EP4419116A1 - Cellules t effectrices terminales, procédé pour leur production et leur isolement et leur utilisation thérapeutique - Google Patents

Cellules t effectrices terminales, procédé pour leur production et leur isolement et leur utilisation thérapeutique

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EP4419116A1
EP4419116A1 EP22808674.0A EP22808674A EP4419116A1 EP 4419116 A1 EP4419116 A1 EP 4419116A1 EP 22808674 A EP22808674 A EP 22808674A EP 4419116 A1 EP4419116 A1 EP 4419116A1
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EP
European Patent Office
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cells
antigen
subpopulation
disease
specific
Prior art date
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Pending
Application number
EP22808674.0A
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German (de)
English (en)
Inventor
Yahia Chebloune
Sara EL KENNANI
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Universite Grenoble Alpes
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Universite Grenoble Alpes
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Publication date
Application filed by Universite Grenoble Alpes, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Universite Grenoble Alpes
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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention falls within the field of cell therapy against infectious and chronic pathologies, in particular severe infectious diseases such as Covid-19.
  • the present invention relates to a method for the production and isolation of a subpopulation of cells comprising terminal effector T cells specific for an antigen linked to a disease of interest, as well as the subpopulation of cells obtained by such a process.
  • the invention also relates to the therapeutic use of such a cell subpopulation, and a pharmaceutical composition containing it.
  • the first strategy proposed by the prior art concerns the use of stem cells from cord blood or placenta as sources capable of stimulating immunity in infected patients.
  • the second strategy concerns the reimplantation of the patient's autologous T cells (CAR/TCR-T).
  • CAR/TCR-T autologous T cells
  • This technology consists of modifying the patient's T cells ex vivo using a chimeric antigen receptor. These modified T cells specifically recognize the cells expressing the antigens and eradicate them by cytolysis.
  • cytokine release syndrome which corresponds to a severe reaction of the immune responses.
  • the present invention aims to provide a solution for the therapeutic treatment of Covid-19, and more generally of infectious diseases, in particular viral diseases, and/or chronic diseases, which has good efficacy, which is simple and quick to implement. , and which is not associated with side effects which may lead to the death of the patient, in particular with diseases of the type of graft rejection and immune responses of the graft against the host.
  • CTEACDs Short Effector T Cells Duration
  • CTEACDs are distinguished in particular from TEMRAs by the absence of expression on their surface of the CD45RO marker. While TEMRAs are CD45RA + /CD45RO
  • the present inventors have discovered that such cells specific for a disease, after having been treated in vitro in a specific way, by their cytotoxicity, are able to recognize the cells affected by this disease and to eliminate them rapidly from the body.
  • more than 95% of such CTEACDs of human origin of the CD8+ type are granzyme B+ and more than 40% of them also secrete IFN-gamma
  • more than 50% of such CTEACDs of human origin of the CD4+ type are granzyme B+ and more than 40% of them produce IFN-gamma.
  • Such CTEACDs thus have all the characteristics of cytotoxic effector cells armed to eradicate the infected cells, so that the implementation of such cells in a treatment by curative cell therapy makes it possible to combat the disease effectively, and this in a completely unexpected given the short lifespan which characterizes them, of the order of 3 to 5 days in cell culture.
  • This short lifespan also advantageously avoids, after introduction of these cells into the body, undesirable side effects such as rejection reactions known as graft-versus-host disease.
  • These specific T cells are also simple and quick to produce and purify, so that they constitute an easily accessible therapeutic active ingredient.
  • the present invention relates to an in vitro or ex vivo method for producing and isolating a subpopulation of cells comprising T cells specific for an antigen linked to a disease of interest, more precisely a population of cells comprising terminal effector T cells (CTEACDs) characterized by a cytotoxic character and a short lifespan, specific for this antigen.
  • CTEACDs terminal effector T cells
  • This process includes steps of:
  • CD45RO and CD27 markers are overwhelmingly CTEACDs, a large proportion of which are specifically directed against the pathological cells associated with the disease of interest.
  • the effector T cells secreting the cytokines and accumulating the lytic molecules (Granzyme B) which result from an antigen re-stimulation in vitro are mainly specific for the antigen
  • the cell subpopulation obtained at the end of the step c/ of isolation, corresponding to the phenotype (CD45RO7CD27) is composed of at least 50%, and even of at least 60% (by number) of antigen-specific CTEACDs cells.
  • the sub cell population obtained at the end of the process can contain at least 90% of CTEACDs specific for the antigen, or even consist of, that is to say contain only, CTEACDs specific for the antigen.
  • Such cells exhibit, when administered to a subject suffering from the disease of interest, within the framework of a treatment of the disease by cell therapy, the capacity to recognize the pathological cells and to eliminate them rapidly from the organism. Furthermore, they do not cause any undesirable reaction in this subject, in particular of the type of rejection of the graft, liable to lead to his death. Furthermore, repeated administration of such cells to a individual in no way has the effect of inducing the appearance of the associated disease, which advantageously makes it possible to envisage its use for the treatment of chronic diseases.
  • the method according to the invention is advantageously simple and quick to implement.
  • a preliminary step of identification for a targeted disease of interest, of an antigen linked to this disease, against which the T cells produced in the body will be specifically directed, and which will be implemented in the part of the process, for step b/ of cell culture.
  • an associated antigen is, as indicated above, the SARS-CoV-2 virus; the H1 N1 virus is an influenza-associated antigen; basal myelin protein is an antigen associated with multiple sclerosis; in the context of cancers, for example neoantigens associated with tumor development or tumor-specific antigens (AST) are also known.
  • AST tumor-specific antigens
  • Step a/ of obtaining a population of mononuclear cells comprising antigen-specific T cells with high proliferation capacity can be carried out in any manner known to those skilled in the art.
  • T cells with a high proliferative capacity is meant, in a conventional way in itself, T cells which are capable of carrying out at least one to two divisions per 24 hours.
  • T cells are in particular terminally differentiated effector T cells and memory effector T cells.
  • step a/ of obtaining a population of mononuclear cells comprising T cells specific for the antigen, with a high capacity for proliferation comprises the identification/the selection of a biological sample of human adult peripheral blood, isolated from the human body, comprising a population of antigen-specific T cells with a high proliferative capacity, and the isolation of mononuclear cells from this biological sample.
  • the identification of a biological sample of human peripheral blood comprising a population of T cells specific for the targeted antigen and with a high capacity for proliferation can be carried out in any conventional manner in itself.
  • the person skilled in the art can in particular carry out tests aimed firstly at determining whether this sample comprises a population of T cells specific for the antigen, then whether or not these T cells have a high capacity for proliferation.
  • any method that is conventional in itself for those skilled in the art can be implemented.
  • Elispot for “enzyme-linked immunospot”
  • this method consists in depositing, in wells of multi-well plates on the surfaces of which are fixed antibodies specific for cytokines (IL-2, IFN-y or TNF-a for example), the sample to be analyzed in a mixture with the target antigen. In the presence of T cells specific for this antigen in the sample, there is then a secretion of cytokines, which are captured by the antibodies present in the wells.
  • spots thus formed testify to the presence in the sample of effector cells specific for the antigen studied, the proportion of these cells in the sample also being able to be quantified. It is within the competence of a person skilled in the art to determine the exact operating conditions for implementing this Elispot technique for each sample of human peripheral blood and each specific antigen targeted.
  • a person skilled in the art can implement any conventional method per se of determining the rate of cell division of a cell.
  • This rate of division can for example be measured either by a commercially available proliferation test, or by labeling the cells with a vital dye, in particular the succinimidyl ester of carboxyfluorescein (CFSE, for English Carboxyfluorescein succinimidyl ester), followed by by flow cytometry of dye dilution following cell divisions occurring.
  • CFSE succinimidyl ester of carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • the step of isolating peripheral blood mononuclear cells (designated by the abbreviation PBMCs, for English Peripheral Blood Mononuclear Cells) from the human peripheral blood sample identified as comprising a population of T cells specific for the antigen with high proliferation capacity, that is to say identified as suitable to serve as a basis for the implementation of the steps of the method according to the invention, can be carried out in any way known to those skilled in the art, for example by centrifugation of a sample of human peripheral blood collected on ethylenediaminetetraacetic acid (5 mM EDTA) in order to prevent its coagulation, and recovery of the cell pellet obtained.
  • PBMCs for English Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • the population of mononuclear cells thus isolated obtained at the end of this isolation step typically contains antigen-specific memory effector T cells.
  • the biological sample of human peripheral blood is a sample of peripheral blood from a human individual who has been affected at least once by the disease of interest, and who is preferably in the convalescent phase, that is to say a few days to a few months after the cessation of the symptoms of the disease.
  • a sample is highly likely to contain a high proportion of disease-associated antigen-specific T cells with high proliferative capacity, which have been produced by the individual in response to contracting the disease.
  • the biological sample of human peripheral blood may for example be a sample of peripheral blood from a human individual who has been immunized against the disease, by vaccination (this individual may also, where appropriate, have contracted the disease before and/or or after vaccine administration).
  • step a/ of obtaining a population of mononuclear cells comprising antigen-specific T cells with a high proliferative capacity can be carried out in vitro from a biological sample of umbilical cord blood from any individual, that is to say from an individual who has not necessarily contracted the disease and/or been immunized against the disease.
  • This step then comprises, carried out in a conventional manner in itself, obtaining, from such a sample, dendritic cells adherent to the plastic and culturing them with an antigen corresponding to the disease targeted, according to a protocol described in the literature (Abbasian et al., Immunobiology, 2006, 108: 203; Bedke et al., J. Immunol. Methods, 2020, 477: 112703). These cells present the antigen on their surface by the major histocompatibility complexes (MHC).
  • MHC major histocompatibility complexes
  • Such a method for obtaining a population of mononuclear cells comprising T cells specific for the antigen with a high capacity for proliferation is in particular particularly suitable when the disease targeted is not a viral infectious disease, but a chronic disease, a cancer or an autoimmune disease, for which the peripheral blood of convalescent individuals contains few or no T cells with high proliferative capacity.
  • Step b/ of the method according to the invention of culturing mononuclear cells obtained from the biological sample, in particular from a biological sample of human peripheral blood, in the presence of the antigen, advantageously makes it possible to produce CTEACDs , a majority of which are specific for this antigen, by in vitro differentiation of the memory effector T cells present in the population of mononuclear cells used.
  • a medium of suitable cell culture for this culture is chosen.
  • a culture medium mention may be made, for example, of the commercial medium RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), in particular supplemented with 10% fetal calf serum, 1% penicillin/streptomycin solution, 1% HEPES buffer and 1% glutamine.
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute
  • penicillin/streptomycin solution 1% penicillin/streptomycin solution
  • HEPES buffer 1% glutamine
  • Another example of such a cell culture medium is the serum-free medium marketed under the name AIM-V® by the company Gibco.
  • the cells can be cultured in a cell culture incubator, preferably at 37°C, and preferably under 5% CO2 and/or saturated humidity.
  • the concentration of antigen to be applied in the cell culture medium depends on the particular antigen used. It is within the competence of those skilled in the art to determine this concentration, so as to maximize the quantity of antigen-specific CTEACDs produced at the end of step b/ of cell culture. To this end, the person skilled in the art can proceed empirically, by testing several different doses of antigen and determining the dose which, while being non-lethal for the cells, makes it possible to obtain the highest rate of production of CTEACDs. This production rate can for example be determined by the Elispot test described above.
  • step b/ of culturing the mononuclear cells is carried out for a period of between 36 to 60 hours, for example for a period of approximately 48 hours.
  • Such a characteristic advantageously makes it possible to produce a large quantity of CTEACDs while ensuring that the lifetime remaining for these CTEACDs at the end of this culture step is as long as possible.
  • Step c/ of isolation from the culture medium of the effector T cells which do not express the CD45RO and CD27 markers on their surface can be carried out in any manner known to those skilled in the art. It can in particular be carried out by collection of effector T cells enriched in T cells specific for the antigen contained in the culture medium, then affinity chromatography using antibodies specific for the molecular markers CD45RO and CD27, the T cells which do not do not express on their surface the CD45RO and CD27 markers being present in the unbound fraction.
  • the collection of effector T cells enriched in specific cells of the antigen, thanks to prior antigenic stimulation, contained in the culture medium can for example be produced by means of centrifugation at 3000 rpm at 4° C. then re-suspension of the pellet in saline phosphate buffer.
  • the next step of isolating the CTEACDs from the rest of the T cells, that is to say from the undifferentiated or not fully differentiated T cells, advantageously takes advantage of the fact that the human CTEACDs do not express the molecular markers on their surface.
  • CD45RO and CD27 glycoproteins that are expressed by other types of human T cells, in particular by memory T cells.
  • the implementation of an affinity chromatography step, using anti-CD45RO and anti-CD27 antibodies, immobilized on a solid support advantageously makes it possible to quickly and effectively separate the CTEACDs from the other lymphocyte subpopulations in the medium.
  • the solid support used for this purpose can be of any conventional type per se. They may in particular be magnetic beads on which these antibodies are grafted, implemented within a purification system by magnetic effect such as the magnetic system marketed by the company Miltenyi Biotec under the name MidiMACS®.
  • all of the steps of the method are carried out in a sterile environment, and preferably at a temperature of between 18 and 20° C., with the exception of step b/ of cell culture, which is preferably performed at 37°C.
  • the method according to the invention may also comprise a step of separating the CTEACDs specific for the antigen contained in the subpopulation of cells obtained.
  • Another aspect of the invention relates to an isolated subpopulation of cells obtained by a method according to the invention, that is to say in the form of a purified subpopulation of T cells obtained in vitro or ex vivo, separated from the other subpopulations of T cells by the isolation step described above, this subpopulation comprising short-lived human terminal effector T cells (CTEACDs) specific for the antigen linked to the disease of 'interest.
  • CTEACDs human terminal effector T cells
  • the cell subpopulation according to the production comprising mainly CTEACDs, can contain at least 50%, and even 60% (by number) of cells Antigen-specific short-lived human terminal effectors.
  • the cell subpopulation according to the invention may contain at least 90 %, in particular at least 95% (by number) of short-lived human terminal effector T cells specific for the antigen, or even consist of such cells specific for the antigen linked to the disease of interest.
  • CTEACDs terminal effector T cells are characterized by a CD45RAVCD45RO7CD27' phenotype and a short lifespan, of the order of a few days, in particular less than or equal to five days.
  • the cell subpopulation according to the invention containing at least 50% of, or consisting of, CTEACDs specific for the antigen, is particularly suitable for use as a medicament, in particular for the treatment of the disease of interest. associated with the antigen against which these CTEACDs are specifically directed. Transferred to the subject who develops this disease, these antigen-specific CTEACDs effectively eradicate the pathological cells, and they disappear within 5 days post-administration, so that they do not trigger any rejection reaction by the body.
  • the cell subpopulation obtained by the method according to the invention can in particular be used for the treatment of a disease of interest of the infectious disease type, in particular a viral pathology, such as influenza or an infection caused by a coronavirus, in particular by a SARS-CoV responsible for the severe acute respiratory syndrome (SARS) or by a MERS-CoV responsible for a potentially severe respiratory attack (MERS).
  • a disease of interest of the infectious disease type in particular a viral pathology, such as influenza or an infection caused by a coronavirus, in particular by a SARS-CoV responsible for the severe acute respiratory syndrome (SARS) or by a MERS-CoV responsible for a potentially severe respiratory attack (MERS).
  • SARS-CoV severe acute respiratory syndrome
  • MERS-CoV responsible for a potentially severe respiratory attack
  • This pathology can in particular be Covid-19, caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the cell subpopulation obtained by the method according to the invention can otherwise be used for the treatment of a disease of interest of the chronic non-communicable disease type, such as cancer, multiple sclerosis, etc.
  • the cell subpopulation obtained by the method according to the invention can in particular be used for the treatment of any disease of interest with which an antigen capable of causing the production by the human body of specific T lymphocytes can be associated.
  • treatment means obtaining a desired pharmacological and physiological effect.
  • treatment includes the partial or total cure of the disease and/or the total or partial disappearance of one or more of its symptoms.
  • the cell subpopulation according to the invention can be administered to any subject in need, that is to say affected or likely to be affected by the disease of interest.
  • This subject may in particular be a mammal, and in particular a human.
  • the subpopulation of cells according to the invention is administered to a subject in need thereof, that is to say affected or likely to be affected by the disease, less than 4 days, preferably less than 3 days and preferably less than 2 days, after its production, that is to say after the end of step b/ of cell culture of the method according to the invention used to obtain it.
  • the cell subpopulation according to the invention is administered to the subject in a therapeutically effective quantity.
  • therapeutically effective amount is meant the amount sufficient to ensure the treatment of the disease. This amount depends on several factors, such as the disease and its severity, age, weight, etc., the subject to be treated, the route and form of administration, etc.
  • the therapeutically effective amount of the cell subpopulation used according to the invention will be determined by the physician for each individual case.
  • the administration of the cell subpopulation according to the invention to the subject to be treated can be carried out by any conventional route in itself in the field of cell therapy, parenteral routes, for example the subcutaneous, intradermal, subdural, intravenous, intramuscular, intrathecal, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial or intra-lesional, or the intranasal route, being particularly preferred in the context of the invention.
  • parenteral routes for example the subcutaneous, intradermal, subdural, intravenous, intramuscular, intrathecal, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial or intra-lesional, or the intranasal route, being particularly preferred in the context of the invention.
  • systemic modes of administration are favored for the treatment of infectious diseases, in particular the modes of administration by injection, for example intravenous injection.
  • injection for example intravenous injection.
  • intratumoral injection or mucosal administration in particular intranasal, will be more particularly preferred.
  • the determination of the dosage of administration of the cell subpopulation according to the invention falls within the competence of the doctor.
  • the cell subpopulation can in particular be administered to the subject to be treated once, or several times, spaced from a few days to a few weeks apart.
  • the invention is also expressed in the terms of a method for the therapeutic treatment of a subject suffering from a disease of interest, in particular an infectious disease, in particular viral, this method comprising a step of administration to this subject in need of a therapeutically effective quantity of an isolated cell subpopulation according to the invention, comprising short-lived terminal effector T cells specific for an antigen linked to this disease of interest.
  • This method can meet one or more of the characteristics described above with reference to the therapeutic use of the cell subpopulation according to the invention as a drug.
  • the invention also relates to the use of a cell subpopulation according to the invention for the manufacture of a medicament, in particular a medicament for treating infectious diseases, in particular viral ones.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition containing a cell subpopulation according to the invention, comprising short-lived terminal effector T cells specific for a disease-associated antigen, as an active principle, in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable vehicle” means any vehicle useful for the preparation of a pharmaceutical composition and which is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable for the subject to be treated, in particular for mammals. and especially humans.
  • the vehicle of the pharmaceutical composition according to the invention can be liquid or semi-solid. It can be a diluent, an adjuvant or any other conventional vehicle in itself for the constitution of pharmaceutical compositions, for example of an aqueous, oily vehicle, etc.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be in any galenic form, in particular in a form suitable for parenteral, in particular intravenous, or intranasal administration.
  • a form suitable for parenteral in particular intravenous, or intranasal administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may also contain one or more excipients/additives conventional per se for the constitution of pharmaceutical compositions in the field of cell therapy, for example chosen from stabilizers, antioxidants, suspending agents , isotonic agents, surfactants, pH adjusters, buffering agents, etc., or any mixture thereof.
  • excipients/additives conventional per se for the constitution of pharmaceutical compositions in the field of cell therapy, for example chosen from stabilizers, antioxidants, suspending agents , isotonic agents, surfactants, pH adjusters, buffering agents, etc., or any mixture thereof.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may also contain one or more active principles other than the CTEACDs specific for the antigen according to the invention, these active principles possibly or not acting synergistically with these cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably formulated in the form of unit doses.
  • the invention also relates to the therapeutic use of a pharmaceutical composition according to the invention, as defined above, for the treatment of a disease, in particular an infectious disease, in particular a viral one.
  • This use may respond to one or more of the characteristics described above with reference to the therapeutic use of the cell subpopulation according to the invention.
  • Figure 1 shows flow cytometry images for human CTEACDs present in a population of human blood mononuclear cells (PBMC) from an immunized individual who has been infected with influenza virus in the past.
  • PBMCs were stimulated in culture with influenza antigen (heat-killed influenza vaccine), then labeled with the antibodies monoclonals directed against the indicated cell surface markers, cytokines and lytic molecules.
  • influenza antigen heat-killed influenza vaccine
  • the different windows represent respectively: a/ all of the human blood mononuclear cells (PBMCs); b/ individual cells, not aggregated together; c/ living cells; d/ lymphocytes; e/ CD8+ T lymphocytes; f/ effector CD8+ T lymphocytes; g/ effector CD8+ T lymphocytes which produce the lytic granules Granzyme B and IFN- ⁇ (96.4%).
  • PBMCs human blood mononuclear cells
  • individual cells not aggregated together
  • c/ living cells d/ lymphocytes; e/ CD8+ T lymphocytes; f/ effector CD8+ T lymphocytes; g/ effector CD8+ T lymphocytes which produce the lytic granules Granzyme B and IFN- ⁇ (96.4%).
  • FIG. 2 represents a graph showing, for an immunological analysis by ELISPOT measuring the number of cells secreting IFN-gamma, the immunological characterization of the functionality of human blood mononuclear cells (PBMCs) and of human CTEACDs isolated from these stimulated PBMCs with the influenza antigen, from two different convalescent donor individuals who have been infected with the influenza virus in the past (donor 1 and donor 2).
  • PBMCs human blood mononuclear cells
  • CTEACDs isolated from these stimulated PBMCs with the influenza antigen
  • FIG. 3 represents a graph showing, as a function of time, the % cell viability of human CTEACDs isolated from human blood mononuclear cells obtained from an individual having been infected with the influenza virus in the past and having developed immunity against this virus, stimulated with the influenza antigen, day 0 corresponds to the day of isolation of the CTEACDs after their production.
  • FIG. 4 represents a graph showing the % cell viability in vitro for human HEK293 cells (“HEK”) and canine MDCK cells (“MDCK”) infected with the H1 N1 virus, 7 days after infection with 10 3 or 10 5 infectious particles, the cells having been cultured alone ("10 3 H1 N1", “10 5 H1 N1") or in the presence, from 2 days after infection, of human CTEACDs isolated from blood mononuclear cells from an individual who has been infected with the influenza virus in the past and who has developed immunity against the virus, stimulated with the influenza H1 N1 antigen (“10 3 H1 N1 + CTEACD”, “10 5 H1 N1 + CTEACD”); "Control” represents uninfected cells cultured alone and "CTEACD” represents uninfected cells co-cultured with CTEACDs.
  • HEK human HEK293 cells
  • MDCK canine MDCK cells
  • FIG. 5 represents graphs showing the % of cell viability in vitro for human HEK293 cells in A/ and canine MDCK cells in B/, these cells having been transfected to express the S, M, N and E antigens of SARS-Cov2, the transfected cells having been cultured for 48 h alone ("T") or in the presence, from 2 days after transfection, of Human CTEACDs isolated from human blood mononuclear cells from an individual convalescing from Covid-19 (after in vitro culture and antigenic stimulation), at a rate of 25,000 CTEACDs (“T + 25,000 CTEACD”) or 50,000 CTEACDs (“T + 50000 CTEACD >>);”NT + 25000 CTEACD” and "NT + 50000 CTEACD” represent non-transfected cells cultured for 48 hours in the presence of human CTEACDs isolated from human blood mononuclear cells from an individual convalescing from Covid-19 (after in vitro culture and antigenic stimulation), at a rate of
  • Example 1 Production and isolation of a cell subpopulation containing human CTEACDs specific for an influenza antigen
  • the concentration/quantity of cells in the cell suspension obtained is determined by counting on a Malassez cell. For this purpose, 10 ⁇ l of cell suspension are mixed with 10 ⁇ l of previously filtered trypan blue, and the mixture is transferred into the Malassez chamber. The counting is carried out under a microscope on 5 independent squares taken at random and the total is divided by 5. Since each square represents 0.01 pL, the number of cells per square is multiplied by 10 5 to obtain the number of cells per mL according to the following formula:
  • PBMC cells 10 million fresh PBMC cells recently isolated or thawed are introduced into a 15 ml conical polypropylene tube.
  • the cells are centrifuged at 1500 rpm, at room temperature, for 10 min and the supernatant decanted.
  • the cells are resuspended in 5 ml of AIM-V® (unstained cells). 1 ml of cells are aliquoted into 3 wells of a 96 deep well plate and 0.5 ml of cells are aliquoted into 4 wells of the plate.
  • concanavalin A Con-A at 2 pg/ml
  • Vaxigrip inactivated quadrivalent split-virion influenza vaccine for injection containing 2 type A strains (H1 N1 and H3N2) and 2 type B strains (Yamagata and Victoria lines), at a rate of 15 mg of hemagglutinin for each strain.
  • the plate is placed in a cell culture incubator for 48-72 h at 37°C, 5% CO2. The cells are then used for the purification of the CTEACDs.
  • Magnetic microbeads grafted with an anti-CD45RO antibody (Miltenyi, ref. 130-046-001)
  • Magnetic microbeads grafted with an anti-CD27 antibody (Miltenyi, ref. 130-051-601)
  • LUNA-FL® automated fluorescence cell counter Dutscher 5 ml polystyrene collection tubes SIMPT415-6 (VWR) MidiMACS® separator (Miltenyi Biotec)
  • the number of cells in each well is determined using the fluorescence cell counter as described previously.
  • the cell suspension is centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is aspirated completely and discarded.
  • the cell pellet is resuspended in 80 ⁇ L of buffer A (solution containing phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.2; 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA) for 10 7 cells.
  • buffer A solution containing phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.2; 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA) for 10 7 cells.
  • 20 ⁇ l of suspension of CD45RO microbeads are added for 10 7 cells. All is mixed and incubated for 15 min at 4°C.
  • the cell pellet complexed with the microbeads is resuspended in 2 ml of buffer A.
  • the LS column is placed in the magnetic field of the MidiMACS® separator. It is prepared by rinsing with 3 mL of buffer A, then the cell suspension is deposited on the column. The unlabeled cells which pass through the column are collected and the cells complexed with the microbeads retained by the column are washed with an appropriate quantity of buffer A. The fraction obtained is called (-)CD45RO. Three column washing steps are carried out successively, each with 3 ml of buffer A.
  • the fractions obtained successively are called, respectively: (-)CD45RO/W1, (-)CD45RO/W2, (-)CD45RO/W3 (these fractions will allow to recover more (-)CD45RO cells if they were not completely collected in the first fraction named (-)CD45RO).
  • the column is removed from the separator and placed on an appropriate collection tube. 3 ml of an appropriate buffer (# 130-091 -222) delivered with the separation kit, are deposited on the column then the magnetically labeled cells are quickly released by firmly pushing the plunger into the column.
  • the fraction obtained is called (+)CD45RO and makes it possible to evaluate, with the negative fraction, the yield of the purification.
  • a new column is prepared.
  • the cell number of the unlabeled (-)CD45RO cell fraction is determined.
  • This suspension of (-)CD45RO cells is centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is completely eliminated.
  • the cell pellet is resuspended in 80 ⁇ l of buffer A for 10 7 cells (as indicated above).
  • 20 ⁇ l of CD27 microbeads are added for 10 7 cells.
  • the whole is mixed and then incubated for 15 min at 4°C.
  • the cells are washed by adding 2 ml of buffer A for 10 7 cells, then, after centrifugation at 300 g for 10 min, the cell pellet is resuspended in 2 ml of buffer A. Magnetic separation of the cells is carried out.
  • (+)CD27 cells and cells of the (-)CD27 fraction are placed in the magnetic field of the MidiMACS® separator.
  • the column is prepared by rinsing with 3 ml of buffer then the cell suspension (-)CD45RO is applied to the column and the unbound fraction called (-)CD45RO/(-)CD27 is collected. It corresponds to a population of CTEACDs containing CTEACDs specific for the influenza antigen.
  • the column is washed with 3 x 3 mL of buffer and the fractions which are obtained successively are named, respectively: (-)CD45RO/(-)CD27/W1, (-)CD45RO/(-)CD27/W2, (-) CD45RO/(-)CD27/W3 (these fractions will allow to recover more (-)CD45RO/(-)CD27 cells if they were not completely collected in the first fraction named (-)CD45RO/(-)CD27) ).
  • the column is removed from the separator and placed on an appropriate collection tube. 3 ml of buffer are placed on the column, then the magnetically labeled cells are quickly rinsed by pushing the plunger firmly into the column. The fraction obtained is called (-)CD45RO/(+)CD27.
  • the protocol of the experiment is as follows. Polychromatic flow cytometry is performed using a BD® LSR-II cytometer with 3 laser beams and analysis of the data obtained after acquisition is performed with FlowJo software.
  • the PBMCs cells are cultured in serum-free AIM5 culture medium in 96-well plates with deep wells at a density of 2 ⁇ 10 6 per mL, then stimulated with the antigens as indicated for the ELISPOT.
  • the cells are incubated for 5 days at 37°C, 5% CO2 and saturated humidity in a cell culture incubator.
  • the cells are restimulated for 6 hours in the presence of costimulation antibodies CD28 (BD, Clone CD28.2) and CD49d (BD, Clone 9F10) (BD Biosciences, France) and Brefeldin A (Invitrogen® 00-4506-51 ).
  • the cells are then rinsed with 1xPBS+1%BSA and incubated for 30 min at room temperature with a combination of cell surface labeling antibodies (Pacific Blue® anti-CD3 (BD, Clone SP34-2), APC-H7 anti-CD8 (SK1), anti-CD4 PE (BD, Clone L200), anti-CD45RA APC (BD, Clone 5H9), anti-CD197 FITC (BD, Clone 150503).
  • the cells are rinsed with 1xPBS+1%BSA, then the cells are fixed and permeabilized by incubation for 15 min at room temperature in 2 mL of BD Cytofix/Cytoperm® solution diluted 1x. The cells are rinsed for 5 min with the BD Perm/Wash solution then intracellular labeling is carried out with the monoclonal antibodies PE-Cy®7 anti-IFN-y (BD, Clone B27) and Alexa Fluor® 700 anti-Granzyme B ( BD, Clone GB11).
  • the cells are rinsed with 1xPBS+1%BSA, then the cell pellets are re-suspended in 250 mL of 1% paraformaldehyde in 1xPBS and then stored in the dark at 4°C until acquisition by LSR-II.
  • the cells are acquired with a flow cytometer and selected according to their particle size and size (prodiffusion and lateral diffusion) corresponding to the lymphocytes (FSC/SSC), then to the EMA- , CD3+, high CD4+ and high CD8+ populations (>100,000 events).
  • the result of flow cytometry analysis is shown in Figure 1.
  • CD8+ T cells of the human CTEACDs present in the PBMC cells of the subject having been infected with influenza and vaccinated against influenza several times, and which have been stimulated in culture with the antigen, are composed of more 98% effector cells. More than 96% of CTEACDs T CD8+ cells are Granzyme B+ and 40% also secrete IFN-gamma.
  • the protocol of the experiment is carried out as follows. Two hundred and fifty thousand PBMCs or CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] from donors 1 and 2 are inoculated in triplicate into wells of a 96-well plate of a human IFN-gamma ELISA kit (Mabtech) in a final volume of 200 mL, then stimulated with 15 mL of the antigens contained in the VaxiGripTetra influenza vaccine, overnight in a cell culture incubator. Negative (cells not stimulated with the antigen) and positive (cells stimulated with ConA) controls are used in parallel.
  • the secondary antibody biotinylated human 7-B6-1, anti-INF- ⁇
  • the substrate Streptavidin-ALP alkaline phosphatase
  • the plates no longer containing cells are rinsed 5 times with 200 ⁇ l PBSxl per well, then drained on clean absorbent paper.
  • CTEACDs (10 6 (-)CD45RO/(-)CD27 cells/well) are cultured in suspension in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum in wells of a 12-well plate, then incubated in a cell culture incubator (37°C, 5% CO2 and saturated humidity). At different postincubation times, fractions (20 ml) are taken for measuring cell viability. The cell viability is measured using a Luna® cell counter, for three days after the end of the purification step. Day 0 corresponds to the day of isolation and culturing of the CTEACDs.
  • the main objective of this experiment is to evaluate the effectiveness of CTEACDs isolated from the blood of a convalescent donor who has been infected with the influenza virus and who has been vaccinated against this virus in the past, in recognizing and cytolysing the cells infected with the H1 N1 virus in vitro.
  • Human HEK-293 cells and canine MDCK cells, known for their susceptibility to Influenza viruses, are used for this experiment.
  • These cells cultured in DMEM medium with 10% fetal calf serum are seeded in 24-well plates at a rate of 10 4 cells per well, and in 6-well plates at a rate of 10 6 cells per well.
  • the cell monolayers are inoculated with the H1 N1 virus (with 10 3 (for the cells in the 24-well plate) and 10 5 (for the cells in the 6-well plate) infectious particles of the virus), at a multiplicity of infection of 0 ,1, then they are either maintained as they are, or co-cultured 48 h after infection with (-)CD45RO/(-)CD27 CTEACDs prepared as indicated above.
  • the cells are analyzed after 5 days of culture using the Abeam ab112118 cytotoxicity test kit, in order to determine the cell viability rate.
  • control controls of uninfected cells (“control”) and of uninfected cells co-cultured with the CTEACDs (“CTEACD”) are also produced.
  • plasmids are introduced into the competent bacterial strain E coli JM109 by conventional transformation using the protocol provided by Promega.
  • the bacteria carrying the plasmids are selected by culture in a selective medium containing 100 mg/ml of ampicillin.
  • the recombinant bacteria carrying the plasmids are amplified in cultures of liquid LB medium (1 L) supplemented with 100 mg/mL of ampicillin and cultured for 24 h at 32° C. with shaking. Plasmid DNA extraction is performed using a Maxiprep kit (Macherey Nagel) and the exact protocol delivered with the kit.
  • the concentration of the isolated DNAs is determined by spectrophotometric reading at a wavelength of 260 nm.
  • the DNAs are transfected into HEK-293 and MDCK cells using a commercial kit (TransIT®, Mirus/Euromedex) and the MIR 5404 kit protocol. A DNA mixture containing 1.25 mg of each of the 4 plasmids is used for each transfection. At 24 h post-transfection, the transfected cells are dissociated and inoculated at the rate of 200,000 cells per well in triplicate in a 24-well cell culture plate.
  • the cell triplicates (HEK-293 and MDCK) are cocultured either with 25,000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] or with 50,000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] isolated (as described above) from the peripheral blood of a donor convalescing from Covid-19 for 4 months.
  • This donor was such that the mononuclear cells contained in his peripheral blood had a very high proportion of SARS-CoV-2 specific cells which secrete IFN- ⁇ (> 3500/10 6 PBMCs), determined by an ELISPOT test.
  • the cells are examined for the proportions of survival and cytolysis. The results of this analysis are reported in Figure 5. These results confirm the high efficiency of cytolysis of cells expressing SARS-CoV-2 antigens by anti-Covid CTEACDs.
  • CTEACDs are produced from mouse spleen cells, according to the following protocol.
  • Concanavalin A (ConA) (Thermo Fisher, ref 00-4978-03)
  • Vaxigrip Tetra vaccine (Sanofi Pasteur)
  • mice 8-week-old C57BI6 mice (2 groups of 4 mice) from the Janvier establishments and housed in the LBFA/UGA animal complex are immunized by intramuscular injection with 1/100th (0.5 ml of the vaccine in 49.5 ml of PBSxl) of a human vaccine dose of the VaxigripTetra commercial vaccine for group 1.
  • the mice of group 2 are immunized with a mixture of the 4 structural proteins (S, M, N and E) at the rate of 0.5 mg of each proteins in a final volume of 100 mL of 1xPBS.
  • the mice are put into deep sleep (anesthesia) with isoflurane vapor.
  • the spleens of the mice are isolated aseptically and directly transferred to Falcon® tubes containing 7 ml of RPMI medium and kept on ice. The spleens are then placed between a sterile blade/coverslip and then minced. The splenocytes are collected in 5 ml of RPMI medium supplemented with 10% FCS. After centrifugation for 10 min at 300 g at 4° C., the splenocytes are washed with 5 mL of 1x PBS + 5 mM ETDA solution.
  • the splenocytes are treated for 2 min with an erythrocyte lysis solution (BD Biosciences) to eliminate the red blood cells. After centrifugation for 5 min at 300 g at 4°C, the cells are counted in the presence of trypan blue using the LUNA-FL® cell counter. Splenocyte stimulation
  • ConA is used to stimulate splenocyte proliferation, as a positive control.
  • the VaxigripTetra vaccine containing influenza antigens, is used to stimulate the differentiation of T cells into CTEACDs.
  • 3 pL of a solution of ConA (in PBSxl) at 1 pg.mL' 1 , 15 pL of VaxigripTetra antigen vaccine solution or 2 mL of the mixture (S+M+N+E) of recombinant structural proteins of SARS- CoV-2 are added to 3 mL of a cell suspension (2 ⁇ 10 7 cells/mL) in RPMI+10% FCS. Cell suspensions are transferred to polystyrene tubes and incubated for 3 days at 37°C in a cell culture incubator under CO2 atmosphere.
  • the number of cells is determined using the fluorescence cell counter. After centrifugation of the cell suspension at 300 g for 10 min, the supernatant is completely eliminated. Up to 10 7 nucleated cells are resuspended with 45 ⁇ l of buffer (PBS pH 7.2+0.5% bovine serum albumin+2 mM EDTA). 5 ⁇ l of the anti-KLRG1-Biotin antibody are added, mixed and incubated for 10 min in the dark at 4°C. The cells are washed by adding 2 ml of buffer and centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is completely aspirated. This washing step is repeated. The cell pellet is resuspended in 80 ⁇ L of buffer.
  • This cell suspension is centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is completely aspirated and the cell pellet is resuspended, at the rate of up to 10 7 nucleated cells per 100 ⁇ l of buffer. Add 10 ⁇ l of mouse/human anti-CD27 antibody, mix and incubate 10 min in the dark at 4°C. The cells are washed by adding 2 ml of buffer and centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is completely aspirated and then the washing step is repeated. The cell pellet is resuspended in 80 ⁇ l of buffer, and 20 ⁇ l of anti-biotin magnetic microbeads are added for 10 7 cells. After mixing, incubate for 15 min at 4°C.
  • the cells are washed by adding 2 ml of buffer per 10 7 cells and centrifuged at 300 g for 10 min. The supernatant is completely aspirated and the cell pellet is resuspended in 2 mL of buffer.
  • the LS column is placed in the magnetic field of the MidiMACS® separator. The LS column is prepared by rinsing it with 3 mL of buffer. The cell suspension is applied to the column and the unbound cell fraction is collected. It contains CTEACDs (+)KLRG1/(-)CD27 cells.
  • mice 4 groups of BALB/c mice were infected with the H1 N1 influenza virus (20,000 infectious particles in 20 ml) via the intranasal route.
  • CTEACDs [(+)KLRG1/(-)CD27] from C57BL/6 mice not immunized with VaxiGripTetra (Group 2, 10 5 CTEACDs/ mouse).
  • CTEACDs [(+)KLRG1/(-)CD27] from C57BL/6 mice having been previously immunized against influenza as described above were transferred to two other groups by intraperitoneal injection. (Group 3, 5 ⁇ 10 4 CTEACDs/mouse and Group 4, 2.5 ⁇ 10 5 CTEACDs/mouse).
  • mice After 4 to 5 days, in Group 1, 3 out of 7 mice died and the 4 others, being in a very deteriorated state due to infection by H1 N1 , were euthanized.
  • the state of health of the mice of Group 2 to which were administered CTEACDs of normal mice deteriorated 5 to 6 days after infection with H1 N1. These diseased mice were euthanized on day 6 postinfection. Conversely, all mice in Group 3 and Group 4 remained alive for more than 6 months without showing any clinical signs.
  • mice were inoculated with 250,000 CTEACDs from C57 BL/6 mice immunized against influenza as previously described.
  • Group 1 mice were kept as controls, group 2 mice received 2 injections with an interval of 10 days, group 3, 4, 5 and 6 mice received received 3, 4, 5 and 6 injections respectively at 10-day intervals.
  • the animals were kept under observation for at least 3 months after the last injection. The results showed no abnormalities or disturbances during follow-up. Indeed, no loss of weight, appetite or hair was observed. All animals remained active and showed no difference with the group of control mice.
  • Example 4 In vivo study of the ability of murine CTEACDs specific for a SARS-CoV-2 antigen to treat mice infected with SARS-CoV-2
  • mice were immunized against SARS-CoV-2 with a vaccine composed of the inactivated SARS-CoV-2 virus (Obtained from BEI Resources, USA) killed by heat (65° C., 30 min). Each mouse received intramuscularly 50 ⁇ l of the vaccine diluted 50 times in saline solution (1 ⁇ PBS), then a booster under the same conditions 2 weeks later. Splenocytes were isolated from immunized mice 2 months after the boost and cultured for 48 h in the presence of SARS-CoV-2 antigens (obtained from BEI Resources, USA). The CTEACDs were then isolated and used in anti-Covid therapy in infected mice.
  • mice In the absence of the existence of a natural mouse model for SARS-CoV-2, the K18 hACE-2 transgenic mouse model was used. These mice express the human hACE-2 receptor in all cells of the body and become susceptible to infection by the virus.
  • mice Two groups of eight K18 hACE-2 mice were infected with the delta strain of the SARS-CoV-2 virus (5x10 3 infectious particles per mouse) intranasally, then one of the two groups was treated with approximately 50,000 CTEACDs obtained as described above by the intravenous route. 2 control mice received virus-free PBS. At 6 days, all the untreated infected animals and 2 animals of the treated group were euthanized because of the deterioration of their state of health. At least 60% of mice infected and treated with CTEACDs survived on day 7 and 40% on day 8 (the last day of the protocol).
  • the first step consists in generating adherent antigen-presenting cells (APC) then loading them with antigens so that they present them via the MHC and finally putting them in coculture with the non-adherent cells containing the T lymphocytes for the make them antigen-specific.
  • APC adherent antigen-presenting cells
  • Cord blood mononuclear cells were purchased from Stemcell Technologies. Cell culture media were purchased from Eurobio and Fisher Technologies.
  • RPM1 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (R10 medium) is preheated to 37° C. in a water bath.
  • FCS fetal calf serum
  • RVC fetal calf serum
  • the cell suspension is then transferred drop by drop into a sterile 50 mL conical tube containing 10 mL of preheated medium.
  • the suspension is then homogenized and centrifuged at 1500 rpm for 10 min at room temperature.
  • the cell pellet is re-suspended in R10 medium at 2 ⁇ 10 6 /ml then inoculated into the wells of a 12-well plate at the rate of 1 ml/well and incubated for 4 h at 37° C. under cell culture conditions .
  • the non-adherent cells remaining in suspension are harvested and cryopreserved in a medium composed of 90% FCS supplemented with 10% DMSO.
  • the cells adherent to the plastic are cultured in 1 mL of R10 medium supplemented with cytokine GM-CSF (800 LJ/mL) and IL-4 (500 U/mL). After 3 days of culture, half (0.5 mL) of the medium is replaced with fresh R10 medium containing GM-CSF and IL-4. On day 6 of the culture, half (0.5 mL) of the medium is replaced with medium containing 500 U of IL-4 and 60 ng of TNF- ⁇ .
  • the antigen influenza or inactivated SARS-CoV-2
  • the cells are incubated for 18 to 24 h before removing the medium and rinsing the cells with fresh R10 medium.
  • the non-adherent cells are removed from liquid nitrogen, incubated in ice and then at 37° C. to thaw them as described above.
  • the cell pellet is resuspended in R10 medium at a rate of 10 6 cells/mL then incubated for 4 h at 37°C.
  • 1 mL of cell suspension is seeded on the monolayers of adherent cells by replacing their culture medium.
  • the coculture is incubated for 3 days then supplemented with IL-2 at the rate of 5 U/mL then incubated for an additional 6 days.
  • This process derives antigen-presenting cells from cord blood and loads them with antigens.
  • the non-adherent cells obtained at the end of the coculture step comprising a population of mononuclear cells comprising antigen-specific T cells with high proliferation capacity, can be used for steps b/ and c/ d a method according to the invention.

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Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de production et d'isolement d'une sous-population de cellules comprenant des cellules T spécifiques d'un antigène lié à une maladie d'intérêt, qui comporte des étapes d'obtention, à partir d'un échantillon biologique humain isolé, d'une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, de culture de ces cellules mononucléées dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant l'antigène, et d'isolement de cellules T spécifiques de l'antigène qui n'expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27. La sous-population cellulaire ainsi obtenue et isolée trouve notamment application pour le traitement de ladite maladie d'intérêt.

Description

CELLULES T EFFECTRICES TERMINALES, PROCÉDÉ POUR LEUR PRODUCTION ET LEUR ISOLEMENT ET LEUR UTILISATION THÉRAPEUTIQUE
La présente invention s’inscrit dans le domaine de la thérapie cellulaire contre les pathologies infectieuses et chroniques, notamment les maladies infectieuses sévères telles que la Covid-19.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la production et l’isolement d’une sous-population de cellules comprenant des cellules T effectrices terminales spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, ainsi que la sous-population de cellules obtenue par un tel procédé. L’invention concerne également l’utilisation thérapeutique d’une telle sous- population cellulaire, et une composition pharmaceutique la contenant.
L’émergence du nouveau coronavirus humain SARS-CoV-2 à l’automne 2019 et l’expansion de son épidémie en pandémie mondiale a révélé la nécessité de disposer de solutions thérapeutiques d’urgence afin d’enrayer rapidement la progression de la pandémie en l’absence de vaccin.
Plusieurs traitements utilisés contre les maladies infectieuses et/ou chroniques ont été repositionnés pour la prise en charge des patients de la Covid-19, comme décrit notamment dans la publication de Mashouri et al., 2021 , Biochem. Pharmacol. 183: 114296. Il s’agit par exemple de la chloroquine et l’hydroxychloroquine, l’azithromycine, l’oméprazole, l’ivermectine, etc. Cependant, les essais cliniques conduits dans de nombreux pays sur les patients infectés n’ont pas été concluants. Les molécules antivirales connues pour être des inhibiteurs de l’ARN polymérase virale, telles que le remdesivir, la ribovirine ou le favipiravir, ont également été testées sans succès. D’autres molécules inhibitrices de la protéase virale, telles que le dolutégravir, le nelfinavir ou le lopinavir, n’ont pas non plus montré d’effets thérapeutiques contre la Covid- 19. Enfin, des inhibiteurs de l’endocytose et de la fusion entre la membrane virale et cellulaire, telles que l’arbidol et l’hydrochloroquine, ont été aussi testés, mais sans succès.
Il en résulte que ni le repositionnement, ni le développement de molécules n’ont montré d’efficacité convaincante contre la Covid-19. Le transfert de plasma de donneurs convalescents qui ont contrôlé et éliminé l’infection par le SARS-CoV-2 a été un des grands espoirs de traitement de première urgence, comme décrit notamment dans la publication de Ghareeb et al., 2021 , J. Pharm. Investig., p1 -16. L’innocuité et l’efficacité du plasma de convalescents de la Covid-19 ont été testées d’abord dans le traitement des patients présentant des symptômes légers à modérés de Covid-19 arrivant aux services d’urgence, afin de prévenir la sévérité de cette maladie causée par le SARS-CoV-2. Par la suite, les autorités sanitaires des Etats-Unis ont délivré une autorisation d’utilisation d’urgence pour traiter les patients hospitalisés atteints de Covid-19 avec du plasma convalescent de personnes qui se sont rétablies du virus. Cependant, cet espoir thérapeutique s’est voué à l’échec pour plusieurs raisons : la quantité de plasma disponible est insuffisante ; les titres d’anticorps neutralisants dans ce plasma sont faibles ; un grand nombre de convalescents perdent les anticorps neutralisants très rapidement.
Enfin, des traitements à base d’anticorps monoclonaux produits artificiellement ont été associés à des résultats encourageants. On peut citer à cet égard le bamlanivimab et le REGN-CoV, anticorps monoclonaux produits respectivement par les sociétés Eli Lilly et Regeneron. Ces anticorps sont conçus pour se fixer directement sur les spicules du virus et bloquer leur interaction avec les récepteurs cellulaires, de sorte à abolir l’infection. Ils sont cependant très coûteux et donc peu accessibles.
Plusieurs études montrent que lors de l'infection par le SARS-CoV-2, la réactivité des lymphocytes T, impliqués dans la réponse immune cellulaire, semble déterminante pour le contrôle de l'évolution de la maladie (Yang et al., 2021 , Clin. Transi. Immunol. 10(3): e1259). Des essais de thérapies cellulaires ont ainsi été réalisés visant à stimuler les réponses immunes cellulaires.
La première stratégie proposée par l’art antérieur concerne l’utilisation des cellules souches issues de sang de cordon ou de placenta comme sources capables de stimuler l’immunité chez les patients infectés.
La seconde stratégie concerne la réimplantation de cellules T autologues du patient (CAR/TCR-T). Cette technologie consiste à modifier ex vivo les cellules T du patient à l’aide de récepteur à l’antigène chimérique. Ces cellules T modifiées reconnaissent spécifiquement les cellules exprimant les antigènes et les éradiquent par cytolyse. Cependant, outre la lourdeur de la mise en place de cette technologie pour une application à large échelle, elle est aussi associée à des effets secondaires très importants représentés essentiellement par le syndrome de libération de cytokine, qui correspond à une réaction sévère des réponses immunitaires.
Un intérêt a par ailleurs été porté sur l’utilisation des cellules T de l’immunité de donneurs convalescents. En effet, plusieurs études ont révélé que contrairement aux anticorps neutralisants qui tendent à disparaître rapidement dans le sang périphérique chez les patients convalescents de la Covid-19, les cellules T spécifiques du virus persistent plus longtemps et peuvent être amplifiées en culture in vitro. Cependant, l’utilisation des cellules T spécifiques du virus en transfert adoptif d’immunité se heurte aux problèmes liés aux effets secondaires associés au syndrome des réponses immunitaires du greffon contre l’hôte ("Graft versus host" : GVH), entraînant des maladies très graves. Pour espérer une chance de succès, les donneurs et les receveurs doivent posséder une compatibilité préalable de leurs antigènes des leucocytes humains (HLA). Ceci limite fortement et alourdit le processus thérapeutique.
La publication de Cooper et al., dans Frontiers in Immunology, 2021 , 11 , Article 598402, décrit une population de cellules T humaines spécifiques de la SARS- CoV-2 dérivées de donneurs convalescents, comprenant des cellules T terminales effectrices à mémoire exprimant le marqueur CD45RA (TEMRA). La publication de Neidleman et al., dans Cell reports Medicine, 2020, 1 :100081 , décrit une population cellulaire contenant des TEMRA.
La présente invention vise à proposer une solution pour le traitement thérapeutique de la Covid-19, et plus généralement des maladies infectieuses, notamment virales, et/ou des maladies chroniques, qui présente une bonne efficacité, qui soit simple et rapide à mettre en oeuvre, et qui ne soit pas associée à des effets secondaires pouvant entrainer la mort du patient, notamment à des maladies du type du rejet du greffon et des réponses immunes du greffon contre l’hôte.
A cet effet, les présents inventeurs se sont intéressés à un type de cellules T particulier, plus précisément les cellules T effectrices à différenciation terminale, également nommées « cellules T effectrices terminales ». Ces cellules, qui se caractérisent notamment par une très courte durée de vie, de l’ordre de quelques jours, plus précisément inférieure ou égale à cinq jours, seront désignées dans la présente description, pour plus de commodité, par le sigle CTEACDs (pour Cellules T Effectrices A Courte Durée). Les CTEACDs se distinguent notamment des TEMRA par l’absence de l’expression à leur surface du marqueur CD45RO. Alors que les TEMRA sont CD45RA+/CD45RO|O/CD27-, les CTEACDs sont CD45RAVCD45RO7CD27- . Les CTEACDs sont notamment dotées des fonctions effectrices les plus élevées et de la durée de vie la plus courte par rapport à tous les autres types de cellules, y compris les TEMRA.
Les présents inventeurs ont découvert que de telles cellules spécifiques d’une maladie, après avoir été traitées in vitro d’une manière spécifique, de par leur cytotoxicité, sont capables de reconnaître les cellules atteintes par cette maladie et de les éliminer rapidement de l’organisme. En particulier, il a été découvert par les présents inventeurs que : plus de 95 % de telles CTEACDs d’origine humaine de type CD8+ sont granzyme B+ et plus de 40 % d’entre elles sécrètent également l’IFN-gamma ; et plus de 50 % de telles CTEACDs d’origine humaine de type CD4+ sont granzyme B+ et plus de 40 % d’entre elles produisent l’IFN- gamma. De telles CTEACDs présentent ainsi toutes les caractéristiques de cellules effectrices cytotoxiques armées pour éradiquer les cellules infectées, si bien que la mise en oeuvre de telles cellules dans un traitement par thérapie cellulaire curative permet de combattre efficacement la maladie, et ce de manière tout à fait inattendue étant donné la courte durée de vie qui les caractérise, de l’ordre de 3 à 5 jours en culture cellulaire. Cette courte durée de vie évite par ailleurs avantageusement, après introduction de ces cellules dans l’organisme, les effets secondaires indésirables tels que les réactions de rejet connues sous le nom de maladie du greffon contre l’hôte. Ces cellules T spécifiques sont en outre simples et rapides à produire et purifier, si bien qu’elles constituent un actif thérapeutique facile d’accès.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de production et d’isolement d’une sous-population de cellules comprenant des cellules T spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, plus précisément d’une population de cellules comprenant des cellules T effectrices terminales (CTEACDs) se caractérisant par un caractère cytotoxique et une courte durée de vie, spécifiques de cet antigène.
Ce procédé comporte des étapes de :
- a/ à partir d’un échantillon biologique humain isolé, obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération,
- b/ culture desdites cellules mononucléées pendant 24 à 72 heures dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant ledit antigène, de sorte à provoquer la différenciation des cellules T effectrices à mémoire, pour produire des cellules T effectrices terminales, de préférence dans des conditions permettant de maximaliser la production de ces dernières,
- et c/ isolement du milieu de culture de cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27.
Ces cellules T spécifiques de l’antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 sont très majoritairement des CTEACDs, dont une large proportion sont spécifiquement dirigées contre les cellules pathologiques associées à la maladie d’intérêt. Etant donné que les cellules T effectrices sécrétant les cytokines et accumulant les molécules lytiques (Granzyme B) qui résultent d’une re-stimulation antigénique in vitro sont majoritairement spécifiques de l’antigène, la sous-population cellulaire obtenue à l’issue de l’étape c/ d’isolement, répondant au phénotype (CD45RO7CD27 ) est composée d’au moins 50 %, et même d’au moins 60% (en nombre) de cellules CTEACDs spécifiques de l’antigène. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention dans lesquels le procédé comprend une étape de purification des cellules spécifiques de l’antigène, réalisée, de manière classique en elle-même, avant ou après l’étape c/, la sous-population cellulaire obtenue à l’issue du procédé peut contenir au moins 90 % de CTEACDs spécifiques de l’antigène, voire consister en, c’est-à-dire contenir uniquement, des CTEACDs spécifiques de l’antigène. De telles cellules présentent, administrées à un sujet atteint de la maladie d’intérêt, dans le cadre d’un traitement de la maladie par thérapie cellulaire, la capacité de reconnaître les cellules pathologiques et de les éliminer rapidement de l’organisme. Elles ne provoquent en outre chez ce sujet aucune réaction indésirable, notamment du type de rejet du greffon, susceptible d’entrainer sa mort. En outre, une administration répétée de telles cellules à un individu n’a nullement pour effet d’induire l’apparition de la maladie associée, ce qui permet avantageusement d’en envisager l’utilisation pour le traitement de maladies chroniques.
Le procédé selon l’invention est avantageusement simple et rapide à mettre en oeuvre.
Il peut comprendre une étape préalable d’identification, pour une maladie d’intérêt visée, d’un antigène lié à cette maladie, contre lequel les cellules T produites dans l’organisme vont être spécifiquement dirigées, et qui sera mis en oeuvre dans le cadre du procédé, pour l’étape b/ de culture cellulaire. L’homme du métier pourra, pour une telle identification, se référer à la littérature publiée sur le sujet, ou procéder de manière empirique.
A titre d’exemple, pour la maladie Covid-19, un antigène associé est, comme indiqué ci-avant, le virus SARS-CoV-2 ; le virus H1 N1 est un antigène associé à la grippe ; la protéine de la myéline basale est un antigène associé à la sclérose en plaque ; dans le cadre des cancers, on connaît également par exemple les néoantigènes associés au développement tumoral ou les antigènes spécifiques de tumeur (AST). Dans le cas de l’auto-immunité, il se produit une surexpression d’antigènes libres et/ou associés aux cellules qui déclenchent des réactions immunitaires.
L’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier.
On entend dans la présente description, par cellules T à forte capacité de prolifération, de manière classique en elle-même, des cellules T qui sont capables d’effectuer au moins une à deux divisions par 24 heures. De telles cellules T sont notamment des cellules T effectrices à différentiation terminale et des cellules T effectrices à mémoire.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, l’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène, à forte capacité de prolifération, comprend l’identification / la sélection d’un échantillon biologique de sang périphérique adulte humain, isolé du corps humain, comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération, et l’isolement de cellules mononucléées à partir de cet échantillon biologique.
L’identification d’un échantillon biologique de sang périphérique humain comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène visé et à forte capacité de prolifération peut être réalisée de toute manière classique en elle- même. Après s’être procuré un échantillon de sang périphérique humain isolé du corps humain, l’homme du métier peut notamment procéder à des tests visant tout d’abord à déterminer si cet échantillon comprend une population de cellules T spécifiques de l’antigène, puis si ces cellules T présentent ou non une forte capacité de prolifération. A cet effet, toutes méthodes classiques en elles- mêmes pour l’homme du métier peuvent être mises en oeuvre.
A titre d’exemple, pour déterminer si un échantillon de sang périphérique humain isolé du corps humain donné contient ou non une population de cellules T spécifiques de l’antigène visé, il peut être mis en oeuvre la technique immunoenzymatique connue sous le nom d’Elispot (pour l’anglais « enzyme- linked immunospot »), méthode utilisée de manière standard pour la mesure de la proportion des cellules effectrices dans une population hétérogène de cellules. Schématiquement, cette méthode consiste à déposer, dans des puits de plaques multi-puits sur les surfaces desquels sont fixés des anticorps spécifiques de cytokines (IL-2, IFN-y ou TNF-a par exemple), l’échantillon à analyser en mélange avec l’antigène cible. En présence de cellules T spécifiques de cet antigène dans l’échantillon, il se produit alors une sécrétion de cytokines, qui sont capturées par les anticorps présents dans les puits. Les spots ainsi formés témoignent de la présence dans l’échantillon de cellules effectrices spécifiques de l’antigène étudié, la proportion ces cellules dans l’échantillon pouvant en outre même être quantifiée. Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer les conditions opératoires exactes de mise en oeuvre de cette technique Elispot pour chaque échantillon de sang périphérique humain et chaque antigène spécifique visés.
Afin de déterminer si la capacité de prolifération de certaines au moins de ces cellules T spécifiques de l’antigène visé présentes dans l’échantillon est ou n’est pas suffisamment forte pour pouvoir utiliser l’échantillon pour la suite du procédé selon l’invention, l’homme du métier peut mettre en oeuvre toute méthode classique en elle-même de déterminer de la cadence de division cellulaire d’une cellule. Cette cadence de division peut par exemple être mesurée soit par un test de prolifération disponible dans le commerce, soit par marquage des cellules avec un colorant vital, notamment l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE, pour l’anglais Carboxyfluorescein succinimidyl ester), suivi par cytométrie en flux de la dilution du colorant suite aux divisions cellulaires se produisant.
L’étape d’isolement de cellules mononucléées de sang périphérique (désignées par l’abréviation PBMCs, pour l’anglais Peripheral Blood Mononuclear Cells) à partir de l’échantillon de sang périphérique humain identifié comme comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération, c’est-à-dire identifié comme adéquat pour servir de base à la mise en oeuvre des étapes du procédé selon l’invention, peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier, par exemple par centrifugation d’un échantillon de sang périphérique humain recueilli sur acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA 5mM) afin d’éviter sa coagulation, et récupération du culot cellulaire obtenu.
La population de cellules mononucléées ainsi isolées obtenues à l’issue de cette étape d’isolement contient typiquement des cellules T effectrices à mémoire spécifiques de l’antigène.
Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l’invention, l’échantillon biologique de sang périphérique humain est un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été atteint au moins une fois par la maladie d’intérêt, et se trouvant de préférence en phase de convalescence, c’est-à-dire quelques jours à quelques mois après la cessation des symptômes de la maladie. Un tel échantillon est hautement susceptible de contenir une forte proportion de cellules T spécifiques de l’antigène associé à la maladie et à forte capacité de prolifération, ayant été produites par l’individu en réaction à la contraction de la maladie.
Autrement, l’échantillon biologique de sang périphérique humain peut par exemple être un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été immunisé contre la maladie, par vaccination (cet individu pouvant également, le cas échéant, avoir contracté la maladie avant et/ou après l’administration du vaccin). Dans des modes de réalisation alternatifs de l’invention, l’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération peut être réalisée in vitro à partir d’un échantillon biologique de sang de cordon ombilical d’un individu quelconque, c’est-à-dire d’un individu n’ayant pas forcément contracté la maladie et/ou été immunisé contre la maladie. Cette étape comprend alors, réalisée de manière classique en elle-même, l’obtention, à partir d’un tel échantillon, de cellules dendritiques adhérentes au plastique et leur mise en culture avec un antigène correspondant à la maladie visée, selon un protocole décrit dans la littérature (Abbasian et al., Immunobiology, 2006, 108: 203 ; Bedke et al., J. Immunol. Methods, 2020, 477: 112703). Ces cellules présentent l’antigène à leur surface par les complexes majeurs d’histocompatibilités (CMH). La mise en coculture de ces cellules avec les cellules non-adhérentes extraites du même échantillon, contenant les lymphocytes T, permet alors l’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération et de différenciation, aptes à générer des cellules effectrices terminales dans l’étape b/ du procédé selon l’invention.
Un tel mode d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération est notamment particulièrement adéquat lorsque la maladie visée n’est pas une maladie infectieuse virale, mais une maladie chronique, un cancer ou une maladie auto-immune, pour lesquels le sang périphérique des individus convalescents ne comporte pas ou peu de cellules T à forte capacité de prolifération.
L’étape b/ du procédé selon l’invention, de culture des cellules mononucléées obtenues à partir de l’échantillon biologique, notamment d’un échantillon biologique de sang périphérique humain, en présence de l’antigène, permet avantageusement de produire des CTEACDs, dont une proportion majoritaire sont spécifiques de cet antigène, par différenciation in vitro des cellules T effectrices à mémoire présentes dans la population de cellules mononucléées mises en oeuvre.
Il entre dans les compétences de l’homme du métier de choisir un milieu de culture cellulaire adéquat pour cette culture. A titre de tel milieu de culture, on peut citer par exemple le milieu commercial RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), notamment supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 1% de solution de pénicilline/streptomycine, 1 % de tampon HEPES et 1 % de glutamine. Un autre exemple de tel milieu de culture cellulaire est le milieu sans sérum commercialisé sous la dénomination AIM-V® par la société Gibco.
Les cellules peuvent cultivées dans un incubateur pour culture cellulaire, de préférence à 37 °C, et préférentiellement sous 5% de CO2 et/ou une humidité saturante.
La concentration d’antigène à appliquer dans le milieu de culture cellulaire dépend de l’antigène particulier mis en oeuvre. Il est du ressort de l’homme du métier de déterminer cette concentration, de sorte à maximaliser la quantité de CTEACDs spécifiques de l’antigène produites à l’issue de l’étape b/ de culture cellulaire. A cet effet, l’homme du métier peut procéder de manière empirique, en testant plusieurs doses d’antigène différentes et en déterminant la dose qui, tout en étant non léthale pour les cellules, permet d’obtenir le plus haut taux de production des CTEACDs. Ce taux de production peut par exemple être déterminé par le test Elispot décrit ci-dessus.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, l’étape b/ de culture des cellules mononucléées est réalisée pendant une durée comprise entre 36 à 60 heures, par exemple pendant une durée d’environ 48 heures. Une telle caractéristique permet avantageusement de produire une quantité importante de CTEACDs tout en assurant que la durée de vie restant à ces CTEACDs à l’issue de cette étape de culture soit la plus longue possible.
L’étape c/ d’isolement du milieu de culture des cellules T effectrices qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier. Elle peut notamment être réalisée par recueil de cellules T effectrices enrichies en cellules T spécifiques de l’antigène contenues dans le milieu de culture, puis chromatographie d’affinité au moyen d’anticorps spécifiques des marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, les cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 étant présentes dans la fraction non liée.
Le recueil des cellules T effectrices enrichies en cellules spécifiques de l’antigène, grâce à la stimulation antigènique préalable, contenues dans le milieu de culture peut par exemple être réalisé au moyen de centrifugation à 3000 t/min à 4°C puis re-suspension du culot dans du tampon phosphate salin.
L’étape suivante d’isolement des CTEACDs du reste des cellules T, c’est-à-dire des cellules T indifférenciées ou non totalement différenciées, tire avantageusement profit du fait que les CTEACDs humaines n’expriment pas à leur surface les marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, glycoprotéines qui sont exprimées par les autres types de cellules T humaines, en particulier par les cellules T à mémoire. La mise en oeuvre d’une étape de chromatographie d’affinité, au moyen d’anticorps anti-CD45RO et anti-CD27, immobilisés sur support solide, permet avantageusement de séparer rapidement et efficacement les CTEACDs des autres sous-populations lymphocytaires du milieu. Le support solide mis en oeuvre à cet effet peut être de tout type classique en lui-même. Il peut notamment s’agir de billes magnétiques sur lesquelles sont greffés ces anticorps, mises en oeuvre au sein d’un système de purification par effet magnétique tel que le système magnétique commercialisé par la société Miltenyi Biotec sous la dénomination MidiMACS®.
Préférentiellement, l’ensemble des étapes du procédé sont réalisées en environnement stérile, et de préférence à une température comprise entre 18 et 20 °C, à l’exception de l’étape b/ de culture cellulaire, qui est quant à elle de préférence réalisée à 37 °C.
Le procédé selon l’invention peut en outre comprendre une étape de séparation des CTEACDs spécifiques de l’antigène contenues dans la sous-population de cellules obtenue.
Un autre aspect de l’invention concerne une sous-population de cellules isolée obtenue par un procédé selon l’invention, c’est-à-dire sous forme d’une sous- population purifiée de cellules T obtenue in vitro ou ex vivo, séparée des autres sous-populations de cellules T par l’étape d’isolement décrite ci-avant, cette sous-population comprenant des cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie (CTEACDs) spécifiques de l’antigène lié à la maladie d’intérêt.
La sous-population cellulaire selon l’obtention, comprenant majoritairement des CTEACDs, peut contenir au moins 50 %, et même 60 % (en nombre) de cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques de l’antigène.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, dépendant des étapes exactes du procédé ayant permis de l’obtenir, et des étapes de purification éventuelles qu’il peut comporter, la sous-population cellulaire selon l’invention peut contenir au moins 90 %, en particulier au moins 95 % (en nombre) de cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques de l’antigène, ou même encore consister en de telles cellules spécifiques de l’antigène lié à la maladie d’intérêt.
Comme indiqué ci-avant, les cellules T effectrices terminales CTEACDs sont caractérisées par un phénotype CD45RAVCD45RO7CD27’ et une durée de vie courte, de l’ordre de quelques jours, en particulier inférieure ou égale à cinq jours. La sous-population cellulaire selon l’invention, contenant au moins 50 % de, ou consistant en, CTEACDs spécifiques de l’antigène, est particulièrement adaptée pour une utilisation en tant que médicament, en particulier pour le traitement de la maladie d’intérêt associée à l’antigène contre lequel ces CTEACDs sont spécifiquement dirigées. Transférées chez le sujet qui développe cette maladie, ces CTEACDs spécifiques de l’antigène éradiquent efficacement les cellules pathologiques, et elles disparaissent dans les 5 jours postadministration, si bien qu’elles ne déclenchent aucune réaction de rejet par l’organisme.
La sous-population cellulaire obtenue par le procédé selon l’invention peut notamment être utilisée pour le traitement d’une maladie d’intérêt de type maladie infectieuse, en particulier d’une pathologie virale, telle que la grippe ou une infection provoquée par un coronavirus, en particulier par un SARS-CoV responsable du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) ou par un MERS- CoV responsable d’une atteinte respiratoire potentiellement sévère (MERS). Cette pathologie peut notamment être la Covid-19, provoquée par le virus SARS- CoV-2.
La sous-population cellulaire obtenue par le procédé selon l’invention peut autrement être utilisée pour le traitement d’une maladie d’intérêt de type maladie chronique non transmissible, telle que le cancer, la sclérose en plaque, etc.
De manière plus générale, la sous-population cellulaire obtenue par le procédé selon l’invention peut notamment être utilisée pour le traitement de toute maladie d’intérêt à laquelle peut être associé un antigène susceptible de provoquer la production par l’organisme humain de lymphocytes T spécifiques.
On entend dans la présente description, par le terme « traitement », l'obtention d’un effet pharmacologique et physiologique souhaité. Le terme « traitement », tel qu’il est utilisé dans la présente description, comprend la guérison partielle ou totale de la maladie et/ou la disparition totale ou partielle d’un ou plusieurs de ses symptômes.
La sous-population cellulaire selon l’invention peut être administrée à tout sujet en ayant besoin, c’est-à-dire atteint ou susceptible d’être atteint par la maladie d’intérêt. Ce sujet peut notamment être un mammifère, et en particulier un humain.
Préférentiellement, la sous-population de cellules selon l’invention est administrée à un sujet en ayant besoin, c’est-à-dire atteint ou susceptible d’être atteint par la maladie, moins de 4 jours, de préférence moins de 3 jours et préférentiellement moins de 2 jours, après sa production, c’est-à-dire après la fin de l’étape b/ de culture cellulaire du procédé selon l’invention mis en oeuvre pour son obtention.
La sous-population cellulaire selon l'invention est administrée au sujet dans une quantité thérapeutiquement efficace. Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend la quantité suffisante pour assurer le traitement de la maladie. Cette quantité dépend de plusieurs facteurs, tels que la maladie et sa gravité, l'âge, le poids, etc., du sujet à traiter, la voie et la forme d'administration, etc. La quantité thérapeutiquement efficace de la sous-population cellulaire utilisée selon l'invention sera déterminée par le médecin pour chaque cas individuel.
L’administration de la sous-population cellulaire selon l’invention au sujet à traiter peut être réalisée par toute voie classique en elle-même dans le domaine de la thérapie cellulaire, les voies parentérales, par exemple la voie sous-cutanée, intradermique, sous-durale, intraveineuse, intramusculaire, intrathécale, intrapéritonéale, intracérébrale, intra-artérielle ou intra-lésionnelle, ou la voie intranasale, étant particulièrement préférées dans le cadre de l’invention.
En particulier, les modes d’administration systémiques sont privilégiés pour le traitement des maladies infectieuses, notamment les modes d’administration par injection, par exemple l’injection intraveineuse. Pour le traitement des maladies chroniques non transmissibles, l’injection intra-tumorale ou l’administration par voie muqueuse, notamment intranasale, seront plus particulièrement privilégiées.
La détermination de la posologie d’administration de la sous-population cellulaire selon l’invention relève des compétences du médecin. La sous-population cellulaire peut notamment être administrée au sujet à traiter à une seule reprise, ou à plusieurs reprises, espacées de quelques jours à quelques semaines.
L’invention s’exprime également dans les termes d’un procédé de traitement thérapeutique d’un sujet souffrant d’une maladie d’intérêt, en particulier d’une maladie infectieuse, notamment virale, ce procédé comprenant une étape d’administration à ce sujet en ayant besoin d’une quantité thérapeutiquement efficace d’une sous-population cellulaire isolée selon l’invention, comprenant des cellules T effectrices terminales à courte durée de vie spécifiques d’un antigène lié à cette maladie d’intérêt. Ce procédé peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation thérapeutique de la sous-population cellulaire selon l’invention en tant que médicament.
L’invention concerne également l’utilisation d’une sous-population cellulaire selon l’invention pour la fabrication d’un médicament, notamment d’un médicament pour traiter les maladies infectieuses, en particulier virales.
Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique contenant une sous-population cellulaire selon l’invention, comprenant des cellules T effectrices terminales à courte durée de vie spécifiques d’un antigène associé à une maladie, en tant que principe actif, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On entend dans la présente description, par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », tout véhicule utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique et qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement indésirable pour le sujet à traiter, en particulier pour les mammifères et notamment les humains.
Le véhicule de la composition pharmaceutique selon l'invention peut être liquide ou semi-solide. Il peut s'agir d'un diluant, d'un adjuvant ou de tout autre véhicule classique en lui-même pour la constitution des compositions pharmaceutiques, par exemple d’un véhicule aqueux, huileux, etc.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique, notamment sous forme adaptée à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse, ou intranasale. A titre d’exemples de telles formes galéniques, non limitatives de l’invention, on peut citer les formes de suspension injectable.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre contenir un ou plusieurs excipients / additifs classiques en eux-mêmes pour la constitution des compositions pharmaceutiques dans le domaine de la thérapie cellulaire, par exemple choisis parmi les stabilisants, les antioxydants, les agents de suspension, les agents isotoniques, les tensioactifs, les ajusteurs de pH, les agents tampons, etc., ou l'un quelconque de leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut en outre contenir un ou plusieurs principes actifs autres que les CTEACDs spécifiques de l’antigène selon l’invention, ces principes actifs pouvant ou non agir de manière synergique avec ces cellules.
La composition pharmaceutique selon l’invention est de préférence formulée sous forme de doses unitaires.
L’invention concerne également l’utilisation thérapeutique d’une composition pharmaceutique selon l’invention, telle que définie ci-avant, pour le traitement d’une maladie, en particulier d’une maladie infectieuse, notamment virale. Cette utilisation peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci- avant en référence à l’utilisation thérapeutique de la sous-population cellulaire selon l’invention.
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 5, dans lesquelles :
La figure 1 montre des images de cytométrie de flux pour des CTEACDs humaines présentes dans une population de cellules mononucléées de sang humain (PBMC) issues d’un individu immunisé ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé. Les PBMC ont été stimulées en culture avec l’antigène de la grippe (vaccin grippal tué par la chaleur), puis marquées avec les anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire, cytokines et molécules lytiques indiqués. Les différentes fenêtres représentent respectivement : a/ la totalité des cellules mononucléées de sang humain (PBMCs) ; b/ les cellules individuelles, non agrégées entre elles ; c/ les cellules vivantes ; d/ les lymphocytes ; e/ les lymphocytes T CD8+ ; f/ les lymphocytes T CD8+ effectrices ; g/ les lymphocytes T CD8+ effectrices qui produisent les granules lytiques Granzyme B et IFN-y (96,4%).
La figure 2 représente un graphe montrant, pour une analyse immunologique par ELISPOT mesurant le nombre de cellules sécrétant l’IFN-gamma, la caractérisation immunologique de la fonctionnalité de cellules mononucléées de sang humain (PBMCs) et de CTEACDs humaines isolées de ces PBMCs stimulées avec l’antigène de la grippe, issues de deux individus donneurs différents convalescents ayant été infectés par le virus de la grippe dans le passé (donneur 1 et donneur 2).
La figure 3 représente un graphe montrant, en fonction du temps, le % de viabilité cellulaire de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé et ayant développé une immunité contre ce virus, stimulées avec l’antigène de la grippe, le jour 0 correspond au jour d’isolement des CTEACDs après leur production.
La figure 4 représente un graphe montrant le % de viabilité cellulaire in vitro pour des cellules humaines HEK293 (« HEK ») et des cellules canines MDCK (« MDCK ») infectées par le virus H1 N1 , 7 jours après l’infection par 103 ou 105 particules infectieuses, les cellules ayant été cultivées seules (« 103 H1 N1 », « 105 H1 N1 ») ou en présence, à partir de 2 jours après l’infection, de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé et ayant développé une immunité contre le virus, stimulées avec l’antigène de la grippe H1 N1 (« 103 H1 N1 + CTEACD », « 105 H1 N1 + CTEACD ») ; « Contrôle » représente des cellules non infectées cultivées seules et « CTEACD » représente des cellules non infectées co-cultivées avec les CTEACDs.
La figure 5 représente des graphes montrant le % de viabilité cellulaire in vitro pour des cellules humaines HEK293 en A/ et des cellules canines MDCK en B/, ces cellules ayant été transfectées pour exprimer les antigènes S, M, N et E du SARS-Cov2, les cellules transfectées ayant été cultivées pendant 48 h seules (« T ») ou en présence, à partir de 2 jours après la transfection, de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu convalescent du Covid-19 (après culture in vitro et stimulation antigénique), à raison de 25000 CTEACDs (« T + 25000 CTEACD ») ou de 50000 CTEACDs (« T + 50000 CTEACD >>) ; « NT + 25000 CTEACD » et « NT + 50000 CTEACD » représente des cellules non transfectées cultivées pendant 48 h en présence des CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu convalescent du Covid-19 (après culture in vitro et stimulation antigénique), à raison respectivement de 25000 CTEACDs et de 50000 CTEACDs.
Exemple 1 - Production et isolement d’une sous-population cellulaire contenant des CTEACDs humaines spécifiques d’un antigène grippal
Toutes les étapes du procédé sont réalisées à 18 à 20 °C, à l’exception de l’étape de culture cellulaire, et en conditions aseptiques.
1 .1/ Isolement et stimulation des PBMCs à partir de sang périphérique humain Matériel
Prélèvements de 30 ml (4 x 7,5 ml) de de sang périphérique de deux donneurs humains sains convalescents ayant été infectés par le virus de la grippe par le passé, dans des tubes à prélèvement Vacutainer® contenant de l’EDTA Tubes UNI-SEP et UNI-SEPMAXI, UNI-SEP+ et UNI-SEPMAXI+ (Eurobio) Solution saline tampon de Hanks (10x) (Eurobio) NaHCOs (Eurobio)
Sérum de veau foetal SVF (Eurobio)
Tampon phosphate salin PBS 1X (Eurobio) acide éthylènediaminetétraacétique EDTA à partir d'une solution mère à 500 mM, pH = 7,8 stérilisé à l'autoclave
Solution de lyse érythrocytaire 10x (BD Biosciences)
Bleu de trypan filtré
Eau distillée stérile
Tubes Falcon® stériles de 50 et 15 ml (Dutscher France)
Centrifugeuse de culture tissulaire Hettich® ROTINA 420 / 420R Milieu de culture cellulaire AIM-V® (Gibco, Fisher)
Isolement des PBMCs
On utilise du sang périphérique d’adulte humain prélevé dans l'EDTA. 25 mL de sang sont dilués avec un volume égal de tampon Hanks 1X + 1% EDTA 0,5M. Le sang dilué est transféré dans un tube UNI-SEP, qui est fermé et centrifugé (à 18-20 °C) à 3000 tr/min pendant 20 min (accélération = 9 / décélération = 0). Les tubes sont retirés de la centrifugeuse et transférés dans un poste de sécurité biologique classe IL La couche de cellules mononucléées est récoltée à l'aide d'une pipette et la suspension cellulaire est transférée dans un nouveau tube Falcon®. Dix ml de plasma riche en plaquettes sont récoltés dans des tubes fermés et stockés à -20 °C. La suspension de cellules mononucléées est diluée avec un volume de Hanks 1x + EDTA 5mM puis centrifugée à 3000 tr/min, à 20 °C pendant 10 min (accélération = 9 / décélération = 9). Le surnageant est éliminé, et le culot de PBMCs est remis en suspension dans 20 mL de solution contenant du PBS 1X et de l’EDTA 5 mM. La suspension est centrifugée à 3000 tr/min, à 20 °C pendant 10 min accélération = 9 / décélération = 9). Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire, contenant les PBMCs, est remis en suspension dans 10 ml de solution contenant du PBS 1 X et d’EDTA 5 mM.
La concentration / quantité de cellules dans la suspension cellulaire obtenue est déterminée par comptage sur une cellule de Malassez. A cet effet, 10 pi de suspension cellulaire sont mélangés avec 10 pL de bleu de trypan préalablement filtré, et le mélange est transféré dans la chambre de Malassez. Le comptage est réalisé sous microscope sur 5 carrés in dépendants pris au hasard et le total est divisé par 5. Etant donné que chaque carré représente 0,01 pL, le nombre de cellules par carré est multiplié par 105 pour avoir le nombre de cellules par mL selon la formule suivante :
Concentration (cellules / ml) = (nombre de cellules x 105) x 2 / 5
La congélation des cellules est réalisée comme suit : centrifugation de la suspension cellulaire à 3000 tr/min, 20 °C pendant 10 min (accélération = 9 / décélération = 9) ; élimination du surnageant ; remise en suspension dans X mL de milieu SVF (10 millions de cellules dans 2 mL de volume final) (X = 9/10ème du volume pour avoir 5x106 cellules/ml - 1/10 du volume est du DMSO ajouté goutte à goutte aux cellules sous agitation douce). Les suspensions cellulaires sont immédiatement refroidies dans de la glace avant transfert à -80 °C.
Stimulation des PBMCs
10 millions de cellules PBMCs fraîches récemment isolées ou décongelées sont introduites dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Les cellules sont centrifugées à 1500 tr/min, à température ambiante, pendant 10 min et le surnageant décanté. Les cellules sont remises en suspension dans 5 ml d'AIM- V® (cellules non colorées). 1 ml de cellules sont aliquotées dans 3 puits d’une plaque à 96 puits profonds et 0,5 ml de cellules sont aliquotées dans 4 puits de la plaque. Sont ajoutés dans chaque puits : de la concanavaline A (Con-A à 2 pg/ml) ou 15 pL des antigènes du vaccin grippal Vaxigrip (vaccin grippal à virion fragmenté quadrivalent inactivé injectable contenant 2 souches de type A (H1 N1 et H3N2) et 2 souches de type B (lignées Yamagata et Victoria)), à raison de 15 mg d’hémagglutinine pour chaque souche. La plaque est placée dans un incubateur pour culture de cellules pendant 48-72 h à 37 °C, 5% de CO2. Les cellules sont par la suite utilisées pour la purification des CTEACDs.
1 .2/ Purification des CTEACDs humaines
Matériel
Microbilles magnétiques greffées par un anticorps anti-CD45RO (Miltenyi, réf. 130-046-001 )
Microbilles magnétiques greffées par un anticorps anti-CD27 (Miltenyi, réf. 130- 051 -601 )
Compteur de cellules à fluorescence automatisé LUNA-FL® (Dutscher) Tubes de prélèvement de 5 ml en polystyrène SIMPT415-6 (VWR) Séparateur MidiMACS® (Miltenyi Biotec)
Colonne LS pour séparation magnétique (Miltenyi Biotec, réf 130-042-401 ).
Protocole
Le nombre de cellules dans chaque puits est déterminé à l'aide du compteur de cellules à fluorescence comme décrit précédemment. La suspension cellulaire est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est aspiré complètement et éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 pL de tampon A (solution contenant un tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,2 ; 0,5 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d'EDTA) pour 107 cellules. 20 pL de suspension de microbilles CD45RO sont ajoutées pour 107 cellules. L’ensemble est mélangé et incubé 15 min à 4 °C. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire complexé aux microbilles est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. La colonne LS est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. Elle est préparée par rinçage avec 3 mL de tampon A, puis la suspension cellulaire est déposée sur la colonne. Les cellules non marquées qui passent à travers la colonne sont recueillies et les cellules complexées aux microbilles retenues par la colonne sont lavées avec une quantité appropriée de tampon A. La fraction obtenue est nommée (-)CD45RO. Trois étapes de lavage de la colonne sont réalisées successivement chacune par 3 ml de tampon A. Les fractions obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/W1 , (-)CD45RO/W2, (-)CD45RO/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (-)CD45RO). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml d’un tampon approprié (# 130-091 -222) livré avec le kit de séparation, sont déposés sur la colonne puis les cellules magnétiquement marquées sont décrochées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (+)CD45RO et permet d’évaluer avec la fraction négative le rendement de la purification.
Une nouvelle colonne est préparée. Le nombre de cellules de la fraction cellulaire non marquée (-)CD45RO est déterminé. Cette suspension de cellules (-)CD45RO est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est complètement éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 pL de tampon A pour 107 cellules (comme indiqué ci-dessus). 20 pL de microbilles CD27 sont ajoutées pour 107 cellules. L’ensemble est mélangé puis incubé 15 min à 4 °C. Les cellules sont lavées par ajout de 2 ml de tampon A pour 107 cellules, puis, après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. Il est procédé à la séparation magnétique des cellules (+)CD27 et des cellules de la fraction (-)CD27. A cet effet, la colonne est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. La colonne est préparée en rinçant avec 3 ml de tampon puis la suspension cellulaire (-)CD45RO est appliquée sur la colonne et la fraction non fixée nommée (-)CD45RO/(-)CD27 est collectée. Elle correspond à une population de CTEACDs contenant des CTEACDs spécifiques de l’antigène grippal. La colonne est lavée avec 3 x 3 mL de tampon et les fractions qui sont obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/(- )CD27/W1 , (-)CD45RO/(-)CD27/W2, (-)CD45RO/(-)CD27/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO/(-)CD27 si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (- )CD45RO/(-)CD27)). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml de tampon sont déposés sur la colonne, puis les cellules magnétiquement marquées sont rincées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (- )CD45RO/(+)CD27.
1 .3/ Analyse des CTEACDs humaines
Analyse par cytométrie de flux
Le protocole de l’expérience est comme suit. La cytométrie en flux polychromatique est réalisée en utilisant un cytomètre BD® LSR-II disposant de 3 rayons lasers et l’analyse des données obtenues après acquisition est réalisée avec le logiciel FlowJo. Les cellules PBMCs sont mises en culture dans du milieu de culture AIM5 sans sérum dans des plaques 96 puits à puits profonds à une densité de 2x106 par mL, puis stimulées avec les antigènes comme indiqué pour l’ELISPOT. Les cellules sont incubées pendant 5 jours à 37 °C, 5% CO2 et humidité saturante dans un incubateur à culture cellulaire. Les cellules sont restimulées pendant 6 h en présence des anticorps de co-stimulation CD28 (BD, Clone CD28.2) et CD49d (BD, Clone 9F10) (BD Biosciences, France) et la Bréfeldine A (Invitrogen® 00-4506-51 ). Les cellules sont ensuite rincées avec du 1xPBS+1%BSA et incubées pendant 30 min à température ambiante avec une combinaison d’anticorps de marquage de surface cellulaire (Pacific Blue® anti- CD3 (BD, Clone SP34-2), APC-H7 anti-CD8 (SK1 ), PE anti-CD4 (BD, Clone L200), APC anti-CD45RA (BD, Clone 5H9), FITC anti-CD197 (BD, Clone 150503). Le monoazide d’éthidium (EMA) à raison de 0,5 mg par puits est aussi ajouté pour permettre la détection et l’exclusion des cellules mortes. Après 15 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les cellules sont fixées et perméabilisées par incubation 15 min à température ambiante dans 2 mL de la solution BD Cytofix/Cytoperm® diluée à 1x. Les cellules sont rincées 5 min avec la solution Perm/Wash de BD puis les marquages intracellulaires sont réalisés avec les anticorps monoclonaux PE-Cy®7 anti-IFN-y (BD, Clone B27) et Alexa Fluor® 700 anti-Granzyme B (BD, Clone GB11 ). Après 30 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les culots cellulaires re-suspendus dans 250 mL de paraformaldéhyde 1% dans 1xPBS puis stockés à l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’acquisition par le LSR-II. Les cellules sont acquises au cytomètre de flux et sélectionnées selon leur granulométrie et taille (prodiffusion et diffusion latérale) correspondant aux lymphocytes (FSC/SSC), puis aux populations EMA- , CD3+, CD4+ élevé et CD8+ élevé (>100,000 événements). Le résultat de l’analyse par cytométrie de flux est montré sur la figure 1 . On y observe que les cellules T CD8+ des CTEACDs humaines présentes dans les cellules PBMCs du sujet ayant été infecté par l’influenza et vacciné contre la grippe à plusieurs reprises, et qui ont été stimulées en culture avec l’antigène, sont composées de plus 98% de cellules effectrices. Plus de 96% des cellules CTEACDs T CD8+ sont Granzyme B+ et 40% secrétent aussi l’IFN-gamma.
Analyse par Elispot
Le protocole de l’expérience est réalisé comme suit. Deux cent cinquante mille PBMCs ou CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] des donneurs 1 et 2 sont inoculées en tripliquât dans des puits d’une plaque 96 puits d’un kit ELISA IFN-gamma humain (Mabtech) dans un volume final de 200 mL, puis stimulées avec 15 mL des antigènes contenus dans le vaccin grippal VaxiGripTetra, pendant la nuit dans un incubateur à culture cellulaire. Des contrôles négatifs (cellules non stimulées avec l’antigène) et positifs (cellules stimulées avec la ConA) sont utilisés en parallèle. A la suite d’une nuit d’incubation, les cellules sont éliminées de chaque puits et la détection des spots spécifiques de l’IFN-gamma est réalisée selon le protocole du kit Mabtech. L’anticorps secondaire (human 7-B6- 1 biotinylé, anti-INF-y) est dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca2+ et Mg2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. En parallèle le substrat Streptavidine-ALP (phosphatase alcaline) est aussi dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca2+ et Mg2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. Les plaques ne contenant plus de cellules sont rincées 5 fois avec 200 pl PBSxl par puits, puis égouttées sur un papier absorbant propre. 100 pl d’anticorps dilué sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est incubée à température ambiante pendant 2 h. La solution est ensuite éliminée, les puits rincés 5 fois avec le tampon PBSxl puis 100 pl de Streptavidine-ALP diluée au 1/1000 sont ajoutés et les plaques incubées 1 h à température ambiante. Cette solution est ensuite éliminée, les plaques rincées 5 fois au PBSxl avant de rajouter 100 pl du substrat BCIP/NBT (0,4 pm). Les plaques sont incubées à température ambiante à l’obscurité jusqu’à l’apparition des spots (environ 12-15 min). Les plaques sont immédiatement rincées à l’eau du robinet, égouttées puis laissées sécher totalement avant de compter les spots. Chaque spot est considéré provenir d’une cellule sécrétrice d’IFN-gamma spécifique des antigènes.
Les résultats obtenus, en termes de nombre de cellules sécrétant l’IFN-gamma, sont montrés sur la figure 2, pour chacun des deux individus donneurs, pour les PBMCs et pour les CTEACDs. On observe que la stimulation in vitro des CTEACDs permet une sécrétion massive de l’IFN-gamma. Les cellules mononucléées (PBMCs) du donneur 2 possèdent une proportion plus élevée de cellules T spécifiques de l’antigène grippal qui sont plus réactives et qui se différencient plus fortement en cellules T effectrices terminales (CTEACDs). Ces résultats démontrent clairement que les cellules réactives dans les PBMCs du donneur 2 sont plus prépondérantes que dans les PBMCs du donneur 1 .
L’ensemble des résultats ci-dessus démontre que les CTEACDs possèdent toutes les caractéristiques de cellules effectrices cytotoxiques armées pour éradiquer les cellules infectées par la grippe.
Test de cytotoxicité
Des CTEACDs (106 cellules (-)CD45RO/(-)CD27 /puits) sont mises en culture en suspension dans du milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau foetal dans des puits d’une plaque de 12 puits, puis incubées dans un incubateur à culture cellulaire (37 °C, 5% CO2 et humidité saturante). A différents temps postincubation, des fractions (20 ml) sont prélevées pour la mesure de la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire est mesurée au moyen d’un compteur de cellules Luna®, pendant trois jours après la fin de l’étape de purification. Le jour 0 correspond au jour d’isolement et la mise en culture des CTEACDs.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 3. On observe que la durée de vie des CTEACDs ne dépasse pas 3 jours en culture cellulaire. Exemple 2
A/ Etude in vitro de la capacité des CTEACDs humaines spécifiques d’un antigène grippal à éliminer les cellules humaines ou canines infectées par la grippe
L’objectif principal de cette expérience est d’évaluer l’efficacité des CTEACDs isolées du sang d’un donneur convalescent ayant été infecté par le virus grippal et ayant été vacciné contre ce virus dans le passé, à reconnaître et cytolyser les cellules infectées par le virus H1 N1 in vitro.
Les cellules humaines HEK-293 et les cellules canines MDCK, connues pour leur susceptibilité aux virus Influenza, sont utilisées pour cette expérience.
Ces cellules cultivées dans le milieu DMEM avec 10 % de sérum de veau foetal sont ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 104 cellules par puits, et dans des plaques de 6 puits à raison de 106 cellules par puits. Les monocouches de cellules sont inoculées avec le virus H1 N1 (avec 103 (pour les cellules en plaque 24 puits) et 105 (pour les cellules en plaque 6 puits) particules infectieuses du virus), à une multiplicité d’infection de 0,1 , puis elles sont soit maintenues telles quelles, soit co-cultivées 48 h après l’infection avec des CTEACDs (-)CD45RO/(-)CD27 préparées comme indiqué ci-dessus.
Les cellules sont analysées après 5 jours de culture à l’aide du kit de test de cytotoxicité Abeam ab112118, afin de déterminer le taux de viabilité cellulaire.
Des témoins de cellules non infectées (« contrôle ») et de cellules non infectées co-cultivées avec les CTEACDs (« CTEACD ») sont également réalisés.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 4. Ils démontrent que les cellules infectées sont toutes cytolysées par l’infection virale, alors qu’il n’y a pas de cytolyse des cellules non infectées utilisées comme témoins. Les cellules infectées co-cultivées avec les CTEACDs ont été protégées de la diffusion virale et se sont mises à proliférer. Ceci témoigne du fait que les CTEACDs lysent rapidement les cellules infectées par le virus et protègent les cellules non- infectées de la mort par ré-infection par le virus.
B/ Etude in vitro de la capacité des CTEACDs humaines spécifiques des antigènes de SARS-CoV-2 à éliminer les cellules humaines ou canines transfectées par les plasmides exprimant les gènes de structure S, M, N et E du coronavirus Les quatre plasmides recombinants exprimant respectivement les gènes S, M, N et E de SARS-CoV-2 ont été obtenus gracieusement du BEI, USA (références BEI : NR-52394, NR-53508, NR-52973 et NR-52967).
Ces plasmides sont introduits dans la souche bactérienne E coli JM109 compétente par transformation classique en utilisant le protocole fourni par Promega. Les bactéries portant les plasmides sont sélectionnées par culture dans un milieu sélectif contenant 100 mg/mL d’ampicilline. Les bactéries recombinantes portant les plasmides sont amplifiées dans des cultures de milieu LB liquide (1 L) supplémenté avec 100 mg/mL d’ampicilline et cultivées 24 h à 32 °C sous agitation. L’extraction d’ADN plasmidique est réalisée en utilisant un kit Maxiprep (Macherey Nagel) et le protocole exact livré avec le kit. La concentration des ADNs isolés est déterminée par lecture spectrophotométrique à la longueur d’onde de 260 nm. Les ADNs sont transfectés dans les cellules HEK-293 et MDCK en utilisant un kit commercial (TransIT®, Mirus/Euromedex) et le protocole du kit MIR 5404. Un mélange d’ADN contenant 1 ,25 mg de chacun des 4 plasmides est utilisé pour chaque transfection. A 24 h post- transfection, les cellules transfectées sont dissociées et inoculées à raison de 200 000 cellules par puits en tripliquât dans une plaque de 24 puits de culture cellulaire. 24 h plus tard, les tripliquâts de cellules (HEK-293 et MDCK) sont cocultivés soit avec 25 000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] soit avec 50 000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] isolées (comme décrit ci-dessus) du sang périphérique d’un donneur convalescent de Covid-19 depuis 4 mois. Ce donneur était tel que les cellules mononucléées contenues dans son sang périphérique possédaient une très forte proportion de cellules spécifiques du SARS-CoV-2 qui secrétent l’IFN-y (> 3500/106 PBMCs), déterminée par un test ELISPOT. Après 48 h de coculture, les cellules sont examinées pour les proportions de survie et de cytolyse. Les résultats de cette analyse sont rapportés sur la figure 5. Ces résultats confirment la forte efficacité de cytolyse des cellules exprimant les antigènes de SARS-CoV-2 par les CTEACDs anti-Covid.
Exemple 3 - Etude in vivo de la capacité des CTEACDs murines spécifiques d’un antigène grippal à traiter des souris infectées par la grippe
3.1/ Production et isolement de CTEACDs
Des CTEACDs sont produites à partir de cellules de rate de souris, selon le protocole suivant.
Matériel
Compteur de cellules à fluorescence automatisé LUNA-FL® (Dutscher) Cytomètre de flux BD® LSR-II
Tubes de prélèvement de 5 ml en polystyrène SIMPT415-6 (VWR)
Milieu RPMI (GIBCO, réf 21875-034)
SVF (Eurobio)
PBS 1X (Eurobio)
EDTA à partir d’une solution mère à 500 mM
Solution de lyse (BD Biosciences, réf 555 899)
Lame et lamelles stérilisées
Tubes Falcon® de 15 ml
Concanavaline A (ConA) (Thermo Fisher, réf 00-4978-03)
Vaccin VaxigripTetra (Sanofi Pasteur)
Protéines structurales recombinantes de SARS-CoV-2 (BEI, USA) Microbilles magnétiques anti-biotine (Miltenyi Biotec, réf. 130-090-485) Anticorps anti-KLRG1 -Biotine, souris, REA1016, (Miltenyi Biotec réf.130-117- 096)
Anticorps anti-CD27-Biotine, humain et souris, REA499, (Miltenyi Biotec réf. 130-114-164)
Séparateur MidiMACS® (Miltenyi Biotec réf. 130-042-302)
Colonne LS pour séparation magnétique (Miltenyi Biotec, réf. 130-042-401 ).
Récolte de sang de souris et de splénocytes
Des souris (2 groupes de 4 souris) C57BI6 âgées de 8 semaines en provenance des établissements Janvier et logées dans le complexe animalier du LBFA/UGA sont immunisées par injection intramusculaire avec 1/100éme (0,5 ml du vaccin dans 49,5 ml de PBSxl ) d’une dose vaccinale humaine du vaccin commercial VaxigripTetra pour le groupe 1. Les souris du groupe 2 sont immunisées avec un mélange des 4 protéines structurales (S, M, N et E) à raison de 0,5 mg de chacune des protéines dans un volume final de 100 mL de 1xPBS. A trois semaines post-immunisation les souris sont mises en sommeil profond (anesthésie) avec de la vapeur d'isoflurane. Après incision de la cavité abdominale, les rates des souris sont isolées aseptiquement et directement transférées dans les tubes Falcon® contenant 7 ml de milieu RPMI et conservées dans de la glace. Les rates sont ensuite placées entre une lame stérile/lamelle, puis dilacérées. Les splénocytes sont collectés dans 5 ml de milieu RPMI supplémenté de 10% SVF. Après centrifugation pendant 10 min à 300 g à 4 °C, les splénocytes sont lavés avec 5 mL de solution de PBS 1x + 5 mM ETDA. Après centrifugation pendant 10 min à 300 tr/min à 4 °C, les splénocytes sont traités pendant 2 min avec une solution de lyse des érythrocytes (BD Biosciences) pour éliminer les globules rouges. Après centrifugation pendant 5 min à 300 g à 4 °C, les cellules sont comptées en présence du bleu de trypan en utilisant le compteur de cellules LUNA-FL®. Stimulation des splénocytes
ConA est utilisée pour stimuler la prolifération des splénocytes, en tant que contrôle positif.
Le vaccin VaxigripTetra, contenant des antigènes de la grippe, est utilisé pour stimuler la différenciation des cellules T en CTEACDs. 3 pL d’une solution de ConA (dans du PBSxl ) à 1 pg.mL’1, 15 pL de solution de vaccin antigénique VaxigripTetra ou 2 mL du mélange (S+M+N+E) de protéines recombinantes structurales de SARS-CoV-2 sont ajoutés dans 3 mL d’une suspension cellulaire (2x107 cellules/mL) dans du RPMI + 10% SVF. Les suspensions de cellules sont transférées dans des tubes en polystyrène et incubées pendant 3 jours à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire sous atmosphère de CO2.
Isolement des CTEACDs
Le nombre de cellules est déterminé à l'aide du compteur de cellules à fluorescence. Après centrifugation de la suspension cellulaire à 300 g pendant 10 min, le surnageant est éliminé complètement. On remet en suspension jusqu'à 107 cellules nucléées par 45 pL de tampon (PBS pH 7,2 + 0,5 % d’albumine de sérum bovin + 2 mM EDTA). On ajoute 5 pL de l'anticorps anti- KLRG1 -Biotine, on mélange et incube 10 min dans l'obscurité à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon et centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant. On répète cette étape de lavage. On remet le culot cellulaire en suspension dans 80 pL de tampon. On ajoute 20 pL de microbilles magnétiques anti-Biotine pour 107 cellules. Après mélange on incube 15 min à 4 °C, puis on lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon pour 107 cellules et on centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet en suspension le culot avec 2 ml de tampon. On place la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS® et on la prépare en rinçant avec 3 ml de tampon. On applique les 2 ml de suspension cellulaire sur la colonne. On recueille la fraction cellulaire non liée, nommée (+)KLRG1.
On centrifuge cette suspension cellulaire à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet le culot cellulaire en suspension, à raison de jusqu'à 107 cellules nucléées par 100 pL de tampon. On ajoute 10 pL de l'anticorps anti-CD27 souris / humain, on mélange et incube 10 min à l'obscurité à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon et centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant puis on répète l'étape de lavage. On remet le culot cellulaire en suspension dans 80 pL de tampon, et on ajoute 20 pL de microbilles magnétiques anti-biotine pour 107 cellules. Après mélange on incube 15 min à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon pour 107 cellules et on centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet le culot cellulaire en suspension dans 2 mL de tampon. On place la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. On prépare la colonne LS en la rinçant avec 3 mL de tampon. On applique la suspension cellulaire sur la colonne et on recueille la fraction cellulaire non liée. Elle contient des cellules CTEACDs (+)KLRG1/(- )CD27.
3.2/ Efficacité thérapeutique
4 groupes de souris BALB/c ont été infectées avec le virus influenza H1 N1 (20 000 particules infectieuses dans 20 ml) par la voie intra-nasale.
Un groupe (Groupe 1 ) a été gardé tel quel. Au jour 2 post-infection, à un groupe, ont été transférées, par injection intrapéritonéale, des CTEACDs [(+)KLRG1/(- )CD27] issues de souris C57BL/6 non immunisées avec VaxiGripTetra (Groupe 2, 105 CTEACDs/souris). En parallèle, à deux autres groupes, ont été transférées, par injection intrapéritonéale, des CTEACDs [(+)KLRG1/(-)CD27] issues de souris C57BL/6 ayant été préalablement immunisées contre la grippe comme ci-dessus décrit. (Groupe 3, 5.104 CTEACDs/souris et Groupe 4, 2,5.105 CTEACDs/souris). Après 4 à 5 jours, dans le Groupe 1 , 3 souris sur 7 sont mortes et les 4 autres, se trouvant dans un état très détérioré en raison de l’infection par H1 N1 , ont été euthanasiées. L’état de santé des souris du Groupe 2 auxquelles ont été administrées des CTEACDs de souris normales, s’est détérioré 5 à 6 jours après l’infection par H1 N1. Ces souris malades ont été euthanasiées au jour 6 postinfection. A l’inverse, toutes les souris du Groupe 3 et du Groupe 4 sont restées vivantes pendant plus de 6 mois sans montrer aucun signe clinique.
Ces résultats apportent la démonstration claire que le transfert adoptif de CTEACDs issues de souris immunisées est associé à une thérapie curatrice persistante chez tous les animaux traités (14/14).
Il est en outre démontré que le transfert de CTEACDs isolées de souris C57BL/6 chez des souris BALB/c de fond génétique différent n’induit aucun signe de maladie de rejet ou de réaction du greffon contre l’hôte après plus de 3 mois d’observation.
L’ensemble des exemples ci-avant apporte la preuve de la capacité des CTEACDs produites conformément à l’invention à éliminer les cellules infectées, et par conséquent à empêcher le développement de la maladie, à la fois en culture de cellules humaines ou canines in vitro, et in vivo chez la souris.
En outre, les souris BALB/c qui avaient été infectées avec H1 N1 et traitées avec les CTEACDs anti-H1 N1 ont été surveillées pendant plus de 10 mois sans qu’il soit observé de signe pathologique ou d’effet secondaire apparent. A la suite de l’euthanasie, les observations anatomopathologiques n’ont permis de déceler aucune lésion dans les organes observés (poumon, rate, foie, cœur). Ces résultats démontrent que les traitements avec les CTEACDs ne sont pas associés à des effets secondaires même après une longue période posttraitement.
3.3/ Injections répétées
Dans le but d’évaluer si l’utilisation thérapeutique réitérée de CTEACDs pourrait ou non provoquer un développement de maladie, 6 groupes de 6 souris BALB/6 âgées de 8 semaines ont été inoculées avec 250000 CTEACDs issues de souris C57 BL/6 immunisées contre la grippe comme précédemment décrit. Les souris du groupe 1 ont été gardées comme contrôles, les souris du groupe 2 ont reçu 2 injections avec un intervalle de 10 jours, les souris des groupes 3, 4, 5 et 6 ont reçu respectivement 3, 4, 5 et 6 injections à des intervalles de 10 jours. Les animaux ont été gardés sous observation au moins 3 mois après la dernière injection. Les résultats n’ont montré aucune anomalie ou perturbation durant le suivi. En effet, aucune perte de poids, d’appétit ou de poil n’a été observée. Tous les animaux sont restés actifs et n’ont montré aucune différence avec le groupe des souris contrôles.
Exemple 4 - Etude in vivo de la capacité des CTEACDs murines spécifiques d’un antigène de SARS-CoV-2 à traiter des souris infectées par le SARS-CoV-2
Des souris BALB/c ont été immunisées contre le SARS-CoV-2 avec du vaccin composé du virus SARS-CoV-2 inactivé (Obtenu du BEI Ressources, USA) tué par la chaleur (65°C, 30min). Chaque souris a reçu par la voie intramusculaire 50 pi du vaccin dilué 50 fois dans la solution saline (1x PBS), puis un rappel dans les mêmes conditions 2 semaines plus tard. Les splénocytes ont été isolés des souris immunisées 2 mois après le rappel et mis en culture pendant 48 h en présence des antigènes du SARS-CoV-2 (obtenus du BEI Ressources, USA). Les CTEACDs ont été ensuite isolées et utilisées en thérapie anti-Covid chez les souris infectées.
En l’absence de l’existence d’un modèle naturel de souris pour le SARS-CoV-2, le modèle de souris transgéniques K18 hACE-2 a été utilisé. Ces souris expriment dans toutes les cellules de l’organisme le récepteur humain hACE-2 et deviennent susceptibles à l’infection par le virus.
Deux groupes de huit souris K18 hACE-2 ont été infectés avec la souche delta du virus SARS-CoV-2 (5x103 particules infectieuses par souris) par la voie intra- nasale puis un des deux groupes a été traité avec environ 50 000 CTEACDs obtenues comme décrit ci-dessus par la voie intraveineuse. 2 souris témoins ont reçu du PBS sans virus. A 6 jours, tous les animaux infectés non-traités et 2 animaux du groupe traité ont été euthanasiés à cause de la détérioration de leur état de santé. Au moins 60% des souris infectées et traitées avec les CTEACDs ont survécu au jour 7 et 40% au jour 8 (le dernier jour du protocole).
Ces résultats démontrent que malgré l’absence de modèle murin adapté et les limitations du modèle murin K18, le traitement par les CTEACDs a démontré une protection partielle des animaux traités. Exemple 5 - Obtention de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques d’un antigène à forte capacité de prolifération à partir de sang de cordon
La première étape consiste à générer des cellules adhérentes présentatrices des antigènes (APC) puis à les charger avec les antigènes pour qu’elles les présentent via le CMH et enfin de les mettre en coculture avec les cellules non- adhérentes contenant les lymphocytes T pour les rendre spécifiques de l’antigène.
Génération des APC chargées avec l’antigène
Les cellules mononucléées du sang de cordon ont été achetées chez Stemcell Technologies. Les milieux de cultures cellulaires ont été achetés chez Eurobio et chez Fisher Technologies.
Au premier jour, du milieu RPM1 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) (milieu R10) est préchauffé à 37°C dans un bain-marie. Les cellules mononucléées du sang de cordon sont sorties de l’azote liquide et incubées dans la glace puis à 37°C dans le bain marie jusqu’à semi-fonte de la suspension cellulaire. La suspension cellulaire est ensuite transférée goutte à goutte dans un tube conique stérile de 50 mL contenant 10 mL de milieu préchauffé. La suspension est ensuite homogénéisée et centrifugée à 1500 tr/min pendant 10 min à température ambiante.
Le culot cellulaire est re-suspendu dans du milieu R10 à 2x106/ml puis ensemencé dans les puits d’une plaque à 12 puits à raison de 1 ml/puits et incubé pendant 4 h à 37°C dans les conditions de culture cellulaire.
Les cellules non adhérentes restées en suspension sont récoltées et cryoconservées dans un milieu composé de 90% de SVF supplémenté avec 10% de DMSO.
Les cellules adhérentes au plastique sont cultivées dans 1 mL de milieu R10 supplémenté de cytokine GM-CSF (800 LJ/mL) et IL-4 (500 U/mL). Après 3 jours de culture, la moitié (0,5 mL) du milieu est remplacée avec du milieu R10 frais contenant la GM-CSF et l’IL-4. Au jour 6 de la culture, la moitié (0,5 mL) du milieu est remplacée avec du milieu contenant 500 U de IL-4 et 60 ng de TNF- a. Au jour 9, l'antigène (grippal ou SARS-CoV-2 inactivé) est ajouté à raison de 1 ug/mL puis les cellules sont incubées pendant 18 à 24 h avant de retirer le milieu et de rincer les cellules avec du milieu R10 frais.
Coculture avec les cellules non-adhérentes
Les cellules non adhérentes sont sorties de l’azote liquide, incubées dans la glace puis à 37°C pour les décongeler comme ci-dessus décrit. Le culot cellulaire est re-suspendu dans du milieu R10 à raison de 106 cellules/mL puis incubé 4 h à 37°C. Enfin, 1 mL de suspension cellulaire est ensemencé sur les monocouches de cellules adhérentes par remplacement de leur milieu de culture. La coculture est incubée pendant 3 jours puis supplémentée avec de l’IL-2 à raison de 5 U/mL puis incubée 6 jours supplémentaires.
Ce procédé permet de dériver des cellules présentatrices d’antigènes à partir de sang de cordon et de les charger avec des antigènes.
Les cellules non-adhérentes obtenues à l’issue de l’étape de coculture, comprenant une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération, peuvent être utilisées pour les étapes b/ et c/ d’un procédé selon l’invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro ou ex vivo de production et d’isolement d’une sous- population de cellules comprenant des cellules T spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, caractérisé en ce qu’il comporte des étapes de :
- a/ à partir d’un échantillon biologique humain isolé, obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération,
- b/ culture desdites cellules mononucléées pendant 24 à 72 heures dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant ledit antigène,
- et c/ isolement du milieu de culture de cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel l’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération comprend l’identification d’un échantillon biologique de sang périphérique humain comprenant une population de cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, et l’isolement de cellules mononucléées à partir dudit échantillon biologique.
3. Procédé selon la revendication 2, selon lequel ledit échantillon biologique de sang périphérique humain est un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été atteint par ladite maladie.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel l’étape b/ de culture desdites cellules mononucléées est réalisée pendant 36 à 60 heures.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel l’étape c/ d’isolement du milieu de culture des cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 est réalisée par recueil des cellules contenues dans le milieu de culture, puis chromatographie d’affinité au moyen d’anticorps spécifiques des marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, lesdites cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 étant présentes dans la fraction non liée.
6. Sous-population de cellules isolée obtenue par un procédé selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant des cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques dudit antigène lié à ladite maladie d’intérêt.
7. Sous-population de cellules selon la revendication 6, contenant au moins 50 % de cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques dudit antigène.
8. Sous-population de cellules selon la revendication 6 ou 7, contenant au moins 90 % de cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques dudit antigène.
9. Sous-population de cellules selon la revendication 6, consistant en des cellules T effectrices terminales humaines à courte durée de vie spécifiques dudit antigène.
10. Sous-population de cellules selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, pour son utilisation en tant que médicament.
11. Sous-population de cellules pour son utilisation selon la revendication 10, pour le traitement de ladite maladie d’intérêt.
12. Sous-population de cellules pour son utilisation selon la revendication 10 ou 1 1 , selon laquelle ladite sous-population de cellules est administrée à un sujet en ayant besoin moins de 4 jours après la fin de l’étape b/ de culture cellulaire du procédé selon l’une des revendications 1 à 5 mis en oeuvre pour son obtention.
13. Sous-population de cellules pour son utilisation selon l’une des revendications 10 à 12, pour le traitement d’une maladie infectieuse, en particulier d’une maladie virale.
14. Sous-population de cellules pour son utilisation selon l’une des revendications 10 à 12, pour le traitement d’une maladie chronique non transmissible.
15. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient une sous- population de cellules selon l’une quelconque des revendications 6 à 9 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15, se présentant sous une forme convenant pour une administration par voie parentérale.
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