EP4153733A1 - Utilisation d'une proteine de fusion pour induire des modifications genetiques par recombinaison meiotique ciblee - Google Patents

Utilisation d'une proteine de fusion pour induire des modifications genetiques par recombinaison meiotique ciblee

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EP4153733A1
EP4153733A1 EP21733496.0A EP21733496A EP4153733A1 EP 4153733 A1 EP4153733 A1 EP 4153733A1 EP 21733496 A EP21733496 A EP 21733496A EP 4153733 A1 EP4153733 A1 EP 4153733A1
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EP
European Patent Office
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fusion protein
cell
nuclease
spoll
protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP21733496.0A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alexandre SERERO
Alain Nicolas
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Sorbonne Universite
Meiogenix SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Sorbonne Universite
Meiogenix SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Curie, Sorbonne Universite, Meiogenix SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C12Y599/01—Other isomerases (5.99.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the field of targeted genetic modifications in eukaryotes. It relates in particular to a method for improving or modifying a eukaryotic cell by inducing targeted meiotic recombinations.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Modification of the genetic material of eukaryotic organisms has greatly developed over the past twenty years, and has found application in the field of plants, human and animal cells as well as microorganisms such as as yeasts for applications in the fields of agriculture, human health, agro-food G and environmental protection.
  • Yeasts find their application in extremely varied industrial fields. Due to the harmlessness of a large number of species, yeasts are used in particular in the food industry as a fermentation agent in bakery, brewery, wine making or distillery, or in the form of extracts as nutritional elements or agents. of palatability.
  • yeasts and plants The diversity of industrial applications of yeasts and plants implies that there is a constant demand for strains of yeast and plant varieties exhibiting improved characteristics or, at the very least, adapted to a new use or new cultivation conditions.
  • those skilled in the art can use sexual reproduction and select a cell or a hybrid organism providing the desired combination. parental characteristics. This method is however random and the selection step can generate significant delays, especially in the case of yeasts and plants.
  • GMOs genetically modified organisms
  • a third alternative consists in causing a reassortment of alleles of paternal and maternal origin in the genome, during meiotic recombination.
  • Meiotic recombination is an exchange of DNA between homologous chromosomes during meiosis. After DNA replication, recombination is initiated by the formation of double-stranded breaks in one (or the other) chromatids of homologous chromosomes, followed by the repair of these breaks, using a chromatid from homologous chromosome.
  • Meiotic recombinations however, have the disadvantage of being non-uniform. Indeed, the double-stranded cut sites at the origin of these recombinations are not distributed homogeneously in the genome.
  • Spoll is the protein catalyzing double-stranded breaks during meiosis. It acts as a dimer in cooperation with other partner proteins. To this day, the factors determining the choice of double-strand cleavage sites by Spoll and its partners remain poorly understood.
  • the objective of the present invention is to provide a fusion protein as well as a method for inducing targeted meiotic recombinations in eukaryotic cells, preferably yeast or plant cells, in any region of the genome. , preferably several different regions of the genome, independently of any known binding site, and in particular in so-called “cold” chromosomal regions.
  • the present invention relates to a fusion protein comprising (i) a nuclease associated with a CRIS PR system, preferably a class 2 CRIS PR system, and (ii) a Spoll protein or one of its partners involved in the formation and repair of double-stranded breaks during meiosis, in which the nuclease associated with the CRISPR system is not a Cas9 nuclease.
  • the nuclease associated with a CRISPR system is not a class II and type IL nuclease
  • the nuclease (i) is associated with a class II CRISPR system, preferably of type V.
  • the nuclease associated with a CRISPR system is a Cpfl nuclease.
  • said Cpfl nuclease may be a Cpfl nuclease comprising a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4 and 22 to 33, and variants of said sequences exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences and Cpfl activity.
  • the fusion protein may comprise a nuclease associated with a CRISPR system that is deficient for nuclease activity.
  • this nuclease can be a variant of a wild-type Cpfl protein exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with said Cpfl protein and in which the corresponding residue to the aspartate at position 832 of SEQ ID NO: 4 is substituted, preferably by an alanine.
  • this nuclease can be a variant of a Cpfl protein chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4 and 22 to 33, exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with said sequence and in which the residue corresponding to the aspartate at position 832 of SEQ ID NO: 4 is substituted, preferably by an alanine.
  • the fusion protein comprises a Spol 1 protein.
  • the Spoll protein can in particular be chosen from the sequences of SEQ ID NOs: 1, 10 to 21 and 40-42, and the variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences and a Spoll activity.
  • the fusion protein may comprise a Spoll protein deficient for nuclease activity.
  • the Spoll protein deficient for nuclease activity may be a variant of a wild-type Spoll protein exhibiting at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% of identity with said Spoll protein and in which the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by a phenylalanine.
  • the Spoll protein deficient for nuclease activity can be a variant of a Spoll protein of one of the sequences SEQ ID NO: 1, 10 to 21 and 40-42, comprising a sequence having at least 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with one of these sequences and in which the residue corresponding to tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by phenylalanine.
  • the fusion protein can comprise a Spoll partner, preferably chosen from the group consisting of Rec102, MTOPVIB / TOPOVIBL, Rec103 / Ski8, Rec104, Red 14, Merl, Mer2 / Recl07, Mei4, Mre2 / Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2 / Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl and Sppl, and the orthologs thereof.
  • a Spoll partner preferably chosen from the group consisting of Rec102, MTOPVIB / TOPOVIBL, Rec103 / Ski8, Rec104, Red 14, Merl, Mer2 / Recl07, Mei4, Mre2 / Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2 / Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl and Sppl, and the orthologs thereof.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the fusion protein defined above.
  • the present invention also relates to an expression cassette or a vector comprising a nucleic acid as defined above.
  • the present invention also relates to a host cell, preferably non-human, comprising a fusion protein, a nucleic acid, a cassette or a vector as defined above.
  • the host cell is a eukaryotic cell, more preferably a yeast, plant, fungal or animal cell, and very particularly preferably the host cell is a plant cell or a yeast cell.
  • the host cell is a plant cell, the plant preferably being of agronomic, horticultural, pharmaceutical or cosmetic interest, in particular vegetables, fruits, herbs, flowers, trees and shrubs.
  • the plant cell is selected from monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, more particularly preferably selected from the group consisting of rice, wheat, soybean, corn, tomato, onion, sugar.
  • the plant cell can be selected from the group consisting of rice, wheat, soybean, corn, tomato, onion, cucumber, lettuce, asparagus, carrot, turnip, Arabidopsis thaliana, barley, rapeseed, cotton, grapevine, sugar cane, beet, cotton, sunflower, olive palm, coffee , tea, cocoa, chicory, pepper, chili, lemon, orange, nectarine, mango, apple, banana, peach, apricot, sweet potatoes, yams, almonds, hazelnuts, strawberries, melons, watermelons, olive trees, and horticultural plants such as roses, tulips, orchids and geraniums.
  • the plant cell is selected from the group consisting of rice, wheat, soybean, corn and tomato.
  • the invention relates to a method for inducing targeted meiotic recombinations in a eukaryotic cell, preferably non-human, comprising
  • the present invention also relates, in a sixth aspect, to a method for generating variants of a eukaryotic organism, preferably non-human, comprising:
  • the present invention also relates to a method for identifying or locating genetic information encoding a characteristic of interest in a eukaryotic cell genome, preferably non-human, comprising:
  • the characteristic of interest is a quantitative characteristic of interest (QTL).
  • the present invention finally relates to the use of a fusion protein, of a nucleic acid, of an expression cassette or of a vector for (i) inducing targeted meiotic recombinations in a cell.
  • eukaryotic preferably non-human
  • (ii) generate variants of a eukaryotic, preferably non-human organism, and / or
  • iii) identify or locate genetic information encoding a characteristic of interest in a eukaryotic cell genome , preferably non-human.
  • the eukaryotic cell is a yeast, plant, fungus or animal cell, preferably a yeast, plant or fungus cell.
  • FIG. 1 illustrates the formation of meiotic double-stranded breaks (CBD) induced by the Cpf 1 -Spo 1 1 Y135F fusion protein and their repair by homologous recombination in the promoter region of the GAL2 gene.
  • Figure 2 illustrates the ability of the Cpfl -Spo 11 Y135F fusion protein to stimulate meiotic recombination in the target region of the promoter of the GAL2 gene.
  • the CRISPR system (“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats”) is a defense system demonstrated in bacteria and archaea against DNA foreigners. These short fragments corresponding to the infectious agent are inserted into a series of CRISPR repeats and are used as a CRISPR RNA guide (crRNA) to target the infectious agent in subsequent infections.
  • This system is essentially based on the association of a Cas endonuclease protein (CRISPR-associated) and a “guide” RNA (gRNA or sgRNA) responsible for the specificity of the cleavage site. It allows double-stranded DNA (CBD) breaks to be made at sites targeted by the CRISPR system.
  • CRISPR-associated Cas endonuclease protein
  • gRNA or sgRNA guide RNA
  • CRISPR systems There are five main types of CRISPR systems that are distinguished by the repertoires of genes associated with CRISPR, the organization of Cas operons, and the structure of repeats within CRISPR matrices. These five types of systems have been divided into two classes: class I grouping together types I, III and IV which use a multimeric crRNA effector module and class II grouping together types II, V and VI which use a monomeric crRNA effector module.
  • the class II and type II CRISPR systems predominantly represented by the Cas9 and Csn2 nucleases, comprise a small trans-acting RNA called tracrRNA ("trans-acting crRNA") which pairs with each repeat of the pre-crRNA (“ CRISPR RNA ”) to form a double-stranded RNA [tracrRNA: crRNA] cleaved by RNase III in the presence of the endonuclease.
  • trans-acting crRNA small trans-acting RNA
  • CRISPR RNA pre-crRNA
  • the class II and type VI CRISPR systems are represented by the proteins Cl 3a (previously known as C2c2), Cl 3b and Cl 3c.
  • the CRISPR-C13 system was discovered in the bacterium Leptotrichia shahii (Abudayyeh et al., Science 2016; 353 (6299): aaf5573) and is analogous to the CRISPR-Cas9 system.
  • Cas9 which targets DNA
  • O3 proteins target and cleave single stranded RNA.
  • Cpfl nuclease also called Cas 12a
  • C2cl also called Cas 12b
  • C2c3 nucleases identified in Alicyclobacillus acidoterrestris (Shmakov et al., Molecular Cell, 2015 Volume 60, Issue 3, P385-397).
  • Cpfl contains a mixed alpha / beta domain, an RuvC-I domain followed by a helical region, an RuvC-II domain and a zinc finger domain.
  • a functional CRISPR-Cpfl system does not require tracrRNA but only crRNA.
  • a crRNA of 42-44 nucleotides with a direct repeat sequence of about 19 nucleotides followed by a proto-spacer sequence of 23-25 nucleotides is sufficient to guide the endonuclease Cpfl to the target nucleic acid.
  • the Cpfl-crRNA complex cleaves the target DNA or RNA by identifying a 5'-YTN-3 'or 5'-TTTN-3' PAM motif adjacent to the protospacer (where "Y” is a pyrimidine and "N "is any nucleobase), as opposed to the guanine-rich PAM motif (5'-NGG-3 ') targeted by Cas9.
  • Cpf1 introduces a double-stranded break releasing sticky ends, generally generating 4 or 5 overhanging nucleotides.
  • This type of cut is different from the breaks generated by class II and type II nucleases such as Cas9, which generate blunt ends after cleavage, and allows, like a Velcro, to carry out directional insertions of genes, analogous to those achieved by traditional restriction enzymes.
  • Cpfl cleaves DNA 18-23 bp downstream of the PAM site, which results in no disturbance of the recognition sequence after repair of double-stranded breaks (CBD). As a result, Cpfl allows multiple rounds of DNA cleavage and offers an increased possibility of obtaining the desired genomic modification.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to modify the CRISPR-Cpfl system in order to induce targeted meiotic recombinations in a eukaryotic cell, and in particular in a yeast or a plant cell. They have in fact shown that the combined expression of a fusion protein comprising a Cpfl domain and a Spol 1 domain and of a guide RNA surprisingly made it possible to induce targeted meiotic recombinations by means of double-strand breaks. during meiosis prophase I and repair of these breaks.
  • the present invention relates to a fusion protein comprising (i) a first domain (CRISPR domain) which is a nuclease associated with a CRISPR system, preferably a class II CRISPR system, and (ii) a second domain (Spoll domain) which is a Spoll protein or one of the Spoll partners involved in the formation and repair of double-stranded breaks during meiosis.
  • CRISPR domain a nuclease associated with a CRISPR system
  • Spoll domain which is a Spoll protein or one of the Spoll partners involved in the formation and repair of double-stranded breaks during meiosis.
  • fusion protein refers to a chimeric protein comprising at least two domains derived from the combination of different proteins or protein fragments.
  • the nucleic acid encoding this protein is obtained by juxtaposition of the regions encoding the proteins or protein fragments so that they are in phase and transcribed on the same mRNA.
  • the different domains of the fusion protein can be directly adjacent or be separated by binding sequences (or linker) which introduce a certain structural flexibility in the construction.
  • the fusion protein according to the present invention comprises a first domain (CRISPR domain) which is a nuclease associated with a CRISPR system and a second domain (Spol 1 domain) which is a Spol 1 protein or one of the Spol 1 partners involved.
  • CRISPR domain a nuclease associated with a CRISPR system
  • Spol 1 domain a second domain which is a Spol 1 protein or one of the Spol 1 partners involved.
  • Spoll is a protein related to the catalytic subunit A of a type II topoisomerase present in archaebacteria (Bergerat et al, Nature, vol. 386, pp 414-7). It catalyzes DNA double-strand breaks initiating meiotic recombinations. It is a protein very conserved at the evolutionary level for which there are homologs in all eukaryotes.
  • Spoll is active as a dimer made up of two subunits, each of which cleaves a strand of DNA. Although essential, Spoll does not act on its own to generate double-stranded breaks during meiosis. In the yeast S. cerevisiae, for example, it cooperates with the proteins, Recl02, MTOPVIB, Recl03 / Skl8, Recl04, Réel 14, Merl, Mer2 / Recl07, Mei4, Mre2 / Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2 / Nbsl, Hopl , Redl, Mekl, Setl and Sppl as described in the articles by Keeney et al. (2001 Curr. Top. Dev. Biol, 52, pp.
  • the Spoll protein, the fragment or domain thereof as used in the present invention can be obtained from any known Spoll protein such as the Spoll protein of Saccharomyces cerevisiae (Gene ID: 856364, NCBI accession number : NP_011841 (SEQ ID NO: 1), Esposito and Esposito, Genetics, 1969, 61, pp. 79-89), the AtSpoll-1 and AtSpoll-2 proteins of Arabidopsis thaliana (Grêlon M. et al, 2001, Embo J., 20, pp. 589-600), the murine mSpoll protein (Baudat F et al, Molecular Cell, 2000, 6, pp. 989-998), the Spoll protein of C.
  • Spoll protein of Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 856364, NCBI accession number : NP_011841 (SEQ ID NO: 1), Esposito and Esposito, Genetics, 1969, 61, pp. 79
  • the Spoll protein is obtained from one of the Spoll proteins of the eukaryotic cell of interest.
  • the Spoll domain comprises, or consists of, a Spoll protein, preferably a wild-type Spoll protein, in particular a Spoll protein of the eukaryotic cell of interest, or a sequence exhibiting at least 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with said Spoll protein and exhibiting Spoll activity.
  • the Spoll domain comprises, or consists of, a Spoll protein, preferably a Spoll protein of Saccharomyces cerevisiae, such as for example the protein of sequence NP_011841 (SEQ ID NO: 1) or a sequence exhibiting at at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with a Spoll protein, preferably with a Spoll protein of Saccharomyces cerevisiae or else a related protein bearing motifs conserved with the Spoll protein , in particular the protein of sequence SEQ ID NO: 1
  • several fusion proteins according to the invention comprising different Spoll domains can be introduced into the same cell.
  • the various fusion proteins can comprise homologs different from Spol 1.
  • two fusion proteins according to the invention respectively comprising Spol domains.
  • Arabidopsis thaliana 1-1 and Spol 1-2 can be introduced into the same cell, preferably into the same Arabidopsis thaliana cell.
  • one or more fusion proteins according to the invention comprising Spol 1-1, Spol 1-2, Spol 1-3 and / or Spol 1-4 domains of rice can be introduced into the same cell. , preferably in the same rice cell.
  • the Spoll domain comprises, or consists of, a plant Spoll protein, in particular chosen from: the Spoll proteins of Arabidopsis thaliana, for example as described under the reference Uniprot Q9M4A2-1 (SEQ ID NO : 10), the Spoll proteins of Oryza sativa (rice), for example as described by Fayos I. et al., 2019 Plant Biotechnol J.
  • the Spoll domain can comprise, or consist of, a Spoll protein chosen from one of the Spoll proteins mentioned above, preferably the sequences of SEQ ID NO: I, 2 and 10 to 21 and 40-42, and variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences and a Spoll activity. More particularly, the Spoll domain can comprise, or consist of, a Spoll protein chosen from the sequences of SEQ ID NOs: 1, 10 to 21 and 40-42, and the variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences and Spoll activity.
  • the Spoll domain can comprise, or consist of, a Spoll protein chosen from the sequences of SEQ ID NOs: 10 to 21 and 40-42, and the variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with one of these sequences and Spoll activity.
  • a Spoll protein chosen from the sequences of SEQ ID NOs: 10 to 21 and 40-42, and the variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with one of these sequences and Spoll activity.
  • Spoll activity refers to the ability of a protein to induce double-stranded breaks during prophase I of meiosis and / or the ability of a protein to recruit one or more partners of meiosis.
  • Spoll as defined below.
  • this term refers to the ability of a protein to recruit one or more partners of Spoll and, optionally, to the ability of a protein to induce double-strand breaks during prophase I of meiosis.
  • the ability of a protein to induce double-stranded breaks during prophase I of meiosis and to recruit one or more Spo 11 partners can be easily tested by those skilled in the art, for example by a complementation test in a yeast.
  • a protein to recruit another for example of a protein to recruit a Spol 1 partner or a Spoll partner to recruit a Spoll protein, can be readily tested by those skilled in the art by the practitioner. through conventional techniques, such as the double hydride technique or the ChIP technique (chromatin immunoprecipitation).
  • the ability of a protein to induce double-strand breaks during prophase I of meiosis can be easily tested by a person skilled in the art by means of standard techniques, for example by Southern blot or by sequencing of the oligonucleotides associated with a protein, especially Spoll.
  • the term “Spoll activity” preferably refers to the ability of a protein to induce double-strand breaks during prophase I of meiosis and the ability of a protein to induce double-stranded breaks during prophase I of meiosis. protein to be recruited, directly or indirectly, one or more Spoll partners as defined below.
  • the term “Spoll activity” preferably refers to the ability of a protein to recruit one or more Spoll partners as defined below.
  • the Spoll domain of the fusion protein comprises a variant of a Spoll protein, preferably a variant whose nuclease activity has been abolished, reduced or improved compared to the wild-type Spoll protein.
  • the Spoll domain of the fusion protein according to the invention is endowed with nuclease activity and responsible for double-stranded breaks.
  • This domain may consist of a Spoll protein or a fragment thereof capable of inducing double strand breaks in DNA.
  • the Spoll domain can comprise a variant of a Spoll protein which exhibits a deficient nuclease activity also called "dead Spoll” or "dSpol 1".
  • the fusion protein used in the present invention may comprise a domain which is a nuclease associated with a CRISPR system and a Spoll domain which is a variant of Spoll exhibiting deficient nuclease activity.
  • the different Spoll domains are all deficient for nuclease activity.
  • nuclease activity refers to the enzymatic activity of an endonuclease which has an active site for creating nicks within DNA or RNA chains, preferably DNA or RNA chains. double strand DNA breaks.
  • nuclease activity “deficient” is understood in particular to mean a reduced, diminished or non-existent nuclease activity, in particular in relation to the nuclease activity of the wild-type protein from which the variant is derived.
  • the capacity for cleavage of DNA or of RNA and / or the hydrolase activity of the nuclease is reduced or diminished, in particular compared with the nuclease activity of the wild-type protein.
  • the nuclease activity of a Spoll domain exhibiting a deficient nuclease activity is reduced by at least 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or by 100%, relative to the nuclease activity of the wild-type Spoll domain.
  • a Spoll domain exhibiting deficient nuclease activity is a Spoll domain incapable of generating double-stranded breaks.
  • the Spoll domain exhibiting a deficient nuclease activity can comprise a mutated catalytic site which induces a deficient nuclease activity, the mutation negatively impacting the nuclease or hydrolytic capacity of the Spoll domain.
  • the Spoll domain can comprise, or consist of, a mutant Spoll protein in which the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by a phenylalanine.
  • a Spoll protein exhibiting such a substitution is incapable of inducing double-stranded DNA breaks (Bergerat et al, Nature, vol. 386, pp 414-417) and may in particular exhibit a sequence as described in SEQ ID NO: 2.
  • the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 in the sequence of a Spoll protein can be easily identified by standard sequence alignment techniques.
  • the Spoll domain can be a variant of a Spoll protein, preferably of a wild-type Spoll protein, in particular of the eukaryotic cell of interest, exhibiting at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, or at least 99% identity with said Spoll protein and in which the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by a phenylalanine.
  • the Spoll domain can be a variant of the sequences SEQ ID NO: 1, 2 and 10 to 21 and 40-42, exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% of identity with one of these sequences and in which the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by a phenylalanine, as presented in SEQ ID NO: 2.
  • the Spoll domain can be a variant of a Spoll protein, said variant comprising a sequence exhibiting at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%.
  • the Spoll domain can be a variant of a Spol 1 protein, said variant comprising a sequence exhibiting at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least. at least 99% identity with one of the sequences of SEQ ID NO: 10 to 21 and 40-42 and in which the residue corresponding to the tyrosine at position 135 of SEQ ID NO: 1 is substituted, preferably by a phenylalanine.
  • the Spoll domain exhibiting a deficient nuclease activity is still capable of recruiting one or more of the partners of Spoll, in particular one or more of the partners described below.
  • the nuclease activity of the Spoll domain may be impaired, its ability to interact with Spoll partners is preferably retained.
  • the Spoll domain of the fusion protein can be replaced by one of the Spoll partners involved in the formation and repair of double-stranded breaks during meiosis.
  • the Spoll partner as used in the fusion protein is capable of recruiting Spo 11, preferably is a protein which forms a complex with Spo 11 and thus induces the formation of double-strand breaks or their repair. This partner can be chosen from the proteins mentioned in the articles by Keeney et al.
  • the fusion protein according to the invention comprises a Spoll partner chosen from Recl02, Recl03 / Skl8, Recl04, Réel 14, MTOPOVIB, Merl, Mer2 / Recl07, Mei4, Mre2 / Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2 / Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl, Ski8, and Sppl, and variants and orthologs thereof.
  • a Spoll partner chosen from Recl02, Recl03 / Skl8, Recl04, Réel 14, MTOPOVIB, Merl, Mer2 / Recl07, Mei4, Mre2 / Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2 / Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl, Ski8, and Sppl, and variants and orthologs thereof.
  • the partner replacing the Spoll domain comprises a protein selected from Mei4, Mer2, Rec102, Rec104, Real 14, Set1, Sppl and MTOPVIB, and variants and orthologs of As contemplated herein, variants of these proteins exhibit at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% sequence identity with any of these proteins and are capable of recruiting Spoll.
  • the partner of Spoll is a topoisomerase, preferably chosen from the TOPOVIB family and one of these variants and orthologs, preferably an MTOPOVIB or MTOPOVIBL active in meiosis (Vrielynck, et al., (2016 Science 351 pp 939-943). All the embodiments described for the fusion protein with a Spol 1 domain which is a Spol 1 protein or a variant thereof, also apply to the fusion proteins in which the Spol 1 domain is one of the partners of Spol 1. 1.
  • the fusion protein according to the present invention also comprises a domain which is a nuclease associated with a CRISPR system (CRISPR domain).
  • CRISPR domain is the domain of the fusion protein that is able to interact with the guide RNA (s) and target the activity of the fusion protein to a given chromosomal region.
  • the fusion protein according to the invention comprises a nuclease associated with a class II CRISPR system, preferably of type II, V or VI, preferably of type V or of type VI, preferably of type V.
  • the fusion protein according to the invention comprises a nuclease associated with a class II and type II CRISPR system, in particular to the exclusion of a Cas9 type nuclease, for example Cns2, in particular the Cns2 nuclease from Streptococcus thermophilus, for example as described under the GenBank accession number: AEM62890.1, from Streptococcus pyogenes, for example as described under the GenBank accession number: ANC25453.1, or from Streptococcus canis for example as described under the GenBank accession number: VTR80107.1
  • the nuclease associated with a CRISPR system is not a Cas9 nuclease.
  • the fusion protein according to the invention comprises a nuclease associated with a class II and type VI CRISPR system, preferably Casl3a (C2c2), Casl3b or Casl3c, for example the Casl3a nuclease from Herbinix hemicellulosilytica, in particular as described under the GenBank accession number: WP_103203632.1, the Casl3a nuclease from Lachnospiraceae bacterium, in particular as described under the GenBank accession number: WP_022785443.1, or the Cas 13a nuclease from Leptotrichia wadei, in particular as described under the GenBank accession number: WP_021746003.1.
  • Casl3a C2c2
  • Casl3b Casl3c
  • Casl3a nuclease from Herbinix hemicellulosilytica in particular as described under the GenBank accession number: WP_103
  • the fusion protein according to the invention comprises a nuclease associated with a class II and type V CRISPR system, preferably Cpf 1 (also called Cas 12a), C2cl (also called Cas 12b) or C2c3 .
  • the fusion protein comprises a class II CRISPR domain, preferably of type V and preferably a Cpfl domain.
  • the nucleases associated with a CRISPR system can comprise, or consist of, a nuclease chosen from one of the nucleases mentioned above, and the variants thereof comprising a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences, and a nuclease activity associated with a system CRISPR.
  • nuclease activity associated with a CRISPR system refers to nuclease activity and / or the ability to interact with guide DNA and recognize the targeted region of the nucleic acid.
  • the nuclease associated with a CRISPR system is a Cpfl nuclease, a variant or a fragment thereof capable of interacting with the guide RNAs.
  • the nuclease associated with a CRISPR system is a Cpfl nuclease or a variant thereof.
  • the Cpfl nuclease can be chosen from the Cpfl proteins derived from bacteria of the genus Prevotella, Moraxella, Leptospira, Lachnospiraceae, Francissela, Candidatus, Eubacterium, Parcubacteria, Peregrinibacteria, Acidmicococcus and Prophyromonas.
  • the Cpfl domain can be selected from the Cpfl proteins of Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpfl, for example as described under the Genbank accession number KKT48220.1, SEQ ID NO: 22), Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 (Pegrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 for example as described under the accession number Genbank KKP36646.1, SEQ ID NO: 23), Acidaminococcus sp.
  • BVBLG (AsCpfl, for example as described under Genbank accession number WP_021736722.1, SEQ ID NO: 24), Prophyromonas macacae (PmCpfl, for example as described under Genbank accession number WP_018359861.1, SEQ ID NO: 25), Prophyromonas crevioricanis (PeCpfl, e.g. as described under Genbank accession number WP_036890108.1, SEQ ID NO: 26), Francisella tularensis (UniProtKB: A0Q7Q2, SEQ ID NO: 27) Acidaminococcus sp.
  • the Cpfl domain comprises, or consists of, a Cpfl protein chosen from wild-type Cpfl proteins, the variants and fragments of these exhibiting a Cpfl activity.
  • said variants exhibit at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these Cpfl proteins.
  • the Cpfl domain comprises, or consists of, a protein comprising a sequence chosen from the sequences described above, in particular chosen from the sequences SEQ ID NO: 22 to 33 and the variants thereof.
  • Cpf1 activity refers to nuclease activity and / or the ability to interact with guide RNA and recognize the targeted region of the nucleic acid, preferably the ability to interact. with the guide RNA and to recognize the targeted region of the nucleic acid and optionally a nuclease activity, in particular a DNA endonuclease activity.
  • the ability of a protein to interact with guide DNA and to recognize the targeted region of the nucleic acid can be easily tested by those skilled in the art, in particular by conventional techniques such as chromatin immunoprecipitation (ChIP ) with an antibody that recognizes the protein and its location on DNA by PCR or sequencing.
  • the nuclease activity, and in particular the DNA endonuclease activity can be easily tested by a person skilled in the art, in particular by conventional techniques such as hybridization of DNA by Southern blot or by using the technique described in article by Zetsche, et al. (2015) Cell, 163, 759-771.
  • Cpfl activity preferably refers to a nuclease activity, in particular DNA endonuclease and to the capacity to interact with the guide RNA and to recognize the region. targeted nucleic acid.
  • Cpfl activity preferably refers to the ability to interact with guide RNA and recognize the targeted region of nucleic acid.
  • the fusion protein comprises a variant or a mutant of Cpfl.
  • the fusion protein according to the invention can comprise a Cpfl domain whose nuclease activity has been abolished, reduced or improved.
  • This type of mutant comprises in particular mutations in the RuvC nuclease domain of Cpf1.
  • the Cpfl domain can also comprise mutations altering the recognition of PAMs as described in Gao et al., Nat Biotechnol. 2017 Aug; 35 (8): 789-792.
  • the Cpfl protein can also be truncated in order to remove the domains of the protein not essential for the functions of the fusion protein, in particular those domains of the Cpf1 protein which are not necessary for the interaction with the guide RNA.
  • the Cpfl domain comprises, or consists of, the sequence of imCpfl (SEQ ID NO: 3), or Lb Cpf 1 (SEQ ID NO: 4) or else a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences.
  • the Cpfl domain comprises, or consists of, a protein comprising a sequence chosen from the sequences described above, in particular chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4 and 22 to 33, and the sequences variants and fragments of said sequences exhibiting Cpf1 activity.
  • said variants exhibit at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these Cpfl proteins.
  • the Cpfl domain comprises, or consists of, a protein comprising a sequence chosen from the sequences described above, in particular chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4 and 22 to 33 and the sequences. variants of said sequences comprising a sequence exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with one of these sequences and a Cpfl activity.
  • the domain which is a nuclease associated with a CRISPR system may exhibit deficient nuclease activity.
  • deficient nuclease activity is meant in particular a reduced nuclease activity, reduced or nonexistent in particular compared to the nuclease activity of the wild protein.
  • the nuclease associated with a CRISPR system exhibits reduced or suppressed DNA endonuclease activity relative to the nuclease activity of the wild-type protein. Nuclease associated with a CRISPR system which exhibits deficient nuclease activity retains its ability to interact with a guide RNA and therefore still allows the targeting of the fusion protein to a given chromosomal region.
  • the capacity for cleavage of DNA or of RNA and / or the hydrolase activity of the nuclease is reduced or diminished, in particular compared with the nuclease activity of the wild-type protein.
  • the nuclease activity of the protein associated with a CRISPR system exhibiting deficient nuclease activity is reduced by at least 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or by 100%, relative to the nuclease activity of the wild-type protein.
  • the nuclease associated with a CRISPR system preferably of class II and of type V, exhibiting deficient nuclease activity can comprise a mutated catalytic site, the mutation having a negative impact on the nuclease or hydrolytic capacity of the protein.
  • the nuclease associated with a CRISPR system deficient for nuclease activity can comprise, or consist of, a mutant Cpfl protein, for example as described in Zhang et al., Cell Discov. 2018; 4:36, with the D832A mutation.
  • a Cpfl protein exhibiting such a substitution is incapable of inducing double-strand breaks in DNA, and can in particular take the name “dead Cpfl” or “dCpfl”.
  • the Cpfl domain can be a variant of a Cpfl protein, preferably of a wild-type Cpfl, exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity with said Cpfl protein and in which the residue corresponding to the aspartate at position 832 of SEQ ID NO: 4 is substituted, preferably by an alanine.
  • the Cpfl domain can be a variant of the sequences SEQ ID NO: 3, 4 and 22 to 33 exhibiting at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or at least 99% identity.
  • the dCpf 1 domain can comprise or consist of the sequence SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • the residue corresponding to aspartate at position 832 of SEQ ID NO: 4 in the sequence of a protein Cpf1 can be easily identified by standard sequence alignment techniques.
  • the fusion protein preferably comprises at least one domain, CRISPR or Spol 1, exhibiting nuclease activity.
  • the fusion protein comprises a Spol 1 domain exhibiting nuclease activity and a domain which is a nuclease associated with a CRISPR system, preferably a Cpfl nuclease, deficient for nuclease activity.
  • the fusion protein comprises a Spoll domain deficient for nuclease activity and a domain which is a nuclease associated with a CRISPR system, preferably a Cpfl nuclease, exhibiting nuclease activity.
  • the fusion protein comprises (i) a Spoll domain exhibiting deficient nuclease activity and (ii) a CRISPR domain exhibiting deficient nuclease activity.
  • the fusion protein of the present invention can comprise a domain which is a nuclease associated with a CRISPR system and a Spoll domain, both domains having deficient nuclease activity.
  • the Spoll domain is on the N-terminal side and the CRISPR domain, preferably the Cpfl domain, on the C-terminal side of the fusion protein.
  • the Spoll domain is on the C-terminal side and the CRISPR domain, preferably the Cpfl domain, on the N-terminal side of the fusion protein.
  • the fusion protein can also include a nuclear localization signal (SLN) sequence.
  • SLN sequences are well known to those skilled in the art and generally comprise a short sequence of basic amino acids.
  • the SLN sequence can comprise the PKKKRKV sequence (SEQ ID NO: 7).
  • the SLN sequence can be present at the N-terminus, C-terminus, or in an internal region of the fusion protein.
  • the fusion protein may also include an additional domain of entry into the cell, that is, a domain that facilitates entry of the fusion protein into the cell.
  • This type of domain is well known to those skilled in the art and may for example comprise a penetrating peptide sequence derived from the TAT protein of HIV-1 such as GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO: 8), derived from the TLM sequence of the virus human hepatitis B such as PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (SEQ ID NO: 9), or a polyarginine peptide sequence.
  • This domain of penetration into the cell can be present at the N-terminus, C-terminus, or within the fusion protein.
  • the fusion protein may further comprise one or more binding sequences (linkers) between the CRIS PR domain, in particular of class II, preferably of type V and preferably Cpfl, and the Spoll domain, and optionally between these domains and the other domains of the protein such as the nuclear localization signal sequence or the cell penetrating domain.
  • binding sequences linkers
  • the length of these binding sequences is easily adjustable by those skilled in the art. In general, these sequences comprise between 10 and 20 amino acids, preferably about 15 amino acids and more preferably 12 amino acids.
  • the binding sequences between the different domains can be of the same or different lengths.
  • the fusion protein comprises, or consists of, successively, from the N-terminal end to the C-terminal end: a nuclear localization signal, a first binding sequence (linkerl) , a CRISPR domain, preferably a Cpfl domain, a second binding sequence (linker2) and a Spoll domain.
  • the fusion protein comprises, or consists of, successively, from the N-terminal end to the C-terminal end: a nuclear localization signal, a first binding sequence (linkerl ), a Spoll domain, a second binding sequence (linker2) and a CRISPR domain, preferably a Cpfl domain.
  • the fusion protein can further include a tag (or tag) which is a defined sequence of amino acids. This tag can in particular be used in order to detect the expression of the fusion protein, to identify the proteins which interact with the fusion protein or to characterize the binding sites of the fusion protein in the genome. Detection of the tag attached to the fusion protein can be carried out with an antibody specific for said tag or any other technique well known to those skilled in the art.
  • Identification of proteins interacting with the fusion protein can be accomplished, for example, by co-immunoprecipitation techniques.
  • the characterization of the binding sites of the fusion protein in the genome can be carried out, for example, by techniques of immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation coupled with quantitative real-time PCR (ChIP-qPCR), chromatin immunoprecipitation coupled with sequencing techniques (ChIP-Seq), mapping using oligonucleotides (oligo mapping) or any other technique well known to those skilled in the art.
  • This tag can be present at the N-terminus of the fusion protein, at the C-terminus of the fusion protein, or at a non-terminal position in the fusion protein. Preferably, the tag is present at the C-terminus of the fusion protein.
  • the fusion protein can comprise one or more tags, identical or different and in any combination of localization, in particular at the level of the N-terminus, C-terminus, N- and C-terminus or in positions internal to the fusion protein.
  • Tags can be selected from the many tags well known to those skilled in the art.
  • the tags used in the present invention can be peptide tags and / or protein tags.
  • the tags used in the present invention are peptide tags.
  • peptide tags usable in the present invention include, but are not limited to, tags formed from repeats of at least six Histidines (His), in particular tags formed from six or eight histidines, as well as Flag tags, polyglutamates, hemagglutinin (HA), calmodulin, Strep, E-tag, myc, V5, Xpress, VSV, S-tag, Avi, SBP, Softag 1, Softag 2, Softag 3, isopetag, SpyTag, tetracysteines and combinations thereof -this.
  • Histidines Histidines
  • Flag tags polyglutamates
  • HA hemagglutinin
  • calmodulin Strep
  • E-tag myc
  • V5 Xpress
  • VSV Xpress
  • S-tag Avi
  • SBP Softag 1, Softag 2, Softag 3
  • isopetag SpyTag
  • tetracysteines and combinations thereof -this.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • CBP chitin binding protein
  • MBP thioredoxin
  • MBP carboxylated biotin transporter proteins
  • Fc fragment constant immunoglobulin
  • labels comprising a fluorescent protein such as GFP (Green Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein), CFP (C
  • the fusion protein comprises a tag formed from six histidines and / or one or more Flag motifs, preferably three Flag motifs.
  • the fusion protein comprises a tag formed of three Flag motifs followed by ôhistin at the C-terminal of the fusion protein.
  • the fusion protein comprises a V5 motif, preferably on the N-terminal side of the fusion protein.
  • the V5 tag is derived from a small epitope (Pk) found on the P and V proteins of the paramyxovirus of the simian virus family 5 (SV5).
  • the V5 tag is generally used with 14 amino acids (GKPIPNPLLGLDST, SEQ ID NO 38) or 9 shorter amino acids (IPNPLLGLD, SEQ ID NO: 39).
  • the fusion protein comprises a tag formed of six histidines and three Flag motifs, preferably at the C-terminal, and a V5 motif at the N-terminal.
  • the fusion protein as described above can be introduced into the cell in a protein form, in particular in its mature form or in the form of a precursor, preferably in its mature form, or in the form of an acid. nucleic acid encoding said protein.
  • protecting groups can be added to the C- and / or N-terminus in order to improve the resistance of the fusion protein to peptidases.
  • the protective group at the N-terminus may be acylation or acetylation and the protective group at the C-terminus may be amidation or esterification.
  • the action of proteases can also be counteracted by the use of amino acids of D configuration, the cyclization of the protein by formation of disulfide bonds, lactam rings or bonds between the N- and C-terminus.
  • the fusion protein can also comprise one or more amino acids which are rare amino acids in particular hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methyl lysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid; or synthetic amino acids in particular ornithine, norleucine, norvaline and cyclohexyl-alanine.
  • amino acids which are rare amino acids in particular hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methyl lysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid; or synthetic amino acids in particular ornithine
  • the fusion protein according to the invention can be obtained by conventional chemical synthesis (in solid phase or in liquid homogeneous phase) or by enzymatic synthesis (Kullmann W, Enzymatic peptide synthesis, 1987, CRC Press, Florida). It can also be obtained by a method consisting in cultivating a host cell expressing a nucleic acid encoding the fusion protein and recovering said protein from these cells or from the culture medium.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the fusion protein according to the invention, in particular a fusion protein comprising a class II nuclease of the CRISPR system, preferably of type V and preferably Cpfl, and a Spoll protein or partner of Spoll as described above.
  • nucleic acid is intended to mean any molecule based on DNA or RNA. They may be synthetic or semi-synthetic, recombinant molecules, optionally amplified or cloned in vectors, chemically modified, comprising non-natural bases or modified nucleotides comprising for example a modified bond, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar.
  • codons is optimized according to the nature of the eukaryotic cell of interest.
  • the nucleic acid according to the invention can be in the form of DNA and / or RNA, single stranded or double stranded.
  • the nucleic acid is an isolated DNA molecule, synthesized by recombinant techniques well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid according to the invention can be deduced from the sequence of the fusion protein according to the invention and the use of codons can be adapted according to the host cell into which the nucleic acid is to be transcribed.
  • the present invention further relates to an expression cassette comprising a nucleic acid according to the invention operably linked to the sequences necessary for its expression.
  • the nucleic acid can be under the control of a promoter allowing its expression in a eukaryotic host cell.
  • an expression cassette comprises, or consists of, a promoter for initiating transcription, a nucleic acid according to the invention, and a transcription terminator.
  • expression cassette refers to a nucleic acid construct comprising a coding region and a regulatory region, operably linked.
  • operably linked indicates that the elements are combined such that the expression of the coding sequence is under the control of the transcriptional promoter.
  • the promoter sequence is placed upstream of the gene of interest, at a distance of the latter compatible with the control of its expression. Spacer sequences can be present, between the regulatory elements and the gene, as long as they do not prevent expression.
  • the expression cassette can also comprise at least one “enhancer” activator sequence operably linked to the promoter.
  • promoters which can be used for the expression of genes of interest in cells or host organisms are available to those skilled in the art. They include constitutive promoters as well as inducible promoters which are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli.
  • the nucleic acid according to the invention is placed under the control of a constitutive promoter or of a promoter specific for meiosis.
  • meiosis-specific promoters which can be used in the context of the present invention include, but are not limited to, endogenous Spoll promoters, promoters of Spoll partners for the formation of double-stranded breaks, the Rec8 promoter (Murakami & Nicolas, 2009, Mol. Cell. Biol, 29, 3500-16,), or the Spol3 promoter (Malkova et al, 1996, Genetics, 143, 741-754,), meiotic promoters of Arabidopsis thaliana for example such as described in Li et al., BMC Plant Biol. 2012; 12: 104, Eid et al., Plant Cell Rep. 2016 Jul; 35 (7): 1555-8, Xu et al., Front. Plant Sci., 13 July 2018e, Da Inippo et al., PLoS Genet, 2013, 9, el003787.).
  • inducible promoters can also be used such as the estradiol promoter (Carlie & Amon, 2008 Cell, 133, 280-91,), the methionine promoter (Care et al, 1999, Molecular Microb 34, 792-798,), the TetO / TetR system inducible by doxycline, promoters induced by thermal shock, metals, steroids, antibiotics and alcohol.
  • Constitutive promoters which can be used in the context of the present invention are, by way of nonlimiting examples: the promoter of the immediate early genes of cytomegalovirus (CMV), the promoter of the simian virus (SV40), the major late promoter of adenoviruses, the Rous sarcoma virus (RSV) promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, ED1-alpha elongation factor promoter, ubiquitin, actin promoters, tubulin promoters, immunoglobulin promoters, alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) promoter, RNA polymerase III dependent promoters such as U6, U3, H1, 7SL, pRPR1 (“Ribonuclease P RNA 1”), SNR52 (“small nuclear RNA 52”) promoters, or the pZmUbi promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • the expression cassette and / or the nucleic acid according to the invention is operably linked to a transcriptional promoter allowing expression of the expression cassette and / or the nucleic acid during meiosis.
  • a transcriptional promoter can be pREC8.
  • the transcription terminator can be readily selected by one skilled in the art.
  • this terminator is RPRlt, the 3 ′ flanking sequence of the Saccharomyces cerevisiae SUP4 gene or the tNOS nopaline synthase terminator.
  • the present invention further relates to an expression vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the invention.
  • This expression vector can be used to transform a host cell and allow expression of the nucleic acid according to the invention in said cell.
  • the vectors can be constructed by conventional techniques of molecular biology, well known to those skilled in the art.
  • the expression vector comprises regulatory elements allowing the expression of the nucleic acid according to the invention. These elements can include, for example, transcription promoters, transcription activators, terminator sequences, initiation and termination codons. The methods for selecting these elements depending on the host cell in which expression is desired are well known to those skilled in the art.
  • the expression vector comprises a nucleic acid encoding the fusion protein according to the invention, placed under the control of a constitutive promoter, preferably the ADH1 promoter (pADH1). It can also include a terminator sequence such as the ADH1 terminator (tADH1).
  • the expression vector can comprise one or more origins of replication, bacterial or eukaryotic.
  • the expression vector may in particular comprise an origin of bacterial replication which is functional in E.coli, such as the origin of replication ColE1.
  • the vector may comprise a eukaryotic origin of replication, preferably functional in plants and in yeasts, in particular in S. cerevisiae.
  • the vector may further comprise elements allowing its selection in a bacterial or eukaryotic host cell such as, for example, a gene for resistance to an antibiotic or a selection gene ensuring the complementation of the respective inactivated gene in the genome of the host cell.
  • elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the expression vector comprises one or more genes for resistance to antibiotics, preferably a gene for resistance to ampicillin, kanamycin, hygromycin, geneticin and / or gene. nourseothricin.
  • the expression vector may also include one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, expression cassette or nucleic acid into the genome of a host cell.
  • the insertion is carried out at the level of a gene whose activation allows the selection of host cells which have integrated the vector, the cassette or the nucleic acid, such as the TRP1 locus.
  • the vector can be circular or linear, single- or double-stranded. It is advantageously chosen from plasmids, phages, phagemids, viruses, cosmids and artificial chromosomes. Preferably, the vector is a plasmid.
  • the present invention relates in particular to a vector, preferably a plasmid, comprising a bacterial origin of replication, preferably the ColE1 origin, a nucleic acid as defined above under the control of a promoter, preferably a constitutive promoter such as the ADH1 promoter, a terminator, preferably the ADH1 terminator, one or more selection markers, preferably resistance markers such as the kanamycin or ampicillin resistance gene, and one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, of the expression cassette or of the nucleic acid into the genome of the host cell, preferably at the level of the TRP1 locus of the genome of a yeast.
  • a promoter preferably a constitutive promoter such as the ADH1 promoter, a terminator, preferably the ADH1 terminator, one or more selection markers, preferably resistance markers such as the kanamycin or ampicillin resistance gene, and one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, of the expression cassette or of the nucleic acid into
  • the invention relates in particular to a vector, preferably a plasmid, compatible for agrotransfection, in particular using Agrobacterium tumefaciens (Fraley et al. Crit. Rev. Plant. Sci. 4 ppl-46; Fromm et al., (1990) Biotechnology 8, pp 833-844) or Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Planta 210 pp 195-204) and aimed at the transformation of plants.
  • Agrobacterium tumefaciens Fraley et al. Crit. Rev. Plant. Sci. 4 ppl-46; Fromm et al., (1990) Biotechnology 8, pp 833-844) or Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Planta 210 pp 195-204) and aimed at the transformation of plants.
  • An example of a compatible plasmid is the Ti-type plasmid, in particular
  • the vector according to the invention comprises a selectable marker.
  • selectable markers for plant transformation include the gene conferring resistance to kanamycin neomycin phosphotransferase II (NPTII), used for selection in a culture containing kanamycin, the phosphinothricin acetyltransferase (HPH) gene, used for selection in a culture containing hygromycin B.
  • NPTII kanamycin neomycin phosphotransferase II
  • HPH phosphinothricin acetyltransferase
  • the nucleic acid according to the invention carried by the vector encodes a fusion protein comprising one or more tags, preferably comprising a tag consisting of six histidines and / or one or more Flag motifs, of preferably three Flag patterns.
  • the tag (s) are in C-terminal.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention to transform or transfect a cell.
  • the host cell can be transiently or stably transformed / transfected and the nucleic acid, cassette or vector can be contained in the cell as an episome or integrated into the genome of the host cell.
  • the present invention thus relates to a host cell comprising a fusion protein, a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention.
  • the cell is a eukaryotic cell.
  • the term "eukaryotic cell” refers to a yeast, plant, fungal or animal cell, particularly a mammalian cell such as a mouse or rat cell, or a cell. insect cell.
  • the eukaryotic cell is preferably non-human and / or non-embryonic.
  • the eukaryotic cell is not an embryonic stem cell of human and / or animal origin.
  • the eukaryotic cell expresses a Spoll protein endowed with nuclease activity, that is to say a Spoll protein capable of inducing double-stranded breaks during prophase I of meiosis.
  • the eukaryotic cell is a yeast cell, in particular a yeast of industrial interest.
  • yeasts of interest include, but are not limited to, yeasts of the genus Saccharomyces sensu stricto, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia or Candida, as well as hybrids obtained from a strain belonging to one of of these kinds.
  • the yeast of interest belongs to the genus Saccharomyces.
  • Saccharomyces cerevisiae preferably Saccharomyces bayanus, Saccharomyces castelli, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus (also called Saccharomyces carlsbergensis), and from at least one of the hybrids obtained from one strain these species such as for example a hybrid S. cerevisiae / S. paradoxus or a hybrid S. cerevisiae / S. uvarum., more preferably said eukaryotic host cell is Saccharomyces cerevisiae.
  • the eukaryotic cell is a fungus cell, in particular a fungus cell of industrial interest.
  • fungi include, but are not limited to, cells of filamentous fungi.
  • Filamentous fungi include fungi belonging to the Eumycota and Oomycota subdivisions.
  • Filamentous fungal cells can be selected from the group consisting of Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Flumicallola, Magnaportheceliospora, Neurosporinus, Flumicalla, Magnaportceliospora, Neurosporium, Mycimophthora, , Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium or Trametes.
  • the eukaryotic cell is a plant cell, in particular a plant cell of agronomic, horticultural, pharmaceutical or cosmetic interest, in particular vegetables, fruits, herbs, flowers, trees and others. shrubs.
  • the plant cell is selected from monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, more particularly preferably selected from the group consisting of rice, wheat, soybean, corn, tomato, onion, cucumber. , lettuce, asparagus, carrot, turnip, Arabidopsis thaliana, barley, rapeseed, cotton, vine, sugar cane, beet, cotton, sunflower, palm oil, coffee, tea, cocoa, chicory, pepper, chili, lemon, orange, nectarine, mango, apple, banana , peach, apricot, sweet potato, yams, almond, hazelnut, strawberry, melon, watermelon, olive tree, potato, zucchini, eggplant, avocado, cabbage, plum, cherry, pineapple, spinach, apple, tangerine, grapefruit, pear, grape , cloves, cashews u, coconut, sesame, rye, hemp, tobacco, berries such as raspberry or blackcurrant, peanut, castor, vanilla, poplar, eucalyptus, green
  • the plant cell can be selected from the group consisting of rice, wheat, soybean, corn, tomato, onion, cucumber, lettuce, asparagus, carrot, turnip, Arabidopsis thaliana, barley, rapeseed, cotton, vine, sugar cane, beet, cotton, sunflower, olive palm, coffee , tea, cocoa, chicory, pepper, chili, lemon, orange, nectarine, mango, apple, banana, peach, apricot, sweet potatoes, yams, almonds, hazelnuts, strawberries, melons, watermelons, olive trees, and horticultural plants such as roses, tulips, orchids and geraniums.
  • Each of the different cells described above can in particular be used in the methods according to the invention described below.
  • the present invention also relates to the use of the fusion protein, of the nucleic acid, of the expression cassette or of the expression vector according to the invention for (i) inducing targeted meiotic recombinations in a cell.
  • eukaryotic (ii) generate variants of a eukaryotic organism, and / or (iii) identify or localize the genetic information encoding a characteristic of interest in a eukaryotic cell genome.
  • the methods according to the invention can be in vitro, in vivo or ex vivo methods, preferably in vitro.
  • the invention relates in particular to a method for inducing targeted meiotic recombinations in a eukaryotic cell, preferably non-human, comprising - the introduction into said cell: a) of a fusion protein, of a nucleic acid, of a expression cassette or a vector as described above; and b) one or more guide RNAs or one or more nucleic acids encoding said guide RNAs, said guide RNAs comprising a nuclease binding RNA structure associated with a CRISPR system of the fusion protein and a sequence complementary to the targeted chromosomal region; and - induction of entry into prophase I of meiosis of said cell.
  • the eukaryotic cell is as described above.
  • guide RNA designates an RNA molecule capable of interacting with the CRISPR domain, preferably with a Cpfl protein, of the fusion protein in order to guide it. to a target chromosomal region.
  • Each gRNA includes a region (commonly referred to as the "SDS" region) at the 3 'end of the gRNA that is complementary to the target chromosomal region and mimics the endogenous CRISPR system's rRNA.
  • SDS region
  • Cpfl gRNA does not require a second region (commonly referred to as the “handle” region), at the 3 'end of the gRNA, which mimics pairing interactions. of bases between the tracrRNA and the crRNA of the endogenous CRISPR system.
  • the sequence of the gRNA varies depending on the chromosome sequence targeted.
  • the "SDS" region of the gRNA which is complementary to the target chromosomal region generally comprises between 10 and 25 nucleotides. Preferably, this region is 19, 20 or 21 nucleotides in length, and particularly preferably 25 nucleotides.
  • the total length of a gRNA is generally 30 to 140 nucleotides, preferably 30 to 125 nucleotides, and more particularly preferably 40 to 100 nucleotides.
  • a gRNA as used in the present invention has a length of 30 to 75 nucleotides, preferably 35 to 65 nucleotides, more preferably 44 to 63 nucleotides.
  • gRNAs can easily define the sequence and structure of gRNAs according to the chromosomal region to be targeted using well known techniques.
  • one or more gRNA can be used simultaneously. These gRNAs can be different or identical. These gRNAs can target identical or different, preferably different, chromosomal regions.
  • GRNAs can be introduced into the eukaryotic cell in the form of mature gRNA molecules, in the form of precursors or in the form of one or more nucleic acids encoding said gRNAs.
  • these gRNAs can contain modified nucleotides or chemical modifications allowing them, for example, to increase their resistance to nucleases and thus increase their lifespan in the cell. They can in particular comprise at least one modified or unnatural nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylarnino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino -2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylarnino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino -2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • the gRNAs used according to the invention can also be modified at the level of the intemucleotide bond such as for example the phosphorothioates, the H-phosphonates or the alkyl-phosphonates, or at the level of the backbone such as for example the alpha-oligonucleotides, the 2'- O-Alkyl ribose or PNAs (Peptid Nucleic Acid) (Egholm et al, 1992 J. Am. Chem. Soc., 114, pp 1895-1897).
  • GRNAs can be natural, synthetic or produced by recombinant techniques. These gRNAs can be prepared by any method known to those skilled in the art such as, for example, chemical synthesis, in vivo transcription or amplification techniques.
  • the method comprises the introduction into the eukaryotic cell of the fusion protein and one or more gRNAs capable of targeting the action of the fusion protein towards a given chromosomal region.
  • the protein and the gRNAs can be introduced into the cytoplasm or the nucleus of the eukaryotic cell by any method known to those skilled in the art, for example by microinjection.
  • the fusion protein can in particular be introduced into the cell as part of a protein-RNA complex comprising at least one gRNA.
  • the method comprises introducing into the eukaryotic cell the fusion protein and one or more nucleic acids encoding one or more gRNAs.
  • the method comprises introducing into the eukaryotic cell a nucleic acid encoding the fusion protein and one or more gRNAs.
  • the method comprises introducing into the eukaryotic cell a nucleic acid encoding the fusion protein and one or more nucleic acids encoding one or more gRNAs.
  • the eukaryotic cell is heterozygous for the gene (s) targeted by the guide RNA (s).
  • the eukaryotic cell is homozygous for the gene (s) targeted by the guide RNA (s).
  • the fusion protein, or the nucleic acid encoding the same, and the gRNA (s), or the nucleic acid (s) encoding them, can be introduced simultaneously or sequentially into the cell.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein and the nucleic acid (s) encoding the gRNA (s) can be introduced into a cell by crossing two cells into which have respectively been introduced the nucleic acid encoding the fusion protein and the nucleic acid (s) encoding the gRNA (s).
  • the nucleic acid encoding the fusion protein and the nucleic acid (s) encoding the gRNA (s) can be introduced into a cell by mitosis of a cell in which the acid nucleic acid encoding the fusion protein and the nucleic acid (s) encoding the gRNA (s) have previously been introduced.
  • the expression of said nucleic acids allows to produce the fusion protein and / or the gRNA (s) in the cell.
  • the nucleic acids encoding the fusion protein and those encoding the gRNAs can be placed under the control of identical or different promoters, constitutive or inducible, in particular promoters specific for meiosis.
  • the nucleic acids are placed under the control of constitutive promoters such as the ADH1 promoter or the pRPR1 and SNR52 promoters dependent on RNA polymerase III, more preferably the pRPR1 promoter.
  • constitutive promoters such as the ADH1 promoter or the pRPR1 and SNR52 promoters dependent on RNA polymerase III, more preferably the pRPR1 promoter.
  • the nature of the promoter may also depend on the nature of the eukaryotic cell.
  • the eukaryotic cell is a plant cell, preferably a rice cell, and the nucleic acids are placed under the control of a promoter chosen from pZmUbi promoters (maize pubiquitin promoter) and them. U3 and U6 polymerase III promoters.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein is placed under the control of the pZmUbi promoter and the nucleic acids encoding the gRNAs are placed under the control of the U3 or U6 promoter, preferably of the U3 promoter.
  • the expression of the gRNA is placed under the control of the tetracycline operator.
  • the Tet system comprises two complementary circuits: the tTA dependent circuit (Tet-Off system) and the rtTA dependent circuit (Tet-On system).
  • Tet-Off system the tTA dependent circuit
  • Tet-On system the rtTA dependent circuit
  • the expression of the gRNA is monitored by a Tet-On system.
  • the expression of gRNA is thus regulated by the presence or absence of tetracycline or one of its derivatives such as doxycycline.
  • nucleic acids encoding the fusion protein and the gRNA (s) can be arranged on the same construct, in particular on the same expression vector, or on separate constructs. Alternatively, the nucleic acids can be inserted into the genome of the eukaryotic cell at the same or separate regions. According to a preferred embodiment, the nucleic acids encoding the fusion protein and the gRNA (s) are placed on the same expression vector.
  • the nucleic acids as described above can be introduced into the eukaryotic cell by any method known to those skilled in the art, in particular by microinjection, transfection, agro-infection, electroporation or biolistics.
  • the expression or the activity of the endogenous Spoll protein of the eukaryotic cell can be suppressed in order to better control the phenomena of meiotic recombination.
  • This inactivation can be carried out by techniques well known to man. of the art, in particular by inactivating the gene encoding the endogenous Spoll protein or by inhibiting its expression by means of interfering RNAs.
  • the Spoll domain of the fusion protein is endowed with nuclease activity in order to complement the absence of endogenous Spoll activity.
  • the method according to the invention comprises the induction of the entry into prophase I of meiosis of said cell.
  • This induction can be done according to different methods, well known to those skilled in the art.
  • the eukaryotic cell is a mouse cell
  • the entry of cells into meiosis prophase I can be induced by the addition of retinoic acid (Bowles J et al, 2006, Sciences, 312 (5773 ), pp. 596-600).
  • the eukaryotic cell is a plant cell
  • the induction of meiosis occurs naturally.
  • a plant is regenerated and placed under conditions favoring the induction of a reproductive phase and thus of the meiosis process. These conditions are well known to those skilled in the art.
  • this induction can be carried out by the transfer of the yeast into a sporulation medium, in particular from a rich medium to a sporulation medium, said sporulation medium preferably being devoid of a carbon source. fermentable or nitrogen, and incubation of the yeasts in the sporulation medium for a time sufficient to induce double-stranded breaks.
  • the initiation of the meiotic cycle depends on several signals: the presence of the two mating type alleles MATa and MAT ⁇ , the absence of a source of nitrogen and fermentable carbon.
  • the term “rich medium” refers to a culture medium comprising a source of fermentable carbon and a source of nitrogen as well as all the nutrients necessary for the yeasts to multiply by mitotic division.
  • This medium can be easily chosen by a person skilled in the art and can, for example, be selected from the group consisting of YPD medium (1% yeast extract, 2% bactopeptone and 2% glucose), YPG medium (1% extract yeast, 2% bactopeptone and 3% glycerol) and a complete synthetic medium (or SC medium) (Treco and Lundblad, 2001, Curr. Protocol. Mol. Biol., Chapter 13, Unit 13.1).
  • sporulation medium refers to any medium inducing entry into meiosis prophase of yeast cells without vegetative growth, in particular to a culture medium not comprising a carbon source. fermentable or nitrogen source but comprising a carbon source metabolizable by respiration such as acetate.
  • This medium can be easily chosen by a person skilled in the art and can, for example, be selected from the group consisting of 1% KAc medium (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518), SPM medium (Kassir and Simchen, 1991, Meth. Enzymol., 194, pp. 94-110) and sporulation media described in the article by Sherman (Sherman, Meth.
  • the cells before being incubated in the sporulation medium, the cells are cultured for a few cycles of division in a pre-sporulation medium so as to obtain efficient and synchronous sporulation.
  • the pre-sporulation medium can be easily chosen by a person skilled in the art. This medium can be, for example, SPS medium (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518).
  • SPS medium Wang and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518.
  • the choice of media depends on the physiological and genetic characteristics of the yeast strain, in particular if this strain is auxotrophic for one or more compounds.
  • the meiotic process can continue until it produces four daughter cells carrying the desired recombinations.
  • the eukaryotic cell is a yeast, and in particular a yeast of the genus Saccharomyces
  • the cells can be replaced in growth conditions in order to resume a mitotic process.
  • This phenomenon called “retum-to-growth” or “RTG” has been described previously in the patent application WO 2014/083142 and occurs when the cells entered into meiosis in response to a nutritional deficiency are placed in the presence of a source.
  • the method may further comprise obtaining the cell (s) exhibiting the desired recombination (s).
  • the method may further comprise a step of culturing and / or multiplying the cell (s) exhibiting the desired recombination (s).
  • the method may further comprise a step of somatic embryogenesis, that is to say the regeneration of a plant embryo from a callus comprising the cells exhibiting the recombination (s). sought.
  • the method according to the invention can be used in all applications where it is desirable to improve and control the phenomena of meiotic recombination.
  • the invention makes it possible to associate, in a preferential manner, genetic traits of interest. This preferential association allows, on the one hand, to reduce the time necessary for their selection, on the other hand, to generate possible but improbable natural combinations.
  • the organisms obtained by this process can be considered as non-genetically modified (non-GMO) organisms.
  • the present invention relates to a method for generating variants of a eukaryotic organism, with the exception of man, preferably a yeast or a plant, more preferably a yeast, in particular a strain of yeast. of industrial interest, including
  • variant should be understood broadly, it designates an organism having at least one genotypic or phenotypic difference from the parent organisms.
  • the recombinant cells can be obtained by allowing meiosis to continue until the spores are obtained, or, in the case of yeasts, by replacing the cells in growth conditions after the induction of the double-strand breaks in order to resume a mitotic process.
  • a plant variant can be generated by fusion of plant gametes, at least one of the gametes being a cell recombined by the method according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for identifying or localizing genetic information encoding a characteristic of interest in a eukaryotic cell genome, preferably a yeast or a plant, comprising:
  • the characteristic of interest is a quantitative characteristic of interest (QTL).
  • QTL quantitative trait locus
  • LCQ or QTL for quantitative trait loci is a larger or smaller region of DNA that is closely associated with a quantitative trait, i.e. a chromosomal region where one or more genes are located. at the origin of the character in question.
  • the present invention finally relates to a kit comprising a fusion protein, a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention, or a host cell transformed or transfected with a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention. It also relates to the use of said kit for implementing a method according to the invention, in particular for (i) inducing targeted meiotic recombinations in a eukaryotic cell, (ii) generating variants of a eukaryotic organism, and / or (iii) identify or locate genetic information encoding a characteristic of interest in a eukaryotic cell genome.
  • C cysteine
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • F phenylalanine
  • G glycine
  • H histidine
  • I isoleucine
  • K lysine
  • L leucine
  • M methionine
  • N asparagine
  • P proline
  • Q glutamine
  • R arginine
  • S serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine.
  • all of the identity percentages mentioned in this application can be set at at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, identity.
  • all the percentages of sequence identity are at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least are considered as described. minus 99%, sequence identity.
  • the humanized version of the CPF1 gene from Francisella novicida carried by the plasmid pY004 was obtained from the Addgene platform (http://n2t.net/addgene:69976; RRID: Addgene_69976) Zetsche, B. , et al., 2015, Cell, 163, 759- 771.
  • the plasmid pAS604 containing the fragment P ADH I-NLS-Fn CPFI-T ADH I was constructed by cloning the sequence of FnCPFl (amplified by PCR from pY004) in the plasmid pAS565 linearized with the Apal-Ndel enzymes.
  • the Spel-Xmal fragment of Plasmid pAS532 was replaced by the Spel-Xmal fragment of plasmid pAS604 containing the sequence NLS (Nuclear Localization Signal; GGMAAPKKKRKVDGG SEQ ID NO: 34) and the part encoding the protein FnCPFl.
  • NLS Nuclear Localization Signal
  • the resulting plasmid, pAS608 contains the PADHi-NLS-FnCPF1-SP011 Y135F -6xFHis-3xFlag-TADm cassette.
  • the PADHI promoter was replaced by the PRECS specific meiosis promoter cloned by Gibson reaction in the vector pAS604 digested with SpeI-XhoI.
  • the final plasmid, pAS628, contains the PREC8-NLS-FnCPFl-SP011 Y135F -6xFHis-3xFlag-TADHi cassette in which the NLS and the N-terminus of FnCpf1 are separated by a linker (GIHGVPAA, SEQ ID NO: 35 ).
  • the FnCpf1 crRNA expression cassette was designed from the plasmid pUD628 (Swiat, et al., 2017Nucleic acids research, 45, 12585-12598); the expression of the crRNAs therein is controlled by the SNR52 promoter (PSNR52) and by the S IJ P 4 terminator (TSUP4).
  • PSNR52 SNR52 promoter
  • TSUP4 S IJ P 4 terminator
  • the final plasmid pAS631 therefore contains the crRNA expression system Ps NR 52-tetO-DR-DR-Tsup4-TetR inducible to doxycycline.
  • the 25 nucleotide guide sequence (5 'GTCCGTGCGG AG AT ATCTGCGCCGT 3' SEQ ID NO: 45) targeting the Gal4 UAS-B , C site in the promoter of the GAL2 gene was inserted between the DR sequences by Gibson reaction in the plasmid pAS631 linearized with BglII.
  • the plasmids pAS533 and pAS628 respectively carrying the P REC8 cassettes -FnCPFl-SP011 Y135F - 6xHis-Flag-T ADHi- TRP1-KanMX were linearized with the restriction enzyme Xbal and integrated into the TRP1 locus by electroporation of the cells.
  • the integration junctions of the expression cassettes of FnCPFl -SPOl 1 Y135F at the TRP1 locus were verified by PCR.
  • the frequency of recombination around the GAL2 gene (chromosome XII) is measured between the NatMX cassette integrated at position 287 725 in the promoter of the EMP46 gene (pEMP46) and the HphMX cassette integrated at position 292068 in the terminator of the GAL2 gene ( tGALZ).
  • the diploid cells are inoculated in a rich liquid medium (YPD) or in a complete synthetic medium lacking Leucine (SC-Leu) in order to maintain the plasmids carrying the LEU2 selection marker.
  • the cells multiply with stirring at 30 ° C. for 24 hours (“Mitotic” point).
  • the saturated SC-Leu liquid cultures are diluted in SPS pre-sporulation medium (2-16 x10 5 cells / ml) and cultured with shaking at 30 ° C for ⁇ 15 hours. Cultures having reached an OD 600 between 2 and 4 are centrifuged, washed twice with water and transferred to the sporulation medium (KAc 1%) with a final OD 600 of 1. This is the To point of the meiotic progression.
  • doxycycline hyclate is added at a final concentration of 10 ⁇ g / ml in the sporulation medium at time To.
  • the YPD growth, SPS pre-sporulation and 1% KAc sporulation media are described in the reference Murakami et al., (2009) Methods Mol Biol, 557, pp 117-142.
  • the YPD medium consists of yeast extract 1%), peptone (2%) and glucose (2%).
  • the complete synthetic medium devoid of Leucine is composed of Yeast Nitrogen Base (0.17%), Ammonium Sulfate (0.5%), Drop-out Mix Synthetic without Leucine (0.16%) and Glucose ( 2%).
  • the 4-spore tetrads were dissected on YPD dishes after 48 hours of incubation in the sporulation medium.
  • the segregation of the NatMX and HygMX markers is visualized by replicating the colonies on YPD dishes respectively containing nourseothricin (100 mg / l) or hygromycin (300 mg / i).
  • the Cpfl-Spo11 Y135F fusion stimulates the formation of meiotic CBDs and their repair by homologous recombination in the promoter region of the GAL2 gene
  • the gene encoding the Cpfl -Spo 11 Y135F fusion protein is induced in diploid SPO11 / SPO11 cells which contain the wild-type target sequence pGAL2B, c (5 'ACGGCGCAGATATCTCCGCACGGAC 3', SEQ ID NO: 43) on the parental chromosome PI and a target sequence pGAL2 b, c mutated resistant to cuts of Cpfl on the parental chromosome P2 (5 'AttcCGC AG AT ATCTCCGC Atat AC 3', SEQ ID NO: 44).
  • doxycycline hyclate is added to the meiotic culture (1% KAc) at time 0 for a final concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • the genomic DNA is extracted from yeast cells, digested with the restriction enzyme Xbal, deposited on an agarose gel (0.6%) and separated by electrophoresis, then transferred to a nitrocellulose membrane and hybridized with a radioactive probe located en in the coding region of the GAL2 gene.
  • the position of the DNA fragments corresponding to the parental chromosomes (PI and P2) as well as to the recombinant molecules (RI and R2) is indicated on the left of the gel.
  • the thick black arrow indicates the CDBs induced by Cpfl -Spo 11 Y135F in the promoter of the target gene GAL2 at the level of the Ga14 uAs -B, C sites on the PI chromosomes.
  • the map of the GAL2 region shows the open reading frames (the arrows indicating the direction of transcription), the heterozygous genetic markers NatMX and HphMX located in trans from the target site GAL2 B, C as well as the position of the probe (hatched rectangle ).
  • the frequency of CDBs as well as the sum of the frequencies of the recombinant molecules R1 and R2 are indicated under the gel.
  • the minimum threshold for detection of DNA molecules is 0.3%.
  • ANT2951 MATa / ⁇ trpl :: pAS628 (CPFl-SP011 Y135F -6xHis-Flag-TRPl-
  • KanMX / trpl :: hisG pGAL2_AB 2 CD 2 E / pGAL2_ab 2 cD 2 E tGAL2 :: HphMX / - pEMP46 :: NatMX / - his4 / "leu2 /" ura3 / "+ plasmid pAS632-crRNA UAS-: B: L , ECU2.
  • the Cpfl-Spol I Y135F fusion stimulates meiotic recombination in the target region of the promoter of the GAL2 gene (FIG. 2).
  • SPOll diploid cells possess the markers NatMX and HphMX heterozygotes on either side of the targeted regions. Their segregation was followed in the meiosis products by dissection of the 4-spore tetrads.
  • the NatMX gene confers resistance to nourseothricin (Nat R ) and the HphMX gene confers resistance to hygromycin (Hyg R ).
  • the four meiosis products are of the parental type: 2 Nat R Hyg s , 2 Nat s Hyg R (parental ditypes PD).
  • TT tetratype
  • NPD non-parental ditype-type
  • Genotype of strain ANT2945 MATa / ⁇ trpl :: pAS628 (CPFESP011 Y135F -6xHis-Flag- TRP1 -KanMX) / trpl :: hisG pGAL2_AB 2 CD 2 E / pGAL2_ab 2 cd 2 e tGAL2 :: HphMX / - pEMP 46: : NatMX / - his4 / "leu2 /" ura3 / "and contains the plasmid pAS632-crRNA UAS-B, C..LEU2.
  • the NatMX and HphMX cassettes were respectively integrated into the GAL2 terminator (tGAL2) between positions 292068 and 292069, and into the EMP46 promoter (pEMP46) between positions 287725 and 287 726.

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Abstract

La présente invention concerne une protéine de fusion comprenant un domaine d'une nucléase issue du système CRISPR de classe 2, en particulier Cpf1, et un domaine Spo11, ainsi que l'utilisation de cette protéine pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote.

Description

UTILISATION D’UNE PROTEINE DE FUSION POUR INDUIRE DES MODIFICATIONS GENETIQUES
PAR RECOMBINAISON MEIOTIQUE CIBLEE
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention relève du domaine des modifications génétiques ciblées chez les eucaryotes. Elle concerne notamment un procédé pour améliorer ou modifier une cellule eucaryote en induisant des recombinaisons méiotiques ciblées.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION La modification du matériel génétique d'organismes eucaryotes s’est grandement développée ces vingt dernières années, et a trouvé une application dans le domaine des plantes, des cellules humaines et animales ainsi que des micro-organismes tels que les levures pour des applications dans les domaines de l'agriculture, de la santé humaine, de G agro-alimentaire et de la protection de l'environnement. Les levures trouvent leur application dans des domaines industriels extrêmement variés. Du fait de l’innocuité d’un grand nombre d’espèces, les levures sont notamment utilisées dans l’industrie alimentaire comme agent de fermentation en boulangerie, en brasserie, vinification ou distillerie, ou sous forme d’extraits comme éléments nutritionnels ou agents de sapidité. Elles peuvent également trouver leur usage dans la production industrielle de bioéthanol ou de molécules d’intérêt telles que des vitamines, des antibiotiques, des vaccins, des enzymes ou des hormones stéroïdiennes, ou encore dans les procédés de dégradation des matières cellulosiques. De la même façon, les plantes sont utilisées dans de nombreux domaines industriels, que ce soit dans l’industrie agro-alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique.
La diversité des applications industrielles des levures et des plantes implique qu’il existe une demande constante pour des souches de levure et des variétés végétales présentant des caractéristiques améliorées ou, tout au moins, adaptées à une nouvelle utilisation ou de nouvelles conditions de culture. Afin d’obtenir une cellule ou un organisme eucaryote présentant une caractéristique particulière, l’homme du métier peut utiliser la reproduction sexuée et sélectionner une cellule ou un organisme hybride apportant la combinaison recherchée des caractéristiques parentales. Cette méthode est cependant aléatoire et l’étape de sélection peut engendrer des délais conséquents notamment dans le cas des levures et des plantes.
De manière alternative, l’homme du métier peut également modifier le patrimoine génétique d'une cellule ou d'un organisme par une technique d’ADN recombinant. Cette modification peut néanmoins constituer un frein à son exploitation, que ce soit pour des raisons réglementaires, sanitaires ou environnementales, notamment dans le cas des plantes considérées comme organismes génétiquement modifiés (OGM).
Une troisième alternative consiste à provoquer un réassortiment des allèles d’origine paternelle et maternelle dans le génome, au cours de la recombinaison méiotique. La recombinaison méiotique est un échange d’ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose. Après la réplication de l’ADN, la recombinaison est initiée par la formation de cassures double -brin dans l’une (ou l’autre) des chromatides des chromosomes homologues, suivie de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue. Les recombinaisons méiotiques ont cependant l’inconvénient d’être non- uniformes. En effet, les sites de coupures double-brin à l’origine de ces recombinaisons ne sont pas distribués de façon homogène dans le génome. On distingue ainsi des régions chromosomiques dites ‘chaudes’ où la fréquence de recombinaison est élevée, et des régions chromosomiques dites ‘froides’ où la fréquence de recombinaison peut être jusqu’à 100 fois plus faible. Spoll est la protéine catalysant les cassures double-brin au cours de la méiose. Elle agit sous forme de dimère en coopération avec d’autres protéines partenaires. A l’heure actuelle, les facteurs déterminant le choix des sites de coupure double-brin par Spoll et ses partenaires restent encore mal compris.
Le contrôle de la formation des cassures double-brin et, de fait, des recombinaisons méiotiques, est crucial pour le développement de techniques d’ingénierie génétique. Il a notamment été montré qu’il est possible de modifier les sites de formation de cassures double- brin en fusionnant Spoll avec le domaine de liaison à l’ADN de l’activateur de transcription Gal4 (Pecina et al, 2002 Cell, 111, pp. 173-184). Les protéines de fusion Gal4BD-Spoll et Gal4-Spoll permettent d’introduire des cassures double-brin dans des régions chromosomiques dites ‘froides’, au niveau des sites de liaison de Gal4 à l’ADN. Cependant, selon le système Spoll-Gal4, l’introduction de cassures double-brin ciblées est conditionnée par la présence de sites de liaison Gal4, rendant impossible d’induire des phénomènes de recombinaisons méiotiques ciblées indépendamment de sites de liaison spécifiques.
La stimulation locale de la recombinaison méiotique sur un certain nombre de sites chromosomiques a été rapportée suite à la liaison de Spoll à la protéine deadCas9 (Samo et al., Nucleic Acids Research, 45 pp. el64). Cependant, l’endonucléase Cas9 et son guide ARN requiert une séquence spécifique riche en guanines appelée PAM (5‘-NGG-3’), ce qui limite les utilisations potentielles de ce système.
Ainsi, il reste un besoin de mettre à disposition des méthodes permettant d'induire facilement et spécifiquement la recombinaison méiotique de régions du génome inaccessibles aux techniques de l'art antérieur et pouvant s’appliquer à une large gamme de cellules eucaryotes.
RESUME DE L’INVENTION
L’objectif de la présente invention est de proposer une protéine de fusion ainsi qu’un procédé permettant d’induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules de levure ou de plante, dans n’importe quelle région du génome, de préférence plusieurs régions différentes du génome, indépendamment de tout site de liaison connu, et notamment dans des régions chromosomiques dites ‘froides’.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant (i) une nucléase associée à un système CRIS PR, de préférence un système CRIS PR de classe 2, et (ii) une protéine Spoll ou l’un de ses partenaires impliqués dans la formation et la réparation des cassures double brin lors de la méiose, dans laquelle la nucléase associée au système CRISPR n’est pas une nucléase Cas9.
De préférence, la nucléase associée à un système CRISPR n’est pas une nucléase de classe II et de type IL
De préférence, la nucléase (i) est associée à un système CRISPR de classe II, de préférence de type V, De manière tout particulièrement préférée, la nucléase associée à un système CRISPR est une nucléase Cpfl. En particulier, ladite nucléase Cpfl peut être une nucléase Cpfl comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33, et les variants desdites séquences présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Cpfl. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre une nucléase associée à un système CRISPR qui est déficiente pour l’activité nucléase. En particulier, cette nucléase peut être un variant d’une protéine Cpfl sauvage présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Cpfl et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine. De manière plus particulière, cette nucléase peut être un variant d’une protéine Cpfl choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33, présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec ladite séquence et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine.
Dans des modes préférés, la protéine de fusion comprend une protéine Spol 1. La protéine Spoll peut notamment être choisie parmi les séquences des SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42, et les variants de celles-ci comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Spoll. En particulier, la protéine de fusion peut comprendre une protéine Spoll déficiente pour l’activité nucléase. La protéine Spoll déficiente pour l’activité nucléase peut être un variant d’une protéine Spoll sauvage présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Spoll et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine. En particulier, la protéine Spoll déficiente pour l’activité nucléase peut être un variant d’une protéine Spoll d’une des séquences SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42, comprenant une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine. Alternativement, la protéine de fusion peut comprendre un partenaire de Spoll, de préférence choisi dans le groupe constitué par Recl02, MTOPVIB/TOPOVIBL, Recl03/Ski8, Recl04, Red 14, Merl, Mer2/Recl07, Mei4, Mre2/Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2/Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl et Sppl, et les orthologues de ceux-ci.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un acide nucléique codant pour la protéine de fusion définie ci-dessus.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne également une cassette d’expression ou un vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne également une cellule hôte, de préférence non humaine, comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette ou un vecteur tel que défini ci-dessus.
De préférence, la cellule hôte est une cellule eucaryote, de manière encore préférée une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale, et de manière tout particulièrement préférée, la cellule hôte est une cellule de plante ou une cellule de levure. En particulier, la cellule hôte est une cellule de plante, la plante étant de préférence d’intérêt agronomique, horticole, pharmaceutique ou cosmétique, notamment les légumes, les fruits, les herbes, les fleurs, arbres et arbustes. De préférence, la cellule de plante est sélectionnée parmi les plantes monocotylédones et plantes dicotylédones, de manière plus particulièrement préférée sélectionnée dans le groupe constitué par du riz, du blé, du soja, du maïs, de la tomate, de l’oignon, du concombre, de la laitue, de l’asperge, de la carotte, du navet, ά' Arabidop sis thaliana, de l’orge, du colza, du coton, de la vigne, de la canne à sucre, de la betterave, du coton, du tournesol, du palmier à huile, du café, du thé, du cacao, de la chicorée, du poivron, du piment, du citron, de l’orange, de la nectarine, de la mangue, de la pomme, de la banane, de la pêche, de l’abricot, de la patate douce, des yams, de l’amande, de la noisette, de la fraise, du melon, de la pastèque, de l’olivier, de la pomme de terre, de courgette, de l’aubergine, de l’avocat, du chou, de la prune, de la cerise, de l’ananas, de l’épinard, de la pomme, de la mandarine, du pamplemousse, de la poire, du raisin, du clou de girofle, de la noix de cajou, de la noix de coco, du sésame, du seigle, du chanvre, du tabac, des baies telles que la framboise ou le cassis, de la cacahuète, du ricin, de la vanille, du peuplier, de l’eucalyptus, la sétaire verte, le manioc et des plantes horticoles comme par exemple les rosiers, les tulipes, les orchidées et les géraniums. En particulier, la cellule de plante peut être sélectionnée dans le groupe constitué par du riz, du blé, du soja, du maïs, de la tomate, de l’oignon, du concombre, de la laitue, de l’asperge, de la carotte, du navet, d ' Arabidopsis thaliana , de l’orge, du colza, du coton, de la vigne, de la canne à sucre, de la betterave, du coton, du tournesol, de l’olivier à palmes, du café, du thé, du cacao, de la chicorée, du poivron, du piment, du citron, de l’orange, de la nectarine, de la mangue, de la pomme, de la banane, de la pêche, de l’abricot, de la patate douce, des yams, de l’amande, de la noisette, de la fraise, du melon, de la pastèque, de l’olivier, et des plantes horticoles comme par exemple les rosiers, les tulipes, les orchidées et les géraniums. De préférence, la cellule de plante est sélectionnée dans le groupe constitué par le riz, le blé, le soja, le maïs et la tomate. Selon un cinquième aspect, l’invention concerne un procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, de préférence non humaine, comprenant
- l’introduction dans ladite cellule : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRIS PR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule.
La présente invention concerne encore, dans un sixième aspect, un procédé pour générer des variants d’un organisme eucaryote, de préférence non humain, comprenant :
- l’introduction dans une cellule dudit organisme : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRIS PR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et
- la genèse d’un variant de l’organisme à partir de ladite cellule recombinée. Dans un septième aspect, la présente invention concerne également un procédé pour identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote, de préférence non humaine, comprenant :
- l’introduction dans la cellule eucaryote : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRIS PR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et - l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et
- l’analyse des génotypes et phénotypes des cellules recombinées afin d’identifier ou de localiser l’information génétique codant pour la caractéristique d’intérêt. De préférence, la caractéristique d’intérêt est un caractère quantitatif d’intérêt (QTL).
Dans un huitième aspect, la présente invention concerne enfin l’utilisation d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, de préférence non humaine, (ii) générer des variants d’un organisme eucaryote, de préférence non humain, et/ou (iii) identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote, de préférence non humaine.
De manière préférée, dans les procédés ou utilisations selon l’invention, la cellule eucaryote est une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale, de préférence une cellule de levure, de plante ou de champignon.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
[Figure 1] illustre la formation des cassures double-brin (CDB) méiotiques induite par la protéine de fusion Cpf 1 -Spo 1 1 Y135F et leur réparation par recombinaison homologue dans la région du promoteur du gène GAL2. [Figure 2] illustre la capacité de la protéine fusion Cpfl -Spo 11 Y135F à stimuler la recombinaison méiotique dans la région cible du promoteur du gène GAL2.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Le système CRISPR ("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats") est un système de défense mis en évidence chez les bactéries et les archées contre les ADN étrangers. Ces courts fragments correspondant à l’agent infectieux sont insérés dans une série de répétitions CRISPR et sont utilisés sous forme de guide ARN CRISPR (crARN) pour cibler l’agent infectieux lors d’infections ultérieures. Ce système repose essentiellement sur l’association d’une protéine endonucléase Cas ( CRISPR-associated ) et d’un ARN « guide » (ARNg ou sgARN) responsable de la spécificité du site de clivage. Il permet la réalisation de cassures d’ADN double-brin (CDB) aux sites ciblés par le système CRISPR.
Il existe cinq types principaux de systèmes CRISPR qui se différencient par les répertoires des gènes associés aux CRISPR, l’organisation des opérons Cas et la structure des répétitions au sein des matrices CRISPR. Ces cinq types de systèmes ont été répartis en deux classes : la classe I regroupant les types I, III et IV qui utilisent un module effecteur crRNA multimérique et la classe II regroupant les types II, V et VI qui utilisent un module effecteur crRNA monomérique.
Les systèmes CRISPR de classe II et de type II, majoritairement représentés par les nucléases Cas9 et Csn2, comprennent un petit ARN agissant en trans appelé tracrARN ("trans- acting crARN") qui s'apparie avec chaque répétition du pré-crARN (« CRISPR ARN ») pour former un ARN double brin [tracrARN:crARN] clivé par la RNase III en présence de l'endonucléase.
Les systèmes CRISPR de classe II et de type VI sont représentés par les protéines Cl 3a (connue précédemment sous le nom C2c2), Cl 3b et Cl 3c. Le système CRISPR-C13 a été découvert chez la bactérie Leptotrichia shahii (Abudayyeh et al., Science 2016 ; 353(6299) : aaf5573) et est analogue au système CRISPR-Cas9. Cependant, contrairement à Cas9 qui cible l'ADN, les protéines 03 ciblent et clivent l'ARN simple brin.
Les systèmes CRISPR-Cas de classe II et de type V, sont entre autres représentés par la nucléase Cpfl (également appelée Cas 12a) récemment découverte chez la bactérie Francisella novicida (Zetsche B, Cell, 2015 ; 163 : 759-771), et les nucléases C2cl (également appelée Cas 12b) et C2c3 identifiées chez Alicyclobacillus acidoterrestris (Shmakov et al., Molecular Cell, 2015 Volume 60, Issue 3, P385-397). Cpfl contient un domaine mixte alpha/bêta, un domaine RuvC-I suivi d'une région hélicoïdale, un domaine RuvC-II et un domaine en doigt de zinc. Un système CRISPR-Cpfl fonctionnel ne nécessite pas de tracrARN mais seulement un crARN. En particulier, un crRNA de 42-44 nucléotides avec une séquence répétée directe d'environ 19 nucléotides suivie d'une séquence proto-espaceur de 23-25 nucléotides est suffisant pour guider l'endonucléase Cpfl vers l’acide nucléique cible. Le complexe Cpfl-crARN clive l'ADN ou l'ARN cible en identifiant un motif PAM 5'- YTN-3’ ou 5'-TTTN-3' adjacent au proto-espaceur (où "Y" est une pyrimidine et "N" est une nucléobase quelconque), par opposition au motif PAM riche en guanine (5'-NGG-3’) ciblé par Cas9. La reconnaissance d’un PAM riche en thymidine permet d’étendre le nombre de sites ciblés par la technique CRISPR aux régions riches en A-T dépourvues des motifs PAM et permet son utilisation dans des cellules présentant un génome riche en G, limitant ainsi la survenue de ciblage aspécifique ou « off-targets ».
Après l'identification du motif PAM, Cpfl introduit une cassure double brin libérant des extrémités collantes, généralement générant 4 ou 5 nucléotides en surplomb. Ce type de coupure se différencie des cassures générées par les nucléases de classe II et de type II telles que Cas9, qui génèrent des extrémités franches après clivage, et permet, à la manière d'un velcro, de réaliser des insertions directionnelles des gènes, analogues à celles réalisées par les enzymes de restrictions traditionnelles. Cpfl clive l'ADN 18-23 pb en aval du site PAM, ce qui n'entraîne aucune perturbation de la séquence de reconnaissance après réparation des cassures double-brin (CDB). En conséquence, Cpfl permet plusieurs cycles de clivage de l'ADN et offre une possibilité accrue d’obtenir la modification génomique souhaitée.
Les inventeurs ont démontré qu’il était possible de modifier le système CRISPR-Cpfl afin d’induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, et en particulier dans une levure ou une cellule de plante. Ils ont en effet montré que l’expression combinée d’une protéine de fusion comprenant un domaine Cpfl et un domaine Spol 1 et d’un ARN guide permettait de manière surprenante d’induire des recombinaisons méiotiques ciblées par le biais de cassures double-brin durant la prophase I de méiose et la réparation de ces cassures.
Ce système n’a jamais été utilisé pour cibler des sites de recombinaison méiotique dans quelque organisme que ce soit.
Ainsi, selon un premier aspect la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant (i) un premier domaine (domaine CRISPR) qui est une nucléase associée à un système CRISPR, de préférence un système CRISPR de classe II, et (ii) un second domaine (domaine Spoll) qui est une protéine Spoll ou l’un des partenaires de Spoll impliqués dans la formation et la réparation des cassures double brin lors de la méiose.
Tel qu’utilisé ici, le terme « protéine de fusion » se réfère à une protéine chimérique comprenant au moins deux domaines issus de la combinaison de différentes protéines ou fragments de protéines. L’acide nucléique codant cette protéine est obtenu par juxtaposition des régions codant les protéines ou fragments de protéine de façon à ce que ceux-ci soient en phase et transcrits sur le même ARNm. Les différents domaines de la protéine de fusion peuvent être directement adjacents ou être séparés par des séquences de liaison (ou linker) qui introduisent une certaine flexibilité structurale dans la construction.
La protéine de fusion selon la présente invention comprend un premier domaine (domaine CRISPR) qui est une nucléase associée à un système CRISPR et un second domaine (domaine Spol 1) qui est une protéine Spol 1 ou l’un des partenaires de Spol 1 impliqués dans la formation et la réparation des cassures double brin lors de la méiose. Spoll est une protéine apparentée à la sous-unité catalytique A d’une topo-isomérase de type II présente chez les archaebactéries (Bergerat et al, Nature, vol. 386, pp 414-7). Elle catalyse les cassures double-brin de l’ADN initiant les recombinaisons méiotiques. C’est une protéine très conservée au niveau évolutif pour laquelle il existe des homologues chez tous les eucaryotes. Spoll est active sous forme d’un dimère formé de deux sous-unités, dont chacune clive un brin d’ADN. Bien qu’essentielle, Spoll n’agit pas seule pour générer des cassures double-brin au cours de la méiose. Chez la levure S. cerevisiae, par exemple, elle coopère avec les protéines, Recl02, MTOPVIB, Recl03/Skl8, Recl04, Réel 14, Merl, Mer2/Recl07, Mei4, Mre2/Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2/Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl et Sppl comme décrits dans les articles de Keeney et al. (2001 Curr. Top. Dev. Biol, 52, pp. 1-53), Smith et al. (Curr. Opin. Genet. Dev, 1998, 8, pp. 200-211) et Acquaviva et al. (2013 Science, 339, pp. 215-218). Il a été démontré que le ciblage de Spoll à un site donné est suffisant pour déclencher le processus de recombinaison méiotique (Pecina et al, 2002 Cell, 111, pp 173-184; Acquaviva et al. 2013 Science, 339, pp. 215-218)). Il est à noter que plusieurs homologues de la protéine Spoll peuvent co-exister dans une même cellule, notamment chez les plantes. La protéine Spoll, le fragment ou domaine de celle-ci tel qu’utilisé dans la présente invention, peut être obtenu à partir de toute protéine Spoll connue telle que la protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae (Gene ID: 856364, Numéro d’entrée NCBI : NP_011841 (SEQ ID NO : 1), Esposito and Esposito, Genetics, 1969, 61, pp. 79-89), la protéine AtSpoll-1 et AtSpoll-2 d 'Arabidopsis thaliana (Grêlon M. et al, 2001, Embo J., 20, pp. 589-600), la protéine murine mSpoll (Baudat F et al, Molecular Cell, 2000, 6, pp. 989-998), la protéine Spoll de C. elegans ou encore la protéine Spoll de drosophile meiW68 (McKim et al, 1998, Genes Dev, 12(18), pp. 2932-2942). Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs et toute protéine Spoll connue peut être utilisée dans la protéine de fusion selon l’invention. De préférence, la protéine Spoll est obtenue à partir d’une des protéines Spoll de la cellule eucaryote d’intérêt.
Selon un mode de réalisation préféré, le domaine Spoll comprend, ou consiste en, une protéine Spoll, de préférence une protéine Spoll sauvage, en particulier une protéine Spoll de la cellule eucaryote d’intérêt, ou une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Spoll et présentant une activité Spoll.
Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Spoll comprend, ou consiste en, une protéine Spoll, de préférence une protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae, telle que par exemple la protéine de séquence NP_011841 (SEQ ID NO :1) ou une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec une protéine Spoll, de préférence avec une protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae ou encore une protéine apparentée portant des motifs conservés avec la protéine Spoll, en particulier la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 Selon un mode de réalisation particulier, plusieurs protéines de fusion selon l’invention comprenant différents domaines Spoll peuvent être introduites dans la même cellule. En particulier, lorsque plusieurs homologues de Spoll existent dans la cellule eucaryote d’intérêt, les différentes protéines de fusion peuvent comprendre des homologues différents de Spol 1. A titre d’exemple, deux protéines de fusion selon l’invention comprenant respectivement des domaines Spol 1-1 et Spol 1-2 d ' Arabidopsis thaliana peuvent être introduites dans la même cellule, de préférence dans la même cellule d ' Arabidopsis thaliana. Toujours à titre d’exemple, une ou plusieurs protéines de fusion selon l’invention comprenant des domaines Spol 1-1, Spol 1-2, Spol 1-3 et/ou Spol 1-4 de riz peuvent être introduits dans la même cellule, de préférence dans la même cellule de riz. De nombreux homologues de Spoll ont été identifiés dans différentes espèces, en particulier dans les espèces végétales (Sprink T et Hartung F, Frontiers in Plant Science, 2014, Vol. 5, article 214, doi: 10.3389/fpls.2014.00214 ; Shingu Y et al, BMC Mol Biol, 2012, doi: 10.1186/1471-2199-13-1). L’homme du métier peut aisément identifier les homologues de Spoll dans une espèce donnée, notamment au moyen de techniques bien connues de bio-informatique. Selon un mode de réalisation préféré, le domaine Spoll comprend, ou consiste en, une protéine Spoll de plante, notamment choisie parmi : les protéines Spoll d ' Arabidopsis thaliana , par exemple telles que décrites sous la référence Uniprot Q9M4A2-1 (SEQ ID NO : 10), les protéines Spoll d ’Oryza sativa (riz), par exemple telles que décrite par Fayos I. et al., 2019 Plant Biotechnol J. Nov;17(l l):2062-2077 et sous les références UniProt Q2QM00 (SEQ ID NO : 11), Q7Y021 (SEQ ID NO : 12), Q5ZPV8 (SEQ ID NO : 13), A2XFC1 (SEQ ID NO : 14) et Uniprot, Q6ZD95(SEQ ID NO : 40), les protéines Spoll de Brassica campestris (moutarde), par exemple telles que décrites sous les références UniProt A0A024AGF2 (SEQ ID NO : 15) et A0A024AHI2 (SEQ ID NO : 16), les protéines Spoll de Zea mays (maïs), par exemple telles que décrites sous les références Uniprot B6UAQ8 (SEQ ID NO : 17) et B6TWI5 (SEQ ID NO : 18), A0A1P8W169-1 (SEQ ID NO : 41) et A0A1P8W163 (SEQ ID NO : 42), les protéines Spoll de Capsicum baccatum (poivrier), par exemple telles que décrites sous les références A0A2G2WFG5 (SEQ ID NO : 19) et A0A2G2WFH4 (SEQ ID NO : 20), la protéine Spoll de Carica papaya (papaye) par exemple telle que décrite sous la référence Uniprot A0A024AG98 (SEQ ID NO : 21).
En particulier, le domaine Spoll peut comprendre, ou consister en, une protéine Spoll choisie parmi l’une des protéines Spoll mentionnées ci-dessus, de préférence les séquences des SEQ ID NO : I, 2 et l0 à21 et 40-42, et les variants de celles-ci comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Spoll. De manière plus particulière, le domaine Spoll peut comprendre, ou consister en, une protéine Spoll choisie parmi les séquences des SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42, et les variants de celles-ci comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Spoll. De préférence, le domaine Spoll peut comprendre, ou consister en, une protéine Spoll choisie parmi les séquences des SEQ ID NO : 10 à 21 et 40-42, et les variants de celles-ci comprenant une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Spoll.
Tel qu’utilisé ici, le terme « activité Spoll » se réfère à la capacité d’une protéine à induire des cassures double-brin durant la prophase I de méiose et/ou la capacité d’une protéine à recruter un ou plusieurs partenaires de Spoll tels que définis ci-dessous. De préférence, ce terme se réfère à la capacité d’une protéine à recruter un ou plusieurs partenaires de Spoll et, optionnellement à la capacité d’une protéine à induire des cassures double-brin durant la prophase I de méiose. La capacité d’une protéine à induire des cassures double-brin durant la prophase I de méiose et à recruter un ou plusieurs partenaires de Spo 11 peut être aisément testée par l’homme du métier, par exemple par un test de complémentation dans une levure ou dans une plante dans laquelle la protéine Spoll endogène a été inactivée. Si la protéine possède cette capacité, cet organisme produira des spores viables. La capacité d’une protéine à en recruter une autre, par exemple d’une protéine à recruter un partenaire de Spol 1 ou d’un partenaire de Spoll à recruter une protéine Spoll, peut être aisément testée par l’homme du métier par le biais de techniques classiques, telles que la technique du double hydride ou la technique de ChIP (chromatine immunoprécipitation). La capacité d’une protéine à induire des cassures double-brin durant la prophase I de méiose peut être aisément testée par l’homme du métier par le biais de techniques classiques par exemple par Southern blot ou par séquençage des oligonucléotide associés à une protéine, en particulier Spoll. Pour une protéine Spoll sauvage ou un variant doué d’activité nucléase, le terme « activité Spoll » se réfère de préférence à la capacité d’une protéine à induire des cassures double-brin durant la prophase I de méiose et la capacité d’une protéine à recruter, de manière directe ou indirecte, un ou plusieurs partenaires de Spoll tels que définis ci-dessous. Pour un variant de Spoll qui présente une activité nucléase déficiente, le terme « activité Spoll » se réfère de préférence à la capacité d’une protéine à recruter un ou plusieurs partenaires de Spoll tels que définis ci-dessous. Selon un aspect particulier, le domaine Spoll de la protéine de fusion comprend un variant d’une protéine Spoll, de préférence un variant dont l’activité nucléase a été abolie, réduite ou améliorée par rapport à la protéine Spoll sauvage.
Dans un mode de réalisation, le domaine Spoll de la protéine de fusion selon l’invention est doué d’une activité nucléase et responsable des cassures double-brin. Ce domaine peut être constitué d’une protéine Spoll ou d’un fragment de celle-ci capable d’induire des cassures double brin de l’ADN.
De manière alternative, le domaine Spoll peut comprendre un variant d’une protéine Spoll qui présente une activité nucléase déficiente encore appelé « dead Spoll » ou « dSpol 1 ». Ainsi, la protéine de fusion utilisée dans la présente invention peut comprendre un domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR et un domaine Spoll qui est un variant de Spoll présentant une activité nucléase déficiente. Dans ce mode de réalisation, lorsque plusieurs protéines de fusion selon l’invention sont introduites dans la cellule eucaryote, de préférence les différents domaines Spoll sont tous déficients pour l’activité nucléase.
Tel qu’utilisé ici, le terme « activité nucléase » se réfère à l’activité enzymatique d’une endonucléase qui possède un site actif permettant de créer des coupures à l'intérieur des chaînes d'ADN ou d'ARN, de préférence des cassures double brin d’ADN. Par « activité nucléase déficiente », on entend particulièrement une activité nucléase réduite, diminuée ou inexistante notamment par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage dont est issu le variant.
Selon un mode particulier, la capacité de clivage de l’ADN ou de l’ARN et/ou l’activité hydrolase de la nucléase est réduite ou diminuée, notamment par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage. De préférence, l’activité nucléase d’un domaine Spoll présentant une activité nucléase déficiente est réduite d’au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou de 100%, par rapport à l’activité nucléase du domaine Spoll sauvage. De manière particulièrement préférée, un domaine Spoll présentant une activité nucléase déficiente est un domaine Spoll incapable de générer des cassures double brin. En particulier, le domaine Spoll présentant une activité nucléase déficiente peut comprendre un site catalytique muté qui induit une activité nucléase déficiente, la mutation impactant négativement la capacité nucléasique ou hydrolytique du domaine Spoll. De préférence, le domaine Spoll peut comprendre, ou consister en, une protéine Spoll mutante dans laquelle le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine. Une protéine Spoll présentant une telle substitution est incapable d’induire des cassures double-brin de l’ADN (Bergerat et al, Nature, vol. 386, pp 414-417) et peut notamment présenter une séquence telle que décrite dans la SEQ ID NO :2. Le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 dans la séquence d’une protéine Spoll peut être aisément identifié par des techniques classiques d’alignement de séquences.
Ainsi, le domaine Spoll peut être un variant d’une protéine Spoll, de préférence d’une protéine Spoll sauvage, en particulier de la cellule eucaryote d’intérêt, présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Spoll et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine. En particulier, le domaine Spoll peut être un variant des séquences SEQ ID NO : 1, 2 et 10 à 21 et 40-42, présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’un de ces séquences et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine, comme présenté dans la SEQ ID NO :2. En particulier, le domaine Spoll peut être un variant d’une protéine Spoll, ledit variant comprenant une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec l’une des séquences des SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42 et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine. Selon un mode préféré, le domaine Spoll peut être un variant d’une protéine Spol 1, ledit variant comprenant une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec l’une des séquences des SEQ ID NO : 10 à 21 et 40-42 et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine.
De préférence, le domaine Spoll présentant une activité nucléase déficiente est toujours capable de recruter un ou plusieurs des partenaires de Spoll, notamment un ou plusieurs des partenaires décrits ci-dessous. Ainsi, bien que l’activité nucléase du domaine Spoll puisse être altérée, sa capacité à interagir avec les partenaires de Spoll est de préférence conservée. De manière alternative, le domaine Spoll de la protéine de fusion peut être remplacé par l’un des partenaires de Spoll impliqués dans la formation et la réparation des cassures double brin lors de la méiose. En particulier, le partenaire de Spoll tel qu’utilisé dans la protéine de fusion est capable de recruter Spo 11 , de préférence est une protéine qui forme un complexe avec Spo 11 et induit ainsi la formation des cassures double -brin ou leur réparation. Ce partenaire peut être choisi parmi les protéines citées dans les articles de Keeney et al. (2001 Curr. Top. Dev. Biol, 52, pp. 1-53), Smith et al. (Curr. Opin. Genet. Dev, 1998, 8, pp. 200-211), Acquaviva et al. (2013 Science, 339, pp. 215-8), Vrielynck et al., (2016 Science, 351, pp 939-943), Roberts et al. (Science 2016: Vol. 351, Issue 6276, pp. 943-949) et Frank R. Blattner (Plant Systematics and Evolution volume 302, pages 239-244(2016). De préférence, la protéine de fusion selon l’invention comprend un partenaire de Spoll choisi parmi Recl02, Recl03/Skl8, Recl04, Réel 14, MTOPOVIB, Merl, Mer2/Recl07, Mei4, Mre2/Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2/Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl, Ski8, et Sppl, et les variants et orthologues de ceux-ci. De manière préférée, le partenaire remplaçant le domaine Spoll comprend une protéine choisie parmi Mei4, Mer2, Recl02, Recl04, Réel 14, Setl, Sppl et MTOPVIB, et les variants et orthologues de celles-ci. Tels qu’envisagés ici, les variants de ces protéines présentent au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité de séquence avec l’une de ces protéines et sont capables de recruter Spoll. De manière toute préférée, le partenaire de Spoll est une topoisomérase, de préférence choisie parmi la famille des TOPOVIB et l’un de ces variants et orthologues, de manière préférée une MTOPOVIB ou MTOPOVIBL active en méiose (Vrielynck, et al., (2016 Science 351 pp 939-943). Tous les modes de réalisation décrits pour la protéine de fusion avec un domaine Spol 1 qui est une protéine Spol 1 ou un variant de celle-ci, s’appliquent également aux protéines de fusion dans lesquelles le domaine Spol 1 est un des partenaires de Spol 1.
La protéine de fusion selon la présente invention comprend également un domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR (domaine CRISPR). Le domaine CRISPR est le domaine de la protéine de fusion qui est capable d’interagir avec le ou les ARN guides et de cibler l’activité de la protéine de fusion vers une région chromosomique donnée.
Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion selon l’invention comprend une nucléase associée à un système CRISPR de classe II, de préférence de type II, V ou VI, de manière préférée de type V ou de type VI, préférentiellement de type V.
Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion selon l’invention comprend une nucléase associée à un système CRISPR de classe II et de type II, en particulier à l’exclusion d’une nucléase de type Cas9, par exemple Cns2, notamment la nucléase Cns2 de Streptococcus thermophilus, par exemple telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank: AEM62890.1, de Streptococcus pyogenes, par exemple telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank: ANC25453.1, ou de Streptococcus canis par exemple telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank: VTR80107.1 De préférence, la nucléase associée à un système CRISPR n’est pas une nucléase Cas9. Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion selon l’invention comprend une nucléase associée à un système CRISPR de classe II et de type VI, de préférence Casl3a (C2c2), Casl3b ou Casl3c, par exemple la nucléase Casl3a de Herbinix hemicellulosilytica, en particulier telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank: WP_103203632.1, la nucléase Casl3a de Lachnospiraceae bacterium, en particulier telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank : WP_022785443.1, ou la nucléase Cas 13a de Leptotrichia wadei, en particulier telle que décrite sous le numéro d’accession GenBank : WP_021746003.1.
Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion selon l’invention comprend une nucléase associée à un système CRISPR de classe II et de type V, de préférence Cpf 1 (également appelé Cas 12a), C2cl (également appelé Cas 12b) ou C2c3.
Dans un mode de réalisation préférée, la protéine de fusion comprend un domaine CRISPR de classe II, de préférence de type V et préférentiellement un domaine Cpfl.
Les nucléases associées à un système CRISPR telles qu’envisagé, peuvent comprendre, ou consister en, une nucléase choisie parmi l’une des nucléases mentionnées ci-dessus, et les variants de celles-ci comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’un de ces séquences, et une activité de nucléase associée à un système CRISPR. Tel qu’utilisé ici, le terme « activité de nucléase associée à un système CRISPR » se réfère à une activité nucléase et/ou la capacité d’interagir avec l' ADN guide et de reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique.
Selon un mode de réalisation particulier, la nucléase associée à un système CRISPR est une nucléase Cpfl, un variant ou un fragment de celle-ci capable d’interagir avec les ARN guides. Selon un mode de réalisation préféré, la nucléase associée à un système CRISPR est une nucléase Cpfl ou un variant de celle-ci. La nucléase Cpfl peut être choisie parmi les protéines Cpfl issues des bactéries du genre Prevotella, Moraxella, Leptospira, Lachnospiraceae, Francissela, Candidatus, Eubacterium, Parcubacteria, Peregrinibacteria, Acidmicococcus et Prophyromonas. En particulier, le domaine Cpfl peut être sélectionné parmi les protéines Cpfl des bactéries Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank KKT48220.1, SEQ ID NO : 22), Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 (PeCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank KKP36646.1, SEQ ID NO : 23), Acidaminococcus sp. BVBLG (AsCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_021736722.1, SEQ ID NO : 24), Prophyromonas macacae (PmCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_018359861.1, SEQ ID NO : 25), Prophyromonas crevioricanis (PeCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_036890108.1, SEQ ID NO : 26), Francisella tularensis (UniProtKB : A0Q7Q2, SEQ ID NO : 27) Acidaminococcus sp. (UniProtKB : U2UMQ6, SEQ ID NO : 28), Prevotella disiens (PdCpFl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_004356401.1, SEQ ID NO : 29), Moraxella bovoculi 237 (MbCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank KDN25524.1, SEQ ID NO : 30), Leptospira inadai (LiCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_020988726.1, SEQ ID NO : 31), Lachnospiraceae bacterium MA2020 (LbCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_044919442.1, SEQ ID NO : 32), Francisella novicida U112 (FnCpfl, par exemple telle que décrit sous le numéro d’accession Genbank WP_003040289.1, SEQ ID NO : 33). Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs et toute protéine Cpfl connue peut être utilisée dans la protéine de fusion ou le procédé selon l’invention. Selon un mode de réalisation, le domaine Cpfl comprend, ou consiste en, une protéine Cpfl choisie parmi les protéines Cpfl sauvages, les variants et fragments de celles-ci présentant une activité Cpfl. De préférence, lesdits variants présentent au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces protéines Cpfl. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cpfl comprend, ou consiste en, une protéine comprenant une séquence choisie parmi les séquences décrites ci-dessus, en particulier choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 22 à 33 et les variants de celles-ci présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Cpfl. Tel qu’utilisé ici, le terme « activité Cpfl » se réfère à une activité nucléase et/ou la capacité d’interagir avec l’ARN guide et de reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique, de préférence la capacité d’interagir avec l’ARN guide et de reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique et optionnellement une activité nucléase, notamment une activité ADN endonucléase. La capacité d’une protéine à interagir avec l' ADN guide et à reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique peut être aisément testée par l’homme du métier, notamment par les techniques classiques telles que l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) avec un anticorps reconnaissant la protéine et sa localisation sur l’ADN par PCR ou séquençage. L’activité nucléase, et en particulier l’activité ADN endonucléase, peut être aisément testée par l’homme du métier, notamment par les techniques classiques telles que l’hybridation de l' ADN par Southern blot ou en utilisant la technique décrite dans l’article de Zetsche, et al. (2015) Cell, 163, 759-771.
Pour une protéine Cpfl sauvage ou un variant doué d’activité nucléase, le terme « activité Cpfl » se réfère de préférence à une activité nucléase, en particulier ADN endonucléase et à la capacité d’interagir avec l’ARN guide et de reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique. Pour un variant de Cpfl qui présente une activité nucléase déficiente, le terme « activité Cpfl » se réfère de préférence à la capacité d’interagir avec l’ARN guide et de reconnaître la région ciblée de l’acide nucléique.
Selon un aspect particulier, la protéine de fusion comprend un variant ou un mutant de Cpfl. Par exemple, la protéine de fusion selon l’invention peut comprendre un domaine Cpfl dont l’activité nucléase a été abolie, réduite ou améliorée. Ce type de mutant comprend notamment des mutations dans le domaine nucléase RuvC de Cpfl. Afin de faciliter le ciblage de différentes régions du génome, le domaine Cpfl peut également comprendre des mutations altérant la reconnaissance des PAM telles que décrites dans Gao et al., Nat Biotechnol. 2017 Aug; 35(8): 789-792. La protéine Cpfl peut également être tronquée afin de supprimer les domaines de la protéine non-essentiels aux fonctions de la protéine de fusion, en particulier les domaines de la protéine Cpfl qui ne sont pas nécessaires à l’interaction avec l’ARN guide.
Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cpfl comprend, ou consiste en, la séquence de imCpfl (SEQ ID NO : 3), ou Lb Cpf 1 (SEQ ID NO : 4) ou encore une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cpfl comprend, ou consiste en, une protéine comprenant une séquence choisie parmi les séquences décrites ci-dessus, en particulier choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33, et les variants et fragments desdites séquences présentant une activité Cpfl. De préférence, lesdits variants présentent au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces protéines Cpfl.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le domaine Cpfl comprend, ou consiste en, une protéine comprenant une séquence choisie parmi les séquences décrites ci-dessus, en particulier choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33 et les variants desdites séquences comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Cpfl.
De manière alternative, le domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR peut présenter une activité nucléase déficiente. Par « activité nucléase déficiente » on entend particulièrement une activité nucléase réduite, diminuée ou inexistante notamment par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage. De préférence, la nucléase associée à un système CRISPR présente une activité ADN endonucléase réduite ou supprimée par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage. La nucléase associée à un système CRISPR qui présente une activité nucléase déficiente conserve sa capacité d’interaction avec un ARN guide et permet donc toujours le ciblage de la protéine de fusion vers une région chromosomique donnée.
Selon un mode particulier, la capacité de clivage de l’ADN ou de l’ARN et/ou l’activité hydrolase de la nucléase est réduite ou diminuée, notamment par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage. De préférence, l’activité nucléase de la protéine associée à un système CRISPR présentant une activité nucléase déficiente est réduite d’au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou de 100%, par rapport à l’activité nucléase de la protéine sauvage.
En particulier, la nucléase associée à un système CRISPR, de préférence de classe II et de type V, présentant une activité nucléase déficiente peut comprendre un site catalytique muté, la mutation impactant négativement la capacité nucléasique ou hydrolytique de la protéine. De préférence, la nucléase associée à un système CRISPR déficiente pour l’activité nucléase peut comprendre, ou consister en, une protéine Cpfl mutante par exemple telle que décrite dans Zhang et al., Cell Discov. 2018; 4: 36, comportant la mutation D832A. Une protéine Cpfl présentant une telle substitution est incapable d’induire des cassures double-brin de l’ ADN, et peut notamment prendre le nom de « dead Cpfl » ou « dCpfl ». En particulier, le domaine Cpfl peut être un variant d’une protéine Cpfl, de préférence d’une Cpfl sauvage, présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Cpfl et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine. De manière plus particulière, le domaine Cpfl peut être un variant des séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33 présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine. De préférence, le domaine dCpf 1 peut comprendre ou consister en la séquence SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. Le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 dans la séquence d’une protéine Cpfl peut être aisément identifié par des techniques classiques d’alignement de séquences.
La protéine de fusion comprend, de préférence, au moins un domaine, CRISPR ou Spol 1, présentant une activité nucléase. Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion comprend un domaine Spol 1 présentant une activité nucléase et un domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR, de préférence une nucléase Cpfl, déficient pour l’activité nucléase. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine de fusion comprend un domaine Spoll déficient pour l’activité nucléase et un domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR, de préférence une nucléase Cpfl, présentant une activité nucléase.
De manière alternative, la protéine de fusion comprend (i) un domaine Spoll présentant une activité nucléase déficiente et (ii) un domaine CRISPR présentant une activité nucléase déficiente. Ainsi, la protéine de fusion de la présente invention peut comprendre un domaine qui est une nucléase associée à un système CRISPR et un domaine Spoll, les deux domaines présentant une activité nucléase déficiente.
Selon un mode de réalisation, le domaine Spoll est du côté N-terminal et le domaine CRISPR, de préférence le domaine Cpfl, du côté C-terminal de la protéine de fusion. Selon un autre mode de réalisation, le domaine Spoll est du côté C-terminal et le domaine CRISPR, de préférence le domaine Cpfl, du côté N-terminal de la protéine de fusion. La protéine de fusion peut également comprendre une séquence signal de localisation nucléaire (SLN). Les séquences SLN sont bien connues de l’homme du métier et comprennent en général une courte séquence d’acides aminés basiques. A titre d’exemple, la séquence SLN peut comprendre la séquence PKKKRKV (SEQ ID NO : 7). La séquence SLN peut être présente à l’extrémité N-terminale, C-terminale ou dans une région interne de la protéine de fusion.
La protéine de fusion peut également comprendre un domaine supplémentaire de pénétration dans la cellule, c’est-à-dire un domaine facilitant l’entrée de la protéine de fusion dans la cellule. Ce type de domaine est bien connu de l’homme du métier et peut comprendre par exemple une séquence peptidique de pénétration dérivée de la protéine TAT du VIH-1 telle que GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO : 8), dérivée de la séquence TLM du virus de l’hépatite B humaine telle que PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (SEQ ID NO : 9), ou une séquence peptidique polyarginine. Ce domaine de pénétration dans la cellule peut être présent à l’extrémité N-terminale, C-terminale ou être à l’intérieur de la protéine de fusion. La protéine de fusion peut comprendre en outre une ou des séquences de liaison (linkers) entre le domaine CRIS PR, en particulier de classe II, de préférence de type V et préférentiellement Cpfl, et le domaine Spoll, et optionnellement entre ces domaines et les autres domaines de la protéine tels que la séquence signal de localisation nucléaire ou le domaine de pénétration dans la cellule. La longueur de ces séquences de liaison est aisément ajustable par l’homme du métier. En général, ces séquences comprennent entre 10 et 20 acides aminés, de préférence environ 15 acides aminés et de manière encore préférée 12 acides aminés. Les séquences de liaison entre les différents domaines peuvent être de longueurs identiques ou différentes.
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend, ou consiste en, successivement, depuis l’extrémité N-terminale jusqu’à l’extrémité C-terminale : un signal de localisation nucléaire, une première séquence de liaison (linkerl), un domaine CRISPR, de préférence un domaine Cpfl, une seconde séquence de liaison (linker2) et un domaine Spoll.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend, ou consiste en, successivement, depuis l’extrémité N-terminale jusqu’à l’extrémité C-terminale : un signal de localisation nucléaire, une première séquence de liaison (linkerl), un domaine Spoll, une seconde séquence de liaison (linker2) et un domaine CRISPR, de préférence un domaine Cpfl. La protéine de fusion peut en outre comprendre une étiquette (ou tag) qui est une séquence définie d’acides aminés. Cette étiquette peut notamment être utilisée afin de détecter l’expression de la protéine de fusion, d’identifier les protéines interagissant avec la protéine de fusion ou de caractériser les sites de fixation de la protéine de fusion dans le génome. La détection de l’étiquette attachée à la protéine de fusion peut être réalisée avec un anticorps spécifique de ladite étiquette ou toute autre technique bien connue de l’homme du métier. L’identification des protéines interagissant avec la protéine de fusion peut être réalisée, par exemple, par des techniques de co-immunoprécipitation. La caractérisation des sites de fixation de la protéine de fusion dans le génome peut être réalisée, par exemple, par des techniques d’immunoprécipitation, d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à une PCR quantitative en temps réel (ChIP-qPCR), d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à des techniques de séquençage (ChIP-Seq), de cartographie à l’aide d’oligonucléotides (oligo mapping) ou toute autre technique bien connue de l’homme du métier.
Cette étiquette peut être présente à l’extrémité N-terminale de la protéine de fusion, à l’extrémité C-terminale de la protéine de fusion ou en position non-terminale dans la protéine de fusion. De préférence, l’étiquette est présente à l’extrémité C-terminale de la protéine de fusion. La protéine de fusion peut comprendre une ou plusieurs étiquettes, identiques ou différentes et dans toutes les combinaisons de localisation, en particulier au niveau de l’extrémité N-terminale, C-terminale, N- et C-terminales ou en positions internes à la protéine de fusion.
Les étiquettes, telles qu’utilisées dans la présente invention, peuvent être choisies parmi les nombreuses étiquettes bien connues de l’homme du métier. En particulier, les étiquettes utilisées dans la présente invention peuvent être des étiquettes peptidiques et/ou des étiquettes protéiques. De préférence, les étiquettes utilisées dans la présente invention sont des étiquettes peptidiques. Des exemples d’étiquettes peptidiques utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les étiquettes formées de répétitions d’au moins six Histidines (His), en particulier les étiquettes formées de six ou huit histidines, ainsi que les étiquettes Flag, polyglutamates, hémagglutinine (HA), calmoduline, Strep, E-tag, myc, V5, Xpress, VSV, S- tag, Avi, SBP, Softag 1, Softag 2, Softag 3, isopetag, SpyTag, tétracystéines et des combinaisons de celles-ci. Des exemples d’étiquettes protéiques utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les étiquettes Glutathion-S-Transférase (GST), protéine A de Staphlococcus aureus, Nus A, protéine de liaison à la chitine (CBP), thiorédoxine, protéine de liaison au maltose (MBP), protéines transporteuses de biotine carboxylées (BCCP), fragment constant des immunoglobulines (Fc), les étiquettes comprenant une protéine fluorescente telles que les protéines GFP (Green Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein), et des combinaisons de celles-ci.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine de fusion comprend une étiquette formée de six histidines et/ou d’un ou plusieurs motifs Flag, de préférence trois motifs Flag. Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion comprend une étiquette formée de trois motifs Flag suivi de ôhistine en C-terminal de la protéine de fusion. Additionnellement ou alternativement, la protéine de fusion comprend un motif V5, de préférence du coté N-terminal de la protéine de fusion. Le tag V5 est dérivé d'un petit épitope (Pk) trouvé sur les protéines P et V du paramyxovirus de la famille des virus simiens 5 (SV5). Le tag V5 est généralement utilisé avec 14 acides aminés (GKPIPNPLLGLDST, SEQ ID NO 38) ou 9 acides aminés plus court (IPNPLLGLD, SEQ ID NO : 39). Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend une étiquette formée de six histidines et trois motifs Flag, de préférence en C- terminal, et un motif V5 en N-terminal. La protéine de fusion telle que décrite ci-dessus peut être introduite dans la cellule sous une forme protéique, notamment sous sa forme mature ou sous la forme d’un précurseur, de préférence sous sa forme mature, ou sous la forme d’un acide nucléique codant ladite protéine.
Lorsque la protéine de fusion est introduite dans la cellule sous une forme protéique, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N-terminales afin d’améliorer la résistance de la protéine de fusion aux peptidases. Par exemple, le groupement protecteur à l’extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l’extrémité C-terminale peut être une amidation ou une estérification. L’action des protéases peut également être contrecarrée par l’utilisation d’acides aminés de configuration D, la cyclisation de la protéine par formation de ponts disulfures, d’anneaux lactames ou de liaisons entre les extrémités N- et C-terminales. La protéine de fusion de l’invention peut également comprendre des liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH et conférant une résistance accrue aux peptidases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2-0, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. La protéine de fusion peut également comprendre un ou plusieurs acides aminés qui sont des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthy lysine, la N- éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N- méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique ; ou des acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine. La protéine de fusion selon l’invention peut être obtenue par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide) ou par synthèse enzymatique (Kullmann W, Enzymatic peptide synthesis, 1987, CRC Press, Florida). Elle peut également être obtenue par une méthode consistant à cultiver une cellule hôte exprimant un acide nucléique codant la protéine de fusion et récupérer ladite protéine à partir de ces cellules ou du milieu de culture.
La présente invention concerne également un acide nucléique codant la protéine de fusion selon l’invention, en particulier une protéine de fusion comprenant une nucléase de classe II du système CRISPR, de préférence de type V et préférentiellement Cpfl, et une protéine Spoll ou partenaire de Spoll tels que décrits ci-dessus. Au sens de l'invention, on entend par « acide nucléique » toute molécule à base d'ADN ou d'ARN. Il peut s'agir de molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. De préférence, l’utilisation des codons est optimisée selon la nature de la cellule eucaryote d’intérêt.
L’acide nucléique selon l’invention peut être sous la forme d’ADN et/ou d'ARN, simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation préférée, l’acide nucléique est une molécule d’ADN isolée, synthétisée par des techniques recombinantes bien connues de l'homme du métier. L’acide nucléique selon l’invention peut être déduit de la séquence de la protéine de fusion selon l’invention et l’usage des codons peut être adapté selon la cellule hôte dans laquelle l’acide nucléique doit être transcrit.
La présente invention concerne en outre une cassette d’expression comprenant un acide nucléique selon l’invention lié de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à son expression. Notamment, l’acide nucléique peut être sous le contrôle d’un promoteur permettant son expression dans une cellule hôte eucaryote. De manière générale, une cassette d’expression comprend, ou consiste en, un promoteur permettant d’initier la transcription, un acide nucléique selon l’invention, et un terminateur de transcription.
Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle du promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de son expression. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression. La cassette d’expression peut également comprendre au moins une séquence activatrice « enhancer » liée de manière opérationnelle au promoteur. Une large variété de promoteurs utilisables pour l’expression de gènes d’intérêt dans des cellules ou des organismes hôtes sont à la disposition de l’homme du métier. Ils incluent des promoteurs constitutifs ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes.
De préférence, l’acide nucléique selon l’invention est placé sous le contrôle d’un promoteur constitutif ou d’un promoteur spécifique de la méiose.
Des exemples de promoteurs spécifiques de la méiose utilisables dans le cadre de la présente invention comprennent, sans y être limités, les promoteurs endogènes de Spoll, les promoteurs des partenaires de Spoll pour la formation des cassures double-brin, le promoteur Rec8 (Murakami & Nicolas, 2009, Mol. Cell. Biol, 29, 3500-16,), ou le promoteur Spol3 (Malkova et al, 1996, Genetics, 143, 741-754,), des promoteurs méiotiques d’Arabidopsis thaliana par exemple tels que décrits dans Li et al., BMC Plant Biol. 2012; 12: 104, Eid et al., Plant Cell Rep. 2016 Jul;35(7): 1555-8, Xu et al., Front. Plant Sci., 13 July 2018e, Da Inès et al., PLoS Genet, 2013, 9, el003787.).
D’autres promoteurs inductibles peuvent également être utilisés tels que le promoteur estradiol (Carlie & Amon, 2008 Cell, 133, 280-91,), le promoteur méthionine (Care et al, 1999, Molecular Microb 34, 792-798,), le système TetO/TetR inductible par la doxycline, les promoteurs induits par les chocs thermiques, les métaux, les stéroïdes, les antibiotiques et l’alcool.
Des promoteurs constitutifs utilisables dans le cadre de la présente invention sont, à titre d’exemples non limitatifs : le promoteur des gènes immédiats précoces du cytomégalovirus (CMV), le promoteur du virus simien (SV40), le promoteur tardif majeur des adénovirus, le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur du virus de la tumeur mammaire de souris (MMTV), le promoteur de la phosphoglycerate kinase (PGK), le promoteur du facteur d’élongation EDl-alpha, les promoteurs de l’ubiquitine, les promoteurs de l’actine, les promoteurs de la tubuline, les promoteurs des immunoglobulines, le promoteur de l’alcool déshydrogénase 1 (ADH1), les promoteurs dépendants de l’ARN polymérase III tels que les promoteurs U6, U3, Hl, 7SL, pRPRl (« Ribonucléase P RNA 1 »), SNR52 (« small nuclear RNA 52 »), ou le promoteur pZmUbi.
De préférence, la cassette d’expression et/ou l’acide nucléique selon l’invention est lié de manière opérationnelle à un promoteur transcriptionnel permettant une expression de cassette d’expression et/ou l’acide nucléique durant la méiose. Par exemple, un tel promoteur peut être pREC8.
Le terminateur de transcription peut être aisément choisi par l’homme du métier. De préférence, ce terminateur est RPRlt, la séquence flanquante du 3’ du gène SUP4 de Saccharomyces cerevisiae ou le terminateur de la nopaline synthase tNOS. La présente invention concerne en outre un vecteur d’expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d’expression selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l’expression de l’acide nucléique selon l’invention dans ladite cellule. Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier. Avantageusement, le vecteur d’expression comprend des éléments régulateurs permettant l’expression de l’acide nucléique selon l’invention. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d’initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l’expression est souhaitée, sont bien connues de l’homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur d’expression comprend un acide nucléique codant la protéine de fusion selon l’invention, placé sous le contrôle d’un promoteur constitutif, de préférence le promoteur ADH1 (pADHl). Il peut également comprendre une séquence terminatrice telle que le terminateur ADH1 (tADHl). Le vecteur d’expression peut comprendre une ou plusieurs origines de réplication, bactérienne ou eucaryote. Le vecteur d’expression peut notamment comprendre une origine de réplication bactérienne fonctionnelle chez E.coli telle que l’origine de réplication ColEl. Alternativement, le vecteur peut comprendre une origine de réplication eucaryote, de préférence fonctionnelle chez les plantes et chez les levures, notamment chez S. cerevisiae. Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans une cellule hôte bactérienne ou eucaryote comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif inactivé dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur d’expression comprend un ou plusieurs gènes de résistance à des antibiotiques, de préférence un gène de résistance à l’ampicilline, à la kanamycine, à l’hygromycine, à la généticine et/ou la nourséothricine.
Le vecteur d’expression peut également comprendre une ou plusieurs séquences permettant l’insertion ciblée du vecteur, de la cassette d’expression ou de l’acide nucléique dans le génome d’une cellule hôte. De préférence, l’insertion est réalisée au niveau d’un gène dont l’inactivation permet la sélection des cellules hôtes ayant intégré le vecteur, la cassette ou l’acide nucléique, tel que le locus TRP1.
Le vecteur peut être circulaire ou linéaire, simple- ou double-brin. Il est avantageusement choisi parmi les plasmides, phages, phagemides, virus, cosmides et chromosomes artificiels. De manière préférée, le vecteur est un plasmide.
La présente invention concerne en particulier un vecteur, de préférence un plasmide, comprenant une origine de réplication bactérienne, de préférence l’origine ColEl, un acide nucléique tel que défini ci-dessus sous le contrôle d’un promoteur, de préférence un promoteur constitutif tel que le promoteur ADH1, un terminateur, de préférence le terminateur ADH1, un ou plusieurs marqueurs de sélection, de préférence des marqueurs de résistance tels que le gène de résistance à la kanamycine ou à l’ampicilline, et une ou plusieurs séquences permettant l’insertion ciblée du vecteur, de la cassette d’expression ou de l’acide nucléique dans le génome de la cellule hôte, de préférence au niveau du locus TRP1 du génome d’une levure.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne en particulier un vecteur, de préférence un plasmide, compatible pour de l’agrotransfection, notamment en utilisant Agrobacterium tumefaciens (Fraley et al. Crit. Rev. Plant. Sci. 4 ppl-46; Fromm et al., (1990) Biotechnology 8, pp 833-844) ou Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Planta 210 pp 195-204) et visant à la transformation de plantes. Un exemple de plasmide compatible est le plasmide de type Ti, notamment le pBIN19 (Fee and Gelvin,(2008) Plant Physiology 146(2) pp 325-332). En particulier, lorsque destiné à une utilisation in planta , le vecteur selon l’invention comprend un marqueur sélectionnable. Fes marqueurs sélectionnables les plus couramment utilisés pour la transformation des plantes incluent le gène conférant une résistance à la kanamycine néomycine phosphotransférase II (NPTII), servant à la sélection dans une culture contenant de la kanamycine, le gène du phosphinothricine acetyltransférase (HPH), servant à la sélection dans une culture contenant de l'hygromycine B.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention porté par le vecteur code pour une protéine de fusion comprenant une ou plusieurs étiquettes, de préférence comprenant une étiquette constituée de six histidines et/ou un ou plusieurs motifs Flag, de préférence trois motifs Flag. De préférence la ou les étiquettes sont en C-terminal.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l’acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d’épisome ou intégré dans le génome de la cellule hôte.
La présente invention concerne ainsi une cellule hôte comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d’expression selon l’invention.
De préférence, la cellule est une cellule eucaryote. Tel qu’utilisé ici, le terme « cellule eucaryote », se réfère à une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale, en particulier une cellule de mammifère telle qu’une cellule de souris ou de rat, ou une cellule d’insecte. La cellule eucaryote est de préférence non- humaine et/ou non-embryonnaire. De préférence la cellule eucaryote n’est pas une cellule souche embryonnaire d’origine humaine et/ou animale. Selon des modes de réalisation préférés, la cellule eucaryote exprime une protéine Spoll douée d’une activité nucléase, c’est-à-dire une protéine Spoll capable d’induire des cassures double-brin lors de la prophase I de méiose. Cette protéine peut être une protéine Spoll endogène de la cellule ou une protéine Spoll hétérologue. De préférence, cette protéine est une protéine Spoll endogène de la cellule. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de levure, en particulier une levure d’intérêt industriel. Des exemples de levures d’intérêt comprennent, sans y être limités, les levures du genre Saccharomyces sensu stricto, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia ou Candida, ainsi que les hybrides obtenus à partir d’une souche appartenant à l’un de ces genres. De préférence, la levure d’intérêt appartient au genre Saccharomyces. de préférence une levure sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces castelli, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus (aussi nommée Saccharomyces carlsbergensis), et des hybrides obtenus à partir d’au moins une souche appartenant à l’une de ces espèces tel que par exemple un hybride S. cerevisiae / S. paradoxus ou un hybride S. cerevisiae / S. uvarum ., de manière encore préférée ladite cellule hôte eucaryote est Saccharomyces cerevisiae.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de champignon, en particulier une cellule de champignon d’intérêt industriel. Des exemples de champignons comprennent, sans y être limités, les cellules de champignons filamenteux. Les champignons filamenteux incluent les champignons appartenant aux subdivisions Eumycota et Oomycota. Les cellules de champignons filamenteux peuvent être choisies dans le groupe constitué des cellules de Trichoderma, Acremonium, Aspergillus , Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus , Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Flumicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Pénicillium , Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ou Trametes.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de plante, en particulier une cellule de plante d’intérêt agronomique, horticole, pharmaceutique ou cosmétique, notamment les légumes, les fruits, les herbes, les fleurs, arbres et arbustes.
De préférence la cellule de plante est sélectionnée parmi les plantes monocotylédones et plantes dicotylédones, de manière plus particulièrement préférée sélectionnée dans le groupe constitué par du riz, du blé, du soja, du maïs, de la tomate, de l’oignon, du concombre, de la laitue, de l’asperge, de la carotte, du navet, d’ Arabidopsis thaliana, de l’orge, du colza, du coton, de la vigne, de la canne à sucre, de la betterave, du coton, du tournesol, du palmier à huile, du café, du thé, du cacao, de la chicorée, du poivron, du piment, du citron, de l’orange, de la nectarine, de la mangue, de la pomme, de la banane, de la pêche, de l’abricot, de la patate douce, des yams, de l’amande, de la noisette, de la fraise, du melon, de la pastèque, de l’olivier, de la pomme de terre, de courgette, de l’aubergine, de l’avocat, du chou, de la prune, de la cerise, de l’ananas, de l’épinard, de la pomme, de la mandarine, du pamplemousse, de la poire, du raisin, du clou de girofle, de la noix de cajou, de la noix de coco, du sésame, du seigle, du chanvre, du tabac, des baies telles que la framboise ou le cassis, de la cacahuète, du ricin, de la vanille, du peuplier, de l’eucalyptus, la sétaire verte, le manioc et des plantes horticoles comme par exemple les rosiers, les tulipes, les orchidées et les géraniums. En particulier, la cellule de plante peut être sélectionnée dans le groupe constitué par du riz, du blé, du soja, du maïs, de la tomate, de l’oignon, du concombre, de la laitue, de l’asperge, de la carotte, du navet, d’Arabidopsis thaliana, de l’orge, du colza, du coton, de la vigne, de la canne à sucre, de la betterave, du coton, du tournesol, de l’olivier à palmes, du café, du thé, du cacao, de la chicorée, du poivron, du piment, du citron, de l’orange, de la nectarine, de la mangue, de la pomme, de la banane, de la pêche, de l’abricot, de la patate douce, des yams, de l’amande, de la noisette, de la fraise, du melon, de la pastèque, de l’olivier, et des plantes horticoles comme par exemple les rosiers, les tulipes, les orchidées et les géraniums. Chacune des différentes cellules décrites ci-dessus peuvent notamment être utilisées dans les procédés selon l’invention décrits ci-après.
Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation de la protéine de fusion, de l’acide nucléique, de la cassette d’expression ou du vecteur d’expression selon l’invention pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, (ii) générer des variants d’un organisme eucaryote, et/ou (iii) identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote.
L’invention concerne également des procédés pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, (ii) générer des variants d’un organisme eucaryote, et/ou (iii) identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote tels que décrits ci-après.
Les procédés selon l’invention peuvent être des procédés in vitro, in vivo ou ex vivo, de préférence in vitro.
L’invention concerne notamment un procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, de préférence non humaine, comprenant - l’introduction dans ladite cellule : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRISPR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et - l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule.
En particulier, la cellule eucaryote est telle que décrite ci-dessus.
Tel qu’utilisé dans la présente demande, le terme « ARN guide » ou « ARNg » désigne une molécule d’ ARN capable d’interagir avec le domaine CRISPR, de préférence avec une protéine Cpfl, de la protéine de fusion afin de la guider vers une région chromosomique cible.
Chaque ARNg comprend une région (communément appelée région « SDS »), à l’extrémité 3’ de l’ARNg, qui est complémentaire de la région chromosomique cible et qui imite l’ARNcr du système CRISPR endogène. Contrairement à d’autre système tel que CRISPR-Cas9, l’ARNg de Cpfl ne nécessite pas une seconde région (communément appelé région « handle »), à l’extrémité 3’ de l’ARNg, qui mime les interactions d’appariement de bases entre l’ARNtracr et l’ARNcr du système CRISPR endogène.
La séquence de l’ARNg varie selon la séquence chromosomique ciblée. En particulier, la région « SDS » de l’ARNg qui est complémentaire de la région chromosomique cible, comprend en général entre 10 et 25 nucléotides. De préférence, cette région a une longueur de 19, 20 ou 21 nucléotides, et de manière particulièrement préférée de 25 nucléotides.
La longueur totale d’un ARNg est en général de 30 à 140 nucléotides, de préférence de 30 à 125 nucléotides, et de manière plus particulièrement préférée de 40 à 100 nucléotides. Selon un mode de réalisation particulier, un ARNg tel qu’utilisé dans la présente invention a une longueur de 30 à 75 nucléotides, de préférence de 35 à 65 nucléotides, de manière préférée de 44 à 63 nucléotides.
L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique à cibler en utilisant des techniques bien connues.
Dans le procédé selon l’invention, un ou plusieurs ARNg peuvent être utilisés simultanément. Ces ARNg peuvent être différents ou identiques. Ces ARNg peuvent cibler des régions chromosomiques identiques ou différentes, de préférence différentes.
Les ARNg peuvent être introduits dans la cellule eucaryote sous la forme de molécules d’ARNg matures, sous la forme de précurseurs ou sous la forme d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARNg.
Lorsque le ou les ARNg sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), ces ARNg peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et ainsi d’augmenter leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Les ARNg utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison intemucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2'-0-alkyl ribose ou les PNA (Peptid Nucleic Acid) (Egholm et al, 1992 J. Am. Chem. Soc., 114, pp 1895- 1897). Les ARNg peuvent être des ARN naturels, synthétiques ou produits par des techniques de recombinaison. Ces ARNg peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’amplification.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend l’introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d’un ou plusieurs ARNg capables de cibler l’action de la protéine de fusion vers une région chromosomique donnée. La protéine et les ARNg peuvent être introduits dans le cytoplasme ou le noyau de la cellule eucaryote par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple par microinjection. La protéine de fusion peut notamment être introduite dans la cellule en tant qu’ élément d’un complexe protéine- ARN comprenant au moins un ARNg.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé comprend l’introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d’un ou plusieurs acides nucléiques codant un ou plusieurs ARNg.
Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé comprend l’introduction dans la cellule eucaryote d’un acide nucléique codant la protéine de fusion et d’un ou plusieurs ARNg.
Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé comprend l’introduction dans la cellule eucaryote d’un acide nucléique codant la protéine de fusion et d’un ou plusieurs acides nucléiques codant un ou plusieurs ARNg.
Selon un mode de réalisation, la cellule eucaryote est hétérozygote pour le ou les gène(s) ciblé(s) par le ou les ARN guide(s).
Selon un autre mode de réalisation, la cellule eucaryote est homozygote pour le ou les gène(s) ciblé(s) par le ou les ARN guide(s). La protéine de fusion, ou l’acide nucléique codant celle-ci, et le ou les ARNg, ou le ou les acides nucléiques codant ceux-ci, peuvent être introduits simultanément ou séquentiellement dans la cellule.
Les techniques de transformation d'une plante sont bien connues et décrites dans la littérature technique et scientifique. Ces techniques visent la transformation de cellules de végétales de plantes entières, de cals ou de protoplastes. Ces techniques incluent l'injection ou la micro-injection (Griesbach (1987) Plant Sci. 50 69-77), l'électroporation de l'ADN (Fromm et autres (1985), Natl Acad Sci., USA 82 : 5824; Wan et Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48), la biolistique (Klein et al. (1987) Nature 327 : 773), la transfection de vecteur viral (Gelvin, Nature Biotechnology 23, 684-685 (2005)), le bombardement (Sood et al., 2011, Biologia Plantarum, 55, 1-15), la fusion de cellules ou de protoplastes (Willmitzer, L., 1993, Transgenic plants. Biotechnology, vol. 2, 627-659), l’agrotransfection par insertion d'ADN-T, notamment en utilisant Agrobacterium tumefaciens (Fraley et al. Crit. Rev. Plant. Sci. 4 1-46; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844) ou Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Planta 210: 195-204) ou d'autres hôtes bactériens (Brootghaerts et al. (2005) Nature 433: 629 -633) en utilisant par exemple la technique de trempage floral dite déflorai dip (Clough et Bent 1998; Zale et al. 2009).
Alternativement, et plus particulièrement concernant les cellules de plante, l’acide nucléique codant pour la protéine de fusion et le ou les acides nucléiques codant pour le ou les ARNg peuvent être introduits dans une cellule par croisement de deux cellules dans lesquelles ont respectivement été introduits l’acide nucléique codant pour la protéine de fusion et le ou les acides nucléiques codant pour le ou les ARNg.
Alternativement, et plus particulièrement concernant les cellules de plante, l’acide nucléique codant pour la protéine de fusion et le ou les acides nucléiques codant pour le ou les ARNg peuvent être introduits dans une cellule par mitose d’une cellule dans laquelle l’acide nucléique codant pour la protéine de fusion et le ou les acides nucléiques codant pour le ou les ARNg ont précédemment été introduits.
Dans les modes de réalisation où la protéine de fusion et/ou le ou les ARNg sont introduits dans la cellule eucaryote sous la forme d’un acide nucléique codant pour ladite protéine et/ou le/lesdits ARNg, l’expression dédits acides nucléiques permet de produire la protéine de fusion et/ou le ou les ARNg dans la cellule. Les acides nucléiques codant pour la protéine de fusion et ceux codant pour les ARNg peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs identiques ou différents, constitutifs ou inductibles, en particulier de promoteurs spécifiques de la méiose. Selon un mode de réalisation préféré, les acides nucléiques sont placés sous le contrôle de promoteurs constitutifs tels que le promoteur ADH1 ou les promoteurs pRPRl et SNR52 dépendant de l’ARN polymérase III, de manière encore préféré le promoteur pRPRl.
La nature du promoteur peut également dépendre de la nature de la cellule eucaryote. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de plante, de préférence une cellule de riz, et les acides nucléiques sont placés sous le contrôle d’un promoteur choisi parmi les promoteurs pZmUbi (promoteur de Pubiquitine de maïs) et les promoteurs de la polymérase III U3 et U6. Selon un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique codant pour la protéine de fusion est placé sous le contrôle du promoteur pZmUbi et les acides nucléiques codant pour les ARNg sont placés sous le contrôle du promoteur U3 ou U6, de préférence du promoteur U3. Selon un aspect particulier, l’expression de l’ARNg est placée sous le contrôle de l’opérateur tétracycline. Le système Tet comprend deux circuits complémentaires : le circuit dépendant du tTA (système Tet-Off) et le circuit dépendant du rtTA (système Tet-On). De préférence, l’expression de l’ARNg est contrôlée par un système Tet-On. L'expression de l’ARNg est ainsi régulée par la présence ou l'absence de tétracycline ou de l'un de ses dérivés tels que la doxycycline.
Les acides nucléiques codant la protéine de fusion et le ou les ARNg peuvent être disposés sur la même construction, en particulier sur le même vecteur d’expression, ou sur des constructions distinctes. De manière alternative, les acides nucléiques peuvent être insérés dans le génome de la cellule eucaryote en des régions identiques ou distinctes. Selon un mode de réalisation préféré, les acides nucléiques codant la protéine de fusion et le ou les ARNg sont disposés sur le même vecteur d’expression.
Les acides nucléiques tels que décrits ci-dessus peuvent être introduits dans la cellule eucaryote par toute méthode connue par l’homme du métier, en particulier par microinjection, transfection, agro-infection, électroporation ou biolistique. Optionnellement, l’expression ou l’activité de la protéine Spoll endogène de la cellule eucaryote peut être supprimée afin de mieux contrôler les phénomènes de recombinaison méiotiques. Cette inactivation peut être réalisée par des techniques bien connues de l’homme du métier, notamment en inactivant le gène codant la protéine Spoll endogène ou en inhibant son expression au moyen d’ARN interférents. De préférence, dans ce mode de réalisation, le domaine Spoll de la protéine de fusion est doué d’activité nucléase afin de complémenter l’absence de l’activité Spoll endogène. Après l’introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d’un ou de plusieurs ARNg, ou des acides nucléiques codant ceux-ci, le procédé selon l’invention comprend l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule.
Cette induction peut se faire selon différentes méthodes, bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple, lorsque la cellule eucaryote est une cellule de souris, l’entrée des cellules en prophase I de méiose peut être induite par l’ajout d’acide rétinoïque (Bowles J et al, 2006, Sciences, 312(5773), pp. 596-600).
Lorsque la cellule eucaryote est une cellule de plante, l’induction de la méiose se fait selon un processus naturel. Selon un mode de réalisation particulier, après transformation d’un cal comprenant une ou des cellules de plante, une plante est régénérée et placée en conditions favorisant l’induction d’une phase reproductive et ainsi du processus de méiose. Ces conditions sont bien connues de l’homme du métier.
Lorsque la cellule eucaryote est une levure, cette induction peut être réalisée par le transfert de la levure dans un milieu de sporulation, en particulier d’un milieu riche à un milieu de sporulation, ledit milieu de sporulation étant de préférence dépourvu de source de carbone fermentescible ou d’azote, et l’incubation des levures dans le milieu de sporulation durant un temps suffisant pour induire des cassures double-brin. L’initiation du cycle méiotique dépend de plusieurs signaux : la présence des deux allèles de type sexuel MATa et MATα, l’absence de source d’azote et de carbone fermentescible. Tel qu’utilisé dans ce document, le terme « milieu riche » se réfère à un milieu de culture comprenant une source de carbone fermentescible et une source d’azote ainsi que tous les éléments nutritifs nécessaires aux levures pour se multiplier par division mitotique. Ce milieu peut être aisément choisi par l’homme du métier et peut, par exemple, être sélectionné parmi le groupe constitué du milieu YPD (1% extrait de levures, 2% bactopeptone et 2% glucose), du milieu YPG (1% extrait de levures, 2% bactopeptone et 3% glycérol) et d’un milieu synthétique complet (ou milieu SC) (Treco and Lundblad, 2001, Curr. Protocol. Mol. Biol., Chapter 13, Unit 13.1). Tel qu’utilisé dans ce document, le terme « milieu de sporulation » se réfère à tout milieu induisant l’entrée en prophase de méiose des cellules de levure sans croissance végétative, en particulier à un milieu de culture ne comprenant pas de source de carbone fermentescible ni de source d’azote mais comprenant une source de carbone métabolisable par respiration telle que l’acétate. Ce milieu peut être aisément choisi par l’homme du métier et peut, par exemple, être sélectionné parmi le groupe constitué du milieu KAc 1% (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518), le milieu SPM (Kassir and Simchen, 1991, Meth. Enzymol., 194, pp. 94-110) et des milieux de sporulation décrits dans l’article de Sherman (Sherman, Meth. Enzymol., 1991, 194, pp. 3-21). Selon un mode de réalisation préféré, avant d’être incubées dans le milieu de sporulation, les cellules sont cultivées durant quelques cycles de division dans un milieu de pré- sporulation de façon à obtenir une sporulation efficace et synchrone. Le milieu de pré-sporulation peut être aisément choisi par l’homme du métier. Ce milieu peut être, par exemple, le milieu SPS (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518). Le choix des milieux (milieu riche, milieu de pré- sporulation, milieu de sporulation) dépend des caractéristiques physiologiques et génétiques de la souche de levure, notamment si cette souche est auxotrophe pour un ou plusieurs composés.
Une fois la cellule engagée en prophase I de méiose, le processus méiotique peut se poursuivre jusqu’à produire quatre cellules filles portant les recombinaisons recherchées. De manière alternative, lorsque la cellule eucaryote est une levure, et en particulier une levure du genre Saccharomyces, les cellules peuvent être replacées en conditions de croissance afin de reprendre un processus mitotique. Ce phénomène appelé « retum-to-growth » ou « RTG » a été décrit précédemment dans la demande de brevet WO 2014/083142 et se produit lorsque les cellules entrées en méiose en réponse à une carence nutritionnelle sont remises en présence d’une source de carbone et d’azote après la formation des cassures double-brin Spol 1 dépendantes mais avant la première division de méiose (Honigberg and Esposito, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1994, 91, pp. 6559-6563). Dans ces conditions, elles interrompent leur progression dans les stades de différenciation méiotique pour reprendre un mode de croissance mitotique tout en induisant les recombinaisons recherchées lors de la réparation des cassures double-brin (Sherman et Roman, Genetics, 1963, 48, pp. 255-261 ; Esposito et Esposito, Proc. Nat. Acad. Sci, 1974, 71, pp. 3172-3176 ; Zenvirth et al, Genes to Cells, 1997, 2, pp. 487-498). Le procédé peut comprendre en outre l’obtention de la ou des cellules présentant la ou les recombinaisons recherchées. Lorsque la cellule est une levure, le procédé peut en outre comprendre une étape de culture et/ou de multiplication de la ou des cellules présentant la ou les recombinaisons recherchées. Lorsque la cellule est une cellule de plante, le procédé peut en outre comprendre une étape d’embryogénèse somatique, c’est-à-dire la régénération d’un embryon végétal à partir d’un cal comprenant les cellules présentant la ou les recombinaisons recherchées.
Le procédé selon l’invention peut être utilisé dans toutes les applications où il est souhaitable d’améliorer et de contrôler les phénomènes de recombinaison méiotique. En particulier, l’invention permet d’associer, de manière préférentielle, des traits génétiques d’intérêt. Cette association préférentielle permet, d’une part, de réduire le temps nécessaire à leur sélection, d’autre part, de générer des combinaisons naturelles possibles mais improbables. Enfin, selon le mode de réalisation choisi, les organismes obtenus par ce procédé peuvent être considérés comme des organismes non génétiquement modifiés (non-OGM). Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé pour générer des variants d’un organisme eucaryote, à l’exception de l’homme, de préférence une levure ou une plante, de manière encore préférée une levure, notamment une souche de levure d’intérêt industriel, comprenant
- l’introduction dans une cellule dudit organisme : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRIS PR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et
- la genèse d’un variant de l’organisme à partir de ladite cellule recombinée. Dans ce procédé, le terme de « variant » doit être compris de façon large, il désigne un organisme ayant au moins une différence génotypique ou phénotypique par rapport aux organismes parents.
Les cellules recombinées peuvent être obtenues en laissant la méiose se poursuivre jusqu’à l’obtention des spores, ou, dans le cas des levures, en replaçant les cellules en conditions de croissance après l’induction des cassures double-brin afin de reprendre un processus mitotique.
Lorsque la cellule eucaryote est une cellule de plante, un variant de la plante peut être généré par fusion des gamètes de plante, au moins l’une des gamètes étant une cellule recombinée par la méthode selon l’invention. La présente invention concerne également un procédé pour identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote, de préférence une levure ou une plante, comprenant :
- l’introduction dans la cellule eucaryote : a) d’une protéine de fusion, d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur tels que décrits ci-dessus ; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRIS PR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et - l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et
- l’analyse des génotypes et phénotypes des cellules recombinées afin d’identifier ou de localiser l’information génétique codant pour la caractéristique d’intérêt. De préférence, la caractéristique d’intérêt est un caractère quantitatif d’intérêt (QTL). Un locus de caractères quantitatifs (LCQ ou QTL pour quantitative trait loci) est une région plus ou moins grande d'ADN qui est étroitement associée à un caractère quantitatif, c'est-à-dire une région chromosomique où sont localisés un ou plusieurs gènes à l'origine du caractère en question. Ces caractères quantitatifs se rapporte généralement à une caractéristique phénotypique. L’analyse des QTL permet d’évaluer le lien entre une variation génétique et une variation phénotypique. La présente invention concerne finalement une trousse comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention, ou une cellule hôte transformée ou transfectée avec un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention. Elle concerne également l’utilisation de ladite trousse pour mettre en œuvre un procédé selon l’invention, en particulier pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, (ii) générer des variants d’un organisme eucaryote, et/ou (iii) identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote.
Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.
Dans certains modes de réalisation, tous les pourcentages d'identité mentionnés dans cette demande peuvent être fixés à au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, d'identité. En particulier, sont considérés comme décrits les modes de réalisations dans lesquels tous les pourcentages d'identité de séquence sont d’au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%, d'identité de séquence.
Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif et permettent d’illustrer l’invention.
EXEMPLES
Matériel et Méthode
Construction de la cassette PREc8-NLS-FnCPFl-SP011Y135F-6xHis-3xFlag-TAHD 1
La version humanisée du gène CPF1 issue de Francisella novicida portée par le plasmide pY004 (pcDNA3.1-hFnCpfl) a été obtenu de la plateforme Addgene (http://n2t.net/addgene:69976; RRID:Addgene_69976) Zetsche, B., et al., 2015, Cell, 163, 759- 771. Le plasmide pAS604 contenant le fragment PADHI-NLS-Fn CPFI-TADHI a été construit par clonage de la séquence de FnCPFl (amplifiée par PCR à partir de pY004) dans le plasmide pAS565 linéarisé avec les enzymes Apal-Ndel. Pour fusionner le fragment C-terminus de imCpfl avec l’extrémité N-terminale de la protéine Spo 1 1 Y135F ; le fragment Spel-Xmal du plasmide pAS532 a été remplacé par le fragment Spel-Xmal du plasmide pAS604 contenant la séquence NLS (Nuclear Localization Signal ; GGMAAPKKKRKVDGG SEQ ID NO : 34) et la partie codant de la protéine FnCPFl. Ainsi, le plasmide résultant, pAS608, contient la cassette PADHi-NLS-FnCPFl-SP011Y135F-6xFHis-3xFlag-TADm. Ensuite, le promoteur PADHI a été remplacé par le promoteur méiose spécifique PRECS cloné par réaction de Gibson dans le vecteur pAS604 digéré par Spel-Xhol. Ainsi le plasmide final, pAS628, contient la cassette PREC8-NLS-FnCPFl-SP011Y135F-6xFHis-3xFlag-TADHi dans laquelle le NLS et l’extrémité N- terminus de FnCpf1 sont séparés par un linker (GIHGVPAA, SEQ ID NO : 35). De plus, les domaines imCpfl (SEQ ID NO : 3) et SpollY135F (SEQ ID NO : 2) sont séparés par un autre linker (PEFMAMEAPGIR SEQ ID NO : 36). Enfin, l’étiquette 6xHis-3xFlag
(HHHHHHGDYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK* SEQ ID NO : 37) est placée à l’extrémité C-terminale de la partie codante SPOl 1Y135F.
Construction du plasmide d’expression des crARNs pour Cpfl
La cassette d’expression des crARNs de FnCpf1 a été conçue à partir du plasmide pUD628 ( Swiat, et al., 2017Nucleic acids research, 45, 12585-12598) ; l’expression des crARNs y est contrôlée par le promoteur SNR52 ( PSNR52 ) et par le terminateur S IJ P 4 ( TSUP4 ). Le fragment PSNR52-DR-DR-TSUP4 dans lequel les DRs sont les « Direct Repeats » de 19 nucléotides entourant la séquence guide, a été synthétisé par GenScript. Ensuite le fragment Sacl-Xhol du plasmide PRPRi-gARN_handle-TRPRi (Farzadfard, et al. (2013) ACS synthetic biology, 2, pp. 604-613) a été remplacé par la séquence PSNR52-DR-DR-TSUP4 pour créer le plasmide pAS603. Afin d’obtenir un système d’expression des crARNs inductible à la doxy cycline, la séquence tetO (assemblée avec un couple d’oligonucléotides) a été insérée dans le promoteur PSNR52 pour obtenir le plasmide pAS622. En se basant sur l’analyse de l’architecture de PSNR52 (Guffanti, et al (2006). J Biol Chem, 281, pp. 23945-23957) la séquence de 17 nucléotides située en position -160,-176 du site de démarrage de la transcription et l’élément A-Box du promoteur, a été remplacée par la séquence tetO de 19 nucléotides comme décrit précédemment pour le promoteur RPR1 (Bak, et al (2010) BMB Rep, 43, pp. 110-114). La construction d’un système d’expression des crARNs inductible à la doxycycline a été achevée par clonage « Gibson » du gène TetR amplifié par PCR à partir du plasmide pRS416gt (Smith et al. (2016) Genome Biol, 17, pp. 45) dans le vecteur pAS622 linéarisé par Xhol. Le plasmide final pAS631 contient donc le système d’expression des crARNs PsNR52-tetO-DR-DR-Tsup4-TetR inductible à la doxycycline. La séquence guide de 25 nucléotides (5’ GTCCGTGCGG AG AT ATCTGCGCCGT 3’ SEQ ID NO : 45) ciblant le site Gal4 UAS-B,C dans le promoteur du gène GAL2 a été insérée entre les séquences DR par réaction de Gibson dans le plasmide pAS631 linéarisé par BglII.
Construction des souches de levure Saccharomyces cerevisiae.
Génotype des souches de Saccharomyces cerevisiae utilisées : AND3482 : MATa/α trpl/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cD2E tGAL2::HphMX/- pEMP46: :NatMXJ- his4/" leu2/" ura3/"
AND3538 : MATa/α trpl::pAS628(CPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TRPl-KanMX)/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cD2E tGAL2::HphMX/-pEMP46 pEMP4:NatMXJ- his4/" leu2/" ura3/" ANT2951 : MATa/α trpl::pAS628(CPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TRPl-KanMX)/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cD2E tGAL2 r.HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" + plasmide pAS632-crARN c/i s- /;, C \ \LEU2.
AND3535 : MATa/α trpl::pAS628(CPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TRPl-KanMX)/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cd2e tGAL2 r.HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" ANT2945 : MATa/α trpl::pAS628(CPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TRPl-KanMX)/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cd2e tGAL2 ::HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" + plasmide pAS632-crARN UAS-B.C ::LEU2.
AND2549 : MATa/α trpl/trplrhisG tGAL2 r.HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" L’introduction des cassettes PREC8-FnCPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TADHi-TRPl-KanMX dans le génome de la levure S. cerevisiae a été effectué comme décrit par Sarno, R et al (2017) Nucleic acids research, 45, el64. Les plasmides pAS533 et pAS628 portant respectivement les cassettes PREC8-FnCPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TADHi-TRPl-KanMX ont été linéarisés par l’enzyme de restriction Xbal et intégrées au locus TRP1 par électroporation des cellules. Les plasmides d’expression des sgARN et crARN portant le marqueur de sélection LEU2 ont été introduits dans les cellules AND3535, AND3538, AND3596 de Saccharomyces. cerevisiae , auxotrophes pour la leucine (leu2 ) par électroporation et les transformants sélectionnés sur des boites contenant un milieu synthétique complet dépourvu de Leucine. Les jonctions d’intégration des cassettes d’expression de FnCPFl -SPOl 1Y135F au locus TRP1 ont été vérifiées par PCR. La fréquence de recombinaison autour du gène GAL2 (chromosome XII) est mesurée entre la cassette NatMX intégrée à la position 287 725 dans le promoteur du gène EMP46 (pEMP46 ) et la cassette HphMX intégrée à la position 292 068 dans le terminateur du gène GAL2 (tGALZ).
Induction de la méiose et de la sporulation
Dans un premier temps, les cellules diploïdes sont inoculées dans un milieu liquide riche (YPD) ou dans un milieu synthétique complet dépourvu de Leucine (SC-Leu) afin de maintenir les plasmides portant le marqueur de sélection LEU2. Les cellules se multiplient sous agitation à 30°C pendant 24 heures (point « Mitotique »). Ensuite les cultures liquides SC-Leu saturées sont diluées dans le milieu de pré- sporulation SPS (2-16 xlO5 cellules/ml) et mises en cultures sous agitation à 30°C pendant ~15 heures. Les cultures ayant atteint une OD600 entre 2 et 4 sont centrifugées, lavées deux fois avec de l’eau et transférées dans le milieu de sporulation (KAc 1%) avec une OD600 finale de 1. C’est le point To de la progression méiotique. Pour induire l’expression des crRNAs du doxycycline hyclate est ajouté à une concentration finale de 10 μg/ml dans le milieu de sporulation au temps To.
Milieux de croissance et de sporulation
Les milieux de croissance YPD, de pré-sporulation SPS et de sporulation KAc 1 % sont décrits dans la référence Murakami et al., (2009) Methods Mol Biol, 557, pp 117-142. Le milieu YPD est constitué d’extrait de levure 1%), de peptone (2%) et de glucose (2%). Le milieu synthétique complet dépourvu de Leucine est composé de Yeast Nitrogen Base (0,17 %), de Sulfate d’ Ammonium (0,5 %), de Drop-out Mix Synthetic sans Leucine (0,16 %) et de Glucose (2 %).
Southern blot et quantifications des CDBs et des molécules recombinantes
L’extraction de l’ADN génomique ainsi que la détection des CDBs et des molécules recombinantes par Southern Blot ont été effectués comme décrit dans les références Murakami, et al., (2009) Methods Mol Biol, 557, pp 117-142.. et Sarno, et al. (2017) Nucleic acids research, 45, el64.
Analyse génétique des tétrades.
Les tétrades à 4 spores ont été disséquées sur des boites YPD après 48 heures d’incubation dans le milieu de sporulation. La ségrégation des marqueurs NatMX et HygMX est visualisée par réplique des colonies sur boites YPD contenant respectivement de la nourseothricine (100 mg/1) ou de l’hygromycine (300 mg/i).
RESULTATS La fusion Cpfl-Spo11Y135F stimule la formation des CDBs méiotiques et leur réparation par recombinaison homologue dans la région du promoteur du gène GAL2
(figure 1). Analyse par Southern blot des cassures doubles brins (CDBs) et des molécules recombinantes dans les cellules exprimant la fusion Cpf 1 -Spo 1 1 Y135F. Les cellules sont récoltées durant la croissance mitotique et durant la progression méiotique (t=0, 2, 4, 6 et 8 heures). Le gène codant la protéine de fusion Cpfl -Spo 11 Y135F est induit dans des cellules diploïdes SPOll/SPOll qui contiennent la séquence cible sauvage pGAL2B,c (5’ ACGGCGCAGATATCTCCGCACGGAC 3’, SEQ ID NO :43) sur le chromosome parental PI et une séquence cible pGAL2b,c mutée résistante aux coupures de Cpfl sur le chromosome parental P2 (5’ AttcCGC AG AT ATCTCCGC Atat AC 3’, SEQ ID NO :44). Pour induire l’expression des crRNAs du doxycycline hyclate est ajoutée à la culture méiotique (1% KAc) au temps 0 pour une concentration finale de 10 pg/ml. L’ADN génomique est extrait des cellules de levure, digéré par l’enzyme de restriction Xbal, déposé sur un gel d’agarose (0.6%) et séparé par électrophorèse, puis transféré sur une membrane de nitrocellulose et hybridée avec une sonde radioactive située en dans la région codante du gène GAL2. La position des fragments d’ADN correspondant aux chromosomes parentaux (PI et P2) ainsi qu’aux molécules recombinantes (RI et R2) est indiquée sur la gauche du gel. La flèche noire épaisse indique les CDBs induites par Cpfl -Spo 11 Y135F dans le promoteur du gène cible GAL2 au niveau des sites Ga14uAs -B, C sur le chromosomes PI. La carte de la région GAL2 montre les phases ouvertes de lecture (les flèches indiquant le sens de la transcription), les marqueurs génétiques hétérozygotes NatMX et HphMX situés en trans du site cible GAL2B,C ainsi que la position de la sonde (rectangle hachuré). La fréquence de CDBs ainsi que la somme des fréquences des molécules recombinantes RI et R2 sont indiquées sous le gel. Le seuil minimal de détection des molécules d’ADN est de 0,3%. Génotype des souches :
AND3482 : MATa/α trpl/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cd2e tGAL2:: HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/"
ANT2951 : MATa/α trpl::pAS628(CPFl-SP011Y135F-6xHis-Flag-TRPl-
KanMX)/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cD2E tGAL2:: HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" + plasmide pAS632-crRNA UAS- :B:L,ECU2.
La fusion Cpfl-Spol lY135F stimule la recombinaison méiotique dans la région cible du promoteur du gène GAL2 (figure 2). Les cellules diploïdes SPOll possèdent les marqueurs hétérozygotes NatMX et HphMX de chaque côté des régions ciblées. Leur ségrégation a été suivie dans les produits de méiose par dissection des tétrades à 4 spores. Le gène NatMX confère la résistance à la nourseothricin (NatR) et le gène HphMX la résistance à l’hygromycine (HygR). En absence de recombinaison entre les marqueurs NatMX et HygMX, les quatre produits de méiose sont de type parental : 2 NatRHygs, 2 Nats HygR (ditypes parentaux PD). Par contre, un évènement de crossing-over entre les marqueurs va conduire à une tétrade de type tétratype (TT) (1 NatRHygs: 1 Nats Hygs , NatR HygR, 1 Nats HygR) tandis que deux évènements de crossing-over impliquant les 4 chromatides dans la même cellule méiotique vont conduire à une tétrade de type ditype non-parental (NPD) (2 Nats Hygs , 2 NatR HygR). D’autres types de ségrégation (appelées Autres) ont été observés. Ils correspondent à des évènements complexes où les marqueurs ségrégent de manière non-mendélienne avec des combinaisons de ségrégation de type 4:0 et/ou 0:4 révélant l’existence de recombinaisons ayant eu lieu avant la méiose et de ségrégations 3:1 et 1:3 révélant la conversions génique des cassettes NatMX et/ou HygMX. Respectivement, 235 et 295 tétrades à 4 spores ont été disséquées à partir des cellules WT et CPF1-SP011y135F. La fréquence de recombinaison entre les marqueurs correspond au ratio (TT+NPD)*100/(PD+TT+NPD).
Génotype de la souche AND3482 : MATa/α trpl/trpl::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cd2e tGAL2:: HphMX/- pEMP46::NatMX/- his4/" leu2/" ura3/"
Génotype de la souche ANT2945 : MATa/α trpl::pAS628( CPFESP011Y135F-6xHis-Flag- TRP1 -KanMX)/trpl ::hisG pGAL2_AB2CD2E/pGAL2_ab2cd2e tGAL2::HphMX/- pEMP 46:: NatMX/- his4/" leu2/" ura3/" et contient le plasmide pAS632-crRNA UAS-B,C..LEU2.
Les cassettes NatMX et HphMX ont été respectivement intégrées dans le terminateur de GAL2 ( tGAL2 ) entre les positions 292 068 et 292069, et dans le promoteur de EMP46 ( pEMP46 ) entre les positions 287725 et 287 726.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine de fusion comprenant (i) une nucléase associée à un système CRISPR, de préférence un système CRISPR de classe II, et (ii) une protéine Spoll ou l’un des partenaires de Spo 11 impliqués dans la formation et la réparation des cassures double brin lors de la méiose, dans laquelle la nucléase associée au système CRISPR n’est pas une nucléase Cas9.
2. Protéine de fusion selon la revendication 1, dans laquelle la nucléase est une nucléase associée à un système CRISPR de classe II et de type V.
3. Protéine de fusion selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la nucléase associée à un système CRISPR est une nucléase Cpfl.
4. Protéine de fusion selon la revendication 3, dans laquelle la nucléase Cpfl comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33, et les variants desdites séquences présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Cpfl.
5. Protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la nucléase associée à un système CRISPR est déficiente pour l’activité nucléase.
6. Protéine de fusion selon la revendication 5, dans laquelle la nucléase associée à un système CRISPR qui est déficiente pour l’activité nucléase est un variant d’une protéine Cpfl sauvage présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Cpfl et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine.
7. Protéine de fusion selon la revendication 5 ou 6, dans laquelle la nucléase associée à un système CRISPR qui est déficiente pour l’activité nucléase est un variant d’une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4 et 22 à 33, présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec ladite séquence et dans lequel le résidu correspondant à l’aspartate en position 832 de la SEQ ID NO : 4 est substitué, de préférence par une alanine.
8. Protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle dans laquelle la protéine de fusion comprend une protéine Spoll.
9. Protéine de fusion selon la revendication 8, dans laquelle dans laquelle la protéine Spoll est choisie parmi les séquences des SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42, et les variants de celles- ci comprenant une séquence présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et une activité Spoll.
10. Protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle la protéine de fusion comprend une protéine Spoll déficiente pour l’activité nucléase.
11. Protéine de fusion selon la revendication 10, dans laquelle la protéine Spol 1 déficiente pour l’activité nucléase est un variant d’une protéine Spol 1 sauvage présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec ladite protéine Spoll et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine.
12. Protéine de fusion selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle la protéine Spoll déficiente pour l’activité nucléase est un variant de l’une des séquences SEQ ID NO : 1, 10 à 21 et 40-42, comprenant une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec l’une de ces séquences et dans lequel le résidu correspondant à la tyrosine en position 135 de la SEQ ID NO : 1 est substitué, de préférence par une phénylalanine.
13. Protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la protéine de fusion comprend un partenaire de Spoll, de préférence choisi dans le groupe constitué des protéines Recl02, MTOPOVIB/TOPOVIBL, Recl03/Ski8, Recl04, Réel 14, Merl, Mer2/Recl07, Mei4, Mre2/Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2/Nbsl, Hopl, Redl, Mekl, Setl et Sppl, et des variants et orthologues de celles-ci, lesdits variants présentant au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou au moins 99% d’identité de séquence avec l’une de ces protéines et étant capables de recruter Spol 1.
14. Acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13.
15. Cassette d’expression ou vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 14 lié de manière opérationnelle à un promoteur transcriptionnel permettant une expression dudit acide nucléique durant la méiose.
16. Cellule hôte non humaine comprenant une protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, un acide nucléique selon la revendication 14, une cassette d’expression ou un vecteur selon la revendication 15, ladite cellule hôte étant de préférence une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale.
17. Cellule hôte selon la revendication 16, laquelle cellule hôte étant une cellule de plante, de préférence une cellule de plante sélectionnée parmi les plantes monocotylédones et plantes dicotylédones, de manière plus particulièrement préférée une cellule de plante sélectionnée dans le groupe constitué du riz, du blé, du soja, du maïs, de la tomate, de l’oignon, du concombre, de la laitue, de l’asperge, de la carotte, du navet, d ' Arabidopsis thaliana, de l’orge, du colza, du coton, de la vigne, de la canne à sucre, de la betterave, du coton, du tournesol, palmier à huile, du café, du thé, du cacao, de la chicorée, du poivron, du piment, du citron, de l’orange, de la nectarine, de la mangue, de la pomme, de la banane, de la pêche, de l’abricot, de la patate douce, des yams, de l’amande, de la noisette, de la fraise, du melon, de la pastèque, de l’olivier, de la pomme de terre, de courgette, de l’aubergine, de l’avocat, du chou, de la prune, de la cerise, de l’ananas, de l’épinard, de la pomme, de la mandarine, du pamplemousse, de la poire, du raisin, du clou de girofle, de la noix de cajou, de la noix de coco, du sésame, du seigle, du chanvre, du tabac, des baies telles que la framboise ou le cassis, de la cacahuète, du ricin, de la vanille, du peuplier, de l’eucalyptus, la sétaire verte, le manioc et des plantes horticoles comme par exemple les rosiers, les tulipes, les orchidées et les géraniums.
18. Procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote non humaine, comprenant
- l’introduction dans ladite cellule : a) d’une protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, d’un acide nucléique selon la revendication 14, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la revendication 15; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRISPR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule.
19. Procédé pour générer des variants d’un organisme eucaryote non humain comprenant :
- l’introduction dans une cellule dudit organisme : a) d’une protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, d’un acide nucléique selon la revendication 14, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la revendication 15; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRISPR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et - la genèse d’un variant de l’organisme à partir de ladite cellule recombinée.
20. Procédé pour identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote non humaine, comprenant :
- l’introduction dans la cellule eucaryote : a) d’une protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, d’un acide nucléique selon la revendication 14, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la revendication 15; et b) d’un ou plusieurs ARN guides ou d’un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation à la nucléase associée à un système CRISPR de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et
- l’induction de l’entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ;
- l’obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et
- l’analyse des génotypes et phénotypes des cellules recombinées afin d’identifier ou de localiser l’information génétique codant pour la caractéristique d’intérêt.
21. Procédé pour identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote non humaine selon la revendication 20, dans lequel la caractéristique d’intérêt est un caractère quantitatif d’intérêt (QTL).
22. Utilisation d’une protéine de fusion selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, d’un acide nucléique selon la revendication 14, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur selon la revendication 15 pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote non humaine, (ii) générer des variants d’un organisme eucaryote non -humain, et/ou (iii) identifier ou localiser l’information génétique codant pour une caractéristique d’intérêt dans un génome de cellule eucaryote non humaine.
23. Procédé selon l’une quelconque des revendications 18 à 21 et utilisation selon la revendication 22, dans lesquels la cellule eucaryote est une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale, de préférence une cellule de levure, de plante ou de champignon.
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