EP4329752A1 - Cardioprotection par induction d'autophagie et reprogrammation metabolique - Google Patents

Cardioprotection par induction d'autophagie et reprogrammation metabolique

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Publication number
EP4329752A1
EP4329752A1 EP22726494.2A EP22726494A EP4329752A1 EP 4329752 A1 EP4329752 A1 EP 4329752A1 EP 22726494 A EP22726494 A EP 22726494A EP 4329752 A1 EP4329752 A1 EP 4329752A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
cells
sg6163f
compounds
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22726494.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine Brenner
Frédéric TARAN
Jean-Christophe Cintrat
Jean-Luc Perfettini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut Gustave Roussy (IGR)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut Gustave Roussy (IGR), Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Saclay, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP4329752A1 publication Critical patent/EP4329752A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
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    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
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    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the invention relates to compounds capable of inducing autophagy and metabolic reprogramming and their use as cardioprotectors, in particular in the context of anti-cancer therapy.
  • the inventors have developed a high-throughput screening assay to identify inhibitors of the main cardiac cell death modalities, i.e. H2O2-induced necrosis and camptothecin-induced apoptosis among libraries chemicals composed of 1600 molecules on a line of H9C2 cardiomyoblasts. This test has thus made it possible to identify cardioprotective molecules capable of compensating for the cardiotoxic effects of anti-cancer therapeutic strategies.
  • the inventors have been able to show that the molecules identified in the context of the present invention act by inhibiting the death of cardiomyocytes by the induction of autophagy and metabolic reprogramming resulting in an inhibition of the phenomena of apoptosis and necrosis.
  • the molecules identified can in particular be used in combination with chemotherapy or radiotherapy to protect heart cells and reduce the side effects of cancer treatments.
  • the invention relates to such cardioprotective molecules capable of inducing autophagy and metabolic reprogramming, for their use in the prevention of cardiac side effects of an anti-cancer treatment.
  • the invention relates more particularly to a compound chosen from the group consisting of SG6163F, LOPA87, VP331 and their analogues, for their use as a cardioprotector.
  • the compound is chosen from SG6163F, LOPA87, and their analogues, more particularly from SG6163F and LOPA87.
  • the compound is used in the treatment of a heart disease chosen from myocardial infarction, ischemia-reperfusion or heart failure.
  • the compound is used in the cardioprotection against the cardiotoxic side effects of a therapy inducing cardiotoxic side effects, in particular an anti-cancer therapy.
  • the invention relates in particular to a compound chosen from the group consisting of SG6163F, LOPA87, VP331 and their analogues, combined with a therapeutic agent such as an anticancer agent, for its use in cardioprotection against the cardiotoxic side effects of a therapy, such as cancer therapy, inducing cardiotoxic side effects.
  • the compound can be administered before, during or after the therapy inducing cardiotoxic side effects.
  • the invention relates to a set of components comprising:
  • component (b) a therapeutic agent useful for treating a patient, said agent however inducing cardiotoxic side effects; wherein component (a) is for use for its cardioprotective effect against the cardiotoxic side effects of component (b).
  • components (a) and (b) are suitable for sequential, separate and/or simultaneous administration.
  • the assembly according to the invention is used in the context of the treatment of cancer, component (b) being a chemotherapeutic or immunotherapeutic anticancer agent, and component (a) being used for its cardioprotective effect against the cardiotoxic side effects of component (b).
  • the invention relates to a method for screening compounds possessing a cardioprotective activity, or capable of possessing a cardioprotective activity, said method comprising the following steps: a) the culture of cardiac cells in a culture medium containing a compound test; b) culturing the heart cells in a culture medium containing a cell death inducer; and c) measuring cell viability.
  • the compounds used are compounds capable of inducing autophagy, metabolic reprogramming and of inhibiting the death of cardiomyocytes by inhibiting the phenomena of apoptosis and necrosis.
  • the inventors were able demonstrate that such compounds are cardioprotective, with no effect of inducing proliferation of cancerous cells.
  • the invention therefore relates to a compound capable of inducing autophagy and metabolic reprogramming, for its use as a cardioprotector.
  • the invention relates more particularly to a compound capable of inducing autophagy and metabolic reprogramming and of inhibiting the death of cardiomocytes by inhibition of apoptosis and/or necrosis, for its use as a cardioprotector.
  • a person skilled in the art is familiar with the autophagy mechanism and the means enabling him to identify compounds capable of inducing this mechanism. Furthermore, he may use the method presented in the experimental part of the present application to identify other compounds possessing such properties.
  • the compound capable of inducing autophagy is a compound chosen from digitoxigenin, digoxin, minaprine, SG6163F, VP331 and LOPA87, and their analogues.
  • digitoxigenin digoxin
  • minaprine SG6163F
  • VP331 VP331 and LOPA87
  • analogues The ability of these compounds to induce autophagy in cardiac cells and metabolic reprogramming by modulation of glycolysis and mitochondrial respiration involving an effect on the mitochondrial network had never been reported in the state of the art.
  • These properties newly identified in the context of the present invention can advantageously be implemented in order to induce a cardioprotective effect in patients requiring such cardioprotection.
  • the formulas of the compounds digitoxigenin, digoxin, minaprine, SG6163F, VP331 and LOPA87 are given below:
  • the compound is chosen from the compounds SG6163F, VP331 and LOPA87, and their analogues. More preferably, the compound is chosen from the compounds SG6163F, LOPA87 and their analogues.
  • the analog of compound SG6163F is a compound of formula (I):
  • Ar is a C6-14 aryl group or a C5-C10 heteroaryl group, said aryl or heteroaryl group being optionally substituted by 1 to 5 groups chosen from C6-C14 aryl groups, C5-C10 heteroaryl groups, halogen atoms, C1-C6 alkyl groups, hydroxyl group, C1-C6 alkoxyl groups, NH2 group, NO2 group, mono-(C1-C6)-alkylamino groups and di- ( C1-C6)-alkylamino; and
  • R is chosen from C6-C14 aryl groups, C5-C10 heteroaryl groups, halogen atoms, C1-C6 alkyl groups, the hydroxyl group, the C1-C6 alkoxyl groups, the NH2 group, the N02 group, the mono-(C1-C6)-alkylamino groups and the di-(C1-C6)-alkylamino groups.
  • the Ar group is a C6-C10 aryl group.
  • C10 is chosen from phenyl, fluorenyl, anthracenyl or naphthyl groups.
  • Ar is an unsubstituted aryl group, in particular an unsubstituted phenyl or naphthyl group, more particularly an unsubstituted phenyl group.
  • Ar is a C6-C10 aryl group substituted by 1 to 5 groups as defined above.
  • Ar is a C6-C10 aryl group substituted by a group chosen from C6-C14 aryl groups, C5-C10 heteroaryl groups, halogen atoms, C1-C6 alkyl groups, the hydroxyl group, the C1-C6 alkoxyl groups, the NH2 group, the NO2 group, the mono-(C1-C6)-alkylamino groups and the di-(C1-C6)-alkylamino groups .
  • Ar is a C6-C10 aryl group substituted by a group chosen from C6-C14 aryl groups, in particular phenyl, halogen atoms, C1-C6 alkyl groups and alkoxyl groups in C1-C6.
  • Ar is a C6-C10 aryl group substituted by a group chosen from C6-C14 aryl groups, in particular phenyl, halogen atoms and C1-C6 alkoxyl groups.
  • Ar is a phenyl group monosubstituted by a phenyl group, a halogen atom, in particular a fluorine atom, or a methoxyl group.
  • Ar is a naphthyl group monosubstituted by a halogen atom or a methoxyl group. According to a variant, Ar is a naphthyl group monosubstituted by a methoxyl group.
  • the Ar group is a C5-C10 heteroaryl group.
  • Ar is an unsubstituted heteroaryl group.
  • Ar is a heteroaryl group substituted by 1 to 5 groups as defined above.
  • Ar is a heteroaryl group substituted by a group chosen from C6-C14 aryl groups, C5-C10 heteroaryl groups, halogen atoms, C1-C6 alkyl groups, the hydroxyl group , C1-C6 alkoxyl groups, the NH2 group, the NO2 group, the mono-(C1-C6)-alkylamino groups and the di-(C1-C6)-alkylamino groups.
  • Ar is a heteroaryl group, in particular imidazolyl, substituted by a group chosen from halogen atoms, C1-C6 alkyl groups and C1-C6 alkoxyl groups.
  • Ar is a heteroaryl group, in particular imidazolyl, substituted by a C1-C6 alkyl group.
  • Ar is a heteroaryl group, in particular imidazolyl, substituted by a methyl group.
  • R is chosen from halogen atoms, C1-C6 alkyl groups, C1-C6 alkoxyl groups and the group N02.
  • R is chosen from halogen atoms, C1-C6 alkoxyl groups and the N02 group. More particularly, R is chosen from halogen atoms, more particularly the chlorine atom, the methoxyl group and the N02 group.
  • the analog of the compound LOPA87 is a compound of formula (II): in which:
  • R1 and R2 are chosen from the following groups: hydrogen atom, halogen atom, C6-C14 aryl, C1-C6 alkyl, hydroxyl, C1-C6 alkoxyl, NH2, NO2, mono -(C1-C6)-alkylamino and di-(C1-C6)-alkylamino.
  • R1 is chosen from hydrogen and a halogen atom.
  • R1 is a hydrogen atom.
  • R2 is a C6-C14 aryl, more particularly a phenyl group.
  • the analog of the compound LOPA87 is the compound LOPA86:
  • LOPA86 Those skilled in the art may refer to the article by Gabillet et al. for the synthesis of compounds SG6163F, LOPA87 and their analogues (Gabillet et al., J. Org. Chem. 2014, 79, p. 9894-9898).
  • the compound is chosen from compound VP331 and its analogues.
  • the analog of compound VP331 is a compound of formula (III): in which R is chosen from a C6-C14, in particular C6-C10, aryl group, more particularly a phenyl group; a halogen atom; C1-C6 alkyl; OH; C1-C6 alkoxyl; NH2; NO2, mono-(C1-C6)-alkylamino and di-(C1-C6)-alkylamino.
  • R is chosen from a C6-C14, in particular C6-C10, aryl group, more particularly a phenyl group; a halogen atom; C1-C6 alkyl; OH; C1-C6 alkoxyl; NH2; NO2, mono-(C1-C6)-alkylamino and di-(C1-C6)-alkylamino.
  • the compound used is minaprine or one of its pharmaceutically acceptable salts, more particularly minaprine dihydrochloride.
  • the compounds according to the invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts, in particular the salts of inorganic and organic acids.
  • inorganic acids include hydrochloric, hydrobromic, hydriodic, phosphoric acid, etc.
  • organic acids include formic, acetic, trichloroacetic, trifluoroacetic, propionic, benzoic, cinnamic, citric, fumaric, maleic, methanesulfonic acid, etc.
  • Other organic or inorganic acid addition salts include the pharmaceutically acceptable salts described in J. Pharm. Science. 1977, 66, 2, and in the "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" edited by P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth 2002.
  • the compounds used according to the present invention can be incorporated into a pharmaceutical composition, comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one compound according to the invention as described above, optionally in combination with another therapeutic active ingredient.
  • compositions according to the invention advantageously comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles. Mention may be made, for example, of saline, physiological, isotonic, buffered solutions, etc., compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions can contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, solvents, etc.
  • the compounds or compositions according to the invention can be administered in different ways and in different forms.
  • they can be administered by oral or systemic route, such as for example by intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal, intra-arterial, intracerebral route, etc.
  • the compounds are usually packaged as liquid suspensions, which can be injected by means of syringes or infusions, for example. It is understood that the flow rate and/or the dose injected can be adapted by those skilled in the art according to the patient, the pathology, the mode of administration, etc.
  • the compounds are administered at doses which can vary between 1 pg and 2 g/administration, preferentially from 0.1 mg to 1 g/administration.
  • the administrations can be daily or repeated several times a day, if necessary.
  • composition according to the invention may additionally comprise at least one other agent or therapeutic active principle.
  • the compounds according to the invention can be advantageously used in the treatment of a heart disease.
  • the heart disease can be myocardial infarction, ischemia-reperfusion or heart failure.
  • treatment or “treating”, according to the invention is meant an improvement, a prophylaxis of the disorder or disease, or of at least one of its symptoms. This includes the improvement or prevention of at least one measurable physical parameter of the disease to be treated, which is not necessarily discernible in the subject.
  • treatment or “treating” also refer to inhibiting or slowing the progression of the disease, or stabilizing one of the symptoms of the disease. It can also be a delay in the onset of at least one symptom of the disease.
  • the compounds of the invention are administered as a preventive measure.
  • the terms “treatment” or “treating” refer to reducing the risk of developing the disease.
  • the compounds according to the invention are particularly suitable for preventing the cardiototoxic effects of certain therapeutic strategies.
  • the invention therefore also relates to a compound according to the invention, for its use as a cardioprotector against the cardiotoxic side effects of a therapy administered to the patient, said therapy being capable of inducing said cardiotoxic effects.
  • the invention also relates to a compound according to the invention, for its use in a method for preventing the cardiotoxic effects of a treatment administered to a patient.
  • the compounds of the invention can in particular be used in a combined treatment, to advantageously exploit their cardioprotective properties.
  • a combined treatment comprises the administration of a compound according to the invention in combination with a therapeutic strategy aimed at treating a pathology with which the patient is suffering, said therapeutic strategy being capable of having cardiotoxic effects.
  • the compound according to the invention is administered to a patient suffering from cancer, to whom an anti-cancer treatment is administered.
  • anti-cancer treatment refers to a treatment used to slow the growth or destroy cancer cells.
  • Cancer treatment can be drug or non-drug.
  • medicinal anti-cancer treatments mention may be made in particular of chemotherapies and immunotherapies.
  • chemotherapy refers to a type of cancer treatment that uses one or more anti-cancer drugs ("chemotherapeutic agents"). Chemotherapy may be given with a curative intent or may be intended to prolong life or reduce the symptoms of a patient's cancer.
  • the chemotherapeutic agents are, for example, selected from anti-cancer alkylating agents, anti-cancer antimetabolites, anti-cancer antibiotics, anti-cancer agents derived from plants, anti-cancer platinum coordination compounds and any combination thereof.
  • chemotherapeutic agents that can be used in the context of the invention, the cardiotoxic effect of which can be advantageously prevented by means of the compounds of the invention, we can cite the anthracyclines, in particular doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, more particularly doxorubicin, tyrosine kinase inhibitors such as imatinib, taxanes (eg docetaxel, paclitaxel), anthracenediones (eg mitoxantrone (MTX), PARP inhibitors, anti-metabolites such as methotrexate and anti-HER2 such as trastuzumab.
  • anthracyclines in particular doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, more particularly doxorubicin, tyrosine kinase inhibitors such as imatinib, taxanes (eg docetaxel, paclitaxel
  • immunotherapy refers to a therapy aimed at inducing and/or improving an immune response towards a specific target, for example towards cancerous cells. Immunotherapy may involve the use of checkpoint inhibitors, checkpoint agonists (also called T cell agonists), IDO inhibitors, PI3K inhibitors, receptor blockers adenosine, inhibitors of adenosine-producing enzymes, adoptive transfer, therapeutic vaccines, and combinations thereof.
  • checkpoint inhibitors also called T cell agonists
  • IDO inhibitors also called T cell agonists
  • PI3K inhibitors receptor blockers adenosine, inhibitors of adenosine-producing enzymes, adoptive transfer, therapeutic vaccines, and combinations thereof.
  • the immunotherapeutic agents that can be used in the context of the invention, the cardiotoxic effect of which can advantageously be prevented by means of the compounds of the invention, we can cite the anti-PD-1 antibodies and the anti-CTLA-4 antibodies.
  • the immunotherapeutic treatment is a combination of an anti-PD-1 antibody
  • Radiotherapy can be cited, in a non-limiting manner, among the non-drug treatments.
  • radiation therapy refers to locoregional treatment of cancers using radiation, including x-rays, gamma rays, neutron radiation, electron beam, proton beam and radiation sources, to destroy cancer cells by blocking their ability to multiply.
  • Any form of radiotherapy can be used in the context of the present invention, in particular external radiotherapy, internal radiotherapy (or "brachytherapy"), radio-immunotherapy, or even metabolic radiotherapy involving administration by the oral route or by intravascular injection. (notably intravenously), of a radioactive substance which binds preferentially to cancerous cells to destroy them.
  • the compounds according to the invention are administered to any patient who will benefit or who is likely to benefit from their cardioprotective effect.
  • the patient can have cancer at any stage, including early non-invasive cancer or late-stage cancer that has already progressed to form metastases in the body.
  • cancer any form of cancer or tumors.
  • Non-limiting examples of cancers include brain cancer (eg, glioma), gastric cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, cancer of the non-small cell lung, small cell lung cancer, prostate cancer, colon cancer, non-Hodgkin's lymphoma, sarcoma, testicular cancer, acute non-lymphocytic leukemia and breast cancer.
  • the brain cancer is an astrocytoma, and more particularly glioblastoma multiforme;
  • the lung cancer is either small cell lung carcinoma or small cell lung carcinoma; and head and neck cancer is squamous cell carcinoma or adenocarcinoma.
  • the cancer is a pediatric cancer.
  • a pediatric cancer By way of illustration, mention may be made, among these pediatric cancers, of neuroblastomas, Ewing's cancer, osteosarcomas, medulloblastomas, rabdomyosarcomas and glioblastomas in children.
  • the compounds can be administered before, at the same time, or after the anti-cancer treatment.
  • the compound or the pharmaceutical composition according to the invention is more specifically for simultaneous, separate or sequential use or administration of the compound according to the invention and at least one other therapeutic agent or active principle or any other non-drug therapeutic strategy.
  • the invention also relates to a set of components comprising:
  • component (b) a chemotherapeutic or immunotherapeutic agent; wherein component (a) is used for its cardioprotective effect against the cardiotoxic side effects of component (b).
  • component (a) is chosen from SG6163F, LOPA87, VP331 and their analogues, more particularly from SG6163F, LOPA87 and their analogues, preferentially from SG6163F and LOPA87.
  • component (a) is the compound SG6163F.
  • the set of components according to the invention comprises in particular components (a) and (b) suitable for sequential, separate and/or simultaneous administration.
  • the set of components according to the invention can be used in the treatment of cancer, component (a) being used for its cardioprotective effect against the cardiotoxic side effects of component (b).
  • the invention relates to a method for screening compounds capable of possessing cardioprotective activity, said method comprising the following steps: a) culturing cardiac cells in a culture medium containing a test compound; b) culturing the heart cells in a culture medium containing a cell death inducer; and c) measuring cell viability.
  • the cells used are chosen from cardiac cells known to those skilled in the art, in particular from primary cardiac cells or cardiac cell lines.
  • the cardiac cells are rodent, in particular rat or mouse, more particularly rat, cells.
  • the cells are H9C2 cells.
  • the cells are cultured in a medium suitable for their culture. Mention may in particular be made of the DMEM medium supplemented with suitable additives. Among the additives that can be used, mention may be made of fetal calf serum, glutamine and antibiotics, in particular for the culture of H9C2 cells.
  • the culture medium is also supplemented with a test compound.
  • the culture medium containing the test compound does not contain fetal calf serum and/or antibiotic.
  • the culture medium containing the test compound does not contain fetal calf serum and does not contain any antibiotic.
  • test compound is meant a compound for which it is desired to determine whether it possesses cardioprotective activity. The test compound will be used at a concentration likely to make it possible to identify said activity. Of course, those skilled in the art may choose to use a concentration range during the method according to the invention to identify the activity of the compound and the effective concentration.
  • the cells are cultured in the presence of the test compound for a sufficient time to allow said test compound to act on the cells.
  • the culture of the cells in the presence of the test compound can be carried out for a time of between 1 minute and 24 hours, for example between 15 minutes and 10 hours, in particular between 1 hour and 3 hours, more particularly for 2 hours.
  • step b) the cells are cultured in a complete medium comprising serum and the antibiotics, which also comprises a cell death inducer.
  • the cell death inducer is introduced into the culture medium of step a).
  • the culture medium from step a) is replaced by a culture medium containing a cell death inducer and the test compound.
  • the culture medium of step a) is replaced by a culture medium containing a cell death inducer but not containing the test compound.
  • the cell death inducers mention may be made of apoptosis inducers or necrosis inducers.
  • camptothecin among the apoptosis inducers that can be used in the context of the method according to the invention.
  • Hydrogen peroxide (H202) can be used as a necrosis inducer.
  • the cells are cultured in the presence of the cell death inducer at a concentration and for a time suitable to allow the observation of cell death in the cells not treated with a test compound, and the observation of an absence or reduction in cell death in cells treated with a test compound found to have cardioprotective activity.
  • camptothecin can be used at a concentration of between 1 and 100 mM, in particular between 5 and 15 pM, more particularly 10 pM, for a period ranging from 10 h to 14 h, in particular 12 h to 36 h, more particularly 24 h.
  • hydrogen peroxide is used for 30 minutes to 5 h, more particularly for 1 h to 3 h, in particular for 2 h, at a concentration of between 100 and 600 pM, in particular between 200 and 400 pM, in particular of 300 ⁇ M.
  • Step c) is implemented to determine cell viability.
  • Techniques for determining cell viability are well known to those skilled in the art. Mention may in particular be made of the technique of staining with methylene blue, staining with propidium iodide, or else the test for the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the method according to the invention can advantageously be implemented to carry out high-throughput screening of several test compounds.
  • the cells can in particular be cultured in devices suitable for such high-throughput screening, in particular in multiwell plates, for example plates of at least 6 wells, at least 12 wells, at least 24 wells or at least 96 well.
  • the screening method according to the invention is implemented on a 96-well plate.
  • test compounds selected according to the screening method described above can then be tested for their ability to induce autophagy and/or metabolic reprogramming.
  • the evaluation of the capacity of the test compounds to induce autophagy can in particular be carried out according to the method described in the examples. Briefly, the steps of the screening method described above are implemented on cardiac cells in which the expression or the activity of proteins involved in the autophagy mechanism is inhibited. If the selected compounds are no longer able to inhibit cell death under these conditions, it can be concluded that their cardioprotective activity depends on an induction of autophagy.
  • the inhibition of the expression or the activity of proteins involved in the autophagy mechanism can be carried out by any means known in the art, in particular by transfection of an inhibitory nucleic acid, in particular an siRNA, targeting the mRNA encoding one or more proteins involved in the autophagy mechanism. Mention may in particular be made of the inhibition of the Atg5 protein or of the Beclin-1 protein, in particular by inhibition of their expression.
  • the method includes inhibiting Atg5 and Beclin-1.
  • the method comprises the inhibition of the expression of Atg5 and of Beclin-1.
  • the method comprises the inhibition of Atg5 and Beclin-1 by siRNA transfection.
  • the ability of compounds to induce autophagy can also be assessed by measuring the conversation of LC3 I and II in cells treated with the test compound selected using the screening method according to the invention.
  • An increase in the conversion of LC3 I to LC3 II shows an induction of autophagy.
  • the ability of the compounds selected to induce the formation of the autophagosome can be determined in order to evaluate the ability of said compounds to induce autophagy.
  • the ability of the selected compounds to reprogram energy metabolism can be determined by techniques known to those skilled in the art. It may thus be envisaged in particular to evaluate the capacity of the compounds selected to raise the local level of reactive oxygen species in cardiac cells treated with the compound selected following the screening according to the invention.
  • a person skilled in the art can advantageously use techniques for detecting the level of anion superoxide, in particular those based on the use of the fluorescent probe MitoSOX in confocal microscopy.
  • the energy metabolism can also be analyzed in real time, in particular by measuring the oxygen consumption proportional to mitochondrial respiration and measuring the production and secretion of protons in the culture medium proportional to glycolysis.
  • Those skilled in the art have methods allowing such an analysis, in particular by means of the Seahorse technology used in the part used below and the measurement of the two ATR synthesis routes set out above and called: oxygen consumption rate (OCR ) and extracellular acidification rate (ECAR). These two parameters can be dynamically determined in the cells after sequential treatment with reference inhibitors of mitochondrial respiratory chain complexes (eg rotenone, antimycin, oligomycin).
  • the absence of toxic effects of the selected compounds can also be assessed.
  • the absence of proliferative effects can be evaluated according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the cardioprotective capacities of the compounds selected by means of the screening method according to the invention can also be verified in animals.
  • test compounds can be compared with compounds whose cardioprotective effects and the properties of inducing autophagy and metabolic reprogramming are already known.
  • the person skilled in the art can advantageously use one or more compounds chosen from SG6163F, VP331, LOPA87 and their analogs as a reference in the screening method of the invention.
  • FIG. 1 High-throughput screening of cardiac cell death inhibitors for hit identification.
  • Figure 1A shows a flowchart of the screening.
  • Figure 1B shows the ranking of the hits on the percentage of survival revealed by labeling with methylene blue.
  • the molecules were used at 10 mM as a pretreatment before induction of cell death.
  • Figure 1C shows the confirmation of the top 6 hits on H9C2 cell viability as measured by an LDH release assay.
  • FIG. 1 Cellular effects of hits on primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes (RNVC) and the lung cancer cell line (A549).
  • RNVC primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes
  • A549 lung cancer cell line
  • Figure 2A shows that hits protect RNVC viability against 300 pM H2O2.
  • Figure 2B shows that hits protect RNVC viability against 10 pM camptothecin.
  • Figure 2C shows the influence of hits on the viability of H9C2 cells.
  • the cells were cultured in the presence of the hits at 10 pM for 48 h. Finally, cells were lysed in lysis buffer and the amount of LDH was measured to assess total cell growth.
  • Figure 2D shows the influence of hits on the viability of A549 cancer cells.
  • the cells were cultured for 6 h in the presence or in the absence of the hits, then for 42 h. Finally, cells were lysed with lysis buffer and the amount of LDH was measured to assess total cell growth.
  • Protein expression levels of BCL-2 (Fig. 3A and Fig. 3B), BXL-XL (Fig. 3C) and BAX (Fig. 3C), in RNVCs after 6h of treatment (Fig. 3A, Fig. 3C, Fig. 3D) or 24h (Fig. 3B). Co., control of untreated cells. Each experiment was replicated at least three times. Representative Western-blot images and quantification of three independent experiments are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, with multiple Sidak comparisons. * , p ⁇ 0.05 vs. DMSO.
  • Figure 4A Inhibition of RNVC cell death by hits requires Atg5 and Beclin-1
  • Figure 4A RNVCs were transfected with siRNAs targeting Atg5 and Beclin-1 and the expression levels of both proteins were assessed by Western blot.
  • FIG. 4B and Figure 4C After transfection of siRNA Atg5 and Beclin-1 respectively, LDFI release was measured in RNVCs treated with 300 mM FI2O2, 2h. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. ns., not significant compared to the cells treated with FI2O2 and transfected with the siRNAs.
  • FIG. 4D After transfection of the GFP-LC3 plasmid, GFP-LC3 green fluorescent dots were visualized by fluorescence microscopy and quantified with Image J to monitor autophagosome formation. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. *** , p ⁇ 0.001 vs. 0.01% DMSO.
  • Figure 4E Protein levels of LC3-I/II in RNVCs. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01 vs. DMSO.
  • Figure 5A LC3-I/Il and p62 protein levels in RNVCs treated with 3-methyladenine (3MA), chloroquine (CQ), and SG6163F for 6 h. 3 mM rapamycin was used as a positive control. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, ns., not significant.
  • Figure 5B After treatment with SG6163F, rapamycin, 3-methyl adenine (MA), chloroquine (CQ), GFP-LC3 green fluorescent dots were visualized by fluorescence microscopy and quantified with Image J. Data are shown as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons, * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01. The experiments were replicated three times.
  • FIG. 6A Effects on mitochondrial dynamics by fluorescence microscopy RNVCs were treated with 1 mM (Figure 6A) and 10 pM (Figure 6B) hits for 6 h and the mitochondrial network was labeled with 200 nM Mitotracker. The mitochondrial network and individual mitochondria were then analyzed using the Leica confocal microscope and IMARIS software. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO.
  • Figure 6C MFN1 and MFN2 protein levels in RNVC analyzed by western-blot.
  • Figure 6D Drp-1 and p-Drp-1 protein levels in RNVCs analyzed by western-blot. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO. The experiments were replicated 3 times. Representative Western-blot images and quantification of three independent experiments are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons.
  • Cells were treated with vehicle (0.01% DMSO), 1 mM digoxin, 1 ⁇ M SG6163F, 10 ⁇ M SG6163F, fixed with glutaraldehyde and analyzed by transmission electron microscopy.
  • Cells treated with digoxin and 10 ⁇ M SG6163F show many shorter round mitochondria compared to the control which shows long and thin mitochondria ( Figure 7B, Figure 7D versus Figure 7A).
  • Treatment with 1 ⁇ M SG6163F did not affect mitochondrial morphology (Figure 7D versus Figure 7C).
  • the right inset in Figure 7D shows a mitochondrial fission figure.
  • Figure 8A H9c2 cells were treated with the compounds for 6 h, then glycolytic function was measured by glycolytic stress assay on XFe96 extracellular flux analyzer (Agilent, USA), data are presented as average ⁇ SEM with one-way ANOVA, and multiple comparisons from Sidak test. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO.
  • FIG. 8B FI9c2 cells were treated with the compounds for 6 h, then a mitochondrial respiration stress test was performed.
  • Figure 8C Exogenous fatty acid oxidation was measured simultaneously using the XF Palmitate-BSA FAO substrate kit with the XF cell mito stress assay. Before starting the assay, 30 ⁇ L of XF Palmitate-BSA FAO substrate or BSA control was added to the appropriate wells.
  • Figure 8D AMPK alpha2 and phospho-AMPK protein levels in RNVCs. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO.
  • FIG. 10 Cellular effects of analogous compounds on RNVCs.
  • the protection of RNVC cells against FI2O2 by analog compounds of SG6163F and LOPA87 was measured by an LDFI release assay and an absorbance measurement at 490 nm.
  • Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO.
  • Figure 11 Effects of compounds on total cell volume.
  • Figure 11 Following treatment of the RNVCs with the compounds as indicated, the cell volume is labeled with 4 mM calcein-AM. Cell volume was then analyzed using IMARIS software. Figure 12. Effects of compounds on mitochondrial ROS production.
  • Figure 12 RNVCs were treated with 0.1% DMSO, 3 mM rapamycin, 1 ⁇ M digitoxigenin, 1 ⁇ M digoxin, 1 ⁇ M minaprin, 1 ⁇ M VP331, 1 ⁇ M LOPA87, 10 ⁇ M SG6163F for 6 h, then ROS production was labeled with the MitoSOX fluorescent probe.
  • Figure 12A Fluorescence was captured with a Leica confocal microscope.
  • Figure 12B Quantification of mitochondrial fluorescence intensity was performed with Image J software. Data are presented as mean ⁇ SEM with one-way ANOVA, and Sidak's multiple comparisons. * , p ⁇ 0.05, ** , p ⁇ 0.01, *** , p ⁇ 0.001 vs. DMSO.
  • the compounds were obtained from two chemical libraries: the Prestwick library (1,200 molecules) and the CEA Saclay library (400 molecules). All compounds were supplied at 10 mM in 100% DMSO.
  • H9C2 cells were cultured in DMEM medium (ATCC® 30-2002TM) supplemented with 10% fetal bovine serum (BSA; BioWhittaker DE14-801 F) and penicillin-streptomycin (Gibco® #15070063). H9C2 cells were seeded in 96-well plates (5000 cells/well), adhered for 48 hours (h), and treated with 10 mM library compounds for 2 h at 37°C. were eliminated and replaced by a cell death inducer: treatment for 24 h with 10 ⁇ M camptothecin (Sigma C9911) for apoptosis or treatment for 2 h with 300 ⁇ M H2O2 (Sigma 216763) for necrosis.
  • BSA fetal bovine serum
  • Gibco® #15070063 penicillin-streptomycin
  • Neonatal rat cardiomyocytes were isolated as previously described (Wang et al., Cell Death Dis, 2016, 7:e2198).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • RNVC rat neonatal ventricular myocytes
  • LB lysis buffer
  • Propidium iodide a non-permeable fluorescent DNA marker, was used to measure membrane integrity. 10 mM propidium iodide was added to the culture medium and a fluorescence reading was taken (ex: 530 nm; em: 620 nm), LB was used as a positive control for total cell lysis .
  • RNVCs were treated with 0.01% DMSO, 3 mM rapamycin, 1 mM digitoxigenin, 1 mM digoxin, 1 mM minaprine, 1 mM VP331, 1 mM LOPA87, 10 mM SG6163F in medium cell culture without serum for 6 hours.
  • MitoSOXTM (ThermoFisher, M36008) was dissolved in 13 ⁇ L of dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a stock solution of 5 mM MitoSOXTM reagent. Next, the 5 mM MitoSOXTM Reagent stock solution in PBS was diluted to prepare a 5 ⁇ M MitoSOXTM Reagent working solution. After treatment, cells were rinsed 2 times with warm PBS, then incubated with MitoSOX reagent working solution for 10 minutes at 37°C. Cells were gently rinsed three times with warm PBS. The red fluorescence was detected under the Leica confocal microscope. Nuclear fluorescence was suppressed and mitochondrial fluorescence intensity was measured using ImageJ software.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the XFe96 extracellular flux analyzer (Seahorse Biosciences, North Billerica, MA, USA) was used to measure the bioenergetic function of FI9C2 cardiomyocytes.
  • FI9C2 cells were seeded at 20,000 cells per well in XF96 cell culture microplates, all pretreatments were performed with serum-free cell culture medium.
  • the Agilent Seahorse XF glycolysis stress assay was performed to measure glycolytic function in FI9C2 cells, extracellular acidification rate (ECAR) was measured sequentially by 3 injections, 10 mM glucose, 2 pM oligomycin and 50 mM 2-deoxy-D-glucose
  • the Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test measured key parameters of mitochondrial function by directly measuring the oxygen consumption rate (OCR) of FI9C2 cells.
  • OCR oxygen consumption rate
  • the assay utilized the built-in injection ports on the XF sensor cartridges to add respiration modulators into the cell well during the assay to reveal key parameters of mitochondrial function.
  • 2 ⁇ M oligomycin was injected first after basal measurements. Then 1 mM carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) was injected. The third injection corresponds to 0.5 mM of antimycin A, to stop mitochondrial respiration.
  • the oxidation of exogenous fatty acids has been measured simultaneously using the XF Palmitate-BSA FAO Substrate Kit with the XF Cell Mitochondrial Stress Assay.
  • the substrate-limited medium is DMEM with 0.5 mM glucose, 1 mM GlutaMAX, 0.5 mM carnitine and 1% fetal bovine serum. Carnitine was added fresh on the day of medium change.
  • FAO test medium contains 111 mM NaCl, 4.7 mM KOI, 1.25 mM CaC, 2 mM MgSO4, 1.2 mM NaFl2PO4, supplemented with 2.5 mM glucose, 0.5 mM carnitine and 5 mM FIEPES on the day of the test, adjusted to pH 7.4 at 37°C.
  • FI9C2 cells were seeded at 20,000 cells per well in XF96 cell culture microplates. All pretreatments were performed with serum-free cell culture medium. 24 hours prior to assay, the growth medium was replaced with substrate-limited medium. 45 min before assay, cells were washed twice with FAO assay medium, 150 ⁇ L/well FAO assay medium was added to the cells.
  • XF Cell Mito Stress Test compounds final concentrations: 2 mM oligomycin, 1 ⁇ M FCCP, 0.5 ⁇ M antimycin A).
  • 30 ⁇ L of XF Palmitate-BSA FAO or BSA substrate was added to the appropriate wells, then the XF cell culture microplate was immediately inserted into the XFe96 analyzer for analysis.
  • FI9C2 cells and RNVCs were detached in LB containing: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% deoxycholate, 1% Triton X 100, 0.1% SDS (pH 8.0) .
  • Cells were collected and placed on ice for 30 minutes. Then the cells were centrifuged at 2000 g for 20 minutes at 4°C. The supernatant was transferred to a new tube and stored on ice. Protein concentration was determined by BCA assay. Protein samples were diluted with sample buffer (2x Laemmli, Sigma), mixed, and heated for 5 minutes at 95 0 C. Then the samples were loaded into a 4–20% gradient precast gel and migrated for 15 minutes at 300 V.
  • the membrane and the gel were placed on the base of a Trans Blot Turbo cassette (Bio Rad) and the proteins were transferred for 3 minutes at 2.5 V. After transfer, the membrane was blocked with 5% milk in PBS-Tween and incubated with primary antibody diluted in PBS-Tween at 5% w/v milk at 4°C under gentle agitation, overnight. The following day, the membrane was washed with PBS-Tween for 6 x 5 min and incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody for 1 h at room temperature. The membrane was washed again with PBS-Tween for 6 x 5 minutes after the secondary antibody.
  • the membrane was incubated with an improved ultra-sensitive chemiluminescent substrate for 5 minutes. Images were recorded with a gel imaging system (Bio Rad).
  • the following antibodies were used: anti-Mitofusin 1 (ab126575, Abcam, USA), anti-Mitofusin 2 (ab124773, Abcam, USA), BCL-2 (C-2) ( sc-7382, Santa Cruz, USA), BAX (B-9) (sc-7480, Santa Cruz, USA), BCL-XL (#2764, Cell Signaling, USA), AMPK alpha2 (# 2757, Cell Signaling, USA), LC3B (D11) (#3868, Cell Signaling, USA), b-Actin (C4) (sc-47778, Santa Cruz, USA), phospho-DRP1 (Ser616 ) (D9A1) (#4494, Cell Signaling, USA), DLP1 (#611112, BD Biosciences, USA).
  • results are expressed as mean ⁇ standard error of the mean (sem). Origin software and Graphpad Prism 6 were used for statistical analysis. The differences between 2 groups were analyzed by one-way ANOVA and the differences between the groups of two genotypes were analyzed by two-way ANOVA, with Sidak multiple comparisons. Statistical significance is indicated as follows: * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001, **** P ⁇ 0.0001. The number of cells and independent experiments performed are indicated in the figure legends.
  • H9C2 cardiomyoblasts were pretreated with the compounds at 10 mM for 2 h with 0.01% DMSO as vehicle, washed and incubated with a cell death inducer (ie H2O2 or camptothecin) for the indicated period (Figure 1A). Then, the percentage of viable cells was assessed by methylene blue staining, and the hits were ranked according to their effectiveness in protecting against cell death, revealing 21 statistically significant hits (Figure 1B).
  • VP331, LOPA87, and minaprine had no effect on mitochondrial network and mitochondrial number except for 10 pM minaprine and 3 pM rapamycin, which decreased mitochondrial mass ( Figures 6A,B). Accordingly, digitoxigenin and digoxin decreased expression of the fusion proteins, MFN1 and MNF2 ( Figure 6C) and digoxin and SG 6163F stimulated fission through phosphorylation of Drp-1 at Ser616 as shown by measuring the ratio (DRP1-P)/(DRP-1 total) by western-blot ( Figure 6D).
  • ROS are produced or accumulated as a metabolic by-product of mitochondrial activity.
  • ROS may be a consequence of mitochondrial function or reflect a defect in the mitochondrial antioxidant system.
  • anion superoxide labeling in RVNCs by the fluorescent probe MitoSOX after cell treatment with the compounds for 6h we were able to show that rapamycin, digitoxigenin, VP331, LOPA87 and Minaprine induced an elevation of the level local mitochondrial anion superoxide, but not digoxin and SG6163F ( Figure 12).
  • SG6163F was found to boost OXPHOS although rapamycin decreased it, independent of substrates as expected (Schieke et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281(37):27643-27652) (Figs 8B,C).
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • the identified molecules can be used in combination with chemotherapy or radiotherapy, in particular, to protect heart cells and reduce the side effects of anti-cancer treatments.

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Abstract

L'invention concerne des composés capables d'induire une autophagie et la reprogrammation métabolique et leur utilisation en tant que cardioprotecteurs, notamment dans le cadre d'une thérapie anti-cancéreuse.

Description

CARDIOPROTECTION PAR INDUCTION D'AUTOPHAGIE ET REPROGRAMMATION METABOLIQUE
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne des composés capables d'induire l’autophagie et la reprogrammation métabolique et leur utilisation en tant que cardioprotecteurs, notamment dans le cadre d'une thérapie anti-cancéreuse.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Malgré les progrès récents des stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses (e.g. radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie), ces dernières sont associées à un risque élevé de complications cardiaques, notamment d'insuffisance cardiaque ou de cardiomyopathies chez de nombreux patients survivants, résultant en une morbidité et mortalité cardiovasculaires accrues. Par ailleurs, le vieillissement général de la population s'accompagne d'une augmentation du nombre de maladies cardiaques impliquant un excès de mort cellulaire, notamment d'infarctus du myocarde, d'ischémie-reperfusion et d'insuffisance cardiaque. Afin de prévenir la cardiotoxicité, une stratégie combinant une thérapie anti-cancéreuse à des molécules possédant une activité cardioprotectrice a été développée. Ainsi, la FDA (Food and Drug Administration; agence du médicament des Etats Unis d'Amérique) a autorisé l'administration de la dexrazoxane, un antioxydant, à des patients pour contrecarrer les effets des stratégies anti-cancéreuses. Il a toutefois été observé depuis que l'emploi de dexrazoxane dans ce contexte est associé à un taux plus élevé de néoplasmes malins secondaires (Shaikh et al., J Natl Cancer Inst, 2016, 108(4)). Il existe donc toujours un besoin urgent de molécules capables de prévenir la cardiotoxicité à long terme.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point un test de criblage à haut débit pour identifier des inhibiteurs des principales modalités de mort cellulaire cardiaque, c'est-à-dire la nécrose induite par H2O2 et l'apoptose induite par la camptothécine parmi des banques chimiques composées de 1600 molécules sur une lignée de cardiomyoblastes H9C2. Ce test a ainsi permis d'identifier des molécules cardioprotectrices capables de compenser les effets cardiotoxiques des stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses. Les inventeurs ont pu montrer que les molécules identifiées dans le cadre de la présente invention agissent en inhibant la mort des cardiomyocytes par l'induction d'autophagie et une reprogrammation métabolique résultant en une inhibition des phénomènes d'apoptose et de nécrose. Les molécules identifiées peuvent notamment être utilisées en combinaison avec la chimiothérapie ou la radiothérapie pour protéger les cellules cardiaques et diminuer les effets secondaires des traitements anti cancéreux.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne de telles molécules cardioprotectrices capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique, pour leur utilisation dans la prévention des effets secondaires cardiaques d'un traitement anti-cancéreux.
L'invention concerne plus particulièrement un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, pour leur utilisation en tant que cardioprotecteur. Selon un mode de réalisation, le composé est choisi parmi SG6163F, LOPA87, et leurs analogues, plus particulièrement parmi SG6163F et LOPA87.
Selon un mode de réalisation, le composé est utilisé dans le traitement d'une maladie cardiaque choisie parmi l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.
Selon un autre mode de réalisation, le composé est utilisé dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques, notamment une thérapie anticancéreuse. L'invention concerne notamment un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, combiné à un agent thérapeutique tel qu'un agent anticancéreux, pour son utilisation dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie, telle qu'une thérapie contre le cancer, induisant des effets secondaires cardiotoxiques. Selon un mode particulier de réalisation, le composé peut être administré avant, pendant ou après la thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et
(b) un agent thérapeutique utile pour traiter un patient, ledit agent induisant toutefois des effets secondaires cardiotoxiques; dans lequel le composant (a) est destiné à être utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Selon un mode particulier de réalisation, les composants (a) et (b) sont appropriés à une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée.
Selon un autre aspect, l'ensemble selon l'invention est utilisé dans le cadre du traitement d'un cancer, le composant (b) étant un agent anticancéreux chimiothérapeutique ou immunothérapeutique, et le composant (a) étant utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de criblage de composés possédant une activité cardioprotectrice, ou susceptibles de posséder une activité cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes: a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé test; b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire; et c) la mesure de la viabilité des cellules.
DESCRIPTION DETAILLEE
Selon l'invention, les composés utilisés sont des composés capables d'induire une autophagie, une reprogrammation métabolique et d'inhiber la mort des cardiomyocytes par inhibition des phénomènes d'apoptose et de nécrose. Les inventeurs ont pu démontrer que de tels composés sont cardioprotecteurs, sans effet d’induction de prolifération de cellules cancéreuses.
Composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique et utilisation en tant que cardioprotecteur
L'invention concerne donc un composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur. L'invention concerne plus particulièrement un composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique et d'inhiber la mort des cardiomocytes par inhibition de l'apoptose et/ou de la nécrose, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur.
L'autophagie joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire. Il s'agit d'un processus catabolique conservé dans l'évolution qui implique la dégradation des composants cytoplasmiques endommagés. Les inventeurs ont pu démontrer que ce mécanisme d'autophagie peut être avantageusement mis à contribution pour prévenir les effets cardiotoxiques, notamment les effets cardiotoxiques induits par des traitements anti-cancéreux.
L'homme du métier connaît bien le mécanisme d'autophagie et les moyens lui permettant d'identifier des composés capables d'induire ce mécanisme. Par ailleurs, il pourra utiliser le procédé présenté dans la partie expérimentale de la présente demande pour identifier d'autres composés possédant de telles propriétés.
Selon un mode particulier de réalisation, le composé capable d'induire une autophagie est un composé choisi parmi la digitoxigénine, la digoxine, la minaprine, SG6163F, VP331 et LOPA87, et leurs analogues. La capacité de ces composés à induire une autophagie dans les cellules cardiaques et une reprogrammation métabolique par modulation de la glycolyse et de la respiration mitochondriale impliquant un effet sur le réseau mitochondrial n'avait jamais été rapportée dans l'état de la technique. Ces propriétés nouvellement identifiées dans le cadre de la présente invention peuvent avantageusement être mise en œuvre afin d'induire un effet cardioprotecteur chez des patients nécessitant une telle cardioprotection. Les formules des composés digitoxigénine, la digoxine, la minaprine, SG6163F, VP331 et LOPA87 sont rappelées ci-dessous:
- digitoxigénine: SG6163F:
De préférence, le composé est choisi parmi les composés SG6163F, VP331 et LOPA87, et leurs analogues. De manière plus préférée, le composé est choisi parmi les composés SG6163F, LOPA87 et leurs analogues. Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé SG6163F est un composé de formule (I):
( dans laquelle:
Ar est un groupement aryle en C6-14 ou un groupement hétéroaryle en C5-C10, ledit groupement aryle ou hétéroaryle étant éventuellement substitué par 1 à 5 groupements choisis parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-C6)-alkylamino et les groupements di- (C1-C6)-alkylamino; et
R est choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement N02, les groupements mono-(C1-C6)-alkylamino et les groupements di-(C1-C6)- alkylamino.
Selon un mode particulier de réalisation, le groupement Ar est un groupement aryle en C6-C10. Selon un autre mode particulier de réalisation, le groupement aryle en C6-
C10 est choisi parmi les groupements phényle, fluorényle, anthracényle ou naphtyle. Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement aryle non substitué, notamment un groupement phényle ou naphtyle non substitué, plus particulièrement un groupement phényle non substitué. Selon une variante de réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par 1 à 5 groupements tels que définis ci-dessus. Selon un autre mode réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6- C14, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-C6)- alkylamino et les groupements di-(C1-C6)-alkylamino. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, notamment phényle, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6 et les groupements alcoxyle en C1-C6. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, notamment phényle, les atomes d'halogène et les groupements alcoxyle en C1-C6. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement phényle monosubstitué par un groupement phényle, un atome d'halogène, notamment un atome de fluor, ou un groupement méthoxyle. Selon une variante, Ar est un groupement naphtyle monosubstitué par un atome d'halogène ou un groupement méthoxyle. Selon une variante, Ar est un groupement naphtyle monosubstitué par un groupement méthoxyle.
Selon un mode particulier de réalisation, le groupement Ar est un groupement hétéroaryle en C5-C10. Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle non substitué. Selon une variante de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle substitué par 1 à 5 groupements tels que définis ci-dessus. Selon un autre mode réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-C6)-alkylamino et les groupements di- (C1-C6)-alkylamino. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6 et les groupements alcoxyle en C1-C6. Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement alkyle en C1-C6. Selon une variante, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement méthyle.
Selon un autre mode de réalisation, R est choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, les groupements alcoxyle en C1-C6 et le groupement N02. Selon un mode particulier de réalisation, R est choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alcoxyle en C1-C6 et le groupement N02. De manière plus particulière, R est choisi parmi les atomes d'halogène, plus particulièrement l'atome de chlore, le groupement méthoxyle et le groupement N02.
Parmi les analogues spécifiques du composé SG6163F utilisables dans le cadre de la présente invention, nous pouvons citer les composés SG6144, SG6146, SG6149, LOPA90, LOPA93, LOPA99, LOPA101, LOPA104, LOPA105 et LOPA106:
- SG6144:
- LOPA90:
- LOPA93:
- LOPA101 :
- LOPA106:
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé LOPA87 est un composé de formule (II): dans laquelle:
R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis parmi les groupements suivants: atome d'hydrogène, atome d'halogène, aryle en C6-C14, alkyle en C1 -C6, hydroxyle, alcoxyle en C1-C6, NH2, NO2, mono-(C1-C6)-alkylamino et di-(C1-C6)-alkylamino.
Selon un mode particulier de réalisation, dans le composé de formule (II), R1 est choisi parmi l'hydrogène et un atome d'halogène. Selon un mode particulier de réalisation, dans le composé de formule (ll),R1 est un atome d'hydrogène. Selon un autre mode de réalisation, dans le composé de formule (II), R2 est un aryle en C6-C14, plus particulièrement un groupement phényle.
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé LOPA87 est le composé LOPA86: L'homme du métier pourra se référer à l'article de Gabillet et al. pour la synthèse de des composés SG6163F, LOPA87 et leurs analogues (Gabillet et al., J. Org. Chem. 2014, 79, p. 9894-9898).
Dans un mode particulier de réalisation, le composé est choisi parmi le composé VP331 et ses analogues.
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé VP331 est un composé de formule (III): dans laquelle R est choisi parmi un groupement aryle en C6-C14, notamment en C6- C10, plus particulièrement un groupement phényle; un atome d'halogène; un alkyle en C1 -C6; OH; un alcoxyle en C1 -C6; NH2; NO2, mono-(C1 -C6)-alkylamino et di-(C1 -C6)- alkylamino.
L'homme du métier pourra se référer aux demandes de brevets EP3476389 et EP3095688 pour la synthèse du composé VP331 et ses analogues. Dans un autre mode particulier de réalisation, le composé utilisé est la minaprine ou l'un de ses sels acceptables sur le plan pharmaceutique, plus particulièrement le dichlorhydrate de minaprine.
Les composés selon l’invention peuvent être utilisés sous forme de sels acceptables sur le plan pharmaceutique, en particulier les sels d’acides inorganiques et organiques. Des exemples représentatifs d’acides inorganiques incluent l’acide chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, phosphorique, etc. Des exemples représentatifs d’acides organiques incluent l’acide formique, acétique, trichloroacétique, trifluoroacétique, propionique, benzoïque, cinnamique, citrique, fumarique, maléique, méthanesulfonique, etc. D’autres sels d’addition d’acide organique ou inorganique incluent les sels pharmaceutiquement acceptables décrits dans J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2, et dans le "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Sélection, and Use" édité par P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth 2002.
Les composés utilisés selon la présente invention peuvent être incorporés dans une composition pharmaceutique, comprenant dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique au moins un composé selon l’invention tel que décrit ci-dessus, éventuellement en association avec un autre actif thérapeutique.
Par l'expression "support acceptable sur le plan pharmaceutique", on entend tout support (par exemple excipient, substance, solvant, etc.) qui n’interfère pas avec l’efficacité de l’activité biologique du ou des actifs thérapeutiques présents dans la composition pharmaceutique et qui n’est pas toxique pour le patient à qui la composition est administrée. Les compositions pharmaceutiques selon l’invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l’homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, solvants, etc.
Les composés ou compositions selon l’invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être administrés par voie orale ou systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra musculaire, sous-cutanée, transdermique, intra-artérielle, intracérébrale, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l’homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d’administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 1 pg et 2 g/administration, préférentiellement de 0,1 mg à 1 g/administration. Les administrations peuvent être quotidiennes ou répétées plusieurs fois par jour, le cas échéant.
D’autre part, la composition selon l’invention peut comprendre, en outre, au moins un autre agent ou principe actif thérapeutique.
Les composés selon l'invention, grâce à leur activité cardioprotectrice, peuvent être avantageusement utilisés dans le traitement d'une maladie cardiaque. En particulier, la maladie cardiaque peut être l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.
Par "traitement" ou "traiter", on entend selon l’invention une amélioration, une prophylaxie du désordre ou de la maladie, ou d'au moins un de ses symptômes. Ceci inclut l’amélioration ou la prévention d’au moins un paramètre physique mesurable de la maladie à traiter, qui n’est pas nécessairement discernable chez le sujet. Les termes "traitement" ou "traiter" se réfèrent également à l’inhibition ou au ralentissement de la progression de la maladie, ou la stabilisation d’un des symptômes de la maladie. Il peut s’agir aussi du retard du déclenchement d’au moins un symptôme de la maladie. Selon certains modes, les composés de l’invention sont administrés par mesure préventive. Dans ce contexte, les termes “traitement” ou “traiter” se réfèrent à la réduction du risque de développer la maladie.
Les composés selon l'invention sont particulièrement adaptés à la prévention des effets cardiototoxiques de certaines stratégies thérapeutiques. L'invention vise donc également un composé selon l'invention, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie administrée au patient, ladite thérapie étant susceptible d'induire lesdits effets cardiotoxiques. L'invention vise également un composé selon l'invention, pour son utilisation dans une méthode de prévention des effets cardiotoxiques d'un traitement administré à un patient. Ainsi, avantageusement, les composés de l'invention peuvent notamment être utilisés dans un traitement combiné, pour exploiter de manière avantageuse leurs propriétés cardioprotectrices. Un traitement combiné comprend l'administration d'un composé selon l'invention en combinaison avec une stratégie thérapeutique visant le traitement d'une pathologie dont le patient est atteint, ladite stratégie thérapeutique étant susceptible d'avoir des effets cardiotoxiques. Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention est administré à un patient souffrant d'un cancer, auquel est administré un traitement anti-cancéreux.
Selon la présente invention, l'expression "traitement anti-cancéreux", ou ses déclinaisons, vise un traitement utilisé pour ralentir la croissance ou détruire des cellules cancéreuses. Le traitement anti-cancéreux peut être médicamenteux ou non- médicamenteux. Parmi les traitements anti-cancéreux médicamenteux, peuvent être cités notamment les chimiothérapies et immunothérapies.
Le terme "chimiothérapie" fait référence à un type de traitement du cancer qui utilise un ou plusieurs médicaments anti-cancéreux ("agents chimiothérapeutiques"). La chimiothérapie peut être administrée avec une visée curative ou peut être destinée à prolonger la vie ou réduire les symptômes d'un cancer dont est atteint le patient. Les agents chimiothérapeutiques sont par exemple sélectionnés parmi des agents d'alkylation anti-cancéreux, des anti-métabolites anti-cancéreux, des antibiotiques anti-cancéreux, des agents anti-cancéreux dérivés de plantes, des composés de coordination du platine anti-cancéreux et toute combinaison de ceux-ci. Parmi les agents chimiothérapeutiques utilisables dans le cadre de l'invention, dont l'effet cardiotoxique peut être avantageusement prévenus au moyen des composés de l'invention, nous pouvons citer les anthracyclines, notamment la doxorubicine, la daunorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, plus particulièrement la doxorubicine, les inhibiteurs de tyrosine kinase tels l’imatinib, les taxanes (ex : docetaxel, paclitaxel), les anthracenediones (ex: mitoxantrone (MTX), les inhibiteurs de PARP , les anti métabolites comme le méthotrexate et les anti-HER2 comme le trastuzumab. Le terme "immunothérapie" fait référence à une thérapie visant à induire et/ou améliorer une réponse immunitaire envers une cible spécifique, par exemple envers des cellules cancéreuses. L’immunothérapie peut impliquer l’utilisation d'inhibiteurs de points de contrôle, d’agonistes de points de contrôle (également dénommés agonistes des lymphocytes T), d’inhibiteurs d’IDO, d’inhibiteurs de PI3K, d’inhibiteurs des récepteurs de l'adénosine, d’inhibiteurs des enzymes produisant l’adénosine, d'un transfert adoptif, de vaccins thérapeutiques, et de combinaisons de ceux-ci. Parmi les agents immunothérapeutiques utilisables dans le cadre de l'invention, dont l'effet cardiotoxique peut être avantageusement prévenu au moyen des composés de l'invention, nous pouvons citer les anticorps anti-PD-1 et les anticorps anti-CTLA-4. Selon un mode particulier de réalisation, le traitement immunothérapeutique est une combinaison d'un anticorps anti-PD-1 et d'un anticorps anti-CTLA-4.
La radiothérapie peut être citée, de manière non-limitative, parmi les traitements non- médicamenteux. L'expression "radiothérapie" se réfère à un traitement locorégional des cancers utilisant des radiations, notamment les rayons X, les rayons gamma, un rayonnement de neutrons, un faisceau d'électrons, un faisceau de protons et des sources de rayonnement, pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se multiplier. Toute forme de radiothérapie est utilisable dans le cadre de la présente invention, notamment la radiothérapie externe, la radiothérapie interne (ou "curiethérapie"), la radio-immunothérapie, ou encore la radiothérapie métabolique impliquant l'administration par voie orale ou par injection intravasculaire (notamment intraveineuse), d'une substance radioactive qui se fixe préférentiellement sur les cellules cancéreuses pour les détruire.
Les composés selon l'invention sont administrés à tout patient qui bénéficiera ou qui est susceptible de bénéficier de leur effet cardioprotecteur. Le patient peut souffrir d'un cancer de n'importe quel stade, notamment un cancer non invasif précoce ou un cancer à un stade tardif qui a déjà progressé pour former des métastases dans le corps.
Par le terme "cancer", on entend toute forme de cancer ou de tumeurs. Des exemples non limitatifs de cancers comprennent le cancer du cerveau (par exemple, le gliome), le cancer gastrique, le cancer de la tête et du cou, le cancer du pancréas, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du poumon à petites cellules, le cancer de la prostate, le cancer du côlon, le lymphome non hodgkinien, le sarcome, le cancer du testicule, la leucémie non lymphocytaire aiguë et le cancer du sein. Dans un mode de réalisation particulier, le cancer du cerveau est un astrocytome, et plus particulièrement le glioblastome multiforme; le cancer du poumon est soit un carcinome pulmonaire à petites cellules soit un carcinome pulmonaire à petites cellules; et le cancer de la tête et du cou est un carcinome malpighien ou un adénocarcinome. Selon un autre mode de réalisation, le cancer est un cancer pédiatrique. A titre illustratif, on peut citer parmi ces cancers pédiatriques les neuroblastomes, le cancer d’Ewing, les ostéosarcomes, les médulloblastomes, les rabdomyosarcomes et les glioblastomes de l’enfant.
Les composés peuvent être administrés avant, en même temps, ou après le traitement anti-cancéreux. Le composé ou la composition pharmaceutique selon l’invention est plus spécifiquement pour une utilisation ou administration simultanée, séparée ou séquentielle du composé selon l’invention et d'au moins un autre agent ou principe actif thérapeutique ou tout autre stratégie thérapeutique non médicamenteuse. Ainsi, l'invention concerne également un ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de la digitoxigénine, la digoxine, la minaprine SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et
(b) un agent chimiothérapeutique ou immunothérapeutique; dans lequel le composant (a) est utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Dans un mode particulier de réalisation, le composant (a) est choisi parmi SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, plus particulièrement parmi SG6163F, LOPA87 et leurs analogues, préférentiellement parmi SG6163F et LOPA87. De préférence, le composant (a) est le composé SG6163F. L'ensemble de composants selon l'invention comprend notamment des composants (a) et (b) appropriés à une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée. Avantageusement, l'ensemble de composants selon l'invention peut être utilisé dans le traitement d'un cancer, le composant (a) étant utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Méthode de criblage de composés cardioprotecteurs Un second aspect, l'invention concerne une méthode de criblage de composés susceptible de posséder une activité cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes: a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé test; b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire; et c) la mesure de la viabilité des cellules.
Les cellules utilisées sont choisies parmi les cellules cardiaques connues de l'homme du métier, notamment parmi des cellules cardiaques primaires ou des lignées cellulaires cardiaques. Selon un mode particulier de réalisation, les cellules cardiaques sont des cellules de rongeur, notamment de rat ou de souris, plus particulièrement de rat. Par exemple, les cellules sont des cellules H9C2.
Les cellules sont cultivées dans un milieu adapté à leur culture. On peut notamment citer le milieu DMEM supplémenté avec des additifs adéquats. Parmi les additifs utilisables, on peut citer le sérum de veau foetal, la glutamine et les antibiotiques, notamment pour la culture des cellules H9C2.
Dans l'étape a), le milieu de culture est également supplémenté avec un composé test. Selon un mode particulier de réalisation, le milieu de culture contenant le composé test ne contient pas de sérum de veau foetal et/ou d'antibiotique. En particulier, selon une variante de l'invention, le milieu de culture contenant le composé test ne contient pas de sérum de veau fœtal et ne contient pas d’antibiotique. Par "composé test", on entend un composé dont on souhaite déterminer s'il possède une activité cardioprotectrice. Le composé test sera utilisé à une concentration susceptible de permettre d'identifier ladite activité. Bien entendu, l'homme du métier pourra choisir d'utiliser une gamme de concentration au cours de la méthode selon l'invention pour identifier l'activité du composé et la concentration efficace. Les cellules sont cultivées en présence du composé test pendant un temps suffisant pour permettre audit composé test d'agir sur les cellules. A titre illustratif, la culture des cellules en présence du composé test peut être réalisée pendant un temps compris entre 1 minute et 24 heures, par exemple entre 15 minutes et 10 heures, notamment entre 1 heure et 3 heures, plus particulièrement pendant 2 heures.
A l'étape b), les cellules sont mises en culture dans un milieu complet comprenant du sérum et les antibiotiques, qui comprend en outre un inducteur de mort cellulaire. Selon un mode particulier de réalisation, à l'étape b) l'inducteur de mort cellulaire est introduit dans le milieu de culture de l'étape a). Selon un autre mode de réalisation, à l'étape b) le milieu de culture de l'étape a) est remplacé par un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire et le composé test. Selon un autre mode de réalisation, préféré, à l'étape b) le milieu de culture de l'étape a) est remplacé un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire mais ne contenant pas le composé test. Parmi les inducteurs de mort cellulaire, on peut citer les inducteurs d'apoptose ou les inducteurs de nécrose. On peut citer la camptothécine parmi les inducteurs d'apoptose utilisable dans le cadre de la méthode selon l'invention. Le péroxyde d'hydrogène (H202) peut être utilisé comme inducteur de nécrose. Les cellules sont cultivées en présence de l'inducteur de mort cellulaire à une concentration et pendant un temps adaptés pour permettre l'observation d'une mort cellulaire dans les cellules non traitées avec un composé test, et l'observation d'une absence ou réduction de la mort cellulaire dans les cellules traitées avec un composé test qui s'avère avoir une activité cardioprotectrice. Par exemple, la camptothécine peut être utilisée à une concentration comprise entre 1 et 100 mM, notamment entre 5 et 15 pM, plus particulièrement de 10 pM, pendant une durée allant de 10h à 14h, notamment 12h à 36h, plus particulièrement 24h. Selon un autre exemple, le péroxyde d'hydrogène est utilisé durant 30 minutes à 5h, plus particulièrement durant 1 h à 3h, en particulier pendant 2h, à une concentration comprise entre 100 et 600 pM, en particulier entre 200 et 400 pM, notamment de 300 pM.
L'étape c) est mise en oeuvre pour déterminer la viabilité cellulaire. Les techniques pour déterminer la viabilité des cellules sont bien connues de l'homme du métier. On pourra notamment citer la technique de coloration au bleu de méthylène, la coloration à l'iodure de propidium, ou encore le test de libération de l'enzyme lactate déshydrogénase (LDH). La méthode selon l'invention peut avantageusement être mise en oeuvre pour réaliser un criblage à haut débit de plusieurs composés tests. Ainsi, les cellules pourront notamment être cultivées dans des dispositifs adaptés à un tel criblage à haut débit, notamment dans des plaques multipuits, par exemple des plaques d'au moins 6 puits, au moins 12 puits, au moins 24 puits ou au moins 96 puits. Selon un mode particulier de réalisation, la méthode de criblage selon l'invention est mise en oeuvre sur plaque 96 puits.
Les composés tests sélectionnés selon la méthode de criblage décrite ci-dessus peuvent ensuite être testés pour leur capacité à induire l'autophagie et/ou une reprogrammation métabolique. L'évaluation de la capacité des composés tests à induire l'autophagie peut notamment être réalisée selon la méthode décrite dans les exemples. En bref, les étapes de la méthode de criblage décrite ci-dessus sont mises en oeuvre sur des cellules cardiaques dans lesquels l'expression ou l'activité de protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie est inhibé. Si les composés sélectionnés ne sont plus capables d'inhiber la mort cellulaire dans ces conditions, il peut être conclut que leur activité cardioprotectrice dépend d'une induction de l'autophagie. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie peut être réalisée par tout moyen connu dans l'art, notamment par transfection d'un acide nucléique inhibiteur, notamment un siRNA, ciblant l'ARNm codant une ou plusieurs protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie. On peut notamment citer l'inhibition de la protéine Atg5 ou de la protéine Beclin-1 , en particulier par inhibition de leur expression. Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'inhibition d'Atg5 et de Beclin-1. Selon un mode particulier de réalisation, la méthode comprend l'inhibition de l'expression d'Atg5 et de Beclin-1. Dans un mode plus particulier de réalisation, la méthode comprend l'inhibition d'Atg5 et de Beclin-1 par transfection de siRNA.
La capacité des composés à induire l'autophagie peut également être évaluée par mesure de la conversation de LC3 I et II dans des cellules traitées avec le composé test sélectionné au moyen de la méthode de criblage selon l'invention. Une augmentation de la conversion de LC3 I en LC3 II montre une induction de l'autophagie. Par ailleurs, la capacité des composés sélectionnés à induire la formation de l'autophagosome pourra être déterminée afin d'évaluer la capacité desdits composés à induire l'autophagie. La capacité des composés sélectionnés à reprogrammer le métabolisme énergétique peut être déterminée par des techniques connues de l'homme du métier. Il peut être ainsi envisagé notamment d'évaluer la capacité des composés sélectionnés à élevé le niveau local d'espèces réactives de l'oxygène dans des cellules cardiaques traitées avec le composé sélectionné suite au criblage selon l'invention. L'homme du métier pourra avantageusement utiliser des techniques de détection du niveau de superoxyde d'anion, notamment celles basées sur l'utilisation de la sonde fluorescente MitoSOX en microscopie confocale. Par ailleurs, le métabolisme énergétique peut également être analysé en temps réel, notamment par la mesure de la consommation d’oxygène proportionnelle à la respiration mitochondriale et la mesure de la production et sécrétion de protons dans le milieu de culture proportionnel à la glycolyse. L'homme du métier dispose de méthodes permettant une telle analyse, notamment au moyen de la technologie Seahorse utilisée dans la partie utilisée ci-dessous et la mesure des deux voies de synthèse de ATR énoncées ci-dessus et dénommés: oxygen consumption rate (OCR) et extracellular acidification rate (ECAR). Ces deux paramètres peuvent être déterminés de manière dynamique dans les cellules après traitement séquentiel par des inhibiteurs de référence des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (e.g. rotenone, antimycine, oligomycine).
L'absence d'effets toxiques des composés sélectionnés peut également être évaluée. Ainsi, l'absence d'effets prolifératifs pourra-t-elle être évaluée selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les capacités cardioprotectrices des composés sélectionnés au moyen de la méthode de criblage selon l'invention peuvent également être vérifiée dans chez l'animal.
Par ailleurs, les effets des composés tests peuvent être comparés à des composés dont les effets cardioprotecteurs et les propriétés d'induction d'autophagie et de reprogrammation métabolique sont déjà connus. A ce titre, l'homme du métier pourra utiliser avantageusement un ou plusieurs composés choisis parmi SG6163F, VP331 , LOPA87 et leurs analogues comme référence dans la méthode de criblage de l'invention. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Criblage haut-débit d'inhibiteurs de la mort des cellules cardiaques pour l'identification de hits.
La figure 1A représente un organigramme du criblage.
La figure 1 B montre le classement des hits sur le pourcentage de survie révélé par marquage au bleu de méthylène. Les molécules ont été utilisées à 10 mM en prétraitement avant induction de la mort cellulaire.
La figure 1C représente la confirmation des 6 meilleurs hits sur la viabilité des cellules H9C2, mesurée par un essai de libération de LDH.
Chaque expérience a été reproduite au moins 3 fois. LB, tampon de lyse. SD, écart type. ****, p< 0.0001 par rapport à H2O2, ns., non significatif. SD est calculé par ANOVA à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak.
Figure 2. Effets cellulaires des hits sur des cardiomyocytes ventriculaires néonatals primaires de rat (RNVC) et la lignée cellulaire de cancer du poumon (A549).
La figure 2Amontre que les hits protègent la viabilité des RNVC contre H2O2 à 300 pM. La figure2B montre que les hits protègent la viabilité des RNVC contre la camptothécine à 10 pM.
La figure2C présente l'influence des hits sur la viabilité des cellules H9C2. Les cellules ont été cultivées en présence des hits à 10 pM pendant 48 h. Enfin, les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse et la quantité de LDH a été mesurée pour évaluer la croissance cellulaire totale.
La figure2D montre l'influence des hits sur la viabilité des cellules cancéreuse A549. Les cellules ont été cultivées pendant 6 h en présence ou en l'absence des hits, puis pendant 42 h. Enfin, les cellules ont été lysées avec du tampon de lyse et la quantité de LDH a été mesurée pour évaluer la croissance cellulaire totale.
Chaque expérience a été reproduite au moins 3 fois. LB, tampon de lyse. LDH, lactate déshydrogènase. Les données sont présentées en moyenne ± erreur type de la moyenne (s.e.m) par ANOVA à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak. *, p< 0.05, **, p< 0.01 , ***, p< 0.001 , ****, p< 0.0001 , par rapport à 300 pM H2O2 (A), 10 pM camptothécine (B) ou 0,01 % DMSO (C). Figure 3. Effets sur l'expression des membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2
Niveaux d'expression protéique de BCL-2 (figure 3A et figure 3B) BXL-XL (figure 3C) et BAX (figure 3C), dans les RNVC après 6h de traitement (Fig. 3A, Fig. 3C, Fig. 3D) ou 24h (Fig. 3B). Co., contrôle des cellules non traitées. Chaque expérience a été reproduite au moins trois fois. Les images représentatives de Western-blot et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05 par rapport au DMSO.
Figure 4. L'inhibition de la mort cellulaire des RNVC par les hits nécessite Atg5 et Beclin-1 figure 4A: les RNVCs ont été transfectés avec des siRNA ciblant Atg5 et Beclin-1 et les niveaux d'expression des deux protéines ont été évalués par Western-blot.
Figure 4B et figure 4C: après transfection de siRNA Atg5 et Beclin-1 respectivement, la libération de LDFI a été mesurée dans les RNVC traités par 300 mM FI2O2, 2h. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ns., non significatif par rapport aux cellules traitées par FI2O2 et transfectées avec les siRNA.
Figure 4D: après la transfection du plasmide GFP-LC3, les points fluorescents verts GFP-LC3 ont été visualisés par microscopie à fluorescence et quantifiés avec Image J pour contrôler la formation de l'autophagosome. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ***, p <0,001 par rapport à 0,01 % de DMSO.
Figure 4E: niveaux de protéines de LC3-I / Il dans les RNVC. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 par rapport au DMSO.
Figure 5. SG6163F stimule le flux d'autophagie dans les RNVC Figure 5A: niveaux de protéines LC3-I / Il et p62 dans les RNVC traités avec de la 3- méthyladénine (3MA), de la chloroquine (CQ) et SG6163F pendant 6 h. La rapamycine à 3 mM a été utilisée comme contrôle positif. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 , ns., non significatif. Figure 5B: après traitement avec SG6163F, la rapamycine, la 3-méthyl adénine (MA), la chloroquine (CQ), les points fluorescents verts GFP-LC3 ont été visualisés par microscopie à fluorescence et quantifiés avec Image J. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak, *, p <0,05, **, p <0,01 . Les expériences ont été reproduites trois fois.
Figure 6. Effets sur la dynamique mitochondriale par microscopie à fluorescence Les RNVC ont été traités par des hits 1 mM (figure 6A) et 10 pM (figure 6B) pendant 6 h et le réseau mitochondrial a été marqué par 200 nM de Mitotracker. Le réseau mitochondrial et les mitochondries individuelles ont ensuite été analysés à l'aide du microscope confocal Leica et du logiciel IMARIS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 6C: niveaux de protéines MFN1 et MFN2 dans les RNVC analysés parwestern- blot.
Figure 6D: niveaux de protéines Drp-1 et p-Drp-1 dans les RNVC analysées par western-blot. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO. Les expériences ont été reproduites 3 fois. Les images représentatives de Western-blot et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak.
Figure 7. Effets du SG6163F et de la digoxine sur la morphologie et l'abondance des mitochondries par microscopie électronique à transmission.
Les cellules ont été traitées avec un véhicule (0,01 % DMSO), 1 mM de digoxine, 1 pM de SG6163F, 10 pM de SG6163F, fixées avec du glutaraldéhyde et analysées par microscopie électronique à transmission. Les cellules traitées à la digoxine et avec 10 pM de SG6163F présentent de nombreuses mitochondries rondes plus courtes par rapport au contrôle qui présente des mitochondries longues et minces (figure 7B, figure 7D contre figure 7A). Le traitement avec 1 pM de SG6163F n'a pas affecté la morphologie des mitochondries (figure 7D versus figure 7C). L'encart droit en dans la figure 7D présente une figure de fission mitochondriale.
Figure 8. Effets de reprogrammation métabolique des hits. Figure 8A: Les cellules H9c2 ont été traitées avec les composés pendant 6 h, puis la fonction glycolytique a été mesurée par test de stress glycolytique sur l'analyseur de flux extracellulaire XFe96 (Agilent, USA), les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA unidirectionnelle, et comparaisons multiples de Sidak tester. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 8B: les cellules FI9c2 ont été traitées avec les composés pendant 6 h, puis un test de stress de respiration mitochondriale a été effectué.
Figure 8C: l'oxydation des acides gras exogènes a été mesurée simultanément en utilisant le kit de substrat XF Palmitate-BSA FAO avec le test de stress mito sur cellules XF. Avant de commencer le test, 30 pL de substrat XF Palmitate-BSA FAO ou contrôle BSA ont été ajoutés aux puits appropriés.
Figure 8D: niveaux de protéines AMPK alpha2 et de phospho-AMPK dans les RNVC. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 9. Effets cellulaires des composés sur les RNVC et FI9c2.
La perméabilisation de la membrane cellulaire des RNVC (figure 9A et figure 9B) a été mesurée avec de l'iodure de propidium. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 10. Effets cellulaires de composés analogues sur les RNVC. la protection des cellules RNVC contre FI2O2 par des composés analogues de SG6163F et LOPA87 a été mesurée par un test de libération de LDFI et une mesure d'absorbance à 490 nm. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 11 . Effets des composés sur le volume cellulaire total.
Figure 11 : suite au traitement des RNVC avec les composés comme indiqué, le volume cellulaire est marqué avec 4 mM de calcéine-AM. Le volume des cellules a ensuite été analysé à l'aide du logiciel IMARIS. Figure 12. Effets des composés sur la production mitochondriale de ROS.
Figure 12: Les RNVC ont été traités avec 0,1 % de DMSO, 3 mM de rapamycine, 1 pM de digitoxigénine, 1 pM de digoxine, 1 pM de minaprine, 1 pM de VP331 , 1 pM de LOPA87, 10 pM de SG6163F pendant 6 h, puis la production de ROS a été marquée avec la sonde fluorescente MitoSOX.
Figure 12A: la fluorescence a été capturée avec un microscope confocal Leica.
Figure 12B: la quantification de l’intensité de fluorescence mitochondriale a été réalisée avec le logiciel Image J. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 , ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
EXEMPLES
Matériel et méthodes
Criblage à haut débit
Banques chimiques. Les composés ont été obtenus à partir de deux bibliothèques chimiques: la bibliothèque Prestwick (1 .200 molécules) et la bibliothèque CEA Saclay (400 molécules). Tous les composés ont été fournis à 10 mM dans 100% de DMSO.
Traitement cellulaire et induction de la mort cellulaire. Des cellules H9C2 ont été cultivées dans du milieu DMEM (ATCC® 30-2002 ™) complémenté avec du sérum de veau fœtal 10% (BSA; BioWhittaker DE14-801 F) et de la pénicilline-streptomycine (Gibco® # 15070063). Les cellules H9C2 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (5000 cellules / puits), laissées adhérer pendant 48 heures (h) et traitées avec des composés des banques à 10 mM pendant 2 h à 37 ° C. Ensuite, les composés ont été éliminés et remplacés par un inducteur de mort cellulaire: traitement pendant 24 h avec 10 pM de camptothécine (Sigma C9911 ) pour l'apoptose ou traitement pendant 2 h avec 300 pM de H2O2 (Sigma 216763) pour la nécrose.
Mesure de viabilité et sélection des hits. Après traitement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et fixées avec de l'éthanol à 95% pendant 30 minutes (min) à température ambiante. Les plaques ont été vidées et séchées pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été colorées avec du bleu de méthylène (0,1 g / L) pendant 5 minutes. Après trois lavages à l'eau, du HCl 0,1 M a été ajouté dans les plaques. La lecture d'absorbance a été effectuée à 665 nm (spectrofluorimètre Envision, Perkin Elmer). Les résultats ont été normalisés avec un contrôle non traité et les hits ont été sélectionnés si la valeur d'absorbance était supérieure à la valeur moyenne contrôle de de la mort cellulaire + 3 déviation standard.
Isolement des cardiomyocytes néonatals
Des cardiomyocytes néonatals de rats ont été isolés comme décrit précédemment (Wang et al., Cell Death Dis, 2016, 7:e2198).
Test de libération de LDH
Un test colorimétrique a été utilisé pour mesurer la lactate déshydrogénase (LDH), une enzyme cytosolique qui est libérée lors de la perméabilisation de la membrane plasmique (Promega G1780). Le dosage a été réalisé en utilisant des surnageants de culture cellulaire obtenus à partir de cellules H9C2 ou RNVC (rat néonatal ventricular myocytes) et du tampon de lyse (LB) a été utilisé comme contrôle positif de la lyse cellulaire totale. La libération de LDH a été mesurée par lecture d'absorbance à 490 nm (spectrofluorimètre Infinité, Tecan).
Test de perméabilisation de la membrane plasmique cellulaire
L'iodure de propidium, un marqueur ADN fluorescent non perméable, a été utilisé pour mesurer l'intégrité de la membrane. De l'iodure de propidium à 10 mM a été ajouté dans le milieu de culture et une lecture de fluorescence a été effectuée (ex: 530 nm; em: 620 nm), le LB a été utilisé comme contrôle positif de la lyse cellulaire totale.
Pharmacologie
L'évaluation de la liaison des composés au canal hERG potassique humain a été réalisée comme décrit précédemment (Eurofins). Transfection de plasmides
Au jour 0, 4 x 105 cardiomyocytes néonatals ont été étalés pendant une nuit dans des boîtes de culture de 35 mm revêtues de laminine (10 pg / ml). Au jour 1 , les cellules ont été transfectées avec 1 pg de plasmide GFP-LC3 en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine® 2000 (1 pg de GFP-LC3 correspond à 2,5 pl de réactif de transfection), pendant 48 h, puis la fluorescence verte a été détectée avec un microscope confocal Leica (SP5). Les analyses ont été réalisées avec le programme Image J (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Etats Unis).
Analyse du réseau mitochondrial par microscopie
Microscopie confocale. Au jour 0, 4 x 105 cardiomyocytes néonatals ont été étalés pendant une nuit sur des boîtes de culture de 35 mm revêtues de laminine (10 pg / ml). Au jour 1 , les cellules ont été traitées avec différents composés à 1 ou 10 pM pendant 6 heures. Les cellules ont été incubées avec du Mitotracker Red 580 à 200 nM pendant 20 minutes à 37°C, puis 4 pM de calcéine (calcéine AM, Life technologies, St Aubin, France) pendant 10 min à 37°C. Les images ont été acquises avec un microscope confocal Leica (SP5) (Mannheim, Allemagne). Le réseau mitochondrial et le modèle 3D du volume cellulaire ont été reconstruits en utilisant le logiciel IMARIS (Bitplane Company, Zurich, Suisse), par conséquent le volume cellulaire, le nombre mitochondrial et le volume ont été analysés.
Microscopie électronique à transmission. Pour l'analyse ultrastructurale, les cellules ont été fixées dans 1 ,6% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M, rincées dans un tampon cacodylate 0,1 M, post-fixées pendant 1 h dans 1 % de tétroxyde d'osmium et 1 % de ferrocyanure de potassium dans un tampon cacodylate 0,1 M pour améliorer la coloration des membranes. Les cellules ont été rincées dans de l'eau distillée, déshydratées dans des alcools et enfin noyées dans de la résine époxy. Des coupes ultrafines contrastées (70 nm) ont été analysées sous un microscope électronique à transmission JEOL 1400 disposant d'une caméra Morada Olympus CCD.
Détection de ROS dans les RNVC Les RNVC ont été traités avec 0,01% de DMSO, 3 mM de rapamycine, 1 mM de digitoxigénine, 1 mM de digoxine, 1 mM de minaprine, 1 mM de VP331, 1 mM de LOPA87, 10 mM de SG6163F dans un milieu de culture cellulaire sans sérum pendant 6 heures. Le contenu (50 pg) d'un flacon d'indicateur de superoxyde mitochondrial
MitoSOX ™ (ThermoFisher, M36008) a été dissous dans 13 pL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de réactif MitoSOX ™ 5 mM. Ensuite, la solution mère de réactif MitoSOX ™ 5 mM dans du PBS a été diluée pour préparer une solution de travail de réactif MitoSOX ™ 5 pM. Après traitement, les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS chaud, puis incubées avec une solution de travail de réactif MitoSOX pendant 10 minutes à 37 ° C. Les cellules ont été délicatement rincées trois fois avec du PBS chaud. La fluorescence rouge a été détectée au microscope confocal Leica. La fluorescence nucléaire a été supprimée et l'intensité de fluorescence mitochondriale a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ.
Analyse du profil bioénergétique en temps réel des cardiomyocytes H9C2
L'analyseur de flux extracellulaire XFe96 (Seahorse Biosciences, North Billerica, MA, Etats Unis) a été utilisé pour mesurer la fonction bioénergétique des cardiomyocytes FI9C2. Les cellules FI9C2 ont été ensemencées à 20 000 cellules par puits dans des microplaques de culture cellulaire XF96, tous les prétraitements ont été réalisés avec du milieu de culture cellulaire sans sérum. Le test de stress de glycolyse Agilent Seahorse XF a été réalisé pour mesurer la fonction glycolytique dans les cellules FI9C2, le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) a été mesuré séquentiellement par 3 injections, 10 mM de glucose, 2 pM d'oligomycine et 50 mM de 2-désoxy-D-glucose
(2-DG). Le test de stress Agilent Seahorse XF Cell Mito a mesuré des paramètres clés de la fonction mitochondriale en mesurant directement le taux de consommation d'oxygène (OCR) des cellules FI9C2. Le test a utilisé les ports d'injection intégrés sur les cartouches de capteur XF pour ajouter des modulateurs de respiration dans le puits cellulaire pendant le test afin de révéler les paramètres clés de la fonction mitochondriale. De l'oligomycine à 2 pM a été injectée en premier après les mesures basales. Puis 1 mM de cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) a été injecté. La troisième injection correspond à 0,5 mM d'antimycine A, pour arrêter la respiration mitochondriale. L'oxydation des acides gras exogènes a été mesurée simultanément en utilisant le kit de substrat XF Palmitate-BSA FAO avec le test de stress mitochondrial sur cellules XF. Le milieu limité en substrat est le DMEM avec 0,5 mM de glucose, 1 mM de GlutaMAX, 0,5 mM de carnitine et 1 % de sérum de veau fœtal. De la carnitine a été ajoutée fraîchement le jour du changement de milieu. Le milieu de test FAO contient 111 mM NaCI, 4,7 mM KOI, 1 ,25 mM CaC , 2 mM MgS04, 1 ,2 mM NaFl2P04, supplémenté avec 2,5 mM de glucose, 0,5 mM de carnitine et 5 mM FIEPES le jour du test, ajusté à pH 7,4 à 37°C. Les cellules FI9C2 ont été ensemencées à 20 000 cellules par puits dans des microplaques de culture cellulaire XF96. Tous les prétraitements ont été réalisés avec du milieu de culture cellulaire sans sérum. 24 heures avant le dosage, le milieu de croissance a été remplacé par un milieu limité en substrat. 45 minutes avant le dosage, les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de test FAO, 150 pL / puits de milieu de dosage FAO ont été ajoutés aux cellules. L'incubation a été réalisée dans un incubateur sans CO2 pendant 30 à 45 minutes à 37°C. La cartouche d'essai a été chargée avec des composés XF Cell Mito Stress Test (concentrations finales: 2 mM d'oligomycine, 1 pM de FCCP, 0,5 pM d'antimycine A). Juste avant de commencer le test, 30 pL de substrat XF Palmitate- BSA FAO ou BSA ont été ajoutés aux puits appropriés, puis la microplaque de culture cellulaire XF a immédiatement été insérée dans l'analyseur XFe96 pour analyse.
SDS-PAGE et western blot
Les cellules FI9C2 et les RNVC ont été détachées dans du LB contenant: Tris 50 mM, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de désoxycholate, 1 % Triton X 100, 0,1 % SDS (pH 8,0). Les cellules ont été collectées et placées sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 2000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et conservé sur de la glace. La concentration en protéines a été déterminée par dosage BCA. Les échantillons de protéines ont été dilués avec du tampon d'échantillon (Laemmli 2x, Sigma), mélangés et chauffés pendant 5 minutes à 95 0 C. Ensuite, les échantillons ont été chargés dans un gel précoulé à gradient de 4 à 20% et ont migré pendant 15 minutes à 300 V. Après la migration, la membrane et le gel ont été placés sur la base d'une cassette Trans Blot Turbo (Bio Rad) et les protéines ont été transférées pendant 3 minutes à 2,5V. Après le transfert, la membrane a été bloquée avec 5% de lait dans du PBS-Tween et incubée avec un anticorps primaire dilué dans du PBS-Tween à 5% p/v de lait à 4°C sous agitation douce, pendant une nuit. Le jour suivant, la membrane a été lavée avec du PBS-Tween pendant 6 x 5 min et incubée avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant 1 h à température ambiante. La membrane a été lavée à nouveau avec du PBS-Tween pendant 6 x 5 minutes après l'anticorps secondaire. Ensuite, la membrane a été incubée avec un substrat chimioluminescent amélioré ultra-sensible pendant 5 minutes. Les images ont été enregistrées avec un système d'imagerie sur gel (Bio Rad). Pour la détection des protéines, les anticorps suivants ont été utilisés: anti-Mitofusin 1 (ab126575, Abcam, États-Unis), anti-Mitofusin 2 (ab124773, Abcam, États-Unis), BCL-2 (C-2) (sc-7382, Santa Cruz, États-Unis), BAX (B-9) (sc-7480, Santa Cruz, États-Unis), BCL-XL (# 2764, Cell Signaling, États- Unis), AMPK alpha2 (# 2757, Cell Signaling, États-Unis), LC3B (D11 ) ( # 3868, Cell Signaling, États-Unis), b-Actin (C4) (sc-47778, Santa Cruz, États-Unis), phospho- DRP1 (Ser616) (D9A1 ) (# 4494, Cell Signaling, États-Unis), DLP1 (# 611112, BD Biosciences, États-Unis).
RT-PCR quantitative
L'ARN total a été purifié à partir de 0,5 million de cellules H9C2 de rat en utilisant le RNeasy Mini Kit (Qiagen). Les quantités d'ARN ont été quantifiées en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). L'intégrité des ARN a été vérifiée en utilisant le bioanalyseur Agilent 2100 avec le test RNA 6000 Nano (Agilent Technologies). 1 pg d'ARN total ont été rétrotranscrits dans un volume de réaction final de 20 pi en utilisant le kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Life Technologies) avec un inhibiteur de RNase et des amorces aléatoires en suivant les instructions du fabricant. La PCR quantitative a été réalisée avec le système de PCR en temps réel QuantStudio 12K Flex en utilisant le protocole de détection TaqMan. 6 ng d'ADNc ont été mélangés avec du TaqMan Universal Master Mix 2 et chaque test TaqMan® dans un volume final de 10 pi. Le mélange réactionnel a été chargé sur des microplaques à 384 puits et soumis à 40 cycles de PCR (50°C / 2 min; 95°C / 10 min; (95°C / 15 s; 60°C / 1 min) X 40). Une analyse qPCR en l'absence d'une étape de rétrotranscription a été réalisée sur tous les échantillons d'ARN pour vérifier l'absence de toute contamination d'ADN. Chaque mesure d'échantillon a été faite en double et trois échantillons biologiques d'ARN indépendants ont été préparés pour chaque condition. Les valeurs Ct ont ensuite été utilisées pour la quantification, et la détermination du rapport relatif d'expression génique a été réalisée en utilisant la méthode AACt et normalisée par la moyenne géométrique d'un ensemble de gènes domestiques stables.
Analyses statistiques
Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur type de la moyenne (s.e.m). Le logiciel Origin et Graphpad Prism 6 ont été utilisés pour l'analyse statistique. Les différences entre 2 groupes ont été analysées par ANOVA à un facteur et les différences entre les groupes de deux génotypes ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle, avec comparaisons multiples de Sidak. La signification statistique est indiquée comme suit: * P <0,05, ** P <0,01 , *** P <0,001 , **** P <0,0001. Le nombre de cellules et d'expériences indépendantes réalisées est indiqué dans les légendes des figures.
Résultats
1. Identification d'inhibiteurs de la mort des cardiomyocytes par criblage à haut débit
Deux criblages à haut débit ont été développés pour identifier les inhibiteurs de la mort cellulaire due à une nécrose induite par H2O2 et à une apoptose induite par la camptothécine, dans la chimiothèque commerciale Prestwick (1200 molécules) et une bibliothèque maison du CEA Saclay (400 molécules). Les cardiomyoblastes H9C2 ont été prétraités par les composés à 10 mM pendant 2 h avec 0,01 % de DMSO comme véhicule, lavés et incubés avec un inducteur de mort cellulaire (i.e. H2O2 ou camptothécine) pendant la période indiquée (figure 1A). Ensuite, le pourcentage de cellules viables a été évalué par coloration au bleu de méthylène, et les hits ont été classés en fonction de leur efficacité à protéger de la mort cellulaire, révélant 21 hits statistiquement significatifs (figure 1B). Ensuite, 6 hits ont été confirmés manuellement sur des cellules H9C2 avec de nouveaux lots de molécules en utilisant le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH) (figures 1C, 1D) et la coloration à l'iodure de propidium (Figure 9) indépendamment. Trois hits appartiennent à la bibliothèque de Prestwick, à savoir la digitoxigénine, la digoxine et la minaprine, et 3 hits appartiennent à la banque du CEA: SG6163F, VP331 et LOPA87 (Gabillet, Loreau et al. 2014). Les structures chimiques des 6 hits sont présentées sur la figure 1E. Certains analogues de SG6163F et LOPA87 ont ensuite été analysés pour leur capacité à protéger contre les effets de H2O2 et ont montré une efficacité.
Ensuite, l'effet des composés a été évalué sur les cardiomyocytes ventriculaires néonatals primaires de rat (RNVC) en utilisant le test LDH et la coloration à l'iodure de propidium. Les 6 composés se sont avérés inhiber efficacement à la fois la nécrose et l'apoptose des RNVC, à l'exception de LOPA87 qui ne protégeait pas de l'apoptose induite par la camptothécine lorsqu'elle était détectée par la libération de LDH (figures 2A, 2B, figure 10), sans toxicité détectable à 48h dans les cellules H9C2 (figure 2C). L’absence d’effets prolifératifs des composés ont également été évalués sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549 pendant 48 h (figure 2C). Ainsi, la digitoxigénine, la digoxine et la minaprine on réduit significativement la croissance cellulaire et ont induit la mort cellulaire, tandis que SG6163F, VP331 et LOPA87 n'ont montré aucun effet prolifératif sur la croissance cellulaire A549 pendant cette période (figure 2C).
Le blocage du canal potassique humain du canal hERG pouvant être responsable de fibrillations cardiaques entraînant un arrêt cardiaque et la mort du patient, la liaison des 3 molécules SG6163F, VP331 et LOPA87 à ce récepteur a été évaluée. Pour ce faire, nous avons mesuré la capacité des molécules à inhiber la liaison spécifique du [3H] dofétilide au canal in vitro et constaté que la liaison de SG6163F, VP331 et LOPA87 est négligeable (tableau 1).
Tableau 1. Test de la liaison au canal hERG. L'inhibition de la fixation du Dofetilide titriée a été mesurée en duplicata lors de deux mesures indépendantes et la moyenne calculée. Seulement les valeurs > 50% sont considérées comme efficaces 2. Effets des composés sur l'expression des membres de la famille BCL-2
Pour déterminer les mécanismes cellulaires par lesquels les composés identifiés inhibent la mort cellulaire, nous avons déterminé le niveau d'expression des membres de la famille d'anti-apoptotiques BCL-2 après un traitement court (6h) ou plus long (24h) de RNVC. Les composés n'ont pas modifié l'expression de BCL-2 indépendamment de la durée du traitement (figures 3A, 3B), tandis que la digoxine a entraîné une diminution de l'expression de BCL-XL (figure 3C). De plus, la digoxine et SG6163F ont considérablement diminué l'expression de la protéine pro-apoptotique BAX. (figure 3D). Pour comparer nos résultats avec des molécules de référence, nous avons utilisé la rapamycine, un inhibiteur sérine / thréonine kinase de mTOR et un inducteur d'autophagie (Foster et al., 2010, Journal of Biological Chemistry 285(19): 14071-14077), qui n'a montré aucun effet sur l'expression des membres de la famille BCL 2 dans les RNVC (figure 3).
3. Dépendance des hits à Atg5 et Beclin-1 et induction de l'autophagie par SG6163F
Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que les composés pourraient protéger les cellules cardiaques en activant l'autophagie, un processus catabolique conservé dans révolution qui implique la dégradation des composants cytoplasmiques endommagés. Ainsi, pour explorer la dépendance des hits à la machinerie des protéines de l'autophagie (Yin ét al., 2016, Cell Death Dis.7:e2198), l'expression d'Atg5 et Beclin-1 , deux acteurs principaux de l'autophagie (Kang et al., 2011 , Cell death and différentiation 18(4): 571 ), a été inhibé par transfection de siRNA dans des RNVC pendant 24h (figure 4A). Ensuite, les cellules ont été traitées par les hits et par H2O2 pendant 2 heures et leur survie a été analysée 4 heures plus tard en mesurant la libération de LDH (figures 4B, 4C). Les résultats montrent que tous les composés ont perdu leur capacité à protéger les RNVC de la nécrose. Tous les composés ont également perdu leur capacité à inhiber la mort cellulaire induite par la camptothécine (non montré). Ces résultats suggérant la capacité des hits à induire une autophagie en tant qu'activité cardioprotectrice, nous avons mesuré la conversion de LC3 I et II et avons constaté que le niveau d'expression de LC3II est significativement augmenté par un traitement des cellules avec 1 mM de SG6163F (> 1 ,5 fois) et de rapamycine (> 1 ,4 fois), comme le montre l'analyse par Western blot (figure 4D). Afin de confirmer par une autre approche l'induction de l'autophagie, les RVNC ont été transfectées avec un plasmide GFP-LC3 et la formation de l'autophagosome a été contrôlée 24 heures plus tard. Les résultats présentés dans la figure 4E montrent que SG6163F est capable de provoquer la formation d'autophagosomes. La rapamycine a été utilisée à 3 mM comme témoin positif d'induction de l'autophagie. Ensuite, pour préciser les mécanismes de l'activité de SG6163F, nous avons mesuré le flux autophagique à l'aide de deux inhibiteurs de référence, la 3-méthyladénine (3MA) et la chloroquine (CQ), en utilisant les techniques de Western blot LC3 I / Il (figure 5A) et de microscopie à fluorescence après transfection de GFP- LC3 (figure 5B).
Dans l'ensemble, ces résultats révèlent que tous les hits nécessitent Atg5 et Beclinl pour exercer leur activité inhibitrice de la mort cellulaire, et stimulent le flux d'autophagie par des mécanismes post-transcriptionnels.
4. Impact sur le réseau mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans les RVNC
En raison de l'importance des mitochondries et des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour le devenir des cellules cardiomyocytes, l'hypothèse selon laquelle les composés pourraient avoir un impact sur le réseau des mitochondries a été explorée. Suite au traitement des RNVCs par les composés testés, le réseau mitochondrial a été marqué par 200 nM de Mitotracker et le volume cellulaire par 4 mM de calcéine-AM. Ainsi, le réseau mitochondrial et les mitochondries individuelles ont ensuite été analysés à l'aide du logiciel IMARIS. Si tous les composés ont diminué de manière significative le volume cellulaire par rapport au véhicule (figure 11), à 1 et 10 mM, la digitoxigénine, la digoxine et le SG6163F ont augmenté le nombre de mitochondries et le volume mitochondrial total par cellule suggérant l'induction de la biogenèse mitochondriale (figures 6A, B). En revanche, VP331 , LOPA87 et minaprine n'ont eu aucun effet sur le réseau mitochondrial et le nombre de mitochondries à l'exception de 10 pM minaprine et 3 pM rapamycine, qui ont diminué la masse mitochondriale (figures 6A, B). En conséquence, la digitoxigénine et la digoxine ont diminué l'expression des protéines de fusion, MFN1 et MNF2 (figure 6C) et la digoxine et SG 6163F ont stimulé la fission par la phosphorylation de Drp-1 au niveau de Ser616 comme le montre la mesure du rapport (DRP1-P) / (DRP-1 total) par western-blot (figure 6D). Les effets sur la dynamique mitochondriale ont été confirmés par microscopie électronique à transmission montrant une augmentation du nombre de mitochondries et une diminution de leur taille dans les cellules H9C2 traitées par 10 mM de SG6163F et 1 mM de digoxine par rapport aux mitochondries traitées au DMSO et 1 mM de SG6163F (figure 7).
Les ROS sont produites ou accumulées en tant que sous-produit du métabolisme de l'activité mitochondriale. Ainsi, les ROS peuvent être une conséquence de la fonction mitochondriale ou refléter un défaut du système antioxydant mitochondrial. Ici, en utilisant le marquage au superoxyde d'anion dans les RVNC par la sonde fluorescente MitoSOX après traitement cellulaire par les composés pendant 6h, nous avons pu montrer que la rapamycine, la digitoxigénine, VP331 , LOPA87 et la Minaprine induisaient une élévation du niveau local de superoxyde d'anion mitochondrial, mais pas la digoxine et SG6163F (figure 12).
5. Les hits identifiés reprogramment le métabolisme énergétique des cellules H9C2
Ensuite, nous avons analysé le métabolisme énergétique en temps réel en utilisant la technologie Seahorse dans les cellules H9C2. En premier lieu, tous les composés ont favorisé une acidification extracellulaire (augmentation de l'ECAR) suggérant une augmentation de la production d'ATP par glycolyse anaérobie, à l'exception de la rapamycine (figure 8A). La digitoxigénine et la minaprine ont amélioré la production d'ATP par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant le glucose et le pyruvate comme substrats (figure 8B), mais pas les acides gras (figure 8C). VP331 et la digoxine ont amélioré la phosphorylation oxydative en utilisant des acides gras comme substrat (figure 8C), mais pas le glucose (figure 8B). SG6163F s'est avéré booster OXPHOS bien que la rapamycine l'ait diminuée, indépendamment des substrats comme prévu (Schieke et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281 (37): 27643- 27652) (figures 8B, C). Enfin, pour préciser les mécanismes de reprogrammation métabolique, nous avons étudié l'activation de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), un maître régulateur du métabolisme et avons constaté que seul LOPA87 stimule la phosphorylation de GAMRK par 1,5 fois par rapport au contrôle DMSO
(figure 8D).
Conclusion
Nous avons mis au point deux essais de criblage à haut débit de composés inhibiteurs de la mort cellulaire. Ces essais nous ont permis d'identifier 6 composés inhibiteurs de la mort des cellules cardiaques par induction de l'autophagie et par reprogrammation métabolique. Nous avons plus particulièrement identifié 3 molécules d'intérêt (SG6163-F, LOPA87 et VP331 ), et les avons validés manuellement dans la lignée de cellules H9C2 et dans des myocytes ventriculaires néonataux de rat (RNVC) en utilisant la mesure de la libération de lactate déshydrogénase et le test fluorescent de perméabilité de l'iodure de propidium. De plus, pour chaque molécule, nous avons identifié l'implication des mécanismes pro-survie telles que les protéines Atg5 et Beclin-1 de la machinerie d'autophagie, la modulation de l'expression de l'oncoprotéine BCL-2, l'impact sur le réseau mitochondrial et la biogenèse mitochondriale, la production des espèces réactives de l'oxygène et la reprogrammation métabolique. Nous avons comparé les nouvelles molécules à quatre molécules commerciales dont 3 identifiées dans le crible à savoir la digitoxigénine, la digoxine et la minaprine, et molécule commerciale étant un inducteur d'autophagie contrôle, la rapamycine. Les 3 molécules d'intérêt n'ont pas montré d'activité cytotoxique sur les cardiomyocytes, n'ont pas augmenté la prolifération de cellules cancéreuses et ne se fixent pas sur le canal cardiaque hHERG. Leurs mécanismes d'action sont différents de ceux de la rapamycine. Ainsi, les molécules identifiées peuvent être utilisées en combinaison avec la chimiothérapie ou la radiothérapie, notamment, pour protéger les cellules cardiaques et diminuer les effets secondaires des traitements anti-cancéreux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, pour leur utilisation en tant que cardioprotecteur.
2. Composé pour son utilisation selon la revendication 1 , choisi parmi SG6163F, LOPA87, et leurs analogues.
3. Composé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, choisi parmi SG6163F et LOPA87.
4. Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation dans le traitement d'une maladie cardiaque choisie parmi l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.
5. Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques
6. Composé pour son utilisation selon la revendication 5, le composé étant administré avant, pendant ou après la thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques.
7. Composé pour son utilisation selon la revendication 5 ou 6, ladite thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxique étant une thérapie anticancéreuse.
8. Ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et
(b) un agent thérapeutique utile pour traiter un patient, ledit agent induisant toutefois des effets secondaires cardiotoxiques; dans lequel le composant (a) est utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
9. Ensemble de composants selon la revendication 8, dans lequel les composants (a) et (b) sont appropriés à une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée.
10. Ensemble de composants selon la revendication 8 ou 9, pour son utilisation dans le cadre du traitement d'un cancer, le composant (b) étant un agent anticancéreux chimiothérapeutique ou immunothérapeutique, et le composant (a) étant utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
11. Méthode de criblage de composés de posséder une activité cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes: a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé test; b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire; et c) la mesure de la viabilité des cellules.
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