EP4188966A1 - Polysaccharide comportant un groupement chélatant soluble à ph physiologique et utilisation de celui-ci - Google Patents

Polysaccharide comportant un groupement chélatant soluble à ph physiologique et utilisation de celui-ci

Info

Publication number
EP4188966A1
EP4188966A1 EP21759335.9A EP21759335A EP4188966A1 EP 4188966 A1 EP4188966 A1 EP 4188966A1 EP 21759335 A EP21759335 A EP 21759335A EP 4188966 A1 EP4188966 A1 EP 4188966A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polysaccharide
group
equal
polysaccharide according
dotaga
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21759335.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Tillement
François LUX
Fabien ROSSETTI
Marco NATUZZI
Thomas BRICHART
Laurent David
Paula NUNES DE OLIVEIRA
Alexandra Montembault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Mexbrain SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Mexbrain SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Mexbrain SAS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4188966A1 publication Critical patent/EP4188966A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/126—Linear polymers, e.g. dextran, inulin, PEG
    • A61K49/128—Linear polymers, e.g. dextran, inulin, PEG comprising multiple complex or complex-forming groups, being either part of the linear polymeric backbone or being pending groups covalently linked to the linear polymeric backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • Polysaccharide comprising a chelating group soluble at physiological pH and use thereof
  • This disclosure relates to the field of compounds bearing a chelating group.
  • the invention relates to polysaccharides chelated or capable of chelating one or more metals and their uses in various techniques such as dialysis for homeostasis, MRI imaging, Curie therapy or even anti-counterfeiting marking of foodstuffs.
  • Polysaccharides are polymers derived from plant, fungal, animal or bacterial biomass. These polymers have a wide variety of physicochemical properties and can be shaped for a wide range of biological applications.
  • the chemical modification of polysaccharides makes it possible to adapt their properties, in particular their solubility in aqueous medium at pH close to neutrality.
  • Their functionalization by highly specific chelating agents also allows applications in the biomedical field. Indeed, after grafting these motifs on the structure of polysaccharides, the polymer could be used as a detoxifier to purify living organisms of pathogenic metals as part of maintaining homeostasis.
  • chelation therapies aimed at reducing the concentration of metal ions have already been used for many years in cases of acute poisoning.
  • a number of chelating agents are already accepted in humans, each associated with a particular metal group (G. Crisponi et al., Coordination Chemistry Reviews, 2015).
  • More and more scientific studies highlight the important role that metals could have in a number of neurological disorders, in particular iron, but also copper, zinc, manganese and even aluminum and lead (EJ McAllum et al., J. Mol. Neurosci., 2016).
  • Patent application WO 2019/122790 discloses a medical device that can be introduced into the body for maintaining metal homeostasis for therapeutic purposes comprising a chelating agent for extracting metals.
  • a device comprising a chelating agent that can be used to capture a metal in an organism can potentially be introduced into the organism in an already chelated form.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • Curie therapy or even the anti-counterfeiting marking of foodstuffs.
  • an object of the invention is to provide a polysaccharide comprising a chelating agent which can be introduced into an organism in chelated or non-chelated form for its use in various applications.
  • the invention relates to a random polysaccharide with a weight-average molecular mass of between 100 kDa and 1000 kDa of formula I:
  • each Rc independently represents a group comprising a chelating agent
  • each Z independently represents a binder which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family
  • x is between 0.005 and 0.7, preferably between 0, 05 and 0.7, and preferably between 0.2 and 0.6
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2
  • the ratio y/x being greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15
  • the sum x+y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35.
  • the invention also relates to the use of said polysaccharide in a dialysis process for the capture of at least one metal.
  • the invention also relates to the use of said polysaccharide in an MRI imaging process.
  • the invention is also directed towards the use of said polysaccharide in a Curie-therapy process.
  • the invention also relates to the use of said polysaccharide in a process for the anti-counterfeiting of foodstuffs.
  • Figure 1 is an HPLC-UV chromatogram obtained using a SEC Phenomenex GFC-P 4000 column of a polysaccharide according to the invention.
  • Figure 2 is 1 F1 NMR spectrum of a polysaccharide according to the invention.
  • FIG. 3 is a graph representing the luminescence intensity at 594 nm as a function of the amount of europium added in a solution comprising a polysaccharide according to the invention.
  • FIG. 4 represents a thermogravimetric analysis graph of a chitosan with a weight-average molecular mass of 600 kDa with an acetylation rate of 0.5% and of a polysaccharide according to the invention grafted with DOTAGA ( graph A) and a graph representing the derived curves (graph B).
  • Figure 5 represents the deconvolution of two Fourier transform infrared spectra.
  • FIG. 6 represents two graphs of the evolution of the quantity of metals as a function of time in a solution dialyzed by ultrapure water (graph A) and a dialysis fluid comprising a polysaccharide according to the invention grafted with DOTAGA (graph B).
  • FIG. 7 represents three graphs of the evolution of the quantity of metals as a function of time in a dialysis fluid comprising a polysaccharide according to the invention grafted with DOTAGA.
  • Figure 8 is a FIPLC-UV chromatogram obtained using an SEC Phenomenex GFC-P 4000 column of a polysaccharide according to the invention (Example 8).
  • Figure 9 is a graph representing the absorbance at 425 nm as a function of the amount of iron added in a solution comprising a polysaccharide according to the invention (example 8).
  • the invention relates to a random polysaccharide with a weight-average molecular mass of between 100 kDa and 1000 kDa of formula I:
  • each Rc independently represents a group comprising a chelating agent
  • each Z independently represents a binder which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family
  • x is between 0.005 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.7, preferably between 0.2 and 0.6, and more preferably between 0.25 and 0.4
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2, the y/x ratio being greater than or equal to 0.05, of preferably greater than or equal to 0.15, and the sum x+y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35.
  • Rc groups may be present in the polysaccharide. These Rc groups can be identical to or different from each other. They are all independently chosen from the groups carrying a chelating agent.
  • Z binders several Z binders may be present, and they may be identical or different from each other.
  • x is between 0.005 and
  • y is between 0.1 and 0.9, the ratio y/x being greater than 0.16, and the sum x+y being greater than 0.4.
  • the polysaccharide according to the invention has a complexation constant of at least 10 15 for a transition element d or f.
  • the polysaccharide of formula I is a polysaccharide of formula II: in which :
  • Rci and RC2 are different, and are groups comprising a chelating agent, Zi and Z2, which are identical or different, are binders which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and which may contain one or more unsaturations and which may contain one or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family,
  • x is between 0.005 and 0.7, of preferably between 0.05 and 0.7, preferably between 0.2 and 0.6, and more preferably between 0.25 and 0.4
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2, the ratio y/x being greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15, the sum x + y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0 .35 , and
  • z is between 0.5 and 1.
  • polysaccharide of formula II may comprise:
  • z is between 0.8 and 0.99, the Rci group is therefore by far the majority.
  • x is between 0.005 and 0.6
  • y is between 0.1 and 0.9
  • the y/x ratio being greater than 0.16
  • the sum x + y being greater than 0.4
  • z is between 0.5 and 1 .
  • Rc-type groups (Rc, Rci and RC2)
  • Rc-type group means the Rc groups in the polysaccharide of formula I, and the Rci and RC2 groups, when the RC2 group is present, in the polysaccharide of formula II.
  • the Rc, Rci and RC2 groups are chelating agents.
  • the Rc, Rci and RC2 groups make it possible to chelate one or more metals by forming a complex.
  • Each of the Rc, Rci and RC2 groups can contain one or more coordination sites.
  • the coordination site is a nitrogen or oxygen atom.
  • each of the Rc, Rci and Rc2 groups comprises between 4 and 8 coordination sites, more advantageously between 6 and 8 coordination sites and even more advantageously each of the Rc, Rci and RC2 groups comprises 8 coordination sites. coordination.
  • coordination site means a single function capable of chelating a metal.
  • an amine function represents a coordination site by the formation of a dative bond between the nitrogen atom and the metal and a hydroxamic acid function also represents a coordination site by the formation of a dative bond between the oxygen of the carbonyl unit and by a covalent bond with the oxygen of the N-oxide unit the coordination site thus forming a five-membered ring.
  • each Rc group is independently chosen from the group consisting of DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N ”,N'”-teracetic), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane-1-glutaric-4,7-diacetic acid ), DOTAGA (2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic acid), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl) -1,4,7,10 tetraazacyclododecane), NOTAM (1,4,7-tetrakis(carbamoylmethyl)-1,4,7-triazacyclononane), DOTP (1,4,7,10-tetrakis(carbamoy
  • Rci and RC2 are independently selected from the group consisting of DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM , DTPA and DFO, preferably from the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA.
  • the Rci group is DOTAGA and the Rc2 group is DFO.
  • Z-type binder is understood to mean the Z binders in the polysaccharide of formula I, and the Z1 and Z2 binders, when the Z2 binder is present, in the polysaccharide of formula II.
  • binders Z, Z ⁇ and Z2 in formulas I and II essentially depends on the groups Rc, Rci and RC2 and the metal to be chelated. Indeed, for steric reasons in particular, the groups Rc, Rci and RC2 can be more or less close to the 6-membered ring of the nitrogen of the glucosamine unit.
  • each Z is independently a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more several heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family.
  • each Z is independently selected from the group consisting of: a bond, a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, and a linear or branched alkenyl chain comprising between 2 and 12 carbon atoms, said alkyl and alkenyl chains possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S -, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'-, -NR'- C(O)-, -NR'-C(0)-NR'-, -NR'- C(0)-0-, -0-C(0)NR', -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'- C(S)-NR' said chains alkyl and alkenyl which may be substituted by one or more groups selected from the group consisting of halogen,
  • each Z is independently selected from the group consisting of: a bond and a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl chain possibly being interrupted by one or more groups C6-C10 aryl, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'- , -NR'-C(O)-, -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR', each R' is independently H or a C1-C6 alkyl .
  • each Z is an alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms.
  • each Z is a polyethylene glycol (PEG).
  • Z1 and Z2 are independently a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising a or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family.
  • Zi and Z2 are independently selected from the group consisting of: a bond, a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, and a linear alkenyl chain or branched chain comprising between 2 and 12 carbon atoms, said alkyl and alkenyl chains possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, - S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'-, -NR'- C(O)-, -NR'-C(0)-NR'-, -NR' -C(0)-0-, -0-C(0)NR', -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR' said alkyl and alkenyl chains which may be substituted by one or more groups selected from the group consisting of
  • Z1 and Z2 are independently selected from the group consisting of: a bond and a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl chain possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR' -, -NR'-C(O)-, -C(S)NR'-, -NR'- C(S)-, -NR'-C(S)-NR', each R' is independently H or a C1-C6 alkyl .
  • Z1 and/or Z2 is an alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms.
  • Z1 and/or Z2 is a polyethylene glycol (PEG).
  • the polysaccharide according to the invention is composed of 3 monomeric units, namely an N-acetylglucosamine type A unit, a glucosamine type B unit and a glucosamine type C type unit functionalized with a chelating agent (of type Rc) bound by a (Z-type) linker to the glucosamine nitrogen.
  • the polysaccharide according to the invention is a random polymer. In other words, the sequence of the different A, B and C-type monomeric units is random.
  • x represents the proportion of A units and x can be between 0.05 and 0.7, preferably x is between 0.2 and 0.6, so more preferably x is between 0.25 and 0.4.
  • y represents the proportion of C-type units and y can be between 0.01 and 0.7.
  • the y/x ratio may be greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15.
  • the effectiveness of the product is determined by the number of chelation sites, directly linked to the number of metals necessary for example for detection by imaging.
  • the polysaccharide according to the invention must be soluble at physiological pH.
  • the sum x+y can be greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35.
  • x is between 0.2 and 0.6, more preferably x is between 0.25 and 0.4.
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2.
  • z is between 0.5 and 1.
  • the units of type C can be exclusively units comprising as binder Zi and as group carrying a chelating agent Rci.
  • the polysaccharide according to the invention has a weight-average molecular mass of between 100 kDa and 1000 kDa, advantageously, the weight-average molecular mass of the polysaccharide according to the invention is between 250 kDa and 750 kDa, more advantageously between 400 kDa and 600 kDa and even more advantageously between 450 kDa and 550 kDa.
  • the polysaccharide is chosen from the following polysaccharides:
  • Rci is DOTAGA and Zi is a bond
  • RC2 is DFO and Z2 is selected from the group consisting of: a bond and a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl chain possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O )-, -NR'-, -C(0)NR'-, -NR'-C(O)-, -C(S)NR'-, -NR'- C(S)-, -NR'- C(S)-NR', each R' is independently H or C1-C6 alkyl.
  • the polysaccharide of formula I or II according to the invention can be obtained from chitosan, partially acetylated or not, in particular by acetylation of part of the amine functions then functionalization of at least part of the amine functions. still present after acetylation.
  • the process for obtaining the polysaccharide according to the invention comprises at least the following three successive steps:
  • Step 1 solubilization of a chitosan in an acid solution at a pH between 4 and 5; • Stage 2: partial acetylation of the amine functions of the chitosan dissolved in stage 1 (formation of the A units);
  • Step 3 functionalization of at least some of the amine functions still present at the end of step 2 (formation of type C units).
  • step 3 of the process can be repeated several times.
  • the method may comprise two steps 3 of functionalization of at least part of the amine functions, a first to introduce the Rci groups and a second to introduce the Rc2 groups .
  • Step 3 can be subdivided into several sub-steps, in particular when the binder Z is a hydrocarbon chain as defined above.
  • step 3 may comprise a sub-step 3-1 consisting in grafting said hydrocarbon chain onto at least some of the amine functions, always present at the end of step 2, then a sub-step 3-2 consisting in the grafting of the group of Rc type on said hydrocarbon chain.
  • step 3 does not include a sub-step.
  • said hydrocarbon chain is coupled with the Rc-type group prior to step 3, said step 3 is then carried out with a molecule comprising the Rc-type group and said hydrocarbon chain.
  • the polysaccharide according to the invention can be obtained from a chitosan having the desired acetylation rate, thus, in this embodiment, the A units are already present and do not need to be formed.
  • the process for obtaining the polysaccharide according to the invention comprises at least the following two successive steps:
  • Step 1b solubilization of a partially acetylated chitosan (unit A) in an acid solution at a pH between 4 and 5; • Step 2b: functionalization of at least some of the amine functions of said partially acetylated chitosan dissolved in step 1b (formation of type C units).
  • step 2b of the process can be repeated several times, when several different Rc-type groups are present.
  • said step 2b can be subdivided into several sub-steps, in particular when the Z-type binder is a hydrocarbon chain as defined above.
  • step 2b may comprise a sub-step 2b-1 consisting in grafting said hydrocarbon chain onto at least some of the amine functions, then a sub-step 2b-2 consisting in the grafting of the group of Rc type on said hydrocarbon chain.
  • step 2b does not include a sub-step.
  • said hydrocarbon chain is coupled with the Rc-type group prior to step 2b, said step 2b is then carried out with a molecule comprising the Rc-type group and said hydrocarbon chain.
  • the method may comprise a step 4 of chelation of the polysaccharide with at least one metal.
  • the polysaccharide according to the invention can be used in various applications thanks to its solubility at physiological pH.
  • Rc-type groups make it possible to chelate a metal, therefore it can be envisaged to introduce said polysaccharide into an organism in two different forms, (i) in chelated form, that is to say that the polysaccharide chelates at least a metal, or (ii) in free form, i.e. the polysaccharide does not chelate a metal.
  • the polysaccharide is in the free form, this means that less than 5% of the Rc-type chelating groups are complexed, in particular, less than 5% of the Rc-type chelating groups chelate ions of interest.
  • the invention also relates to the use of said polysaccharide in a dialysis process for the capture of at least one metal, in an MRI imaging process, in a curie-therapy process or yet in an anti-counterfeit marking process for foodstuffs.
  • polysaccharide When the polysaccharide is used in a dialysis process for the capture of at least one metal, said polysaccharide is in free form, to allow the capture of at least one metal.
  • the polysaccharide When the polysaccharide is used in an MRI imaging process, in a Curie-therapy process or even in a process for the anti-counterfeiting of foodstuffs, said polysaccharide chelates at least one metal.
  • the polysaccharide according to the invention can be used as such, or formulated in a composition. In the case where the polysaccharide is formulated in a composition, said polysaccharide is advantageously in the form of a hydrogel.
  • the dialysis is MARS dialysis or CSF dialysis.
  • the metal preferably belongs to the group consisting of copper, iron, lead, zinc, aluminum, gadolinium and manganese and more preferably from the group consisting of copper, iron and lead.
  • the groups of Rc type are preferably chosen from the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA.
  • x is preferably between 0.25 and 0.4.
  • y is preferably between 0.05 and 0.2.
  • the y/x ratio is preferably between 0.15 and 1.5.
  • the sum x+y is preferably between 0.35 and 0.8.
  • said polysaccharide When the polysaccharide is used in an MRI imaging process, said polysaccharide chelates at least one metal.
  • the metal preferably belongs to the group consisting of gadolinium, iron, manganese and dysprosium and more preferably the metal is gadolinium.
  • z is preferably equal to 1 and the Rci group is preferably DOTAGA.
  • x is preferably between 0.05 and 0.35.
  • y is preferably between 0.1 and 0.7.
  • said polysaccharide When the polysaccharide is used in a Curie-therapy process, said polysaccharide chelates at least one metal.
  • Metal is a radioactive isotope.
  • the metal when used in a Curie therapy process, preferably belongs to the group of radioactive isotopes consisting of 177 Lu, 166 Ho, 212 Bi, 213 Bi, 90 Y and 225 At.
  • z is preferably equal to 1 and the Rci group is preferably chosen from the group consisting of DOTAGA.
  • said polysaccharide When the polysaccharide is used in an anti-counterfeit marking process for foodstuffs, said polysaccharide chelates at least one metal.
  • the metal preferably belongs to the group consisting of lanthanides and bismuth.
  • the Rc type groups are preferably chosen independently from the group consisting of DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM , DOTP, NOTP, TETA and TETAM.
  • cyclic chelating agents are in fact advantageous in order to avoid transmetallation.
  • Acetic anhydride (>99%) and propane-1,2-diol were supplied by Sigma-Aldrich (France), DOTAGA anhydride, DTPA-Bisanhydride and p-NCS-Bz-DFO ( N1-hydroxy-N1-(5-(4-(hydroxy(5-(3-(4- isothiocyanatophenyl)thioureido)pentyl)amino)-4-oxobutanamido)pentyl)-N4-(5-(N- hydroxyacetamido)pentyl )succinamide) were supplied by CheMatech (France), DMSO was supplied by Fischer Chemicals) ultra-pure water (Milli-Q water) was obtained using an Eolia filtration system.
  • the chitosan was supplied by Mahtani, the GdCb by Sanofi, the KBr and all the metal salts used in example 4 (nitrates of Al, Mn, Cu, Pb and Zn) by Sigma-Aldrich (France).
  • the tangential filtration is carried out by means of a Sartoflow Smart tangential filtration machine with Sartocon Slice 200 membranes in polyethersulfone with a cut-off threshold of 100 kDa.
  • the HPLC-UV is carried out with an Agilent 1200 apparatus with a DAD detector.
  • the steric exclusion column used is a Polysep-GFC-P-4000 with a 0.1 M acetic acid/ammonium acetate buffer as eluent.
  • the detection is carried out by a UV detector at a wavelength of 295 nm.
  • the analyte is injected at a concentration of approximately 10 g. L -1 .
  • UV-Vis spectrophotometry studies were carried out on a Cary 50 UV-VIS device from the company Varian.
  • the proton NMR spectroscopy was carried out on a Brucker Avance III 400 MHz at room temperature. All samples were dissolved at 8 mg/mL in deuterated water (D2O) comprising 5 pL of 12N HCL and placed in 5 mm NMR tubes.
  • D2O deuterated water
  • the TMPSA is used as an internal reference.
  • the relaxivity at 1.5T was carried out with an apparatus of the Minispec mq-60 type from Brucker (Karlsruhe, Germany).
  • step 1 60 g of chitosan, 4 L of ultra-pure water and 45 mL of glacial acetic acid are introduced into a 10 L reactor and placed under stirring for a period of 16 hours at a pH of 4.5 ⁇ 0.5. A pale yellow solution is obtained.
  • step 2 1.2 L of propane-1,2-diol are added to the pale yellow solution obtained in step 1 and stirring is maintained for 1 hour.
  • a solution composed of 14 mL of acetic anhydride dissolved in 600 mL of propane-1,2-diol is then added slowly over 10 min in order to obtain homogeneous acetylation along the polymer chain, the reaction medium is kept under stirring for 4 hrs.
  • the acetylation rate can be determined by elemental analysis.
  • the non-acetylated unit of the polysaccharide (unit B) has a molar mass of 161.2 g. mol 1 (C6NO 4 H 11 ) while the acetylated unit (unit A) has a molar mass of 203.2 g.
  • step 3 2 L of the solution obtained in acetylation step 2 are placed in a stirred reactor. 120 g of DOTAGA anhydride are then added and stirring is maintained for 16 h. At the end of this reaction, the solution is diluted by 10 in ultra-pure water and purified by tangential filtration using a 100 kDa membrane. After a first step of re-concentration up to 16 L, the solution is filtered with 480 L of 0.1 M acetic acid solution at constant volume (16 L), followed by 320 L of ultra-pure water and another step of re-concentration up to 8 L. The HPLC-UV makes it possible to verify that the DOTAGA has indeed been eliminated (FIG. 1).
  • the peak around 7 min corresponds to the polymer while the peak around 11 min corresponds to the non-grafted DOTAGA.
  • the solution with a polysaccharide concentration of 10 g/L is then filtered through a nylon filter (0.4 ⁇ m) before freeze-drying.
  • the proton NMR makes it possible to determine the level y of functionalization by the DOTAGA on the polysaccharide by knowing the level x of acetylation.
  • the non-grafted and non-acetylated unit (unit B) consists of 7 protons, covalently bonded to carbon atoms, with a chemical shift between 2.9 and 4.3 ppm.
  • the acetylated unit (unit A) has these same 7 protons as well as 3 protons, covalently bonded to a carbon atom, present on the acetyl characterized by a chemical shift between 2 and 2.2 ppm.
  • the unit grafted with DOTAGA (unit C) includes 34 protons, covalently bonded to carbon atoms, of which 32 integrate between 2.9 and 4.3 ppm and 2 integrate between 2 and 2.2 ppm.
  • the NMR spectrum represented in figure 2 makes it possible, thanks to the integrations of the different masses, to determine the values of y thanks to the following equation:
  • the rate of grafted units (unit C) can also be determined by fluorescence with europium. Europium indeed presents a luminescence mainly centered around 590 ( 5 Do -> 7 Fi) and 615 nm ( 5 Do -> 7 F2). This luminescence is extinguished when the europium ion is coordinated only with water molecules.
  • the principle of the method for determining the rate of grafted units is to add increasing amounts of europium, so that it is chelated, the luminescence then increases, when all the chelation sites are filled, the luminescence reaches a plateau.
  • the polysaccharide obtained at the end of step 3 was placed in an acetate buffer at pH 5, a europium chloride salt dissolved in the acetate buffer was then added.
  • step 1b 3 g of a chitosan with an average mass of 600 kDa having an acetylation rate of 0.5%, 150 mL of ultra-pure water and 2.1 mL of glacial acetic acid are introduced into a 1 L reactor and placed under stirring for a period of 16 hours at a pH of 4.5 ⁇ 0.5. A pale yellow solution is obtained.
  • step 1b Following solubilization step 1b, 150 mL of propane-1,2-diol are added to the above solution and stirring is maintained for 1 hour. 11 g of DOTAGA anhydride are then added and stirring is maintained for 16 h. At the end of this reaction, the light brown solution is diluted by 10 in ultra-pure water and purified by tangential filtration using a 100 kDa membrane. This first purification cycle is followed by a second using ultra-pure water to purification by a factor of 50. The following filtrations are carried out in 0.01 M HCl for a final purification factor of 1250.
  • the grafting by DOTAGA was shown by thermogravimetric analysis using a TA Instruments TGA-Q500 device with heating at 10° C./min, under an inert atmosphere, from 30° C. to 700°C.
  • the grafting of DOTAGA induces a reduction in the degradation temperature proportional to the degree of grafting.
  • thermogravimetric analyzes graph (A) of FIG. 4
  • graph (B) of FIG. 4 makes it possible to deduce that the step of functionalization has been effective.
  • D s is the degree of substitution of the analyzed chitosan
  • A' ( 1590 ) is the area of the band at 1590 cm 1 of the IR spectrum of the chitosan to be analyzed
  • A'T is the total area of the IR spectrum of the chitosan at analyze
  • a ref (1590) is the area of band IV at 1590 cm 1 of the IR spectrum of the reference chitosan
  • Ane f is the total area of the spectrum of the reference chitosan
  • a degree of grafting of DOTAGA close to 60% (spectrum (B)) is then obtained.
  • step 1 0.25 g of chitosan, 25 ml_ of ultra-pure water and 0.18 ml_ of glacial acetic acid are introduced into a 250 ml_ reactor and placed under stirring for a period of 16 hours at a pH of 4.5 ⁇ 0.5. A pale yellow solution is obtained.
  • step 2 5 ml_ of propane-1,2-diol are added to the pale yellow solution obtained in step 1 and stirring is maintained for 1 hour.
  • a solution composed of 0.045 ml of acetic anhydride dissolved in 5 ml of propane-1,2-diol is then added slowly over 10 min in order to obtain homogeneous acetylation along the polymer chain, the reaction medium is kept under stirring for 4 hrs.
  • step 3 a solution composed of 0.346 g of DTPA-Bisanhydride dissolved in 15 ml of propane-1,2-diol and 16.58 ⁇ l of ultra-pure water is kept under stirring for 1.5 h. Then this solution is added to the solution obtained in step 2 and stirring is maintained for 16 h. At the end of this reaction, the solution is diluted by 10 by adding ultra-pure water and purified by tangential filtration using a 100 kDa membrane. The following filtrations are carried out in ultra-pure water for a final purification factor of 6250. The solution at a concentration of 5 g/L is then freeze-dried.
  • Example 4 use of the polymer of example 1 for the capture of metals
  • Example 1 The polysaccharide synthesized in Example 1 was formulated to be incorporated into a hemodialysis dialysate in order to demonstrate its ability to perform metal extraction in the context of conventional hemodialysis.
  • a Dialife DIAPH06 high-flux hemodialyzer, a Cole Parmer 7555-05 Masterflex peristaltic pump, Masterflex L/S PharMed BPT Tubing, L/S #16 were used.
  • the metal solution used here was made to have approximately 50 ppb of Cu, Zn, Pb, Al and Mn in 5 L of water. The flow rate is 200 mL/min and the temperature 37°C.
  • a dialysate containing only water was compared to a dialysate comprising 0.001 mol.L 1 of DOTAGA, corresponding to 1.6 g/L of the polysaccharide synthesized in Example 1.
  • a higher uptake is observed for the dialysis fluid comprising the functionalized polymer 25 min after the start of the dialysis by ICP/MS analysis (FIG. 6).
  • the quantity of metal present in the solution to be dialyzed is indeed 30 against 42 ppb for manganese, 18 against 46 ppb for zinc, 7 against 46 ppb for copper and 8 against 55 ppb for lead after dialysis with the solution of the polysaccharide of example 1 in comparison with a dialysis carried out with an aqueous solution containing no polysaccharide according to the invention.
  • Example 5 use of the polymer of example 1 in a pig blood dialysis process for the capture of metals
  • Example 4 In order to demonstrate the uptake capacity in a biological medium, an experiment similar to that described in Example 4 was carried out with pig blood instead of the metallic aqueous solution presented in Example 4.
  • a Dialife 20HP high-flux hemodialyzer, three Cole Parmer peristaltic pumps (7555-05, 7523-80 and 7523-90) Masterflex, Masterflex L/S PharMed BPT Tubing, L/S #16 and Ismatec SC0328 PharMed BPT Tubing were used.
  • 10 L of pig blood were dialysed at different flow rates: 200 mL/min (from 0 to 10 min and from 70 to 80 min), 100 mL/min (from 10 to 30 min) and 50 mL/min (from 30 at 70 min) respectively.
  • the dialysis fluid was formulated with the polysaccharide synthesized in Example 1 at a concentration of 0.001 mol.L 1 .
  • the results of the study after analysis by ICP/MS are presented in FIG. 7.
  • a strong increase in the levels of Zn, Fe and Pb is observed in the dialysis fluid comprising the polysaccharide synthesized in example 1 in comparison with dialysis carried out without the polysaccharide synthesized in Example 1.
  • the quantity of metal present in the dialysate solution is thus 83 against 20 ppb for zinc, 257 against 55 ppb for copper and 2604 against 62 ppb for iron.
  • Example 6 Addition of gadolinium to obtain an imageable polymer in MRI After the purification of Example 2, 4.9 g of gadolinium chloride hexahydrate are added to the solution, the pH is then adjusted to 5 and the solution is left under stirring at 80° C. for 48 hours. The pH is continuously adjusted to 5 with 0.5 M sodium hydroxide until it becomes stable, indicating that the DOTAGA has complexed all the Gd 3+ ions.
  • the polysaccharide according to the invention complexed with gadolinium in Example 6 was implemented in an MRI imaging process.
  • the r2/n ratio is 1.4 which is typical of a positive contrast agent.
  • the longitudinal relaxivity is a little less than 4 times greater than that of commercial contrast agents ( ⁇ 4 mM 1 .s 1 ).
  • Example 8 Preparation of a polysaccharide according to the invention with an acetylation rate of 40% (x-0.4) and a grafting rate of DOTAGA and DFO of 11% in all (y-0.11) at from a chitosan with an average mass of 250 kDa
  • the chitosan-DOTAGA was synthesized beforehand as described in example 1.
  • a volume of 720 mL of purified chitosan-DOTAGA at a concentration of 7 g/L is inserted into a 2L flask.
  • This solution (pH between 6 and 6.5) is supplemented with ultra-pure water to reach a total volume of 900 mL.
  • 143.1 mg of p-NCS-Bz-DFO are weighed and dissolved in 100 mL of DMSO. This solution is then added drop by drop to the chitosan-DOTAGA solution. The solution is kept under stirring and heated at 40° C. overnight.
  • the solution is then purified with ultrapure water using the STARTOFLOW SMART purification machine with a PES membrane with a cut-off threshold of 100 kDa up to a purification rate of 545.
  • the solution at a concentration of 5.1 g/L is then freeze-dried.
  • HPLC-UV analysis of the product makes it possible to confirm the grafting of the DFO and the elimination of the residual p-NCS-Bz-DFO.
  • the comparison of the analyzes HPLC-UV of chitosan-DOTAGA and chitosan-DOTAGA-DFO shows an increase in polymer peak absorption (around 7 min) when p-NCS-Bz-DFO is grafted ( Figure 8).
  • the amount of p-NCS-Bz-DFO grafted can be determined by UV-Vis spectrophotometric assay at the maximum absorption wavelength of the DFO-iron complex (425 nm).
  • Increasing concentrations of iron (III) are added to a solution of chitosan-DOTAGA-DFO at 0.1 g/L in an acetate buffer at pH 4.5 (0.1 M ammonium acetate and 0.1 M acetic acid).
  • the absorption measured at 425 nm is then plotted as a function of the iron concentration and a break in slope is observed for 35 mM of iron (Figure 9).
  • a molecule of DFO can complex a single atom of iron, so 1 gram of polymer contains 35 ml of DFO.

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Abstract

L'invention concerne un polysaccharide statistique de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100kDa et 1000kDa de formule (I) suivante : dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l'azote, l'oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, et préférentiellement entre 0,2 et 0,6, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35. L'invention a également trait à l'utilisation dudit polysaccharide dans un procédé de dialyse pour la captation d'au moins un métal, dans un procédé d'imagerie IRM., dans un procédé de Curie-thérapie ou dans procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.

Description

Polysaccharide comportant un groupement chélatant soluble à pH physiologique et utilisation de celui-ci
Domaine technique
[0001] La présente divulgation relève du domaine des composés porteur d’un groupe chélatant. En particulier, l’invention concerne les polysaccharides chélatés ou pouvant chélater un ou plusieurs métaux et leurs utilisations dans des techniques diverses telles que la dialyse pour l’homéostasie, l’imagerie par IRM, la Curie thérapie ou encore le marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.
Technique antérieure
[0002] Les polysaccharides sont des polymères issus de la biomasse végétale, fongique, animale ou bactérienne. Ces polymères possèdent des propriétés physicochimiques très variées et peuvent être mis en forme pour un large éventail d’applications biologiques. La modification chimique des polysaccharides permet d’adapter leurs propriétés, en particulier leur solubilité en milieu aqueux à des pH proches de la neutralité. Leur fonctionnai isation par des agents chélatants hautement spécifiques permet également des applications dans le domaine biomédical. En effet, après greffage de ces motifs sur la structure de polysaccharides, le polymère pourrait être utilisé en tant que détoxifiant pour purifier les organismes vivants de métaux pathogènes comme dans le cadre du maintien de l’homéostasie.
[0003] Le maintien de l’homéostasie du milieu intérieur de l’organisme, c’est-à-dire de l’ensemble des liquides ou fluides biologiques de l’organisme, est nécessaire au bon fonctionnement de ce dernier. Dans de nombreuses pathologies, des dysrégulations systémiques ou locales de l’homéostasie des métaux et/ou de peptides ou protéines ont été mises en évidence.
[0004] En ce qui concerne les métaux, des thérapies de chélation, visant à diminuer la concentration en ions métalliques sont déjà utilisées depuis de nombreuses années dans les cas d’intoxications aigues. Ainsi, un certain nombre de chélatants sont déjà acceptés chez l’homme, chacun étant associé à un groupe de métaux particuliers (G. Crisponi et al., Coordination Chemistry Reviews, 2015). [0005] De plus en plus d’études scientifiques mettent en avant le rôle important que pourraient avoir les métaux dans nombre d’atteintes neurologiques, notamment le fer, mais également le cuivre, le zinc, le manganèse et même l’aluminium et le plomb (E. J. McAllum et al., J. Mol. Neurosci., 2016). C’est en particulier le cas pour la neurodégénérescence avec surcharge en fer qui est une maladie rare associée à une anomalie génétique liée à une accumulation du fer dans certaines zones du cerveau et qui ne bénéficie à ce jour que de traitements palliatifs (S. Wiethoff et al., Handb. Clin. Neurol., 2017). Par ailleurs, de nombreuses études ont montré que le fer avait tendance à s’accumuler dans le cerveau avec l’âge (J. Acosta-Cabronero et al., Journal of Neuroscience, 2016). La maladie de Wilson est aussi une maladie génétique entraînant une accumulation de cuivre dans l’organisme et entraînant différents problèmes en particulier hépatiques et/ou neurologiques (Anna Cztonkowskal et al., Nature Rev., 2018).
[0006] Plusieurs maladies neurologiques telles qu’Alzheimer, Parkinson et la maladie d’Huntington s’accompagnent également d’accroissement de la quantité de fer dans des zones spécifiques entraînant des dommages cellulaires ainsi que du stress oxydant (A. A. Belaidi et al., Journal of Neurochemistry, 2016). A titre d’exemple, la maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative se traduisant par des troubles du mouvement, un déclin cognitif et des problèmes d’ordre psychiatriques. Dans cette pathologie, de nombreux marqueurs du stress oxydant sont observés au niveau du cerveau qui peut être relié à une dérégulation de l’homéostasie du fer (S. J. A. van den Bogaard et al., International Review of Neurobiology, 2013). L’augmentation du niveau de fer au niveau de plusieurs régions du cerveau (putamen, noyau caudé et pallidum) a été ainsi validée par plusieurs études IRM dont celle de Bartzorkis (G. Bartzorkis et al., Archives of Neurology, 1999).
[0007] Dans la maladie d’Alzheimer notamment, il a été mis en évidence des interactions entre certains ions métalliques, notamment des ions issus de métaux tels le zinc, le fer ou le cuivre, avec les peptides Ab pouvant conduire à une agrégation accrue des protéines (Tougu et al. Metallomics, 2010). [0008] Il est ainsi admis que dans de nombreuses protéinopathies, les cations métalliques jouent un rôle important dans la formation de configurations anormales de certaines protéines, en particulier certains favorisent la formation d’agrégats, fibrilles ou autres dépôts solides. Dans les protéinopathies, on serait ainsi localement dans une double dérégulation de l’homoéostasie, dérégulation de l’homéostasie de certains métaux et dérégulation de l’homéostasie de molécules cibles de type protéines, à l’origine des agrégats et autres dépôts solides.
[0009] La demande de brevet WO 2019/122790 divulgue un dispositif médical pouvant être introduit dans l’organisme pour le maintien de l’homéostasie métallique à des fins thérapeutiques comprenant un agent chélatant permettant d’extraire des métaux.
Problème technique
[0010] S’il existe donc des dispositifs médicaux qui donnent satisfaction, il est toujours bénéfique d’améliorer les résultats obtenus à ce jour. Par ailleurs, un dispositif comprenant un agent chélatant pouvant être utilisé pour capter un métal dans un organisme peut potentiellement être introduit dans l’organisme sous une forme déjà chélatée. Dans cette dernière configuration, d’autres applications très variées sont envisageables, comme l’imagerie à résonance magnétique (IRM), la Curie thérapie, ou encore le marquage anti-contrefaçon de denrée alimentaires.
[0011] Ainsi, un objectif de l’invention est de proposer un polysaccharide comportant un agent chélatant pouvant être introduit dans un organisme sous forme chélatée ou non pour son utilisation dans diverses applications.
Résumé de l’invention
[0012] L’invention concerne un polysaccharide statistique de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100kDa et 1000kDa de formule I :
Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, et préférentiellement entre 0,2 et 0,6, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[0013] L’invention a également trait à l’utilisation dudit polysaccharide dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal.
[0014] L’invention concerne aussi l’utilisation dudit polysaccharide dans un procédé d’imagerie IRM.
[0015] L’invention est en outre dirigée vers l’utilisation dudit polysaccharide dans un procédé de Curie-thérapie. [0016] L’invention se rapporte également à l’utilisation dudit polysaccharide dans un procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.
Brève description des dessins
[0017] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0018] [Fig. 1] La figure 1 est un chromatogramme HPLC-UV obtenu en utilisant une colonne SEC Phenomenex GFC-P 4000 d’un polysaccharide selon l’invention.
Fig. 2
[0019] [Fig. 2] La figure 2 est Spectre RMN 1FI d’un polysaccharide selon l’invention.
Fig. 3
[0020] [Fig. 3] La figure 3 est un graphique représentant l’Intensité de luminescence à 594 nm en fonction de la quantité d’europium ajoutée dans une solution comprenant un polysaccharide selon l’invention.
Fig. 4
[0021] [Fig. 4] La figure 4 représente un graphique d’analyse thermogravimétrique d’un chitosane de masse moléculaire moyenne en poids de 600 kDa avec un taux d’acétylation de 0,5% et d’un polysaccharide selon l’invention greffé avec du DOTAGA (graphique A) et un graphique représentant les courbes dérivées (graphique B).
Fig. 5
[0022] [Fig. 5] La figure 5 représente la déconvolution de deux spectres infrarouges à transformée de Fourier.
Fig. 6
[0023] [Fig. 6] La figure 6 représente deux graphiques de l’évolution de la quantité de métaux en fonction du temps dans une solution dialysée par de l’eau ultrapure (graphique A) et un fluide de dialyse comprenant un polysaccharide selon l’invention greffé avec du DOTAGA (graphique B).
Fig. 7
[0024] [Fig. 7] La figure 7 représente trois graphiques de l’évolution de la quantité de métaux en fonction du temps dans un fluide de dialyse comprenant un polysaccharide selon l’invention greffé avec du DOTAGA.
[0025] Fig. 8
[0026] La figure 8 est un chromatogramme FIPLC-UV obtenu en utilisant une colonne SEC Phenomenex GFC-P 4000 d’un polysaccharide selon l’invention (exemple 8).
[0027] Fig. 9
[0028] La figure 9 est un graphique représentant l’absorbance à 425 nm en fonction de la quantité de fer ajoutée dans une solution comprenant un polysaccharide selon l’invention (exemple 8). [0029]
Description détaillée de l’invention
[0030] Comme préalablement indiqué, l’invention concerne un polysaccharide statistique de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100kDa et lOOOkDa de formule I :
Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[0031] Il est entendu que, dans la formule I ci-dessus, plusieurs groupements Rc peuvent être présents dans le polysaccharide. Ces groupements Rc peuvent être identiques ou différents les uns des autres. Ils sont tous indépendamment choisis parmi les groupements portant un agent chélatant. Il en va de même des liants Z : plusieurs liants Z peuvent être présents, et ils peuvent être identiques ou différents les uns des autres.
[0032] Selon un mode de réalisation, dans la formule I, x est compris entre 0,005 et
0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, et la somme x + y étant supérieure à 0,4.
[0033] De manière préférée, le polysaccharide selon l’invention présente une constante de complexation d’au moins 1015 pour un élément de transition d ou f.
[0034] Selon un mode de réalisation, le polysaccharide de formule I est un polysaccharide de formule II : dans laquelle :
Rci et RC2 sont différents, et sont des groupements comportant un agent chélatant, Zi et Z2, identiques ou différents, sont des liants pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35 , et z est compris entre 0,5 et 1.
[0035] Dans ce mode de réalisation spécifique, le polysaccharide de formule II peut comprendre :
- un seul type de groupement comportant un agent chélatant, Rci, lorsque z = 1, ou - 2 types de groupements comportant un agent chélatant, Rci et RC2, lorsque 0,5 < z < 1.
[0036] Selon un mode de réalisation, z est compris entre 0,8 et 0,99, le groupement Rci est donc largement majoritaire.
[0037] Selon un autre mode de réalisation, dans la formule II, x est compris entre 0,005 et 0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, la somme x + y étant supérieure à 0,4, et z est compris entre 0,5 et 1 .
Les groupements de type Rc (Rc, Rci et RC2)
[0038] On entend par groupement de type Rc, les groupements Rc dans le polysaccharide de formule I, et les groupements Rci et RC2, lorsque le groupement RC2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.
[0039] Conformément à l’invention, les groupements Rc, Rci et RC2 sont des agents chélatants. En d’autres termes les groupements Rc, Rci et RC2 permettent de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.
[0040] Chacun des groupements Rc, Rci et RC2 peut contenir un ou plusieurs sites de coordination. De préférence, le site de coordination est un atome d’azote ou d’oxygène. De manière avantageuse, chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 comporte entre 4 et 8 sites de coordination, de manière plus avantageuse entre 6 et 8 sites de coordination et de manière encore plus avantageuse chacun des groupements Rc, Rci et RC2 comporte 8 sites de coordination.
[0041] On entend par site de coordination une unique fonction capable de chélater un métal. Par exemple, une fonction amine représente un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’atome d’azote et le métal et une fonction acide hydroxamique représente également un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’oxygène du motif carbonyle et par une liaison covalente avec l’oxygène du motif N-oxyde le site de coordination formant ainsi un cycle à cinq chaînons.
[0042] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule I, chaque groupement Rc est indépendamment choisi dans le groupe constitué du DOTA (acide 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N’”- téracétique), NOTA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan-1 -yl)pentanedioïque), DOTAM (1 ,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7,10 tétraazacyclododécane), NOTAM (1 ,4,7-tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7-triazacyclononane), DOTP (1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane 1 ,4,7,10-tétrakis(méthylène phosphonate), NOTP (1 ,4,7-tétrakis(méthylène phosphonate)-1 ,4,7-triazacyclononane), TETA (acide 1 ,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N”’-téraacétique), TETAM (1 ,4,8,11 - tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N”’-tétrakis(carbamoyl méthyl), du DTPA (acide diéthylène triaminopentaacétique) et DFO (deferoxamine), de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le groupement Rc est le DOTAGA.
[0043] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule II, Rci et RC2 sont indépendamment choisis dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA.
[0044] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA, et de préférence, z=1 .
[0045] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA et le groupement Rc2est le DFO
Les liants de type Z (Z, Zi et Z2)
[0046] On entend par liant de type Z, les liants Z dans le polysaccharide de formule I, et les liants Z1 et Z2, lorsque le liant Z2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.
[0047] Le choix des liants Z, Z^ et Z2 dans les formules I et II dépend essentiellement des groupements Rc, Rci et RC2 et du métal à chélater. En effet, pour des raisons stériques notamment, les groupements Rc, Rci et RC2 peuvent être plus ou moins proche du cycle à 6 chaînons de l’azote de l’unité glucosamine.
[0048] De préférence, dans la formule I, chaque Z est indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes. [0049] Selon un mode de réalisation, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 2 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’- C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’-C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’- C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, - SR’, -NR’2, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0050] Avantageusement, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’- C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0051] Dans un mode de réalisation particulier chaque Z est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.
[0052] Dans un autre mode de réalisation particulier, chaque Z est un polyéthylène glycol (PEG).
[0053] De préférence, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes. [0054] Selon un mode de réalisation, dans la formule II, Zi et Z2 sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 2 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’- C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’-C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’- C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, - SR’, -NR’2, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0055] Avantageusement, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’- C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0056] Dans un mode de réalisation particulier Z1 et/ou Z2 est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.
[0057] Dans un autre mode de réalisation particulier, Z1 et/ou Z2 est un polyéthylène glycol (PEG).
Unités monomériques du polysaccharide selon l’invention
[0058] Le polysaccharide selon l’invention est composé de 3 unités monomériques, à savoir une unité A de type N-acétylglucosamine, une unité B de type glucosamine et une unité de type C de type glucosamine fonctionnalisée par un agent chélatant (de type Rc) lié par un liant (de type Z) à l’azote de la glucosamine. [0059] Le polysaccharide selon l’invention est un polymère statistique. En d’autres termes, l’enchaînement des différentes unités monomériques A, B et de type C est aléatoire.
[0060] Dans les formules I et II, x représente la proportion d’unités A et x peut être compris entre 0,05 et 0,7, de manière préférée, x est compris entre 0,2 et 0,6, de manière plus préférée x est compris entre 0,25 et 0,4.
[0061] Dans les formules I et II, y représente la proportion d’unités de type C et y peut être compris entre 0,01 et 0,7.
[0062] Le reste des unités monomériques des formules I et II sont des unités B. Ainsi, dans les formules I et II, la proportion d’unités B est égale à 1-x-y.
[0063] Conformément à l’invention, dans les formules I et II, le rapport y/x peut être supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15. En effet, l’efficacité du produit est déterminée par le nombre de site de chélation, directement lié au nombre de métaux nécessaires par exemple pour une détection par imagerie.
[0064] Pour pouvoir être introduit sous forme liquide dans un organisme tout en produisant les effets désirés, le polysaccharide selon l’invention doit être soluble à pH physiologique. Pour ce faire, la somme x + y peut être supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[0065] La combinaison du rapport particulier entre le nombre d’unités A et le nombre d’unités de type C et de la somme de la proportion d’unités A et de la proportion d’unité de type C, permet d’obtenir une chélation et une solubilité adéquates pour permettre l’utilisation du polysaccharide selon l’invention dans des domaines variés tels que la dialyse pour la captation d’au moins un métal, l’imagerie IRM, la Curie thérapie et le marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.
[0066] De manière avantageuse, x est compris entre 0,2 et 0,6, de manière plus préférée x est compris entre 0,25 et 0,4.
[0067] De manière avantageuse, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2. [0068] Conformément à l’invention, z est compris entre 0,5 et 1 . En d’autres termes les unités de type C peuvent être exclusivement des unités comportant comme liant Zi et comme groupement portant un agent chélatant Rci.
[0069] Le polysaccharide selon l’invention a une masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100kDa et 1000kDa, de manière avantageuse, la masse moléculaire moyenne en poids du polysaccharide selon l’invention est comprise entre 250kDa et 750 kDa, de manière plus avantageuse entre 400 kDa et 600kDa et de manière encore plus avantageuse, entre 450kDa et 550kDa.
[0070] Selon un mode de réalisation, le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides suivants :
- polysaccharide de formule II où z = 1 , Rci est DOTAGA et Zi est une liaison;
- polysaccharide de formule II où z = 1 , Rci est DTPA et Zi est une liaison; et
- polysaccharide de formule II où 0,5 < z < 1 , Rci est DOTAGA et Zi est une liaison, et RC2 est DFO et Z2 est sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’- C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
Procédé d’obtention du polysaccharide selon l’invention
[0071] Le polysaccharide de formule I ou II selon l’invention peut être obtenu à partir de chitosane, partiellement acétylé ou non, en particulier par acétylation d’une partie des fonctions amines puis fonctionnai isation d’au moins une partie des fonctions amines toujours présentes après l’acétylation.
[0072] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’obtention du polysaccharide selon l’invention comporte au moins les trois étapes successives suivantes :
• Etape 1 : solubilisation d’un chitosane dans une solution acide à un pH compris entre 4 et 5 ; • Etape 2 : acétylation partielle des fonctions amines du chitosane solubilisé en étape 1 (formation des unités A) ;
• Etape 3 : fonctionnai isation d’au moins une partie des fonctions amines toujours présentes à l’issu de l’étape 2 (formation des unités de type C).
[0073] Lorsque le polysaccharide comprend plusieurs groupements différents de type Rc, l’étape 3 du procédé peut être répétée plusieurs fois. Par exemple, si le polysaccharide de formule II comprend un groupement Rci et un groupement RC2, le procédé peut comprendre deux étapes 3 de fonctionnalisation d’au moins une partie des fonctions amines, une première pour introduire les groupements Rci et une deuxième pour introduire les groupements Rc2.
[0074] L’étape 3 peut être subdivisée en plusieurs sous étapes, notamment lorsque le liant Z est une chaîne hydrocarbonée telle que définit précédemment.
[0075] Dans les modes de réalisations où le liant de type Z est une chaîne hydrocarbonée telle que définit précédemment, l’étape 3 peut comprendre une sous étape 3-1 consistant à greffé ladite chaîne hydrocarbonée sur au moins une partie des fonctions amines toujours présentes à l’issue de l’étape 2, puis une sous étape 3-2 consistant au greffage du groupement de type Rc sur ladite chaîne hydrocarbonée. De manière alternative, l’étape 3 ne comporte pas de sous étape. Dans cette alternative, ladite chaîne hydrocarbonée est couplée avec le groupement de type Rc préalablement à l’étape 3, ladite étape 3 est alors réalisée avec une molécule comprenant le groupement de type Rc et ladite chaîne hydrocarbonée.
[0076] De manière alternative, le polysaccharide selon l’invention peut être obtenu à partir d’un chitosane présentant le taux d’acétylation souhaité, ainsi, dans ce mode de réalisation les unités A sont déjà présentes et n’ont pas besoin d’être formée. Dans ce mode de réalisation, le procédé d’obtention du polysaccharide selon l’invention comporte au moins les deux étapes successives suivantes :
• Etape 1 b : solubilisation d’un chitosane partiellement acétylé (unité A) dans une solution acide à un pH compris entre 4 et 5 ; • Etape 2b : fonctionnai isation d’au moins une partie des fonctions amines dudit chitosane partiellement acétylé solubilisé à l’étape 1 b (formation des unités de type C).
[0077] De la même manière que précédemment, l’étape 2b du procédé peut être répétée plusieurs fois, lorsque plusieurs groupements différents de type Rc sont présents.
[0078] De la même manière que précédemment pour ladite étape 3, ladite étape 2b peut être subdivisée en plusieurs sous étapes, notamment lorsque le liant de type Z est une chaîne hydrocarbonée telle que définit précédemment.
[0079] Dans les modes de réalisations où le liant de type Z est une chaîne hydrocarbonée telle que définit précédemment, l’étape 2b peut comprendre une sous étape 2b-1 consistant à greffé ladite chaîne hydrocarbonée sur au moins une partie des fonctions amines, puis une sous étape 2b-2 consistant au greffage du groupement de type Rc sur ladite chaîne hydrocarbonée. De manière alternative, l’étape 2b ne comporte pas de sous étape. Dans cette alternative, ladite chaîne hydrocarbonée est couplée avec le groupement de type Rc préalablement à l’étape 2b, ladite étape 2b est alors réalisée avec une molécule comprenant le groupement de type Rc et ladite chaîne hydrocarbonée.
[0080] Lorsque le polysaccharide selon l’invention est sous forme chélaté, le procédé peut comprendre une étape 4 de chélation du polysaccharide avec au moins un métal.
Utilisation du polysaccharide selon l’invention
[0081] Le polysaccharide selon l’invention peut être utilisé dans diverses applications grâce à sa solubilité à pH physiologique. Les groupements de type Rc permettent de chélater un métal, dès lors il peut être envisagé d’introduire ledit polysaccharide dans un organisme sous deux formes différentes, (i) sous forme chélaté, c’est-à-dire que le polysaccharide chélate au moins un métal, ou (ii) sous forme libre, c’est-à-dire que le polysaccharide ne chélate pas de métal. Lorsque le polysaccharide est sous forme libre, cela signifie que moins de 5% des groupements chélatant de type Rc sont complexés, en particulier, moins de 5% des groupements chélatant de type Rc chélatent des ions d’intérêt. Lorsque le polysaccharide est sous forme chélaté, cela signifie qu’au moins 80% des groupements chélatant de type Rc sont complexés avec le ou les métaux d’intérêt.
[0082] Comme indiqué précédemment, l’invention a également trait à l’utilisation dudit polysaccharide dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, dans un procédé d’imagerie IRM, dans un procédé de Curie-thérapie ou encore dans un procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.
[0083] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, ledit polysaccharide est sous forme libre, pour permettre la captation d’au moins un métal.
[0084] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé d’imagerie IRM, dans un procédé de Curie-thérapie ou encore dans un procédé de marquage anti contrefaçon de denrées alimentaires, ledit polysaccharide chélate au moins un métal. [0085] Le polysaccharide selon l’invention peut être utilisé en tant que tel, ou formulé dans une composition. Dans le cas où le polysaccharide est formulé dans une composition, ledit polysaccharide est avantageusement sous forme d’hydrogel.
Utilisation dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal
[0086] Dans un mode de réalisation particulier, la dialyse est une dialyse MARS ou une dialyse du CSF.
[0087] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, le métal appartient de préférence au groupe constitué du cuivre, du fer, du plomb, du zinc, de l’aluminium, du gadolinium et du manganèse et de manière plus préférentielle, dans le groupe constitué du cuivre, du fer et du plomb.
[0088] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, les groupements de type Rc sont de préférence choisis dans le groupe constitué de DOTAGA, DFO, DOTAM et DTPA. [0089] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, x est de préférence compris entre 0,25 et 0,4.
[0090] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, y est de préférence compris entre 0,05 à 0,2.
[0091] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, le rapport y/x est de préférence compris entre 0,15 et 1,5.
[0092] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, la somme x + y est de préférence comprise entre 0,35 et 0,8.
Utilisation dans un procédé d’imagerie IRM
[0093] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé d’imagerie IRM, ledit polysaccharide chélate au moins un métal. Le métal appartient de préférence au groupe constitué du gadolinium, du fer, du manganèse et du dysprosium et de manière plus préférentielle, le métal est le gadolinium.
[0094] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé d’imagerie IRM, z est de préférence égal à 1 et le groupement Rci est de préférence le DOTAGA.
[0095] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé d’imagerie IRM, x est de préférence compris entre 0,05 et 0,35.
[0096] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé d’imagerie IRM, y est de préférence compris entre 0,1 et 0,7.
Utilisation dans un procédé de Curie thérapie
[0097] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de Curie-thérapie, ledit polysaccharide chélate au moins un métal. Le métal est un isotope radioactif.
[0098] Ainsi, lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de Curie thérapie, le métal appartient de préférence au groupe des isotopes radioactifs constitué du 177Lu, 166 Ho, 212Bi, 213Bi, 90Y et 225At. [0099] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de Curie thérapie, z est de préférence égal à 1 et le groupement Rci est de préférence choisi dans le groupe constitué de DOTAGA.
Utilisation dans un procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires
[0100] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de marquage anti contrefaçon de denrées alimentaires, ledit polysaccharide chélate au moins un métal. Le métal appartient de préférence au groupe constitué des lanthanides et du bismuth.
[0101] Lorsque le polysaccharide est utilisé dans un procédé de marquage anti contrefaçon de denrées alimentaires, les groupements de type Rc sont de préférence choisis indépendamment dans le groupe constitué du DOTA, du NOTA, du NODAGA, du DOTAGA, du DOTAM, du NOTAM, du DOTP, du NOTP du TETA et du TETAM. Pour l’utilisation du polysaccharide selon l’invention dans un procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires, les chélatants cycliques sont en effet avantageux afin d’éviter une transmétallation.
Exemples
Matériel et méthodes
[0102] L’anhydride acétique (>99%) et le propane-1 ,2-diol ont été fournis par Sigma-Aldrich (France), le DOTAGA anhydride, le DTPA-Bisanhydride et le p-NCS- Bz-DFO (N1-hydroxy-N1-(5-(4-(hydroxy(5-(3-(4- isothiocyanatophenyl)thioureido)pentyl)amino)-4-oxobutanamido)pentyl)-N4-(5-(N- hydroxyacetamido)pentyl)succinamide) ont été fournis par CheMatech (France), le DMSO a été fourni par Fischer Chemicals) l’eau ultra-pure (eau Milli-Q) a été obtenue grâce à un système de filtration Eolia. Le chitosane a été fourni par Mahtani, le GdCb par Sanofi, le KBr et tous les sels métalliques utilisés dans l’exemple 4 (nitrates de Al, Mn, Cu, Pb et Zn) par Sigma-Aldrich (France).
[0103] La filtration tangentielle est réalisée au moyen d’une machine de filtration tangentielle Sartoflow Smart avec des membranes Sartocon Slice 200 en polyethersulfone avec un seuil de coupure de 100 kDa. [0104] L’HPLC-UV est réalisée avec un appareil Agilent 1200 avec un détecteur DAD. La colonne d’exclusion stérique utilisée est une Polysep-GFC-P-4000 avec comme éluant un tampon à 0,1 M acétique acide/acétate d’ammonium. La détection est opérée par un détecteur UV à une longueur d’onde de 295 nm. La substance à analyser est injectée à une concentration d’environ 10 g. L-1.
[0105] Les études de spectrophotométrie UV-Visible ont été réalisées sur un appareil Cary 50 UV-VIS de la société Varian.
[0106] La spectroscopie RMN du proton a été réalisée sur un Brucker Avance III 400 MHz à température ambiante. Tous les échantillons ont été dissous à 8 mg/mL dans l’eau deutérée (D2O) comprenant 5 pL d’HCL 12N et placés dans des tubes RMN de 5 mm. Le TMPSA est utilisé comme référence interne.
[0107] L’analyse élémentaire a été faite à l’Institut des Sciences Analytiques, UMR 5280, Pôle Isotopes & Organique, 5 rue de la Doua 69100 Villeurbanne.
[0108] Les études de luminescence en temps résolu ont été réalisées à l’aide d’un appareillage de type Cary Eclipse de chez Agilent.
[0109] La relaxivité à 1 ,5T a été réalisée avec un appareillage de type Minispec mq- 60 de chez Brucker (Karlsruhe, Allemagne).
Exemple 1 : Préparation d’un polysaccharide selon l’invention avec un taux d’acétylation de 40% (x=0,4) et un taux de greffage de DOTAGA de 10% (y=0,1) à partir d’un chitosane de masse moyenne 250 kDa
[0110] Dans l’étape 1 , 60 g de chitosane, 4 L d’eau ultra-pure et 45 mL d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 10 L et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. Une solution jaune pâle est obtenue.
[0111] Dans l’étape 2, 1 ,2 L de propane-1 ,2-diol sont ajoutés à la solution jaune pâle obtenue à l’étape 1 et l’agitation est maintenue pendant 1 h. Une solution composée de 14 mL d’anhydride acétique dissous dans 600 mL de propane-1 ,2- diol est ensuite ajoutée lentement en 10 min afin d’obtenir une acétylation homogène le long de la chaîne polymérique, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h. [0112] Le taux d’acétylation peut être déterminé par analyse élémentaire. L’unité non acétylée du polysaccharide (unité B) présente une masse molaire de 161 ,2 g. mol 1 (C6NO4H11) tandis-que l’unité acétylée (unité A) présente une masse molaire de 203,2 g. mol 1 (C8NO5H13). L’analyse élémentaire du polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 2 d’acétylation est la suivante : C 39,22% ; H 7,55% et N 6,77%, ce qui correspond à un taux d’unités acétylées (unités A) de 40% (x=0,4)
[0113] Dans l’étape 3, 2 L de la solution obtenue à l’étape 2 d’acétylation, sont placés dans un réacteur sous agitation. 120 g de DOTAGA anhydride sont ensuite ajoutés et l’agitation est maintenue pendant 16 h. A l’issue de cette réaction, la solution est diluée par 10 dans de l’eau ultra-pure et purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Après une première étape de re concentration jusqu’à 16 L, la solution est filtrée par 480 L de solution à 0,1 M en acide acétique à volume constant (16 L), suivi par 320 L d’eau ultra-pure et par une autre étape de re-concentration jusqu’à 8 L. L’HPLC-UV permet de vérifier que le DOTAGA a bien été éliminé (Figure 1 ). Le pic aux alentours de 7 min correspond au polymère tandis que le pic aux alentours de 11 min correspond aux DOTAGA non greffés. La solution à une concentration de polysaccharide de 10 g/L est ensuite filtrée sur un filtre nylon (0,4 pm) avant lyophilisation.
[0114] La RMN du proton permet de déterminer le taux y de fonctionnalisation par le DOTAGA sur le polysaccharide en connaissant le taux x d’acétylation. L’unité non greffée et non acétylée (unité B) est constituée de 7 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, présentant un déplacement chimique compris entre 2,9 et 4,3 ppm. L’unité acétylée (unité A) présente ces 7 mêmes protons ainsi que 3 protons, liés de manière covalente à un atome de carbone, présents sur l’acétyle caractérisés par un déplacement chimique compris entre 2 et 2,2 ppm. Enfin, l’unité greffée avec le DOTAGA (unité C) inclut 34 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, dont 32 intègrent entre 2,9 et 4,3 ppm et 2 intègrent entre 2 et 2,2 ppm. Le spectre RMN représenté à la figure 2 permet grâce aux intégrations des différents massifs de déterminer les valeurs de y grâce à l’équation suivante :
[Math. 1] [0115] Le taux d’unité greffée (unité C) est d’environ 0,1.
[0116] Ainsi, le polysaccharide obtenu à un taux d’unité A d’environ 0,4 (x=0,4), un taux d’unité B d’environ 0,5 (1 -x-y=0,5) et un taux d’unité C d’environ 0,1 (y=0,1 ). [0117] Le taux d’unités greffées (unité C) peut également être déterminé par fluorescence avec de l’europium. L’europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de 590 (5Do -> 7Fi) et 615 nm (5Do -> 7F2). Cette luminescence est éteinte lorsque l’ion europium est coordonné seulement avec des molécules d’eau. Le principe de la méthode de détermination du taux d’unités greffées est d’ajouter des quantités croissantes d’europium, afin que celui-ci soit chélaté, la luminescence augmente alors, lorsque tous les sites de chélation sont remplis, la luminescence atteint un plateau. En pratique, le polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 3 a été placé dans un tampon acétate à pH 5, un sel de chlorure d’europium dissous dans le tampon acétate a ensuite été ajouté. Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant l’émission à 590 nm (Figure 3). Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de 0,4 pmol par mg de polymère, soit un taux d’environ 10% (y=0,1).
Exemple 2 : Préparation d’un polysaccharide selon l’invention avec un taux d’acétylation de 0,5% (x=0,005) et un taux de greffage de DOTAGA de 60% (y=0,6) à partir d’un chitosane de masse moyenne 600 kDa présentant un taux d’acétylation de 0,5%>
[0118] Dans l’étape 1b, 3 g d’un chitosane de masse moyenne 600 kDa présentant un taux d’acétylation de 0,5%, 150 mL d’eau ultra-pure et 2,1 mL d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 1 L et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. Une solution jaune pâle est obtenue.
[0119] A la suite de l’étape 1b de solubilisation, 150 mL de propane-1 ,2-diol sont ajoutés à la solution précédente et l’agitation est maintenue pendant 1 h. 11 g de DOTAGA anhydride sont ensuite ajoutés et l’agitation est maintenue pendant 16 h. A l’issue de cette réaction, la solution brun claire est diluée par 10 dans l’eau ultra- pure et purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Ce premier cycle de purification est suivi d’un second en utilisant l’eau ultra-pure pour une purification d’un facteur 50. Les filtrations suivantes sont effectuées dans HCl 0,01 M pour un facteur final de purification de 1250.
[0120] Le greffage par le DOTAGA (unités C) a été montré par analyse thermogravimétrique à l’aide d’un appareil TA Instruments TGA-Q500 avec un chauffage de 10°C/min, sous atmosphère inerte, de 30°C à 700°C. Le greffage du DOTAGA induit une diminution de la température de dégradation proportionnelle au taux de greffage. Ainsi, la comparaison des analyses thermogravimétrique (graphique (A) de la figure 4) du chitosane de départ et du polysaccharide selon l’invention et des courbes dérivées (graphique (B) de la figure 4) permet de déduire que l’étape de fonctionnalisation a bien été effective.
[0121] Les spectres IR sont normalisés en utilisant la bande présentant un maximum d’absorption (1072 cm-1) (Figure 5). Par déconvolution du spectre et en regardant l’aire de la bande à 1590 cm-1 (bande d’élongation de la liaison NH2 des amines), il est possible de valider la formation de liaisons amides et de les quantifier. Le calcul est effectué en comparant les aires des bandes des spectres situées vers 1590 cm-1. Pour la détermination du facteur z= 100*(1-x-y) de l’équation suivante, il est nécessaire de déterminer le degré de fonctionnalisation du produit chitosane / DOTAGA par d'autres techniques. Dans cet exemple, le spectre IR de chitosane + DOTAGA (6,0%) a été utilisé comme spectre de référence (spectre (A)).
Ds = 100
Où Dsest le degré de substitution du chitosane analysé, A’(1590) est l’aire de la bande à 1590 cm 1 du spectre IR du chitosane à analyser, A’T est l’area totale du spectre IR du chitosane à analyser, Aref (1590) est l’aire de la bande IV à 1590 cm 1 du spectre IR du chitosane de référence, A-n-ef est l’aire totale du spectre du chitosane de référence et z est le pourcentage de groupes d’amines libres du chitosane (x = 0.02 ; y = 0.06) utilisée comme référence (z = 92). On obtient alors un taux de greffage de DOTAGA proche de 60% (spectre (B)). Exemple 3 : Préparation d’un polysaccharide selon l’invention avec un taux d’acétylation de 60% (x=0,6) et un taux de greffage de DTP A proche de 5% (y~0,05) à partir d’un chitosane de masse moyenne 250 kDa
[0122] Dans l’étape 1 , 0,25 g de chitosane, 25 ml_ d’eau ultra-pure et 0,18 ml_ d’acide acétique glacial sont introduit dans un réacteur de 250 ml_ et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. Une solution jaune pâle est obtenue.
[0123] Dans l’étape 2, 5 ml_ de propane-1 ,2-diol sont ajoutés à la solution jaune pâle obtenue à l’étape 1 et l’agitation est maintenue pendant 1 h. Une solution composée de 0,045 ml_ d’anhydride acétique dissous dans 5 ml_ de propane-1 ,2- diol est ensuite ajoutée lentement en 10 min afin d’obtenir une acétylation homogène le long de la chaîne polymérique, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h.
[0124] Dans l’étape 3, une solution composée de 0,346 g de DTPA-Bisanhydride dissous dans 15 ml de propane-1 ,2-diol et 16,58 pl_ d’eau ultra-pure est maintenu sous agitation pendant 1 ,5 h. Ensuite cette solution est ajoutée à la solution obtenue à l’étape 2 et l’agitation est maintenue pendant 16 h. À l’issue de cette réaction, la solution est diluée par 10 en ajoutant de l’eau ultra-pure et purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Les filtrations suivantes sont effectuées dans de l’eau ultra-pure pour un facteur final de purification de 6250. La solution à une concentration de 5 g/L est ensuite lyophilisée.
Exemple 4 : utilisation du polymère de l’exemple 1 pour la captation de métaux
[0125] Le polysaccharide synthétisé dans l’exemple 1 a été formulé pour être incorporé dans un dialysat d’hémodialyse dans le but de démontrer sa capacité à procéder à une extraction métallique dans le cadre d’une hémodialyse conventionnelle. Pour les besoins de l’expérience, un hémodialyseur à haut flux Dialife DIAPH06, une pompe péristaltique Cole Parmer 7555-05 Masterflex, des tubulures Masterflex L/S PharMed BPT Tubing, L/S #16 ont été utilisés. La solution métallique utilisée ici a été réalisée pour présenter un taux d’environ 50 ppb de Cu, de Zn, de Pb, d’AI et de Mn dans 5 L d’eau. Le débit est de 200 mL/min et la température de 37°C. Un dialysat ne comprenant que de l’eau a été comparé à un dialysat comprenant 0,001 mol.L 1 de DOTAGA, correspondant à 1 ,6 g/L du polysaccharide synthétisé dans l’exemple 1 . Pour tous les métaux à l’exception de l’aluminium, une captation supérieure est observée pour le fluide de dialyse comprenant le polymère fonctionnalisé 25 min après le début de la dialyse par analyse ICP/MS (Figure 6). La quantité de métal présente dans la solution à dialyser est en effet de 30 contre 42 ppb pour le manganèse, de 18 contre 46 ppb pour le zinc, de 7 contre 46 ppb pour le cuivre et de 8 contre 55 ppb pour le plomb après dialyse avec la solution du polysaccharide de l’exemple 1 en comparaison avec une dialyse effectuée avec une solution aqueuse ne contenant pas de polysaccharide selon l’invention.
Exemple 5 : utilisation du polymère de l’exemple 1 dans un procédé de dialyse de sang de porc pour la captation de métaux
[0126] Afin de démontrer la capacité de captation en milieu biologique, une expérience similaire à celle décrite à l’exemple 4 a été réalisée avec du sang de porc à la place de la solution aqueuse métallique présentée à l’exemple 4. Pour les besoins de l’expérience, un hémodialyseur à haut flux Dialife 20HP, trois pompes péristaltiques Cole Parmer (7555-05, 7523-80 and 7523-90) Masterflex, des tubulures Masterflex L/S PharMed BPT Tubing, L/S #16 et Ismatec SC0328 PharMed BPT Tubing ont été utilisés. 10 L de sang de porc ont été dialysés à différents débits : 200 mL/min (de 0 à 10 min et de 70 à 80 min), 100 mL/min (de 10 à 30 min) et 50 mL/min (de 30 à 70 min) respectivement. Le fluide de dialyse a été formulé par le polysaccharide synthétisé à l’exemple 1 à une concentration de 0,001 mol.L 1. Les résultats de l’étude après analyse par ICP/MS sont présentés en figure 7. Une forte augmentation des taux de Zn, Fe et Pb est observée dans le fluide de dialyse comprenant le polysaccharide synthétisé à l’exemple 1 en comparaison avec une dialyse réalisée sans le polysaccharide synthétisé à l’exemple 1 . La quantité de métal présente dans la solution de dialysat est ainsi de 83 contre 20 ppb pour le zinc, de 257 contre 55 ppb pour le cuivre et de 2604 contre 62 ppb pour le fer.
Exemple 6 : Ajout de gadolinium pour l’obtention d’un polymère imageable en IRM [0127] Après la purification de l’exemple 2, 4,9 g de chlorure de gadolinium hexahydrate sont ajoutés à la solution, le pH est ensuite ajusté à 5 et la solution est laissée sous agitation à 80°C pendant 48 heures. Continuellement le pH est ajusté à 5 avec de la soude à 0,5 M jusqu’à ce qu’il devienne stable, indication que le DOTAGA a complexé tous les ions Gd3+.
Exemple 7 ; utilisation du polysaccharide complexé avec du gadolinium
[0128] Le polysaccharide selon l’invention complexé avec du gadolinium à l’exemple 6 a été mis en œuvre dans un procédé d’imagerie par IRM.
[0129] L’efficacité du polymère complexé avec le gadolinium pour l’IRM a été évalué par la mesure de sa relaxivité longitudinale (n = 15.2 mM 1s 1 par gadolinium) et de sa relaxivité transversale {Î2 = 21 .5 mM 1.s 1 par gadolinium) à 37°C sous un champ de 1 .5T. Le rapport r2/n est de 1 .4 ce qui est typique d’un agent de contraste positif. La relaxivité longitudinale est un peu moins de 4 fois plus importante que celle des agents de contraste commerciaux (~4 mM 1.s 1).
Exemple 8 Préparation d’un polysaccharide selon l’invention avec un taux d’acétylation de 40% (x-0,4) et un taux de greffage de DOTAGA et de DFO de 11% en tout (y-0, 11) à partir d’un chitosane de masse moyenne 250 kDa
[0130] Le chitosane-DOTAGA a été préalablement synthétisé comme décrit dans l’exemple 1 .
[0131] Un volume de 720 mL de chitosane-DOTAGA purifié à une concentration de 7 g/L est inséré dans un ballon de 2L. Cette solution (pH entre 6 et 6.5) est complétée avec de l’eau ultra-pure pour atteindre un volume total de 900 mL. En parallèle, 143.1 mg de p-NCS-Bz-DFO sont pesés et dissous dans 100 mL de DMSO. Cette solution est ensuite ajoutée goutte à goutte à la solution de chitosane- DOTAGA. La solution est maintenue sous agitation et chauffée à 40°C pendant une nuit. La solution est ensuite purifiée à l’eau ultra pure à l’aide de la machine de purification STARTOFLOW SMART avec une membrane en PES avec un seuil de coupure de 100 kDa jusqu’à un taux de purification de 545. La solution à une concentration de 5.1 g/L est ensuite lyophilisée.
[0132] L’analyse HPLC-UV du produit permet de confirmer le greffage du DFO et l’élimination du p-NCS-Bz-DFO résiduel. En effet, la comparaison des analyses HPLC-UV du chitosane-DOTAGA et du chitosane-DOTAGA-DFO montre une augmentation de l’absorption du pic polymère (autour de 7 min) lorsque le p-NCS- Bz-DFO est greffé (Figure 8).
[0133] La quantité de p-NCS-Bz-DFO greffé peut être déterminée par dosage spectrophotométrie UV-Visible à la longueur d’onde d’absorption maximale du complexe DFO-fer (425 nm). Des concentrations croissantes de fer (III) sont ajoutées à une solution de chitosane-DOTAGA-DFO à 0.1 g/L dans un tampon acétate à pH 4.5 (0.1 M ammonium acétate et 0.1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 425 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en fer et une rupture de pente est observée pour 35 mM de fer (Figure 9). Une molécule de DFO pouvant complexer un seul atome de fer, 1 gramme de polymère contient donc 35 mitioI de DFO. Les groupements chélatant greffés sont donc à 90% du DOTAGA et à 10% du DFO (z=0,9).

Claims

Revendications
[Revendication 1] Polysaccharide statistique de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100kDa et lOOOkDa de formule I : Formule I dans laquelle chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, et préférentiellement entre 0,2 et 0,6, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[Revendication 2] Polysaccharide selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque groupement Rc est indépendamment choisi dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le groupement Rc est le DOTAGA.
[Revendication 3] Polysaccharide selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est de formule II dans laquelle :
Rci et RC2 sont différents, et sont des groupements comportant un agent chélatant, Zi et Z2, identiques ou différents, sont des liants pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, et préférentiellement entre 0,2 et 0,6, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35, et z est compris entre 0,5 et 1.
[Revendication 4] Polysaccharide selon la revendication 3, caractérisé en ce que Rci et RC2 sont indépendamment choisis dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA.
[Revendication 5] Polysaccharide selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que x est compris entre 0,25 et 0,4.
[Revendication 6] Polysaccharide selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que y est compris entre 0,05 et 0,2.
[Revendication 7] Polysaccharide selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est formulé dans une composition sous forme d’hydrogel.
[Revendication 8] Polysaccharide selon l’une des revendications 1 à 7 pour son utilisation dans un procédé de dialyse pour la captation d’au moins un métal, de préférence une dialyse MARS ou une dialyse du CSF, le métal appartenant de préférence au groupe constitué du cuivre, du fer, du plomb, du zinc, de l’aluminium, du gadolinium et du manganèse.
[Revendication 9] Polysaccharide selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le polysaccharide chélate au moins un métal.
[Revendication 10] Polysaccharide selon la revendication 9 pour son utilisation dans un procédé d’imagerie IRM.
[Revendication 11] Polysaccharide selon la revendication 9 pour son utilisation dans un procédé de Curie-thérapie.
[Revendication 12] Utilisation du polysaccharide selon la revendication 9, dans procédé de marquage anti-contrefaçon de denrées alimentaires.
[Revendication 13] Procédé d’obtention du polysaccharide selon l’une des revendications 1 à 7 à partir de chitosane, comportant au moins les trois étapes successives suivantes :
• Etape 1 : solubilisation d’un chitosane dans une solution acide à un pH compris entre 4 et 5 ;
• Etape 2 : acétylation partielle des fonctions amines du chitosane solubilisé en étape 1 (formation des unités A) ;
• Etape 3 : fonctionnalisation d’au moins une partie des fonctions amines qui n’ont pas été acétylées en étape 2 (formation des unités de type C).
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