EP4271807A1 - Verfahren und system zur schnellen isolierung von nukleinsäuren direkt aus vollblutproben - Google Patents

Verfahren und system zur schnellen isolierung von nukleinsäuren direkt aus vollblutproben

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EP4271807A1
EP4271807A1 EP21847739.6A EP21847739A EP4271807A1 EP 4271807 A1 EP4271807 A1 EP 4271807A1 EP 21847739 A EP21847739 A EP 21847739A EP 4271807 A1 EP4271807 A1 EP 4271807A1
Authority
EP
European Patent Office
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nucleic acids
cells
solid phase
buffer
washing
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21847739.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Kristin WESSEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IST Innuscreen GmbH
Original Assignee
IST Innuscreen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by IST Innuscreen GmbH filed Critical IST Innuscreen GmbH
Publication of EP4271807A1 publication Critical patent/EP4271807A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the invention relates to the use of a commercially available generation of devices, with which nucleic acids are normally automatically purified from a biological sample, including directly from whole blood samples, using magnetic or paramagnetic particles, for the purification of nucleic acids without these magnetic or paramagnetic particles .
  • the lysate is usually mixed with a binding buffer or an alcohol and with magnetic or paramagnetic particles (with some suppliers the blood sample to be processed can already contain a binding buffer and magnetic or paramagnetic particles during the lysis. These must can then no longer be added after the lysis.
  • the use of magnetic or paramagnetic particles is essential for the extraction in all these methods, since the nucleic acids are bound to the particles after their release.
  • the so-called plastic combs then move according to a predetermined programming further cavities, in which the reagents required for the extraction are located. The particles with the bound nucleic acids are then also moved via this progressive movement from cavity to cavity.
  • nucleic acids are extracted according to the classic principle of lysing-binding-washing-drying-eluting. This principle is well known to those skilled in the art. Both this type of extraction device and the working principle are well known and used worldwide.
  • a general disadvantage is that the use of magnetic or paramagnetic particles often leads to difficulties with the purity of the nucleic acids to be isolated. This is especially true when whole blood samples are processed. Washing the bound nucleic acids is often difficult. In addition, the use of these particles often leads to discolored nucleic acid eluates.
  • Another major disadvantage is that after each process step, the particles have to be collected using the magnets that move into the combs. These steps take time and result in loss of nucleic acids if collection is not complete.
  • the subject matter of the disclosure is a new and greatly simplified method and means that allow cells to be enriched from a sample and removed from the sample, and then the nucleic acids contained in the cells to be released and isolated in a way that the same means used for the enrichment of the cells was used, is also used for the isolation of the nucleic acids.
  • the nucleated cells are bound to the rough surface used there, then lysed, the nucleic acid is released and then bound to the rough material again, washed and finally the nucleic acid is eluted.
  • This means that the process is fully automated and delivers high-quality nucleic acid. However, the process takes a long time because it requires many work steps.
  • the invention was therefore based on the object of eliminating the disadvantages of the technical solutions described in the prior art.
  • a method for the isolation of nucleic acids - preferably directly from whole blood samples - was provided by means of the illustrated generation of extraction machines for magnetic particles, which is significantly easier and faster to carry out than the known methods and which allows extremely high yields of nucleic acids to insulate with high quality and which does not require magnetic particles.
  • Another important advantage is that magnetic and paramagnetic particles are often very expensive, which significantly affects the price per extraction.
  • WO 2016/169677 A1 describes the isolation of nucleic acids by means of rough surfaces. Since there is no exact definition of the term "roughness", a rough surface in the context of this invention means a surface whose roughness can be felt by sight or touch. Creating a rough surface is extremely easy, at least for plastics. All you have to do is treat the originally smooth surface with sandpaper, a grinder, a file or by scratching.
  • the present invention enables nucleic acids to be isolated directly from a whole blood sample and requires no preparatory steps or complex process protocols. A previous attachment of the blood cells to the rough surface (as described in WO 2018/167138) is also not required.
  • the invention is universal and can be carried out with all extraction devices which work according to the walk-away principle known to those skilled in the art from the "KingFisher" device platform (Thermo Electron and other global suppliers of devices which work according to the same principle). All these devices, which work for working with magnetic particles, can be used for the extraction of nucleic acids without magnetic particles.
  • the extraction can thus be carried out significantly more cheaply, since it is known that magnetic or paramagnetic particles are expensive.
  • the method according to the invention only requires a mechanical roughening or scratching of the plastic combs, which are normally used as intended for the collection of the magnetic particles.
  • lysis buffers and binding buffers known to the person skilled in the art as well as proteolytic enzymes are used. Surprisingly, however, it turned out that clean nucleic acid eluates and high yields of nucleic acids are obtained if the known, customary washing buffer compositions are not used.
  • These known compositions consist of alcoholic components and preferably chaotropic salts or Tris or EDTA admixtures.
  • washing buffers are not suitable for isolating nucleic acids directly from a whole blood sample using rough surfaces or magnetic particles.
  • a wash buffer containing lithium salt preferably a high concentration of lithium chloride (greater than 0.1 M) and Tris, and a high concentration of ethanol, preferably over 50%, ideally fulfills the task that the brushes on the roughened plastic combs bound nucleic acid is washed efficiently.
  • This wash buffer is used as the first wash buffer in the run-off protocol.
  • the other obligatory wash buffers are then alcoholic wash buffers with low salt concentrations and additions of Tris or pure, preferably 80% ethanol.
  • the decisive factor is the use of the first wash buffer according to the invention. This makes it possible to isolate nucleic acids directly from a whole blood sample with high quality and yield using the device systems listed, which normally work with magnetic particles. The binding of the nucleic acids takes place solely on the plastic combs that are obligatory for these devices and are mechanically roughened for this purpose. This allows nucleic acid to be isolated from a whole blood sample easily, quickly and inexpensively and fully automatically.
  • the use of the lithium washing buffer is of course possible in every washing step and also when isolating cells other than blood cells, but not necessary, only when isolating blood cells from whole blood.
  • the relatively poor ratio's A26o:A23o when using magnetic particles indicate that the use of a lithium wash buffer would also make sense with this method.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • a preferred concentration range of the lithium salt is 0.1 to 0.5M, more preferred is a concentration of 0.3M.
  • a higher concentration than 0.5M has no measurable effect, but only increases the further washing steps.
  • the system according to the invention comprises:
  • At least one solid phase which preferably consists of a plastic that has a rough surface, this rough surface being immersed in said buffers
  • any type of polymer can be used as the plastic, including those that were produced using the 3D printing process. With the latter one saves the roughening (because the type of layered production produces a roughness that is already necessary), but it is currently uneconomical.
  • the invention also relates to an automated method using devices that perform automated isolation and purification of nucleic acids using magnetic separation. By eliminating the use of magnetic particles and simply roughening the surface of the plastic combs, the automated process is significantly easier.
  • the extraction was carried out with the device KingFisher Flex magnetic particle processor (Thermo Electron).
  • the plastic combs into which the magnetic rods retract in the standard procedure, were used in a different way and serve to bind and subsequent extraction of the nucleic acid.
  • the plastic combs were roughened using a grinder.
  • the wash buffer used for the first wash step was the wash buffer according to the invention (50 mM Tris HCl; pH 7.5, 0.3 M lithium chloride, 80% ethanol).
  • the deep well plates were loaded with the required buffers as follows:
  • Plate 1 (lysis/binding): 200 ⁇ l whole blood, 300 ⁇ l lysis buffer CLS and 20 ⁇ l proteinase K
  • Plate 2 (wash 1): 50 mM Tris HCl; pH7.5, 0.3 M lithium chloride, 80% ethanol)
  • Plate 3 (Wash 2): 20 mM Tris HCl; pH7.5, 10mM NaCl, 80% ethanol)
  • Plate 4 (Wash 3): 80% ethanol
  • the automated extraction was started. First, the sample is lysed on the KingFisher Flex. After the lysis, a binding optimizer (Analytik Jena AG) and 400 ⁇ l of isopropanol were added to the first plates.
  • the extraction procedure with magnetic particles was carried out according to the manual. A kit from Analytik Jena (innuPREP Blood DNA Kit KFFLX) was used. The plastic for it has not been treated. The extraction process took about 55 minutes.
  • the isolated nucleic acid was detected by means of a spectrophotometric measurement. In addition to the yield, the purity of the isolated nucleic acid was also determined.
  • DNA can be isolated directly from whole blood samples using the agents according to the invention and the magnetic particle processor device.
  • the yields are comparable to those of a classic extraction process using magnetic particles.
  • the well-known poor ratios A26O:A23O do not occur when using magnetic particles with the agents according to the invention.
  • the ratios are significantly better.
  • No Eluates are discolored.
  • the eluates were clearly discolored.
  • the extraction can be carried out faster than with the classic method.
  • the process is also significantly less complex since all the steps for collecting and transporting the magnetic particles are not necessary. Finally, since the procedure is performed without magnetic particles, it is cheaper.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist die Nutzung einer kommerziell verfügbaren Generation von Geräten, mit denen normalerweise Nukleinsäuren mittels magnetischer oder paramagnetischer Partikel aus einer biologischen Probe, u.a. direkt aus Vollblutproben, automatisiert aufgereinigt werden, für die Aufreinigung von Nukleinsäuren, allerdings ohne diese magnetischen oder paramagnetischen Partikel, sondern stattdessen mit aufgerauten Kunststoffmaterialien. Entscheidend dabei ist, dass die an die rauen Materialien gebundenen Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer behandelt werden, der mindestens ein Lithiumsalz enthält.

Description

Verfahren und System zur schnellen Isolierung von Nukleinsäuren direkt aus Vollblutproben
Beschreibung
[0001] Gegenstand der Erfindung ist die Nutzung einer kommerziell verfügbaren Generation von Geräten, mit denen normalerweise Nukleinsäuren mittels magnetischer oder paramagnetischer Partikel aus einer biologischen Probe, u.a. direkt aus Vollblutproben, automatisiert aufgereinigt werden, für die Aufreinigung von Nukleinsäuren ohne diese magnetischen oder paramagnetischen Partikel.
[0002] Beispielhaft für diese Art der Geräte ist der sog. KingFisher Flex Magnetic Particle Prozessor der Firma Thermofischer, (https ://www. therm ofi sher , com/ de/ de/home/life- science/bioproduction/contaminant-and-impurity-testing/sample-prep-and- automation/kingfisher-fl ex -magnetic-particle-processor.html). Ähnliche Geräte, welche nach genau demselben Prinzip arbeiten, gibt es auch von anderen Anbietern. Alle diese Geräte arbeiten nach folgendem Prinzip:
[0003] Diese Geräte verwenden Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Die Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Blutprobe beginnt mit der Lyse der Probe, welche sich zusammen mit einem Lysepuffer und ggf. einem proteolytischen Enzym z.B. in einer Kavität einer 96-Well Deep Well Platte befindet.
[0004] Nach erfolgter Lyse wird in der Regel das Lysat mit einem Bindungspuffer oder einem Alkohol und mit magnetischen oder paramagnetischen Partikeln versetzt (bei einigen Anbietern kann die zu bearbeitende Blutprobe auch schon während der Lyse einen Bindungspuffer und magnetische oder paramagnetische Partikel enthalten. Diese müssen dann nicht mehr nach der Lyse zugegeben werden. Essenziell für die Extraktion bei all diesen Verfahren ist die Verwendung der magnetischen oder paramagnetischen Partikel, da die Nukleinsäuren nach ihrer Freisetzung an die Partikel gebunden werden. Die sog. Plastikkämme bewegen sich dann nach einer vorgegebenen Programmierung in weitere Kavitäten, in welchen sich die für die Extraktion notwendigen Reagenzien befinden. Über diese fortschreitende Bewegung von Kavität zu Kavität werden dann auch die Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren bewegt. Dies erfolgt dadurch, dass in die Plastikkämme ein Magnetstab einfährt, so dass dann die Partikel außen an den Plastikkämmen gesammelt und von Kavität zu Kavität transportiert werden können. Mittels dieses einfachen Automationsverfahren erfolgt die Extraktion der Nukleinsäuren nach dem klassischen Prinzip Lysieren-Binden-Waschen-Trocknen-Eluieren. Dem Fachmann ist dieses Prinzip hinlänglich bekannt. Sowohl diese Art der Extraktionsgeräte als auch das Arbeitsprinzip sind hinlänglich bekannt und werden weltweit eingesetzt. Generell nachteilig ist aber, dass die Verwendung von magnetischen oder paramagnetischen Partikeln oftmals zu Schwierigkeiten bei der Reinheit der zu isolierenden Nukleinsäuren führt. Dies besonders, wenn Vollblutproben bearbeitet werden. Das Waschen der gebundenen Nukleinsäuren ist oftmals schwierig. Darüber hinaus führt die Verwendung von diesen Partikeln auch oft zu verfärbten Nukleinsäure-Eluaten. Ein weiterer wesentlicher Nachteil besteht darin, dass nach jedem Prozessschritt die Partikel mittels der Magneten, welche in die Kämme einfahren, gesammelt werden müssen. Diese Schritte benötigen Zeit und führen bei einem nicht vollständigen Einsammeln zu einem Verlust an Nukleinsäuren.
[0005] In der Offenlegungsschrift WO 2016/169677 Al wird gezeigt, dass man mittels eines Automaten zur Extraktion von Nukleinsäuren, der Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel isoliert (KingFisher ml, Thermo Electron), Nukleinsäuren auch ohne Magnetpartikel isolieren kann. Dieses Gerät gehört zur Gruppe der oben beschriebenen Extraktionsautomaten und erlaubt die Extraktion von Nukleinsäuren aus maximal 15 Proben parallel. Die Druckschrift offenbart, dass allein das mechanische Anrauen der Plastikkämme ausreichend ist, Nukleinsäuren an diese raue Oberfläche zu binden. Die Druckschrift führt einige Ausgangsmaterialien auf, welche für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt wurden. Beschrieben wird auch die Isolierung von Nukleinsäuren aus Blut. Allerdings wurden die Blutproben nicht direkt für die Extraktion eigesetzt. Beschrieben wird nur die Isolierung von DNA aus den kernhaltigen Blutzellen, welche mittels vorbereitender Schritte erst einmal gewonnen werden mussten. Nachteilig an einem solchen Verfahren sind die durchzuführenden Verfahrensschritte der Lyse der Erythrozyten und der Pelletierung der kernhaltigen Zellen. Eine Automatisierung dieser Schritte benötigt eine Zentrifuge. Es ist bekannt, dass die technische Implementierung einer Zentrifuge in einen automatisierten Prozess zur Isolierung von Nukleinsäuren aufwendig und teuer ist. Die Verwendung einer Vollblutprobe ohne diese zusätzlichen Schritte der Vorbehandlung führt dazu, dass die Qualität der isolierten DNA extrem schlecht ist und die Eluate nach Ablösen der DNA von den angerauten Plastikkämmen deutlich sichtbar verfärbt sind.
[0006] Solche verfärbten Eluate werden auch häufig bei der Extraktion von Nukleinsäuren aus Blutproben mittels magnetischer Partikel beobachtet. Dem Fachmann ist dies bekannt. Die als Waschpuffer eingesetzten Lösungen sind nicht ausreichend effizient genug, um saubere Nukleinsäure-Eluate zu erzeugen. Dies umso mehr, wenn man Nukleinsäuren mittels der Bindung an raue Oberflächen isolieren möchte. Deshalb ist es notwendig, zuerst die kernhaltigen Blutzellen zu separieren. Damit ist der Prozess der Extraktion von Nukleinsäuren aus Blut kein komplett automatisierter Vorgang und bedarf aufwendiger vorbereitender manueller Schritte. Um den Prozess der Extraktion von Nukleinsäuren komplett automatisiert ablaufen zu lassen, bedient sich die Druckschrift WO 2018/167138 eines anderen Lösungsansatzes. Gegenstand der Offenlegungsschrift ist ein neuartiges und stark vereinfachtes Verfahren und Mittel, welches es erlaubt, Zellen aus einer Probe anzureichern und aus der Probe zu entfernen, danach die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren freizusetzen und zu isolieren, der Art, dass dasselbe Mittel, welches für die Anreicherung der Zellen verwendet wurde, auch für die Isolierung der Nukleinsäuren genutzt wird. Das bedeutet, dass man den Extraktionsprozess direkt mit einer Vollblutprobe starten kann. Die kernhaltigen Zellen werden an die dort eingesetzte raue Oberfläche gebunden, nachfolgend lysiert, die Nukleinsäure wird freigesetzt und nachfolgend wieder an das raue Material gebunden, gewaschen und final die Nukleinsäure eluiert. Damit ist der Prozess voll automatisiert und liefert Nukleinsäure einer hohen Qualität. Der Prozess dauert allerdings sehr lange, da er viele Arbeitsschritte benötigt.
[0007] Die Verwendung von Lithiumchlorid zur Fällung von RNA ist bekannt (https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/ambion-tech-support/rna- isolation/general-articles/the-use-of-licl -precipitation-for-rna-purification.html). Beispielsweise beschreibt die europäische Patentschrift EP 3 277 809 Bl die Lyse von Zellen mittels Lithiumchlorid in einer Konzentration von 0,05 bis 1 M. Die Verwendung von Lithiumsalzen als Komponente von Waschpuffern zur Reinigung von isolierten Nukleinsäuren ist bisher nichts bekannt.
Aufgabe der Erfindung
[0008] Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen technischen Lösungen zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
[0009] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. [0010] Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren - vorzugsweise direkt aus Vollblutproben - mittels der dargestellten Generation von Extraktionsautomaten für Magnetpartikel bereitgestellt, welches deutlich einfacher und schneller in der Durchführung ist als die bekannten Verfahren und welches es erlaubt, extrem hohe Ausbeuten an Nukleinsäuren mit hoher Qualität zu isolieren und welches keine Magnetpartikel benötigt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass magnetische und paramagnetische Partikel oftmals sehr teuer sind, was den Preis je Extraktion erheblich beeinflusst.
[0011] Basis der Erfindung ist die Druckschrift WO 2016/169677 Al, welche die Isolierung von Nukleinsäuren mittels rauer Oberflächen beschreibt. Da es keine exakte Definition des Begriffs „Rauheit“ gibt, ist unter einer rauen Oberfläche im Sinne dieser Erfindung eine Oberfläche gemeint, deren Rauheit man durch Ansicht oder Berühren ertasten kann. Das Herstellen einer rauen Oberfläche ist denkbar einfach, zumindest bei Kunststoffen. Dafür muss nur die ursprünglich glatte Oberfläche mit einem Schleifpapier, einem Schleifgerät, einer Feile oder durch Ritzen behandelt werden.
[0012] Die vorliegende Erfindung ermöglicht - im Unterschied zu WO 2016/169677 Al oder WO 2018/167138 - die Isolierung von Nukleinsäuren direkt aus einer Vollblutprobe und benötigt keine vorbereitenden Schritte oder aufwendige Ablaufprotokolle. Auch eine vorherige Anbindung der Blutzellen an die raue Oberfläche (wie in WO 2018/167138 beschrieben) entfällt. Die Erfindung ist universell und kann mit allen Extraktionsgeräten, welche nach dem dem Fachmann bekannten walk-away -Prinzip der Geräteplattform „KingFisher“ (Thermo Electron und anderer weltweiter Anbieter von Geräten, welche nach demselben Prinzip arbeiten) arbeiten, durchgeführt werden. Alle diese Geräte, welche für das Arbeiten mit Magnetpartikeln arbeiten, können für die Extraktion von Nukleinsäuren ohne magnetische Partikel eingesetzt werden. Damit kann die Extraktion deutlich preiswerter durchgeführt werden, da bekanntermaßen magnetische oder paramagnetische Partikel teuer sind. Für das erfindungsgemäße Verfahren bedarf es lediglich eines mechanischen Anrauens oder Ankratzens der Plastikkämme, welche normalerweise für die Sammlung der Magnetpartikel bestimmungsgemäß benutzt werden. Weiterhin werden dem Fachmann bekannte Lysepuffer und Bindungspuffer sowie proteolytische Enzyme eingesetzt. Überaschenderweise zeigte sich aber, dass man saubere Nukleinsäure-Eluate und hohe Ausbeuten an Nukleinsäuren bekommt, wenn man nicht die bekannten gebräuchlichen Waschpufferzusammensetzungen verwendet. Diese bekannten Zusammensetzungen bestehen aus alkoholischen Komponenten und vorzugsweise chaotropen Salzen bzw. Tris- oder EDTA- Beimischungen. Es zeigt sich, dass diese Waschpuffer nicht geeignet sind, mittels rauer Oberflächen oder Magnetpartikeln Nukleinsäuren direkt aus einer Vollblutprobe zu isolieren. Zwei Beobachtungen treten auf, wenn man bekannte Waschpufferzusammensetzungen einsetzt. Entweder die Eluate sind sauber, dann ist die Ausbeute an Nukleinsäure sehr gering oder die Eluate sind verfärbt, dann ist zwar ausreichend Nukleinsäure im Eluat enthalten, die Qualität ist allerdings sehr schlecht. Erfindungsgemäß erfüllt ein Waschpuffer, welcher Lithiumsalz, vorzugsweise eine hoher Konzentration an Lithiumchlorid (größer als 0,1 M) und Tris und eine hohe Konzentration an Ethanol, vorzugsweise über 50%, enthält, in idealer Weise die Aufgabe, dass die an den angerauten Plastikkämmen gebundene Nukleinsäure effizient gewaschen wird. Dieser Waschpuffer wird als erster Waschpuffer im Ablaufprotokoll eingesetzt. Die weiteren obligaten Waschpuffer sind dann alkoholische Waschpuffer mit geringen Salzkonzentrationen und Beimengungen an Tris bzw. reiner, vorzugsweise 80%iger Ethanol. Entscheidend ist die Verwendung des erfindungsgemäßen ersten Waschpuffers. Damit ist es möglich, Nukleinsäuren direkt aus einer Vollblutprobe mit hoher Qualität und Ausbeute zu isolieren und dies mittels der aufgeführten Gerätesysteme, welche normalerweise mit Magnetpartikeln funktionieren. Die Bindung der Nukleinsäuren erfolgt allein an den für diese Geräte obligaten Plastikkämmen, die dafür mechanisch angeraut sind. Damit kann einfach, schnell und preiswert und vollautomatisiert Nukleinsäure aus einer Vollblutprobe isoliert werden. Die Verwendung des Lithium -Waschpuffers ist selbstverständlich bei jedem Waschschritt und auch bei der Isolierung von anderen als Blutzellen möglich, aber nicht erforderlich, sondern nur bei der Isolierung von Blutzellen aus Vollblut. Die relativ schlechten Ratio‘s A26o:A23o bei der Verwendung von Magnetpartikeln (siehe Tabelle 1) deuten darauf hin, dass auch bei diesem Verfahren die Verwendung eines Lithium -Waschpuffers sinnvoll wäre.
[0013] Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst folgende Schritte:
■ Lyse der Zellen und Anbindung der Nukleinsäuren aus diesen Zellen an eine feste Phase
■ Erstes Waschen der an die feste Phase gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Puffers, der ein Lithiumsalz enthält
■ Wiederholtes Waschen mit dem Waschpuffer oder mit an sich bekannten Waschpuffern
■ Eluieren der gereinigten Nukleinsäuren mit bekannten Mitteln
[0014] Ein bevorzugter Konzentrationsbereich des Lithiumsalzes beträgt 0,1 bis 0,5 M, besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 0,3 M. Eine höhere Konzentration als 0,5 M hat keinen messbaren Effekt, sondern erhöht nur die weiteren Waschschritte.
[0015] Das erfindungsgemäße System umfasst:
■ Einen an sich bekannten Puffer zur Lyse von biologischen Zellen
■ Einen an sich bekannten Puffer zur Anbindung der Nukleinsäuren aus den lysierten Zellen an eine feste Phase
■ Einen Waschpuffer, der mindestens ein Lithiumsalz enthält
■ Weitere an sich bekannte Waschpuffer
■ Mittel zum Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren
■ Mindestens eine feste Phase, die vorzugsweise aus einem Kunststoff besteht, der eine raue Oberfläche hat, wobei diese raue Oberfläche in die genannten Puffer eintaucht
[0016] Als Kunststoff kann jede Art von Polymer eingesetzt werden, auch solche, die im 3D- Druckverfahren erzeugt wurden. Bei letztgenannten erspart man sich zwar das Aufrauen (weil die Art der schichtweisen Herstellung eine bereits notwendige Rauheit erzeugt), aber ist zZ unwirtschaftlich.
[0017] Gegenstand der Erfindung ist auch ein automatisiertes Verfahren mittels Geräten, die eine automatisierte Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe der Magnetseparation durchführen. Durch den Verzicht auf magnetische Teilchen, indem einfach die Oberfläche der Plastikkämme aufgeraut wird, ist das automatisierte Verfahren deutlich einfacher.
[0018] Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Das Ausführungsbeispiel stellt dabei keine Limitierung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiel
Isolierung von DNA aus 4 verschiedenen Vollblutproben mittels der erfindungsgemäßen Mittel und mit einem klassischen Kit zur Isolierung von DNA aus Vollblut mittels Magnetpartikel
[0019] Die Extraktion erfolgte mit dem Gerät KingFisher Flex Magnetpartikelprozessor (Thermo Electron). Dazu wurden die Plastikkämme, in welche im Standardverfahren die Magnetstäbe einfahren, zweckentfremdet eingesetzt und dienen der Bindung und nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Plastikkämme mittels eines Schleifgerätes angeraut. Der für den ersten Waschschritt eingesetzter Waschpuffer war der erfindungsgemäße Waschpuffer (50 mM Tris HCl; pH 7.5, 0.3 M Lithiumchlorid, 80% Ethanol). Die Deep Well Platten wurden mit den benötigten Puffern wie folgt beladen:
Platte 1 (Lyse/Bindung): 200 pl Vollblut, 300 pl Lysepuffer CLS und 20 pl Proteinase K Platte 2 (Waschen 1): 50 mM Tris HCl; pH7.5 , 0.3 M Lithiumchlorid, 80% Ethanol) Platte 3 (Waschen 2): 20 mM Tris HCl; pH7.5, 10 mM NaCl, 80% Ethanol) Platte 4 (Waschen 3): 80% Ethanol
Platte 5 (Waschen 4): 80% Ethanol
Platte 6 (Elution): 10 mM Tris HCl; pH 8.5
[0020] Die automatisierte Extraktion wurde gestartet. Zuerst erfolgt die Lyse der Probe auf dem KingFisher Flex. Nach der Lyse erfolgte die Zugabe eines Binding Optimizers (Analytik Jena AG) sowie von 400 pl Isopropanol in die ersten Platten.
[0021] Dann wurde die automatisierte Extraktion fortgesetzt. Der gesamte Extraktionsprozess war nach ca. 45 min abgeschlossen.
[0022] Das Extraktionsverfahren mit Magnetpartikeln wurde gemäß dem Manual durchgeführt. Verwendet wurde ein Kit der Firma Analytik Jena (innuPREP Blood DNA-Kit KFFLX). Die Plastik dafür wurde nicht behandelt. Der Extraktionsprozess benötigte ca. 55 min.
[0023] Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometri scher Messung. Neben der Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt.
Tabelle 1 : Ergebnisse der spektrophotometri sehen Vermessung:
[0024] Wie die Ergebnisse eindrucksvoll zeigen, kann mit den erfindungsgemäßen Mitteln und dem Magnetpartikelprozessor-Gerät DNA direkt aus Vollblutproben isoliert werden. Die Ausbeuten sind mit denen eines klassischen Extraktionsverfahrens mittels magnetischer Partikel vergleichbar. Es zeigt sich aber eindrucksvoll, dass die bekannten schlechten Ratio‘s A26O:A23O bei der Verwendung von Magnetpartikeln mit den erfindungsgemäßen Mitteln nicht auftreten. Im Gegensatz zur klassischen Methode sind die Ratio‘s deutlich besser. Keine Eluate sind verfärbt. Bei der klassischen Methode waren die Eluate deutlich verfärbt. Mit der Erfindung kann die Extraktion schneller als mit dem klassischen Verfahren durchgeführt werden. Das Verfahren ist auch deutlich weniger komplex, da ja alle Schritte zum Sammeln und zum Transport der Magnetpartikel nicht notwendig sind. Letztlich ist das Verfahren, da es ohne Magnetpartikel durchgeführt wird, billiger.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Zellen, bei dem nach Lyse der Zellen die in den Zellen enthaltene Nukleinsäuren an eine feste Phase gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass die an die feste Phase gebundene Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer behandelt werden, der mindestens ein Lithiumsalz enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Lithiumsalzes zwischen 0,1 und 0,5 M, bevorzugt 0,3 M beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Lyse der Zellen und Anbindung der Nukleinsäuren aus diesen Zellen an eine feste Phase b) Erstes Waschen der an die feste Phase gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Puffers, der ein Lithiumsalz enthält c) Wiederholtes Waschen mit dem Waschpuffer oder mit an sich bekannten Waschpuffern d) Eluieren der gereinigten Nukleinsäuren mit bekannten Puffern
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase aufgeraute Kunststoffmaterialien dienen, wobei die Rauheit der Oberfläche durch Berühren oder durch Ansicht der Oberfläche erkennbar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den aufgerauten Kunststoffmaterialien um aufgeraute Plastikkämme handelt, die bei einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten für die Isolierung von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel eingesetzt werden können und deren raue Oberfläche in die Puffer gemäß Anspruch 3 eintauchen kann.
6. Automatisiertes Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5 mit mehreren aufgerauten Plastikkämmen nach dem walk-away -Prinzip.
7. System zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Zellen, bei dem nach Lyse der Zellen die in den Zellen enthaltene Nukleinsäuren an eine feste Phase gebunden werden, wobei die an die feste Phase gebundene Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer behandelt werden umfassend: a) einen an sich bekannten Puffer zur Lyse von biologischen Zellen b) einen an sich bekannten Puffer zur Anbindung der Nukleinsäuren aus den lysierten Zellen an eine feste Phase c) einen Waschpuffer, der mindestens ein Lithiumsalz enthält d) weitere an sich bekannte Waschpuffer e) Puffer zum Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren f) mindestens eine feste Phase, die vorzugsweise aus einem Kunststoff besteht, der eine raue Oberfläche hat, wobei die Rauheit der Oberfläche durch Berühren oder durch Ansicht der Oberfläche erkennbar ist und diese raue Oberfläche in die genannten Puffer eintauchen kann. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Systems gemäß Anspruch 7 zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus biologischen Zellen. Verwendung nach Anspruch 8 zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus Vollblut. . Verwendung von Lithiumsalzen in einem Waschpuffer zur Reinigung von Nukleinsäuren, die nach einer Lyse biologischer Zellen an eine feste Phase gebunden sind.
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KR102190922B1 (ko) * 2015-09-01 2020-12-14 삼성전자주식회사 핵산 분리 방법
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