of the present invention thus makes it possible to limit the biases caused by the sampling of solid supports during the study of the growth kinetics of Clostridium (C. beijerinckii or
  • This method can be extrapolated/applied in a similar way to other types of fermentations with immobilized cells, as long as only one type of bacterial strain is used, and that the bacterial strains used have a specific productivity.
  • the system described is made up of the bioreactor 1 with a working volume of 0.35 L.
  • the plate of this bioreactor is equipped with an inlet for the supply of substrate 2, a plunger for the samples, the liquid outlet is ensured by an overflow system.
  • the polyurethane foams 4 are placed in the bioreactor 1 so as to have 0.24 L of foam per liter of bioreactor.
  • the system is sterilized under vacuum at 120° C. for 20 min. A volume of 0.315 L of sterile carbonaceous substrate (GAPES medium) and anoxic is introduced into the
  • the feed tank (not shown in Figure 1) containing sterile carbonaceous substrate (GAPES medium) is connected to bioreactor 1.
  • GPES medium sterile carbonaceous substrate
  • Fermentation is carried out by the strain Clostridium beijerinckii DSM6423.
  • the inoculation is carried out using 0.035 L of preculture of this strain previously incubated for 24 hours at 34°C and under anoxic conditions.
  • the flow rate normalized by the useful volume of the bioreactor 1 is called the dilution rate. As shown in Figure 1, the latter is increased as the assay progresses so as not to accumulate inhibitory butanol concentrations as the biofilm grows.
  • the flow of gas produced by the strain used is measured using a volumetric meter.
  • FIG. 6 represents on the abscissa the time expressed in hours, and on the ordinate, along the left vertical axis the concentration of living microorganisms per ml of reaction volume of the bioreactor, and along the right vertical axis the flow rate in litre/ hour of the flows entering 2 and leaving 3 (identical) of the bioreactor.
  • the diamonds represent the living micro-organisms in suspension/ml of volume V1 of the
  • the solid curve represents the fermentation gas flow measurement
  • the dotted curve shows the change in the dilution rate in h -1 as defined above.
  • the measured gas volume flow rate can be used to estimate the total concentration of active cells in the fermentation medium.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l'action desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et tel qu'on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.

Description

Procédé de production d’alcools par fermentation
Domaine technique
La présente invention concerne un procédé de production d’alcools par fermentation continue à cellules immobilisées d’un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré.
5 Technique antérieure
Afin de répondre aux enjeux de la transition énergétique, de nombreuses recherches sont menées pour développer des procédés dits « verts », permettant d’accéder à des intermédiaires chimiques d’une façon alternative au raffinage du pétrole et/ou à la pétrochimie.
Les alcools issus de procédés fermentaires (par exemple isopropanol et n-butanol) sont parmi
10 les substituts de dérivés pétrochimiques les plus prometteurs. La fermentation ABE (Acétone - Butanol - Ethanol), réalisée par des microorganismes appartenant au genre Clostridium, est une des plus anciennes fermentations à avoir été industrialisée, et a été depuis largement étudiée. Plus récemment, la fermentation IBE (Isopropanol - Butanol - Ethanol) produisant un mélange d’isopropanol, butanol et éthanol et réalisée également par des micro-organismes
15 solvantogènes, appartenant notamment au genre Clostridium, a fait l’objet de nombreuses études.
Concernant le mode de conduite fermentaire employé dans ce type de procédé, la production en mode discontinu (« batch » selon la terminologie anglo-saxonne) reste la méthode conventionnelle pour les fermentations ABE et IBE, malgré la faible productivité affichée pour
20 ce type de procédé, dans l’intervalle 0,1-0, 7 g/L.h (voir, par exemple, Jones D. T., Woods D.R., 1986, Acetone- Butanol Fermentation Revisited. Microbiol. Rew., 50 (4), 484-524 ou Tableau 16.6 Lopez-contreras A. et al chapter book 16, Bioalcohol Production: Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass, 2010). Mais ces productivités restent trop faibles pour envisager un procédé industriel économiquement viable.
25 Un procédé continu avec des cellules en suspension dans un réacteur homogène peut également être envisagé. Mais la productivité est également assez faible et peut difficilement être augmentée de façon significative. Un problème technique est la concentration des cellules dans le milieu fermentaire, principalement contrôlée par le taux de dilution appliqué dans le procédé. Celui-ci ne peut pas être élevé pour éviter le lavage cellulaire (« wash out » selon la
30 terminologie anglo-saxonne) dans le bioréacteur.
Pour ces raisons, depuis quelques années, un fort intérêt est porté aux méthodes visant une forte rétention de la biomasse microbienne, notamment par immobilisation des micro- organisxes dans le bioréacteur. L’utilisation du procédé en continu et à cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité volumique en alcool, puisque le temps de séjour des micro-organismes, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en micro-organismes est plus
5 élevée dans le bioréacteur.
La présente invention s’intéressera donc plus particulièrement à la technique d’immobilisation des cellules : Il a ainsi été proposé dans le brevet FR-3 086 670 un procédé où l’on vient fixer dans le réacteur fermentaire au moins une partie de la biomasse bactérienne par adsorption sous forme de biofilm sur un matériau poreux à base de mousse polymérique, de type mousse
10 de polyuréthane. Ce matériau s’est révélé particulièrement performant, en permettant un procédé fermentaire en continu, la mousse permettant de fixer les bactéries de façon suffisamment importante, c’est-à-dire au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire. Ce matériau ouvre une nouvelle voie pour la production de mélanges de type IBEA, en donnant aussi accès à une production en mode continu par immobilisation de la biomasse bactérienne.
15 Il est utile, pour la conduite du procédé de fermentation, d’évaluer l’efficacité des microorganismes immobilisés sur des supports dans le réacteur de fermentation. En effet, les microorganismes sont immobilisés sous forme d’un biofilm sur le support solide. Ce biofilm est composé d’un mélange de cellules de micro-organismes et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est peu contrôlable et dépend de nombreux facteurs. En
20 effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, notamment, peuvent influencer son développement. La part de cellules viables et donc productrices de métabolites au sein de cette structure peut également largement varier en fonction de l’âge du biofilm étudié ainsi que des conditions opératoires du procédé. En outre, les micro-organismes immobilisés tendent à
25 produire du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes, ce qui conduit à devoir augmenter le débit volumique d’entrée du fluide contenant les sucres à fermenter (et de sortie du fluide contenant les produits de fermentation).
Pour toutes ces raisons, il s’est avéré que le contrôle de la quantité totale de micro-organismes vivants du biofilm qui se dépose sur les supports dans le bioréacteur est un paramètre-clé pour
30 piloter de façon optimale le procédé de fermentation. Or, il est difficile de procéder à son suivi. En effet, il est délicat d’envisager des prélèvements des supports hors du bioréacteur, car le bioréacteur fonctionne généralement avec des conditions drastiques de stérilité et d’anoxie, qui seraient fortement perturbées par l’ouverture régulière du bioréacteur pour procéder à ces prélèvements. De plus, il est complexe d’avoir un échantillon représentatif à partir duquel on
35 pourrait quantifier la concentration totale en cellules viables. Enfin les méthodes d’extractions prennent du temps et peuvent introduire un biais important sur la mesure. Par ailleurs, des études se sont intéressées à des moyens pour estimer la vitesse de croissance des biofilms, notamment par voie électro-chimique, comme décrit notamment dans la demande de brevet EP- 3 035 052, sans pour autant parvenir à estimer la proportion de micro-organismes vivants dans ces biofilms. Et la mise en œuvre de ces solutions est
5 complexe dans une installation à l’échelle industrielle.
L’invention a alors pour but de remédier à ces inconvénients. Elle a notamment pour but la mise au point de procédés de fermentation utilisant des micro-organismes immobilisés sur des supports qui soient plus faciles à piloter. Elle a notamment pour but de quantifier plus facilement et/ou plus précisément l’évolution de l’activité de ces micro-organismes
10 immobilisés.
Résumé de l’invention
L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré dans une section réactionnelle comprenant un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin
15 de produire par fermentation sous l’action desdits micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation (CO2/H2), tel que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et tel qu’on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de microorganismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports.
On comprend par « section réactionnelle » au moins un bioréacteur avec tous les équipements
20 permettant d’opérer une fermentation. Si la section réactionnelle comprend plusieurs bioréacteurs, ils peuvent être opérés en parallèle et/ou en série. Certains peuvent être en fonctionnement pendant que un/plusieurs autres sont en maintenance, notamment pour changer les supports d’immobilisation, afin de ne pas interrompre la production.
On entend par « support » un matériau, par exemple du type de celui décrit dans le brevet FR-
25 3 086 670 précité, sur les parois duquel les micro-organismes peuvent se déposer (et former progressivement des biofilms), on parle alors de micro-organismes immobilisés. C’est généralement un matériau poreux, qui peut être de nature polymérique, comme une mousse de type mousse à base de polyuréthane, ou de nature minéral, comme un matériau poreux de type céramique ... Il peut se présenter sous forme d’un monobloc, ou sous forme de plusieurs
30 blocs, agencés de manière ordonnée (en couches superposées par exemple)ou désordonnée (en vrac) dans le volume de la section réactionnelle où s’opère la fermentation. Ces blocs peuvent être de forme géométrique régulière et de mêmes taille (des cubes par exemple), ou être de forme irrégulière et/ou de tailles différentes. On comprend par « sans intervention sur lesdits supports » le fait que l’invention n’opère pas de manipulation sur les supports, notamment qu’elle s’abstient de faire des prélèvements de support hors de la section réactionnelle, notamment en vue de les analyser. Cela signifie que la mise en œuvre de l’invention se fait sans ouvrir la section réactionnelle, sans ouvrir le ou
5 les bioréacteurs que comporte la section réactionnelle, sachant que dans le domaine de la fermentation les sections réactionnelles (le ou les bioréacteurs) fonctionnent en étant fermées, étanches, sans entrée d’atmosphère extérieure.
On comprend par «micro-organismes » des organismes aptes à convertir des molécules en d’autres molécules d’intérêt par fermentation. Dans la description qui suit, on pourra aussi les
10 désigner sous forme de « cellules » ou encore de « bactéries ».
Le terme « vivant » a la même signification, dans le présent texte, que « viable » au sujet des micro-organismes : il s’agit des micro-organismes qu’on considère actifs vis-à-vis de la fermentation.
Le terme « en suspension » a la même signification que le terme « libres » et désigne des
15 cellules qui sont en suspension dans la phase liquide, par opposition aux cellules immobilisées sur substrat.
On a ainsi choisi selon l’invention de piloter la production d’alcool(s) en fonction des microorganismes vivants sur support, ce qui est la façon la plus fiable de le faire, tout particulièrement au démarrage de la production. En effet, quand on démarre la production, la
20 première étape consiste, dans le bioréacteur, à disposer des supports, par exemple poreux comme des mousses de polymère, puis à y déposer les micro-organismes en injectant dans le bioréacteur un fluide contenant des micro-organismes appelé préculture. Ces microorganismes viennent progressivement, pour partie, coloniser les supports en créant des biofilms, qui sont un mélange de micro-organismes et de polymères extra-cellulaires. Une
25 autre part des micro-organismes va rester en phase liquide dans le bioréacteur. La croissance des biofilms est difficile à contrôler, et plus encore la part de micro-organismes vivants qu’ils contiennent.
Les micro-organismes à la fois en suspension et immobilisés sont actifs vis-à-vis de la conversion des sucres en alcools, cependant les micro-organismes en suspension sont
30 susceptibles d’être lessivés (c’est-à-dire soutirés avec les alcools lors de leur extraction du bioréacteur). Et il s’avère que les micro-organismes immobilisés qui sont vivants produisent, eux aussi, du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes.
Concrètement, au fur et à mesure de la croissance du biofilm rendant compte de l’augmentation de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, on doit faire évoluer les paramètres du procédé, et on vient généralement augmenter le débit d’entrée des réactifs dans le réacteur (celui du fluide contenant les sucres à convertir), ainsi que le débit de sortie des produits de réaction depuis le réacteur (celui du fluide contenant les alcools obtenus par la fermentation des sucres). On choisit ainsi, pour piloter le procédé, et donc, notamment faire
5 évoluer ces débits d’entrée/sortie, d’évaluer la quantité de micro-organismes vivants immobilisés. Mais ce qui est le cœur de l’invention, c’est que ce suivi se fait sans intervention sur les supports, c’est-à-dire, concrètement, sans avoir à ouvrir le bioréacteur pour faire des manipulations ou des traitements, notamment sans prélever des portions de support. Or c’est extrêmement avantageux de faire cette évaluation sans ouvrir le bioréacteur ni perturber son
10 fonctionnement. En effet, ces bioréacteurs fonctionnent en général en conditions stériles et anoxiques : toute ouverture du réacteur, tout prélèvement de support notamment, est très complexe à réaliser pour parvenir à maintenir ces conditions stériles et anoxiques, voire impossibles, tout particulièrement à l’échelle industrielle.
Pour ce faire, selon l’invention, on opère le suivi de la quantité de micro-organismes vivants
15 immobilisés sur le support à partir d’analyses réalisées à la fois sur la phase liquide de la section réactionnelle et sur le/les gaz de fermentation produits.
L’invention a ainsi développé un suivi indirect de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, en couplant :
- des mesures sur la phase liquide (qui, elle, peut être facilement prélevée depuis le
20 bioréacteur, voire en ligne), qui vont permettre de déterminer la quantité de micro-organismes vivants en suspension dans le réacteur,
- et des mesures sur les gaz fermentaires (qui peuvent également être facilement prélevés depuis le réacteur), qui vont permettre d’estimer la quantité totale de micro-organismes vivants, c’est-à-dire la somme des micro-organismes vivants (actifs) en suspension et
25 immobilisés. Avec ce couplage de données, on peut alors en déduire une estimation de la quantité des micro-organismes vivants immobilisés, et ceci sans toucher au support, sans ouvrir le bioréacteur, sans modifier/perturber le fonctionnement du bioréacteur. Avec cette estimation, l’invention permet de moduler (augmenter) les débits entrants/sortants de façon très précise pour tenir compte et contrer, au plus juste, la formation de butanol inhibiteur. Cette
30 estimation peut aussi permettre de piloter la production selon d’autres critères que la formation de composés inhibiteurs : elle peut permettre par exemple d’évaluer la saturation des supports par les micro-organismes. En effet, au-delà d’une certaine période de temps, le support se trouve largement colonisé par les micro-organismes, et des phénomènes de bouchage apparaissent : quand le matériau support se présente sous forme de blocs ou de particules, le
35 bouchage peut être observé entre les particules/blocs et/ou au sein même des particules/blocs quand leur matériau est poreux, ce qui fait alors chuter la production. En outre, il faut prendre en compte la mortalité des cellules dans le biofilm, la saturation observée étant donc la conjonction de phénomènes de bouchage croissants et de la mort croissante des bactéries au cours du temps. L’invention permet ainsi d’évaluer la diminution progressive de microorganismes vivants, donc l’augmentation de la quantité de micro-organismes morts, et ainsi aider à la décision de changer les supports, en tout ou partie.
5 De préférence, l’analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle comprend une mesure de viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
Avantageusement, on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase
10 liquide.
La cytométrie en flux (CM F) est une technologie permettant l'analyse individuelle de cellules. Les cellules sont alignées selon le principe du centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser. Les phénomènes optiques engendrés permettent une analyse des caractéristiques physiques (taille, structure) des cellules ou biologiques après incubation avec
15 des réactifs le plus souvent.
Cette technique d’analyse est très intéressante dans le cadre de l’invention, dans la mesure où, d’une part, elle est capable de cibler la mesure de la quantité des micro-organismes vivants, et d’autre part parce qu’elle permet d’obtenir rapidement les résultats, notamment en moins de 1 heure (15 ou 30 minutes par exemple).
20 De préférence, l’échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle ou dans le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive. On peut ainsi choisir une fréquence plus élevée au démarrage de la production, et moins élevée par la suite. La fréquence des prélèvements et des mesures associées peut par exemple être de l’ordre de la dizaine de
25 minutes, de l’heure ou de la journée selon l’avancement de la campagne de production. L’analyse peut aussi être réalisée en continu, en ligne, sur le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, et être automatisée.
L’analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend de préférence une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle. En effet, dans un bioréacteur, il est généralement
30 prévu en partie haute, au niveau du ciel gazeux, une sortie équipée d’une vanne qui permet facilement de récupérer un échantillon ou de mesurer le débit sortant de gaz, sachant que la fermentation produit des gaz, généralement un mélange d’hydrogène et de gaz carbonique H2/CO2 . Evaluer la quantité produite de gaz de fermentation permet d’estimer la quantité de micro-organismes vivants totale dans le bioréacteur (en suspension et immobilisées). Selon l’invention, on opère donc l’analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle pour déterminer la concentration en micro-organismes viables de ladite phase liquide, on opère l’analyse (notamment l’analyse de débit) sur le/les gaz de fermentation produits pour évaluer la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et on déduit
5 de ces analyses une évaluation de la concentration des micro-organismes viables immobilisés sur le support. On comprend la concentration comme la quantité de cellules /micro-organismes par ml de volume réactionnel dans le bioréacteur.
On va ainsi pouvoir, selon l’invention, moduler le débit entrant de flux sucré dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût depuis la section réactionnelle en fonction du suivi
10 de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui revient en fait à moduler le taux de dilution de la fermentation dans le bioréacteur.
Comme indiqué plus haut, les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support, et on peut évaluer la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui peut donner des
15 informations intéressantes en début de production (pour suivre l’accroche initiale des microorganismes sur le support), et plus avant dans la campagne de production : on peut en effet évaluer au moins en partie le niveau de saturation du support en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm.
Avantageusement, on produit selon l’invention un moût fermentaire comprenant de
20 l’isopropanol, du butanol et de l’éthanol, les micro-organismes étant issus d’une souche appartenant au genre Clostridium.
L’invention a également pour objet un système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de microorganismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation mettant en œuvre le
25 procédé décrit plus haut.
L’invention a également pour objet un système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que ledit système comprend :
- une section réactionnelle comprenant un support, notamment sous forme de mousse de
30 polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d’une entrée pour le fluide sucré et d’une sortie pour le moût,
- des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports. De préférence, les moyens de suivi comprennent :
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle,
5 - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle,
- des moyens de calcul (tout moyen de type électronique/informatique) déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
10 La section réactionnelle selon l’invention comprend de préférence un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques.
L’invention sera décrite plus en détails ci-après, et sera illustrée à l’aide d’exemple(s) et de figures non limitatives de ladite invention.
Liste des figures
15 La figure 1 représente de façon très schématique un bioréacteur mettant en œuvre l’invention.
La figure 2 représente de façon très schématique le schéma-bloc du procédé selon l’invention.
La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives).
La figure 4 est un graphe représentant l’évolution de la concentration en micro-organismes
20 vivants (cellules dites actives) en fonction du temps.
La figure 5 est un graphe représentant la concentration en micro-organismes vivants (en cellules actives) estimées en fonction de la même concentration mesurée expérimentalement.
La figure 6 est un graphe représentant la variation de concentration en micro-organismes vivants immobilisés sur support en fonction du temps, telle que déduite selon le procédé de
25 l’invention.
Description des modes de réalisation
L’invention s’intéresse plus particulièrement aux fermentations de type IBE ou ABE à cellules immobilisées, dont un exemple est décrit dans le brevet FR-3 086670 précité auquel on pourra se reporter. Les procédés de fermentation IBE ou ABE continue à cellules immobilisées sont employés afin de produire de l’isopropanol et du butanol à partir de ressources renouvelables. Les bactéries mises en œuvre dans ces procédés sont en effet capables de dégrader certains sucres simples afin de former du butanol, de l’isopropanol ainsi que du gaz sous forme d’un
5 mélange H2/CO2.
La toxicité du butanol et le faible taux de croissance des bactéries en phase solvantogène limitent les performances du procédé batch et en continu simple. L’utilisation du procédé en continu à cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité volumique, puisque le temps de séjour des bactéries, dans ces conditions, est décorrélé du
10 temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en bactéries augmente dans le bioréacteur.
Les bactéries sont immobilisées sous forme d’un biofilm sur un support solide. Ce biofilm est composé d’un mélange de cellules et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est difficilement contrôlable, et dépend de nombreux facteurs. En effet, les
15 conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, peuvent influencer son développement. La part de cellules viables, et donc productrices de métabolites au sein de cette structure, peut également largement varier en fonction de l’âge du biofilm étudié, ainsi que des conditions opératoires du procédé.
20 Il est à noter que la biomasse active se trouve à la fois en suspension dans le milieu liquide et sur les solides supports. Ainsi, le contrôle de la quantité totale de cellules actives du biofilm au sein du bioréacteur est un paramètre-clé à connaître afin de piloter le procédé de manière optimale. En effet, les cellules immobilisées viables produisent du butanol, un composé inhibiteur de la croissance bactérienne. Par conséquent, le débit volumique d’entrée et de
25 sortie du procédé doit être augmenté au fur et à mesure de la croissance du biofilm au sein des supports, dans les exemples qui suivent à base de mousses en polyuréthane.
Néanmoins, les prélèvements de solides supports ne peuvent pas être effectués au cours des procédés de fermentation à cellules immobilisées. En effet, un prélèvement de support pourrait causer des problèmes quant au maintien de la stérilité et des conditions anoxiques du procédé.
30 Par conséquent, une méthode de suivi indirect du développement du biofilm/ de la quantité de cellules actives immobilisées dans ces biofilms a tout son intérêt.
La mise en œuvre de l’invention décrite ci-dessous est donc une méthode de mesures de débit de gaz en ligne couplé à des mesures de la concentration en cellules actives en suspension par cytométrie en flux, afin d’estimer la quantité de cellules actives immobilisées sur le solide support (biofilm).
En effet, le débit de gaz mesuré en sortie de réacteur est corrélé à la concentration en cellules actives totale mesurée par cytométrie en flux (voir équation ci-dessous). Ainsi, lorsque la
5 concentration en cellules actives dans le milieu liquide est mesurée via cette même méthode, la part de cellules actives immobilisées peut être estimée. La présente invention permet ainsi une estimation du développement du biofilm lors des lancements de fermentation, sans pour autant prélever de solides supports, ce qui représente un avantage pour la gestion du démarrage de ce procédé.
10
L’invention peut être mise en œuvre au cours d’une fermentation IBE ou ABE continue à cellules immobilisées. Au cours de ce type de fermentation, les cellules sont adsorbées sur un support poreux, préférentiellement des mousses en polyuréthane. Les cellules se multiplient au sein de ce support poreux au fur et à mesure de la fermentation continue.
15 La figure 1 représente de façon très simplifiée un bioréacteur 1 apte à mettre en œuvre l’invention. Elle ne détaille pas tous les équipements conventionnels des bioréacteurs, et n’est pas nécessairement à l’échelle. Le bioréacteur 1 délimite un volume intérieur sensiblement sous la forme d’un cylindre vertical, se décomposant en un volume V1 inférieur rempli d’une phase liquide et un volume V2 supérieur, qui est le ciel gazeux du réacteur. Le bioréacteur 1
20 comprend une entrée alimentée par un flux de fluide contenant le substrat carboné sucré_2, et une sortie 3 d’où est extrait le moût fermentaire 3 enrichi en alcools. Le volume V1 est muni de support(s) en mousse de polyuréthane 4. Le bioréacteur 1 est muni de moyens d’agitation 5 de la phase liquide, d’une sortie 5 permettant de prélever des échantillons de phase liquide en vue de réaliser dessus des analyses de cytométrie en flux, et d’une sortie 6 dans le volume
25 V2 permettant de prélever des échantillons de la phase gazeuse ou de mesurer le débit sortant de la phase gazeuse.
Le procédé de l’invention peut être synthétisé sous la forme d’un schéma-bloc représenté à la figure 2.
- étape A : on mesure le débit de gaz (fermentaire) sortant du ciel gazeux V2 (sortie 6, munie
30 d’une vanne et équipée de moyens de mesure de débit conventionnels), dans les exemples suivants on utilise un débitmètre gazeux ou compteur volumétrique, donnant une valeur de débit volumique en gaz d’un mélange H2/CO2. Les débits mesurés peuvent varier entre 0 et 5 L.Lréacteur1.h-1 mais sont préférentiellement compris entre 0,5 et 3 L.Lréacteur1.h-1,
- étape B: on en déduit une estimation des cellules actives totales (en suspension dans la phase liquide et immobilisés sur les supports 4 dans le volume V1), comme détaillé plus loin
- étape C : on analyse la viabilité des cellules en suspension dans la phase liquide V1 , par des
5 prélèvements sur la phase liquide (sortie 5), l’analyse se faisant par cytométrie en flux. Cette analyse peut être automatisée. La méthode employée dans les exemples ci-dessous est la suivante : La mesure de viabilité est effectuée en diluant une suspension cellulaire prélevée du bioréacteur dans du tampon mac llvaine jusqu’à obtenir une concentration comprise entre 5.105 et 2.106 cellules. mL-1. Une fois cette concentration atteinte, de l’iodure de propidium ainsi
10 que du diacétate de carboxyfluoresceine sont ajoutés à la suspension cellulaire à une concentration finale de 10 pg.mL-1. La suspension cellulaire est ensuite analysée à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser à argon (A : 488 nm). La lumière diffusée aux angles et dans l’axe du laser sont récoltées et analysées pour chaque particule détectée. La lumière diffusée perpendiculairement à l’axe du laser passe à travers un filtre passe bande (530 ± 15
15 nm) pour collecter la fluorescence verte ainsi qu’à travers un filtre passe haut (> 630 nm) pour collecter la fluorescence dans le rouge. La cytométrie en flux, contrairement à la mesure de la concentration en masse sèche, permet de mesurer les cellules actives parmi la biomasse totale, ce qui permet de calculer avec plus de précision les productivités spécifiques du procédé,
20 - étape D : on en déduit le nombre de cellules actives en suspension dans la phase liquide
- étape E : on déduit des résultats des étapes C et D une estimation de la concentration en cellules actives immobilisées sur les supports 4,
- étape F : on exploite les résultats de l’étape E pour la conduite du procédé de fermentation (choix des débits entrant 2 et sortant 3 notamment).
25 Ce procédé est itératif, à une fréquence donnée qui peut évoluer au cours du procédé de fermentation.
On décrit ci-dessous le type de flux carboné sucré, le type de micro-organisme et le type de support qu’on peut utiliser.
Le fluide contenant le substrat carboné sucré 2
30 Selon un ou plusieurs modes de réalisation, le fluide contenant le substrat carboné sucré comprend une solution aqueuse de sucres issus de la lignocellulose en C5 et/ou C6, et/ou de sucres issus des plantes saccharifères (par exemple glucose, fructose et saccharose), et/ou de sucres issus des plantes amylacées (par exemple dextrines, maltose et autres oligomères, voire d’amidon). Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la solution aqueuse de sucres en
35 C5 et/ou C6 provient du traitement d’une source renouvelable. Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la source renouvelable est du type biomasse lignocellulosique qui peut notamment comprendre les substrats ligneux (par exemple feuillus et résineux), les sous- produits de l’agriculture (par exemple de la paille) ou ceux des industries génératrices de déchets lignocellulosiques (provenant d’industries agroalimentaires, papeteries). La source
5 renouvelable peut également provenir de plantes sucrières, comme par exemple la betterave sucrière et la canne à sucre ou encore les plantes amylacées comme le maïs et le blé. La solution aqueuse de sucres en C5 et/ou C6 peut également provenir d’un mélange de différentes sources renouvelables. Selon un mode de conduite, cette solution est stérilisée pendant 20 minutes à 120°C.
10 La biomasse produite par la souche appartenant au genre Clostridium
La biomasse bactérienne est principalement adsorbée sous forme de biofilm sur un support solide. Préférablement, les bactéries sont des souches appartenant à l’espèce Clostridium beijerinckii et/ou Clostridium acetobutylicum. Les bactéries utilisées dans le procédé peuvent être des souches génétiquement modifiées ou non et naturellement productrices
15 d’isopropanol, et/ou des souches de Clostridium naturellement productrices d’acétone génétiquement modifiées pour les faire produire de l’isopropanol. Dans les exemples suivants, il s’agit de Clostridium beijerinckii DSM 6423.
Le support solide
20 Le support solide comprend une mousse en polyuréthane. La mousse en polyuréthane est particulièrement avantageuse car elle donne accès non seulement à la production de mélanges de type IBEA, mais elle donne aussi accès à la production de type continu par immobilisation de la biomasse bactérienne. En effet, la mousse en polyuréthane est capable de fixer les bactéries du genre Clostridium de façon suffisamment importante (Le., au-delà du
25 taux de dilution causant le lavage cellulaire) permettant de produire en continu des mélanges de type IBEA. De plus, la mousse en polyuréthane est adaptée pour être immobilisée par immersion dans un réacteur. Alternativement, on peut utiliser une mousse à base de matériau(x) céramique(s).
Selon un ou plusieurs modes de réalisation, la mousse en polyuréthane présente :
30 - des cavités volumiques (Le., pores ou cellules) dont le diamètre de sphère équivalent est compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,25 mm et 1 ,1 mm, de préférence entre 0,55 et 0,99 mm, et/ou
- une densité apparente (Le., masse sur volume apparent) mesurée dans l’air comprise entre 10 et 90 g/L, de préférence entre 10 et 80 g/L, de préférence entre 15 et 45 g/L, tel qu’entre 20 et 45 g/L ou entre 25 et 45 g/L.
Dans le cas d’une fermentation batch avec Clostridium beijerinckii DSM6423, la corrélation entre cellules actives en suspension et débit de gaz de fermentation a premièrement été
5 établie et est présentée à la figure 3, qui est un graphe qui représente en abscisse la concentration en cellules actives en cellules. mL-1, et en ordonnée le débit de gaz sortant du bioréacteur en Lh-1.
Ces essais ont été réalisés sur milieu GAPES, à 34°C et sans régulation pH.
Les conditions opératoires de ces essais sont les suivantes :
10 Après réduction du milieu CALAM dont la composition est donnée dans le tableau 1 ci- dessous, les spores sont activées par un choc thermique à 100°C pendant une minute, et une inoculation du milieu à 2% est réalisée. La préculture est ensuite incubée à 34°C, en anaérobie et sous agitation à 100 rpm pendant 24 h.
Tableau 1
15
Une seconde préculture en milieu GAPES, dont la composition est donnée dans le tableau 2 ci-dessous, est ensuite réalisée avant l’ensemencement final du fermenteur. Une inoculation du milieu GAPES est cette fois-ci effectuée à 10% puis la préculture incubée à 34°C, en anaérobie et sous agitation à 100 rpm pendant 24 h.
20 Tableau 2
Enfin la fermentation en réacteur est réalisée avec du milieu GARES préalablement réduit et avec une inoculation à 10%. Les conditions de cultures employées sont : température à 34°C, agitation de 200 rpm, sans bullage à l’azote et sans régulation de pH.
5 Dans le cas des fermentations continues, une première phase de croissance en batch a lieu pendant 8h puis le réacteur est connecté à une bouteille d’alimentation (milieu GAPES) et une bouteille de soutirage. L’alimentation est démarrée et progressivement augmentée.
Le débit de gaz a été mesuré à l’aide d’un compteur volumétrique Ritter et la quantité de cellules actives p paarr marquage aauu cFDA et analyse par cytométrie en flux.
10
Le protocole de mesure est le suivant :
Tampon Mac llvaine pH 4
1. Préparer une solution d’acide citrique à 0,1 M (soit 19,21 g/L) et une solution de Na2HPO4 à 0,2 M (soit 28,38 g/L).
15 2. Pour obtenir un pH égal à 4, mélanger 307,25 mL de la solution d’acide citrique à 0,1 M avec 192,75 mL de la solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Vérifier le pH de la solution tampon obtenue.
3. Filtrer la solution et la conserver à 4°C.
Marqueur de viabilité
20 lodure de propidium : 1 ,4986 mM dans de l’eau milliQ - à conserver à 4°C
Chemchrome V8 commercialisé par Biomérieux (cFDA : diacétate de carboxyfluoresceine ) : 0,217 μM dans de l’acétone - à conserver à -20°C
Marquage des cellules
1. Diluer la suspension cellulaire dans du tampon Mac llvaine afin d’obtenir une
25 concentration d’environ 1.106 cellules/mL. 2. Ajouter 10 μL de Chemchrome V8 et 10 pL d’iodure de propidium dans 1 mL de la suspension cellulaire diluée
3. Incuber 10 min à 40 °C.
4. Passer l’échantillon au cytomètre en flux.
5 La figure 3 est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) tel que mesuré, exprimé en L.h-1 , en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives), exprimée en nombre de cellules viables par ml de volume V1 (volume utile) de bioréacteur. Cette figure démontre qu’une relation linéaire entre débit de gaz et concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux est obtenue. Cette dernière permet ainsi
10 d’estimer la productivité spécifique cellulaire en gaz de fermentation selon la relation suivante :
La valeur du paramètre qG correspond en effet au coefficient directeur de la droite de régression : 5,54.10-10 ± 3.5.10-11 L.cellules-1.h-1. En faisant l’hypothèse que la productivité spécifique cellulaire qG est constante dans le temps, cette même relation peut ensuite être
15 utilisée afin de calculer la quantité totale de cellules actives à partir des débits de gaz mesurés lors de fermentation continue. Cette méthode a ainsi été utilisée dans un second temps pour estimer la concentration en cellules actives au cours d’une fermentation continue à cellules libres.
Les résultats sont illustrés aux figures 4 et 5 :
20 - La figure 4 est un graphe représentant en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonné la concentration en cellules actives au cours d’une fermentation IBE à 34°C à cellules libres exprimée en cellules actives. mL-1.
- La figure 5 est un graphe représentant en abscisse la concentration en cellules actives estimées au cours d’une fermentation IBE à 34°C à cellules libres exprimée en cellules
25 actives. mL-1, et en ordonnée les cellules actives mesurées expérimentalement avec la même unité.
Les résultats de l’estimation de la concentration en cellules libres sont présentés sur la figure
4. Les traits continus représentent l’estimation de la concentration en cellules actives au cours du temps à partir du débit de gaz mesuré.
30 Les points blancs à la figure 5 représentent la concentration en cellules actives mesurée par cytométrie en flux : La figure 5 montre que les données estimées à partir de la productivité spécifique cellulaire qG calculées expérimentalement au cours des fermentation batch sont proches des données expérimentales (R2 = 0,87). Cet essai permet de valider l’hypothèse de constance de la productivité spécifique cellulaire qG (5,54.10-10 L.cellules-1h-1).
Il est donc bien possible d’estimer la concentration en cellules actives totales au cours de la
5 fermentation. Cette relation peut alors être employée de manière inventive afin d’estimer la concentration en cellules actives du biofilm d’un procédé continu à cellules immobilisées, à condition que la productivité spécifique cellulaire en gaz des cellules immobilisée soit égale à celle mesurée en suspension.
10 Ainsi :
Dans ce cas-là, une mesure de la quantité de cellules actives en suspension par cytométrie en flux est réalisée. Il est ainsi possible de suivre la colonisation du biofilm sans prélèvement et analyses de solides supports.
15 L’avantage de cette invention est qu’elle permet d’opérer le taux de dilution de la fermentation, afin que la concentration en cellules actives immobilisées soit maximale, sans prélèvement invasif dans le bioréacteur pendant la production. Le procédé développé dans le cadre de la présente invention permet ainsi de limiter les biais entraînés par le prélèvement des solides supports lors de l’étude de la cinétique de croissance de Clostridium (C. beijerinckii ou
20 acetobutylicum) en biofilm : perte de stérilité (c’est-à-dire risques de contaminations) et des conditions anoxiques (entrée d’oxygène) affectant la croissance des bactéries étudiées.
Ce procédé peut être extrapolé/appliqué de façon analogue à d’autres types de fermentations à cellules immobilisées, tant qu’on a recours qu’à un seul type de souche bactérienne tout au moins, et que les souches bactériennes employées possèdent une productivité spécifique en
25 gaz fixe/peu changeante tout au long de la fermentation étudiée.
Exemple 1
Le système décrit est composé du bioréacteur 1 d’un volume utile de 0,35 L. La platine de ce bioréacteur est équipée d’une entrée pour l’alimentation en substrat 2, d’un plongeant pour les prélèvements, la sortie liquide est assurée par un système de débordement. Les mousses en polyuréthane 4 sont placés dans le bioréacteur 1 de manière à avoir 0,24 L de mousse par litre de bioréacteur. Le système est stérilisé à vide à 120°C pendant 20 min. Un volume de 0,315 Lde substrat carboné stérile (milieu GAPES) et anoxique est introduit dans le
5 bioréacteur. La cuve d’alimentation (non représentée à la figure 1) contenant du substrat carboné stérile (milieu GAPES) est raccordée au bioréacteur 1. La fermentation est réalisée par la souche Clostridium beijerinckii DSM6423. L’inoculation est effectuée à partir de 0,035 L de préculture de cette souche préalablement incubée pendant 24 h à 34°C et sous conditions anoxiques.
10 Une fois l’inoculation réalisée, une période d’incubation de 8 h en batch est respectée. L’essai a été effectué à 34°C, avec une agitation de 200 rpm et le pH de la fermentation n’est pas contrôlé. Le substrat carboné 2 est ensuite amené de manière continue dans la partie réactionnelle V1 du bioréacteur 1 à l’aide d’une pompe péristaltique. Le débit volumique d’entrée du substrat carboné 2 et de sortie du jus fermenté, appelé aussi moût de fermentation
15 3 sont égaux tout au long de l’essai. Le débit normalisé par le volume utile du bioréacteur 1 est appelé taux de dilution. Comme indiqué sur la figure 1 , ce dernier est augmenté au fur et à mesure de l’essai afin de ne pas accumuler des concentrations inhibitrices en butanol au fur et à mesure de la croissance du biofilm. Le débit de gaz produit par la souche utilisée est mesuré à l’aide d’un compteur volumétrique.
20 La figure 6 représente en abscisse le temps exprimé en heure, et en ordonnées, selon l’axe vertical gauche la concentration en micro-organismes vivants par ml de volume réactionnel du bioréacteur, et selon l’axe vertical droit le débit en litre/heure des flux entrant 2 et sortant 3 (identiques) du bioréacteur.
- Les losanges représentent les micro-organismes vivants en suspension/ ml de volume V1 du
25 bioréacteur,
- Les ronds représentent la concentration en micro-organismes vivants sur biofilm / ml de volume V1 du bioréacteur telle qu’estimée selon l’invention,
- La courbe en trait plein représente la mesure du débit de gaz de fermentation,
- La courbe en pointillés l’évolution du taux de dilution en h-1 tel que défini plus haut.
30 Comme indiqué sur la figure 6, le débit volumique de gaz mesuré peut servir à estimer la concentration totale en cellules actives dans le milieu de fermentation. Ainsi, il est possible, à partir de la mesure de gaz, et de la mesure de la viabilité des cellules en suspension par cytométrie en flux, d’estimer la concentration en cellules viables qui sont immobilisées dans le bioréacteur. Ces données montrent que lorsque le taux de dilution appliqué au système est faible en début d’essai, la majorité des cellules viables (c’est-à-dire les micro-organismes vivants) sont en suspension. Lorsque le taux de dilution est augmenté, les cellules viables en suspension sont lessivées du bioréacteur, bien que le débit volumique en gaz reste constant. Le dénombrement
5 des cellules viables en suspension ainsi que l’analyse du débit volumique de gaz de fermentation permettent alors de vérifier que la majorité des cellules viables sont alors immobilisées sur les mousses en polyuréthane. Ces analyses peuvent alors servir à mieux comprendre où se situent les cellules viables dans le bioréacteur considéré, et ainsi à optimiser le procédé de fermentation.
10 On peut ainsi moduler au mieux le taux de dilution au long du procédé de fermentation, ce qui est tout particulièrement intéressant au démarrage du procédé.

Claims

Revendications
1. Procédé de production d’alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous
5 l’action desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et en ce qu’on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, à partir d’analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation
10 produits.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’analyse sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) comprend une mesure de viabilité des microorganismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle.
3. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’on mesure la viabilité des
15 micro-organismes en suspension dans la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide.
4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle (1) ou dans le flux du moût (3) de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence
20 fixe ou évolutive.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle (1).
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’analyse sur la
25 phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) détermine la concentration en microorganismes viables de ladite phase liquide, en ce que l’analyse sur le/les gaz de fermentation produits évalue la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et en ce qu’on déduit de ces analyses une évaluation de la concentration des microorganismes viables immobilisés sur le support.
30 7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on module le débit entrant de flux sucré (2) dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût (3) depuis la section réactionnelle (1) en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les microorganismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support (4), et en ce qu’on évalue la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de microorganismes vivants immobilisés sur le support.
5 9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on évalue le niveau de saturation du support (4) en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm.
10. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on produit un moût fermentaire (3) comprenant de l’isopropanol, du butanol et de l’éthanol, les microorganismes étant issus d’une souche appartenant au genre Clostridium.
10 11. Système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que ledit système comprend :
- une section réactionnelle (1) comprenant un support (4), notamment sous forme de mousse de polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite
15 section réactionnelle étant munie d’une entrée pour le fluide sucré et d’une sortie pour le moût,
- des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, par analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits.
12. Système selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens de suivi
20 comprennent :
- un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle,
- un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section
25 réactionnelle,
- des moyens de calcul déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support.
13. Système selon l’une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la section réactionnelle (1) comprend un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et
30 anoxiques.
EP22802527.6A 2021-10-20 2022-10-10 Procédé de production d'alcools par fermentation Pending EP4419642A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2111141A FR3128226B1 (fr) 2021-10-20 2021-10-20 Procédé de production d’alcools par fermentation
PCT/EP2022/078032 WO2023066697A1 (fr) 2021-10-20 2022-10-10 Procédé de production d'alcools par fermentation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4419642A1 true EP4419642A1 (fr) 2024-08-28

Family

ID=80786448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP22802527.6A Pending EP4419642A1 (fr) 2021-10-20 2022-10-10 Procédé de production d'alcools par fermentation

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240409863A1 (fr)
EP (1) EP4419642A1 (fr)
CN (1) CN118139964A (fr)
CA (1) CA3233528A1 (fr)
FR (1) FR3128226B1 (fr)
WO (1) WO2023066697A1 (fr)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268179A (zh) * 2005-09-15 2008-09-17 尼克弗公司 连续培养产醇细菌的装置和培养该细菌的方法
EP3035052A1 (fr) 2014-12-18 2016-06-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Procédé et dispositif de mesure pour la détermination de la vitesse de croissance d'un biofilm
FR3086670B1 (fr) * 2018-09-28 2024-05-31 Ifp Energies Now Procede de production d’alcools avec clostridium sur support solide
KR102833819B1 (ko) * 2018-10-03 2025-07-15 플루리 바이오텍 리미티드. 모듈식 생물반응기

Also Published As

Publication number Publication date
FR3128226A1 (fr) 2023-04-21
US20240409863A1 (en) 2024-12-12
CA3233528A1 (fr) 2023-04-27
WO2023066697A1 (fr) 2023-04-27
FR3128226B1 (fr) 2024-11-08
CN118139964A (zh) 2024-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reiniati et al. Kinetics of cell growth and crystalline nanocellulose production by Komagataeibacter xylinus
US20030077770A1 (en) Process for ozonating and converting organic materials into useful products
CA3111898A1 (fr) Procede de production d'alcools avec clostridium sur support solide
EP2597461A2 (fr) Procédé de mesure directe de multiples biodégradabilités
Dumitrache et al. Tracking the cellulolytic activity of Clostridium thermocellum biofilms
Zeng et al. In situ reactivation of aerobic granular sludge in a membrane bioreactor after long-term storage: Revealing the variation in metabolic pathways under restored bioactivity
WO2023066697A1 (fr) Procédé de production d'alcools par fermentation
WO2009044076A2 (fr) Procede de traitement en continu de produits organiques solides et installation pour le traitement en continu de produits organiques solides
FR3041629A1 (fr) Dispositif de production d'hydrogene
EP3419413B1 (fr) Procede de culture d'organismes photosynthetiques a l'aide d'une source de co2
WO2014072934A1 (fr) Utilisation de lumiere bleue pour la stimulation du metabolisme de microorganismes non phototrophes
EP4248191B1 (fr) Procédé de mesure de solubilisation de particules par des cellules vivantes et/ou leurs produits dérivés et kit associé
CN101918568A (zh) 用于制备沼气的煎盘梭菌
EP1891199B1 (fr) Procede de preparation d'une boisson fermentee peu alcoolisee
EP3461902A1 (fr) Procédé d'hydrolyse enzymatique en alimentation séquentielle avec ajouts du substrat prétraité de plus en plus éspaces dans le temps
JP3004509B2 (ja) 微細藻からのエタノール製造方法及び装置
FR2583060A1 (fr) Production de butanol et d'acetone par fermentation avec recyclage de la biomasse par ultrafiltration
BE1029281B1 (fr) Procédé de production biologique d'éthanol à partir de feuilles d’aleurite
EP4263783A1 (fr) Procédé de production d'alcools avec un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes
FR2883296A1 (fr) Procede et dispositif permettant d'isoler les microorganismes
FR3161124A1 (fr) Procede de preparation d’un biogaz
WO2025056406A1 (fr) Procédé de production d'alcools avec un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes
FR3098828A1 (fr) Dispositif et procédé de production de microorganismes photosynthétiques en photobioréacteur
JP2026030865A (ja) 耐熱性酵母を用いたエタノールの製造方法
FR2786782A1 (fr) Procede de detection de micro-organismes et support utilisable dans un tel procede

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20240521

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC ME MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)