EP4162272A1 - Plasmonverstärkte-fluoreszenz-basierende sensor zum nachweis krankheitsspezifischer biomarker - Google Patents

Plasmonverstärkte-fluoreszenz-basierende sensor zum nachweis krankheitsspezifischer biomarker

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EP4162272A1
EP4162272A1 EP21731955.7A EP21731955A EP4162272A1 EP 4162272 A1 EP4162272 A1 EP 4162272A1 EP 21731955 A EP21731955 A EP 21731955A EP 4162272 A1 EP4162272 A1 EP 4162272A1
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EP
European Patent Office
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biomarker
fluorophore
bound
detection sensor
aptamer
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21731955.7A
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English (en)
French (fr)
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Raffaele Velotta
Dirk Mayer
Bartolomeo Della Ventura
Antonio Minopoli
Bohdan Lenyk
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to biomarker detection sensors for the detection of disease-specific biomarkers, kits based on these sensors, methods for determining disease-specific biomarkers in body fluids and uses.
  • Fluorescence-based techniques are among the most widespread methods in the fields of biotechnology, life sciences and (bio) medical research. Fluorescence probes and fluorescence-labeled bioreceptors are used extensively in optogenetic studies, in cytogenetic assays, in multicolor fluorescent in situ hybridization (multicolor fluorescent in situ hybridization - mFISFI), in bioimaging analysis, for the observation of both the location and the movement of cells or subcellular elements, when researching molecular dynamics, as well as in fluoroimmunoassays for the detection of molecular biomarkers, as enzyme-linked immunosorbet assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbet assay
  • fluorescence methods for the sensory method is severely restricted by the low yields of many fluorescent dyes and the occurrence of signal interference.
  • the detection of very low analyte concentrations is still one of the main problems. Many attempts have been made to amplify the fluorescence signals to enable their applicability to ultrasensitive fluoroimm
  • plasmonic nanostructures To meet this challenge - without the use of expensive equipment, specific or toxic reagents, or significant changes to well-established fluorescence-based assays - plasmonic nanostructures have drawn attention in recent years. This is due to the ability of plasmonic nanostructures to influence the spectral properties of nearby fluorescent dyes. This influence depends strongly on the spectral overlap between the fluorescent dye and the plasmonic absorption, as well as on the distance z between the fluorophore and the nanostructure. In particular, due to the Förster resonance energy transfer mechanism (FRET) (i.e.
  • FRET Förster resonance energy transfer mechanism
  • Two-dimensional (2D) arrays of metallic nanostructures are particularly suitable as plasmon-enhanced fluorescence (PEF - plasmon-enhanced fluorescence) - based biosensing platforms.
  • various fluorescence amplifiers such as gold micro-islands or arrays of metallic nano-objects (e.g. nanoparticles, nanotubes, nanotrangles, nanocrystals, nano-antennas and resonant nanocavities) have been tried in order to move the detection limit further down in fluorescence-based assays.
  • the object of the present invention was to provide possibilities for the highly sensitive determination of disease-specific biomarkers which no longer have the problems of the prior art. Further tasks emerge for the person skilled in the art when considering the following description and the claims.
  • 2D frameworks of ordered and periodic gold nanoparticles (AuNPs), produced via self-organized diblock copolymer nanolithography, represent an effective way of eliminating most of the problems of the prior art that have been identified.
  • AuNPs ordered and periodic gold nanoparticles
  • the favorable and scalable position and the easy adjustment of their plasmonic properties by adjusting the AuNP size and the interparticle distance by simply varying the lengths of the hydrophilic or hydrophobic part of the copolymers are the main strengths of such a PEF platform.
  • the plasmonic behavior of a 2D framework made of well-ordered AuNPs is closely related to the ratio R between the nanoparticle diameter D and the interparticle distance d. When each nanoparticle is in close proximity to its neighbors (i.e.
  • LSP localized surface plasmons
  • DSP - delocalized surface plasmon delocalized surface plasmon
  • room temperature means a temperature of 293.15 Kelvin, i.e. 20 ° C.
  • a plasmon-enhanced fluorescence immunosensor for the determination and detection of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase (P / LDFI) - a malaria marker - is described in whole blood samples.
  • the analyte determination is achieved within the scope of the present invention by means of oriented antibodies which are immobilized in a tightly packed configuration by means of photochemical immobilization technology (PIT).
  • PIT photochemical immobilization technology
  • BCMN Block Copolymer Micelle Nanolithography
  • PIT enables maximum control over the nanoparticle size and lattice constant, as well as the distance of the fluorophore from the sensor surface.
  • the assemblies of the present invention in some embodiments achieve a detection limit of less than 1 pg / ml ( ⁇ 30 fM) with very high specificity without pretreatment of the samples; this is achieved according to the invention in particular in the embodiments in which the gold nanoparticles form a two-dimensional lattice in the form of honeycombs, ie the gold nanoparticles are preferably arranged densely in a hexagonal or hexagonal manner.
  • This detection limit is several orders of magnitude lower than what is achieved in rapid malaria tests or even commercial ELISA kits.
  • the confirmation can be made by redundant, second signals or the detection of a second antigen and the detection can be, for example, down to 50 pM for a green fluorescent fluorophore and up to 260 fM for a red fluorescent fluorophore.
  • the arrangements of the present invention i.e. the biomarker detection sensors, can be used as a substrate in multititer plates.
  • the efficiency is considerably improved compared to conventional fluorescence immunoassays.
  • the present invention relates to a biomarker detection sensor for the detection of disease-specific biomarkers comprising or consisting of a substrate with metal nanoparticles bound thereon in branched two-dimensional structures and / or a two-dimensional lattice, in particular gold nanoparticles, and anti-biomarker receptors bound to the metal nanoparticles, in particular gold nanoparticles.
  • the detection takes place via fluorescence analyzes, since these can be implemented particularly well in continuous operation.
  • the electronic structure of the biomarker detection sensors is changed by the attachment of the disease-specific biomarkers in such a way that they can be measured in their fluorescence emission or absorbance spectrum.
  • the substrates of the biomarker detection sensors according to the present invention can be any substrates on which the nanoparticles can be deposited.
  • these are known assay wells, surfaces based on polyacrylates (e.g. Plexiglas®), polystyrene or glass surfaces.
  • all substrates are suitable that are stable under the experimental conditions (including the Fier position), are transparent for excitation and fluorescence in the respective investigated / applied wavelength range and have no intrinsic fluorescence.
  • the metal nanoparticles to be deposited on the substrates can, in principle, be used on all materials that are non-corrosive under the production and investigation conditions to be chosen.
  • the materials can be selected from the group consisting of noble metals, in particular gold, silver, platinum, copper, chromium, alloys thereof and Janus particles of these metals. It is particularly advantageous and preferred if the metal nanoparticles are gold nanoparticles.
  • the disease to be detected is malaria.
  • the disease-specific biomarker is Plasmodium falciparum L-lactate dehydrogenase (PA.DH).
  • the anti-biomarker receptors bound to the gold nanoparticles are anti-pLDH antibodies.
  • these anti-pLDH antibodies are fixed on the gold nanoparticles, i.e. bound to them.
  • the present invention therefore includes biomarker detection sensors of the aforementioned type in which the anti-biomarker receptors are anti-pLDH antibodies which are bound to the gold nanoparticles via thiol groups.
  • these anti-pLDH antibodies are anti-pLDH antibodies which have been pretreated with UV radiation.
  • UV radiation as a pretreatment, it is possible to modify the anti-pLDH antibodies in such a way that thiol groups become available through the cleavage of disulfide bridges.
  • the UV irradiation results in a selective photoreduction of the disulfide bridges in specific cysteine-cysteine / tryptophan triads (in which the presence of the tryptophan activates the disulfide bridge in this triad, so to speak).
  • the cleavage of these Cys-Cys bonds in both antibody fragments leads to a total of four free thiol groups, two of which can interact with the surface of the gold nanoparticles to form a covalent bond.
  • the UV treatment is carried out for 30 seconds with a radiation output of 1 watt / cm 2 and a wavelength of 254 nm or with a radiation output of 6 watt / cm 2 and a wavelength of 254 nm.
  • the present invention also includes biomarker detection sensors in which the ratio R of the diameter D of the nanoparticles to the distance d between the individual gold nanoparticles (edge-to-edge distance) in the two-dimensional grid is> 2.3.
  • This ratio is preferably between 2.3 and 3.5, and particularly preferably 2.5 or 3.0.
  • the gold nanoparticles form a two-dimensional lattice in the form of honeycombs, i.e. the gold nanoparticles are preferably arranged hexagonally or hexagonally densely.
  • the gold nanoparticles form a two-dimensional branched structure, ie the gold nanoparticles are preferably arranged in branched, ribbon-like structures, with only a few particles (2-4) ever have tight packing.
  • the gold nanoparticles form a combined two-dimensional structure in which both parts of the structure form lattices in the form of honeycombs, ie the gold nanoparticles are preferably hexagonal or hexagonal in density in these parts arranged, and at the same time parts of the structure form two-dimensional branched structures, ie the gold nanoparticles are preferably arranged in these parts in branched, ribbon-like structures with only a few particles (2-4) always having a dense packing and otherwise being randomly distributed.
  • the densely packed nanoparticles in the band-like structures can generate absorptions at 680 nm (delocalized surface plasmons) and the particles, which are only closely spaced with a few neighbors, can generate absorptions at approx. 530 nm (localized surface plasmons LSPR).
  • the diameter D of the nanoparticles of the biomarker detection sensors is between 40 and 60 nm, preferably between 44 and 55 nm, particularly preferably between 46 and 52 nm and particularly preferably about 48 or about 50 nm. In other embodiments, is the diameter D of the nanoparticles of the biomarker detection sensors between 50 and 70 nm, preferably between 55 and 65 nm, particularly preferably 60 nm.
  • the distance d between the individual gold nanoparticles (the edges of the individual particles) of the biomarker detection sensors is preferably between 16 and 24 nm, more preferably between 17 and 22 nm, particularly preferably between 18 and 21 nm and particularly preferably 19 or 20 nm.
  • the size information was determined by means of scanning electron microscopy.
  • An example of a microscope that can be used is a Zeiss® Leo 1550 VP.
  • the corresponding information denotes mean diameters; Naturally, the effective diameters in these orders of magnitude scatter a little around the specified specific value. This in turn also means that the distance d between the particles scatters around a central value. This is known to the person skilled in the art.
  • the deviation in embodiments is plus / minus 0.14 nm.
  • the deviation in embodiments is plus / minus 0.19 nm.
  • the specific structure of the AuNP on the substrate can be controlled in the manufacture of the biomarder detection sensors of the present invention.
  • a simple way of switching between hexagonal structures and branched structures is to regulate the deposition rate; if the speed is increased above a certain value, the particles no longer have sufficient time to ideally arrange themselves and the resulting structure moves away from the ideal hexagonal arrangement.
  • the deposition can be influenced by targeted modification of the substrate, for example by roughening, hydrophobizing / hydrophilizing, functionalizing or the like.
  • biomarker detection sensor kits comprising or consisting of
  • C) optionally further analysis material preferably cuvettes, pipettes, light source (s), fluorescence detector, in particular fluorescence spectrometer.
  • biomarker detection sensor kits comprising or consisting of A) at least one biomarker detection sensor as set out above,
  • Bl at least one further preparation comprising at least one identical biomarker-specific aptamer with another fluorophore bound to it, and / or
  • C) optionally further analysis material preferably cuvettes, pipettes, light source (s), fluorescence detector, in particular fluorescence spectrometer.
  • B2i) at least one, preferably exactly one, different biomarker-specific aptamer for the detection of the same biomarker but binding to a different epitope of the biomarker with a different fluorophore bound to it
  • B2M at least one, preferably exactly one, other biomarker-specific aptamer for the detection of a further biomarker with another fluorophore bound to it, and are selected accordingly from B2i) and / or B2M).
  • B2i confirms the detection of this biomarker by binding two aptamers to the same biomarker and is therefore even more reliable than B1) and that B2M) can detect a second biomarker.
  • kit does not necessarily have to be suitable for the "fin pocket”. Rather, it is intended to express that, prior to the analysis, both the biomarker detection sensor as described above and the preparations comprising biomarker-specific aptamer (s) are present separately from one another, although they are coordinated and associated with one another. In addition, the kit should also be able to include several detection sensors and several aptamer preparations, which are also designed for different biomarkers.
  • the biomarker detection sensor kit it is possible for the biomarker detection sensor kit to be configured as a transportable kit.
  • a transportable light source is then configured, for example, in the form of a flashlight and the fluorescence detector is correspondingly configured in a comparatively handy form.
  • the fluorescence detector only displays a fluorescence signal, but cannot necessarily represent its intensity quantitatively. This would be an example of a rapid test kit.
  • the biomarker detection sensor kit on a laboratory scale is designed, ie in particular both the fluorescence light source and the fluorescence detector are suitable and designed for permanent laboratory operation.
  • biomarker-specific aptamer is in principle selected appropriately for any disease-specific biomarker.
  • biomarker-specific aptamer is directed to the same biomarker in accordance with the anti-biomarker receptor bound to the gold nanoparticles, with aptamer and antibodies directed to different epitopes of the biomarker (in the event that that aptamer and antibody would be directed to the same epitope if they would compete with each other and worsen the result).
  • biomarker-specific aptamer is a malaria-specific aptamer.
  • biomarker-specific aptamer, the malaria 2008 aptamer is particularly preferred.
  • any fluorophore that can be chemically bound to this biomarker is suitable.
  • fluorophores that can be used are 5-FAM (5-carboxyfluorescein), cyanine 7, cyanine 5, cyanine 3b or also quantum dots.
  • 5-FAM and / or cyanine 5 is bound as a fluorophore to the biomarker-specific aptamer.
  • biomarker-specific aptamer in the context of the present invention is therefore the malaria 2008 aptamer with cyanine 5 bound to it, provided that a single fluorophore is used.
  • 5-FAM and Cy5 are combined as fluorophores.
  • the plasmon resonance is designed in such a way that it is coupled with the emission peak of the 5-FAM with both the excitation peak and the emission peak of the Cy5, which means, through emission rate improvement, a 160-fold fluorescence amplification and, through a dual mechanism (excitation and emission rates ), a 5200-fold signal gain is achieved.
  • the detection concentration range expands by two orders of magnitude compared to detection of only a single fluorophore in complex matrices such as human blood.
  • the confirmation of the analyte binding by two redundant fluorescence signals improves the reliability of the signal and reduces false positive signals due to unspecific binding.
  • the proposed approach can also be used for simultaneous monitoring of different biomarkers at low concentrations, paving the way for potential multiplex and floch throughput analysis.
  • two different biomarker-specific aptamers can be used, or else the same.
  • biomarker-specific aptamers with the same fluorophores or different fluorophores can be used in order to detect different biomarkers at the same time, or the same biomarker-specific aptamer with different fluorophores for the detection of the same biomarker but at different wavelengths.
  • the present invention can therefore cover many different variants which allow a high degree of flexibility, in particular when used in the form of kits. It is noteworthy that the variant of the present invention with two different fluorophores, in particular 5-FAM and Cy5, extends the accessible detection range by using both fluorophores, Cy5 being more sensitive in the lower concentration range (up to 0.1 pM), while 5-FAM covers large concentrations (up to 1 pM). In this way, for example, over seven orders of magnitude can be measured instead of four or five for one fluorophore alone.
  • BCMN block copolymer micellar nanolithography
  • branching patterns of plasmon-coupled, honeycomb-shaped AuNPs which generate a collective mode, the resonance of which is in the far red range
  • interspersed plasmon-decoupled AuNPs which localize a narrow one
  • LSPR surface plasmon resonance
  • Said preparation comprising at least one biomarker-specific aptamer with a fluorophore bonded to it can be this aptamer per se, but in addition to the aptamer with a fluorophore bonded to it can also contain other substances, such as those for the use of such aptamers with fluorophores bonded to it in the Are known in the art.
  • the fluorophore-labeled aptamer can be present in aqueous solutions, it being possible for these aqueous solutions to be buffered, for example, or also to contain preservatives or the like.
  • 10 millimolar phosphate buffered saline solutions (PBS) are well suited in embodiments of the present invention. This applies accordingly to all variants B0), Bl) and B2).
  • biomarker detection sensors are designed as described above. This is because the combinations of the biomarker detection sensors as described above with the preparations comprising at least one biomarker-specific aptamer enable a high level of selectivity.
  • the selectivity for the P / LDH is achieved in particular by the combination of the anti-pLDH antibody, which is bound to the gold nanoparticles via thiol groups, and the Malaria 2008 aptamer with cyanine 5 bound to it as a fluorophore.
  • the fluorescence intensity depends on the concentration of the biomarker.
  • the intensity increases with the increasing concentration of the biomarker and asymptotically approaches a limit value. This limit value is reached when all antibodies are covered by biomarkers bound to them.
  • biomarker concentrations between 0.001 femtomoles and 100 nanomoles, in particular between 0.01 femtomoles and 10 nanomoles, can be determined quantitatively.
  • Flatter concentrations can be qualitatively determined.
  • Qualitative determination means that the presence of the biomarker is indicated by fluorescence, but the exact amount is not determined or, in the case of complete coverage of all antibodies, cannot be determined.
  • the qualitative determination is usually sufficient.
  • the quantitative determination is usually used for more precise clinical examinations.
  • the order symmetry of the two-dimensional lattice of the gold nanoparticles can influence the plasmon resonance.
  • a particularly good plasmon resonance was achieved with hexagonal or hexagonal tightly packed gold nanoparticles;
  • the present invention also encompasses cubically densely packed, randomly densely packed or other symmetries of order.
  • the dual amplification for the variant of the hexagonal arrangements and with a biomarker-specific aptamer and a fluorophore bound to it reaches its maximum due to the plasmon resonance at a distance of about 10 nm from the particle surface.
  • this particularly preferred embodiment of the present invention achieves a particularly strong dual amplification and particularly high selectivity and efficiency.
  • the present invention is greatly improved with regard to sandwich assays known from the prior art.
  • the present invention also relates to a method for determining disease-specific biomarkers in body fluids. This procedure includes or consists of the following steps:
  • Step i) consists in providing a biomarker detection sensor as described above.
  • a body fluid sample is then applied to the sensor and mixed with at least one biomarker-specific aptamer with a fluorophore coupled to it.
  • the sample applied to the sensor is then irradiated in step iii) by means of a light source.
  • the light source is selected in such a way that the fluorophore used is particularly well excited.
  • this light source is a light source that emits in the red range of the visible spectrum; particularly advantageous results are achieved when the light source in a wavelength range between 610 and 670 nm, preferably between 625 and 655 nm, in particular, in the case of cyanine 5 as the fluorophore, emitted at 625 nm.
  • 5-FAM as the fluorophore
  • particularly preferred results are achieved when the light source emits wavelengths of 450 nm to 510 nm, in particular 470 nm.
  • step iv the fluorescence emission of the sample is detected.
  • this detection can be carried out using any of the methods known to those skilled in the art. If the method according to the invention is carried out with one of the biomarker detection sensor kits according to the invention, this can also be a purely visual detection by the person performing the method; respectively.
  • the detection preferably takes place with dedicated fluorescence spectrometers, for example those based on CMOS or sCMOS photodetectors.
  • the at least one biomarker-specific aptamer with a fluorophore coupled to it to be mixed with the body fluid sample is as described above and can also be in the form of the preparation described for the biomarker detection sensor kit which contains this biomarker-specific aptamer with a fluorophore bound to it.
  • the analysis of the fluorescence emission can take place as an optional step v) in the method according to the invention.
  • This analysis can be quantitative, qualitative, or both.
  • This analysis is expediently carried out by means of commercially available computers and fluorescence data processing programs known to those skilled in the art.
  • the determined result of the fluorescence emission analysis can be stored or displayed, or both.
  • the body fluid is not limited to a specific body fluid in the method for determining disease-specific biomarkers according to the present invention, it is a matter of course for the person skilled in the art that he selects the body fluid according to whether the disease-specific biomarkers he is looking for occur in the respective body fluid.
  • the body fluid is blood samples.
  • the body fluids Before being used in the method of the present invention, the body fluids can be worked up or prepared in accordance with the methods customary in the art.
  • the method of the present invention is particularly suitable and intended for examining body fluid samples that are already present as such, i.e. the removal of body fluids is not part of the method of the present invention.
  • the anti-biomarker receptors are anti-pLDFI antibodies
  • the biomarker-specific aptamers are malaria 2008 aptamers, which are preferred 5-FAM and / or cyanine 5 is / are bound as a fluorophore; in accordance with the above statements on the biomarker detection sensor or the biomarker detection sensor kit of the present invention.
  • the pre-treatment of the anti-pLDFI antibodies with UV radiation activates them.
  • the antibodies are converted into a conformation so that they bind to the gold nanoparticles in a way that makes the binding epitopes of the antibody easily accessible for the biomarker to be examined.
  • the present invention also relates to uses of the biomarker detection sensors, the biomarker detection sensor kits or the method according to the invention for determining disease-specific ones Biomarkers in body fluids for the qualitative or quantitative determination of disease-specific biomarkers.
  • this use is encompassed for the determination of malaria biomarkers and in particular in body fluid samples, most preferably in blood samples.
  • Another preferred use according to the present invention is the use of the biomarker detection sensors according to the present invention as a substrate in automated multititer plates.
  • biomarker detection sensors according to the present invention can be analogous to Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., "Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications", Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https://doi.Org/10.1116/l.3536839.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the procedure for producing a biomarker detection sensor according to the present invention.
  • These micelles can then be used on a Substrate 1, for example by means of a dip coater, are deposited. Due to their structure, the micelles then arrange themselves in regular structures on the surface of the substrate. The micelles around the gold precursors are then removed, for example by means of plasma furnace treatment. In the process, the gold precursors 9 are also reduced to form the gold nanoparticles 2. A two-dimensional grid of gold nanoparticles 2 (unfilled circles) then remains on the surface.
  • Section B illustrates how a solution of anti-pLDH antibodies 10 is pretreated by means of UV radiation (shown as a flash) and then subsequently this treated aqueous solution 10a is poured onto the substrate produced in section A) with gold nanoparticles located thereon where the antibodies bind to the gold nanoparticles.
  • the substrate 1 illustrated in section C) is then obtained with gold nanoparticles 2 located thereon, to which the anti-biomarker receptors are bound, which is represented here by filled circles.
  • This production method is also described, for example, in Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., "Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications", Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https: // doi.Org/10.1116/l.3536839.
  • FIG. 1 shows the arrangement of the particles on the substrate only schematically and by way of illustration and is not restricted to a specific arrangement.
  • the production method illustrated in this figure can be used both for the production of substrates with hexagonally arranged nanoparticles (as illustrated) and for the production of branched nanoparticles or also for mixed forms.
  • FIG. 2a is a scanning electron microscope image of a substrate provided with ordered gold nanoparticles according to a variant of the present invention. It can be seen from this recording that imperfections can certainly occur during the manufacture of the sensors. However, these flaws are not detrimental to the overall performance of the biomarker detection sensor, since they are, so to speak, averaged out in the context of plasmon resonance or dual amplification.
  • FIG. 2b are two scanning electron microscope images of another substrate provided with ordered gold nanoparticles according to another variant of the present invention. From these recordings it can be seen that here in the short-range order there are still hexagonal structures, but the long-range order essentially has branched structures as well as isolated nanoparticles. The upper picture shows a structure before and the lower picture one after the AuNP growth.
  • Figure 3 is a diagram in which the two narrow curves represent the excitation spectrum (left, dashed curve) and the emission spectrum (right, dotted curve) of cyanine 5 (Cy5) and the broad curve the experimentally determined extinction spectrum of a malaria biomarker detection sensor ( prepared according to Example A) described below). It can be seen that the broad extinction spectrum allows the plasmonic resonance to be superimposed on both the extinction and emission spectrum of cyanine 5. The wavelength in nm is plotted on the x-axis and the extinction (left) and the normalized excitation / emission (right) on the y-axis.
  • FIG. 3b for a substrate produced in accordance with Example B) described below shows the experimental (solid line) extinction spectrum.
  • the plasmon fluorophore overlap with 5-FAM (emission spectrum, small dashed line // excitation spectrum, large dashed line) and Cy5 (emission spectrum, dash-dot line // excitation spectrum, dotted line) dyes is shown.
  • the experimental extinction spectrum shows two plasmonic resonances at 524 nm and 675 nm. Isolated AuNPs contribute to the resonance at smaller wavelengths, as was to be expected based on 30 nm gold nanospheres in air, whereas AuNPs arranged along the branches lead to a collective resonance at higher wavelengths.
  • the extinction is plotted on the left-hand axis, and excitation / emission on the right-hand axis.
  • the wavelength in nm is plotted on the horizontal axis.
  • FIG. 4 is a diagrammatic representation of the particle size distribution of gold nanoparticles produced according to Example A) described below became.
  • the mean diameter D of the gold nanoparticles in this example is about 48 nm (47.67 + 0.14 nm).
  • FIG. 5 is a diagrammatic representation of the inter-particle distances in nanometers in relation to the respective centers of the nanometers.
  • the mean inter-particle distance, measured center-to-center, is about 68 nm (68.47 + 0.19 nm), resulting in an inter-particle distance, measured particle edge to particle edge, of about 20 nm (produced according to Example A described below) ).
  • FIG. 6 shows schematically the mode of operation of the present invention on a single gold nanoparticle (AuNP).
  • the basis is a gold nanoparticle 2 arranged on a substrate 1 to which antibodies 3 (shown here as Y) are bound.
  • antibodies 3 shown here as Y
  • the way in which the antibodies 3 are represented makes it clear that they are bound to the gold nanoparticles 2 in a conformation which makes the binding epitopes of the antibodies easily accessible to the respective biomarker. This is illustrated by the fact that in each case one “arm” of the antibody 3 is oriented away from the gold nanoparticle 2.
  • the biomarker 4 (Pfl_DH) to be examined is shown (only one, for the sake of clarity, in the form of a cloud), which is here is shown as binding to the binding epitope of the middle antibody 3.
  • An aptamer 5 is then shown on the other side of the biomarker 4, which thus, as it were, sandwiches the biomarker 4 together with the antibody 3
  • the fluorophore 6 is shown as a star, which is intended to represent its fluorescence emission, on the opposite side of the aptamer 5.
  • the distance between the fluorophore 6 and the surface 1 is approximately 10 nm, which means that with this arrangement both high sensitivity and high selectivity is achieved.
  • FIG. 7 shows an image of the fluorescence points of a sensor structure with a detected biomarker according to example B), below.
  • the picture shows a reproduction in which the red and green channels, which result from the detection with two color channels, ie two different fluorophores (5-FAM and Cy5), are shown combined (here in black and white for reproduction purposes).
  • two color channels ie two different fluorophores (5-FAM and Cy5)
  • Au-S gold salt especially HAuCU
  • Diblock copolymers P18226-S2VP and P3807-S2VP, respectively
  • Toluene (99.8%), gold (III) chloride trihydrate (HAUCU * 3H 2 0), silver nitrate (AgNCb) and ascorbic acid were purchased from Sigma-Aldrich; Acetone (> 99.0%), 2-propanol (> 99.5%) and ethanol (> 99.5%) were used by Merck Millipore bought; Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) (> 99.0%) was purchased from Fluka; Bovine serum albumin (BSA) (Fraction V IgG-free, low in fatty acids) came from Gibco. Pure deionized water, which was used for all aqueous solutions, was dosed from a Milli-Q® system (18.2 megohms specific resistance).
  • BSA Bovine serum albumin
  • PBS phosphate-buffered saline
  • NaF PO 10 mM NazFIPO 10 mM, MgCh 1 mM, pH 7.1
  • Pan malaria antibody anti-pLDH monoclonal antibody clone 19g7 was produced by Vista Laboratory Services (Langley, USA).
  • Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase (P / LDH) and PvLDH were obtained by bacterial expression.
  • the Malaria 2008s aptamers labeled with 5-FAM or cyanine-5-tag (5'-5-FAM (Cy5) -CTG GGC GGT AGA ACC ATA GTG ACC CAG CCG TCT AC-3 ') were provided by Friz Biochem GmbH ( Neuried, Germany).
  • Millex® syringe filters (pore size 0.20 ⁇ m) with hydrophobic polytetrafluoroethylene membrane were purchased from Merck Millipore; Superslip® coverslips (borosilicate glass, 0.13-0.17 mm thick) were purchased from Thermo Fisher Scientific and cut by a diamond-tipped glass cutter.
  • Nanolithography based on the self-assembly of block copolymers has been used to produce arrays of ordered AuNPs with adjustable density, size and interparticle spacing.
  • 29.2 mg of the diblock copolymers P18226-S2VP were added to 15 ml of toluene with vigorous stirring and under controlled conditions (argon inert gas, O2 ⁇ 1 ppm, H 2 q ⁇ 0.1 ppm) and held for 72 hours in order to obtain a homogeneously dispersed, to obtain inverted micelles with a hydrophilic core and an outer hydrophobic shell (spherical).
  • the substrates were cleaned by ultrasound for five minutes in succession in acetone, 2-propanol and pure ethanol and then immersed in toluene To “make” the surface non-polar so that the hydrophobic shells could adhere to it. Subsequently, the substrates were dipped into the solution containing PS-AuNPs by means of a dip coater with careful adjustment of the dipping speed. It was found that an immersion speed of 0.6 mm / s enabled a particularly good coating of the glass surface both with regard to the density of the arrangement of the AuNPs and with regard to the large-area uniformity of the deposition.
  • the PS-AuNPs were transferred to the non-polar glass surface by hydrophobic interaction, whereby a hexagonal arrangement took place by means of self-organization is also illustrated in FIG.
  • the copolymers were then etched by means of oxygen plasma treatment (0.8 mbar pressure, 200 W, 30 minutes), as a result of which the AuNPs were immobilized at prefixed positions on the glass surface.
  • the plasmonic resonance depends strongly on the ratio R between the AuNP diameter D and the interparticle distance d, higher values of R guarantee greater coupling between the AuNPs.
  • R> 2/3 the plasmonic resonance is dominated by the collective behavior of the AuNPs, and several advantages for metal-enhanced fluorescence (MEF) result.
  • CEF metal-enhanced fluorescence
  • the functionalization of the AuNPs with pan-malaria antibodies was carried out using photochemical immobilization technology (PIT).
  • PIT photochemical immobilization technology
  • 1 ml of aqueous solution of anti-pLDH (25 pg / ml) was irradiated by means of a UV lamp for 30 seconds and then poured onto the substrate.
  • the UV source consisted of two U-shaped low-pressure mercury lamps (2 W at 254 nm) into which a standard quartz cuvette could be inserted. Under consideration of Geometry of the lamps and the proximity to the cuvette, the radiation intensity that was used to generate the thiol groups was approximately 1 W / cm 2 .
  • the samples were rinsed with ultrapure water (dosed using a Milli-Q® system) in order to remove unbound antibodies.
  • bovine serum albumin (BSA) solution 50 pg / ml was applied to cover the free gold surface and to protect it from non-specific adsorption.
  • Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase (Pfl_DH) was added to 1 ml of a dilute solution of uninfected human blood (dilution 1: 100 in 25 mM Tris buffer).
  • the functionalized substrates were incubated with 1 ml of contaminated blood solution of the same dilution for 2 hours at room temperature.
  • a rocker shaker was used to accelerate the binding kinetics and improve analyte diffusion. Concentrations between 0.01 femtomol and 10 nanomol were measured.
  • the samples were rinsed copiously with Tris buffer (25 mM) and with ultrapure water to remove unbound proteins.
  • the samples were rinsed copiously with PBS and ultrapure water to remove unbound aptamers.
  • Fluorescence images were taken with a Zeiss Axio Observer ZI phase-inverted contrast fluorescence microscope, equipped with a Zeiss Colibri.2 LED light source (module 625 nm), Zeiss Plan apochromat objective 10x / 0.45 Ph 1 M27
  • Such a value is then subtracted from the original image , smoothing out spatial variations in the background.
  • the rolling ball radius was set to 10 pixels, a size sufficiently larger than the size of the largest objects that were not part of the background.
  • a threshold value which was slightly higher than the smoothed background, was set in order to segment the image, the total intensity of which was measured by adding up the signal components from all spots. In order to obtain a good and reliable analysis of the fluorescence signals, ten images were taken at random of each sample and their intensity average was determined.
  • Bloch BCs (periodic boundary conditions ) were only used for polarization studies to compensate for the phase shift that occurs when reintroduced an electromagnetic interference with a non-zero angle on the opposite side of the workspace.
  • Perfectly adjusted layer BCs in the z-direction ensure perfect absorption of the electromagnetic waves that are backscattered by the plane containing the light source and incident through the opposite side of the working environment.
  • the working environment was resolved via a grid with a spatial resolution of 0.5 nm, which ensured high accuracy and at the same time kept the simulation time within a few hours.
  • the AuNPs were modeled as homogeneous gold hemispheres, whereas the substrate was represented as a thick dielectric layer of silicon dioxide (S1O2).
  • the substrates were cleaned by ultrasound for five minutes in succession in acetone, 2-propanol and ethanol and then immersed in a non-polar solvent to prevent the adhesion of hydrophobic polystyrene - Allow envelopes.
  • the substrates were then dipped into the solution containing PS-AuNPs by means of a dip coater at a dipping speed of 0.8 mm / s. This immersion speed enables a good coating of the substrate surface with simultaneous prevention of maximum packing density (cf. FIG. 2b, from which it can be seen that in the short-range order there are still hexagonal structures, but the long-range order shows branched structures).
  • the copolymers were then etched by means of oxygen plasma treatment (0.8 mbar pressure, 200 W, 30 minutes), as a result of which the AuNPs were immobilized at prefixed positions on the glass surface.
  • the substrates were then incubated for 2 hours with exclusion of light with 2 ml of an Au deposition solution (CTAB 190 mM, FIAuCU * 3H 2 0 42 mM, AgNO3 8 mM, ascorbic acid 100 mM).
  • the functionalization of the AuNPs with pan-malaria antibodies was carried out using photochemical immobilization technology (PIT).
  • PIT photochemical immobilization technology
  • 1 ml of aqueous solution of anti-pLDFI (50 pg / ml) was irradiated using a UV lamp for 30 seconds and then poured onto the substrate.
  • the UV source (Trylight, Promete Srl) consisted of two U-shaped low-pressure mercury lamps (6 W at 254 nm) into which a 10 mm standard quartz cuvette could be inserted. Taking into account the geometry of the lamps and the proximity to the cuvette, the radiation intensity that was used to generate the thiol groups was approximately 0.3 W / cm 2 .
  • Uninfected human blood was diluted 1: 100 in 25 mM Tris buffer to reduce the turbidity of the sample.
  • the desired amount of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase (P / LDFI) was added to 1 ml of a dilute solution of the sample in order to achieve analyte concentrations in the range from 1 fM to 1 pm received (based on the undiluted blood).
  • the functionalized substrates were incubated with 1 ml of contaminated blood solution for 2 hours at room temperature.
  • the recorded fluorescence images were processed with ImageJ software to process the full intensity emanating from the bright points.
  • the RGB images were divided into two channels containing the red and green components in order to analyze the proportions of the two fluorophores separately.
  • the “rolling balT” algorithm was also used here.
  • FIG. 7 shows the resulting image in which the red and green channels are shown combined again (here in black and white for reproduction purposes).
  • the specificity of the apta immunosensor was tested against lactate dehydrogenase from Plasmodium vivax (PvLDH), which is 90% identical to P / LDH.
  • PvLDH lactate dehydrogenase from Plasmodium vivax
  • the Pv DH was added to uninfected human blood (diluted 1: 100 in 1 mL of 25 mM Tris buffer) in order to obtain the highest analyte concentration investigated in the calibration curve (1 mM based on undiluted whole blood).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Biomarker-Detektionssensoren zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern, Kits aufbauend auf diesen, Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten und Verwendungen.

Description

PLASMONVERSTÄRKTE-FLUORESZENZ-BASIERENDE SENSOR ZUM NACHWEIS KRANKHEITSSPEZIFISCHER BIOMARKER
Die vorliegende Erfindung betrifft Biomarker-Detektionssensoren zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern, Kits aufbauend auf diesen Sensoren, Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten und Verwendungen.
Fluoreszenz-basierte Techniken gehören in den Bereichen der Biotechnologie, Life- Sciences und der (bio-)medizinischen Forschung zu den am weitesten verbreiteten Methoden. Fluoreszenzproben und Fluoroeszenz-gelabelte Biorezeptoren werden umfangreich eingesetzt in optogenetischen Studien, bei zytogenetischen Assays, bei Vielfarbfluroreszenz-in situ Hybridisierung (multicolor fluorescent in situ hybridization - mFISFI), bei biobildgebender Analyse, für die Beobachtung von sowohl des Orts als auch der Bewegung von Zellen oder subzellularen Elementen, bei der Erforschung von molekularen Dynamiken, wie auch in Fluoroimmunoassays zur Detektion von molekularen Biomarkern, als Enzyme-Linked Immunosorbet Assay (ELISA). Allerdings wird die Anwendung von Fluoreszenz-Verfahren für das sensorische Verfahren durch die geringen Ausbeuten vieler Fluoreszenzfarbstoffe und das Auftreten von Signalinterferenzen stark eingeschränkt. Insbesondere ist die Detektion von sehr geringen Analytkonzentrationen immer noch eines der Hauptprobleme. Viele Versuche wurden unternommen, die Fluoreszenzsignale zu verstärken, um deren Anwendbarkeit für ultrasensitive Fluoroimmunoassays zu ermöglichen.
Um diese Herausforderung zu meistern - ohne die Verwendung von teurer Ausrüstung, spezifischen oder toxischen Reagenzien oder signifikante Änderungen an gute etablierten fluoreszenzbasierten Assays vornehmen zu müssen - haben in den letzten Jahren plasmonische Nanostrukturen Beachtung gefunden. Dies ist zurückzuführen auf die Fähigkeit von plasmonischen Nanostrukturen die spektralen Eigenschaften von in der Nähe befindlichen Fluoreszenzfarbstoffen zu beeinflussen. Diese Beeinflussung häng stark von der spektralen Überlappung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und der plasmonischen Absorption ab, sowie von der Distanz z zwischen Fluorophor und Nanostruktur. Insbesondere wird, aufgrund des Förster- Resonanzenergietransfer-Mechanismus (FRET) (d.h. Dipol-Dipol Wechselwirkungen zwischen dem Oberflächenplasmon und dem Fluorophor), eine starke Fluoreszenzverstärkung (FE) für kleine z (<10 nm) erreicht, wenn die plasmonische Absorption den Anregungspeak des Fluorophors überlagert (excitation coupling). Hingegen führt bei großen z die schwache Kopplung zu verschwindend geringer Fluoreszenzverstärkung. Im Gegensatz dazu führt die Überlappung mit dem Fluorophor-Emission-Peak (emission coupling) zu einer starken Fluoreszenzverstärkung bei großen z (>10 nm), aufgrund der Verstärkung der Fluorophor-Strahlungsrate durch den Purcell-Effekt, wohingegen eine fortschreitende Abnahme der Fluoreszenzverstärkung bei kleineren z auftritt aufgrund der steigenden Fluoreszenzlöschung via nicht-strahlender Verluste in der metallischen Nanostruktur. In dem Fall, dass die Plasmonabsorption sowohl den Anregungs- als auch den Emissionspeak des Fluorophors überlagert (kombinierter Modus), entsteht eine sehr große Fluoreszenzverstärkung bei einem optimalen z von ca. 10-15 nm; eine starke Löschung tritt bei kurzen z auf, wohingegen eine Wiederherstellung der normalen Fluoreszenzbedingungen (d.h. in Abwesenheit einer plasmonischen Struktur) bei längeren Distanzen aufgrund der schwächeren Plasmon-Fluorophor-Kopplung auftritt.
Zweidimensionale (2D) Arrays von metallischen Nanostrukturen sind besonders geeignet als plasmonverstärkte Fluoreszenz (PEF - plasmon-enhanced fluorescence)- basierte Biosensing Plattformen. Bisher wurden verschiedene Fluoreszenzverstärker wie Gold-Mikroinseln oder Arrays von metallischen Nanoobjekten (z.B. Nanopartikel, Nanoröhren, Nanotriangeln, Nanokristalle, Nanoantennen und resonante Nanokavitäten) ausprobiert, um das Detektionslimit in Fluoreszenz-basierten Assays weiter nach unten zu verschieben. Trotz der großen Verbesserungen im Hinblick auf die erreichbaren Detektionslimits (LOD - limit of detection), die bis hinunter zum femto-molaren-Level reichen, repräsentieren die Notwendigkeit von geschultem Personal, teure Technologien, zeitaufwändigen Prozeduren, geringe Versatilität, schlechte Skalierbarkeit und niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis limitierende Faktoren für routinemäßiges Testen, Point-of-Care-Analyse und großflächige Verwendung von PEF-basierenden Fluoroassays.
Die Entwicklung von plasmonischen Biosensoren, die Verlässlichkeit und Einfachheit in der Handhabung kombinieren, ist immer noch eine Herausforderung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Möglichkeiten für die hochsensitive Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern zur Verfügung zu stellen, welche die Probleme des Standes der Technik nicht mehr aufweisen. Weitere Aufgabenstellungen ergeben sich für den Fachmann bei Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung und der Ansprüche.
Diese und weitere Aufgaben, die sich dem Fachmann bei Betrachtung der vorliegenden Beschreibung erschließen, werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen dargestellten Gegenstände gelöst.
Besonders vorteilhafte und bevorzugte Gegenstände ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass 2D-Gerüste von geordneten und periodischen Gold-Nanopartikeln (AuNPs), hergestellt über selbstorganisierte Diblockcopolymer-Nanolithographie einen effektiven Weg darstellen, die meisten der aufgezeigten Probleme des Standes der Technik zu beseitigen. Die günstige und skalierbare Fierstellung und die einfache Einsteilbarkeit von deren plasmonischen Eigenschaften, durch Anpassen der AuNP-Größe und der Zwischenteilchendistanz durch einfache Variation der Längen von hydrophilem bzw. hydrophobem Teil der Copolymere, sind die wesentlichen Stärken einer solchen PEF- Plattform. Das plasmonische Verhalten eines 2D-Gerüsts aus gut-geordneten AuNPs steht in enger Relation zu dem Verhältnis R zwischen dem Nanopartikeldurchmesser D und der Zwischenteilchendistanz d. Wenn jedes Nanopartikel in enger Nähe zu seinen Nachbarn steht (d.h. wenn R>2/3 wird), wird durch die Wechselwirkung zwischen den lokalisierten Oberflächenplasmonen (LSPs - localized surface plasmons) eine langreichweitige, kollektive Oszillation, delokalisiertes Oberflächenplasmon (DSP - delocalized surface plasmon) genannt, erhalten. Solch ein kollektiver Effekt wird vernachlässigbar je mehr R<2/3 wird; in diesem Fall ist die plasmonische Reaktion des 2D-Gerüsts gut durch ein System von entkoppelten LSPs beschrieben.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet Raumtemperatur eine Temperatur von 293,15 Kelvin, d.h. 20°C.
Soweit nicht weiter ausgeführt herrscht bei allen Reaktionen und Vorgehensweisen Atmosphärendruck (1013 mbarabsoiut) und Raumtemperatur.
In der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein Plasmon-verstärkter Fluoroszenz-Immunosensor für die Bestimmung und Detektion von Plasmodium falciparum Lactatdehydrogenase (P/LDFI) - einem Malariamarker - in Ganzblutproben beschrieben. Die Analyt-Bestimmung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erreicht durch orientierte Antikörper, die in einer dichtgepackten Konfiguration mittels photochemischer Immobilisationstechnik (PIT) immobilisiert werden. Die Kombination von BCMN (Block Copolymer Micelle Nanolithography) und PIT ermöglicht maximale Kontrolle über die Nanopartikelgröße und Gitterkonstante, sowie die Distanz des Fluorophors von der Sensoroberfläche. Aufgrund dieser Charakteristiken erreichen die Anordnungen der vorliegenden Erfindung in einigen Ausführungsformen ein Detektionslimit von weniger als 1 pg/ml (<30 fM) mit sehr hoher Spezifizität ohne eine Vorbehandlung der Proben; dies wird erfindungsgemäß insbesondere bei den Ausführungsformen erreicht, bei denen die Gold-Nanopartikel ein zweidimensionales Gitter in Form von Waben ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel bevorzugt hexagonal oder hexagonal dicht angeordnet sind. Dieses Detektionslimit ist mehrere Größenordnungen niedriger als das, was in Malaria-Schnelltests oder sogar kommerziellen ELISA-Kits erreicht wird.
In anderen Ausführungsformen, die nicht voll auf maximales LOD (Limit Of Detectability) optimiert sind, wenn beispielsweise die Probenkonzentrationen im Bereich von nM oder pM liegen, sind diese Empfindlichkeiten nicht unbedingt erforderlich. In diesen Ausführungsformen, die sich insbesondere durch den Einsatz mehrerer Fluorophore auszeichnen, kann aber die Bestätigung durch redundante, zweite Signale oder den Nachweis eines zweiten Antigens erfolgen und die Detektion beispielsweise bis hinunter zu 50 pM für ein grün fluoreszierendes Fluorophor und bis zu 260 fM für ein rot fluoreszierendes Fluorophor. Durch die Kombination eines Fluorophors, der niedrige LODs ermöglicht mit einem Fluorophor, der über ein hohes LOD verfügt, kann der Konzentrationsbereich, in dem der Biomarker detektiert werden kann, verbreitert werden.
Aufgrund ihrer Gesamtdimensionen, der Einfachheit in der Anwendung und der hohen Analysedurchsätze, können die Anordnungen der vorliegenden Erfindung, d.h. die Biomarker-Detektionssensoren als Substrat in Multititerplatten eingesetzt werden. Die Effizienz ist gegenüber konventionellen Fluoreszenz-Immunoassays erheblich verbessert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biomarker-Detektionssensor zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern umfassend oder bestehend aus einem Substrat mit darauf gebundenen in verzweigten zweidimensionalen Strukturen und/oder einem zweidimensionalen Gitter angeordneten Metall-Nanopartikeln, insbesondere Gold-Nanopartikeln, und an die Metall-Nanopartikel, insbesondere Gold- Nanopartikel, gebundenen Anti-Biomarker-Rezeptoren.
In breiten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind verschiedene Möglichkeiten denkbar, mittels derer die Detektion der spezifischen Biomarker angezeigt werden kann. Beispielsweise ist dies möglich durch Ausgestaltung der Detektionssensoren als Mikrowaagen, mittels derer dann spezifisch gebundene Biomarker ausgewogen werden können, d.h. die Detektion erfolgt über eine Gewichtszunahme des Sensors.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Detektion jedoch über Fluoreszenzanalysen, da diese im kontinuierlichen Betrieb besonders gut zu verwirklichen sind.
Dazu wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Ausgestaltungsformen die elektronische Struktur der Biomarker-Detektionssensoren durch die Anlagerung der krankheitsspezifischen Biomarker derart geändert, dass diese in ihrem Fluoreszenzemissions- oder -extinktionsspektrum messbar sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können aufbauend auf dem erfindungsgemäßen Prinzip quasi beliebige krankheitsspezifische Biomarker detektiert werden, es ist dafür lediglich notwendig, dass die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Antibiomarker-Rezeptoren ausreichend spezifisch für diese entsprechenden Biomarker sind.
Die Substrate der Biomarker-Detektionssensoren gemäß vorliegender Erfindung können beliebige Substrate sein, auf denen sich die Nanopartikel abscheiden lassen. In Ausführungsformen sind dies bekannte Assay-Wells, Oberflächen auf Basis von Polyacrylaten (z.B. Plexiglas®), Polystyren oder Glasoberflächen. Geeignet sind im Übrigen im Prinzip alle Substrate, die unter den experimentellen Bedingungen (unter anderem der Fierstellung) stabil sind, im jeweils untersuchten/angewandten Wellenlängenbereich für Anregung und Fluoreszenz transparent sind und keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
Die auf den Substraten abzuscheidenden Metall-Nanopartikel können im Prinzip auf allen unter Flerstellungs- und Untersuchungsbedingungen nicht korrosiven Materialien ausgewählt werden. In Varianten der vorliegenden Erfindung können die Materialien ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Edelmetallen, insbesondere Gold, Silber, Platin, Kupfer, Chrom, Legierungen davon und Janus-Partikel dieser Metalle. Besonders vorteilhaft und bevorzugt ist es, wenn die Metall-Nanopartikel Gold- Nanopartikel sind.
Bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die zu detektierende Krankheit Malaria ist. Insbesondere handelt es sich dann um den bei dem krankheitsspezifischen Biomarker um Plasmodium falciparum L-Laktat Dehydrogenase (PA.DH).
Entsprechend sind die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker- Rezeptoren in bevorzugten Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung anti- pLDH-Antikörper.
Diese anti-pLDH-Antikörper werden erfindungsgemäß auf den Gold-Nanopartikeln fixiert, d.h. daran gebunden. Mithin sind von der vorliegenden Erfindung Biomarker- Detektionssensoren der vorgenannten Art umfasst, bei denen die Anti-Biomarker- Rezeptoren anti-pLDH-Antikörper sind, die über Thiolgruppen an die Gold- Nanopartikel gebunden sind.
In besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind diese anti-pLDH- Antikörper mit UV-Strahlung vorbehandelte anti-pLDH-Antikörper.
Mittels einer UV-Strahlung als Vorbehandlung ist es möglich, die anti-pLDH-Antikörper derart zu modifizieren, dass Thiolgruppen verfügbar werden durch Spaltung von Disulfidbrücken.
Im Falle von in anti-pLDH-Antikörpern erfolgt durch die UV-Bestrahlung eine selektive Photoreduktion der Disulfidbrücken in spezifischen Cystein-Cystein/Tryptophan Triaden (bei denen die Gegenwart des Tryptophans die Disulfidbrücke in dieser Triade sozusagen aktiviert). Die Spaltung dieser Cys-Cys-Bindungen in beiden Antikörperfragmenten führt zu insgesamt vier freien Thiolgruppen, von denen zwei mit der Oberfläche der Gold-Nanopartikel interagieren können, um eine kovalente Bindung auszubilden.
Zusätzlich wird durch diese Art der Bindung erreicht, dass das spezifische Gebiet der anti-pLDH-Antikörper, an das das P/LDH bindet, von den Gold-Nanopartikeln weg in den Raum hinein orientiert angeordnet und mithin für die PfLDH gut zugänglich wird. In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die UV- Behandlung für 30 Sekunden mit einer Strahlungsleistung von 1 Watt/cm2 und bei einer Wellenlänge von 254 nm oder mit einer Strahlungsleistung von 6 Watt/cm2 und bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Obwohl im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen auf Gold- Nanopartikel abgestellt wird, bleibt darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung im Prinzip auch mit anderen Metall-Atomen denkbar ist.
Weiterhin von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Biomarker- Detektionssensoren, bei denen das Verhältnis R von Durchmesser D der Nanopartikel zum Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln (Rand-zu-Rand-Abstand) in dem zweidimensionalen Gitter >2,3 beträgt. Bevorzugt liegt dieses Verhältnis zwischen 2,3 und 3,5, und insbesondere bevorzugt bei 2,5 oder 3,0.
Besonders bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung in einer Alternative, wenn die Gold-Nanopartikel ein zweidimensionales Gitter in Form von Waben ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel sind bevorzugt hexagonal oder hexagonal dicht angeordnet.
Besonders bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung in einer anderen Alternative, wenn die Gold-Nanopartikel eine zweidimensionale verzweigte Struktur ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel sind bevorzugt in verzweigten, bandartigen Strukturen angeordnet, wobei immer nur wenige Partikel (2-4) eine dichte Packung aufweisen.
Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine dritte Alternative, wenn die Gold-Nanopartikel eine kombinierte zweidimensionale Struktur ausbilden, bei dem sowohl Teile der Struktur Gitter in Form von Waben ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel sind in diesen Teilen bevorzugt hexagonal oder hexagonal dicht angeordnet, und gleichzeitig Teile der Struktur zweidimensionale verzweigte Strukturen ausbilden, d.h. die Gold-Nanopartikel sind in diesen Teilen bevorzugt in verzweigtem, bandartigen Strukturen angeordnet wobei immer nur wenige Partikel (2-4) eine dichte Packung aufweisen und ansonsten zufällig verteilt sind. In dieser Alternative können die dichtgepackten Nanopartikel in den bandartigen Strukturen Absorptionen bei 680 nm erzeugen (delokalisierte Oberflächenplasmonen) und die Partikel, die nur mit wenigen Nachbarn dichte Abstände aufweisen, Absorptionen bei ca. 530nm (lokalisierte Oberflächenplasmonen LSPR). In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt der Durchmesser D der Nanopartikel der Biomarker-Detektionssensoren zwischen 40 und 60 nm, bevorzugt zwischen 44 und 55 nm, besonders bevorzugt zwischen 46 und 52 nm und insbesondere bevorzugt etwa 48 oder etwa 50 nm. In anderen Ausführungsformen beträgt der Durchmesser D der Nanopartikel der Biomarker- Detektionssensoren zwischen 50 und 70 nm, bevorzugt zwischen 55 und 65 nm besonders bevorzugt 60 nm.
Der Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln (den Rändern der einzelnen Partikel) der Biomarker-Detektionssensoren liegt bevorzugt zwischen 16 und 24 nm, mehr bevorzugt zwischen 17 und 22 nm, besonders bevorzugt zwischen 18 und 21 nm und insbesondere bevorzugt bei 19 oder 20 nm.
Die Größenangaben wurden bestimmt mittels Rasterelektronenmikroskopie. Ein Beispiel für ein verwendbares Mikroskop ist ein Zeiss® Leo 1550 VP.
Im Hinblick auf den Durchmesser D der Nanopartikel ist darauf hinzuweisen, dass mit den entsprechenden Angaben mittlere Durchmesser bezeichnet werden; naturgemäß streuen die effektiven Durchmesser in diesen Größenordnungen ein wenig um den entsprechend genannten spezifischen Wert. Dies wiederum bedeutet auch, dass der Abstand d zwischen den Partikeln um einen zentralwert streut. Dies ist dem Fachmann bekannt.
Bei einem Durchmesser D von 47,67 nm etwa beträgt die Abweichung in Ausführungsformen plus/minus 0,14 nm.
Bei einem Zwischenteilchenabstand (gemessen Mitte bis Mitte) von 68,47 nm etwa beträgt die Abweichung in Ausführungsformen plus/minus 0,19 nm.
Die spezifische Struktur der AuNP auf dem Substrat kann bei der Herstellung der Biomarder-Detektionssensoren der vorliegenden Erfindung gesteuert werden.
Eine einfache Variante, zwischen hexagonalen Strukturen und verzweigten Strukturen zu wechseln ist es, die Abscheidegeschwindigkeit zu regulieren; wenn die Geschwindigkeit über einen gewissen Wert erhöht wird, haben die Partikel nicht mehr ausreichend Zeit sich ideal anzuordnen und die resultierende Struktur entfernt sich von der idealen hexagonalen Anordnung. Ähnlich lässt sich die Abscheidung durch gezielte Modifikation des Substrates, beispielsweise durch aufrauen, hydrophobieren/hydrophilieren, funktionalisieren oder ähnliches beeinflussen.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Biomarker-Detektionssensor- Kits (Sensorkits) umfassend oder bestehend aus
A) mindestens einem Biomarker-Detektionssensor wie oben dargelegt,
B0) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor,
C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Küvetten, Pipetten, Lichtquelle(n), Fluoreszenzdetektor, insbesondere Fluoreszenzspektrometer.
Noch weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Biomarker- Detektionssensor-Kits (Sensorkits) umfassend oder bestehend aus A) mindestens einem Biomarker-Detektionssensor wie oben dargelegt,
B0) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor, optional
Bl) mindestens eine weitere Zubereitung umfassend mindestens ein gleiches Biomarker-spezifisches Aptamer mit anderem daran gebundenem Fluorophor, und/oder
B2) mindestens eine weitere Zubereitung umfassend mindestens ein anderes Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem anderem Fluorophor,
C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Küvetten, Pipetten, Lichtquelle(n), Fluoreszenzdetektor, insbesondere Fluoreszenzspektrometer.
Bei der Variante B2) kann zwischen zwei bevorzugten Ausführungsformen unterschieden werden in
B2i) mindestens ein, bevorzugt genau ein, anderes Biomarker-spezifisches Aptamer für den Nachweis des gleichen Biomarkers aber bindend an ein anderes Epitop des Biomarkers mit daran gebundenem anderem Fluorophor, und B2M) mindestens ein, bevorzugt genau ein, anderes Biomarker-spezifisches Aptamer für den Nachweis eines weiteren Biomarkers mit daran gebundenem anderem Fluorophor, und entsprechend ausgewählt werden aus B2i) und/oder B2M).
Die Vorteile von B2) liegen darin, dass B2i) durch das Binden von zwei Aptameren an den gleichen Biomarker die Detektion dieses Biomarkers bestätigt und somit noch zuverlässiger ist als Bl) und dass B2M) einen zweiten Biomarker nachweisen kann.
„Gleich" und „anders" bezieht sich bei Bl), B2) jeweils auf B0).
Sofern im Folgenden eine Einzelvariante beschrieben/diskutiert wird, ist dies, sofern nicht anders angeführt, B0) oder eine beliebige.
Im Zusammenhang mit dem Begriff „Kit" sei drauf hingewiesen, dass dieses Kit nicht zwangsweise für die „Flosentasche" geeignet sein muss. Vielmehr soll dadurch ausgedrückt werden, dass vor der Analyse sowohl der Biomarker-Detektionssensor wie oben beschrieben als auch die Zubereitungen umfassend Biomarker-spezifische Aptamer(e) getrennt voneinander vorliegen, obwohl sie aufeinander abgestimmt und zugehörig sind. Zudem soll das Kit auch mehrere Detektionssensoren und mehrere Aptamerzubereitungen, die auch für verschiedene Biomarker ausgeführt sind, umfassen können.
Dem Fachmann ist in diesem Zusammenhang auch ohne weiteres klar, dass das weitere Analysenmaterial nicht zwangsweise auf die eben genannten Küvetten, Pipetten, Fluoreszenzlichtquelle und Fluoreszenz-Detektor beschränkt ist, sondern im Rahmen des Üblichen weiteres Material umfassen kann.
In Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass das Biomarker- Detektionssensor-Kit als transportables Kit ausgestaltet ist. In diesem Zusammenhang ist dann eine transportable Lichtquelle beispielsweise in Form einer Taschenlampe ausgestaltet und der Fluoreszenzdetektor entsprechend auch in einer vergleichsweise handlichen Form ausgestaltet. Für diesen Zweck kann es in Varianten ausreichend sein, wenn der Fluoreszenzdetektor lediglich ein Fluoreszenzsignal anzeigt, aber nicht zwangsweise dessen Intensität quantitativ darstellen kann. Dies wäre ein Beispiel für einen Schnelltest-Kit. Genauso ist es aber auch möglich, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Biomarker-Detektionssensor-Kit im Labormaßstab ausgestaltet ist, d.h. insbesondere sowohl die Fluoreszenzlichtquelle als auch der Fluoreszenzdetektor für dauerhaften Laborbetrieb geeignet und ausgestaltet sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass das Biomarker-spezifische Aptamer im Prinzip für beliebige krankheitsspezifische Biomarker passend ausgewählt wird.
Wesentlich ist dabei jedoch, dass das Biomarker-spezifische Aptamer in Übereinstimmung mit dem an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker- Rezeptor übereinstimmend auf den gleichen Biomarker gerichtet ist, wobei Aptamer und Antikörper auf verschiedene Epitope des Biomarkers gerichtet sind (für den Fall, dass Aptamer und Antikörper auf das gleiche Epitop gerichtet wären, würden sie in Konkurrenz zu einander stehen und das Ergebnis verschlechtern).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Biomarker-spezifische Aptamer um ein Malaria-spezifisches Aptamer handelt. Insbesondere bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Biomarker spezifische Aptamer das Malaria-2008-Aptamer.
Weiterhin ist im Prinzip jedes Fluorophor, das chemisch an diesen Biomarker gebunden werden kann, geeignet. Beispiele für einsetzbare Fluorophore sind 5-FAM (5-Carboxyfluorescein), Cyanin 7, Cyanin 5, Cyanin 3b oder auch Quantenpunkte.
In der Praxis haben sich als Fluorophore für solche oder ähnliche Untersuchungen 5- FAM und Cyanin 5 als Fluorophore gut bewährt.
Entsprechend ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn 5-FAM und/oder Cyanin 5 als Fluorophor an das Biomarker-spezifische Aptamer gebunden wird.
Das höchst bevorzugte Biomarker-spezifische Aptamer im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist mithin das Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5, sofern ein einziges Fluorophor eingesetzt wird.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn gleichzeitig zwei verschiedene Fluorophore eingesetzt werden.
Dies führt dann zu einer Überlappung der Plasmonresonanzen und kann mithin zu einer weiteren Verstärkung des Signals genutzt werden. Auch in diesen Ausgestaltungen sind im Prinzip alle Fluorophore, die chemisch an die Biomarker gebunden werden können, geeignet.
Besonders bevorzugt ist es, wenn als Fluorophore 5-FAM und Cy5 kombiniert werden. In diesem Fall ist die Plasmonresonanz derart ausgestaltet, dass sie mit dem Emissionspeak des 5-FAM mit sowohl dem Anregungsspeak als auch dem Emissionspeak des Cy5 gekoppelt ist, womit, durch Emissionsratenverbesserung, eine 160-fache Fluoreszenzverstärkung und, durch einen Dualmechanismus (Anregungs und Emissionsraten), eine 5200-fache Signalverstärkung erzielt wird.
Durch die Kombination von beiden Fluoreszenzdetektionen erweitert sich der Erfassungskonzertierungsbereich um zwei Größenordnungen im Vergleich mit einer Detektion nur eines einzelnen Fluorophors in komplexen Matrizen, wie menschlichem Blut. Darüber hinaus verbessert die Bestätigung der Analytbindung durch zwei redundante Fluoreszenzsignale die Zuverlässigkeit des Signals und vermindert falsch positive Signale aufgrund unspezifischer Bindung. Alternativ kann der vorgeschlagene Ansatz auch für die gleichzeitige Überwachung verschiedener Biomarker bei niedrigen Konzentrationen verwendet werden, was den Weg für eine potenzielle Multiplex- und Flochdurchsatzanalyse ebnet.
In diesen Ausgestaltungen können zwei verschiedene Biomarker-spezifische Aptamere eingesetzt werden, oder aber die gleichen.
Mithin lassen sich in diesen Ausgestaltungen verschiedene Biomarker-spezifische Aptamere mit gleichen Fluorophore oder unterschiedlichen Fluorophoren einsetzen, um verschiedene Biomarker gleichzeitig zu detektieren, oder aber das gleiche Biomarker-spezifische Aptamer mit unterschiedlichen Fluorophoren zur Detektion des gleichen Biomarkers aber bei unterschiedlichen Wellenlängen.
Analoge Vorgehensweisen und Ausgestaltungen mit drei oder noch mehr verschiedenen Fluorophoren und/oder Biomarker-spezifischen Aptameren sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Es lassen sich mithin mit der vorliegenden Erfindung viele verschiedene Varianten abdecken, die eine hohe Flexibilität ermöglichen, insbesondere bei Verwendung in Form von Kits. Es ist bemerkenswert, dass durch die Variante der vorliegenden Erfindung mit zwei verschiedenen Fluorophoren, insbesondere 5-FAM und Cy5, der zugängliche Detektionsbereich durch die Verwendung beider Fluorophore erweitert wird, wobei Cy5 im unteren Konzentrationsbereich (bis zu 0,1 pM) empfindlicher ist, während 5- FAM große Konzentrationen (bis zu 1 pM) abdeckt. Auf diese Weise kann beispielsweise über sieben Größenordnungen gemessen werden, anstatt vier oder fünf für einen Fluorophor allein.
Insofern war es auch Teil der vorliegenden Erfindung, Multiplex-Detektion - unter Beibehaltung hoher Qualitätsleistungen - zu ermöglichen und eine entsprechend entwickelte doppelresonante plasmonische Nanostruktur, die für den gleichzeitigen Nachweis von zwei verschiedenen Analyten in der interessierenden Matrix geeignet ist, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Dazu werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mittels Block- Copolymer-Mizellen-Nanolithographie (BCMN) Verzweigungsmuster aus plasmonengekoppelten, wabenförmig angeordneten AuNPs, die einen kollektiven Modus erzeugen, dessen Resonanz im fernen roten Bereich liegt, und eingestreuten plasmonenentkoppelten AuNPs, die eine schmale lokalisierte Oberflächenplasmonresonanz (LSPR) bei 524 nm aufweisen, hergestellt.
Die genannte Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor kann dieses Aptamer an sich sein, kann aber auch neben dem Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor noch weitere Stoffe enthalten, wie diese für die Verwendung von solchen Aptameren mit daran gebundenen Fluorophoren in der Fachwelt bekannt sind. Beispielsweise kann das Fluorophor- gelabelte Aptamer in wässrigen Lösungen vorliegen, wobei diese wässrigen Lösungen beispielsweise noch gepuffert sein können oder auch Konservierungsmittel oder ähnliches enthalten können. In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gut geeignet sind beispielsweise 10 millimolare phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS). Dies gilt sinngemäß entsprechend für alle Varianten B0), Bl) und B2).
Wesentlich ist es bei diesen Biomarker-Detektionssensor-Kits auch, dass die Biomarker-Detektionssensoren wie oben beschrieben ausgestaltet sind. Denn durch die Kombinationen der Biomarker-Detektionssensoren wie oben beschrieben mit den Zubereitungen umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer wird eine hohe Selektivität ermöglicht.
Die Selektivität für das erfindungsgemäß bevorzugt zu bestimmende P/LDH wird insbesondere durch die Kombination des anti-pLDH-Antikörpers, der über Thiolgruppen an die Gold-Nanopartikel gebunden ist, und dem Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5 als Fluorophor erreicht.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass für die Ausgestaltung mit einem Fluorophor bei einem Durchmesser D der Nanopartikel von 48 oder 50 nm und einem Zwischenpartikelabstand (Rand-zu-Rand) d in dem zweidimensionalen Gitter von 19 oder 20 nm zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln, welche über Thiolgruppen daran gebundene anti-pLDFI-Antikörper aufweisen, in Kombination mit dem Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor Cyanin 5 eine besonders starke Fluoreszenzerhöhung erreicht werden konnte.
Entsprechend kann mit dieser besonders bevorzugten Ausgestaltungsform eine besonders hohe Spezifizität und Empfindlichkeit erreicht werden.
Die Fluoreszenzintensität ist dabei von der Konzentration des Biomarkers abhängig. Die Intensität steigt mit zunehmender Konzentration des Biomarkers an und nähert sich asymptotisch einem Grenzwert an. Dieser Grenzwert wird erreicht, wenn alle Antikörper durch daran gebundene Biomarker belegt sind.
Bis zur Vollbelegung aller Antiköper ist eine quantitative Bestimmung der Biomarkerkonzentration möglich, indem die Fluoreszenzintensität bestimmt wird.
Ab dem Zeitpunkt der vollständigen Belegung aller Antikörper mit Biomarkern erfolgt keine Quantifizierung mehr, sondern lediglich eine qualitative Anzeige (wie vorher natürlich zusätzlich auch schon).
Im Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Biomarker- Konzentrationen zwischen 0,001 Femtomol und 100 Nanomol, insbesondere zwischen 0,01 Femtomol und 10 Nanomol, quantitativ bestimmt werden. Flöhere Konzentrationen sind Qualitativ bestimmbar.
Qualitative Bestimmung bedeutet dabei, dass die Gegenwart des Biomarkers durch Fluoreszenz angezeigt wird, aber die genaue Menge nicht bestimmt wird oder, für den Fall der vollständigen Belegung aller Antiköper, nicht bestimmt werden kann. Für den Einsatz der vorliegenden Erfindung als Schnelltest bzw. Point-of-Care-Analyse ist die Qualitative Bestimmung in der Regel ausreichend. Die quantitative Bestimmung kommt in der Regel bei genaueren klinischen Untersuchungen zum Einsatz.
Es ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass dies beides möglich ist.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass für andere Fluorophore andere Dimensionen im Hinblick auf die Durchmesser D und Abstand d vorteilhafter sein können. Dies kann im Einzelfall genau abgestimmt werden.
Gleichsam ist darauf hinzuweisen, dass die Ordnungssymmetrie des zweidimensionalen Gitters der Gold-Nanopartikel einen Einfluss auf die Plasmonenresonanz nehmen kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde mit hexagonal oder hexagonal dicht gepackten Gold-Nanopartikeln eine besonders gute Plasmonenresonanz erzielt; gleichsam sind von der vorliegenden Erfindung aber auch kubisch dicht gepackte, zufällig dicht gepackt oder auch andere, Ordnungssymmetrien umfasst.
Für die besonders bevorzugten Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung mit einer hexagonalen oder hexagonal dichten Packung der Gold-Nanopartikel, anti-pLDFI- Antikörpern und Malaria-2008-Aptamer mit daran gebundenem Cyanin 5, für D = 40 bis 60 nm, bevorzugt 44 bis 55 nm, besonders bevorzugt 46 bis 52 nm, insbesondere bevorzugt 48 oder 50 nm und d = 16 bis 24 nm, bevorzugt 17 bis 22 nm, besonders bevorzugt 18 bis 21 nm, insbesondere bevorzugt 19 oder 20 nm, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine besonders hohe Verstärkung der Fluoreszenz beobachtet und gefunden, da sich die erzeugte Plasmonenresonanz mit der Fluorophor-Absorption und Fluorophor-Emission überlagert; dies wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als duale Verstärkung bezeichnet, weil beide Prozesse gleichsam verstärkt werden.
In diesem Zusammenhang sei auch darauf hingewiesen, dass die duale Verstärkung für die Variante der hexagonalen Anordnungen und mit einem Biomarker-spezifischen Aptamer und einem daran gebundenen Fluorophor durch die Plasmonenresonanz ihr Maximum bei etwa 10 nm Abstand von der Partikeloberfläche erreicht. Durch die eben beschriebene Kombination von Antikörper/PfLDFI/Aptamer wird im Rahmen dieser Variante der vorliegenden Erfindung genau dieser Abstand erreicht. Entsprechend wird durch diese besonders bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung eine besonders starke duale Verstärkung erzielt und besonders hohe Selektivität und Effizienz erreicht.
Dies ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber einem Sandwich- Assay, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, da bei solchen Sandwich-Assays zwei Antikörper verwendet werden. Diese zwei Antikörper würden aber dazu führen, dass der Abstand zwischen dem Fluorophor und der Partikeloberfläche zu groß wird und die entsprechende Verstärkung geringer. Dies würde dann zu schlechteren Detektionsgrenzen und geringerer Effizienz führen.
Insofern ist die vorliegende Erfindung im Hinblick auf aus dem Stand der Technik bekannte Sandwich-Assays stark verbessert.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten. Dieses Verfahren umfasst die im Folgenden genannten Schritte oder besteht aus diesen Schritten:
Schritt i) besteht in der Bereitstellung eines Biomarker-Detektionssensors wie oben beschrieben.
Als Schritt ii) wird dann eine Körperflüssigkeitsprobe auf den Sensor aufgebracht und mit mindestens einem Biomarker-spezifischen Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor versetzt.
Dies kann derart passieren, dass die Körperflüssigkeitsprobe und der mindestens eine Biomarker-spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor gleichzeitig auf den Sensor aufgebracht werden, oder dass das mindestens eine Biomarker-spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor vorher oder nachher zugefügt wird. Genauso ist es möglich, direkt schon eine vorher angefertigte Mischung aus Körperflüssigkeitsprobe und mindestens einem Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor auf den Sensor aufzubringen.
Die auf den Sensor aufgebrachte Probe wird dann in Schritt iii) mittels einer Lichtquelle bestrahlt. Die Lichtquelle wird dabei derart ausgesucht, dass das verwendete Fluorophor besonders gut angeregt wird. In bevorzugten Ausgestaltungen ist diese Lichtquelle eine Lichtquelle, die im roten Bereich des sichtbaren Spektrums emittiert; besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn die Lichtquelle in einem Wellenlängenbereich zwischen 610 und 670 nm, bevorzugt zwischen 625 und 655 nm, insbesondere, im Fall von Cyanin 5 als Fluorophor, bei 625 nm emittiert. Für den Fall von 5-FAM als Fluorophor werden besonders bevorzugte Ergebnisse erzielt, wenn die Lichtquelle Wellenlängen von 450 nm bis 510 nm, insbesondere 470 nm emittiert.
Als Nächstes wird als Schritt iv) die Fluoreszenzemission der Probe detektiert.
Diese Detektion kann im Prinzip mit allen in der Fachwelt bekannten Methoden erfolgen. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren mit einem der erfindungsgemäßen Biomarker-Detektionssensor-Kits ausgeführt wird, kann dies auch eine rein visuelle Erfassung durch die das Verfahren ausführende Person sein, die Detektion würde in diesem Falle einfach über den optischen Eindruck, den der das Verfahren Durchführende erhält, erfolgen.
Bevorzugt erfolgt die Detektion aber mit dedizierten Fluoreszenzspektrometern, beispielsweise solchen basierend auf CMOS oder sCMOS-Photodetektoren.
Bei Anregungen durch eine Lichtquelle mit Wellenlängen von 625 bis 655 nm werden beispielsweise für den Fall anti-pLDFI-Antikörper/Pfl_DFI/Malaria2008-Aptamer-Cy5 Emissionen von 665 bis 715 nm erhalten und für eine Anregung mit Wellenlängen von 450 bis 490 nm für den Fall anti-pLDFI-Antikörper/Pfl_DFI/Malaria2008-Aptamer-5FAM Emissionen von 500 bis 550 nm.
Das mindestens eine mit der Körperflüssigkeitsprobe zu vermischende Biomarker spezifische Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor ist wie oben beschrieben und kann auch in Form der für das Biomarker-Detektionssensor-Kit beschriebenen Zubereitung vorliegen, die dieses Biomarker-spezifische Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor enthält.
Als optionaler Schritt v) kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Analyse der Fluoreszenzemission erfolgen. Diese Analyse kann sowohl quantitativ als auch qualitativ oder beides sein. Zweckmäßigerweise erfolgt diese Analyse mittels handelsüblicher Computer und dem Fachmann bekannten Fluoreszenz- Datenverarbeitungsprogrammen.
Weiterhin optional als Schritt vi) im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das ermittelte Ergebnis der Fluoreszenzemissionsanalyse gespeichert werden oder angezeigt werden oder beides. Obwohl bei dem Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern gemäß vorliegender Erfindung die Körperflüssigkeit nicht auf eine spezielle Körperflüssigkeit beschränkt ist, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass er die Körperflüssigkeit danach auswählt, ob die von ihm gesuchten krankheitsspezifischen Biomarker in der jeweiligen Körperflüssigkeit Vorkommen.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Blutproben.
Die Körperflüssigkeiten können vor Einsatz in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung entsprechend den in der Fachwelt üblichen Verfahren aufgearbeitet bzw. vorbereitet werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung insbesondere dafür geeignet und dazu gedacht ist, Körperflüssigkeitsproben zu untersuchen, die bereits als solche vorliegen, d.h. die Entnahme von Körperflüssigkeiten ist nicht Teil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugt bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es sich bei den Anti-Biomarker-Rezeptoren um anti- pLDFI-Antikörper handelt, und bei den Biomarker-spezifischen Aptameren um Malaria- 2008-Aptamere, an die bevorzugt 5-FAM und/oder Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist/sind; in Übereinstimmung mit der den obigen Ausführungen zum Biomarker Detektionssensor bzw. der Biomarker-Detektionssensor-Kit der vorliegenden Erfindung.
Durch die Vorbehandlung der anti-pLDFI-Antikörper mittels UV-Strahlung werden diese aktiviert. Im Rahmen dieser Aktivierung werden die Antikörper in eine Konformation überführt, so dass sie an die Gold-Nanopartikel in einer Art und Weise binden, welche die Bindungsepitope des Antikörpers leicht zugänglich für den zu untersuchenden Biomarker machen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Verwendungen der Biomarker- Detektionssensoren, der Biomarker-Detektionssensor-Kits oder des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern.
Insbesondere ist diese Verwendung umfasst für die Bestimmung von Malaria- Biomarkern und insbesondere in Körperflüssigkeitsproben, höchst bevorzugt in Blutproben.
Eine weitere bevorzugte Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist die Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren gemäß vorliegender Erfindung als Substrat in automatisierten Multititerplatten.
Die Biomarker-Detektionssensoren gemäß vorliegende Erfindung kann analog zu Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., „Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications", Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https://doi.Org/10.1116/l.3536839 erfolgen.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Die Figuren sind dabei nicht unbedingt maßstabsgetreu und vereinfacht. So sind übliche, dem Fachmann geläufige Maßnahmen etc. nicht unbedingt dargestellt (Schrauben, Ventile, Reaktionsgefäße, genaue Molekülstruktur etc.), um die Lesbarkeit der Figuren zu erleichtern.
Figurenbeschreibung:
Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Herstellung eines Biomarker-Detektionssensors gemäß vorliegender Erfindung.
Die Herstellung dieser Arrays von Gold-Nanopartikeln erfolgte dabei, wie in Abschnitt A) illustriert ist, zunächst über Nanolithographie basierend auf der Selbstanordnung von Blockcopolymeren. Dazu werden Blockcopolymere 7 verwendet, die eine hydrophile Kette (dargestellt durch Strich) und eine hydrophobe Kette (dargestellt durch Block) haben. Durch Vermischen mit einem unpolaren Lösungsmittel, insbesondere Toluen T, entstehen inverse Mizellen 8, d.h. Mizellen, bei denen der Kern hydrophil und die äußere Schale hydrophob ist. Zu dieser Mischung enthaltend die inversen Mizellen wird dann ein Gold-Salz Au-S (beispielsweise HAuCU) hinzugegeben, was dazu führt, dass die inversen Mizellen Gold-Precursoren 9 in ihrem Zentrum, dem hydrophilen Kern, aufnehmen. Diese Mizellen können dann auf einem Substrat 1, beispielweise mittels Tauch-Beschichter, abgeschieden werden. Aufgrund ihrer Struktur ordnen sich die Mizellen dann auf der Oberfläche des Substrats in regelmäßigen Strukturen an. Anschließend werden dann die Mizellen um die Gold- Precursoren herum entfernt, beispielsweise mittels Plasmaofenbehandlung. Dabei werden auch die Gold-Precursoren 9 zu den Gold-Nanopartikeln 2 reduziert. Auf der Oberfläche verbleibt dann ein zweidimensionales Gitter von Gold-Nanopartikeln 2 (ungefüllte Kreise).
In Abschnitt B) ist illustriert, wie eine Lösung von anti-pLDH-Antikörpern 10 mittels UV-Strahlung (dargestellt als Blitz) vorbehandelt und dann anschließend diese behandelte wässrige Lösung 10a auf das in Abschnitt A) hergestellte Substrat mit darauf befindlichen Gold-Nanopartikeln gegossen wird, wobei sich die Antikörper an die Gold Nanopartikel binden.
Im Ergebnis erhält man dann das in Abschnitt C) illustrierte Substrat 1 mit darauf befindlichen Gold-Nanopartikeln 2, an die die Anti-Biomarker-Rezeptoren gebunden sind, was hier durch gefüllte Kreise dargestellt wird. Diese Herstellungsweise ist beispielsweise auch in Lohmüller, T., Aydin, D., Schwieder, M. et al., „Nanopatterning by block copolymer micelle nanolithography and bioinspired applications", Biointerphases 6, MR1-MR12 (2011), https://doi.Org/10.1116/l.3536839 beschrieben.
Figur 1 gibt die Anordnung der Teilchen auf dem Substrat nur schematisch-illustrativ wieder und ist nicht auf eine bestimmte Anordnung beschränkt. Die in dieser Figur illustrierte Herstellungsweise kann sowohl für die Herstellung von Substraten mit hexagonal darauf angeordneten Nanopartikeln (wie illustriert), als auch für die Herstellung von verzweigt angeordneten Nanopartikeln oder auch für Mischformen eingesetzt werden.
Figur 2a ist eine Rasterelektronmikroskop-Aufnahme eines mit geordneten Gold- Nanopartikeln versehenen Substrats gemäß einer Variante der vorliegenden Erfindung. Aus dieser Aufnahme ist zu ersehen, dass bei der Herstellung der Sensoren durchaus Fehlstellen Vorkommen können. Allerdings sind diese Fehlstellen für die Gesamt-Performance des Biomarkers-Detektionssensors nicht schädlich, da diese im Rahmen der Plasmonenresonanz bzw. der dualen Verstärkung sozusagen herausgemittelt werden. Figur 2b sind zwei Rasterelektronmikroskop-Aufnahmen eines anderen mit geordneten Gold-Nanopartikeln versehenen Substrats gemäß einer anderen Variante der vorliegenden Erfindung. Aus diesen Aufnahmen ist zu ersehen, dass hierbei in der Nahordnung noch hexagonale Strukturen gegeben sind, die Fernordnung aber im wesentlichen verzweigte Strukturen sowie auch vereinzelte Nanopartikel aufweist. Dabei zeigt das obere Bild eine Struktur vor und das untere Bild eine nach dem AuNP- Wachstum.
Figur 3 ist ein Diagramm, in welchem die beiden schmaleren Kurven das Anregungsspektrum (links, gestrichelte Kurve) und das Emissionsspektrum (rechts, gepunktete Kurve) von Cyanin 5 (Cy5) darstellen und die breite Kurve das experimentell bestimmte Extinktionsspektrum eines Malaria-Biomarker Detektionssensors (gemäß dem nachfolgend beschriebenen Beispiel A) hergestellt). Es ist ersichtlich, dass das breite Extinktionsspektrum die Überlagerung der plasmonischen Resonanz über sowohl Extinktions- als auch Emissionsspektrum von Cyanin 5 erlaubt. Die Wellenlänge in nm ist auf der x-Achse aufgetragen und die Extinktion (links) und die normalisierte Anregung (Excitation) / Emission (rechts) auf der y-Achse.
Figur 3b für ein gemäß dem nachfolgend beschriebenen Beispiel B) hergestelltes Substrat zeigt das experimentelle (durchgezogene Linie) Extinktionsspektrum. Zudem ist die Plasmon-Fluorophor-Überlappung mit 5-FAM- (Emissionsspektrum, klein gestrichelte Linie // Anregungsspektrum, groß gestrichelte Linie) und Cy5- (Emissionsspektrum, Strich-Punkt-Linie // Anregungsspektrum, gepunktete Linie) Farbstoffen gezeigt. Dabei ist zu sehen, dass das experimentelle Extinktionsspektrum zwei plasmonische Resonanzen bei 524 nm und 675 nm zeigt. Isolierte AuNP tragen dabei zu der Resonanz bei kleinerer Wellenlänge bei, wie dies ausgehend von 30 nm Goldnanosphären in Luft zu erwarten war, wohingegen AuNP, die entlang der Zweige angeordnet sind zu einer kollektiven Resonanz bei höherer Wellenlänge führen. Auf der linken Achse ist die Extinktion aufgetragen, auf der rechten Achse Anregung/Emission. Auf der horizontalen Achse ist die Wellenlänge in nm aufgetragen.
Figur 4 ist eine diagrammatische Darstellung der Teilchengrößenverteilung von Goldnanopartikel, die gemäß dem nachfolgend beschriebenen Beispiel A) hergestellt wurden. Der mittlere Durchmesser D der Gold-Nanopartikel bei diesem Beispiel liegt bei etwa 48 nm (47,67 + 0,14 nm).
Figur 5 ist eine diagrammatische Darstellung der Zwischenpartikelabstände in Nanometern bezogen auf die jeweiligen Mitten der Nanometer. Der mittlere Zwischenteilchenabstand, gemessen Mitte zu Mitte, liegt bei etwa 68 nm (68,47 + 0,19 nm)), woraus sich ein Zwischenpartikelabstand, gemessen Teilchenrand zu Teilchenrand, von etwa 20 nm ergibt (gemäß dem nachfolgend beschriebenen Beispiel A) hergestellt).
Figur 6 zeigt schematisch die Funktionsweise der vorliegenden Erfindung an einem einzigen Goldnanoteilchen (AuNP). Basis ist ein auf einem Substrat 1 angeordnetes Goldnanoteilchen 2, an das Antikörper 3 (hier als Y dargestellt) gebunden sind. In dieser Figur wird durch die Darstellungsweise der Antikörper 3 klar, dass diese in einer Konformation an die Gold-Nanopartikel 2 gebunden sind, welche die Bindungsepitope der Antikörper leicht für den jeweiligen Biomarker zugänglich machen. Dies ist dadurch illustriert, dass jeweils ein „Arm" der Antikörper 3 vom Gold- Nanopartikel 2 fort orientiert ist. Ferner ist der zu untersuchende Biomarker 4 (Pfl_DH) dargestellt (nur einer, der Übersichtlichkeit halber, in Form einer Wolke), welcher hier als an das Bindungsepitop des mittleren Antikörpers 3 bindend dargestellt ist. Auf der anderen Seite des Biomarkers 4 ist dann ein Aptamer 5 dargestellt, welches somit den Biomarker 4 zusammen mit dem Antikörper 3 sozusagen in die Zange nimmt (Sandwich). An der dem Biomarker 4 abgewandten Seite des Aptamers 5 ist das Fluorophor 6 als Stern dargestellt, der dessen Fluoreszenz-Emission darstellen soll. Der Abstand zwischen dem Fluorophor 6 und der Oberfläche 1 beträgt hier ungefähr 10 nm, wodurch mit dieser Anordnung sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Selektivität erreicht wird.
Figur 7 zeigt ein Bild der Fluoreszenzpunkte eines Sensoraufbaus mit detektiertem Biomarker gemäß Beispiel B), unten. Das Bild zeigt eine Wiedergabe, bei der die rot- und grün-Kanäle, die aus der Detektion mit zwei Farbkanälen, d.h. zwei verschiedenen Fluorophoren (5-FAM und Cy5) resultieren, vereint dargestellt sind (hier zu Reproduktionszwecken in schwarz-weiß). Man sieht deutlich die Fluoreszenzpunkte und mithin die gute Detektierbarkeit, die mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann. Eine entsprechende Detektierbarkeit gilt auch für die Variante nach Beispiel A) (nicht gezeigt). Bezugszeichenliste:
In den Figuren bedeuten gleiche Bezugszeichen gleiche Materialien, Stoffe etc.
1 Substrat
2 Gold-Nanopartikel
2a Gold-Nanopartikel mit gebundenen Antikörpern
3 Antikörper
4 Biomarker
5 Aptamer
6 Fluorophor
7 Blockcopolymer
8 inverse Micelle
9 Gold-Nanopartikel-Precursor
10 Lösung von anti-pLDFI-Antikörpern (unbehandelt)
10a Lösung von anti-pLDH-Antikörpern (nach UV-Behandlung)
T Toluen
Au-S Goldsalz, insbesondere HAuCU
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Heranziehung der folgenden nicht- limitierenden Beispiele näher erläutert. Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele dienen dazu die darin ausgeführten Ausgestaltungen darzulegen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Variationen dieser Beispiele im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich sind.
Beispiele:
0. Materialien und Chemikalien
Diblockcopolymere (P18226-S2VP bzw. P3807-S2VP) wurden von Polymer Source Inc. (Dorval, Canada) gekauft und wurden hergestellt aus Polystyren(x)-b-2- polyvi nyl pyrid i n(y) (PS(x)-b-P2VP(y)), worin x = 30000 und y = 8500 bzw. x = 325000 und y = 92000 das jeweilige Molekulargewicht von Polystyren (PS) und Poly(2-vinylpyridin) (P2VP) angeben (Angegeben ist jeweils das Zahlenmittel (MN) der Verteilung. Das Verhältnis von MW: MN liegt für P18226-S2VP bei 1,06 und indiziert eine sehr monodisperse Verteilung). Toluen (99,8%), Gold(III)chlorid-T rihyd rat (HAUCU*3H20), Silbernitrat (AgNCb) und Ascorbinsäure wurden von Sigma-Aldrich gekauft; Aceton (>99,0%), 2-Propanol (>99,5%) und Ethanol (>99,5%) wurden von Merck Millipore gekauft; Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (>99,0%) wurde von Fluka gekauft; Bovinserumalbumin (BSA) (Fraktion V IgG-frei, arm an Fettsäuren) kam von Gibco. Flochreines entionisiertes Wasser, dass für alle wässrigen Lösungen verwendet wurde, wurde aus einem Milli-Q®-System (18,2 Megaohm spezifischer Widerstand) dosiert.
10 mM Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (NaCI 10 mM, NaF PO 10 mM, NazFIPO 10 mM, MgCh 1 mM, pH 7,1) und 25 mM Tris-HCl-Puffer (NaCI lOOmM, Imidazol 20 mM, Tris (=Tris(hydroxymethyl)aminomethan) 25 mM, HCl 25 mM, pH 7,5) wurden durch lösen der Reagenzien (gekauft von Sigma-Aldrich) in hochreinem Wasser hergestellt. Pan-Malaria-Antikörper (monoklonaler anti-pLDH Antikörperklon 19g7) wurde von Vista Laboratory Services (Langley, USA) hergestellt. Die rekombinante Plasmodium falciparum- Laktatdehydrogenase (P/LDH) und PvLDH wurden durch bakterielle Expression erhalten. Die Malaria 2008s-Aptamere gelabelt mit 5-FAM bzw. Cyanin-5-Tag (5'-5-FAM(Cy5)-CTG GGC GGT AGA ACC ATA GTG ACC CAG CCG TCT AC-3') wurden durch Friz Biochem GmbH (Neuried, Deutschland) hergestellt. Millex® Spritzenfilter (Porengröße 0,20 pm) mit hydrophober Polytetrafluorethylenmembran wurden von Merck Millipore gekauft; Superslip® Deckgläser (Borosilikatglas, Dicke 0,13 - 0,17 mm) wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft und durch einen Glasschneider mit Diamantspitze geschnitten.
Beispiel A):
1. Herstellung eines geordneten Arrays von AuNPs zur Detektion von Pf LDH in Blut
Nanolithographie basierend auf der Selbstanordnung von Blockcopolymeren wurde eingesetzt, um Arrays von geordneten AuNPs mit einstellbarer Dichte, Größe und Zwischenpartikelabstand herzustellen. 29,2 mg der Diblockcopolymere P18226-S2VP wurden unter starkem Rühren und unter kontrollierten Bedingungen (Argoninertgas, O2 < 1 ppm, H2q<0,1 ppm) zu 15 ml Toluen gegeben und für 72 Stunden gehalten, um ein homogen dispergierte, umgekehrte Micellen mit hydrophilem Kern und äußerer hydrophober Schale (kugelförmig) zu erhalten. Dann wurden 15,7 mg HAuCU*3H20 während 72 Stunden in die Lösung gegeben, um den Goldprekursor in dem hydrophilen Kern der Micellen aufzunehmen, was zu der Bildung von AuNPs, die von einer hydrophoben Schale umhüllt waren, führte. Nachdem das Goldpulver vollständig dispergiert war, wurde die gelbliche Lösung filtriert, um Micellenaggregate und Verunreinigungen zu entfernen. Unter Beibehaltung des Rührens konnte diese Lösung für mindestens sechs Monate gelagert werden. Bevor die PS-AuNPs auf den Glasdeckgläsern (die eine Größe von 10 x 8 mm2 hatten) abgeschieden wurden, wurden die Substrate mittels Ultraschall für fünf Minuten nacheinander in Aceton, 2-Propanol und reinem Ethanol gereinigt und in Toluen getaucht werden, um die Oberfläche nicht-polar „zu machen", so dass die hydrophoben Hüllen an dieser anhaften konnten. Anschließend wurden die Substrate mittels eines Tauchbeschichters bei sorgfältiger Einstellung der Eintauchgeschwindigkeit in die PS-AuNPs enthaltende Lösung getaucht. Es stellte sich dabei heraus, dass eine Eintauchgeschwindigkeit von 0,6 mm/s eine besonders gute Beschichtung der Glasoberfläche sowohl im Hinblick auf die Dichte der Anordnung der AuNPs als auch im Hinblick auf die großflächige Gleichmäßigkeit der Abscheidung ermöglichte. Die PS-AuNPs wurden auf der nicht-polaren Glasoberfläche durch hydrophobe Interaktion transferiert, wodurch eine hexagonale Anordnung mittels Selbstorganisation erfolgte. Ein entsprechender Vorgang ist auch in Figur 1 illustriert. Danach wurden die Copolymere mittels Sauerstoffplasmabehandlung geätzt (0,8 mbar Druck, 200 W, 30 Minuten), wodurch die AuNPs an präfixierten Positionen auf der Glasoberfläche immobilisiert wurden.
Weil die plasmonische Resonanz stark von dem Verhältnis R zwischen dem AuNP- Durchmesser D und dem Zwischenpartikelabstand d abhängt, garantieren höhere Werte von R eine größere Kopplung zwischen den AuNPs. Für R> 2/3 wird die plasmonische Resonanz durch das kollektive Verhalten der AuNPs dominiert, und mehrere Vorteile für die Metallverstärkte Fluoreszenz (MEF) resultieren. Um R zu erhöhen, wurden die Substrate für 2 Stunden unter Lichtausschluss mit 2 ml einer Au- Depositionslösung (CTAB 190 mM, HAuCU*3H20 42 mM, AgNC 8 mM, Ascorbinsäure 100 mM) inkubiert. Danach wurden die Substrate reichlich mit hochreinem Wasser gespült und bis zur Verwendung unter Lichtausschluss gelagert. Die Charakterisierung der nanostrukturierten Substrate erfolgte mittels UV-VIS-Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
Darstellungen der Messergebnisse finden sich in Figuren 2 bis 5.
2. Funktionalisierung
Die Funktionalisierung der AuNPs mit Pan-Malaria-Antikörpern wurde mittels photochemischer Immobilisierungstechnik (PIT) vorgenommen. Dazu wurde 1 ml wässrige Lösung von anti-pLDH (25 pg/ml) mittels einer UV-Lampe für 30 Sekunden bestrahlt und dann auf das Substrat gegossen. Die UV-Quelle bestand aus zwei U- förmigen Niederdruckquecksilberlampen (2 W bei 254 nm) in die eine Standardquarzküvette eingesetzt werden konnte. Unter Berücksichtigung der Geometrie der Lampen und der Nähe zu der Küvette, lag die Strahlungsintensität, die zur Generierung der Thiolgruppen verwendet wurde, bei ungefähr 1 W/cm2. Diese Intensität war so schwach, dass eine direkte Photolyse der Disulfidbrücken, die bei 254 nm nur schwach absorbieren, vermieden wird. Lediglich die Disulfidbrücke der Cys-Cys-Trp-Triade (bei der das Tryptophan die Disulfidbrücke „aktiviert") wurde dadurch gespalten. Funktionalisierung mittels PIT stellte sicher, dass die Antikörper (Abs) kovalent auf die Goldoberfläche geknüpft und ihre Bindungsstellen für die Umgebung zugänglich wurden.
3. Waschen
Die Proben wurden mit hochreinem Wasser (dosiert mittels eines Milli-Q®-systems) gespült, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen.
4. Blockieren
1 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung (50 pg/ml) wurde aufgetragen, um die freie Goldoberfläche zu bedecken und vor nicht-spezifischer Adsorption zu schützen.
5. Waschen
Die Proben wurden reichlich mit hochreinem Wasser gespült. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte in PBS-Lösung (10 mM) bei Raumtemperatur.
6. Analyt-Detektion (PfLDH-Fixierung durch immobilisierte Abs)
Die gewünschte Menge von Plasmodium falciparum Laktat-Dehydrogenase (Pfl_DH) wurde zu 1 ml einer verdünnten Lösung von nicht infiziertem menschlichen Blut gegeben (Verdünnung 1: 100 in 25 mM Tris-Puffer). Die funktionalisierten Substrate wurden mit 1 ml kontaminierter Blutlösung gleicher Verdünnung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Wippschüttler wurde verwendet, um die Bindungskinetik zu beschleunigen und die Analyt-Diffusion zu verbessern. Es wurden Konzentrationen zwischen 0,01 Femtomol und 10 Nanomol gemessen.
7. Waschen
Die Proben wurden reichlich mit Tris-Puffer (25 mM) und mit hochreinem Wasser gespült, um ungebundene Proteine zu entfernen.
8. Fluoreszenz-Aptamer-basierendes Assay Die Proben wurden in 1 ml 10 mM phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) überführt, wobei hier die PBS noch 0,1 pM Malaria 2008s-Aptamere gelabelt mit Cy5-Tag (5'- Cy5-CTG GGC GGT AGA ACC ATA GTG ACC CAG CCG TCT AC-3') enthält (d.h. das Malaria2008-Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor. Die Lösung wurde unter Lichtausschluss für 2 Stunden mittels eines Wippschüttlers sanft geschüttelt. Als Ergebnis erhielt man eine Sandwich-Anordnung. Eine solche Anordnung ist exemplarisch auch in Figur 6 dargestellt.
9. Waschen
Die Proben wurden reichlich mit PBS und hochreinem Wasser gespült, um ungebundene Aptamere zu entfernen.
10. Messung des Fluoreszenz-Signals
Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer ZI phaseninvertiertem Kontrastfluoreszenzmikroskop, ausgerüstet mit Zeiss Colibri.2 LED Lichtquelle (Module 625 nm), Zeiss Plan-Apochromat-Objektiv 10x/0,45 Ph 1 M27
(FWD = 2,1 mm), Kubus 50 Cy5 Filter (Anregung 625 - 655 nm/Emission 665 - 715 nm) und pco.edge 5.5 sCMOS Photodetektor (Skalierung 0,650 pm x 0,650 pm pro Pixel, Bildgröße 2560 x 2160 Pixel, skalierte Bildgröße 1,66 mm x 1,40 mm, 16 Bit Dynamikumfang, 2 Sekunden Belichtungszeit jeweils für jedes Bild). Die aufgezeichneten Fluoreszenzbilder wurden mit ImageJ-Software verarbeitet. Der „rolling ball"-Algorithmus wurde verwendet, um den durch die Optik bedingten Helligkeitsunterschied zwischen Bildzentrum und Bildrand herauszurechnen. Der Flintergrund wurde lokal für jeden Pixel mittels Durchschnittsbildung über einen Kreis um den Pixel herum vermessen. Solch ein Wert wird dann von dem Originalbild abgezogen, wodurch räumliche Variationen des Hintergrunds geglättet werden. Der „rolling ball"-Radius war auf 10 Pixel gesetzt, eine Größe, die ausreichend größer war als die Größe der größten Objekte, die nicht Teil des Hintergrunds waren. Ein Schwellenwert, der geringfügig höher als der geglättete Hintergrund war, wurde eingestellt, um das Bild zu segmentieren, dessen Gesamtintensität durch Aufsummierung der Signalanteile von allen Spots gemessen wurde. Um eine gute und verlässliche Analyse der Fluoreszenzsignale zu erhalten, wurden zehn Bilder zufällig von jeder Probe gemacht und deren Intensitätsdurchschnitt ermittelt.
11. Simulation des E-Felds um die Goldnanopartikel herum Die optische Antwort der 2D-AuNP-Gerüste wurde durch das „FDTD Solutions" -Tool, das in Lumerical Software implementiert war, simuliert. Eine linear polarisierte elektromagnetische Strahlung, die entlang der z-Richtung lief, wurde verwendet, um das System zu untersuchen. Virtuelle (simulierte) Photo -Detektoren (PDs), sinnvoll in dem Arbeitsraum angeordnet, konnten die Intensität des elektromagnetischen Feldes in Abhängigkeit der Zeit messen. Ein Photo -Detektor war dazu bestimmt, das Excitationsspektrum der Nanostruktur zu messen. Symmetrische/antisymmetrische Randbedingungen (BCs - boundary conditions), eingestellt entlang der x- und y- Richtung, erstrecken die plasmonische Anregung über ein unendliches 2D-Gerüst und reduzieren gleichzeitig die Simulationszeit um einen Faktor 8, ohne dabei die Genauigkeit der Resultate zu verschlechtern. Bloch BCs (periodische Randbedingungen) wurden nur für Polarisationsstudien verwendet, um die Phasenverschiebung zu kompensieren, die entsteht, wenn eine elektromagnetische Störung mit einem nicht-Null-Winkel auf der gegenüberliegenden Seite des Arbeitsraums wiedereingeführt. Perfekt eingestellte Schicht-BCs in z-Richtung stellen perfekte Absorption der elektromagnetischen Wellen, die durch die Ebene, enthaltend die Lichtquelle, zurückgestreut werden und durch die gegenüberliegende Seite der Arbeitsumgebung einfallen, sicher. Die Arbeitsumgebung wurde über ein Gitter mit einer räumlichen Auflösung von 0,5 nm aufgelöst, wodurch eine hohe Genauigkeit sichergestellt und gleichzeitig die Simulationszeit innerhalb weniger Stunden gehalten wurde. Die AuNPs wurden als homogene Goldhalbkugeln modelliert, wohingegen das Substrat als dicke dielektrische Schicht von Siliziumdioxid (S1O2) repräsentiert wurde.
Beispiel B):
Im Wesentlichen entsprechend oben bei Beispiel A) wurde wie folgt vorgegangen:
1. Herstellung eines Arrays von AuNPs
24,3 mg der Diblockcopolymere P3807-S2VP wurden unter starkem Rühren zu 15 ml Toluen gegeben und für 72 Stunden gehalten, um eine homogene, monodisperse Lösung umgekehrter Micellen zu erhalten. Dann wurden 13,1 mg FIAuCU*3H20 während 72 Stunden in die Lösung gegeben, um die Bildung von Goldkernen umhüllt von Polystyren-Flüllen (PS-AuNPs) zu ermöglichen. Anschließend wurde die gelbliche Lösung filtriert, um mögliche Copolymeraggregate zu entfernen. Diblockcopolymere und Gold(III)chloridtrihyd rat wurden dabei ein einer Glovebox unter Inertgas (Argon) und kontrollierten Bedingungen (O2 < 1 ppm, FI2O < 0,1 ppm) gehandhabt. Bevor die PS-AuNPs auf den Glasdeckgläsern (10 x 8 mm2) abgeschieden wurden, wurden die Substrate mittels Ultraschall für fünf Minuten nacheinander in Aceton, 2- Propanol und Ethanol gereinigt und dann in ein nichtpolares Lösungsmittel getaucht, um das Anhaften von hydrophoben Polystyren-Hüllen zu ermöglichen. Anschließend wurden die Substrate mittels eines Tauchbeschichters und einer Eintauchgeschwindigkeit von 0,8 mm/s in die PS-AuNPs enthaltende Lösung getaucht. Diese Eintauchgeschwindigkeit ermöglicht eine gute Beschichtung der Substratoberfläche bei gleichzeitiger Verhinderung maximaler Packungsdichte (vgl. Figur 2b, woraus ersichtlich ist, dass in der Nahordnung noch hexagonale Strukturen gegeben sind, die Fernordnung aber verzweigte Strukturen zeigt). Danach wurden die Copolymere mittels Sauerstoffplasmabehandlung geätzt (0,8 mbar Druck, 200 W, 30 Minuten), wodurch die AuNPs an präfixierten Positionen auf der Glasoberfläche immobilisiert wurden. Anschließend wurden die Substrate für 2 Stunden unter Lichtausschluss mit 2 ml einer Au-Depositionslösung (CTAB 190 mM, FIAuCU*3H20 42 mM, AgNÜ3 8 mM, Ascorbinsäure 100 mM) inkubiert.
2. Funktionalisierung
Die Funktionalisierung der AuNPs mit Pan-Malaria-Antikörpern wurde mittels photochemischer Immobilisierungstechnik (PIT) vorgenommen. Dazu wurde 1 ml wässrige Lösung von anti-pLDFI (50 pg/ml) mittels einer UV-Lampe für 30 Sekunden bestrahlt und dann auf das Substrat gegossen. Die UV-Quelle (Trylight, Promete S.r.l) bestand aus zwei U-förmigen Niederdruckquecksilberlampen (6 W bei 254 nm) in die eine 10 mm Standardquarzküvette eingesetzt werden konnte. Unter Berücksichtigung der Geometrie der Lampen und der Nähe zu der Küvette, lag die Strahlungsintensität, die zur Generierung der Thiolgruppen verwendet wurde, bei ungefähr 0,3 W/cm2.
3. Waschen wie oben
4. Blockieren wie oben
5. Waschen wie oben
6. Analyt-Detektion (PfLDH-Fixierung durch immobilisierte Abs)
Nicht infiziertes menschliches Blut wurde 1: 100 in 25 mM Tris-Puffer verdünnt, um die Turbidität der Probe zu verringern. Die gewünschte Menge von Plasmodium falciparum Laktat-Dehydrogenase (P/LDFI) wurde zu 1 ml einer verdünnten Lösung der Probe gegeben, um Analytkonzentrationen im Bereich von 1 fM bis 1 pm zu erhalten (bezogen auf das unverdünnte Blut). Die funktionalisierten Substrate wurden mit 1 ml kontaminierter Blutlösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Waschen wie oben
8. Fluoreszenz-Aptamer-basierendes Assay
5-FAM und Cy-5 gelabelte Malaria-Aptamere wurden in einem Verhältnis von 1: 1 in
1 ml 10 mM phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) überführt, um eine Aptamerkonzentration von 0,1 pM zu erhalten (d.h. das Malaria2008-Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor). Die Lösung wurde unter Lichtausschluss für
2 Stunden mittels eines Wippschüttlers sanft geschüttelt. Als Ergebnis erhielt man eine Sandwich-Anordnung. Eine solche Anordnung ist exemplarisch auch in Figur 6 dargestellt.
9. Waschen wie oben
10. Messung des Fluoreszenz-Signals
Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer ZI phaseninvertiertem Kontrastfluoreszenzmikroskop, ausgerüstet mit Zeiss Colibri.2 LED Lichtquelle (Module 470 und 625 nm), Zeiss Plan-Apochromat-Objektiv 10x/0,45 Ph 1 M27 (FWD = 2,1 mm), 38 HE Filter (Excutation 450-490 nm/Emission 500-550 nm) und Kubus 50 Cy5 Filter (Anregung 625 - 655 nm/Emission 665 - 715 nm) und pco.edge 5.5 sCMOS Photodetektor (Skalierung 0,650 pm x 0,650 pm pro Pixel, Bildgröße 2560 x 2160 Pixel, skalierte Bildgröße 1,66 mm x 1,40 mm, 16 Bit Dynamikumfang, 2 Sekunden Belichtungszeit jeweils für jedes Bild). Die aufgezeichneten Fluoreszenzbilder wurden mit ImageJ-Software verarbeitet, um die vollständige von den hellen Punkten ausgehende Intensität zu verarbeiten. Zunächst wurden die RGB- Bilder in zwei die roten und grünen Komponenten enthaltende Kanäle aufgeteilt, um die Anteile der zwei Fluorophore separat zu analysieren. Auch hier wurde der „rolling balT'-Algorithmus verwendet. Figur 7 zeigt das resultierende Bild, bei dem die rot- und grün-Kanäle wieder vereint dargestellt sind (hier zu Reproduktionszwecken in schwarz-weiß).
11. Prüfung der Spezi fizität
Die Spezifität des apta-Immunosensors wurde gegen die Laktatdehydrogenase von Plasmodium vivax (PvLDH) getestet, die zu 90% mit der P/LDH identisch ist. Die Pv DH wurde in nicht infiziertes menschliches Blut gegeben (1: 100 verdünnt in 1 mL 25 mM Tris-Puffer), um die höchste in der Kalibrierungskurve untersuchte Analytkonzentration zu erhalten (1 mM bezogen auf unverdünntes Vollblut). Die Messung der Fluoreszenzintensität ergab, dass, obwohl die untere Biorezeptorschicht - bestehend aus Pan-Malaria-Anti-PLDH - jeden Plasmodium-Malaria-Marker erfassen kann, im Fall von PvLDFI dank der extrem hohen Spezifität der als obere Biorezeptorschicht verwendeten Aptamere keine signifikante Kreuzreaktion festgestellt werden konnte, sondern die Fluoreszenz für das gewünschte Ziel (PfLDFI) um Größenordnungen höher lag, also eine sehr hohe Spezifizität belegt wurde.

Claims

Ansprüche
1. Biomarker-Detektionssensor zur Detektion von krankheitsspezifischen Biomarkern umfassend oder bestehend aus einem Substrat mit darauf gebundenen in verzweigten zweidimensionalen Strukturen und/oder einem zweidimensionalen Gitter angeordneten Metall- Nanopartikeln und an die Metall-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker- Rezeptoren.
2. Biomarker-Detektionssensor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Metall-Nanopartikel Gold-Nanopartikel sind.
3. Biomarker-Detektionssensor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem krankheitsspezifischen Biomarker um Pfl_DH handelt und die an die Gold-Nanopartikel gebundenen Anti-Biomarker- Rezeptoren mit UV-Strahlung vorbehandelte anti-pLDH-Antikörper sind.
4. Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis R von Durchmesser D der Nanopartikel zum Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln in dem zweidimensionalen Gitter >2,3 beträgt, bevorzugt zwischen 2,3 und 3,5 liegt, insbesondere bevorzugt bei 2,5 oder 3,0 liegt.
5. Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Goldpartikel al) hexagonal oder hexagonal dicht gepackt sind, oder a2) in verzweigtem, bandartigen Strukturen angeordnet sind, oder a3) eine kombinierte zweidimensionale Struktur ausbilden, bei der Teile der Struktur hexagonal oder hexagonal dicht angeordnet, und gleichzeitig Teile der Struktur in verzweigten, bandartigen Strukturen angeordnet sind; b) der Durchmesser D der Nanopartikel zwischen 40 und 60 nm, bevorzugt zwischen 44 und 55 nm, besonders bevorzugt zwischen 46 und 52 nm, insbesondere bevorzugt 48 oder 50 nm, beträgt, oder der Durchmesser D der Nanopartikel zwischen 50 und 70 nm, bevorzugt zwischen 55 und 65 nm, besonders bevorzugt 60 nm, beträgt, und c) der Abstand d zwischen den einzelnen Gold-Nanopartikeln zwischen 16 und 24 nm, bevorzugt zwischen 17 und 22 nm, besonders bevorzugt zwischen 18 und 21 nm, insbesondere bevorzugt 19 oder 20 nm, beträgt.
6. Biomarker-Detektionssensor-Kit umfassend oder bestehend aus
A) mindestens einen Biomarker-Detektionssensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5,
B0) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Fluorophor, optional
Bl) mindestens eine weitere Zubereitung umfassend mindestens ein gleiches Biomarker-spezifisches Aptamer mit anderem daran gebundenem Fluorophor, und/oder
B2) mindestens eine weitere Zubereitung umfassend mindestens ein anderes Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem anderem Fluorophor,
C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Küvetten, Pipetten, Lichtquelle, Fluoreszenzdetektor, insbesondere
Fluoreszenzspektrometer.
7. Biomarker-Detektionssensor-Kit gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass B2) ausgewählt wird aus
B2i) mindestens einem, bevorzugt genau einem, anderen Biomarker spezifisches Aptamer für den Nachweis des gleichen Biomarkers aber bindend an ein anderes Epitop des Biomarkers mit daran gebundenem anderem Fluorophor, und/oder
B2M) mindestens einem, bevorzugt genau einem, anderen Biomarker spezifischen Aptamer für den Nachweis eines weiteren Biomarkers mit daran gebundenem anderem Fluorophor.
8. Biomarker-Detektionssensor-Kit gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei B0) bei dem Biomarker-spezifischen Aptamer um Malaria-2008-Aptamer handelt, an das bevorzugt Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist.
9. Biomarker-Detektionssensor-Kit gemäß Anspruch 6, umfassend
B0) eine Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem 5-FAM-Fluorophor, und
Bl) mindestens eine weitere Zubereitung umfassend mindestens ein gleiches Biomarker-spezifisches Aptamer mit daran gebundenem Cy5-Fluorophor.
10. Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern in Körperflüssigkeiten umfassend die folgenden Schritte oder bestehend aus den folgenden Schritten i) Bereitstellen eines Biomarker-Detektionssensors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, ii) Aufbringen auf den Sensor von iial) einer Körperflüssigkeitsprobe, und iia2) mindestens einem Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor entweder nach iial) oder gleichzeitig mit iial), oder iib) einer Mischung aus Körperflüssigkeitsprobe und mindestens einem Biomarker-spezifischem Aptamer mit daran gekoppeltem Fluorophor, iii) Bestrahlen der auf den Sensor aufgebrachten Probe mit Lichtquelle, iv) Detektion der Fluoreszenzemission der Probe, v) optional Analyse der Fluoreszenzemission, bevorzugt mittels Computern, und vi) optional Speichern und/oder Anzeigen der analysierten Fluoreszenzemission.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Körperflüssigkeit um Blutproben handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Anti-Biomarker-Rezeptoren um anti-pLDH-Antikörper und bei dem Biomarker-spezifischen Aptamer um Malaria-2008-Aptamer handelt, an das bevorzugt Cyanin 5 als Fluorophor gebunden ist.
13. Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, der Biomarker-Detektionssensor-Kits gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 oder des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern, insbesondere Malaria-Biomarkern, bevorzugt in Körperflüssigkeitsproben, insbesondere in Blutproben.
14. Verwendung der Biomarker-Detektionssensoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als Substrat in automatisierten Multititerplatten.
EP21731955.7A 2020-06-09 2021-06-07 Plasmonverstärkte-fluoreszenz-basierende sensor zum nachweis krankheitsspezifischer biomarker Withdrawn EP4162272A1 (de)

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