EP4347838A1 - Aptameres arn specifiques de conformeres de fibres de la proteine a-synucleine - Google Patents

Aptameres arn specifiques de conformeres de fibres de la proteine a-synucleine

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Publication number
EP4347838A1
EP4347838A1 EP22732601.4A EP22732601A EP4347838A1 EP 4347838 A1 EP4347838 A1 EP 4347838A1 EP 22732601 A EP22732601 A EP 22732601A EP 4347838 A1 EP4347838 A1 EP 4347838A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
syn
aptamer
identity
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22732601.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Alix BOUVIER-MÜLLER
Frédéric DUCONGE
Luc BOUSSET
Ronald MELKI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4347838A1 publication Critical patent/EP4347838A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to the fields of aptamers and neurodegenerative diseases, in particular synucleinopathies.
  • an aptamer characterized by having the ability to distinguish the F-type a-Syn fiber conformers of a-Synuclein (a-Syn) protein from the a-Syn fiber conformers of type R, and in that it comprises a specific sequence of modified ribonucleic acid (modified RNA) having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, and SEQ ID NO:7, preferably chosen from SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2.
  • modified RNA modified ribonucleic acid
  • the present invention also relates to a composition or a kit comprising at least one of these aptamers, as well as to their uses.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing neurodegenerative diseases as well as a method for stratifying, monitoring, prognosing and evaluating the effectiveness of a treatment for a synucleinopathy, comprising the use of at at least one aptamer and/or a composition and/or a kit mentioned above.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, Creutzfeldt-Jakob's or dementia with Lewy bodies
  • This diagnosis is, however, made difficult to make because the symptoms of these different diseases are very similar, especially in the early stages of the disease.
  • a definite diagnosis can only be made when the disease has reached an advanced stage and the patient is suffering from the most severe forms of the symptoms (Gconsz-Rio et al., 2016). It is therefore essential to develop new diagnostic methods that make it possible to make a reliable distinction between the different neurodegenerative diseases (NDs).
  • NDs neurodegenerative diseases
  • Genetic biomarkers can be alleles or mutations in the genome that have been identified as predisposing to disease. This type of marker thus makes it possible to identify an “at risk” population, which has a higher probability of developing NDs.
  • Biochemical markers are biomolecules whose presence and/or quantity is correlated with the evolution of the pathology. For example, Parkinson's disease is histologically marked by the accumulation of alpha-Synuclein (or a-Synuclein or a-Syn) within Lewy bodies (Katsuno et al., 2018). Biochemical markers are therefore considered as signs of the onset and development of the disease, while genetic biomarkers are rather predisposing factors for developing the disease. The identification of biochemical markers can thus make it possible to detect the onset of a disease early, to carry out more precise diagnoses, to follow the evolution of the disease more easily, and also to evaluate with precision the effectiveness of a therapy.
  • the accumulation of protein aggregates in the central nervous system is a common feature of several progressive neurodegenerative disorders (eg Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's and Creutzfeldt-Jakob's diseases).
  • a three-dimensional misfolding of certain proteins can increase their tendency to bind together and transmit this misfolding to each other.
  • the aggregated forms of these proteins then gradually accumulate and can interfere with the normal function of neurons, which can gradually lead to their death.
  • the proteins that can form this type of aggregates mention may be made of the a-Synuclein protein, the Tau protein, Huntingtin, the beta-amyloid peptide or the PrP protein.
  • a-Synuclein fibers are found within protein aggregates in the brain of patients suffering from certain MNs grouped under the name of “synucleinopathies”. These diseases include but are not limited to: Parkinson's disease (PD), dementia with Lewy bodies (MLB) and multiple system atrophy (MSA).
  • a-Syn fibers are composed of thousands of abnormally folded protein repeats. They form by successive recruitment of proteins, according to a propagation mechanism where a misfolded a-Syn protein transmits its erroneous conformation when it binds to another protein.
  • a-Syn fibers with distinct structural conformations have been isolated and it has been shown that they could induce different pathologies (Peelaerts et al., 2015; Rey et al., 2019). These different conformations are called conformers.
  • these conformers we can cite the conformers of a-Syn fibers of type F, R, 91 and 65 (Bousset et al., 2013; Makky et al., 2016).
  • the F-type, 65 and 91 a-Syn fiber conformers have a cylindrical shape, while the R-type fiber conformers have a flat ribbon shape, the 91 and 65 fibers are twisted but with pitches of different propellers.
  • the F-type a-Syn fiber conformers are the stiffest, with a flexural strength measurement four times greater than the R fiber conformers and twice the 65 and 91 fiber conformers.
  • the fiber conformers of a-Syn can also be distinguished from each other by analysis by controlled proteolysis with proteinase K. Their structural difference leads to degradation profiles which are different from one conformer to another. These profiles are comparable to barcodes (or fingerprints) specific to each conformer (see an example of a degradation profile in Figure 1 (Landureau et al., 2021)).
  • the entire form of the protein in the F-type a-Syn fiber conformers is more resistant to proteolysis than in the R-type conformer (Fenyi et al., 2021).
  • aptamers offer advantageous possibilities.
  • Aptamers are nucleic acid structures with properties comparable to antibodies. They are generally obtained by a directed molecular evolution process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Since the discovery of SELEX in the 90s, the use of aptamers has been experimentally validated for many applications (diagnosis, purification, therapy, etc.).
  • an aptamer anti- VEGF Macugen® has already received Marketing Authorization for the treatment of macular degeneration of the eye.
  • a DNA aptamer (named M5-15) was selected against the monomeric form of a-Syn. However, this aptamer also binds non-specifically to the oligomeric and fibrillar forms of a-Syn (Tsukakoshi et al., 2010).
  • a second study made it possible to obtain a second DNA aptamer (T-S0508) capable of discriminating the oligomeric form from the monomeric and fibrillar forms of a-Syn.
  • a-Syn fibers and, in particular of conformers of type F and R a-Syn fibers in the diagnosis of various neurodegenerative diseases, it is essential to develop molecules capable of Distinguish between different a-Syn fiber conformers, in particular F- and R-type a-Syn fiber conformers.
  • the present invention makes it possible to meet this need.
  • RNA aptamers capable of specifically recognizing certain conformers of a-Syn fibers.
  • the inventors have in fact selected and isolated RNA aptamers having different affinities for different ⁇ -Syn fiber conformers.
  • the aptamers developed are capable of distinguishing the conformers of F-type a-Syn fibers from the conformers of R-type a-Syn fibers, unlike the aptamers DNA versus a-Syn described in the prior art.
  • the data show that these aptamers are tools for the specific and sensitive detection of the different fibers of a-Syn.
  • the present invention therefore provides both effective and reliable diagnostic methods for neurodegenerative diseases, methods for screening molecules but also tools for research in the field of neurodegenerative diseases.
  • the present invention therefore relates to an aptamer characterized in that it has the ability to distinguish the conformers of fibers of a-Syn of the type F of the protein a-Syn (a-Syn) from the conformers of fibers of a-Syn of type R, and in that it comprises a specific sequence of modified ribonucleic acid (RNA) having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7, preferably chosen from SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2.
  • RNA modified ribonucleic acid
  • the RNA has been modified in order to increase its resistance to RNA nucleases, preferably by modifying the riboses of the pyrimidines of the aptamer so that they bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the present invention further relates to a composition or a kit comprising at least one of these aptamers, as well as their uses.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing neurodegenerative diseases as well as a method for stratifying, monitoring, prognosing and evaluating the effectiveness of a treatment for a synucleinopathy, comprising the use of at at least one aptamer and/or a composition and/or a kit mentioned above.
  • an aptamer characterized by having the ability to distinguish the F-type a-Syn fiber conformers of the a-Syn (a-Syn) protein from the a-Syn fiber conformers of type R, and in that it comprises a specific sequence of modified ribonucleic acid (RNA) having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, and SEQ ID NO:7, preferably chosen from SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2.
  • RNA modified ribonucleic acid
  • the dissociation constant K d(F) measured for the conformers of fibers of type F a-Syn is: a) lower than the dissociation constant K d ⁇ R > measured for the conformers of R-type a-Syn fibers, preferably lower by at least 10 times; b) lower than the dissociation constant K d(Mono) measured for the monomers of a-Syn, preferably lower by at least 2 times; c) lower than the dissociation constant K d(Random) of a random aptamer measured for the conformers of fibers of type F a-Syn, preferably lower by at least 2 times; d) lower than the dissociation constant K d ⁇ R> measured for the conformers of fibers of R-type a-Syn, preferably lower by at least 10 times; and lower than the dissociation constant K d(Mono) measured for the monomers of a-Syn,
  • At least one dissociation constant K d is as follows: a) the dissociation constant K d ⁇ F > measured for the conformers of a-Syn fibers of type F is less than 15 nM, preferably less than 10 nM; and/or b) the dissociation constant K d ⁇ R> measured for the conformers of R-type a-Syn fibers is greater than 100 nM, preferably greater than 150 nM.
  • the present invention further relates to an aptamer as above, further comprising: i. 5' to the specific sequence, a modified RNA primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 95% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO:29 and SEQ ID NO:30, preferably located at the 5' end of the specific sequence; and/or ii. 3' to the specific sequence, a modified RNA primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 95% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 and SEQ ID NO:33, preferably located at the 3' end of the specific sequence.
  • the present invention further relates to an aptamer as above, comprising a modified RNA sequence having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, and SEQ ID NO:40, preferably chosen from SEQ ID NO:34 and SEQ ID NO:35.
  • the present invention also relates to a kit comprising at least one aptamer according to the invention.
  • the kit further comprises at least one additional aptamer chosen from aptamers comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO :8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 and SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, and SEQ ID NO:28; the kit preferably further comprising an aptamer comprising a random sequence of modified RNA.
  • At least one additional aptamer further comprises: i. 5' to the specific sequence, a modified RNA primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 95% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO:29 and SEQ ID NO:30, preferably located at the 5' end of the specific sequence; and/or ii. 3' to the specific sequence, a modified RNA primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 95% of identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 33, preferably located at the 3' end of the specific sequence.
  • the present invention also relates to a kit as above, in which at least one additional aptamer is chosen from aptamers comprising a modified RNA sequence having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 and SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, and SEQ ID NO:60.
  • the kit comprises at least the following aptamers: aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 1, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO:2, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO:3, aptamer comprising a specific sequence of Modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO:8, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO:9, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 10, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 11, aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 12, aptamer comprising a sequence specific for modified
  • the kit according to the invention is preferably characterized in that, when the kit comprises several aptamers, these are: a) all in a single composition, or b) distributed in several distinct compositions in separate containers, including the case wherein each of the aptamers is in a separate composition located in a separate container.
  • the present invention further relates to an aptamer as above or a kit as above, in which the RNA of the aptamer or of all the aptamers of the kit has been modified in order to increase its resistance to -vis RNA nucleases, preferably in which the riboses of the pyrimidines of the aptamer or of all the aptamers of the kit bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the present invention also relates to an in vitro use of at least one aptamer according to the invention, of at least one kit according to the invention, or of any combination thereof, for: a) detecting the presence or the absence of at least one F-type ⁇ -Syn fiber conformer in a biological sample; b) determining the amount of an F-type ⁇ -Syn fiber conformer in a biological sample; c) establishing a molecular fingerprint of a-Syn fiber conformers, preferably of a-Syn F and R type a-Syn fibers, in a biological sample; d) screening compounds/molecules capable of detecting and/or recognizing of an F-type a-Syn fiber conformer, preferably screening compounds/molecules capable of discriminating the conformers of type F a-Syn fibers F conformers of R-type a-Syn fibers; or e) any combination of a) to d).
  • the present invention also relates to an in vitro method for diagnosing a synucleinopathy in a subject having at least one symptom of a neurodegenerative disease, comprising: a) bringing a biological sample from the subject into contact with at least one aptamer according to invention, with at least one kit according to the invention, or with any combination thereof; b) the detection of the presence or the absence of at least one conformer of fibers of type F a-Syn, the quantification of the conformers of fibers of type F a-Syn, the establishment of a fingerprint molecular conformers of a-Syn fibers (preferably of a-Syn F and R type a-Syn fibers), or any combination thereof, in the subject's biological sample; and c) diagnosing the presence or absence of a synucleinopathy in the subject based on the result of step b).
  • the present invention also relates to an in vitro method for stratifying a synucleinopathy, for prognosing a synucleinopathy, for monitoring a synucleinopathy, or for evaluating the effectiveness of a treatment for a synucleinopathy in a subject suffering from of a synucleinopathy, comprising: a) bringing a biological sample from the subject into contact with at least one aptamer according to the invention, with at least one kit according to the invention, or with any combination thereof; b) the detection of the presence or the absence of at least one conformer of fibers of type F a-Syn, the quantification of the conformers of fibers of type F a-Syn, the establishment of a fingerprint molecular conformers of a-Syn fibers (preferably of a-Syn F and R type a-Syn fibers), or any combination thereof, in the subject's biological sample; and c) stratifying the synucleinopathy, prognosing the synucleinopathy,
  • a-Synuclein or “a-Syn” or “a-syn” or “alpha-Synuclein” or “a-Synuclein” is meant a phosphoprotein of the synuclein family which is abundant in the human brain. It is also found in small amounts in the heart, muscles and other tissues. In the brain, a-Syn is found primarily at the end of nerve cells (neurons) in presynaptic terminals.
  • the reference protein sequence for the human ⁇ -Synuclein protein is the NCBI sequence referenced under the number P37840.1.
  • the a-Syn protein exists in two forms. It can be soluble or bound to a membrane. In the soluble state in the cytosol, a-Syn has a disordered structure (Fauvet et al., 2012). In the presence of a lipid membrane, the N-terminal part of Ga-Syn adopts an a-helix structure which allows its embedding within lipid membranes (Eliezer et al., 2001). When bound to a large diameter membrane (at least 100 nm), Ga-Syn adopts the shape of a large elongated helix (Trexler and Rhoades, 2009). When, on the contrary, it interacts with small vesicles (and therefore with high curvature), Ga-Syn adopts a structure composed of two small a-helix (Chandra et al., 2003).
  • a-Syn can also adopt so-called “pathological” conformations, rich in b-sheets. These pathological conformations have a strong propensity to form fibrillar aggregates (called “fibrillar a-Syn” or “a-Syn fibers”) which are found as intracellular deposits in synucleinopathies (El-Agnaf et al., 1998a ).
  • a-Syn fibrillar or “a-Syn fiber” or “a-Syn fibrillar aggregate” or “a-Syn aggregate” is meant a fiber (or an aggregate, or an assembly) composed many abnormally folded ⁇ -Syn protein repeats (including from 25 to several hundred abnormally folded ⁇ -Syn protein repeats). It is therefore an assembly of several copies (from 25 to several hundred) of misfolded a-Syn proteins (presenting an abnormal/pathological/non-native folding).
  • a-Syn fibers are formed by successive recruitment of a-Syn proteins, according to a propagation mechanism where a misfolded a-Syn protein transmits its erroneous conformation when it binds to another protein.
  • PD Parkinson's disease
  • DCL dementia with Lewy bodies
  • MSA multiple system atrophy
  • a-Syn fiber conformers Several forms of a-Syn fibers with distinct structural conformations have been isolated and it has been shown that they could induce different synucleinopathies. These different conformations are called ⁇ -Syn fiber conformers.
  • the a-Syn protein can undergo one or more post-translational modifications, such as the addition of a functional group (for example chosen from acetylation, alkylation, biotinylation, carboxylation, glutamylation, glycylation, glycosylation, hydroxylation, isoprenylation, lipoylation, phosphopantetheinylation, phosphorylation, ribosylation, sulfation, selenation, amidation, etc., and any combination thereof), the addition of peptide or protein groups (provided for the latter that the added protein is not an a-Syn protein; the addition of peptide or protein groups is for example chosen from ubiquitination, neddylation, sumoylation
  • a-Syn or “conformer of a-Syn fibers” is meant a specific structural/spatial configuration (conformation) formed by an aggregate of a-Syn proteins having an abnormal folding (i.e. i.e. a specific structural configuration adopted by fibrillar Ga-Syn).
  • Different fiber conformers of a-Syn have been identified such as F-, R-, 65- and 91-type a-Syn fiber conformers.
  • the F-type, 65 and 91 a-Syn fiber conformers have a cylindrical shape, while the R-type fiber conformers have a flat ribbon shape, the 91 and 65 fibers are twisted but with pitches of different propellers.
  • at least one copy of the a-Syn protein may comprise one or more post-translational modifications as defined above.
  • fiber F or “conformer of F-type a-Syn fibers” or “conformer of a-Syn F-type fibers” is meant an aggregate of a-Syn proteins which is in a cylindrical shape, producing 9 bands during their controlled proteolysis by proteinase K (example in Figure 1 (Landureau et al., 2021)) and whose bending stiffness is approximately 5.8 10-26 Nm 2 .
  • fiber R or “conformers of fibers of type R of a-Syn” or “conformers of type R fibers of a-Syn” is meant an aggregate of a-Syn proteins which is in the form of ribbons dishes.
  • R-type fibers are more flattened than F-type fibers. They produce 3 bands during their proteolysis mediated by proteinase K (example in Figure 1 (Landureau et al., 2021)) and have a bending stiffness of about 1.4 10 26 Nm 2 .
  • fiber 65 or “conformer of fibers 65” or “conformer of fibers 65 of a-Syn” is meant an aggregate of a-Syn proteins which is in the form of tight twists. They have a bending stiffness of about 2.7 10 26 Nm 2 .
  • fiber 91 or “fiber 91 conformer” or “fiber 91 conformer of a-Syn” is meant an aggregate of a-Syn proteins which is in the form of loose twists. They produce 7 bands during their proteolysis mediated by proteinase K (example in Figure 1 (Landureau et al., 2021)) and have a bending stiffness of approximately 2.4 ⁇ 10 26 Nm 2 .
  • fibers can be distinguished using the different molecular and structural analysis techniques known to those skilled in the art, such as solid-state NMR analysis, atomic force microscopy, electron microscopy, proteolysis spared, the diffraction of X-rays by the fibers, the binding of the ligand such as Thioflavin T or antibodies, etc.
  • these techniques have in particular made it possible to show that the conformers of fibers F, R, 65 and 91 are 1 to 2 ⁇ m long on average, with a width of the order of 15 to 20 nm, the conformers of fibers of a- F-type Syn being the narrowest, and the fiber 65 conformers the widest.
  • the fiber conformers 65 and 91 show periodic variations in height, unlike the fiber conformers of F and R type a-Syn.
  • these different types of fiber conformers can be distinguished by their mechanical properties, using different mechanical analysis techniques known to those skilled in the art, such as atomic force microscopy. These mechanical analyzes made it possible in particular to demonstrate that the four types of fibers had different mechanical properties.
  • the F-type a-Syn fiber conformers are the stiffest, with a flexural strength measurement four times higher than the R fiber conformer and twice the 65 and 91 fiber conformers.
  • ⁇ -Syn fibers can also be distinguished from each other (especially ⁇ -Syn fiber conformers can be distinguished from other types of ⁇ -Syn fiber conformers) by their protease degradation profile . Their structural difference results in degradation profiles which are different from one conformer to another. These profiles are comparable to barcodes (or fingerprints) specific to each conformer (see an example of a degradation profile in Figure 1).
  • the entire form of the protein in the F-type a-Syn fiber conformers is more resistant to proteolysis than in the R-type conformer (Fenyi et al., 2021).
  • At least one copy of the a-Syn protein may comprise one or more post-translational modifications as defined above.
  • oligomer of a-Syn or "a-Syn in oligomeric form” is meant an assembly comprising several copies (between 2 and 24) of the protein of the a-Syn protein, in the form of a chain (c i.e. a sequence of linked/associated a-Syn proteins, comprising between 2 and 24 a-Syn proteins).
  • An a-Syn oligomer differs from an a-Syn fiber in that it comprises a lower number of a-Syn copies (Pieri et al., 2016).
  • An a-Syn oligomer therefore comprises from 2 to about twenty copies of the a-Syn protein.
  • An ⁇ -Syn oligomer is not an ⁇ -Syn fiber within the meaning of the present invention, since it comprises less than 25 ⁇ -Syn monomers.
  • a-Syn monomer or "a-Syn in monomeric form” is meant a molecule of the a-Syn protein in a free form, that is to say which is not bound / associated to another molecule of the a-Syn protein.
  • An a-Syn monomer therefore comprises a single copy of the a-Syn protein.
  • An a-Syn monomer is therefore distinguished from the oligomers and aggregates/fibers of the a-Syn protein.
  • the single copy of the ⁇ -Syn protein in the monomer may nevertheless comprise one or more post-translational modifications, as defined above.
  • aptamer is meant an oligonucleotide (i.e. a segment of a nucleic acid chain) which adopts a three-dimensional structure giving it the ability to bind specifically to a given ligand (the ligand is called “target”). ), especially of a protein nature.
  • An aptamer is said to bind specifically to a target when it exhibits essentially no affinity for a compound structurally unrelated to the target.
  • a protein compound is said to have no structural relationship with the target according to the invention, when the sequence identity between the target and the compound is less than 60%, preferably less than 70%, more preferably still less than 80%.
  • an aptamer is said to exhibit essentially no affinity for a compound according to the invention, in particular when the dissociation constant of the aptamer with respect to the compound is greater than 10 6 mol / l, preferably greater than 10 7 mol/l.
  • the dissociation constant can in particular be determined, under standard conditions, using the Scatchard and Lineweaver Burk representations well known to those skilled in the art.
  • the aptamers generally comprise from a few nucleotides to a few tens of nucleotides, for example from 15 to 100 nucleotides (preferably from 20 to 90 nucleotides, more preferably from 30 to 80 nucleotides, more preferably from 40 to 70 nucleotides, preferably another 50 to 60 nucleotides).
  • Aptamers are mainly manufactured by synthetic route, by techniques known to those skilled in the art (such as chemical or enzymatic synthesis). Aptamers are generally selected/identified by a directed molecular evolution process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment).
  • the aptamer may comprise at least one modified nucleotide (that is to say a nucleotide which is not a natural DNA or RNA nucleotide).
  • modified nucleotides can in particular be used to increase the resistance of the aptamer to degradation by nucleases. This is particularly advantageous for RNA aptamers, which are generally more sensitive to nucleases than DNA aptamers.
  • An RNA comprising at least one modified nucleotide is called modified RNA.
  • the aptamer can also comprise at least one additional group, in addition to the constituent nucleotides of its nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid of the aptamer can be linked to at least one additional group.
  • modified RNA an RNA comprising at least one modified nucleotide.
  • a modified RNA can in particular be an RNA in which the backbone of the nucleic acid is modified, in whole or in part, in particular to make it resistant to hydrolytic degradation, in particular due to the action of nucleases.
  • RNA can be modified in whole (i.e. each nucleotide which constitutes it is modified) or in part (i.e. only part of the nucleotides which constitute it is modified). When the RNA is partially modified, one can choose to modify all or part of the purines and/or all or part of the pyrimidines.
  • RNA and/or of a nucleotide
  • modifications of an RNA are well known to those skilled in the art and can in particular be chosen from: modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a phosphorothioate (PS) group (this is called the phosphorothioate skeleton); the use of a structure of the locked nucleic acid type (Locked Nucleic Acid, LNA), that is to say the formation of a methylene bridge in order to lock the ribose in the
  • additional group is meant a chemical group of any type and of any nature, not forming part of the nucleic sequence of the aptamer.
  • the additional group may in particular be chosen from: a radioisotope, an organic molecule comprising at most 100 carbon atoms, a nanoparticle, a protein (in particular a glycoprotein), a carbohydrate, a lipid, a polynucleotide, and any combination of these this.
  • the additional group is preferably chosen from: a detectable marker, a pharmacological compound, a compound capable of modifying the pharmacokinetic characteristics of a nucleic acid to which it is linked (such as polyethylene glycol (PEG)), and any combination of these.
  • PEG polyethylene glycol
  • the detectable label may be of any type, it may in particular be a fluorophore (for example fluorescein or luciferase), a radioisotope (in particular suitable for scintigraphy, for example 99m Tc), a label recognizable by an antibody (eg c-Myc protein or a polyhistidine tag), an affinity tag (eg biotin), an enzyme (eg horseradish peroxidase), a contrast, etc.
  • a fluorophore for example fluorescein or luciferase
  • a radioisotope in particular suitable for scintigraphy, for example 99m Tc
  • a label recognizable by an antibody eg c-Myc protein or a polyhistidine tag
  • an affinity tag eg biotin
  • an enzyme eg horseradish peroxidase
  • a contrast etc.
  • the pharmacological compound can also be of any type. It may in particular be an anti-cancer chemotherapy agent (such as a cytostatic or cytological agent), an antibody, a toxin, a hormone, an enzyme, an antiviral compound, an antibiotic compound, an antifungal compound, an antibacterial compound, etc.
  • an anti-cancer chemotherapy agent such as a cytostatic or cytological agent
  • an antibody such as an antibody, a toxin, a hormone, an enzyme, an antiviral compound, an antibiotic compound, an antifungal compound, an antibacterial compound, etc.
  • specific/target sequence of an aptamer or “specific/target sequence of an aptamer” is meant the part (section/region/portion) of the sequence of an aptamer which is specific for the ligand (of the target) of the aptamer, i.e. the sequence which is specific to a specific aptamer.
  • the specific sequence of an aptamer varies from one aptamer to another (therefore it is a variable sequence, as opposed to constant sequences which may also be present in an aptamer).
  • the specific sequence of an aptamer therefore differs from the primer sequences (or “constant” sequences, or “aspecific” sequences) likely to also be present in an aptamer.
  • primer sequence of an aptamer or “constant sequence of an aptamer” is meant a part (section/region/portion) of the sequence of an aptamer which is present in all the aptamers which have been identified/selected by the same session (the same implementation) of the selection method used (such as SELEX). This is generally the sequence of a primer used for the PCR step during SELEX.
  • An aptamer therefore generally comprises two primer sequences, one 5' to the specific/target sequence, and the other 3' to the specific/target sequence, thus allowing amplification by PCR. The primer sequences of an aptamer are therefore not specific/specific to the aptamer.
  • random sequence is meant a sequence serving as a control and designed randomly by the person skilled in the art (that is to say that the nucleotides which constitute it are assembled at random).
  • the random sequence preferably has the same length as that of the aptamer.
  • the random sequence preferably has the same "constant” sequences ("primers"; preferably 3' and/or 5') as the aptamer, if any.
  • the constant sequences bracket the random sequence of the aptamer (the constant sequences are therefore at 5' and/or at 3' of the random sequence of the random aptamer) to form a random aptamer whose complete sequence has the same length as that of the aptamer according to the invention also having constant sequences (identical to or different from those of the random aptamer, preferably identical).
  • a-Syn fibrillar a-Synuclein (a-Syn) protein
  • a molecule for example an aptamer
  • a molecule is able to distinguish at least two ⁇ -Syn fiber conformers when it exhibits a significantly stronger affinity for one ⁇ -Syn fiber conformer than the other ⁇ -Syn fiber conformer.
  • a molecule is able to distinguish at least two a-Syn fiber conformers when it has a binding capacity to an a-Syn fiber conformer significantly greater than its binding capacity to at least one other fiber conformer of a-Syn.
  • the molecule is able to distinguish at least two ⁇ -Syn fiber conformers when it exhibits a significantly lower dissociation constant for one ⁇ -Syn fiber conformer than for at least one other ⁇ -Syn fiber conformer.
  • a-Syn fibers are examples of the a-Syn fibers.
  • the molecule may in particular be capable of distinguishing at least the F-type a-Syn fiber conformer of the a-Syn protein from the R-type a-Syn fiber conformer of the a-Syn protein, if it has significantly higher affinity for (ability to bind to) the F-type a-Syn fiber conformer than to (than the) R-type a-Syn fiber conformer.
  • the molecule is able to distinguish the F-type a-Syn fiber conformer from the a -R-type Syn when its average (measured/calculated) dissociation constant for the F-type a-Syn fiber conformer is significantly lower than its average (measured/calculated) dissociation constant for the d-fiber conformer 'a-Syn type R.
  • a molecule is able to distinguish the fiber conformer of type F a-Syn from the fiber conformer of type R a-Syn when it is able to bind to the F-type a-Syn fiber conformer but not to the R-type a-Syn fiber conformer.
  • the molecule may be able to further distinguish the F-type a-Syn fiber conformer of the a-Syn protein from other a-Syn protein fiber conformers (such as the 65 fiber conformer and the fibers 91, in addition to the conformer of a-Syn type R fibers); and/or the molecule may in particular be capable of further distinguishing the F-type a-Syn fiber conformer of the a-Syn protein from other forms of the a-Syn protein (such as the a-Syn monomer and/or ⁇ -Syn oligomers).
  • other a-Syn protein fiber conformers such as the 65 fiber conformer and the fibers 91, in addition to the conformer of a-Syn type R fibers
  • the molecule may in particular be capable of further distinguishing the F-type a-Syn fiber conformer of the a-Syn protein from other forms of the a-Syn protein (such as the a-Syn
  • K d Equilibrium dissociation constant
  • Kd the constant which makes it possible to evaluate the affinity between two molecules (for example between an aptamer and a fiber of the protein a-Syn) .
  • This affinity is based on the nature, geometry and number of physicochemical interactions between the two molecules (electrostatic interaction, hydrogen bonds, van der Waals interaction and hydrophobic forces).
  • Kd is expressed in M (mol/l), often in nM or pM.
  • dissociation constants there are several techniques for determining/measuring dissociation constants, which are well known to those skilled in the art, such as ELISA, gel retardation assays, filtration, chromatography, thermophoresis, "pull -down", equilibrium dialysis, analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal calorimetric titration (ITC), nitrocellulose membrane filtration, etc.
  • the equilibrium dissociation constant can in particular be determined, under standard conditions, using the Scatchard and Lineweaver Burk representations well known to those skilled in the art.
  • ND neurodegenerative disease
  • NDs designate a group of pathologies with very diverse clinical symptoms which have in common to be chronic diseases with slow progression characterized by dysfunction and progressive death of nerve cells (Gao and Hong, 2008).
  • the disorders induced by this neurodegeneration can be motor, cognitive or even sensory. They worsen as the disease progresses and increasingly handicap patients.
  • the frequency of MNs increases significantly with age.
  • due to the progressive aging of the population the number of people suffering from NDs has increased considerably over the past decades and is expected to grow steadily in the years to come (Heemels, 2016).
  • NDs are extremely debilitating pathologies that gradually lead to a loss of patient autonomy.
  • MNs include in particular synucleinopathies.
  • synucleinopathy or “a-synucleinopathies” or “alpha-synucleinopathies” is meant a neurodegenerative disease characterized by the abnormal accumulation of a-Syn protein aggregates in neurons, nerve fibers or glial cells.
  • A-synucleinopathies are chronic and progressive pathologies that manifest themselves by motor and cognitive disorders and behavioral changes.
  • the synucleinopathies include in particular Parkinson's disease (PD), dementia with Lewy bodies (DCL) and multiple system atrophy (MSA). These three diseases have in common the occurrence of behavioral disorders in REM sleep, dysautonomia and an asymmetric parkinsonian syndrome.
  • Synucleinopathies also include rarer conditions, such as the various neuroaxonal dystrophies
  • diagnosis is meant the identification/determination of a disease, or the absence of a disease, in a subject.
  • Diagnosis includes, for example, the search for the causes (etiology) and effects (symptoms) of the disease, in particular on the basis of observations and/or measurements, carried out using various tools.
  • the diagnostic tools include the observation of cognitive, motor and sensory disorders experienced by patients and the detection/quantification of genetic and/or biochemical biomarkers. Genetic biomarkers can be alleles or mutations in the genome that have been identified as predisposing to ND.
  • Biochemical markers are biomolecules whose presence and/or quantity is correlated with the evolution of the pathology (for example the accumulation of alpha-Synuclein for synucleinopathies).
  • stratification is meant the separation/classification of subjects into subgroups by severity/g ravity of the disease.
  • the different subgroups include in particular the subgroup of healthy subjects as well as different subgroups of subjects suffering from a disease, classified according to the stage of evolution/advancement of the disease. It is also possible to stratify the subjects according to the type of symptoms present. The stage of evolution and the symptoms can be determined on the basis of observations and/or measurements, carried out using different tools. In the case of neurodegenerative diseases, stratification tools include tools that are also used for their diagnosis.
  • prognosis we mean the prediction/determination/assessment of the risks of progression of a disease in a subject.
  • the prognosis includes in particular the evaluation of the future development of the subject's condition and the possible chances of improvement or even cure.
  • the prognosis can be determined on the basis of observations and/or measurements, carried out using different tools.
  • prognostic tools include tools that are also used for their diagnosis or subject stratification.
  • monitoring is meant determining/assessing the progress of a disease in a subject. Monitoring can be carried out on the basis of observations and/or measurements, carried out using different tools, at different time intervals. Intervals can be regular or irregular. Their frequency depends on the disease but also on the stage of evolution of the disease. It may be of the order of a few days (for example in the event of illness severe/advanced/severe stage and/or in case of rapidly progressing disease and/or in case of exacerbation phase) to a few years (e.g. in case of disease at a preliminary, mild or moderate stage, and/ or in the case of a slowly progressing illness).
  • tracking tools include tools that are also used for disease diagnosis or prognosis, or subject stratification.
  • evaluation of the efficacy of a treatment we mean the determination of the clinical state of a subject subjected to a treatment.
  • the treatment can be preventive, for example in the case of a predisposition to a disease, or it can be curative, for example in the case of a diagnosed disease.
  • the effectiveness of the treatment can for example be evaluated by determining the state of the subject at different time intervals.
  • the condition of the subject can in particular be assessed before the first dose of the treatment and then at regular (or irregular) time intervals after this first dose (for example after each new dose of the treatment). A comparison of the state of the subject evaluated at these different intervals can then be made in order to identify any change.
  • an improvement, no worsening, or a worsening of the patient's condition less than that expected in the absence of treatment indicates that the treatment is effective, while a worsening of the patient's condition at least equal to that expected in the absence of treatment indicates that the treatment is not effective.
  • an absence of onset of the disease or an onset later and/or less severe than expected in the absence of treatment indicates that the treatment is effective, while such an early onset and severe than expected in the absence of treatment indicates that the treatment is not effective.
  • the patient's condition can be assessed on the basis of observations and/or measurements, carried out using different tools.
  • the tools for evaluating the effectiveness of a treatment include tools that are also used for the diagnosis, prognosis or monitoring of the disease, or the stratification of subjects.
  • Stage of a neurodegenerative disease means a phase of the neurodegenerative disease which is determined according to the severity of the symptoms the subject suffers and their implications/consequences on the subject's mode and/or quality of life. These stages can be four in number. For instance :
  • Stage 1 (or first stage) is referred to as mild disease or mild stage.
  • stage 2 we speak of moderate disease or moderate stage.
  • stage 3 we speak of severe disease or severe stage.
  • stage 4 we speak of very severe disease or very severe stage. The quality of life is, at this stage, considerably impaired.
  • Aggravation or “aggravation phase” means a period during which the clinical signs of a neurodegenerative disease increase in a subject suffering from said disease.
  • subject or “patient”, we mean a human individual or an animal other than a human.
  • the subject is for example a human or an animal likely to be affected by a neurodegenerative disease or suffering from such a disease.
  • the subject is preferably a human being.
  • the subject may be a child (human subject 16 years of age or younger) or an adult (human subject over 16 years of age).
  • healthy subject is meant a subject who does not suffer from the disease in question.
  • a healthy subject is preferably a subject who does not suffer from any neurodegenerative disease, more preferably a subject who does not suffer from any disease.
  • reference subject a subject who suffers from a known neurodegenerative disease (in particular a synucleinopathy, and in particular Parkinson's disease (PD), dementia with Lewy bodies (DCL) or multiple system atrophy (MSA) ), at a known stage.
  • a known neurodegenerative disease in particular a synucleinopathy, and in particular Parkinson's disease (PD), dementia with Lewy bodies (DCL) or multiple system atrophy (MSA)
  • PD Parkinson's disease
  • DCL dementia with Lewy bodies
  • MSA multiple system atrophy
  • Bio sample or “sample” from a subject means an entire organ or a tissue or part of such an organ or tissue, a fluid or a fraction of such a fluid, cells or cellular components , obtained from this subject, as well as a homogenate, a lysate or an extract prepared therefrom.
  • a “biological sample” or “sample” is preferably any tissue (preferably portions or fractions thereof) which may contain neurons and/or a-Syn proteins, including, but not including limited to, a sample of the central nervous system (CNS), such as a sample of the brain or a sample of the spinal cord, salivary glands, digestive system (e.g. colon), cerebrospinal fluid, plasma, blood , etc.
  • CNS central nervous system
  • the biological sample may have been obtained beforehand by any technique known in the profession. These techniques include, for example, surgery (such as stereotactic surgery), puncture, explant, excision, biopsy.
  • surgery such as stereotactic surgery
  • excision is meant a surgical procedure consisting in cutting (excising) a more or less wide or deep part of the tissue, preferably an abnormality or growth of the tissue. An excision may be performed to remove and/or analyze a cancerous or suspicious tumor.
  • biopsy here designates a sample of cells or tissues taken for analysis. Several types of biopsy procedures are known and practiced in the field.
  • the more common types include (1) incisional biopsy, in which only a sample of the tissue is taken; (2) excisional biopsy (or surgical biopsy), which consists of completely removing a tumor mass, thus carrying out a therapeutic and diagnostic procedure; and (3) needle biopsy, in which a tissue sample is removed using a needle, which can be coarse or fine.
  • Other types of biopsy exist, such as smear or curettage, and can also be used to obtain the sample. Therefore, the sample can be, for example, an explant, an excision, a biopsy, etc.
  • the sample is preferably obtained by a minimally invasive procedure, such as stereotactic surgery.
  • identity or “sequence identity” is meant an exact sequence correspondence between two polypeptides or amino acids, or between two molecules of nucleic acids or oligonucleotides.
  • the percentages of identity to which reference is made in the context of the presentation of the present invention are determined after optimal global alignment of the sequences to be compared, which can therefore comprise one or more additions, deletions, truncations and/or substitutions. This percentage of identity can be calculated by any sequence analysis method well known to those skilled in the art. The percentage of identity is determined after overall alignment of the sequences to be compared taken in their entirety, over their entire length. Besides manually, it is possible to determine the global alignment of sequences using the algorithm of Needleman and Wunsch (1970).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the EDNAFULL matrix (EMBOSS version of NCBI NUC4.4).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the matrix BLOSUM62.
  • sequence identity notably represents 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • RNA ribonucleic acid
  • the inventors have in fact selected and isolated modified RNA aptamers having different affinities for different ⁇ -Syn fiber conformers.
  • the aptamers developed are capable of distinguishing the conformers of F-type a-Syn fibers from the conformers of R-type a-Syn fibers, unlike the aptamers DNA versus a-Syn described in the prior art.
  • the aptamers developed by the inventors have a strong affinity for the conformer of ⁇ -Syn fibers of type F (dissociation constant K d between 5 and 10 nM).
  • these aptamers have a very low or even zero affinity for the conformer of fibers of a-Syn of type R, as well as the conformers of fiber 65 and 91 of a-syn.
  • the inventors have also demonstrated that these aptamers recognize with an affinity at least 10 times lower the a-Syn protein in native form (monomeric, non-fibrillar form).
  • the inventors have developed a method using a mixture of these aptamers which makes it possible to effectively discriminate these fiber conformers by high-throughput sequencing, applicable to patient samples.
  • the data show that these aptamers are tools for the specific and sensitive detection of the different fibers of a-Syn.
  • the present invention therefore provides both effective and reliable diagnostic methods for neurodegenerative diseases, methods for screening molecules but also tools for research in the field of neurodegenerative diseases.
  • Aptamers have several advantages: 1) they have affinities and recognition specificity for their target comparable to those of antibodies; 2) being oligonucleotides, they can be used in many molecular biology techniques (quantitative PCR, chip, rolling circle amplification, high-throughput sequencing, etc.); 3) they are easy to synthesize or amplify in vitro; 4) they can be easily coupled to a large number of compounds; 5) they are poorly immunogenic; 6) they are not subject to denaturation problems during storage; 7) they are very resistant to temperature changes; 8) they are significantly cheaper than antibodies.
  • the present invention therefore relates to an aptamer characterized in that it has the ability to distinguish at least two fiber conformers of the protein a-Synuclein (a-Syn), and in that it comprises, or consists essentially of, or consists of a specific sequence of modified ribonucleic acid (RNA) having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 (specific sequence of aptamer N30), SEQ ID NO: 2 (sequence specific for aptamer N124), SEQ ID NO: 3 (specific sequence for aptamer N3), SEQ ID NO: 4 (specific sequence for aptamer 4F02), SEQ ID NO: 5 (specific sequence for aptamer 4F03), SEQ ID NO: 6 (sequence specific for aptamer F124), and SEQ ID NO: 7 (sequence specific for aptamer P65); preferably chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5; more
  • the present invention relates in particular to an aptamer characterized in that it has the ability to distinguish the conformers of a-Syn fibers of the type F of the protein a-Syn (a-Syn) from the conformers of fibers of a- Syn type R, and in that it comprises, or consists essentially of, or consists of, a target/specific sequence of modified ribonucleic acid (RNA) having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ I D NO: 1 (specific sequence of aptamer N30), SEQ ID NO: 2 (specific sequence of aptamer N124), SEQ ID NO: 3 (specific sequence of aptamer N3), SEQ ID NO: 4 (sequence specific for aptamer 4F02), SEQ ID NO: 5 (sequence specific for aptamer 4F03), SEQ ID NO: 6 (sequence specific for aptamer F124), and SEQ ID NO: 7 (sequence specific for aptamer P65);
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific sequence of modified RNA having at least 86% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7; preferably chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 and SEQ ID NO:5; more preferably chosen from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific sequence of modified RNA having at least 87% identity, more preferably at least 88% identity, more preferably at least 89 % identity, more preferably at least 90% identity, more preferably at least 91% identity, more preferably at least 92% identity, more preferably at least 93% identity, of more preferably at least 94% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, more preferably at least 98% identity, more preferably at least 99% identity, with a specific sequence of modified RNA chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7; preferably chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5; more preferably chosen from SEQ ID NO:1, and SEQ ID NO:2.
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, and SEQ ID NO:7; preferably chosen from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5; more preferably chosen from SEQ ID NO:1, and SEQ ID NO:2.
  • SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7 are shown in Table 1 below -below.
  • Table 1 Specific sequences of aptamers N30, N124, N3, 4F02, 4F03, F124 and P65. [Table 1 ]
  • the aptamer according to the invention also has the ability to distinguish the conformers of fibers of a-Syn of type F from the monomers of a-Syn.
  • the aptamer according to the invention also has the ability to distinguish the conformers of fibers of type F a-Syn from the conformers of fibers 65 of a-Syn and/or of a-Syn fibers 91.
  • the aptamer according to the invention also has the ability to distinguish the conformers of F-type a-Syn fibers from the oligomers of a-Syn.
  • the aptamer according to the invention has the ability to distinguish the conformers of F-type a-Syn fibers from the conformers of R-type a-Syn fibers, as well as the conformers of a-Syn fibers 65, a-Syn fiber conformers 91, a-Syn oligomers and a-Syn monomers.
  • the aptamer according to the invention is specific for the conformers of ⁇ -Syn fibers of type F.
  • the aptamer according to the invention has no affinity for the conformers of R-type a-Syn fibers, as well as a-Syn fiber 65 conformers, a-Syn fiber conformer 91, and a-Syn monomers.
  • the dissociation constant K d ⁇ F) of the aptamer according to the invention, measured for the conformers of a-Syn fibers of type F, is lower (preferably significantly lower) than the dissociation constant K d(R > measured for the conformers of R-type a-Syn fibers, preferably at least 10 times lower, more preferably at least 11 times lower, more preferably still lower at least 12 times, more preferably at least 13 times less, more preferably at least 14 times less, more preferably at least 15 times less, more preferably at least 20 times less, of more preferably at least 25 times lower, more preferably at least 30 times lower, more preferably at least 40 times lower, more preferably at least 50 times lower, more preferably at least less than 100 times, preferably still less by at least 200 times, pr at least 300 times still lower, preferably at least 400 times still less, more preferably at least 500 times still less, more preferably at least 600 times still less, more preferably at least 600 times still less at least 700 times
  • the affinity of the aptamer according to the invention for the conformers of R-type a-Syn fibers is so low that the dissociation constant K d(R > cannot be measured /determined using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above).
  • the dissociation constant K d ⁇ F) of the aptamer according to the invention, measured for the conformers of fibers of type F a-Syn is lower (preferably significantly lower) than the dissociation constant K d(Mono) measured for the monomers of a-Syn, preferably lower by at least 2 times, preferably lower by at least 3 times, of preferably at least 4 times lower, preferably at least 5 times lower, preferably at least 6 times lower, preferably at least 7 times lower, preferably at least 8 times lower, than preferably at least 9 times lower, more preferably at least 10 times lower, more preferably at least 11 times lower, more preferably at least 12 times lower, more preferably at least 13 times, preferably still lower by at least 14 times, preferably still less lower by at least 15 times, more preferably lower by at least 20 times, more preferably at least 25 times lower, more preferably at least 30 times lower, more preferably at least 40 times lower, more preferably at least
  • the affinity of the aptamer according to the invention for the monomers of a-Syn is so low that the dissociation constant Ki mono) cannot be measured/determined using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above).
  • the dissociation constant K d ⁇ F) of the aptamer according to the invention, measured for the conformers of fibers of a-Syn of type F, is lower (preferably significantly lower) than the dissociation constant K d( 65> measured for the conformers of fibers 65 of a-Syn, preferably lower by at least 2 times, preferably lower by at least 3 times, preferably at least 4 times lower, preferably at least 5 times lower, preferably at least 6 times lower, preferably at least 7 times lower, preferably at least 8 times, preferably at least 9 times lower, more preferably at least 10 times lower, more preferably at least 11 times lower, more preferably at least 12 times lower, preferably still lower by at least 13 times, preferably still lower by at least 14 times, more preferably at least 15 times less, more preferably at least 20 times less, more preferably at least 25 times less, more preferably at least 30 times less, more preferably at least 40 times lower,
  • the affinity of the aptamer according to the invention for the conformers of fibers 65 of a-Syn is so low that the dissociation constant K d( 65> cannot be measured/determined using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above ).
  • the dissociation constant K d ⁇ F > of the aptamer according to the invention, measured for the conformers of fibers of a-Syn of type F, is lower (preferably significantly lower) than the dissociation constant K d ⁇ 9i> measured for the 91 fiber conformers of a-Syn, preferably lower by at least 2 times, preferably lower by at least 3 times, preferably at least 4 times lower, preferably at least 5 times lower, preferably at least 6 times lower, preferably at least 7 times lower, preferably at least 8 times, preferably at least 9 times lower, more preferably at least 10 times lower, more preferably at least 11 times lower, more preferably at least 12 times lower, preferably still lower by at least 13 times, preferably still lower by at least 14 times, more preferably at least 15 times less, more preferably at least 20 times less, more preferably at least 25 times less, more preferably at least 30 times less, more preferably at least 40 times lower
  • the affinity of the aptamer according to the invention for the conformers of 91 fibers of a-Syn is so low that the dissociation constant K d ⁇ 9i> cannot be measured/determined using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above).
  • the dissociation constant K d ⁇ F > of the aptamer according to the invention, measured for the conformers of fibers of a-Syn of type F, is lower (preferably significantly lower) than the dissociation constant K d(Random) of a random aptamer (that is to say an aptamer comprising a random sequence of modified RNA, preferably such as defined below in the “composition and kits” section) measured for the fiber conformers of F-type a-Syn, preferably at least 2 times lower, preferably at least 3 times lower, preferably at least 4 times lower, preferably at least 5 times, preferably at least 6 times lower, preferably at least 7 times lower, preferably at least 8 times lower, preferably at least 9 times lower, more preferably at least at least 10 times, more preferably at least 11 times less, more preferably at least 12 times less, more preferably at least 13 times less, more preferably at least 14 times less, more
  • the affinity of the random aptamer for the conformers of ⁇ -Syn fibers of type F is so low that the dissociation constant K d(random) cannot be measured/determined in using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above).
  • the dissociation constant K d ⁇ F) measured, in particular using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above), for the conformers of a-Syn fibers of type F is less than 50 nM, more preferably less than 40 nM, more preferably less than 30 nM, more preferably less than 25 nM, more preferably less than 20 nM, more preferably less than 18 nM, of more preferably less than 16 nM, more preferably less than 14 nM, more preferably less than 13 nM, more preferably less than 12 nM, more preferably less than 11 nM, more preferably less than 10 nM, more preferably less than 9 nM, more preferably less than 8 nM, more preferably less than 7 nM.
  • the dissociation constant K d ⁇ R > measured, in particular using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above), for the conformers of a-Syn fibers of type R is greater than 100 nM, more preferably greater than 150 nM, more preferably greater than 200 nM, more preferably greater than 300 nM, more preferably greater than 400 nM, more preferably greater than 500 nM, more preferably greater than 600 nM, more preferably greater than 700 nM, more preferably greater than 800 nM, more preferably greater than 900 nM, more preferably greater than 1000 nM.
  • the affinity of the aptamer according to the invention for the conformers of R-type a-Syn fibers is so low that the dissociation constant K d(R > cannot be measured /determined using the usual methods for determining dissociation constants (such as those listed in the definition section above).
  • the aptamer according to the invention has at least one dissociation constant K d as follows: a) the dissociation constant K d ⁇ F > measured for the conformers of a-Syn fibers of type F is less than 15 nM, preferably less than 10 nM; and/or b) the dissociation constant K d ⁇ R> measured for the conformers of R-type a-Syn fibers is greater than 100 nM, preferably greater than 500 nM.
  • the dissociation constant K d of an aptamer is for example measured using the usual methods for determining dissociation constants, preferably chosen from those listed in the definition section above, more preferably by filtration, more preferably by nitrocellulose membrane filtration.
  • the aptamer according to the invention further comprises: i. 5' to the specific sequence, a modified RNA 5' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 29 (primer sequence P72 of aptamers N, at 5'), and SEQ ID NO :30 (primer sequence P73 of aptamers 4F, F, R and P, in 5′), preferably located at the 5′ end of the specific sequence; and or ii.
  • RNA 3' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 31 (3' PiRT primer), SEQ ID NO: 32 (Sequence G of 24 nts in 3′), and SEQ ID NO: 33 (PiRT-G; PiTR primer+G sequence combination, in 3′), preferably located at the 3′ end of the specific sequence.
  • the aptamer is in the form “5’ Primer - Specific sequence” (in the 5’ - 3’ direction of the modified RNA sequence).
  • the aptamer is in the form "Specific sequence - 3' primer” (in the 5' - 3' direction of the modified RNA sequence).
  • the aptamer is in the form "Primer 5' - Specific sequence - Primer 3'" (in the 5' - 3' direction of the sequence of modified RNA), the latter form being hereinafter referred to as “complete aptamer sequence” (or “combined aptamer sequence”).
  • sequences SEQ ID NO:29 to SEQ ID NO:33 are shown in Table 2 below.
  • the aptamer according to the invention comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete sequence of modified RNA having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 34 (complete sequence of aptamer N30, with 5' and 3' primers, but without G sequence), SEQ ID NO: 35 (complete sequence of aptamer N124), SEQ ID NO: 36 (complete sequence of aptamer N3), SEQ ID NO: 37 (complete sequence of aptamer 4F02), SEQ ID NO: 38 (complete sequence of aptamer 4F03), SEQ ID NO: 39 (complete sequence of aptamer F124), and SEQID NO:40 (complete sequence of aptamer P65), preferably chosen from SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, and SED ID NO:38; more preferably chosen from
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete sequence of modified RNA having at least 86% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, and SEQ ID NO:40; preferably chosen from SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, and SEQ ID NO:38; more preferably chosen from SEQ ID NO:34 and SEQ ID NO:35.
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete sequence of modified RNA having at least 87% identity, more preferably at least 88% identity, more preferably at least 89% identity, more preferably at least 90% identity, more preferably at least 91% identity, more preferably at least 92% identity, more preferably at least 93% identity, more preferably more preferably at least 94% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, more preferably at least 98% identity identity, more preferably at least 99% identity, with a complete sequence of modified RNA chosen from SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, and SEQ ID NO:40; preferably chosen from SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, and SEQ ID NO:38; more preferably chosen from SEQ ID NO:34 and SEQ ID
  • the aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 , SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, and SEQ ID NO:40; preferably chosen from SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, and SEQ ID NO:38; more preferably chosen from SEQ ID NO:34 and SEQ ID NO:35.
  • Table 3 Complete sequence of aptamers N30, N124, N3, 4F02, 4F03, F124 and P65. [Table 3]
  • the aptamer according to the invention may also comprise, 3' to the complete sequence "5' Primer - Specific sequence - 3'Primer" as defined above, a modified RNA 3' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with SEQ ID NO:32, preferably located at the 3' end of the aptamer.
  • the aptamer is in the form "Primer 5' - Specific sequence - Primer 3' - Sequence G” (in the 5' - 3' direction of the modified RNA sequence), this form being hereinafter referred to as “complete aptamer G sequence” (or combined aptamer G sequence).
  • the RNA of the aptamer according to the invention (that is to say of any aptamer as described above, including the specific sequence of the aptamer, the sequence of the 5' and/or 3' primers, the complete sequence of the aptamer, and the complete G sequence of the aptamer) has been modified in order to increase its resistance to RNA nucleases.
  • the RNA of the aptamer according to the invention has been modified by at least one modification chosen from: modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a phosphorothioate (PS) group (this is called the phosphorothioate skeleton); the use of a locked nucleic acid type structure (Locked Nucleic Acid, LNA), i.e.
  • LNA locked nucleic Acid
  • the RNA of the aptamer according to the invention has preferably been modified by at least one modification chosen from modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); and any combination thereof.
  • the riboses of the pyrimidines bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the modified IRNA of the aptamer according to the invention is an RNA whose riboses of the pyrimidine nucleotides (pyrimidine nucleotides) carry an atom fluorine on the carbon in the 2' position, preferably in which the riboses of the purine nucleotides (purine nucleotides) are unchanged (therefore it is a 2'Fluoropyrimidine RNA (RNA2'F-Py)).
  • RNA2'F-Py 2'Fluoropyrimidine RNA
  • the aptamer according to the invention further comprises at least one additional group as defined above in the “Definitions” section.
  • the additional group can be added to any nucleotide of the aptamer.
  • the additional group(s) is (are) preferably located at the 3' end of the aptamer, or at the 5' end of the aptamer, or at the end 3' and at the 5' end of the aptamer.
  • aptamers having a strong affinity for the conformer of ⁇ -Syn fibers of the F type (dissociation constant K d between 5 and 10 nM).
  • these aptamers exhibit a very low or even zero affinity for the conformer of fibers of a-Syn of type R, as well as the conformers of fibers 65 and 91 of a-syn.
  • the inventors have also demonstrated that these aptamers recognize with an affinity at least 10 times lower the a-Syn protein in native form (monomeric, non-fibrillar form).
  • the inventors have developed a method using a mixture of these aptamers which makes it possible to effectively discriminate these fiber conformers by high-throughput sequencing, applicable to patient samples.
  • the present invention therefore relates to a composition
  • a composition comprising, or consisting essentially of, at least one aptamer according to the invention (as defined above).
  • the present invention further relates to a kit comprising, or consisting essentially of, at least one aptamer according to the invention (as defined above).
  • the composition or the kit further comprises at least one additional aptamer chosen from aptamers comprising, or consisting essentially of, or consisting of, a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO:8 (sequence specific for aptamer NO), SEQ ID NO:9 (sequence specific for aptamer N1), SEQ ID NO:10 (sequence specific for aptamer N2), SEQ ID NO: 11 (specific sequence of aptamer N4), SEQ ID NO: 12 (specific sequence of aptamer N5), SEQ ID NO: 13 (specific sequence of aptamer N15), SEQ ID NO: 14 ( specific sequence of aptamer N20), SEQ ID NO: 15 (sequence specific for aptamer N37), SEQ ID NO: 16 (specific sequence for aptamer N62) and SEQ ID NO: 17 (specific sequence for aptamer N73), SEQ ID NO: 18 (specific sequence for aptamer chosen from
  • the additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific sequence of modified RNA having at least 86% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, and SEQ ID NO:28.
  • the additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific sequence of modified RNA having at least 87% identity, more preferably at least 88% identity, more preferably at least 89 % identity, more preferably at least 90% identity, more preferably at least 91% identity, more preferably at least 92% identity, more preferably at least 93% identity, of more preferably at least 94% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, more preferably at least 98% identity, more preferably at least 99% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID
  • the additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a specific modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 , SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, and SEQ ID NO:28.
  • a specific modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ
  • Table 4 Specific sequences of additional aptamers NO, N1, N2, N4, N5, N15, N20, N37, N62, N73, N164, 4F01, 4F04, 4F05, R01, R02, R03, R04, R05, R84 and P91 [Table 4]
  • At least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention further comprises: i. 5' of the specific sequence, a 5' primer sequence of modified RNA having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 29 (primer sequence P72 of the aptamers N, at 5') and SEQ ID NO: 30 (primer sequence P73 of aptamers 4F, F, R and P, at 5'), preferably located at the 5' end of the specific sequence; and/or ii.
  • RNA 3' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 31 (3' PiRT primer), SEQ ID NO: 32 (Sequence G of 24 nts in 3′) and SEQ ID NO: 33 (PiRT-G; PiTR primer+G sequence combination, in 3′), preferably located at the 3′ end of the specific sequence.
  • the additional aptamer is in the form "5' Primer - Additional Aptamer Specific Sequence" (in the 5' - 3' direction of the modified RNA sequence).
  • the additional aptamer is in the form "Additional aptamer specific sequence - 3' primer” (in the 5'-3' direction of the RNA sequence amended).
  • the additional aptamer is in the form "5' Primer - Additional Aptamer Specific Sequence - 3' Primer” (in the 5' - 3' direction of the modified RNA sequence), the latter form being referred to hereinafter as “complete sequence of the additional aptamer” (or combined sequence of the additional aptamer).
  • sequences SEQ ID NO:29 to SEQ ID NO:33 are shown in Table 2 above.
  • At least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention is chosen from aptamers comprising, or consisting essentially of, or consisting of, a complete sequence of modified RNA having at least 85% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 41 (complete sequence of the aptamer NO, with primers 5 'and 3 ', but without sequence G), SEQ ID NO: 42 (complete sequence of aptamer N1), SEQ ID NO: 43 (complete sequence of aptamer N2), SEQ ID NO: 44 (complete sequence of aptamer N4), SEQ ID NO: 45 (complete sequence of aptamer N5), SEQ ID NO: 46 (complete sequence of aptamer N15), SEQ ID NO: 47 (complete sequence of aptamer N20), SEQ ID NO: 48 (complete sequence of aptamer N37), SEQ ID NO: 49 (complete sequence of aptamer N62) and SEQ ID NO: 50 (complete sequence of aptamer N73
  • At least one additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete sequence of modified RNA having at least 86% identity with a sequence chosen from SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:
  • the additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete sequence of modified RNA having at least 87% identity, more preferably at least 88% identity, more preferably at least 89 % identity, more preferably at least 90% identity, more preferably at least 91% identity, more preferably at least 92% identity, more preferably at least 93% identity, of more preferably at least 94% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, more preferably at least 98% identity, more preferably at least 99% identity, with a complete modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46,
  • At least additional aptamer comprises, or consists essentially of, or consists of, a complete modified RNA sequence chosen from SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, and SEQ ID NO:61.
  • sequences SEQ ID NO:41 to 61 are shown in Table 5 below.
  • At least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention may also comprise, 3′ of the complete sequence “Primer 5′ - Additional aptamer specific sequence - Primer 3′” as defined above, a sequence modified RNA 3' primer having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity
  • the additional aptamer is in the form "Primer 5' - Specific sequence additional aptamer - Primer 3' - Sequence G" (in the 5'-3' direction of the modified RNA sequence), this form being referred to below as “complete sequence G of the additional aptamer” (or combined sequence G of the additional aptamer).
  • the RNA of at least one aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention has been modified in order to increase its resistance to RNA nucleases.
  • the RNA of at least one aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention (preferably the RNA of all the aptamers according to the invention of the composition or of the kit according to the invention) has been modified by at least one modification chosen from: modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a
  • RNA of at least one aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention has preferably been modified by at least one modification chosen from modification of the OH function on the carbon in the 2′ position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); and any combination thereof.
  • modification of the OH function on the carbon in the 2′ position of the ribose by methylation the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an O-Methoxyethyl group
  • the RNA of at least one aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention has been modified so that the riboses of the pyrimidine nucleotides bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the modified RNA of the aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention is an RNA in which the riboses of the pyrimidine nucleotides (pyrimidine nucleotides) bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position, preferably in which the riboses of the purine nucleotides (purine nucleotides) are unchanged (it therefore acts as an RNA 2'Fluoro-pyrimidines (RNA2'F-Py)).
  • RNA2'F-Py RNA 2'Fluoro-pyrimidines
  • the RNA of at least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention has been modified in order to increase its resistance to RNA nucleases.
  • the RNA of at least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention (preferably the RNA of all the additional aptamers of the composition or of the kit according to the invention) has been modified by at least a modification chosen from: modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a phosphorothioate (
  • the RNA of at least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention has preferably been modified by at least one modification chosen from modification of the OH function on the carbon in the 2′ position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); and any combination thereof.
  • modification of the OH function on the carbon in the 2′ position of the ribose by methylation the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group
  • the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group the substitution of the
  • the RNA of at least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention (preferably the RNA of all the additional aptamers of the composition or of the kit according to the invention) has been modified so that the riboses of pyrimidine nucleotides carry a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the modified RNA of the additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention is an RNA whose the riboses of the pyrimidine nucleotides (pyrimidine nucleotides) bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position, preferably in which the riboses of the purine nucleotides (purine nucleotides) are unchanged (therefore it is an RNA 2'Fluoro-pyrimidines (RNA2'F-Py)).
  • RNA2'F-Py RNA 2'Fluoro-pyrimidines
  • the RNA of all the additional aptamers of the composition or of the kit according to the invention has been modified as defined above.
  • the RNA of at least one additional aptamer of the composition or of the kit according to the invention (preferably of all the additional aptamers of the composition or of the kit according to the invention) has been modified in the same way way that the RNA of at least one aptamer according to the invention of the composition or of the kit according to the invention (preferably of all the aptamers according to the invention of the composition or of the kit according to the invention).
  • the composition or the kit according to the invention comprises, or consists essentially of, or consists of, at least the following aptamers: aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 1 (sequence specific for aptamer N30), aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 2 (sequence specific for aptamer N124), aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO:3 (specific sequence of aptamer N3), aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity with SEQ ID NO: 8 (specific sequence of aptamer NO), aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity, with SEQ ID NO: 9 (specific sequence of aptamer N1), aptamer comprising a specific sequence of modified RNA having at least 85% identity, with SEQ ID NO
  • a specific molecular imprint (a characteristic signature or even a distinctive profile) can be obtained for a biological sample containing different conformers of the a-Syn protein.
  • This specific molecular fingerprint can be used in the diagnosis, prognosis, stratification or even monitoring of neurodegenerative diseases, in particular synucleinopathies.
  • the composition or the kit according to the invention comprises, or consists essentially of, or consists of, at least the aptamers (that is to say an assortment/mixture of aptamers) comprising a modified RNA specific sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89 % identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94 % identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99 % identity, preferably 100% identity, with the following sequences: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13
  • At least one aptamer from the assortment of aptamers of the composition or of the kit according to the invention further comprises: i. 5' to the specific sequence, a modified RNA 5' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 29 (primer sequence P72 of aptamers N, at 5') and SEQ ID NO: 30 (primer sequence P73 of aptamers 4F, F, R and P, in 5'), preferably located at the 5' end of the specific sequence; and/or
  • RNA 3' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98 % identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 31 (3' PiRT primer), SEQ ID NO: 32 (Sequence G of 24 nts in 3', cf page 128 of the thesis) and SEQ ID NO: 33 (PiRT-G; PiTR primer+G sequence combination, in 3'), preferably located at the 3' end of the specific sequence.
  • the composition or the kit according to the invention comprises, or consists essentially of, or consists of, at least the aptamers (that is to say an assortment/mixture of aptamers) comprising a complete modified RNA sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with the following sequences: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO :42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:
  • At least one aptamer of the assortment of aptamers of the composition or of the kit according to the invention may also comprise, in 3′ of the complete sequence “Primer 5′ - Aptamer specific sequence assortment - Primer 3′” as defined above, a modified RNA 3' primer sequence having at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity identity, preferably at least 94% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with SEQ ID NO:32, preferably located at the 3' end of the aptamer of the assortment.
  • the aptamer of the assortment is in the form "Primer 5' - Aptamer specific sequence assortment - Primer 3' - Sequence G" (in the 5' - 3' direction of the RNA sequence modified), this form being referred to hereinafter as "complete sequence G of the aptamer of the assortment” (or combined sequence G of the aptamer of the assortment).
  • the composition or the kit according to the invention further comprises at least one aptamer (aptamer called "random aptamer”) comprising, or consisting essentially of, or consisting of, a random sequence of modified RNA having at at least 85% identity, preferably at least 86% identity, preferably at least 87% identity, preferably at least 88% identity, preferably at least 89% identity, preferably at least at least 90% identity, preferably at least 91% identity, preferably at least 92% identity, preferably at least 93% identity, preferably at least 94% identity, preferably at least at least 95% identity, preferably at least 96% identity, preferably at least 97% identity, preferably at least 98% identity, preferably at least 99% identity, preferably 100% identity, with a sequence chosen from SEQ ID NO:62 (Scr-1), and SEQ ID NO:63 (Scr-2), preferably with SEQ ID NO:63.
  • Table 6 shows the sequences SEQ ID NO:62 and SEQ ID NO:63.
  • the RNA of at least one random aptamer of the composition or of the kit according to the invention has been modified in order to increase its resistance to RNA nucleases.
  • the RNA of at least one random aptamer of the composition or of the kit according to the invention (preferably the RNA of all the random aptamers of the composition or of the kit according to the invention) has been modified by at least a modification chosen from: modification of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); the replacement of the phosphodiester (PO) by a phosphorothioate (
  • the RNA of at least one random aptamer of the composition or of the kit according to the invention has preferably been modified by at least a modification chosen from modification of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by methylation; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by an O-Methoxyethyl group; the substitution of the OH function on the carbon in the 2' position of the ribose by an amino group; the substitution of the OH function on the carbon in position 2' of the ribose by a halogen (in particular by fluorine); and any combination thereof this.
  • the RNA of at least one random aptamer of the composition or of the kit according to the invention has been modified so that the riboses of pyrimidine nucleotides carry a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • the modified IRNA of the random aptamer of the composition or of the kit according to the invention is an RNA whose riboses of the pyrimidine nucleotides (pyrimidine nucleotides) bear a fluorine atom on the carbon in the 2' position.
  • RNA2'F-Py 2'Fluoro-pyrimidine RNA
  • the RNA of at least one random aptamer of the composition or of the kit according to the invention (preferably of all the random aptamers of the composition or of the kit according to the invention) has been modified in the same way so that the RNA of at least one aptamer according to the invention and/or of at least one additional aptamer (as defined above) of the composition or of the kit according to the invention (preferably of all the aptamers according to the invention and/or of all the additional aptamers of the composition or of the kit according to the invention).
  • the kit according to the invention is characterized in that, when the kit comprises several aptamers, these are: a) all in a single composition, or b) distributed in several distinct compositions in separate containers , including the case where each of the aptamers is in a separate composition located in a separate container.
  • the kit according to the invention further comprises instructions for use.
  • composition or the kit according to the invention may also comprise an excipient (chosen for example from carriers, solvents, diluents, adjuvants, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, absorption, and any combination thereof), a buffer solution (selected, for example, from Tris, Hepes, phosphate, sodium, and any combination thereof), a solution of divalent ions (selected, for example, from magnesium ions , calcium, sodium, potassium and any combination thereof), an enzyme (chosen for example from DNA polymerases, RNA polymerases, reverse-transcriptase, ligases, and any combination thereof), nucleotides, etc, and any combination thereof.
  • excipient Chosen for example from carriers, solvents, diluents, adjuvants, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, absorption, and any combination thereof
  • a buffer solution selected, for example, from Tris, Hepes, phosphate, sodium, and any
  • the excipients, buffer solutions, solution of divalent ions, enzymes, nucleotides, etc. may each be in a separate composition located in a separate container, or may be mixed in pairs or more in separate compositions in separate containers, or all in one composition. They can also be mixed with one or more aptamers from the kit.
  • excipients include water, NaCl, saline solutions, saccharide solutions (e.g. glucose, trehalose, sucrose, dextrose, etc.), Ringer's milk, alcohols, oils, gelatins, carbohydrates such as lactose, amylose or starch, fatty acid esters, hydroxymethylcellulose, etc. (see for example the most recent edition of Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins).
  • composition or the kit according to the invention can also comprise the compounds necessary for the amplification (in vitro) of the conformers of ⁇ -Syn fibers of type F and/or of type R.
  • the amplification of the conformers of fibers can be carried out by any technique known to those skilled in the art. Such techniques include in particular methods for the cyclic amplification of misfolded proteins (PMCA, for "protein misfolding cyclic amplification” in English), for example as described in Fenyi et al., 2019.
  • composition or the kit according to the invention may further comprise a buffer solution suitable for the amplification of ⁇ -Syn fiber conformers (chosen for example from Tris, Tris-HCl, Hepes, KCl, and any combination thereof), and/ or ⁇ -Syn monomers, etc.
  • a buffer solution suitable for the amplification of ⁇ -Syn fiber conformers (chosen for example from Tris, Tris-HCl, Hepes, KCl, and any combination thereof), and/ or ⁇ -Syn monomers, etc.
  • RNA ribonucleic acid
  • the present invention therefore provides useful aptamers for carrying out screening of molecules but also tools for research in the field of neurodegenerative diseases.
  • the present invention therefore relates to the in vitro use of at least one aptamer according to the invention, of at least one composition according to the invention, of at least one kit according to the invention, or of any combination of these, for: a) detecting the presence or absence of at least one conformer of ⁇ -Syn type F fibers in a biological sample; b) quantifying (ie determining the amount of) a conformer of ⁇ -Syn type F fibers in a biological sample; c) establishing a molecular fingerprint of a-Syn fiber conformers, preferably of a-Syn F and R type a-Syn fibers, in a biological sample; d) screening compounds/molecules capable of detecting and/or recognizing an F-type a-Syn fiber conformer, preferably screening compounds/molecules capable of discriminating F-type a-Syn fiber conformers from conformers of R-type a-Syn fibers; or e) any combination of a) to d
  • the in vitro use for a) detecting the presence or absence of at least one F-type ⁇ -Syn fiber conformer in a biological sample preferably comprises the following steps:
  • Detection methods can use in particular ELISA techniques, gel retardation tests, filtration (in particular filtration on a nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, equilibrium dialysis , analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal titration calorimetry (ITC), PCR, quantitative PCR, sequencing (including high-throughput sequencing) , DNA chips etc.
  • ELISA techniques gel retardation tests, filtration (in particular filtration on a nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, equilibrium dialysis , analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal titration calorimetry (ITC), PCR, quantitative PCR, sequencing (including high-throughput sequencing) , DNA chips etc.
  • the in vitro use for b) quantifying (i.e. determining the amount of) a conformer of ⁇ -Syn type F fibers in a biological sample preferably comprises the following steps:
  • the quantification methods can in particular use ELISA techniques, gel retardation tests, filtration (in particular filtration on a nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, dialysis with balance, analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal calorimetric titration (ITC), PCR, quantitative PCR, high-throughput sequencing, chip DNA etc.
  • Methods for molecular fingerprinting of a-Syn conformers, particularly of F-type a-Syn fiber conformers include ELISA techniques, gel retardation assays, filtration (including filtration on nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, equilibrium dialysis, analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic tests , isothermal calorimetric titration (ITC), PCR, quantitative PCR, high-throughput sequencing, DNA chip etc.
  • composition or a kit according to the invention comprising at least 2 aptamers will preferably be chosen, and in particular a composition or a kit comprising an assortment of aptamers as defined above. -above.
  • the in vitro use for d) screening compounds/molecules capable of detecting and/or recognizing a conformer of ⁇ -Syn type F fibers preferably comprises the following steps:
  • the quantification methods can in particular use ELISA techniques, gel retardation tests, filtration (in particular filtration on a nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, dialysis with balance, analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal calorimetric titration (ITC), PCR, quantitative PCR, high-throughput sequencing, chip DNA etc.
  • ELISA techniques gel retardation tests, filtration (in particular filtration on a nitrocellulose membrane), chromatography, thermophoresis, "pull-down” tests, dialysis with balance, analytical ultracentrifugation, surface plasmon resonance (SPR), spectroscopic assays, isothermal calorimetric titration (ITC), PCR, quantitative PCR, high-throughput sequencing, chip DNA etc.
  • the in vitro use according to the invention (i.e. the use as described above for a) detecting the presence or absence of at least one conformer of a-Syn fibers of type F in a biological sample, b) quantify a conformer of fibers of type F of a-Syn in a biological sample, c) establish a molecular fingerprint of conformers of fibers of a-Syn in a biological sample, d) screening for compounds/molecules capable of detecting and/or recognizing an F-type a-Syn fiber conformer, and any combination thereof) further comprises a step 1') performed before step 1), amplification (in vitro) of conformers of F-type and/or R-type a-Syn fibers in a biological sample or a sample of conformers of F-type a-Syn fibers.
  • fibers can be made by any technique known to those skilled in the art. Such techniques include in particular protein misfolding cyclic amplification (PMCA) methods
  • aptamers according to the invention can be used as tools for diagnosis, prognosis, stratification or even monitoring of neurodegenerative diseases, in particular synucleinopathies, or even for evaluating the effectiveness of a treatment .
  • a specific molecular fingerprint (a characteristic signature or even a distinctive profile) can be obtained for a biological sample containing different conformers of the a-Syn protein.
  • This specific molecular fingerprint makes it possible to distinguish neurodegenerative diseases from each other, in particular synucleinopathies.
  • the present invention therefore relates to an in vitro method for diagnosing a synucleinopathy in a subject having at least one symptom of a neurodegenerative disease, comprising: a) bringing a biological sample from the subject (called sample (A)) into contact with at least one aptamer according to the invention, at least one composition according to the invention, at least one kit according to the invention, or any combination thereof; b) the detection of the presence or the absence of at least one conformer of fibers of type F a-Syn, the quantification of the conformers of fibers of type F a-Syn, the establishment of a fingerprint molecular conformers of a-Syn fibers (preferably of a-Syn F and R type a-Syn fibers), or any combination thereof, in the subject's biological sample; and c) diagnosing the presence or absence of a synucleinopathy in the subject based on the result of step b).
  • the subject is suffering from a synucleinopathy, if the presence of at least one conformer of ⁇ -Syn type F fibers is detected and/or if a molecular fingerprint specific to a synucleinopathy is obtained .
  • the method further comprises a step a′) carried out before step a), of amplification (in vitro) of the conformers of F-type and/or R-type a-Syn fibers in a biological sample from said subject (referred to as sample (A)).
  • sample (A) a biological sample from said subject
  • the amplification of the fiber conformers can be carried out by any technique known to those skilled in the art. Such techniques include in particular protein misfolding cyclic amplification (PMCA) methods, for example as described in Fenyi et al., 2019.
  • PMCA protein misfolding cyclic amplification
  • the method further comprises a step b′) carried out between step b) and step c), of detecting the presence or absence of at least one conformer of F-type a-Syn fibers, quantification of conformers of F-type a-Syn fibers, establishment of a molecular fingerprint of conformers of a-Syn fibers, Syn (preferably a-Syn F and R type a-Syn fibers), or any combination thereof, in one or more biological sample(s) from subject(s) of reference.
  • the reference subject(s) preferably comprises at least one reference subject suffering from a synucleinopathy and optionally at least one healthy reference subject.
  • the method may further comprise a step b”) carried out between step b′) and step c), of comparison of the conformers of F-type a-Syn fibers detected, of the conformers of quantified F-type a-Syn fibers, and/or of the molecular fingerprint of the F-type a-Syn fiber conformers obtained, for steps b) and b′).
  • step c) includes diagnosing the synucleinopathy in the subject based on the comparison in step b”).
  • the subject will be diagnosed as suffering from a synucleinopathy if the comparison of step b') shows that the result of step b) is comparable to that obtained in step b') for a reference sample of a reference subject suffering from synucleinopathy (depending on the different reference samples, more accurate diagnosis among synucleinopathies can potentially be made on the same principle), and as not suffering from synucleinopathy if the result of step b ) is comparable to that obtained in step b′) for a reference sample from a healthy reference subject.
  • the method according to the invention may comprise steps a′), a), b), and c) as described above, or steps a), b), b′), and c) such as described above, or steps a'), a), b), b'), and c) as described above, or steps a), b), b'), b”), and c) as described above, or else steps a′), a), b), b′), b”), and c) as described above.
  • the present invention further relates to an in vitro method for stratifying a synucleinopathy, prognosing a synucleinopathy, monitoring a synucleinopathy, or evaluating the efficacy of a treatment for a synucleinopathy in a subject suffering from a synucleinopathy, comprising: a) bringing a biological sample from the subject (called sample (A)) into contact with at least one aptamer according to the invention, at least one composition according to the invention, at least one kit according to the invention, or any combination thereof; b) the detection of the presence or the absence of at least one conformer of fibers of type F a-Syn, the quantification of the conformers of fibers of type F a-Syn, the establishment of a fingerprint structure of a-Syn fiber conformers (from preferably ⁇ -Syn type F and ⁇ -Syn R fibers, or any combination thereof, in the subject's biological sample; and c) stratifying the synucleinopathy, pro
  • the synucleinopathy is aggravated, or the prognosis for the synucleinopathy is negative, or the synucleinopathy has evolved, or the treatment for the synucleinopathy is ineffective or not very effective, if the presence of at least one conformer is detected of a-Syn type F fibers and/or if a molecular fingerprint specific to a synucleinopathy is obtained.
  • the method further comprises a step a′) carried out before step a), of amplification (in vitro) of the conformers of F-type and/or R-type a-Syn fibers in a biological sample from said subject (referred to as sample (A)).
  • sample (A) a biological sample from said subject
  • the amplification of the fiber conformers can be carried out by any technique known to those skilled in the art. Such techniques include in particular protein misfolding cyclic amplification (PMCA) methods, for example as described in Fenyi et al., 2019.
  • PMCA protein misfolding cyclic amplification
  • the in vitro method for prognosis and/or stratification further comprises a step b′) carried out between step b) and step c ), detection of the presence or absence of at least one conformer of F-type a-Syn fibers, quantification of the conformers of F-type a-Syn fibers, establishment of a fingerprint molecular structure of a-Syn fiber conformers (preferably a-Syn F- and R-type a-Syn fibers), or any combination thereof, in one or more biological sample(s) reference subject(s).
  • the reference subject(s) preferably comprises at least one subject suffering from a synucleinopathy at a known prognosis/stage/level of stratification (preferably at least one reference subject suffering from a synucleinopathy at a known prognosis/stage/level of stratification, the synucleinopathy being the same for the reference subject and for the tested/prognosticated subject) and optionally at least one healthy reference subject.
  • a sample from a reference subject suffering from a synucleinopathy use may in particular be made of a sample from a subject suffering from Parkinson's disease (PD), dementia with Lewy bodies (LCD) or multiple system atrophy (MSA).
  • PD Parkinson's disease
  • LCD dementia with Lewy bodies
  • MSA multiple system atrophy
  • the method may further comprise a step b”) carried out between step b′) and step c), of comparison of the conformers of F-type a-Syn fibers detected, of the conformers of quantified F-type a-Syn fibers, and/or of the molecular fingerprint of the F-type a-Syn fiber conformers obtained, for steps b) and b′).
  • step c) comprises the prognosis and/or the stratification of the synucleinopathy in the subject according to the comparison of step b”).
  • the subject will have a comparable prognosis, and/or will be stratified as being at a comparable stage/level of stratification, to that of a reference subject with the same synucleinopathy at a known prognosis/stage/level of stratification, if the comparison of step b') shows that the result of step b) is comparable to that obtained in step b') for a reference sample of the reference subject (according to the different reference samples, a prognosis and/ or a more precise stratification among the different stages can potentially be done on the same principle).
  • the subject will have a more negative prognosis, and/or will be stratified as being at a more advanced (more severe) stage/level of stratification, than a reference subject with the same synucleinopathy at a known prognosis/stage/level of stratification or a healthy reference subject, if the result of step b) shows a greater detection of F fibers, or a higher quantity of F-type a-Syn fibers, or a molecular fingerprint richer in fibers F, than that obtained in step b′) for a reference sample from the reference subject or from the healthy reference subject.
  • the subject will have a better prognosis, and/or will be stratified as being at a less advanced stage/level of stratification (less severe), than a reference subject suffering from the same synucleinopathy at a prognosis/stage/ known level of stratification, if the result of step b) shows a lower detection of F fibers, or a lower quantity of F-type a-Syn fibers, or a molecular fingerprint poorer in F fibers, than that obtained in step b′) for a reference sample of the reference subject.
  • the method according to the invention may comprise steps a′), a), b), and c) as described above, or steps a), b), b′), and c) such as described above, or steps a'), a), b), b'), and c) as described above, or steps a), b), b'), b”), and c) as described above, or else steps a′), a), b), b′), b”), and c) as described above.
  • the in vitro method of stratifying a synucleinopathy, prognosing a synucleinopathy, monitoring a synucleinopathy, or evaluating the effectiveness of a treatment of a synucleinopathy in a subject suffering from a synucleinopathy further comprises a step b') carried out between step b) and step c), of detecting the presence or absence of at least one conformer of F-type a-Syn fibers, quantification of the conformers of F-type a-Syn fibers, establishment of a molecular fingerprint of conformers of a-Syn fibers ( preferably, a-Syn F and R type a-Syn fibers, or any combination thereof, in a second biological sample from the test subject (referred to as sample (B)).
  • Said second sample (B) was preferably obtained/taken after sample (A), for example during a second visit (sample (A) then having been obtained during a first visit), preferably said sample (B) having been obtained at least 24 hours after sample (A), more preferably at least 48 hours after sample (A), more preferably at least 72 hours after sample (A ), more preferably at least 7 days after sample (A), more preferably at least 10 days after sample (A), more preferably at least 15 days after sample (A), more preferably at least
  • sample (A) was obtained between 7 days and 6 months after sample (A), more preferably said sample (B) having been obtained between 10 days and 5 months after sample (A), more preferably between 15 days and 4 months, more preferably between 21 days and 3 months, more preferably between 30 and 60, more preferably between 40 and 50 days.
  • the method can further comprise a step b”) carried out between step b′) and step c), of comparison of the conformers of type F a-Syn fibers detected, of the conformers of quantified F-type a-Syn fibers, and/or the molecular fingerprint of the obtained F-type a-Syn fiber conformers, for steps b) (therefore for sample (A) of the subject ) and b') (therefore for the sample (B) of the subject).
  • step c) includes synucleinopathy stratification, synucleinopathy prognosis, synucleinopathy follow-up, the evaluation of the effectiveness of the treatment of the synucleinopathy, in the subject, according to the comparison of step b”).
  • the subject will be stratified as being at an unchanged/comparable stage/level of stratification, or the subject will have an unchanged/comparable prognosis, or the synucleinopathy will have little or no progress in the subject (will be stable), or the treatment of the synucleinopathy will be reasonably effective, if the comparison of step b') shows that the result of step b) is comparable to that obtained in step b').
  • the subject will be stratified as being at a more advanced (more severe) stage/level of stratification, or the subject will have a more negative prognosis, or the synucleinopathy will have evolved (worsened, worsened) in the subject, or the treatment of the synucleinopathy will be ineffective or not very effective, if the result of step b) shows a greater detection of F fibers, or a higher quantity of F-type a-Syn fibers, or a molecular fingerprint richer in fibers F, than that obtained in step b').
  • the subject will be stratified as being at a less advanced stage/level of stratification (less severe), or the subject will have a better prognosis, or the synucleinopathy will have improved (will be less severe, will have receded) in the subject , or the treatment of the synucleinopathy will be effective, if the result of step b) shows a lower detection of F fibers, or a lower quantity of F-type a-Syn fibers, or a lower molecular fingerprint in fibers F, than that obtained in step b′).
  • the method according to the aforementioned embodiment may also further comprise a step a′) carried out before step a), of amplification (in vitro) of the conformers of a-Syn fibers of type F and/or of type R in sample (A) and/or sample (B).
  • the amplification of the fiber conformers can be carried out by any technique known to those skilled in the art. Such techniques include in particular protein misfolding cyclic amplification (PMCA) methods, for example as described in Fenyi et al., 2019.
  • PMCA protein misfolding cyclic amplification
  • the method according to the invention may comprise steps a′), a), b), and c) as described above, or steps a), b), b′), and c) such as described above, or steps a'), a), b), b'), and c) as described above, or steps a), b), b'), b”), and c) as described above, or else steps a′), a), b), b′), b”), and c) as described above.
  • FIG. 1 Representative example of barcodes/molecular fingerprints of a-Syn fiber conformers of type F (left panel), R (middle panel) and 91 (right panel) obtained following controlled proteinase proteolysis K (PK) at different times in minutes (1, 5 or 15 min, indicated at the top of each panel; Landureau et al., 2021).
  • PK proteinase proteolysis K
  • FIG. 2 Results of the screening of the 28 candidate aptamers and their associated random sequences against the F, R, 65 and 91 fibers of a-Syn: Ratio between the amount of oligonucleotide remaining bound on the nitrocellulose membrane compared to the amount of their associated random sequence (Scr1-G or Scr2-G) remained linked.
  • the graphs show the ratio between the amount of oligonucleotide remaining bound on the nitrocellulose membrane relative to the amount of associated random sequence (Scr1-G or Scr2-G) remaining bound.
  • FIG. 3 Measurement of the affinity of aptamer N30-G for a-Syn fibers of type F or R.
  • FIG. 4 Measurement of the affinity of aptamer N30-G for "amyloid-b" type fibers or the P110 fiber of a-Syn or the monomers of a-Syn.
  • FIG. 5 Measurement of the affinity of aptamer N124-G for a-Syn fibers of type F or R.
  • FIG. 6 Measurement of the affinity of aptamer N124-G for "amyloid-b" type fibers or the P110 fiber of a-Syn or the monomers of a-Syn.
  • FIG. 7 Detection of F-type a-Syn fibers by aptamer N30-G by separation on Sp6 column.
  • FIG. 8 Representative example of a molecular fingerprint of the presence of a conformer by analyzing the aptamer frequency of a mixture by high-throughput sequencing.
  • FIG. 9 Molecular fingerprint of the presence of an F or R conformer in a medium by sequencing the evolution of the frequency of 15 oligonucleotides.
  • a mixture of 14 aptamers (named N) and a control sequence (named Scr-2 (for Scramble 2)) was incubated in a medium containing F or R fiber conformers (respectively conditions Fn1 to Fn3 and Rn1 to Rn3 ) or in a fiber-free medium (conditions 0n1 to 0n4).
  • the figure represents the evolution of the frequency of each aptamer in the mixture compared to its initial frequency in the mixture. This analysis reveals a specific signature for each conformer.
  • RNA chemistry in which all the pyrimidines are modified in the 2' position of their ribose by a fluorine group. This chemical modification is known to greatly increase the resistance of RNAs to degradation by RNAses.
  • the affinity of the aptamers was evaluated using a second method, which consists in measuring the quantity of complex formed by varying the concentration of the aptamer, and leaving that of the target constant. During these measurements, we place us in such a way that the target concentration is so high compared to the aptamer concentration, so we can neglect the quantity of target bound to the aptamer compared to the quantity of free target.
  • the curve of the quantity of complex formed as a function of the concentration of candidate initially present must be hyperbolic and show saturation.
  • aptamers M5-15 and T-S0508 selected by Tsukakoshi and his collaborators respectively in 2010 and 2012 (Tsukakoshi et al., 2010, 2012), were chosen. These aptamers in DNA chemistry have been selected to recognize the monomeric and oligomeric forms of a-syn respectively.
  • T-S0508 which recognized a-Syn oligomers with a kd of 68 nM, was shown to also have affinity for A640 oligomers (kd of 25 nM).
  • aptamers F5R1 and F5R2 which are also in DNA chemistry and were selected in 2019 by Zheng et al., (Zheng et al., 2018; Ren et al., 2019). They recognize Ga-Syn with kds of 2.4 and 3.07 nM respectively.
  • the DNA chemistry aptamer Tau 3146 was also tested. This aptamer was isolated by a rapid process called “Non-SELEX", during which three successive rounds of selection without amplification between selections were carried out against the monomeric Tau 441 isoform (Lisi et al., 2018).
  • Aptamer Tau 3146 has been shown to be able to bind to Tau 441, Tau 381, Tau 352 and Tau 383 isoforms with kds of 13 ⁇ 3nM, 116 ⁇ 6nM, 84 ⁇ 6 nM and 49 ⁇ 4nM respectively.
  • the affinity of candidate aptamers as well as that of aptamers from the literature was also measured against different "amyloid" type fibers (Tau1 N3R fibers and A640 fibers), in addition to the F and R fiber conformers of a-syn.
  • the affinity of candidate aptamers against the a-Syn "P110" fiber was also measured. This fiber was made from a-Syn proteins truncated from amino acid no. 110 (the 30 amino acids of the C-terminal domain are therefore missing).
  • Oligonucleotides at 10 nM (hybridized by heat shock to SpG-LNA radioactively labeled with P32 for RNA2'F chemistry oligonucleotides, or directly labeled with P32 for DNA oligonucleotides) were presented to the proteins at 250 nM in a Ts1X solution containing 0.1% Igepal and ssDNA added in a 5-1 proportion relative to the oligonucleotides (ie between 0.135 pg/ml and 17.325 pg/ml). After 30 min of incubation at 37° C., 25 ml of each mixture is deposited on the nitrocellulose membrane, then filtered.
  • the measurements were carried out in triplicate (three independent experiments on different days) for the a-Syn fibers of the F and R type, and in duplicate for the other fibers (Tau1 N3R and the A640 fibers, and P110) as well as for a-syn monomers.
  • the oligonucleotides radioactively labeled with P32 (by hybridization to a SpG-LNA labeled with P32 for the RNA2'F-Py sequences, by direct labeling for the DNA sequences) were mixed with the proteins at 250 nM (fiber F or monomers of a -syn) in Ts1X, Igepal 0.1%. After 30 min of incubation at 37° C, 25 ⁇ l of the mixtures were deposited on an Sp6 column whose buffer had been changed beforehand to Ts1X. After a first centrifugation of the deposit, the column was washed twice with Ts1X. The columns were finally eluted by washing with 2% SDS solution. The fractions were then deposited in a 24-well plate, and the plate exposed for several hours on a photostimulable phosphor screen. Exposure analysis allowed quantification of each of the fractions for each condition.
  • a mixture of 14 aptamers (named N) and a control sequence (named Scr-2 (for Scramble 2)) was incubated in a medium containing F or R fiber conformers (respectively conditions Fn1 to Fn3 and Rn1 to Rn3 ) or in a fiber-free medium (conditions 0n1 to 0n4).
  • the mixture was filtered on an exclusion column and the sequences retained on the column after 3 washes were eluted with 2% SDS.
  • Phenol-chloroform extraction the mixture of oligonucleotides was amplified by RT-PCR. During this step, the sequences were extended by "adaptor" sequences allowing their high-throughput sequencing. After purification by agarose gel electrophoresis, the mixtures were sequenced by high-throughput sequencing. 1.2. Results
  • Table 8 shows the sequences of successful candidates.
  • Table 8 - Sequences of selected aptamer candidates. The random parts (i.e. the specific parts) of the sequences are underlined, and the constant parts corresponding to the sites of the primers are not underlined. Scr-1 and Scr-2 aptamers have a random sequence.
  • Figure 2 shows that the aptamers N3, N30, N124, 4F01, 4F02, 4F03, 4F05, F124 and P65 remain bound to the conformers of F-type a-Syn fibers in much larger quantities than random sequences.
  • candidates N3-G, N30-G and N124-G remain on average 3.5 times more bound to F-type a-Syn fibers than Scr2-G.
  • the coefficient of variation is expressed, the ratio between the standard deviation of the values and their mean.
  • the "reproducibility” column gives the number of experiments for which binding between the aptamer and the target was measured. The symbol “-” means that no experiment was carried out. The mention “No binding” is indicated in the table when the binding of the aptamer tested is not significantly greater than that of the random sequence associated with it.
  • aptamers N30-G, N124-G, T-S0508 and F5R1 bind to F-type a-Syn fibers with K d less than 10 nM at each experiment.
  • Aptamers T-S0508 and F5R1 also bound to R-type a-Syn fibers in each experiment, while aptamers N30-G and N124-G did not bind to R-type a-Syn fibers in each experiment. significantly superior to their associated random sequences.
  • Aptamers M5-15, F5R2 and Tau 3146 bind neither to F fibers nor to R-type a-Syn fibers (no binding significantly greater than their associated random sequences).
  • the data reveal that only the N30-G and N124-G aptamers are able to discriminate the F fiber from the R fiber among the tested aptamers.
  • the aptamers of the prior art recognize either the 2 fibers with comparable affinities (aptamers T-S0508 and F5R1), or are not able to recognize the fibers of type R a-Syn nor the fibers of a-Syn type F (M5-15, F5R2 and Tau 3146).
  • the aptamers T-S0508 and F5R1 have lower K d values for the F fiber and higher Bmax values for the R fiber (differing on the order of a factor of 2). However, a difference in K d of a factor of 2 is not sufficient to allow reliable discrimination between the 2 types of fibers.
  • Figures 4 and 6 further show that aptamers N30 and N124 show no affinity for a-Syn monomers.
  • aptamers N30 and N124 have a highly specific affinity for the F fiber of a-Syn. Indeed, the aptamers N30 and N124 are capable of discriminating, in a reproducible and specific manner, the F fiber of a-Syn not only from the R fiber of a-Syn but also from the monomer of a-Syn and other types of fibers such as amyloid-B fibers.
  • aptamer N30-G The affinity of aptamer N30-G for F fiber conformers or monomers was tested by exclusion column filtration (Sp6 from Biorad). The capacities of aptamer N30-G were compared to those of aptamer T-S0508. Scr2-G and Scr_DNA sequences were used as controls.
  • the inventors have developed a new diagnostic method using a mixture of aptamers to diagnose the presence of a fiber conformer in a medium (Figure 8).
  • a selection of 14 of the 28 aptamers developed was mixed in equimolar quantity, as well as a control sequence. This mixture was incubated in a medium containing no fiber or containing either F or R fiber conformers. The mixtures were then deposited on an Sp6 exclusion column. After amplification and purification, the mixtures were sequenced by high-throughput sequencing. The proportion of each sequence in the mixture is compared to the starting proportion.
  • Figure 9 represents the evolution of the frequency of each aptamer in the mixture compared to its initial frequency in the mixture. This analysis reveals a specific signature for each conformer.

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Abstract

La présente invention concerne un aptamère caractérisé en ce qu'il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d'α-Syn de type F de la protéine α-Syn (α-Syn) des conformères de fibres d'α-Syn de type R, et en ce qu'il comprend une séquence spécifique d'acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d'identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, et SEQ ID NO :7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2. La présente invention concerne en outre une composition ou un kit comprenant au moins de ces aptamères, ainsi que leurs utilisations in vitro. La présente invention porte également sur une méthode de diagnostic de synucléinopathies ainsi qu'une méthode de stratification, de suivi, de pronostic et d'évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une synucléinopathie, comprenant l'utilisation d'au moins un aptamère et/ou une composition et/ou un kit susmentionné.

Description

TITRE : APTAMERES ARN SPECIFIQUES DE CONFORMERES DE FIBRES DE LA PROTEINE A-
SYNUCLEINE
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne les domaines des aptamères et des maladies neurodégénératives, en particulier des synucléinopathies.
La présente invention concerne un aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Synucléine (a-Syn) des conformères de fibres d’a-Syn de type R, et en ce qu’il comprend une séquence spécifique d’acide ribonucléique modifié (ARN modifié) ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, et SEQ ID NO :7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2.
La présente invention se rapporte en outre à une composition ou à un kit comprenant au moins un de ces aptamères, ainsi qu’à leurs utilisations. La présente invention porte également sur une méthode de diagnostic de maladies neurodégénératives ainsi qu’une méthode de stratification, de suivi, de pronostic et d’évaluation de l’efficacité d’un traitement d’une synucléinopathie, comprenant l’utilisation d’au moins un aptamère et/ou une composition et/ou un kit susmentionné.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Le diagnostic des maladies neurodégénératives, telles que les maladies dAlzheimer, de Parkinson, d'Huntington, de Creutzfeldt-Jakob ou la démence à corps de Lewy, repose sur l’observation des troubles cognitifs, moteurs et sensoriels éprouvés par les patients. Ce diagnostic est cependant rendu difficile à poser car les symptômes de ces différentes maladies sont très similaires, surtout aux premiers stades de la maladie. Souvent, un diagnostic certain ne peut être posé que lorsque la maladie a atteint un stade avancé et que le patient souffre des formes les plus sévères des symptômes (Gômez-Rio et al., 2016). Il est donc capital de mettre au point de nouvelles méthodes de diagnostic permettant de faire une distinction fiable entre les différentes maladies neurodégénératives (MNs). En sus, un meilleur diagnostic permettrait de donner aux patients un suivi et un pronostic plus fiable de l’évolution de la maladie, et de mieux évaluer l’efficacité des traitements administrés. De plus, les symptômes moteurs liés à ces maladies apparaissent souvent très tard dans le processus, alors que les dommages neuronaux sont déjà très importants. Par exemple, on estime que lorsque les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson apparaissent, 50% des neurones dopaminergique de la substantia nigra sont déjà morts (Cheng et al., 2010). Pouvoir détecter le début des MNs avant l’apparition des symptômes moteurs est donc essentiel, car cela permettrait de commencer des traitements plus tôt, lorsque le phénomène de neurodégénérescence n’a pas encore pris trop d’ampleur.
Deux types de marqueurs ont été plus particulièrement étudiés pour diagnostiquer les MNs: les biomarqueurs génétiques et biochimiques.
Les biomarqueurs génétiques peuvent être des allèles ou des mutations dans le génome qui ont été identifiés comme prédisposant à la maladie. Ce type de marqueurs permet ainsi d’identifier une population « à risque », qui a une plus forte probabilité de développer des MNs.
Les marqueurs biochimiques sont des biomolécules dont la présence et/ou la quantité est corrélée à l’évolution de la pathologie. Par exemple, la maladie de Parkinson est marquée d’un point de vue histologique par l’accumulation d’alpha-Synucléine (ou a-Synucléine ou a- Syn) au sein de corps de Lewy (Katsuno et al., 2018). Les marqueurs biochimiques sont donc considérés comme des marques de l’apparition et du développement de la maladie alors que les biomarqueurs génétiques sont plutôt des facteurs de prédisposition à développer la maladie. L’identification de marqueurs biochimiques peut ainsi permettre de détecter l’apparition d’une maladie de manière précoce, de réaliser des diagnostics plus précis, de suivre l’évolution de la maladie plus facilement, et aussi d’évaluer avec précision l’efficacité d’une thérapie. Actuellement, de nombreux efforts sont donc à l’œuvre pour identifier de tels marqueurs qui seraient présents dans les tissus ou fluides biologiques des patients (sang, sérum, fluide cérébrospinal etc.) et consisteraient en des signatures distinctives de chaque maladie (Agrawal and Biswas, 2015; Beach, 2017).
L'accumulation d'agrégats de protéines dans le système nerveux central est une caractéristique commune à plusieurs troubles neurodégénératifs progressifs (par exemple les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, d'Huntington et de Creutzfeldt-Jakob). Un mauvais repliement tridimensionnel de certaines protéines peut augmenter leur tendance à se lier entre elles et à transmettre ce mauvais repliement les unes aux autres. Les formes agrégées de ces protéines s'accumulent alors progressivement et peuvent interférer avec la fonction normale des neurones, ce qui peut progressivement aboutir à leur mort. Parmi les protéines pouvant former ce type d'agrégats, on peut citer la protéine a-Synucléine, la protéine Tau, l'Huntingtine, le peptide bêta-amyloïde ou la protéine PrP. Il a été démontré que la conformation tridimensionnelle pathologique de ces protéines pouvait être transmissible non seulement entre les cellules mais également d'un individu à l'autre. Ceci a permis de démontrer que certaines protéines, appelées "Prions", pouvaient être des agents infectieux au même titre que les virus, les bactéries et les parasites. Même si la transmission d'un individu à l'autre a surtout été démontrée pour la protéine PrP, des études récentes ont démontré que d'autres protéines impliquées dans les maladies neurodégénératives pourraient avoir des propriétés comparables. Parmi ces protéines, on peut également citer la protéine a-Synucléine, la protéine Tau, l'Huntingtine ou le peptide bêta-amyloïde.
Les fibres d’a-Synucléine (a-Syn) sont retrouvées au sein d’agrégats de protéines dans le cerveau de patients souffrant de certaines MNs regroupées sous le nom de « synucléinopathies ». Ces maladies comprennent entre autres : la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l’atrophie Multi-Systématisée (AMS). Les fibres d'a-Syn sont composées de milliers de répétitions de protéine anormalement repliées. Elles se forment par recrutement successif des protéines, selon un mécanisme de propagation où une protéine d'a-Syn mal repliée transmet sa conformation erronée lorsqu’elle se lie à une autre protéine. Récemment, plusieurs formes de fibres d'a-Syn avec des conformations structurales distinctes ont été isolées et il a été mis en évidence qu’elles pourraient induire des pathologies différentes (Peelaerts et al., 2015; Rey et al., 2019). Ces différentes conformations sont appelées des conformères. Parmi ces conformères, on peut citer les conformères de fibres d'a-Syn de type F, R, 91 et 65 (Bousset et al., 2013; Makky et al., 2016). Les conformères de fibres d'a-Syn de type F, 65 et 91 ont une forme cylindrique, tandis que les conformères de fibres de type R ont une forme de rubans plats, les fibres 91 et 65 sont torsadées mais avec des pas d’hélices différents. Des analyses par RMN du solide et microscopie à force atomique ont permis de préciser les différences structurales entre ces quatre conformères de fibres. Ainsi ces conformères de fibres sont longues de 1 à 2 pm en moyenne, avec une largeur de l’ordre de 15 à 20 nm, les conformères de fibres d’a-Syn de type F étant les moins larges, et les conformères de fibres 65 les plus larges. Leur hauteur est de l’ordre de 5 à 7 nm, les conformères de fibres d’a-Syn de type R étant les moins hautes et les conformères de fibres 65 les plus hautes. Enfin, les conformères de fibres 65 et 91 présentent des variations périodiques de la hauteur, à la différence des conformères de fibres d’a-Syn de type F et R. D’autres analyses ont aussi mis en évidence que les quatre conformères de fibres avaient des propriétés mécaniques différentes. Ainsi, les conformères de fibres d’a-Syn de type F sont les plus rigides, avec une mesure de la résistance à la flexion quatre fois supérieure au conformères de fibre R et deux fois supérieure aux conformères de fibres 65 et 91 . Les conformères de fibres d'a-Syn peuvent également être distingués les uns des autres par une analyse par protéolyse ménagée à la protéinase K. Leur différence structurale aboutit à des profils de dégradation qui sont différents d’un conformère à une autre. Ces profils sont comparables à des codes barres (ou empreinte digitales) spécifiques à chaque conformère (voir un exemple de profil de dégradation en Figure 1 (Landureau et al., 2021 )). De plus, la forme entière de la protéine dans les conformères de fibres d’a-Syn de type F est plus résistante à la protéolyse que dans le conformère de type R (Fenyi et al., 2021 ).
Différentes études suggèrent que ces différents conformères de fibres d'a-Syn pourraient être des marqueurs spécifiques des différentes synucléinopathies. Un modèle animal de rat a permis de mettre en évidence que l’injection de conformères de fibres de type F ou R dans le cerveau d’animaux conduisait à deux phénotypes différents. Il a été notamment montré que les conformères de fibres d’a-Syn de type F provoquaient dans ce modèle un déficit moteur plus important, tandis que les conformères de fibres d’a-Syn de type R engendraient un nombre plus important de dépôts de types de corps et de neurite de Lewy (Peelaerts et al., 2015). Des études plus récentes ont mis en évidence que les conformères de fibres obtenues chez des patients souffrant de MP ou d’AMS ressemblaient aux conformères de fibres de type R tandis que les fibres issues des patients souffrant de DCL ressemblaient aux conformères de fibres de type F (Van der Perren et al., 2020).
Il est donc essentiel de développer des méthodes permettant une détection efficace, spécifique, sensible et fiable de ces marqueurs.
Plusieurs anticorps ont été développés pour pouvoir quantifier I'a-Syn dans le plasma ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) (W02007/011907 ; Perrin et al., 2003; Vaikath et al., 2019). Cependant, la plupart de ces anticorps ne sont pas spécifiques d'une conformation particulière de la protéine. De ce fait, ils permettent de doser la protéine mais ne sont pas utiles d'un point de vue diagnostique car ils ne permettent pas de déterminer la quantité de protéine qui est sous forme agrégée. De nouveaux anticorps ont été développés pour reconnaître spécifiquement la forme agrégée de la protéine par rapport à la forme monomérique (Vaikath et al., 2015). Cependant, ces anticorps ne sont pas spécifiques d'un type de fibre particulier. D'autre part, il est toujours difficile et coûteux d'utiliser plusieurs anticorps pour quantifier plusieurs biomarqueurs en même temps.
Dans ce contexte, les aptamères offrent des possibilités avantageuses. Les aptamères sont des structures d’acides nucléiques ayant des propriétés comparables aux anticorps. Ils sont généralement obtenus par un processus d’évolution moléculaire dirigée nommé SELEX (Sytematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Depuis la découverte du SELEX dans les années 90, l’utilisation des aptamères a été validée expérimentalement pour de nombreuses applications (diagnostic, purification, thérapie...). De plus, un aptamère anti- VEGF (Macugen®) a d’ores et déjà reçu une AMM pour le traitement des dégénérescences maculaires de l’œil.
Quelques études ont conduit à l’identification d’aptamères d’ADN reconnaissant I'a-Syn. Un aptamère ADN (nommé M5-15) a été sélectionné contre la forme monomérique d’a-Syn. Toutefois, cet aptamère se fixe également de manière non spécifique sur les formes oligomériques et fibrillaires d’a-Syn (Tsukakoshi et al., 2010). Une deuxième étude a permis d’obtenir un second aptamère ADN (T-S0508) capable de discriminer la forme oligomérique des formes monomériques et fibrillaires d’a-Syn. Néanmoins des tests complémentaires ont mis en évidence que cet aptamère reconnaissait également la forme oligomérique d’Amyloïde-b avec une affinité du même ordre de grandeur (Kd d’environ 100 nM ; Tsukakoshi et al., 2012). Les aptamères F5R1 et F5R2, qui sont également en chimie ADN, ont été sélectionnés en 2019 par Zheng et ses collaborateurs. Ils reconnaissent Ga-Syn avec des kd respectivement de 2.4 et 3.07 nM (Zheng et al., 2018; Ren et al., 2019). D’autres aptamères en chimie ADN ont également été sélectionnés par Derosa et ses collaborateurs (WO201979887). Aucun de ces différents aptamères n’a été évalué pour sa capacité à discriminer différents conformères de fibres d'a-Syn.
Au vu de l’importance des fibres d'a-Syn et, notamment des conformères de fibres d’a-Syn de type F et R, dans le diagnostic de différentes maladies neurodégénératives, il est primordial de mettre au point des molécules capables de distinguer les différents conformères de fibres d'a-Syn, en particulier des conformères de fibres d’a-Syn de type F et R.
La présente invention permet de répondre à ce besoin.
EXPOSE DE L’INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des aptamères d’acide ribonucléique (ARN) capables de reconnaître de manière spécifique certains conformères de fibres d’a-Syn. Les Inventeurs ont en effet sélectionné et isolé des aptamères ARN ayant des affinités différentes pour différents conformères de fibre d’a-Syn.
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les aptamères mis au point sont capables de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R, à la différence des aptamères ADN contre l’a-Syn décrits dans l’art antérieur.
Les données montrent en particulier que les aptamères mis au point par les Inventeurs ont une forte affinité pour le conformère de fibres d’a-Syn de type F (constante de dissociation Kd entre 5 et 10 nM). De manière inattendue, ces aptamères présentent en revanche une affinité très faible voire nulle pour le conformère de fibres d’a-Syn de type R. Les Inventeurs ont également mis en évidence que ces aptamères reconnaissent avec une affinité au moins 10 fois plus faible la protéine a-Syn sous forme native (forme monomérique, non fibrillaire). De façon remarquable, les Inventeurs ont développé une méthode utilisant un mélange de ces aptamères qui permet de discriminer efficacement ces conformères de fibre par séquençage à haut-débit, applicables à des échantillons de patients.
Les données montrent que ces aptamères sont des outils de détection spécifique et sensible des différentes fibres d’a-Syn. La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de diagnostic efficace et fiable des maladies neurodégénératives, des méthodes de criblage de molécules mais également des outils pour la recherche dans le domaine des maladies neurodégénératives.
La présente invention concerne donc un aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn (a-Syn) des conformères de fibres d’a-Syn de type R, et en ce qu’il comprend une séquence spécifique d’acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6 et SEQ ID NO :7, de préférence choisie parmi SEQ I D NO : 1 et SEQ ID NO :2. Selon un mode de réalisation préféré, l’ARN a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à-vis des nucléases ARN, de préférence en modifiant les riboses des pyrimidines de l’aptamère pour qu’ils portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'.
La présente invention concerne en outre une composition ou un kit comprenant au moins de ces aptamères, ainsi que leurs utilisations. La présente invention porte également sur une méthode de diagnostic de maladies neurodégénératives ainsi qu’une méthode de stratification, de suivi, de pronostic et d’évaluation de l’efficacité d’un traitement d’une synucléinopathie, comprenant l’utilisation d’au moins un aptamère et/ou une composition et/ou un kit susmentionné.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Résumé de l’invention
La présente invention concerne un aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn (a-Syn) des conformères de fibres d’a-Syn de type R, et en ce qu’il comprend une séquence spécifique d’acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, et SEQ ID NO :7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2. Selon un mode de réalisation de l’aptamère selon l’invention, la constante de dissociation Kd(F) mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est : a) inférieure à la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; b) inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a- Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; c) inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; d) inférieure à la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; e) inférieure à la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; ou f) inférieure à la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois.
Selon un mode de réalisation de l’aptamère selon l’invention, au moins une constante de dissociation Kd est comme suit : a) la constante de dissociation Kd<F> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est inférieure à 15 nM, de préférence inférieure à 10 nM ; et/ou b) la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R est supérieure à 100 nM, de préférence supérieure à 150 nM.
La présente invention concerne en outre un aptamère tel que ci-dessus, comprenant en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 et SEQ ID NO :30, de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :31 , SEQ ID NO :32 et SEQ ID NO :33, de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
La présente invention concerne en outre un aptamère tel que ci-dessus, comprenant une séquence d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40, de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35.
La présente invention concerne également un kit comprenant au moins un aptamère selon l’invention.
Selon un mode de réalisation du kit selon l’invention, le kit comprend en outre au moins un aptamère additionnel choisi parmi les aptamères comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 , SEQ ID NO :16 et SEQ ID NO :17 , SEQ ID NO :, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 , SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, et SEQ ID NO :28 ; le kit comprenant de préférence en outre un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
Selon un mode de réalisation du kit selon l’invention, au moins un aptamère additionnel comprend en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 et SEQ ID NO :30, de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ I D NO : 31 , SEQ ID NO :32, et SEQ ID NO :33, de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
La présente invention concerne également un kit tel que ci-dessus, dans lequel au moins un aptamère additionnel est choisi parmi les aptamères comprenant une séquence d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43 , SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48 et SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51 , SEQ ID NO :52 , SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, et SEQ ID NO :60.
Selon un mode de réalisation du kit selon l’invention, le kit comprend au moins les aptamères suivants : aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :1 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :2, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :3 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :8, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :9, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :10 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 11 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :12 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 13 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :14, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 16, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :17, et aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 18; le kit comprenant de préférence en outre un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
Le kit selon l’invention est de préférence caractérisé en ce que, lorsque le kit comprend plusieurs aptamères, ceux-ci sont : a) tous dans une seule composition, ou b) répartis dans plusieurs compositions distinctes dans des récipients séparés, incluant le cas où chacun des aptamères est dans une composition distincte située dans un récipient séparé.
La présente invention concerne en outre un aptamère tel que ci-dessus ou un kit tel que ci- dessus, dans lequel l’ARN de l’aptamère ou de tous les aptamères du kit a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à-vis des nucléases ARN, de préférence dans lequel les riboses des pyrimidines de l’aptamère ou de tous les aptamères du kit portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'.
La présente invention concerne également une utilisation in vitro d’au moins un aptamère selon l’invention, d’au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci, pour : a) détecter la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; b) déterminer la quantité d’un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; c) établir une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn, de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn, dans un échantillon biologique ; d) cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître d’un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de préférence cribler des composés/molécules capables de discriminer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R ; ou e) une combinaison quelconque de a) à d). La présente invention concerne également une méthode in vitro de diagnostic d'une synucléinopathie chez un sujet ayant au moins un symptôme de maladie neurodégénérative, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet avec au moins un aptamère selon l’invention, avec au moins un kit selon l’invention, ou avec une combinaison quelconque de ceux-ci; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) le diagnostic de la présence ou l’absence d’une synucléinopathie chez le sujet en fonction du résultat de l’étape b).
La présente invention concerne également une méthode in vitro de stratification d'une synucléinopathie, de pronostic d'une synucléinopathie, de suivi d'une synucléinopathie, ou d’évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une synucléinopathie chez un sujet souffrant d’une synucléinopathie, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet avec au moins un aptamère selon l’invention, avec au moins un kit selon l’invention, ou avec une combinaison quelconque de ceux-ci ; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) la stratification de la synucléinopathie, le pronostic de la synucléinopathie, le suivi de la synucléinopathie, l’évaluation de l'efficacité du traitement de la synucléinopathie, chez le sujet, en fonction du résultat de l’étape b); dans laquelle synucléinopathie est de préférence choisie parmi la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l’atrophie Multi-Systématisée (AMS), de préférence encore synucléinopathie est la DCL. Définitions
Par « a-Synucléine » ou « a-Syn » ou « a-syn » ou « alpha-Synucléine » ou « a-Synucléine » on entend une phosphoprotéine de la famille des synucléines qui est abondante dans le cerveau humain. On en trouve aussi de petites quantités dans le cœur, les muscles et d'autres tissus. Dans le cerveau, I'a-Syn se trouve essentiellement à l'extrémité des cellules nerveuses (neurones) dans les terminaisons présynaptiques. La séquence protéique de référence pour la protéine a-Synucléine humaine est la séquence NCBI référencée sous le numéro P37840.1 .
A l’état physiologique, la protéine a-Syn existe sous deux formes. Elle peut être soluble ou bien liée à une membrane. A l’état soluble dans le cytosol, l’a-Syn a une structure désordonnée (Fauvet et al., 2012). En présence de membrane lipidique, la partie N- terminale de Ga-Syn adopte une structure en hélice a qui permet son enchâssement au sein de membranes lipidiques (Eliezer et al., 2001 ). Lorsqu’elle est liée à une membrane de large diamètre (au moins 100 nm), Ga-Syn adopte la forme d’une grande hélice allongée (Trexler and Rhoades, 2009). Lorsqu’au contraire elle interagit avec des petites vésicules (et donc à forte courbure), Ga-Syn adopte une structure composée de deux petites hélice a (Chandra et al., 2003).
En cas de repliement anormal, l’a-Syn peut également adopter des conformations dites « pathologiques », riches en feuillets-b. Ces conformations pathologiques ont une forte propension à former des agrégats fibrillaires (appelés « a-Syn fibrillaires » ou « fibres d’a- Syn ») qui sont retrouvés sous forme de dépôts intracellulaires dans les synucléinopathies (El-Agnaf et al., 1998a). Par « a-Syn fibrillaire » ou « fibre d'a-Syn » ou « agrégat fibrillaire d’a-Syn » ou « agrégat d’a-Syn », on entend une fibre (ou un agrégat, ou un assemblage) composée de nombreuses répétitions de protéines a-Syn anormalement repliées (notamment de 25 à plusieurs centaines de répétitions de protéine d’a-Syn anormalement repliées). Il s’agit donc d’un assemblage de plusieurs copies (de 25 à plusieurs centaines) de protéines a-Syn mal repliées (présentant un repliement anormal/pathologique/non natif). Ces fibres d’a-Syn se forment par recrutement successif des protéines a-Syn, selon un mécanisme de propagation où une protéine d'a-Syn mal repliée transmet sa conformation erronée lorsqu’elle se lie à une autre protéine. Ces fibres insolubles peuvent se retrouver dans les corps de Lewy caractéristiques de certaines pathologies connues sous le nom de synucléinopathies, telles que la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l'atrophie multisystématisée (AMS).
Plusieurs formes de fibres d'a-Syn avec des conformations structurales distinctes ont été isolées et il a été mis en évidence qu’elles pourraient induire des synucléinopathies différentes. Ces différentes conformations sont appelées des conformères de fibres d'a-Syn. La protéine a-Syn peut subir une ou plusieurs modifications post-traductionnelles, tels que l’addition d’un groupe fonctionnel (par exemple choisi parmi l’acétylation, l’alkylation, la biotinylation, la carboxylation, la glutamylation, la glycylation, la glycosylation, l’hydroxylation, l’isoprénylation, la lipoylation, la phosphopantetheinylation, la phosphorylation, la ribosylation, la sulfatation, la sélénation, l’amidation, etc., et une combination quelconque de ceux-ci), l’addition de groupes peptidiques ou de protéines (à condition pour cette dernière que la protéine ajoutée ne soit pas une protéine a-Syn ; l’addition de groupes peptidiques ou de protéines est par exemple choisi parmi l’ubiquitination, la neddylation, la sumoylation, l’urmylation, etc., et une combination quelconque de ceux-ci), le changement de la nature chimique d’un acide aminé (par exemple choisi parmi la citrullination, la déamidation, etc., et une combination quelconque de ceux-ci), un changement structural (par exemple choisi parmi la formation de pont disulfure, etc.), et une combination quelconque de ceux-ci.
Par « conformère d'a-Syn » ou « conformère de fibres d'a-Syn » on entend une configuration (conformation) structurale/spatiale spécifique formée par un agrégat de protéines a-Syn ayant un repliement anormal (c’est-à-dire une configuration structurale spécifique adoptée par Ga-Syn fibrillaire). Différents conformères de fibres d’a-Syn ont été identifiés tels que les conformères de fibres d’a-Syn de type F, R, 65 et 91 . Les conformères de fibres d'a-Syn de type F, 65 et 91 ont une forme cylindrique, tandis que les conformères de fibres de type R ont une forme de rubans plats, les fibres 91 et 65 sont torsadées mais avec des pas d’hélices différents. Au sein de ces fibres, au moins une copie de la protéine a-Syn peut comprendre une ou plusieurs modifications post-traductionnelles telles que définies ci-dessus.
Par « fibre F » ou « conformère de fibres d’a-Syn de type F » ou « conformère de fibres de type F d'a-Syn » on entend un agrégat de protéines a-Syn qui se présente sous une forme cylindrique, produisant 9 bandes lors de leur protéolyse ménagée par la protéinase K (exemple en Figure 1 (Landureau et al., 2021 )) et dont la rigidité à la flexion est d’environ 5.8 10-26 N.m2.
Par « fibre R » ou « conformères de fibres d’a-Syn de type R » ou « conformères de fibres de type R d'a-Syn » on entend un agrégat de protéines a-Syn qui se présente sous la forme de rubans plats. Les fibres de type R sont plus aplaties que les fibres de type F. Elles produisent 3 bandes lors de leurs protéolyse ménagée par la protéinase K (exemple en Figure 1 (Landureau et al., 2021 )) et ont une rigidité à la flexion d’environ 1.4 10 26 N.m2. Par « fibre 65 » ou « conformère de fibres 65 » ou « conformère de fibres 65 d'a-Syn » on entend un agrégat de protéines a-Syn qui se présente sous la forme de torsades serrées. Elles ont une rigidité à la flexion d’environ 2.7 10 26 N.m2.
Par « fibre 91 » ou « conformère de fibres 91 » ou « conformère de fibres 91 d'a-Syn » on entend un agrégat de protéines a-Syn qui se présente sous la forme de torsades lâches. Elles produisent 7 bandes lors de leurs protéolyse ménagée par la protéinase K (exemple en Figure 1 (Landureau et al., 2021 )) et ont une rigidité à la flexion d’environ 2.4 10 26 N.m2. Ces différents types de fibres peuvent être distingués à l’aide des différentes techniques d’analyses moléculaires et structurales connues de l’homme du métier, telles que l’analyse RMN du solide, la microscopie à force atomique, la microscopie électronique, la protéolyse ménagée, la diffraction des rayons X par les fibres, la fixation du ligand comme la Thioflavin T ou des anticorps, etc. Ces techniques ont notamment permis de montrer que les conformères de fibres F, R, 65 et 91 sont longues de 1 à 2 pm en moyenne, avec une largeur de l’ordre de 15 à 20 nm, les conformères de fibres d’a-Syn de type F étant les moins larges, et les conformères de fibres 65 les plus larges. Leur hauteur est de l’ordre de 5 à 7 nm, les conformères de fibres d’a-Syn de type R étant les moins hautes et les 65 les plus hautes. Enfin, les conformères de fibres 65 et 91 présentent des variations périodiques de la hauteur, à la différence des conformères de fibres d’a-Syn de type F et R. Alternativement ou en combinaison avec les techniques d’analyses moléculaires et structurales, ces différents types de conformères de fibres peuvent être distingués par leurs propriétés mécaniques, à l’aide des différentes techniques d’analyses mécaniques connues de l’homme du métier, telles que la microscopie à force atomique. Ces analyses mécaniques ont notamment permis de mettre en évidence que les quatre types de fibres avaient des propriétés mécaniques différentes. Ainsi, les conformères de fibres d’a-Syn de type F sont les plus rigides, avec une mesure de la résistance à la flexion quatre fois supérieure au conformère de fibre R et deux fois supérieure aux conformères de fibres 65 et 91. Les conformères de fibres d'a-Syn peuvent également être distingués les uns des autres (en particulier les conformères de fibres d'a-Syn peuvent être distingués des autres types de conformères de fibres d'a-Syn) par leur profil de dégradation par protéase. Leur différence structurale aboutit à des profils de dégradation qui sont différents d’un conformère à une autre. Ces profils sont comparables à des codes barres (ou empreinte digitales) spécifiques à chaque conformère (voir un exemple de profil de dégradation en Figure 1 ). De plus, la forme entière de la protéine dans les conformères de fibres d’a-Syn de type F est plus résistanteà la protéolyse que dans le conformère de type R (Fenyi et al., 2021 ).
Au sein de ces fibres, au moins une copie de la protéine a-Syn peut comprendre une ou plusieurs modifications post-traductionnelles telles que définies ci-dessus. Par « oligomère d'a-Syn » ou « a-Syn sous forme oligomérique » on entend un assemblage comprenant plusieurs copies (entre 2 et 24) de la protéine de la protéine a-Syn, se présentant sous une forme de chaîne (c’est-à-dire une suite de protéines a-Syn liées/associées les unes aux autres, comprenant entre 2 et 24 protéines a-Syn). Un oligomère d’a-Syn se distingue d’une fibre d’a-Syn en ce qu’il comprend un nombre plus faible de copies d’a-Syn (Pieri et al., 2016). Un oligomère d'a-Syn comprend donc de 2 à une vingtaine de copies de la protéine a-Syn. Un oligomère d'a-Syn n’est pas une fibre d'a-Syn au sens de la présente invention, puisqu’il comprend moins de 25 monomères d’a-Syn.
Par « monomère d'a-Syn » ou « a-Syn sous forme monomérique » on entend une molécule de la protéine a-Syn se présentant sous une forme libre, c’est-à-dire qui n’est pas liée/associée à une autre molécule de la protéine a-Syn. Un monomère d'a-Syn comprend donc une copie unique de la protéine a-Syn. Un monomère d'a-Syn se distingue donc des oligomères et des agrégats/fibres de la protéine a-Syn. La copie unique de la protéine a-Syn dans le monomère peut néanmoins comprendre une ou plusieurs modifications post- traductionnelles, telles que définies ci-dessus.
Par « aptamère » on entend un oligonucléotide (c’est-à-dire un segment de chaîne d'acides nucléiques) qui adopte une structure tridimensionnelle lui conférant la capacité de se fixer spécifiquement sur un ligand donné (le ligand est appelé « cible »), notamment de nature protéique. Un aptamère est dit se lier de manière spécifique à une cible lorsqu’il ne présente essentiellement pas d’affinité pour un composé sans rapport structural avec la cible. De préférence, dans le cas d’une cible protéique, un composé protéique est dit sans rapport structural avec la cible selon l’invention, lorsque l’identité de séquence entre la cible et le composé est inférieure à 60%, de préférence inférieure à 70%, de préférence encore inférieure à 80%. De préférence, selon l’invention, un aptamère est dit ne présenter essentiellement pas d’affinité pour un composé selon l’invention, notamment lorsque la constante de dissociation de l’aptamère vis-à-vis du composé est supérieure à 106 mol/l, de préférence supérieure à 107 mol/l. La constante de dissociation peut notamment être déterminée, dans des conditions standards, à l'aide des représentations de Scatchard et de Lineweaver Burk bien connues de l’homme du métier.
Les aptamères comprennent en général de quelques nucléotides à quelques dizaines de nucléotides, par exemple de 15 à 100 nucléotides (de préférence de 20 à 90 nucléotides, de préférence encore de 30 à 80 nucléotides, de préférence encore de 40 à 70 nucléotides, de préférence encore de 50 à 60 nucléotides). Les aptamères sont principalement fabriqués par voie synthétique, par des techniques connues de l’homme du métier (telles que la synthèse chimique ou enzymatique). Les aptamères sont généralement sélectionnés/identifiés par un processus d’évolution moléculaire dirigée nommé SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment).
L’aptamère peut comprendre au moins un nucléotide modifié (c’est-à-dire un nucléotide qui n’est pas un nucléotide d’un ADN ou un ARN naturel). Ces nucléotides modifiés peuvent notamment être utilisés afin d’augmenter la résistance de l’aptamère à la dégradation par les nucléases. Ceci est particulièrement avantageux pour les aptamères ARN, généralement plus sensibles aux nucléases que les aptamères ADN. Un ARN comprenant au moins un nucléotide modifié est appelé ARN modifié.
L'aptamère peut également comprendre au moins un groupement additionnel, en plus des nucléotides constitutifs de sa séquence d "acide nucléique. Ainsi, l'acide nucléique de l’aptamère peut être lié à au moins un groupement additionnel.
Par « ARN modifié » on entend un ARN comportant au moins un nucléotide modifié. Un ARN modifié peut notamment être un ARN dans lequel le squelette de l'acide nucléique est modifié, en totalité ou en partie, en particulier pour le rendre résistant à une dégradation hydrolytique, en particulier du fait de l'action de nucléases. L’ARN peut être modifié en totalité (c'est à dire que chaque nucléotide qui le constitue est modifié) ou en partie (c'est à dire que seule une partie des nucléotides qui le constitue est modifié). Lorsque l’ARN est modifié en partie, on peut choisir de modifier tout ou partie des purines et/ou tout ou partie des pyrimidines.
Les modifications d’un ARN (et/ou d’un nucléotide) sont bien connues de l'homme du métier et peuvent notamment être choisies parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre-phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci. Par « groupement additionnel » on entend un groupement chimique de tout type et de toute nature, ne faisant pas partie de la séquence nucléique de l’aptamère. Le groupement additionnel peut notamment être choisi parmi : un radioisotope, une molécule organique comprenant 100 atomes de carbone au plus, une nanoparticule, une protéine (notamment une glycoprotéine), un glucide, un lipide, un polynucléotide, et une combinaison quelconque de ceux-ci. Le groupement additionnel est de préférence choisi parmi : un marqueur détectable, un composé pharmacologique, un composé susceptible de modifier les caractéristiques pharmacocinétiques d'un acide nucléique auquel il est lié (tel que le polyéthylène glycol (PEG)), et une combinaison quelconque de ceux-ci.
Le marqueur détectable peut être de tout type, il peut notamment s'agir d'un fluorophore (par exemple la fluorescéine ou la luciférase), d'un radioisotope (notamment adapté à la scintigraphie, par exemple 99mTc), d'une étiquette reconnaissable par un anticorps (par exemple la protéine c-Myc ou une étiquette polyhistidine), d'une étiquette d'affinité (par exemple la biotine), d'une enzyme (par exemple la peroxydase de raifort), d’un agent de contraste, etc.
Le composé pharmacologique peut également être de tout type. Il peut notamment s'agir d'un agent de chimiothérapie anticancéreuse (tel qu'un agent cytostatique ou cytologique), d’un anticorps, d’une toxine, d’une hormone, d’une enzyme, d’un composé antiviral, d’un composé antibiotique, d’un composé antifongique, d’un composé antibactérien, etc.
Par « séquence spécifique/cible d’un aptamère » ou « séquence spécifique/cible d’un aptamère » on entend la partie (section/région/portion) de la séquence d’un aptamère qui est spécifique du ligand (de la cible) de l’aptamère, c’est-à-dire la séquence qui est propre à un aptamère spécifique. La séquence spécifique d’un aptamère varie d’un aptamère à l’autre (il s’agit donc d’une séquence variable, par opposition à des séquences constantes susceptibles d’être également présentes dans un aptamère). La séquence spécifique d’un aptamère se distingue donc des séquences amorces (ou séquences « constantes », ou séquences « aspécifiques ») susceptibles d’être également présentes dans un aptamère.
Par « séquence amorce d’un aptamère » ou « séquence constante d’un aptamère » on entend une partie (section/région/portion) de la séquence d’un aptamère qui est présente dans tous les aptamères qui ont été identifiés/sélectionnés par une même session (une même mise en oeuvre) de la méthode de sélection utilisée (tel que le SELEX). Il s’agit en général de la séquence d’une amorce utilisée pour l’étape de PCR lors du SELEX. Un aptamère comprend donc généralement deux séquences amorces, l’une en 5’ de la séquence spécifique/cible, et l’autre en 3’ de la séquence spécifique/cible, permettant ainsi l’amplification par PCR. Les séquences amorces d’un aptamère ne sont donc pas spécifiques/propres à l’aptamère. Par « séquence aléatoire » on entend une séquence servant de contrôle et conçue de manière aléatoire par l’homme du métier (c’est-à-dire que les nucléotides qui la constituent sont assemblés au hasard). La séquence aléatoire a de préférence la même longueur que celle de l’aptamère. La séquence aléatoire a de préférence les mêmes séquences « constantes » (« amorces » ; de préférence en 3’ et/ou en 5’) que l’aptamère, le cas échéant. Dans ce cas, les séquences constantes encadrent la séquence aléatoire de l’aptamère (les séquences constantes sont donc en 5’ et/ou en 3’ de la séquence aléatoire de l’aptamère aléatoire) pour former un aptamère aléatoire dont la séquence complète a la même longueur que celle de l’aptamère selon l’invention ayant également des séquences constantes (identiques ou différentes de celles de l’aptamère aléatoire, de préférence identiques).
Par « capacité de distinguer/discriminer au moins deux conformères de la protéine a- Synucléine (a-Syn) fibrillaire » on entend la propriété que possède une molécule (par exemple un aptamère) lui permettant de se lier à au moins l’un des conformères de fibres d’a-Syn (tels que les conformères de fibres de type F, R, 91 et 61 ) avec une affinité significativement plus élevée (c’est à dire avec une constante de dissociation plus faible) qu’à au moins un autre conformère de fibres d’a-Syn. En particulier, une molécule est capable de distinguer au moins deux conformères de fibres d’a-Syn lorsqu’elle présente une affinité significativement plus forte pour un conformère de fibres d’a-Syn par rapport à l’autre conformère de fibres d’a-Syn. En d’autres termes, une molécule est capable de distinguer au moins deux conformères de fibres d’a-Syn lorsque qu’elle possède une capacité de liaison à un conformère de fibres d’a-Syn significativement supérieure à sa capacité de liaison à au moins un autre conformère de fibres d’a-Syn. Par exemple, la molécule est capable de distinguer au moins deux conformères de fibres d’a-Syn lorsque qu’elle présente une constante de dissociation significativement plus faible pour un conformère de fibres d’a- Syn que pour au moins un autre conformère de fibres d’a-Syn.
La molécule peut notamment être capable de distinguer au moins le conformère de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn du conformère de fibres d’a-Syn de type R de la protéine a-Syn, si elle présente une affinité pour (une capacité de liaison à) le conformère de fibres d’a-Syn de type F significativement plus élevée que pour (qu’au) conformère de fibres d’a-Syn de type R. Par « capacité de distinguer/discriminer le conformère de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn du conformère de fibres d’a-Syn de type R » on entend donc la propriété que possède une molécule lui permettant de se lier au conformère de fibres d’a-Syn de type F avec une affinité significativement plus élevée (c’est à dire avec une constante de dissociation plus faible) qu’au conformère de fibres d’a-Syn de type R. Par exemple, la molécule est capable de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F du conformère de fibres d’a-Syn de type R lorsque que sa constante de dissociation moyenne (mesurée/calculée) pour le conformère de fibres d’a-Syn de type F est significativement inférieure à sa constante de dissociation moyenne (mesurée/calculée) pour le conformère de fibres d’a-Syn de type R. En particulier, une molécule est capable de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F du conformère de fibres d’a-Syn de type R lorsque qu’elle est capable de se lier au conformère de fibres d’a-Syn de type F mais pas au conformère de fibres d’a-Syn de type R.
La molécule peut notamment être capable de distinguer en outre le conformère de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn des autres conformères de fibres de la protéine a- Syn (tels que le conformère de fibres 65 et le conformère de fibres 91 , outre le conformère de fibres d’a-Syn de type R) ; et/ou la molécule peut notamment être capable de distinguer en outre le conformère de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn des autres formes de la protéine a-Syn (tels que le monomère d’a-Syn et/ou des oligomères d’a-Syn). La définition donnée ci-dessus aux termes « capacité de distinguer/discriminer le conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn du conformère de fibres d’a-Syn de type R » s’applique alors, mutatis mutandis, à la capacité de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F du conformère de fibres 65 d’a-Syn, à la capacité de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F du conformère de fibres 91 d’a-Syn, à la capacité de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F du monomère d’a-Syn, et à la capacité de distinguer le conformère de fibres d’a-Syn de type F des oligomères d’a- Syn.
Par « constante de dissociation à l’équilibre » ou « Kd » ou « Kd » on entend la constante qui permet d'évaluer l’affinité entre deux molécules (par exemple entre un aptamère et une fibre de la protéine a-Syn). Cette affinité repose sur la nature, la géométrie et le nombre des interactions physicochimiques entre les deux molécules (interaction électrostatique, liaisons hydrogène, interaction de van der Waals et forces hydrophobes). Plus la valeur Kd est basse, plus l'affinité de liaison entre les deux molécules est élevée. Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM.
Il existe plusieurs techniques permettant de déterminer/mesurer les constantes de dissociation, qui sont bien connues de l’homme du métier, telles qu'ELISA, les essais de retard sur gel, la filtration, la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la filtration sur membrane de nitrocellulose, etc. La constante de dissociation à l’équilibre peut notamment être déterminée, dans des conditions standards, à l'aide des représentations de Scatchard et de Lineweaver Burk bien connues de l’homme du métier.
Par « maladie neurodégénérative » ou « MN » on entend une pathologie dont la cause première est la mort des neurones. Les MNs désignent un groupe de pathologies aux symptômes cliniques très divers qui ont pour point commun d’être des maladies chroniques à évolution lente caractérisées par un dysfonctionnement et une mort progressive des cellules nerveuses (Gao and Hong, 2008). Les troubles induits par cette neurodégénérescence peuvent être d’ordre moteur, cognitif ou même sensoriel. Ils s’aggravent au fur et à mesure de l’évolution de la maladie et handicapent de manière croissante les patients. La fréquence des MNs augmente de manière importante avec l’âge. Or, en raison du vieillissement progressif de la population, le nombre de personnes souffrant de MNs a considérablement augmenté au cours des dernières décennies et devrait croître de manière régulière dans les années à venir (Heemels, 2016). Par exemple, l’Organisation mondiale de la Santé estime aujourd’hui à 50 millions le nombre de personnes souffrant de démence dans le monde, et prévoit 250 millions de patients à l’horizon 2050 (World Alzheimer Report, 2019; Naqvi, 2017). Les MNs sont des pathologies extrêmement invalidantes qui entraînent progressivement une perte d’autonomie des patients.
Les MNs les plus connues sont : la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la Sclérose latérale amyotrophique (SLA). Les MNs incluent notamment les synucléinopathies.
Par « synucléinopathie » ou « a-synucléinopathies » ou « alpha-synucléinopathies » on entend une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de protéine a-Syn dans les neurones, les fibres nerveuses ou les cellules gliales. Les a- synucléinopathies sont des pathologies chroniques et progressives qui se manifestent par des troubles moteurs et cognitifs et des changements du comportement. Les synucléinopathies comprennent en particulier la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l'atrophie multisystématisée (AMS). Ces trois maladies présentent notamment comme points communs la survenue de troubles du comportement en sommeil paradoxal, une dysautonomie et un syndrome parkinsonien asymétrique. Les synucléinopathies comprennent également des affections plus rares, telles que les différentes dystrophies neuroaxonales Par « diagnostic », on entend l’identification/la détermination d’une maladie, ou de l’absence d’une maladie, chez un sujet. Le diagnostic comprend par exemple la recherche des causes (étiologie) et des effets (symptômes) de la maladie, notamment sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies neurodégénératives, les outils de diagnostic comprennent l’observation des troubles cognitifs, moteurs et sensoriels éprouvés par les patients et la détection/quantification de biomarqueurs génétiques et/ou biochimiques. Les biomarqueurs génétiques peuvent être des allèles ou des mutations dans le génome qui ont été identifiés comme prédisposant à la MN. Ce type de marqueurs permet ainsi d’identifier une population « à risque », qui a une plus forte probabilité de développer des MNs. Les marqueurs biochimiques sont des biomolécules dont la présence et/ou la quantité est corrélée à l’évolution de la pathologie (par exemple l’accumulation d’alpha-Synucléine pour les synucléinopathies).
Par « stratification », on entend la séparation/classification de sujets en sous-groupes par sévérité /g ravi té de la maladie. Les différents sous-groupes comprennent notamment le sous- groupe des sujets sains ainsi que différents sous-groupes de sujets souffrant d’une maladie, classés en fonction du stade d’évolution/d’avancement de la maladie. On peut aussi stratifier les sujets en fonction du type de symptômes présents. Le stade d’évolution et les symptômes peuvent être déterminés sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies neurodégénératives, les outils de stratification comprennent les outils qui sont également utilisés pour leur diagnostic.
Par « pronostic », on entend la prédiction/la détermination/l’évaluation des risques d'évolution d'une maladie chez un sujet. Le pronostic comprend notamment l’évaluation du développement futur de l'état du sujet et des chances éventuelles d’amélioration voire de guérison. Le pronostic peut être déterminé sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies neurodégénératives, les outils de pronostic comprennent les outils qui sont également utilisés pour leur diagnostic ou la stratification des sujets.
Par « suivi », on entend la détermination/l’évaluation de l’évolution d’une maladie chez un sujet. Le suivi peut être réalisé sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils, à différents intervalles de temps. Les intervalles peuvent être réguliers ou irréguliers. Leur fréquence dépend de la maladie mais aussi du stade d’évolution de la maladie. Elle peut être de l’ordre de quelques jours (par exemple en cas de maladie à un stade sévère /avancé /g rave et/ou en cas de maladie à évolution rapide et/ou en cas de phase d’exacerbation) à quelques années (par exemple en cas de maladie à un stade préliminaire, léger ou modéré, et/ou en cas de maladie à évolution lente). Dans le cas des maladies neurodégénératives, les outils de suivi comprennent les outils qui sont également utilisés pour le diagnostic ou le pronostic de la maladie, ou la stratification des sujets.
Par « évaluation de l'efficacité d'un traitement », on entend la détermination de l’état clinique d’un sujet soumis à un traitement. Le traitement peut être préventif, par exemple en cas de prédisposition à une maladie, ou il peut être curatif, par exemple en cas de maladie diagnostiquée. L’efficacité du traitement peut par exemple être évaluée en déterminant l’état du sujet à différents intervalles de temps. L’état du sujet peut notamment être évalué avant la première prise du traitement puis à des intervalles de temps réguliers (ou irréguliers) après cette première prise (par exemple après chaque nouvelle prise du traitement). Une comparaison de l’état du sujet évalué à ces différents intervalles peut alors être effectuée afin d’identifier un éventuel changement. Dans le cas d’un traitement curatif, une amélioration, une absence d’aggravation, ou une aggravation de l’état du patient inférieure à celle attendue en absence de traitement indique que le traitement est efficace, tandis qu’une aggravation de l’état du patient au moins égale à celle attendue en absence de traitement indique que le traitement n’est pas efficace. Dans le cas d’un traitement préventif, une absence d’apparition de la maladie ou une apparition plus tardive et/ou moins grave qu’attendue en l’absence de traitement indique que le traitement est efficace, tandis qu’une apparition aussi précoce et grave qu’attendue en l’absence de traitement indique que le traitement n’est pas efficace. L’état du patient peut être évalué sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies neurodégénératives, les outils d’évaluation de l’efficacité d’un traitement comprennent les outils qui sont également utilisés pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi de la maladie, ou la stratification des sujets.
Par « stade d’une maladie neurodégénérative » « stade d’évolution d’une maladie neurodégénérative» ou « stade d’avancement d’une maladie neurodégénérative», on entend une phase de la maladie neurodégénérative qui est déterminée selon la gravité des symptômes dont souffrent le sujet et leurs implications/conséquences sur le mode et/ou la qualité de vie du sujet. Ces stades peuvent être au nombre de quatre. Par exemple :
- Au stade 1 (ou premier stade), on parle de maladie légère ou de stade léger.
- Au stade 2 (ou deuxième stade), on parle de maladie modérée ou de stade modéré.
- Au stade 3 (ou troisième stade), on parle de maladie sévère ou de stade sévère. - Au stade 4 (ou quatrième stade), on parle de maladie très sévère ou de stade très sévère. La qualité de vie est, à ce stade, considérablement altérée.
Par « aggravation » ou « phase d’aggravation », on entend une période durant laquelle les signes cliniques d’une maladie neurodégénérative se majorent chez un sujet souffrant de ladite maladie.
Par « sujet » ou « patient », on entend un individu humain ou un animal différent d’un humain. Le sujet est par exemple un humain ou un animal susceptible d’être atteint d’une maladie neurodégénérative ou souffrant d’une telle maladie. Le sujet est de préférence un être humain. Le sujet peut être un enfant (sujet humain âgé de 16 ans ou moins) ou un adulte (sujet humain âgé de plus de 16 ans). Par « sujet sain » on entend un sujet qui ne souffre pas de la maladie considérée. Dans le cadre de la présente invention, un sujet sain est de préférence un sujet qui ne souffre d’aucune maladie neurodégénérative, de préférence encore un sujet qui ne souffre d’aucune maladie. Par « sujet de référence » on entend un sujet qui souffre d’une maladie neurodégénérative connue (notamment une synucléinopathie, et en particulier une maladie de Parkinson (MP), une démence à corps de Lewy (DCL) ou une atrophie multisystématisée (AMS)), à un stade connu.
Par "échantillon biologique" ou "prélèvement" d’un sujet, on entend un organe entier ou un tissu ou une partie d’un tel organe ou tissu, un fluide ou une fraction d’un tel fluide, des cellules ou des composants cellulaires, obtenus de ce sujet, ainsi qu’un homogénat, un lysat ou un extrait préparé à partir de ceux-ci. En particulier, un "échantillon biologique" ou "prélèvement" est de préférence tout tissu (de préférence des portions ou fractions de celui- ci) qui peut contenir des neurones et/ou des protéines a-Syn, y compris, mais sans s'y limiter, un échantillon du système nerveux central (SNC), tel qu'un échantillon de cerveau ou un échantillon de moelle épinière, de glandes salivaires, du système digestif (par exemple le colon), du fluide cérébrospinal, du plasma, du sang, etc.
L'échantillon biologique peut avoir été préalablement obtenu par toute technique connue dans la profession. Ces techniques comprennent, par exemple, la chirurgie (telle que la chirurgie stéréotaxique), la ponction, l'explant, l'excision, la biopsie. Par "excision", on entend une procédure chirurgicale consistant à couper (exciser) une partie plus ou moins large ou profonde du tissu, de préférence une anomalie ou une croissance du tissu. Une excision peut être pratiquée pour enlever et/ou analyser une tumeur cancéreuse ou suspecte. Le terme "biopsie" désigne ici un échantillon de cellules ou de tissus prélevé pour analyse. Plusieurs types de procédures de biopsie sont connus et pratiqués sur le terrain. Les types les plus courants comprennent (1 ) la biopsie incisionnelle, dans laquelle seul un échantillon du tissu est prélevé ; (2) la biopsie excisionnelle (ou biopsie chirurgicale), qui consiste à retirer totalement une masse tumorale, réalisant ainsi une procédure thérapeutique et diagnostique ; et (3) la biopsie à l'aiguille, dans laquelle un échantillon de tissu est prélevé à l'aide d'une aiguille, qui peut être grosse ou fine. D'autres types de biopsie existent, comme les frottis ou le curetage, et peuvent également être utilisés pour obtenir l'échantillon. Par conséquent, l'échantillon peut être, par exemple, un expiant, une excision, une biopsie, etc. L'échantillon est de préférence obtenu par une procédure peu invasive, telle que la chirurgie stéréotaxique.
Par « identité » ou « identité de séquence », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou acides aminés, ou entre deux molécules d’acides nucléiques ou oligonucléotides. Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement global optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions. Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier. Le pourcentage d’identité est déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970). Notamment, pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
À titre illustratif, "au moins 80% d'identité de séquence", tel qu'utilisé ici, représente notamment 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité de séquence.
Apta mères
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des aptamères d’acide ribonucléique (ARN) modifié capables de reconnaître de manière spécifique certains conformères de fibres d’a-Syn. Les Inventeurs ont en effet sélectionné et isolé des aptamères ARN modifié ayant des affinités différentes pour différents conformères de fibre d’a-Syn.
Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les aptamères mis au point sont capables de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R, à la différence des aptamères ADN contre l’a-Syn décrits dans l’art antérieur.
Les données montrent en particulier que les aptamères mis au point par les Inventeurs ont une forte affinité pour le conformère de fibres d’a-Syn de type F (constante de dissociation Kd entre 5 et 10 nM). De manière inattendue, ces aptamères présentent en revanche une affinité très faible voire nulle pour le conformère de fibres d’a-Syn de type R, ainsi que les conformères de fibre 65 et 91 d’a-syn. Les Inventeurs ont également mis en évidence que ces aptamères reconnaissent avec une affinité au moins 10 fois plus faible la protéine a-Syn sous forme native (forme monomérique, non fibrillaire). De façon remarquable, les Inventeurs ont développé une méthode utilisant un mélange de ces aptamères qui permet de discriminer efficacement ces conformères de fibre par séquençage à haut-débit, applicables à des échantillons de patients.
Les données montrent que ces aptamères sont des outils de détection spécifique et sensible des différentes fibres d’a-Syn. La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de diagnostic efficace et fiable des maladies neurodégénératives, des méthodes de criblage de molécules mais également des outils pour la recherche dans le domaine des maladies neurodégénératives.
Les aptamères présentent plusieurs avantages : 1 ) ils ont des affinités et une spécificité de reconnaissance pour leur cible comparables à celles des anticorps ; 2) étant des oligonucléotides, ils peuvent être utilisés dans de nombreuses techniques de biologie moléculaire (PCR quantitative, puce, rolling circle amplification, séquençage à haut-débit...) ; 3) ils sont faciles à synthétiser ou à amplifier in vitro ; 4) ils peuvent être couplés facilement à un grand nombre de composés ; 5) ils sont peu immunogènes ; 6) ils ne sont pas soumis aux problèmes de dénaturation pendant le stockage ; 7) ils sont très résistants aux changements de température ; 8) ils sont nettement moins chers que les anticorps.
La présente invention concerne donc un aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer au moins deux conformères de fibre de la protéine a-Synucléine (a-Syn), et en ce qu’il comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 (séquence spécifique de l’aptamère N30), SEQ ID NO :2 (séquence spécifique de l’aptamère N124), SEQ ID NO :3 (séquence spécifique de l’aptamère N3), SEQ ID NO :4 (séquence spécifique de l’aptamère 4F02), SEQ ID NO :5 (séquence spécifique de l’aptamère 4F03), SEQ ID NO :6 (séquence spécifique de l’aptamère F124), et SEQ ID NO :7 (séquence spécifique de l’aptamère P65) ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4, et SEQ ID NO :5 ; de préférence encore choisie parmi SEQ I D NO : 1 et SEQ ID NO :2.
La présente invention concerne en particulier un aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn (a-Syn) des conformères de fibres d’a-Syn de type R, et en ce qu’il comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence cible/spécifique d’acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ I D NO : 1 (séquence spécifique de l’aptamère N30), SEQ ID NO :2 (séquence spécifique de l’aptamère N124), SEQ ID NO :3 (séquence spécifique de l’aptamère N3), SEQ ID NO :4 (séquence spécifique de l’aptamère 4F02), SEQ ID NO :5 (séquence spécifique de l’aptamère 4F03), SEQ ID NO :6 (séquence spécifique de l’aptamère F124), et SEQ ID NO :7 (séquence spécifique de l’aptamère P65) ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5 ; de préférence encore choisie parmi SEQ I D NO : 1 et SEQ ID NO :2.
Selon un mode de réalisation préféré, l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 86% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ I D NO : 1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO :6 et SEQ ID NO :7 ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5 ; de préférence encore choisie parmi SEQ I D NO : 1 et SEQ ID NO :2. De préférence, l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 87% d’identité, de préférence encore au moins 88% d’identité, de préférence encore au moins 89% d’identité, de préférence encore au moins 90% d’identité, de préférence encore au moins 91% d’identité, de préférence encore au moins 92% d’identité, de préférence encore au moins 93% d’identité, de préférence encore au moins 94% d’identité, de préférence encore au moins 95% d’identité, de préférence encore au moins 96% d’identité, de préférence encore au moins 97% d’identité, de préférence encore au moins 98% d’identité, de préférence encore au moins 99% d’identité, avec une séquence spécifique d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6 et SEQ ID NO :7; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4, et SEQ ID NO :5 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :1 , et SEQ ID NO :2. De manière particulièrement préférée, l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, et SEQ ID NO :7; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4, et SEQ ID NO :5 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :1 , et SEQ ID NO :2.
Les séquences SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6 et SEQ ID NO :7 sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Séquences spécifique des aptamères N30, N124, N3, 4F02, 4F03, F124 et P65. [Table 1 ]
Selon un mode de réalisation, l’aptamère selon l’invention possède en outre la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des monomères d’a-Syn. Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison, l’aptamère selon l’invention possède en outre la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres 65 d’a-Syn et/ou de fibres 91 d’a-Syn. Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison, l’aptamère selon l’invention possède en outre la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des oligomères d’a-Syn. Ainsi, selon un mode de réalisation, l’aptamère selon l’invention possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R, ainsi que des conformères de fibres 65 d’a-Syn, des conformères de fibres 91 d’a-Syn, des oligomères d’a- Syn et des monomères d’a-Syn. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, l’aptamère selon l’invention est spécifique les conformères de fibres d’a-Syn de type F. Selon un mode de réalisation, l’aptamère selon l’invention n’a aucune affinité pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, ainsi que pour les conformères de fibres 65 d’a-Syn, les conformères de fibres 91 d’a-Syn, et les monomères d’a-Syn.
Selon un mode de réalisation préféré, la constante de dissociation Kd<F) de l’aptamère selon l’invention, mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère selon l’invention pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R est tellement faible que la constante de dissociation Kd(R> ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Selon un mode de réalisation préféré alternatif ou en combinaison avec le mode préféré ci- dessus, la constante de dissociation Kd<F) de l’aptamère selon l’invention, mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois, de préférence inférieure d’au moins 3 fois, de préférence inférieure d’au moins 4 fois, de préférence inférieure d’au moins 5 fois, de préférence inférieure d’au moins 6 fois, de préférence inférieure d’au moins 7 fois, de préférence inférieure d’au moins 8 fois, de préférence inférieure d’au moins 9 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère selon l’invention pour les monomères d’a-Syn est tellement faible que la constante de dissociation Kimono) ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Selon un mode de réalisation préféré alternatif ou en combinaison avec un ou plusieurs des modes préférés ci-dessus, la constante de dissociation Kd<F) de l’aptamère selon l’invention, mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd(65> mesurée pour les conformères de fibres 65 d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois, de préférence inférieure d’au moins 3 fois, de préférence inférieure d’au moins 4 fois, de préférence inférieure d’au moins 5 fois, de préférence inférieure d’au moins 6 fois, de préférence inférieure d’au moins 7 fois, de préférence inférieure d’au moins 8 fois, de préférence inférieure d’au moins 9 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère selon l’invention pour les conformères de fibres 65 d’a-Syn est tellement faible que la constante de dissociation Kd(65> ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Selon un mode de réalisation préféré alternatif ou en combinaison avec un ou plusieurs des modes préférés ci-dessus, la constante de dissociation Kd<F> de l’aptamère selon l’invention, mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd<9i> mesurée pour les conformères de fibres 91 d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois, de préférence inférieure d’au moins 3 fois, de préférence inférieure d’au moins 4 fois, de préférence inférieure d’au moins 5 fois, de préférence inférieure d’au moins 6 fois, de préférence inférieure d’au moins 7 fois, de préférence inférieure d’au moins 8 fois, de préférence inférieure d’au moins 9 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère selon l’invention pour les conformères de fibres 91 d’a-Syn est tellement faible que la constante de dissociation Kd<9i> ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Selon un mode de réalisation préféré alternatif ou en combinaison avec un ou plusieurs des modes préférés ci-dessus, la constante de dissociation Kd<F> de l’aptamère selon l’invention, mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire (c’est-à-dire un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié, de préférence tel que défini ci-dessous dans la section « composition et kits ») mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois, de préférence inférieure d’au moins 3 fois, de préférence inférieure d’au moins 4 fois, de préférence inférieure d’au moins 5 fois, de préférence inférieure d’au moins 6 fois, de préférence inférieure d’au moins 7 fois, de préférence inférieure d’au moins 8 fois, de préférence inférieure d’au moins 9 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère aléatoire pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est tellement faible que la constante de dissociation Kd(aiéatoire) ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Avantageusement, la constante de dissociation Kd<F) mesurée, notamment en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus), pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, est inférieure à 50 nM, de préférence encore inférieure à 40 nM, de préférence encore inférieure à 30 nM, de préférence encore inférieure à 25 nM, de préférence encore inférieure à 20 nM, de préférence encore inférieure à 18 nM, de préférence encore inférieure à 16 nM, de préférence encore inférieure à 14 nM, de préférence encore inférieure à 13 nM, de préférence encore inférieure à 12 nM, de préférence encore inférieure à 11 nM, de préférence encore inférieure à 10 nM, de préférence encore inférieure à 9 nM, de préférence encore inférieure à 8 nM, de préférence encore inférieure à 7 nM.
Avantageusement, la constante de dissociation Kd<R> mesurée, notamment en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus), pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, est supérieure à 100 nM, de préférence encore supérieure à 150 nM, de préférence encore supérieure à 200 nM, de préférence encore supérieure à 300 nM, de préférence encore supérieure à 400 nM, de préférence encore supérieure à 500 nM, de préférence encore supérieure à 600 nM, de préférence encore supérieure à 700 nM, de préférence encore supérieure à 800 nM, de préférence encore supérieure à 900 nM, de préférence encore supérieure à 1000 nM. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’affinité de l’aptamère selon l’invention pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R est tellement faible que la constante de dissociation Kd(R> ne peut pas être mesurée/déterminée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation (telles que celles listées dans la section définition ci-dessus).
Selon un mode de réalisation préféré, l’aptamère selon l’invention a au moins une constante de dissociation Kd comme suit : a) la constante de dissociation Kd<F> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est inférieure à 15 nM, de préférence inférieure à 10 nM ; et/ou b) la constante de dissociation Kd<R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R est supérieure à 100 nM, de préférence supérieure à 500 nM.
La constante de dissociation Kd d’un aptamère est par exemple mesurée en utilisant les méthodes usuelles de détermination des constantes de dissociation, de préférence choisie parmi celles listées dans la section définition ci-dessus, de préférence encore par filtration, de préférence encore par filtration sur membrane de nitrocellulose.
Selon un mode de réalisation préféré, l’aptamère selon l’invention comprend en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 5’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 (séquence amorce P72 des aptamères N, en 5’), et SEQ ID NO :30 (séquence amorce P73 des aptamères 4F, F, R et P, en 5’), de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :31 (amorce PiRT en 3’), SEQ ID NO :32 (Séquence G de 24 nts en 3’), et SEQ ID NO :33 (PiRT-G ; combinaison amorce PiTR + séquence G, en 3’), de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
Selon le mode de réalisation i. ci-dessus, l’aptamère se présente sous la forme « Amorce 5’ - Séquence spécifique » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié). Selon le mode de réalisation ii. ci-dessus en relation avec l’amorce de SEQ ID NO :31 , l’aptamère se présente sous la forme « Séquence spécifique - Amorce 3’ » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié). Selon le mode de réalisation i. combiné au mode de réalisation ii. ci-dessus en relation avec l’amorce de SEQ ID NO :31 , l’aptamère se présente sous la forme« Amorce 5’ - Séquence spécifique - Amorce 3’ » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié), cette dernière forme étant nommée ci-après « séquence complète de l’aptamère » (ou « séquence combinée de l’aptamère »).
Les séquences SEQ ID NO :29 à SEQ ID NO :33 sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Séquences des amorces 3’ et 5’ d’ARN modifié des aptamères. [Table 2] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’aptamère selon l’invention comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :34 (séquence complète de l’aptamère N30, avec amorces 5’ et 3’, mais sans séquence G), SEQ ID NO :35 (séquence complète de l’aptamère N124), SEQ ID NO :36 (séquence complète de l’aptamère N3), SEQ ID NO :37 (séquence complète de l’aptamère 4F02), SEQ ID NO :38 (séquence complète de l’aptamère 4F03), SEQ ID NO :39 (séquence complète de l’aptamère F124), et SEQID NO :40 (séquence complète de l’aptamère P65), de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO : 37, et SED ID NO :38 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35.
Selon un mode de réalisation préféré, l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 86% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40 ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :37, et SEQ ID NO :38 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35. De préférence l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 87% d’identité, de préférence encore au moins 88% d’identité, de préférence encore au moins 89% d’identité, de préférence encore au moins 90% d’identité, de préférence encore au moins 91% d’identité, de préférence encore au moins 92% d’identité, de préférence encore au moins 93% d’identité, de préférence encore au moins 94% d’identité, de préférence encore au moins 95% d’identité, de préférence encore au moins 96% d’identité, de préférence encore au moins 97% d’identité, de préférence encore au moins 98% d’identité, de préférence encore au moins 99% d’identité, avec une séquence complète d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40 ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :37, et SEQ ID NO :38 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35. De manière particulièrement préférée l’aptamère comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40 ; de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :37, et SEQ ID NO :38 ; de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35.
Les séquences SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40 sont indiquées dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 : Séquence complète des aptamères N30, N124, N3, 4F02, 4F03, F124 et P65. [Table 3]
L’aptamère selon l’invention peut en outre comprendre, en 3’ de la séquence complète « Amorce 5’ - Séquence spécifique - Amorce 3’ » telle que définie ci-dessus, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec SEQ ID NO :32, de préférence située à l’extrémité 3’ de l’aptamère. Selon ce mode de réalisation, l’aptamère se présente sous la forme « Amorce 5’ - Séquence spécifique - Amorce 3’ - Séquence G » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié), cette forme étant nommée ci-après « séquence complète G de l’aptamère » (ou séquence combinée G de l’aptamère).
Selon un mode de réalisation préféré, l’ARN de l’aptamère selon l’invention (c’est-à-dire de n’importe quel aptamère tel que décrit ci-dessus, y compris la séquence spécifique de l’aptamère, la séquence des amorces 5’ et/ou 3’, la séquence complète de l’aptamère, et la séquence complète G de l’aptamère) a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à- vis des nucléases ARN. Avantageusement, l’ARN de l’aptamère selon l’invention a été modifié par au moins une modification choisie parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre-phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci. L’ARN de l’aptamère selon l’invention a été de préférence modifié par au moins une modification choisie parmi la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor); et une combinaison quelconque de ceux-ci. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l’aptamère selon l’invention, les riboses des pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'.
Ainsi, de manière préférée, IARN modifié de l’aptamère selon l'invention est un ARN dont les riboses des nucléotides de pyrimidines (nucléotides de pyrimidiques) portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', de préférence dans lequel les riboses des nucléotides de purines (nucléotides puriques) sont inchangées (il s’agit donc d’un ARN 2’Fluoro- pyrimidines (ARN2’F-Py)).
Selon un mode de réalisation, l'aptamère selon l'invention comprend en outre au moins un groupement additionnel tel que défini ci-dessus dans la partie « Définitions ». Le groupement additionnel peut être ajouté à n’importe quel nucléotide de l’aptamère. Le(s) groupement(s) additionnel(s) est(sont) de préférence situé(s) à l’extrémité 3’ de l’aptamère, ou à l’extrémité 5’ de l’aptamère, ou à l’extrémité 3’ et à l’extrémité 5’ de l’aptamère.
Compositions et kits
Les Inventeurs ont mis au point des aptamères ayant une forte affinité pour le conformère de fibres d’a-Syn de type F (constante de dissociation Kd entre 5 et 10 nM). De manière inattendue, ces aptamères présentent en revanche une affinité très faible voire nulle pour le conformère de fibres d’a-Syn de type R, ainsi que les conformères de fibres 65 et 91 d’a- syn. Les Inventeurs ont également mis en évidence que ces aptamères reconnaissent avec une affinité au moins 10 fois plus faible la protéine a-Syn sous forme native (forme monomérique, non fibrillaire). De façon remarquable, les Inventeurs ont développé une méthode utilisant un mélange de ces aptamères qui permet de discriminer efficacement ces conformères de fibre par séquençage à haut-débit, applicables à des échantillons de patients.
La présente invention concerne donc une composition comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins un aptamère selon l’invention (tel que défini ci-dessus).
La présente invention concerne en outre un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins un aptamère selon l’invention (tel que défini ci-dessus).
Selon un mode de réalisation, la composition ou le kit comprend en outre au moins un aptamère additionnel choisi parmi les aptamères comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :8 (séquence spécifique de l’aptamère NO), SEQ ID NO :9 (séquence spécifique de l’aptamère N1 ), SEQ ID NO :10 (séquence spécifique de l’aptamère N2), SEQ ID NO : 11 (séquence spécifique de l’aptamère N4), SEQ ID NO :12 (séquence spécifique de l’aptamère N5), SEQ I D NO : 13 (séquence spécifique de l’aptamère N15), SEQ ID NO :14 (séquence spécifique de l’aptamère N20), SEQ ID NO :15 (séquence spécifique de l’aptamère N37), SEQ ID NO :16 (séquence spécifique de l’aptamère N62) et SEQ ID NO :17 (séquence spécifique de l’aptamère N73), SEQ ID NO :18 (séquence spécifique de l’aptamère N164), SEQ ID NO :19 (séquence spécifique de l’aptamère 4F01 ), SEQ ID NO :20 (séquence spécifique de l’aptamère 4F04), SEQ ID NO :21 (séquence spécifique de l’aptamère 4F05), SEQ ID NO :22 (séquence spécifique de l’aptamère R01 ), SEQ ID NO :23 (séquence spécifique de l’aptamère R02), SEQ ID NO :24 (séquence spécifique de l’aptamère R03), SEQ ID NO :25 (séquence spécifique de l’aptamère R04), SEQ ID NO :26 (séquence spécifique de l’aptamère R05), SEQ ID NO :27 (séquence spécifique de l’aptamère R84), et SEQ ID NO :28 (séquence spécifique de l’aptamère P91 ) ; la composition ou le kit comprenant de préférence en outre au moins un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
Selon un mode de réalisation préféré, l’aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 86% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 , SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, et SEQ ID NO :28. De préférence l’aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 87% d’identité, de préférence encore au moins 88% d’identité, de préférence encore au moins 89% d’identité, de préférence encore au moins 90% d’identité, de préférence encore au moins 91% d’identité, de préférence encore au moins 92% d’identité, de préférence encore au moins 93% d’identité, de préférence encore au moins 94% d’identité, de préférence encore au moins 95% d’identité, de préférence encore au moins 96% d’identité, de préférence encore au moins 97% d’identité, de préférence encore au moins 98% d’identité, de préférence encore au moins 99% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 , SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, et SEQ ID NO :28. De manière particulièrement préférée, l’aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence spécifique d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 , SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, et SEQ ID NO :28.
Les séquences SEQ ID NO :8 à 28 sont indiquées dans le Tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 : Séquences spécifique des aptamères additionnels NO, N1 , N2, N4, N5, N15, N20, N37, N62 N73, N164, 4F01 , 4F04, 4F05, R01 , R02, R03, R04, R05, R84 et P91 [Table 4]
Selon un mode de réalisation, au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention comprend en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 5’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 (séquence amorce P72 des aptamères N, en 5’) et SEQ ID NO :30 (séquence amorce P73 des aptamères 4F, F, R et P, en 5’), de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :31 (amorce PiRT en 3’), SEQ ID NO :32 (Séquence G de 24 nts en 3’) et SEQ ID NO :33 (PiRT-G ; combinaison amorce PiTR + séquence G, en 3’), de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
Selon le mode de réalisation i. ci-dessus, l’aptamère additionnel se présente sous la forme « Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère additionnel » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié). Selon le mode de réalisation ii. ci-dessus en relation avec l’amorce de SEQ ID NO :31 , l’aptamère additionnel se présente sous la forme « Séquence spécifique aptamère additionnel - Amorce 3’ » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié). Selon le mode de réalisation i. combiné au mode de réalisation ii. ci-dessus en relation avec l’amorce de SEQ ID NO :31 , l’aptamère additionnel se présente sous la forme« Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère additionnel - Amorce 3’ » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié), cette dernière forme étant nommée ci-après « séquence complète de l’aptamère additionnel » (ou séquence combinée de l’aptamère additionnel).
Les séquences SEQ ID NO :29 à SEQ ID NO :33 sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention est choisi parmi les aptamères comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :41 (séquence complète de l’aptamère NO, avec amorces 5’ et 3’, mais sans séquence G), SEQ ID NO :42 (séquence complète de l’aptamère N1 ), SEQ ID NO :43 (séquence complète de l’aptamère N2), SEQ ID NO :44 (séquence complète de l’aptamère N4), SEQ ID NO :45 (séquence complète de l’aptamère N5), SEQ ID NO :46 (séquence complète de l’aptamère N15), SEQ ID NO :47 (séquence complète de l’aptamère N20), SEQ ID NO :48 (séquence complète de l’aptamère N37), SEQ ID NO :49 (séquence complète de l’aptamère N62) et SEQ ID NO :50 (séquence complète de l’aptamère N73), SEQ ID NO :51 (séquence complète de l’aptamère N164), SEQ ID NO :52 (séquence complète de l’aptamère 4F01 ), SEQ ID NO :53 (séquence complète de l’aptamère 4F04), SEQ ID NO :54 (séquence complète de l’aptamère 4F05), SEQ ID NO :55 (séquence complète de l’aptamère R01 ), SEQ ID NO :56 (séquence complète de l’aptamère R02), SEQ ID NO :57 (séquence complète de l’aptamère R03), SEQ ID NO :58 (séquence complète de l’aptamère R04), SEQ ID NO :59 (séquence complète de l’aptamère R05), SEQ ID NO :60 (séquence complète de l’aptamère R84), et SEQ ID NO :61 (séquence complète de l’aptamère P91 ).
Selon un mode de réalisation préféré, au moins un aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 86% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID
NO :43, SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48, SEQ ID
NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51 , SEQ ID NO :52, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID
NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60, et SEQ
ID NO :61. De préférence l’aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 87% d’identité, de préférence encore au moins 88% d’identité, de préférence encore au moins 89% d’identité, de préférence encore au moins 90% d’identité, de préférence encore au moins 91% d’identité, de préférence encore au moins 92% d’identité, de préférence encore au moins 93% d’identité, de préférence encore au moins 94% d’identité, de préférence encore au moins 95% d’identité, de préférence encore au moins 96% d’identité, de préférence encore au moins 97% d’identité, de préférence encore au moins 98% d’identité, de préférence encore au moins 99% d’identité, avec une séquence complète d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46,
SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51 , SEQ ID NO :52,
SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58,
SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60, et SEQ ID NO :61. De manière particulièrement préférée, au moins aptamère additionnel comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence complète d’ARN modifié choisie parmi SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51 , SEQ ID NO :52, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60, et SEQ ID NO :61 .
Les séquences SEQ ID NO :41 à 61 sont indiquées dans le Tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 : Séquence complète des aptamères additionnels NO, N1 , N2, N4, N5, N15, N20, N37, N62 N73, N164, 4F01 , 4F04, 4F05, R01 , R02, R03, R04, R05, R84 et P91 [Table 5] Au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention peut en outre comprendre, en 3’ de la séquence complète « Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère additionnel - Amorce 3’ » telle que définie ci-dessus, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec SEQ ID NO :32, de préférence située à l’extrémité 3’ de l’aptamère additionnel. Selon ce mode de réalisation, l’aptamère additionnel se présente sous la forme « Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère additionnel - Amorce 3’ - Séquence G » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié), cette forme étant nommée ci-après « séquence complète G de l’aptamère additionnel » (ou séquence combinée G de l’aptamère additionnel).
Selon un mode de réalisation préféré, l’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à- vis des nucléases ARN. Avantageusement, l’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié par au moins une modification choisie parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre-phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci.
L’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention) a été de préférence modifié par au moins une modification choisie parmi la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O- Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor); et une combinaison quelconque de ceux- ci. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié de sorte que les riboses des nucléotides pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'. Ainsi, de manière préférée, IARN modifié de l’aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l'invention (de préférence l’ARN modifié de tous les aptamères selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention) est un ARN dont les riboses des nucléotides de pyrimidines (nucléotides de pyrimidiques) portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', de préférence dans lequel les riboses des nucléotides de purines (nucléotides puriques) sont inchangées (il s’agit donc d’un ARN 2’Fluoro-pyrimidines (ARN2’F-Py)).
Selon un mode de réalisation préféré, l’ARN d’au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à- vis des nucléases ARN. Avantageusement, l’ARN d’au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié par au moins une modification choisie parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre-phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci.
L’ARN d’au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention) a été de préférence modifié par au moins une modification choisie parmi la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O- Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor); et une combinaison quelconque de ceux- ci. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ARN d’au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié de sorte que les riboses des nucléotides pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'. Ainsi, de manière préférée, IARN modifié de l’aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l'invention (de préférence l’ARN modifié de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention) est un ARN dont les riboses des nucléotides de pyrimidines (nucléotides de pyrimidiques) portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', de préférence dans lequel les riboses des nucléotides de purines (nucléotides puriques) sont inchangées (il s’agit donc d’un ARN 2’Fluoro-pyrimidines (ARN2’F-Py)).
Avantageusement, l’ARN de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention a été modifié comme défini ci-dessus. De manière particulièrement préférée, l’ARN d’au moins un aptamère additionnel de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié de la même façon que l’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence de tous les aptamères selon l’invention de la composition ou du kit selon l’invention).
Selon un mode de réalisation préféré, la composition ou le kit selon l’invention comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins les aptamères suivants : aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 1 (séquence spécifique de l’aptamère N30), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :2 (séquence spécifique de l’aptamère N124), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :3 (séquence spécifique de l’aptamère N3), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :8 (séquence spécifique de l’aptamère NO), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité , avec SEQ ID NO :9 (séquence spécifique de l’aptamère N1 ), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :10 (séquence spécifique de l’aptamère N2), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 11 (séquence spécifique de l’aptamère N4), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :12 (séquence spécifique de l’aptamère N5), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 13 (séquence spécifique de l’aptamère N15), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :14 (séquence spécifique de l’aptamère N20), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 16 (séquence spécifique de l’aptamère N62), aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :17 (séquence spécifique de l’aptamère N73), et aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :18 (séquence spécifique de l’aptamère N164) ; le kit ou la composition comprenant de préférence en outre au moins un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
En effet, les Inventeurs ont montré qu’avec un tel assortiment d’aptamères, une empreinte moléculaire spécifique (une signature caractéristique ou encore un profil distinctif) peut être obtenue pour un échantillon biologique contenant différents conformères de la protéine a-Syn. Cette empreinte moléculaire spécifique peut être utilisée dans le diagnostic, le pronostic, la stratification ou encore le suivi de maladies neurodégénératives, notamment des synucléinopathies.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition ou le kit selon l’invention comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins les aptamères (c’est-à-dire un assortiment/mélange d’aptamère) comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec les séquences suivantes : SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, et SEQ ID NO :18 ; le kit ou la composition comprenant de préférence en outre au moins un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
Selon un mode de réalisation, au moins un aptamère de l’assortiment d’aptamères de la composition ou du kit selon l’invention comprend en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 5’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 (séquence amorce P72 des aptamères N, en 5’) et SEQ ID NO :30 (séquence amorce P73 des aptamères 4F, F, R et P, en 5’), de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :31 (amorce PiRT en 3’), SEQ ID NO :32 (Séquence G de 24 nts en 3’, cf page 128 de la thèse) et SEQ ID NO :33 (PiRT-G ; combinaison amorce PiTR + séquence G, en 3’), de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition ou le kit selon l’invention comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins les aptamères (c’est-à-dire un assortiment/mélange d’aptamère) comprenant une séquence complète d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec les séquences suivantes : SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, et SEQ ID NO :51 ; le kit ou la composition comprenant de préférence en outre au moins un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
Au moins un aptamère de l’assortiment d’aptamères de la composition ou du kit selon l’invention peut en outre comprendre, en 3’ de la séquence complète « Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère assortiment - Amorce 3’ » telle que définie ci-dessus, une séquence amorce 3’ d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec SEQ ID NO :32, de préférence située à l’extrémité 3’ de l’aptamère de l’assortiment. Selon ce mode de réalisation, l’aptamère de l’assortiment se présente sous la forme « Amorce 5’ - Séquence spécifique aptamère assortiment - Amorce 3’ - Séquence G » (dans le sens 5’ - 3’ de la séquence d’ARN modifié), cette forme étant nommée ci-après « séquence complète G de l’aptamère de l’assortiment » (ou séquence combinée G de l’aptamère de l’assortiment).
Selon un mode de réalisation, la composition ou le kit selon l’invention comprend en outre au moins un aptamère (aptamère appelé « aptamère aléatoire ») comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, une séquence aléatoire d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 86% d’identité, de préférence au moins 87% d’identité, de préférence au moins 88% d’identité, de préférence au moins 89% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 91% d’identité, de préférence au moins 92% d’identité, de préférence au moins 93% d’identité, de préférence au moins 94% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 96% d’identité, de préférence au moins 97% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de préférence au moins 99% d’identité, de préférence 100% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :62 (Scr-1 ), et SEQ ID NO :63 (Scr-2), de préférence avec SEQ ID NO :63.
Le Tableau 6 montre les séquences SEQ ID NO :62 et SEQ ID NO :63.
Tableau 6 : Séquences des aptamères aléatoires Scr-1 et Scr-2.
[Table 6]
Selon un mode de réalisation préféré, l’ARN d’au moins un aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l’invention a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à- vis des nucléases ARN. Avantageusement, l’ARN d’au moins un aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères aléatoires de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié par au moins une modification choisie parmi : la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O-Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor) ; le remplacement du phosphodiester (PO) par un groupement phosphorothioate (PS) (on parle alors de squelette phosphorothioate) ; le recours à une structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA), c’est-à-dire la formation d’un pont méthylène afin de verrouiller le ribose en conformation C3’-endo (N-type); le recours à une structure de type acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA), c’est-à-dire le remplacement du squelette sucre- phosphate par un squelette de type peptide ; et une combinaison quelconque de ceux-ci. L’ARN d’au moins un aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères aléatoires de la composition ou du kit selon l’invention) a été de préférence modifié par au moins une modification choisie parmi la modification de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement O- Méthoxyethyl; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un groupement amino ; la substitution de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par un halogène (notamment par le fluor); et une combinaison quelconque de ceux- ci. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’ARN d’au moins un aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence l’ARN de tous les aptamères aléatoires de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié de sorte que les riboses des nucléotides pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'. Ainsi, de manière préférée, IARN modifié de l’aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l'invention est un ARN dont les riboses des nucléotides de pyrimidines (nucléotides de pyrimidiques) portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', de préférence dans lequel les riboses des nucléotides de purines (nucléotides puriques) sont inchangées (il s’agit donc d’un ARN 2’Fluoro-pyrimidines (ARN2’F-Py)). Avantageusement, l’ARN de tous les aptamères aléatoires de la composition ou du kit selon l’invention a été modifié comme défini ci-dessus. De manière particulièrement préférée, l’ARN d’au moins un aptamère aléatoire de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence de tous les aptamères aléatoires de la composition ou du kit selon l’invention) a été modifié de la même façon que l’ARN d’au moins un aptamère selon l’invention et/ou d’au moins un aptamère additionnel (tel que défini ci-dessus) de la composition ou du kit selon l’invention (de préférence de tous les aptamères selon l’invention et/ou de tous les aptamères additionnels de la composition ou du kit selon l’invention).
Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention est caractérisé en ce que, lorsque le kit comprend plusieurs aptamères, ceux-ci sont : a) tous dans une seule composition, ou b) répartis dans plusieurs compositions distinctes dans des récipients séparés, incluant le cas où chacun des aptamères est dans une composition distincte située dans un récipient séparé.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention comprend en outre une notice d’utilisation.
La composition ou le kit selon l’invention peut en outre comprendre un excipient (choisi par exemple parmi les supports, les solvants, les diluants, les adjuvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les agents antibactériens et antifongiques, les agents d'absorption, et toute combinaison de ceux-ci), une solution tampon (choisie par exemple parmi Tris, Hepes, phosphate, sodium, et toute combinaison de ceux-ci), une solution d’ions divalents (choisis par exemple parmi les ions magnésium, calcium, sodium, potassium et toute combinaison de ceux-ci), une enzyme (choisie par exemple parmi les polymérases ADN, les polymérases ARN, les reverse-transcriptase, les ligases, et toute combinaison de celles- ci), des nucléotides, etc, et toute combinaison de ceux-ci. Dans le cas d’un kit, les excipients, solutions tampon, solution d’ions divalents, enzymes, nucléotides, etc., peuvent être chacun dans une composition distincte située dans un récipient séparé, ou peuvent être mélangés deux à deux ou plus dans des compositions distinctes dans des récipients séparés, ou tous dans une même composition. Ils peuvent également être mélangés avec un ou plusieurs aptamère du kit.
Des exemples non limitatifs d’excipients comprennent l'eau, le NaCl, les solutions salines, les solutions de saccharides (par exemple le glucose, le tréhalose, le saccharose, le dextrose, etc.), le Ringer lacté, les alcools, les huiles, les gélatines, les hydrates de carbone tels que le lactose, l'amylose ou l'amidon, les esters d'acides gras, l'hydroxyméthycellulose, etc. (voir par exemple l'édition la plus récente de Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).
La composition ou le kit selon l’invention peut en outre comprendre les composés nécessaires à l’amplification (in vitro ) des conformères de fibres d’a-Syn de type F et/ou de type R. L’amplification des conformères de fibres peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification cyclique de protéines mal repliées (PMCA, pour « protein misfolding cyclic amplification » en anglais), par exemple telle que décrites dans Fenyi et al., 2019. Ainsi, la composition ou le kit selon l’invention peut en outre comprendre une solution tampon adaptée à l’amplification des conformères de fibres d’a-Syn (choisie par exemple parmi Tris, Tris-HCl, Hepes, KCl, et toute combinaison de ceux-ci), et/ou des monomères d’a-Syn, etc.
Utilisations
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des aptamères d’acide ribonucléique (ARN) modifié capables de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des autres conformères de fibres d’a-Syn et des monomère d’a-Syn.
Les données montrent en particulier ces aptamères sont des outils de détection spécifique et sensible des différentes fibres d’a-Syn. La présente invention fournit donc des aptamères utiles pour réaliser des criblages de molécules mais également des outils pour la recherche dans le domaine des maladies neurodégénératives.
La présente invention concerne donc l’utilisation in vitro d’au moins un aptamère selon l’invention, d’au moins une composition selon l’invention, d’au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci, pour : a) détecter la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; b) quantifier (i.e. déterminer la quantité d’) un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; c) établir une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn, de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn, dans un échantillon biologique ; d) cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de préférence cribler des composés/molécules capables de discriminer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R ; ou e) une combinaison quelconque de a) à d).
L’utilisation in vitro pour a) détecter la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique comprend de préférence les étapes suivantes :
1. la mise en contact d’un échantillon biologique avec au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ;
2. la détection de la présence ou l’absence de l’aptamère fixé dans l’échantillon ;
3. la détermination de la quantité et/ou de la présence ou l’absence d’au moins un conformère d’a-syn, de préférence des conformères de fibres d’a-Syn de type F dans l’échantillon biologique.
Les méthodes de détection peuvent utiliser notamment les techniques ELISA, les essais de retard sur gel, la filtration (notamment la filtration sur membrane de nitrocellulose), la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la PCR, la PCR quantitative, le séquençage (notamment le séquençage à haut-débit), les puces à ADN etc.
L’utilisation in vitro pour b) quantifier (i.e. déterminer la quantité d’) un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique comprend de préférence les étapes suivantes :
1. la mise en contact d’un échantillon biologique avec au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ;
2. la quantification de la quantité d’aptamère fixé dans l’échantillon ;
3. la détermination de la quantité d’au moins un conformère d’a-syn, de préférence des conformères de fibres d’a-Syn de type F dans l’échantillon biologique. Les méthodes de quantification peuvent utiliser notamment les techniques d’ELISA, les essais de retard sur gel, la filtration (notamment la filtration sur membrane de nitrocellulose), la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), de PCR, de PCR quantitative, de séquençage à haut-débit, de puce à ADN etc.
L’utilisation in vitro pour c) établir une empreinte moléculaire (c’est-à-dire une signature caractéristique ou encore un profil distinctif) de conformères de fibres d’a-Syn, de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn, comprend de préférence les étapes suivantes :
1. la mise en contact d’un échantillon biologique avec au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ;
2. la quantification de la quantité d’aptamère fixé dans l’échantillon ;
3. l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn, de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn dans l’échantillon biologique.
Les méthodes pour établir une empreinte moléculaire des conformères d’a-Syn, en particulier des conformères de fibres d’a-Syn de type F, comprennent notamment les techniques d’ELISA, les essais de retard sur gel, la filtration (notamment la filtration sur membrane de nitrocellulose), la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), de PCR, de PCR quantitative, de séquençage à haut-débit, de puce à ADN etc.
Dans le cadre de l’utilisation pour établir une empreinte moléculaire, on choisira de préférence une composition ou un kit selon l’invention comprenant au moins 2 aptamères, et en particulier une composition ou un kit comprenant un assortiment d’aptamères tel que défini ci-dessus.
L’utilisation in vitro pour d) cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître d’un conformère de fibres d’a-Syn de type F comprend de préférence les étapes suivantes :
1. la mise en contact d’au moins un composé/une molécule avec un échantillon de conformères de fibres d’a-Syn de type F et au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ;
2. la quantification de la quantité d’aptamère fixé dans l’échantillon ;
3. la détermination de la capacité du composé à se lier aux conformères de fibres d’a- Syn de type F (donc à induire une perte d'affinité de l'aptamère), sur la base de la quantification de l’étape 2.
Les méthodes de quantification peuvent utiliser notamment les techniques d’ELISA, les essais de retard sur gel, la filtration (notamment la filtration sur membrane de nitrocellulose), la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), de PCR, de PCR quantitative, de séquençage à haut-débit, de puce à ADN etc.
Selon un mode de réalisation, l’utilisation in vitro selon l’invention, (i.e. l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour a) détecter la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique, b) quantifier un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique, c) établir une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn dans un échantillon biologique, d) cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître un conformère de fibres d’a- Syn de type F, et un combinaison quelconque de ceux-ci) comprend en outre une étape 1 ’) réalisée avant l’étape 1), d’amplification (in vitro ) des conformères de fibres d’a-Syn de type F et/ou de type R dans un échantillon biologique ou un échantillon de conformères de fibres d’a-Syn de type F. L’amplification des conformères de fibres peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification cyclique de protéines mal repliées (PMCA, pour « protein misfolding cyclic amplification » en anglais), par exemple telle que décrites dans Fenyi et al., 2019.
Méthodes
Les Inventeurs ont montré que les aptamères selon l’invention peuvent être utilisés comme des outils de diagnostic, de pronostic, de stratification ou encore de suivi de maladies neurodégénératives, notamment des synucléinopathies, ou encore d’évaluation de l'efficacité d’un traitement.
Les données montrent en particulier qu’en utilisant un assortiment d’aptamères, une empreinte moléculaire spécifique (une signature caractéristique ou encore un profil distinctif) peut être obtenue pour un échantillon biologique contenant différents conformères de la protéine a-Syn. Cette empreinte moléculaire spécifique permet de distinguer les maladies neurodégénératives les unes des autres, notamment les synucléinopathies.
La présente invention concerne donc une méthode in vitro de diagnostic d'une synucléinopathie chez un sujet ayant au moins un symptôme de maladie neurodégénérative, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet (appelé échantillon (A)) avec au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) le diagnostic de la présence ou l’absence d’une synucléinopathie chez le sujet en fonction du résultat de l’étape b).
Selon un mode de réalisation préféré, le sujet est atteint d'une synucléinopathie, si on détecte la présence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F et/ou si on obtient une empreinte moléculaire spécifique à une synucléinopathie.
Selon un mode de réalisation, la méthode comprend en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro ) des conformères de fibres d’a-Syn de type F et/ou de type R dans un échantillon biologique dudit sujet (appelé échantillon (A)). L’amplification des conformères de fibres peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification cyclique de protéines mal repliées (PMCA, pour « protein misfolding cyclic amplification » en anglais), par exemple telle que décrites dans Fenyi et al., 2019.
Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), de détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, d’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans un ou plusieurs échantillon(s) biologique(s) de sujet(s) de référence. Le(s) sujet(s) de référence comprend(comprennent) de préférence au moins un sujet de référence souffrant d’une synucléinopathie et optionnellement au moins un sujet de référence sain. Comme échantillon d’un sujet de référence souffrant d’une synucléinopathie, on pourra notamment utiliser un échantillon d’un sujet souffrant de la maladie de Parkinson (MP), de la démence à corps de Lewy (DCL) ou d’atrophie multisystématisée (AMS). Plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de différentes synucléinopathies peuvent être utilisés à l’étape b’). Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des conformères de fibres d’a-Syn de type F détectés, des conformères de fibres d’a-Syn de type F quantifiés, et/ou de l’empreinte moléculaire des conformères de fibres d’a-Syn de type F obtenus, pour les étapes b) et b’). Dans ce cas, l’étape c) comprend le diagnostic de la synucléinopathie chez le sujet en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet sera diagnostiqué comme souffrant d’une synucléinopathie si la comparaison de l’étape b’) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence d’un sujet de référence souffrant d’une synucléinopathie (selon les différents échantillons de référence, un diagnostic plus précis parmi les synucléinopathies peut potentiellement être fait sur le même principe), et comme ne souffrant pas d’une synucléinopathie si le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence d’un sujet de référence sain.
Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus.
La présente invention concerne en outre une méthode in vitro de stratification d'une synucléinopathie, de pronostic d'une synucléinopathie, de suivi d'une synucléinopathie, ou d’évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une synucléinopathie chez un sujet souffrant d’une synucléinopathie, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet (appelé échantillon (A)) avec au moins un aptamère selon l’invention, au moins une composition selon l’invention, au moins un kit selon l’invention, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci ; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) la stratification de la synucléinopathie, le pronostic de la synucléinopathie, le suivi de la synucléinopathie, l’évaluation de l'efficacité du traitement de la synucléinopathie, chez le sujet, en fonction du résultat de l’étape b); dans laquelle synucléinopathie est de préférence choisie parmi la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l’atrophie Multi-Systématisée (AMS), de préférence encore synucléinopathie est la DCL.
Selon un mode de réalisation préféré, la synucléinopathie est aggravée, ou le pronostic de la synucléinopathie est négatif, ou la synucléinopathie a évolué, ou le traitement de la synucléinopathie est inefficace ou peu efficace, si on détecte la présence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F et/ou si on obtient une empreinte moléculaire spécifique à une synucléinopathie.
Selon un mode de réalisation, la méthode comprend en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro ) des conformères de fibres d’a-Syn de type F et/ou de type R dans un échantillon biologique dudit sujet (appelé échantillon (A)). L’amplification des conformères de fibres peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification cyclique de protéines mal repliées (PMCA, pour « protein misfolding cyclic amplification » en anglais), par exemple telle que décrites dans Fenyi et al., 2019.
Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode in vitro de pronostic et/ou de stratification comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), de détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, d’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans un ou plusieurs échantillon(s) biologique(s) de sujet(s) de référence. Le(s) sujet(s) de référence comprend (comprennent) de préférence au moins un sujet souffrant d’une synucléinopathie à un pronostic/stade/niveau de stratification connu (de préférence au moins un sujet de référence souffrant d’une synucléinopathie à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, la synucléinopathie étant la même pour le sujet de référence et pour le sujet testé/pronostiqué) et optionnellement au moins un sujet de référence sain. Comme échantillon d’un sujet de référence souffrant d’une synucléinopathie, on pourra notamment utiliser un échantillon d’un sujet souffrant de la maladie de Parkinson (MP), de la démence à corps de Lewy (DCL) ou d’atrophie multisystématisée (AMS). Plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de différentes synucléinopathies peuvent être utilisés à l’étape b’). Préférentiellement, plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de la même synucléinopathie mais à des pronostics/stades/niveaux de stratification différents connus peuvent être utilisés à l’étape b’). Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des conformères de fibres d’a-Syn de type F détectés, des conformères de fibres d’a-Syn de type F quantifiés, et/ou de l’empreinte moléculaire des conformères de fibres d’a-Syn de type F obtenus, pour les étapes b) et b’). Dans ce cas, l’étape c) comprend le pronostic et/ou la stratification de la synucléinopathie chez le sujet en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet aura un pronostic comparable, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification comparable, à celui d’un sujet de référence souffrant de la même synucléinopathie à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, si la comparaison de l’étape b’) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence (selon les différents échantillons de référence, un pronostic et/ou une stratification plus précis(e) parmi les différents stades peut potentiellement être fait sur le même principe). Le sujet aura un pronostic plus négatif, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification plus avancé (plus grave), qu’un sujet de référence souffrant de la même synucléinopathie à un pronostic/stade/niveau de stratification connu ou d’un sujet de référence sain, si le résultat de l’étape b) montre une détection plus importante de fibres F, ou une quantité de fibres d’a-Syn de type F plus élevée, ou une empreinte moléculaire plus riche en fibres F, que celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence ou du sujet de référence sain. A l’inverse, le sujet aura un meilleur pronostic, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification moins avancé (moins grave), qu’un sujet de référence souffrant de la même synucléinopathie à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, si le résultat de l’étape b) montre une détection moins importante de fibres F, ou une quantité de fibres d’a-Syn de type F moins élevée, ou une empreinte moléculaire plus pauvre en fibres F, que celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence.
Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus. Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode in vitro de stratification d'une synucléinopathie, de pronostic d'une synucléinopathie, de suivi d'une synucléinopathie, ou d’évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une synucléinopathie chez un sujet souffrant d’une synucléinopathie, comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), de détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, d’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans un second échantillon biologique du sujet testé (appelé échantillon (B)). Ledit second échantillon (B) a de préférence été obtenu/prélevé postérieurement à l’échantillon (A), par exemple lors d’une seconde visite (l’échantillon (A) ayant alors lui été obtenu lors d’une première visite), de préférence ledit échantillon (B) ayant été obtenu au moins 24 heures après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 48 heures après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 72 heures après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 7 jours après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 10 jours après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 15 jours après l’échantillon (A), de préférence encore au moins
I mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 2 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 3 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 4 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 5 mois après l’échantillon (A), , de préférence encore au moins 6 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 7 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 8 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 9 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 10 mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins
I I mois après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 12 mois après l’échantillon (A). De préférence encore ledit échantillon (B) a été obtenu entre 7 jours et 6 mois après l’échantillon (A), de préférence encore ledit échantillon (B) ayant été obtenu entre 10 jours et 5 mois après l’échantillon (A), de préférence encore entre 15 jours et 4 mois, de préférence encore entre 21 jours et 3 mois, de préférence encore entre 30 et 60, de préférence encore entre 40 et 50 jours. Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des conformères de fibres d’a-Syn de type F détectés, des conformères de fibres d’a-Syn de type F quantifiés, et/ou de l’empreinte moléculaire des conformères de fibres d’a-Syn de type F obtenus, pour les étapes b) (donc pour l’échantillon (A) du sujet) et b’) (donc pour l’échantillon (B) du sujet). Dans ce cas, l’étape c) comprend la stratification de la synucléinopathie, le pronostic de la synucléinopathie, le suivi de la synucléinopathie, l’évaluation de l'efficacité du traitement de la synucléinopathie, chez le sujet, en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification inchangé/comparable, ou le sujet aura un pronostic inchangé/comparable, ou la synucléinopathie n’aura pas ou peu évolué chez le sujet (sera stable), ou le traitement de la synucléinopathie sera raisonnablement efficace, si la comparaison de l’étape b’) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’).
Le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification plus avancé (plus grave), ou le sujet aura un pronostic plus négatif, ou la synucléinopathie aura évolué (aura empiré, se sera aggravée) chez le sujet, ou le traitement de la synucléinopathie sera inefficace ou peu efficace, si le résultat de l’étape b) montre une détection plus importante de fibres F, ou une quantité de fibres d’a-Syn de type F plus élevée, ou une empreinte moléculaire plus riche en fibres F, que celui obtenu à l’étape b’). A l’inverse, le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification moins avancé (moins grave), ou le sujet aura un meilleur pronostic, ou la synucléinopathie se sera améliorée (sera moins grave, aura reculé) chez le sujet, ou le traitement de la synucléinopathie sera efficace, si le résultat de l’étape b) montre une détection moins importante de fibres F, ou une quantité de fibres d’a-Syn de type F moins élevée, ou une empreinte moléculaire moins riche en fibres F, que celui obtenu à l’étape b’).
La méthode selon le mode de réalisation susmentionné peut également comprendre en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro ) des conformères de fibres d’a-Syn de type F et/ou de type R dans l’échantillon (A) et ou l’échantillon (B). L’amplification des conformères de fibres peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification cyclique de protéines mal repliées (PMCA, pour « protein misfolding cyclic amplification » en anglais), par exemple telle que décrites dans Fenyi et al., 2019.
Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention, et ne sauraient être considérés comme limitatifs. DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig. 1]: Exemple représentatif de codes barres/empreintes moléculairesdes conformères de fibres d’a-Syn de type F (Panneau de gauche), R (Panneau du milieu) et 91 (panneau de droite) obtenu suite à une protéolyse ménagée à la protéinase K (PK) à différents temps en minutes (1 , 5 ou 15 min, indiqué en haut de chaque panneau ; Landureau et al. , 2021 ).
[Fig. 2]: Résultats du criblage des 28 candidats aptamères et de leurs séquences aléatoires associées contre les fibres F, R, 65 et 91 d’a-Syn : Ratio entre la quantité d'oligonucléotide restée liée sur la membrane nitrocellulose par rapport à la quantité de leur séquence aléatoire associée (Scr1 -G ou Scr2-G) restée liée. Les graphiques présentent le ratio entre la quantité d'oligonucléotide restée liée sur la membrane nitrocellulose par rapport à la quantité séquence aléatoire associée (Scr1 -G ou Scr2-G) restée liée.
[Fig. 3]: Mesure de l’affinité de l’aptamère N30-G pour les fibres d’a-Syn de type F ou R.
[Fig. 4]: Mesure de l’affinité de l’aptamère N30-G pour les fibres de type « amyloïdes-b » ou la fibre P110 d’a-Syn ou les monomères d’a-Syn.
[Fig. 5]: Mesure de l’affinité de l’aptamère N124-G pour les fibres d’a-Syn de type F ou R.
[Fig. 6]: Mesure de l’affinité de l’aptamère N124-G pour les fibres de type « amyloïdes-b » ou la fibre P110 d’a-Syn ou les monomères d’a-Syn.
[Fig. 7]: Détection des fibres d’a-Syn de type F par l’aptamère N30-G par séparation sur colonne Sp6.
[Fig. 8]: Exemple représentatif d’une empreinte moléculaire de la présence d’un conformère par l’analyse de la fréquence en aptamères d’un mélange par séquençage à haut-débit.
[Fig. 9]: Empreinte moléculaire de la présence d’un conformère F ou R dans un milieu par séquençage de l’évolution de la fréquence de 15 oligonucléotides. Un mélange de 14 aptamères (nommés N) et d’une séquence contrôle (nommée Scr-2 (pour Scramble 2)) a été incubé dans un milieu contenant des conformères de fibre F ou R (respectivement conditions Fn1 à Fn3 et Rn1 à Rn3) ou dans un milieu sans fibre (conditions 0n1 à 0n4). La figure représente l’évolution de la fréquence de chaque aptamère dans le mélange par rapport à sa fréquence initiale dans le mélange. Cette analyse permet de révéler une signature spécifique pour chaque conformère.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Conception et mises au point d’aptamères spécifiques de conformère d’a- Syn
1.1. Matériels et méthodes
1.1.1. SELEX
Plusieurs SELEX ont été réalisés contre différents conformères de fibre d'a-Synucléine, notamment des conformères appelés « F » et « R ». Les conformères de fibre F ont un aspect cylindrique tandis que les conformères de fibre R ont une forme de rubans. Il a été démontré que des rongeurs peuvent développer deux formes de synucléinopathie différentes : la maladie de Parkinson et l'atrophie multi-systématisée, lorsqu'ils sont injectés avec respectivement des conformères de fibre F ou R.
Une sélection d’aptamère a été réalisée en chimie ARN dont toutes les pyrimidines sont modifiées en position 2’ de leur ribose par un groupement Fluor. Cette modification chimique est connue pour augmenter considérablement la résistance des ARN à la dégradation par des RNAses.
Au cours de ces SELEX, des étapes de contre-sélection ont été réalisées pour diriger la spécificité de reconnaissance des aptamères vers un type de conformère particulier et afin de garantir que les aptamères aient peu d’affinité pour la forme monomérique d’a-Syn. Par exemple, pour sélectionner des aptamères spécifiques des conformères de fibre F, une banque de 1015 oligonucléotides différents a été préalablement incubée avec des formes monomériques ou des conformères de fibre R. Seuls les oligonucléotides n'ayant pas d'affinité pour ces conformations ont été utilisés pour une sélection contre conformères de fibre F. Avec ce type de contre sélection, l’objectif était d’isoler des aptamères ayant de l'affinité pour les conformères de fibre F mais dépourvus d'affinité pour les autres formes de la protéine.
Des échantillons des banques ont été analysés par séquençage à haut-débit. 28 candidats issus de ces SELEX ont été retenus (tableau 7 ci-dessous). L’affinité de ces candidats ont été criblés par filtration sur nitrocellulose.
1. 1.2. Tests d’affinité des aptamères candidats 10 nM de chaque aptamère candidat (hybridés par choc thermique à un oligonucleotide marqué radioactivement au P32) ont été incubés avec des conformères de fibre d’a-Syn à 1 mM dans une solution de TsIX (HEPES (pH 7.6) 10mM, NaCl 150mM, KCl 5mM, CaCl2 1 ,5mM, MgCl2 1 mM) contenant de l’Igepal à 0.1% et de l’ADNss ajouté en proportion 5-1 par rapport aux oligonucléotides (c’est-à-dire à hauteur de 1.7 pg/ml). Après 30 min d’incubation à 37° C, 25 pl_ de chaque mélange est déposé en triplicat sur la membrane nitrocellulose, puis filtré. Deux lavages au Ts1X sont ensuite réalisés. Les quantités d’oligonucléotides retenus sur la membrane nitrocellulose sont quantifiés par exposition de la membrane à un écran au phosphore photostimulable.
1.1.3. Détermination des constantes de dissociation des aptamères candidats et comparaisons avec les aptamères de l’art antérieur
L’affinité des aptamères a été évaluée à l’aide d’une seconde méthode, qui consiste à mesurer la quantité de complexe formée en faisant varier la concentration de l’aptamère, et en laissant celle de la cible constante. Lors de ces mesures, on se place de manière à ce que la concentration en cible soit tellement grande comparée à la concentration en aptamère, ainsi on peut négliger la quantité de cible liée à l’aptamère comparée à la quantité de cible libre. Lorsque l’interaction est de type « spécifique » entre un candidat et sa cible, la courbe de la quantité de complexe formée en fonction de la concentration en candidat initialement présente doit être hyperbolique et montrer une saturation. On peut alors calculer les constantes d’affinité de l’aptamère pour sa cible, le Bmax et le Kd.
Les affinités des aptamères candidats ont également été comparées à des aptamères décrits dans la littérature comme ayant été sélectionnés contre a-syn. les aptamères M5-15 et T- S0508, sélectionnés par Tsukakoshi et ses collaborateurs respectivement en 2010 et 2012 (Tsukakoshi et al., 2010, 2012), ont étés choisis. Ces aptamères en chimie ADN ont été sélectionnés pour reconnaître respectivement les formes monomériques et oligomériques d’a-syn. Il a été démontré que le T-S0508, qui reconnaissait les oligomères d’a-Syn avec un kd de 68 nM, avait aussi une affinité pour les oligomères d’A640 (kd de 25nM). Ont également été choisis les aptamères F5R1 et F5R2, qui sont également en chimie ADN et ont été sélectionnés en 2019 par Zheng et ses collaborateurs (Zheng et al., 2018; Ren et al., 2019). Ils reconnaissent Ga-Syn avec des kd respectivement de 2.4 et 3.07 nM. Enfin, l’aptamère Tau 3146 de chimie ADN a également été testé. Cet aptamère a été isolé par un procédé rapide appelé « Non-SELEX », durant lequel trois tours de sélection successifs sans amplification entre les sélections ont été réalisés contre l’isoforme monomérique Tau 441 (Lisi et al., 2018). L’aptamère Tau 3146 a été montré comme étant capable de se lier aux isoformes Tau 441 , Tau 381 , Tau 352 et Tau 383 avec des kd respectivement de 13±3nM, 116±6nM, 84±6 nM et 49±4nM.
Tous ces aptamères étant de chimie ADN, il est nécessaire de les comparer à une séquence aléatoire de la même chimie et de longueur comparable. Une séquence d’ADN utilisée au laboratoire comme amorce pour des PCR a été choisie comme contrôle. Cette amorce, nommée « Scr_ADN » a une taille de 87 nucléotides qui est comparable aux séquences des aptamères ADN que nous avons sélectionnés à partir de la littérature (Tableau 7 ci-dessous).
Tableau 7 - Séquences des aptamères de l’art antérieur utilisés comme comparatif pour les tests d’affinités des aptamères selon l’invention et de leur séquence aléatoire associée.
[Table 7]
L’affinité des aptamères candidats ainsi que celle des aptamères issus de la littérature a également mesurée contre différentes fibres de types « amyloïdes » (fibres Tau1 N3R et les fibres A640), outre les conformères de fibre F et R d’a-syn. L’affinité des aptamères candidats contre la fibre d’a-Syn « P110 » a également mesurée. Cette fibre a été réalisée à partir de protéine a-Syn tronquées à partir de l’acide aminés n° 110 (il manque ainsi les 30 acides aminés du domaine C-terminal).
Les oligonucléotides (aptamères) à 10 nM (hybridés par choc thermique au SpG-LNA marqué radioactivement au P32 pour les oligonucléotides de chimie ARN2’F, ou bien directement marqués au P32 pour les oligonucléotides ADN) ont été présentés aux protéines à 250 nM dans une solution de Ts1X contenant de l’Igepal à 0.1% et de l’ADNss ajouté en proportion 5-1 par rapport aux oligonucléotides (c’est-à-dire entre 0.135pg/ml et 17.325 pg/ml). Après 30 min d’incubation à 37° C, 25 mI_ de chaque mélange est déposé sur la membrane nitrocellulose, puis filtré. Deux lavages au Ts1X sont ensuite réalisés. Les quantités d’oligonucléotides retenues sur la membrane nitrocellulose sont quantifiés par exposition de la membrane à un écran au phosphore photostimulable. Les Kd et Bmax ont été calculés avec l’aide du logiciel Prism en utilisant un modèle de régression non linéaire analysant l’affinité totale (spécifique et non spécifique) d’un candidat pour la cible, en faisant l’hypothèse qu’il n’existe qu’un seul site de liaison sur la cible pour le candidat.
Les mesures ont été réalisées en triplicat (trois expériences indépendantes à des jours différents) pour les fibres d’a-Syn de type F et R, et en duplicat pour les autres fibres (Tau1 N3R et les fibres A640, et P110) ainsi que pour les monomères d’a-syn.
1. 1.4. Tests d’affinité par colonne Sp6
Les oligonucléotides radioactivement marqués au P32 (par hybridation à un SpG-LNA marqué au P32 pour les séquences ARN2’F-Py, par marquage direct pour les séquences ADN) ont été mélangés aux protéines à 250 nM (fibre F ou monomères d’a-syn) en Ts1X, Igepal 0.1%. Après 30 min d’incubation à 37° C, 25pL des mélanges ont été déposés sur colonne Sp6 dont le tampon a été changé au préalable en Ts1X. Après une première centrifugation du dépôt, deux lavages au Ts1X de la colonne ont été réalisés. Les colonnes ont enfin été éluées par un lavage avec solution de SDS 2%. Les fractions ont ensuite été déposées dans une plaque 24 puits, et la plaque exposée plusieurs heures sur un écran au phosphore photostimulable. L’analyse de l’exposition a permis une quantification de chacune des fractions pour chaque condition.
1.1.5. Empreinte moléculaire par l’analyse de la fréquence en aptaméres d’un mélange par séquençage à haut-débit (FootBal-Seq)
Un mélange de 14 aptaméres (nommés N) et d’une séquence contrôle (nommée Scr-2 (pour Scramble 2)) a été incubé dans un milieu contenant des conformères de fibre F ou R (respectivement conditions Fn1 à Fn3 et Rn1 à Rn3) ou dans un milieu sans fibre (conditions 0n1 à 0n4). Le mélange a été filtré sur une colonne d’exclusion et les séquences retenues sur la colonne après 3 lavages ont été éluées par du SDS2%. Après extraction Phénol- chloroforme, le mélange d’oligonucléotides a été amplifié par RT-PCR. Au cours de cette étape les séquences ont été allongées par des séquences « adaptateurs » permettant leur séquençage à haut-débit. Après purification par électrophorèse sur gel d’agarose, les mélanges ont été séquencés par séquençage à haut-débit. 1.2. Résultats
1.2.1. Aptamères sélectionnés par Selex
Le Tableau 8 ci-dessous présente les séquences des candidats retenus. Tableau 8 -Séquences des candidats aptamères sélectionnés. Les parties aléatoires (i.e. les parties spécifiques) des séquences sont soulignées, et les parties constantes correspondant aux sites des amorces ne sont pas soulignées. Les aptamères Scr-1 et Scr-2 ont une séquence aléatoire.
[Table 8]
1.2.2. Affinité des aptamères candidats pour les différents conformères d’a-syn
La Figure 2 montre que les aptamères N3, N30, N124, 4F01 , 4F02, 4F03, 4F05, F124 et P65 restent liés aux conformères de fibres d’a-Syn de type F en quantité bien plus importante que des séquences aléatoires. En particulier, les candidats N3-G, N30-G et N124-G restent en moyenne 3.5 fois plus liés aux fibres d’a-Syn de type F que le Scr2-G.
Les données montrent en outre que les aptamères N3, N30, N124, 4F01 , 4F02, 4F03, 4F05, F124 et P65 restent liés aux conformères de fibres d’a-Syn de type F en quantité bien plus importante qu’aux autres conformères (R, 91 et 61 ; Figure 2). Ces résultats démontrent que les aptamères N3, N30, N124, 4F01 , 4F02, 4F03, 4F05, F124 et P65 sont capables de discriminer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des autres conformères d’a-syn.
1.2.3. Détermination des constantes de dissociation des aptamères candidats et comparaison avec les aptamères de l’art antérieur
Les résultats représentatifs de chaque test d’affinité sont représentés par les Figures 3 et 4 pour les aptamères N30 et par les Figures 5 et 6 pour les aptamères N124. Les calculs des Kd et Bmax calculés par Prism sont indiqués sur les graphiques, lorsque qu’il a été déterminé que l’aptamère se liait significativement à la protéine par rapport à sa séquence aléatoire associée. Les tableaux 9 à 12 ci-dessous récapitulent les moyennes des Kd et Bmax calculés pour chaque aptamère et pour chaque protéine, à partir de l’ensemble des duplicats ou triplicats d’expériences réalisées, pour chaque type de fibre.
Tableau 9 - Moyenne des constantes d'affinités (Kd et Bmax) calculées pour les candidats oligonucléotides, pour les fibres d’a-Synucléine de type F.
[Table 9]
Tableau 10 - Moyenne des constantes d'affinités (Kd et Bmax) calculées pour les candidats oligonucléotides, pour les fibres d’a-Synucléine de type R. [Table 10]
Tableau 11 - Moyenne des constantes d'affinités (Kd et Bmax) calculées pour les candidats oligonucléotides, pour les fibres d’a-Synucléine de type P110.
[Table 11]
Tableau 12 - Moyenne des constantes d'affinités (Kd et Bmax) calculées pour les candidats oligonucléotides, pour les fibres d 'Amyloïde 6.
[Table 12]
En pourcentage est exprimé le coefficient de variation, le ratio entre l’écart type des valeurs et leur moyenne. La colonne « reproductibilité » donne le nombre d’expériences pour lesquelles liaison entre l’aptamère et la cible a été mesurée. Le symbole « - » signifie qu’aucune expérience n’a été réalisée. La mention « Pas de liaison » est indiqué dans le tableau lorsque la liaison de l’aptamère testé n’est pas significativement supérieure à celle de la séquence aléatoire qui lui est associée.
Les données montrent que les mesures des affinités pour la fibre F sont très reproductibles : les aptamères N30-G, N124-G, T-S0508 et F5R1 se lient aux fibres d’a-Syn de type F avec des Kd inférieurs à 10 nM à chaque expérience. Les aptamères T-S0508 et F5R1 se lient également aux fibres d’a-Syn de type R à chaque expérience, tandis que les aptamères N30- G et N124-G ne se lient pas aux fibres d’a-Syn de type R de manière significativement supérieure par rapport à leur séquences aléatoires associées. Les aptamères M5-15, F5R2 et Tau 3146 ne se lient ni aux fibres F, ni aux fibres d’a-Syn de type R (pas de fixation significativement supérieure à leur séquences aléatoires associées).
Ainsi, les données révèlent que seuls les aptamères N30-G et N124-G sont capables de discriminer la fibre F de la fibre R parmi les aptamères testés. Les aptamères de l’art antérieur reconnaissent soit les 2 fibres avec des affinités comparables (aptamères T-S0508 et F5R1 ), soit ne sont pas capables de reconnaître les fibres d’a-Syn de type R ni les fibres d’a-Syn de type F (M5-15, F5R2 et Tau 3146).
Les aptamères T-S0508 et F5R1 ont des Kd plus faibles pour la fibre F et des Bmax plus importants pour la fibre R (différant de l’ordre d’un facteur 2). Toutefois, une différence de Kd d’un facteur 2 n’est pas suffisant pour permettre une discrimination fiable entre les 2 types de fibres.
Les figures 4 et 6 montrent en outre que les aptamères N30 et N124 ne présentent aucune affinité pour les monomères d’a-Syn.
De même, les données révèlent que les aptamères N30 et N124 ne reconnaissent pas les fibres d’amyloide-B de manière significative (figures 4 et 6 et tableau 9).
L’ensemble de ces données démontrent que les aptamères N30 et N124 possèdent une affinité hautement spécifique pour la fibre F d’a-Syn. En effet, les aptamères N30 et N124 sont capables de discriminer, de manière reproductible et spécifique, la fibre F d’a-Syn non seulement de la fibre R d’a-Syn mais également du monomère d’a-Syn et d’autres types de fibres telles les fibres d’amyloide-B.
1.2.4. Tests d’affinité par colonne Sp6
L’affinité de l’aptamère N30-G pour les conformères de fibre F ou les monomères a été testée par filtration sur colonne d’exclusion (Sp6 de Biorad). Les capacités de l’aptamère N30-G ont été comparées à celles de l’aptamère T-S0508. Les séquences Scr2-G et Scr_ADN ont été utilisées comme contrôles.
Les résultats des essais de détection sont présentés Figure 7. Les données montrent que ces résultats sont reproductibles. On observe que lorsque les oligonucléotides ont été présenté aux fibres d’a-Syn de type F, 16.7% du N30-G, 2.1% du Scr2-G, 3.9% du T-S0508 et 3.0% du Scr_ADN sont élués dans la fraction du lavage au SDS 2% des colonnes Sp6. Ceci signifie que le N30-G est environ 8 fois mieux retenu aux fibres d’a-Syn de type F que sa séquence aléatoire associée, et 4 fois mieux retenu que le T-S0508. Ces résultats sont une nouvelle confirmation de la capacité du N30-G à reconnaître les fibres F, et aussi de sa supériorité face au T-S0508.
Les données montrent que, lorsque le N30-G a été présenté aux monomères, seul 1.1% des oligonucléotides sont élués dans la fraction d’élution du SDS 2%. Ceci signifie que le N30-G reconnaît les fibres d’a-Syn de type F environ 16 fois mieux que les monomères. De manière intéressante, les fractions éluées par SDS 2% sont similaires pour le T-S0508 qu’il ait été présenté aux fibres d’a-Syn de type F ou aux monomères (respectivement 3.9 et 3.8%). Ces résultats montrent que le T-S0508 ne réalise pas de distinction entre les fibres d’a-Syn de type F et les monomères. 1.2.5. Obtention d’une empreinte moléculaire diagnostique par FootBal-Seq
Les Inventeurs ont développé une nouvelle méthode de diagnostic utilisant un mélange d’aptamères pour diagnostiquer la présence d’un conformère de fibre dans un milieu (Figure 8). Une sélection de 14 des 28 aptamères mis au point a été mélangée en quantité équimolaire, ainsi qu’une séquence contrôle. Ce mélange a été incubé dans un milieu ne contenant aucune fibre ou contenant des conformères de Fibre soit F ou R. Les mélanges ont ensuite été déposés sur colonne d’exclusion Sp6. Après amplification et purification, les mélanges ont été séquencés par séquençage à haut-débit. La proportion de chaque séquence dans le mélange est comparée à la proportion de départ. La figure 9 représente l’évolution de la fréquence de chaque aptamère dans le mélange par rapport à sa fréquence initiale dans le mélange. Cette analyse permet de révéler une signature spécifique pour chaque conformère. Par exemple un fort enrichissement en N30, N73 et N15 par rapport aux autres séquences pour le conformère de Fibre F et un enrichissement en séquences N30, N124, N5, N73 et N15 pour le conformère de fibre R. Ainsi, les données mettent en évidence une signature spécifique pour les conformères de fibre F et les conformères de fibre R (Figure 9).
Ces résultats ont été confirmés sur des échantillons de patients. Ces données confirment qu’un tel mélange d’aptamères peut être utilisé pour obtenir une signature à partir d’échantillons biologiques de patients, permettant ainsi le diagnostic de maladies neurodégénératives. Ce mélange permet notamment de déterminer si le patient souffre d’une synucléinopathie ou d’un autre type de maladie neurodégénérative. Dans le cas où il s’agit d’une synucléinopathie, il est également possible de déterminer laquelle, par le même test. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Aptamère caractérisé en ce qu’il possède la capacité de distinguer les conformères de fibres d’a-Syn de type F de la protéine a-Syn (a-Syn) des conformères de fibres d’a-Syn de type R, et en ce qu’il comprend une séquence spécifique d’acide ribonucléique (ARN) modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 , SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, et SEQ ID NO :7, de préférence choisie parmi SEQ I D NO : 1 et SEQ ID NO :2.
2. Aptamère selon la revendication 1 , dont la constante de dissociation Kd(F> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est : a) inférieure à la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; b) inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a- Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; c) inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; d) inférieure à la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; e) inférieure à la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; ou f) inférieure à la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R, de préférence inférieure d’au moins 10 fois ; inférieure à la constante de dissociation Kd(Mono) mesurée pour les monomères d’a-Syn, de préférence inférieure d’au moins 2 fois ; et inférieure à la constante de dissociation Kd(Aiéatoire) d’un aptamère aléatoire mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F, de préférence inférieure d’au moins 2 fois.
3. Aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, ayant au moins une constante de dissociation Kd comme suit : a) la constante de dissociation Kd<F) mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type F est inférieure à 15 nM, de préférence inférieure à 10 nM ; et/ou b) la constante de dissociation Kd(R> mesurée pour les conformères de fibres d’a-Syn de type R est supérieure à 100 nM, de préférence supérieure à 150 nM.
4. Aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 et SEQ ID NO :30, de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :31 , SEQ ID NO :32 et SEQ ID NO :33, de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
5. Aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une séquence d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQID NO :34, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQID NO :38, SEQ ID NO :39, et SEQ ID NO :40, de préférence choisie parmi SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35.
6. Kit comprenant au moins un aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Kit selon la revendication 6, comprenant en outre au moins un aptamère additionnel choisi parmi les aptamères comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 , SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 , SEQ ID NO :16 SEQ ID NO :17 , SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 , SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, et SEQ ID NO :28 ; le kit comprenant de préférence en outre un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
8. Kit selon la revendication 7, dans lequel au moins un aptamère additionnel comprend en outre : i. en 5’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :29 et SEQ ID NO :30, de préférence située à l’extrémité 5’ de la séquence spécifique ; et/ou ii. en 3’ de la séquence spécifique, une séquence amorce d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, avec une séquence choisie parmi SEQ I D NO : 31 , SEQ ID NO :32, et SEQ ID NO :33, de préférence située à l’extrémité 3’ de la séquence spécifique.
9. Kit selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel au moins un aptamère additionnel est choisi parmi les aptamères comprenant une séquence d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41 , SEQ ID NO :42, SEQ ID NO :43 , SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48 SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51 , SEQ ID NO :52 , SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, et SEQ ID NO :60.
10. Kit selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, comprenant au moins les aptamères suivants : aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :1 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :2, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :3 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :8, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :9, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :10 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ I D NO : 11 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :12 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :13 , aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :14, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :16, aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :17, et aptamère comprenant une séquence spécifique d’ARN modifié ayant au moins 85% d’identité avec SEQ ID NO :18; le kit comprenant de préférence en outre un aptamère comprenant une séquence aléatoire d’ARN modifié.
11. Kit selon l’une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que, lorsque le kit comprend plusieurs aptamères, ceux-ci sont : a) tous dans une seule composition, ou b) répartis dans plusieurs compositions distinctes dans des récipients séparés, incluant le cas où chacun des aptamères est dans une composition distincte située dans un récipient séparé.
12. Aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ou kit selon l’une quelconque des revendications 6 à 11 , dans lequel l’ARN de l’aptamère ou de tous les aptamères du kit a été modifié afin d’augmenter sa résistance vis-à-vis des nucléases ARN, de préférence dans lequel les riboses des pyrimidines de l’aptamère ou de tous les aptamères du kit portent un atome de fluor sur le carbone en position 2'.
13. Utilisation in vitro d’au moins un aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 12, d’au moins un kit selon l’une quelconque des revendications 6 à 12, ou d’une combinaison quelconque de ceux-ci, pour : a) détecter la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; b) déterminer la quantité d’un conformère de fibres d’a-Syn de type F dans un échantillon biologique ; c) établir une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn, de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn, dans un échantillon biologique ; d) cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître d’un conformère de fibres d’a-Syn de type F, de préférence cribler des composés/molécules capables de discriminer les conformères de fibres d’a-Syn de type F des conformères de fibres d’a-Syn de type R ; ou e) une combinaison quelconque de a) à d).
14. Méthode in vitro de diagnostic d'une synucléinopathie chez un sujet ayant au moins un symptôme de maladie neurodégénérative, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet avec au moins un aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 13, avec au moins un kit selon l’une quelconque des revendications 7 à 13, ou avec une combinaison quelconque de ceux-ci; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) le diagnostic de la présence ou l’absence d’une synucléinopathie chez le sujet en fonction du résultat de l’étape b).
15. Méthode in vitro de stratification d'une synucléinopathie, de pronostic d'une synucléinopathie, de suivi d'une synucléinopathie, ou d’évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une synucléinopathie chez un sujet souffrant d’une synucléinopathie, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique du sujet avec au moins un aptamère selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 13, avec au moins un kit selon l’une quelconque des revendications 7 à 13, ou avec une combinaison quelconque de ceux-ci ; b) la détection de la présence ou l’absence d’au moins un conformère de fibres d’a- Syn de type F, la quantification des conformères de fibres d’a-Syn de type F, l’établissement d’une empreinte moléculaire de conformères de fibres d’a-Syn (de préférence de fibres d’a-Syn de type F et R d’a-Syn), ou une combinaison quelconque de ceux-ci, dans l’échantillon biologique du sujet ; et c) la stratification de la synucléinopathie, le pronostic de la synucléinopathie, le suivi de la synucléinopathie, l’évaluation de l'efficacité du traitement de la synucléinopathie, chez le sujet, en fonction du résultat de l’étape b); dans laquelle synucléinopathie est de préférence choisie parmi la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) et l’atrophie Multi-Systématisée (AMS), de préférence encore synucléinopathie est la DCL.
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