FR3032203A1 - Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo11, ainsi que l'utilisation de cette protéine pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote.

Description

La présente invention relève du domaine des eucaryotes, plus particulièrement du domaine de la microbiologie. Elle concerne notamment un procédé pour améliorer ou modifier une souche de levure en induisant des recombinaisons méiotiques ciblées. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Les levures trouvent leur application dans des domaines industriels extrêmement variés. Du fait de l'innocuité d'un grand nombre d'espèces, les levures sont notamment utilisées dans l'industrie alimentaire comme agent de fermentation en boulangerie, en brasserie, vinification ou distillerie, ou sous forme d'extraits comme éléments nutritionnels ou agents de sapidité. Elles peuvent également trouver leur usage dans la production industrielle de bioéthanol ou de molécules d'intérêt telles que des vitamines, des antibiotiques, des vaccins, des enzymes ou des hormones stéroïdiennes, ou encore dans les procédés de dégradation des matières cellulosiques. La diversité des applications industrielles des levures implique qu'il existe une demande constante pour des souches de levure présentant des caractéristiques améliorées ou, tout au moins, adaptées à une nouvelle utilisation ou de nouvelles conditions de culture. Afin d'obtenir une souche présentant une caractéristique particulière, l'homme du métier peut utiliser la reproduction sexuée en croisant deux souches parentales présentant des caractéristiques intéressantes et en sélectionnant une souche hybride apportant la combinaison recherchée des caractéristiques parentales. Cette méthode est cependant aléatoire et l'étape de sélection peut engendrer des délais conséquents. De manière alternative, il peut également modifier génétiquement la souche par une technique d'ADN recombinant. Cette modification peut néanmoins constituer un frein à son exploitation, que ce soit pour des raisons réglementaires, sanitaires ou environnementales. Une troisième alternative consiste à provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, au cours de la recombinaison méiotique. La recombinaison méiotique est un échange d'ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose. Elle est initiée par la formation de cassures double-brin dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, suivie de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue. Les recombinaisons méiotiques ont cependant l'inconvénient d'être aléatoires et non-uniformes. En effet, les sites de coupures double-brin à l'origine de ces recombinaisons ne sont pas distribués de façon homogène dans le génome. On distingue ainsi des régions chromosomiques dites 'chaudes' où la fréquence de recombinaison est élevée, et des régions chromosomiques dites 'froides' où la fréquence de recombinaison peut être jusqu'à 100 fois plus faible.

Spo 11 est la protéine catalysant les cassures double-brin au cours de la méiose. Elle agit sous forme de dimère en coopération avec de nombreux partenaires. A l'heure actuelle, les facteurs déterminant le choix des sites de coupure double-brin par Spoll et ses partenaires restent encore mal compris. Le contrôle de la formation des cassures double-brin et, de fait, des recombinaisons méiotiques, est crucial pour le développement de techniques d'ingénierie génétique. Il a récemment été montré qu'il est possible de modifier les sites de formation de cassures double-brin en fusionnant Spol 1 avec le domaine de liaison à l'ADN de l'activateur de transcription Ga14 (Pecina et al, 2002 Cell, 111, 173-184,). La protéine de fusion Ga14-Spoll permet d'introduire des cassures double-brin dans des régions chromosomiques dites 'froides', au niveau des sites de liaison de Ga14 à l'ADN. Cependant, dans cette dernière approche, l'introduction de cassures double-brin est conditionnée par la présence de sites de liaison Ga14, il reste donc impossible d'induire des phénomènes de recombinaisons méiotiques ciblées indépendamment de sites de liaison spécifiques. RESUME DE L'INVENTION L'objectif de la présente invention est de proposer un procédé permettant d'induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules de levure, dans n'importe quelle région du génome, indépendamment de tout site de liaison connu, et notamment dans des régions chromosomiques dites 'froides'. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote comprenant - l'introduction dans ladite cellule : a) d'une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo 11 ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et b) d'un ou plusieurs ARN guides ou d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation au domaine Cas9 de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et - l'induction de l'entrée en prophase I de méiose de ladite cellule. La protéine de fusion peut comprendre en outre une séquence signal de localisation nucléaire.

De préférence, le domaine Cas9 de la protéine de fusion est une protéine Cas9 déficiente pour l'activité nucléase. L'acide nucléique codant ladite protéine de fusion peut être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, inductible ou spécifique de la méiose. Un ou plusieurs ARN guides supplémentaires ciblant une ou plusieurs autres régions chromosomiques, ou acides nucléiques codant lesdits ARN guides supplémentaires, peuvent être introduits dans la cellule eucaryote. De préférence, la cellule eucaryote est une levure. L'entrée en prophase I de la levure peut alors être induite par son transfert d'un milieu riche à un milieu de sporulation. La présente invention concerne aussi, selon un deuxième aspect, une protéine de fusion telle que définie dans le procédé ci-dessus. Selon un troisième aspect, la présente invention concerne encore un acide nucléique codant pour la protéine de fusion définie ci-dessus. La présente invention concerne également, selon un quatrième aspect, une cassette d'expression ou un vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus. De préférence, le vecteur est un plasmide comprenant, une origine de réplication bactérienne, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus, un ou plusieurs marqueurs de sélection, et/ou une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome de la cellule hôte. En particulier, le plasmide comprend une origine de réplication bactérienne, de préférence l'origine Co1E1, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus sous le contrôle d'un promoteur, de préférence le promoteur ADH1, un terminateur, de préférence le terminateur ADH1, un ou plusieurs marqueurs de sélection, de préférence des marqueurs de résistance tels que le gène de résistance à la kanamycine ou à l'ampicilline, une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome de la cellule hôte, de préférence au niveau du locus TRP 1 du génome d'une levure. De manière préférée, le plasmide comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la SEQ ID NO : 1 et la SEQ ID NO : 2. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1. Schéma représentant les plasmides P1 (SEQ ID NO : 1) et P2 (SEQ ID NO : 2) de la fusion SpCas9-Spo 1 1 ou SpCas9*-Spo 1 1. P1 et P2 codent respectivement pour l'expression de NLS-SpCas9-Spo 1 1 et NLS-SpCas9*-Spo 1 1 chez la levure. Les blocs noirs représentent le promoteur constitutif ADH1 (pADH1) et le terminateur ADH1 (tADH1). La flèche indique l'orientation de la transcription sous le contrôle du promoteur ADH1. Figure 2. Schéma représentant les plasmides d'expression d'ARNg dans des cellules de levure. (A) Schéma du plasmide contenant une unique cassette d'expression d'ARNg afin de cibler une seule région du génome de la levure. RE indique le site de restriction où la séquence déterminant la spécificité de l'ARNg (SDS) est insérée par le procédé de Gibson. Le promoteur et le terminateur (Term) sont dépendants de l'ARN polymérase III. La flèche sur le promoteur indique le sens de la transcription de la séquence. La cassette d'expression d'un ARNg contient un ARNg encadré par un promoteur et un terminateur. (B) Schéma du plasmide contenant plusieurs cassettes d'expression d'ARNg afin de cibler de multiples régions du génome de la levure (ciblage multiplexé). Les différentes cassettes d'ARNg se distinguent par leur séquence déterminant leur spécificité (SDS). Elles ont été introduites successivement dans le site de clonages multiples (MCS) par les techniques classiques de clonage/ligature. Figure 3. Schéma représentant le plasmide P1 (SEQ ID NO: 1). Figure 4. Schéma représentant le plasmide P2 (SEQ ID NO : 2). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le système CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) est un système de défense bactérien contre les ADN étrangers. Ce système repose essentiellement sur l'association d'une protéine Cas9 et d'un ARN « guide » (ARNg) responsable de la spécificité du site de clivage. Il permet la réalisation de cassures d'ADN double-brin (CDB) aux sites ciblés par le système CRISPR/Cas9. Ce système a déjà été utilisé pour faire de l'ingénierie ciblée du génome dans des cellules eucaryotes (cf. par exemple la demande de brevet EP2764103), notamment des cellules humaines (Cong L et al.,2013, Science 339(6121):819-823 ; Mali P et al.,2013, Science, 339(6121):823-826 ; Cho SW et al., 2013, Nature Biotechnology 31(3):230-232), de rat (Li D, et al., 2013, Nature Biotechnology, 31(8):681-683 ; WO 2014/089290), de souris (Wang H et al., 2013, Cell, 153(4):910-918), de lapin (Yang D et al., 2014, Journal of Molecular Cell Biology, 6(1):97-99), de grenouille (Nakayama T et al., 2013, Genesis, 51(12):835-843), de poisson (Hwang WY et al., 2013, Nature Biotechnology, 31(3):227-229), de plantes (Shan Q et al., 2013, Nature Biotechnology, 31(8):686-688 ; Jiang W et al., 2013, Nucleic Acids Research, 41(20):e188.), de drosophile (Yu Z et al, 2013, Genetics, 195(1):289-291), de nématode (Friedland AE et al., 2013, Nature Methods, 10(8):741-743), de levure (DiCarlo J, et al., 2013, Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research 41(7):4336- 4343.), mais aussi des cellules bactériennes (Jiang W et al., 2013, Nature Biotechnology, 31(3):233-239). En revanche, ce système n'a jamais été utilisé pour cibler des sites de recombinaison méiotique dans quelque organisme que ce soit. Les inventeurs ont démontré qu'il était possible de modifier le système CRISPR-Cas9 afin d'induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, et en particulier dans une levure. Ils ont en effet montré que l'expression combinée d'une protéine de fusion Spoll-Cas9 et d'un ou plusieurs ARN guides permettait de cibler l'action de la transestérase Spo 11 qui est responsable des cassures double-brin durant la méiose. La réparation de ces cassures en utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue induit les phénomènes de recombinaison recherchés. Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote comprenant - l'introduction dans ladite cellule : a) d'une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo 11, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et b) d'un ou plusieurs ARN guides ou d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation au domaine Cas9 de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée ; et - l'induction de l'entrée en prophase I de méiose de ladite cellule. Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule eucaryote », se réfère à une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale, en particulier une cellule de mammifère telle qu'une cellule de souris ou de rat, ou une cellule d'insecte. La cellule eucaryote est de préférence non-humaine et/ou non-embryonnaire. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de levure, en particulier une levure d'intérêt industriel. Des exemples de levures d'intérêt comprennent, sans y être limités, les levures du genre Saccharomyces sensu stricto, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia ou Candida, ainsi que les hybrides obtenus à partir d'une souche appartenant à l'un de ces genres. De préférence, la levure d'intérêt appartient au genre Saccharomyces. Elle peut notamment appartenir à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces castelli, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces pastorianus (aussi nommée Saccharomyces carlsbergensis), ou est un hybride obtenu à partir d'une souche appartenant à l'une de ces espèces tel que par exemple un hybride S. cerevisiae/ S. paradoxus ou un hybride S. cerevisiae/S. uvarum. Selon un autre mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote est une cellule de champignon, en particulier une cellule de champignon d'intérêt industriel. Des exemples de champignons comprennent, sans y être limités, les cellules de champignons filamenteux. Les champignons filamenteux incluent les champignons appartenant aux subdivisions Eumycota et Oomycota. Les cellules de champignons filamenteux peuvent être choisies dans le groupe constitué des cellules de Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ou Trametes. Tel qu'utilisé ici, le terme « protéine de fusion » se réfère à une protéine chimérique comprenant au moins deux domaines issus de la combinaison de différentes protéines ou fragments de protéines. L'acide nucléique codant cette protéine est obtenu par recombinaison des régions codant les protéines ou fragments de protéine de façon à ce que ceux-ci soient en phase et transcrits sur le même ARNm. Les différents domaines de la protéine de fusion peuvent être directement adjacents ou être séparés par des séquences de liaison (ou linker) qui introduisent une certaine flexibilité structurale dans la construction. La protéine de fusion utilisée dans la présente invention comprend un domaine Cas9 et un domaine Spoll. Le domaine Cas9 est le domaine de la protéine de fusion qui est capable d'interagir avec les ARN guides et de cibler l'activité nucléase du domaine Spo 1 1 vers une région chromosomique donnée. Le domaine Cas9 peut être constitué d'une protéine Cas9 (aussi appelée Csnl ou Csx12), sauvage ou modifiée, ou d'un fragment de cette protéine capable d'interagir avec les ARN guides. La protéine Cas9 peut notamment être modifiée pour moduler son activité enzymatique. Ainsi, l'activité nucléase de la protéine Cas9 peut être modifiée ou inactivée. La protéine Cas9 peut également être tronquée afin de supprimer les domaines de la protéine non-essentiels aux fonctions de la protéine de fusion, en particulier les domaines de la protéine Cas9 qui ne sont pas nécessaires à l'interaction avec les ARN guides. La protéine Cas9 ou le fragment de celle-ci tel qu'utilisé dans la présente invention, peut être obtenu à partir de toute protéine Cas9 connue (Makarova et al, 2008, Nat. Rev. Microbiol., 9, pp. 466-477). Des exemples de protéines Cas9 utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les protéines Cas9 de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis da ssonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius,Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, ou Acaryochloris marina. D'autres protéines Cas9 utilisables dans la présente invention sont également décrites dans l'article de Makarova et al. (Makarova et al, 2008, Nat. Rev. Microbiol., 9, pp. 466-477). De préférence, le domaine Cas9 comprend, ou consiste en, la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes (Numéro d'entrée NCBI : WP 010922251.1, SEQ ID NO : 8) ou un fragment de celle-ci capable d'interagir avec les ARN guides. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cas9 est constitué d'une protéine Cas9 entière, de préférence la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes. De manière générale, les protéines Cas9 comprennent deux domaines nucléases : un domaine apparenté à un domaine RuvC et un domaine apparenté à un domaine HNH. Ces deux domaines coopèrent pour créer des cassures double-brin de l'ADN (Jinek et al, Science, 337 : 816-821). Chacun de ces domaines nucléases peut être inactivé par délétion, insertion ou substitution en recourant à des techniques bien connues de l'homme du métier comme la mutagénèse dirigée, la mutagénèse par PCR ou la synthèse totale de gènes. Ainsi, le domaine RuvC peut être inactivé par exemple par la substitution D 10A et le domaine HNH peut être inactivé par exemple par la substitution H840A (Jinek et al, Science, 337 : 816-821), les positions indiquées étant celles de la SEQ ID NO : 8. Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I: isoleucine; K: lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N: asparagine ; P : proline ; Q: glutamine ; R: arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y: tyrosine. Selon un mode de réalisation, le domaine Cas9 est déficient pour au moins une activité nucléase. Ce domaine peut être obtenu en inactivant au moins l'un des domaines nucléases de la protéine Cas9 tels que décrits ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cas9 comprend, ou consiste en, une protéine Cas9 ou un fragment de protéine Cas9, dépourvu d'activité nucléase (aussi appelé Cas9*). Cette forme catalytiquement inactive peut être obtenue en inactivant les deux domaines nucléases de la protéine Cas9 comme mentionné ci-dessus, par exemple en introduisant les deux mutations ponctuelles substituant l'aspartate 10 et l'histidine 840 par des alanines. Selon un mode de réalisation préféré, le domaine Cas9 comprend, ou consiste en, une protéine Cas9, de préférence la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes, dépourvue d'activité nucléase. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Cas9 comprend, ou consiste en, la séquence présentée en SEQ ID NO : 8 dans laquelle l'aspartate en position 10 et l'histidine en position 840 ont été substitués par des alanines. Spo 11 est une protéine apparentée à la sous-unité catalytique A d'une topo-isomérase de type II présente chez les archaebactéries (Bergerat et al, Nature, vol. 386, pp 414-7). Elle catalyse les cassures double-brin de l'ADN initiant les recombinaisons méiotiques. C'est une protéine très conservée pour laquelle il existe des homologues chez tous les eucaryotes. Spoll est active sous forme d'un dimère formé de deux sous-unités, dont chacune clive un brin d'ADN. Bien qu'essentielle, Spol 1 n'agit pas seule pour générer des cassures double-brin au cours de la méiose. Chez la levure S. cerevisiae, par exemple, elle coopère avec les protéines, Rec102, Rec103/5k18, Rec104, Rec114, Merl, Mer2/Rec107, Mei4, Mre2/Nam8, Mrell, Rad50, Xrs2/Nbsl, Hopi, Redl, Mekl, Sen et Sppl ainsi qu'avec d'autres partenaires décrits dans les articles de Keeney et al. (2001 Curr. Top. Dey. Biol, 52, pp. 1-53), Smith et al. (Curr. Opin. Genet. Dey, 1998, 8, pp. 200-211) et Acquaviva et al. (2013 Science, 339, pp. 215-8). Il a cependant été récemment démontré que le ciblage de Spoll à un site donné est suffisant pour déclencher le processus de recombinaison méiotique (Pecina et al, 2002 Cell, 111, 173-184). Le domaine Spo 1 1 de la protéine de fusion Cas9-Spo 1 1 est en général le domaine responsable des cassures double-brin. Ce domaine peut être constitué d'une protéine Spol 1 ou d'un fragment de celle-ci capable d'induire des cassures double brin de l'ADN.

La protéine Spoll ou le fragment de celle-ci tel qu'utilisé dans la présente invention, peut être obtenu à partir de toute protéine Spoll connue telle que la protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae (Gene ID: 856364, Numéro d'entrée NCBI : NP 011841 (SEQ ID NO : 9) Esposito and Esposito, Genetics, 1969, 61, pp. 79-89), la protéine AtSpo 1 1-1 et AtSpo 1 1-2 d'Arabidopsis thaliana (Grelon M. et al, 2001, Embo J., 20, pp. 589-600), la protéine murine mSpo 11 (Baudat F et al, Molecular Cell, 2000, 6, pp. 989-998), la protéine Spoll de C. elegans ou encore la protéine Spoll de drosophile meiW68 (McKim et al, 1998, Genes Dey, 12(18), pp. 2932-42). Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs et toute protéine Spoll connue peut être utilisée dans le procédé selon l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le domaine Spo 11 comprend, ou consiste en, une protéine Spoll, de préférence une protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae, telle que par exemple la protéine de séquence SEQ ID NO : 9. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine Spo 11 est déficient pour l'activité nucléase. En particulier, le domaine Spo 1 1 peut comprendre, ou consister en, la protéine mutante Spo 11-Y135F, une protéine mutante incapable d'induire des cassures double-brin de l'ADN (Neale MJ, 2002, Molecular Cell, 9, 835-846). La position indiquée est celle de la SEQ ID NO : 9. La capacité de la protéine de fusion selon l'invention à induire des cassures double brin de l'ADN, peut provenir du domaine Cas9 ou du domaine Spol 1. Ainsi, la protéine de fusion comprend au moins un domaine, Cas9 ou Spoll, présentant une activité nucléase, de préférence le domaine Spoll. La protéine de fusion selon l'invention comprend un domaine Spoll et un domaine Cas9 tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation, le domaine Spoll est du côté N-terminal et le domaine Cas9 du côté C-terminal de la protéine de fusion. Selon un autre mode de réalisation, le domaine Spoll est du côté C-terminal et le domaine Cas9 du côté N-terminal de la protéine de fusion. La protéine de fusion peut également comprendre une séquence signal de localisation nucléaire (SLN). Les séquences SLN sont bien connues de l'homme du métier et comprennent en général une courte séquence d'acides aminés basiques. A titre d'exemple, la séquence SLN peut comprendre la séquence PKKKRKV (SEQ ID NO : 3). La séquence SLN peut être présente à l'extrémité N-terminale, C-terminale ou dans une région interne de la protéine de fusion, de préférence à l'extrémité N-terminale de la protéine de fusion.

La protéine de fusion peut également comprendre un domaine supplémentaire de pénétration dans la cellule, c'est-à-dire un domaine facilitant l'entrée de la protéine de fusion dans la cellule. Ce type de domaine est bien connu de l'homme du métier et peut comprendre par exemple une séquence peptidique de pénétration dérivée de la protéine TAT du VIH-1 telle que GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO : 4), dérivée de la séquence TLM du virus de l'hépatite B humaine telle que PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (SEQ ID NO : 5), ou une séquence peptidique polyarginine. Ce domaine de pénétration dans la cellule peut être présent à l'extrémité N-terminale, C-terminale ou être à l'intérieur de la protéine de fusion, de préférence à l'extrémité N-terminale. La protéine de fusion peut comprendre en outre une ou des séquences de liaison (linkers) entre les domaines Cas9 et Spoll, et optionnellement entre ces domaines et les autres domaines de la protéine tels que la séquence signal de localisation nucléaire ou le domaine de pénétration dans la cellule. La longueur de ces séquences de liaison est aisément ajustable par l'homme du métier. En général, ces séquences comprennent entre 10 et 20 acides aminés, de préférence environ 15 acides aminés et de manière encore préférée 12 acides aminés. Les séquences de liaison entre les différents domaines peuvent être de longueurs identiques ou différentes. Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend, ou consiste en, successivement, depuis l'extrémité N-terminale jusqu'à l'extrémité C-terminale : un signal de localisation nucléaire, une première séquence de liaison (linkerl), un domaine Cas9, une seconde séquence de liaison (linker2) et un domaine Spoll. Selon un autre mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend, ou consiste en, successivement, depuis l'extrémité N-terminale jusqu'à l'extrémité C-terminale : un signal de localisation nucléaire, une première séquence de liaison (linkerl), un domaine Spo 11, une seconde séquence de liaison (linker2) et un domaine Cas9. La protéine de fusion peut en outre comprendre une étiquette (ou tag) qui est une séquence définie d'acides aminés. Cette étiquette peut notamment être utilisée afin de détecter l'expression de la protéine de fusion, d'identifier les protéines interagissant avec la protéine de fusion ou de caractériser les sites de fixation de la protéine de fusion dans le génome. La détection de l'étiquette attachée à la protéine de fusion peut être réalisée avec un anticorps spécifique de ladite étiquette ou toute autre technique bien connu de l'homme du métier. L'identification des protéines interagissant avec la protéine de fusion peut être réalisée, par exemple, par des techniques de co-immunoprécipitation. La caractérisation des sites de fixation de la protéine de fusion dans le génome peut être réalisée, par exemple, par des techniques d'immunoprécipitation, d'immunoprécipitation de la chromatine couplée à une PCR quantitative en temps réel (ChIP-qPCR), d'immunoprécipitation de la chromatine couplée à des techniques de séquençage (ChIP-Seq), de cartographie à l'aide d'oligonucléotides (oligo mapping) ou toute autre technique bien connue de l'homme du métier. Cette étiquette peut être présente à l'extrémité N-terminale de la protéine de fusion, à l'extrémité C-terminale de la protéine de fusion ou en position non-terminale dans la protéine de fusion. De préférence, l'étiquette est présente à l'extrémité C-terminale de la protéine de fusion. La protéine de fusion peut comprendre une ou plusieurs étiquettes, identiques ou différentes. Les étiquettes, telles qu'utilisées dans la présente invention, peuvent être choisies parmi les nombreuses étiquettes bien connues de l'homme du métier. En particulier, les étiquettes utilisées dans la présente invention peuvent être des étiquettes peptidiques et/ou des étiquettes protéiques. De préférence, les étiquettes utilisées dans la présente invention sont des étiquettes peptidiques. Des exemples d'étiquettes peptidiques utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les étiquettes formées de répétitions d'au moins six Histidines (His), en particulier les étiquettes formées de six ou huit histidines, ainsi que les étiquettes Flag, polyglutamates, hémagglutinine (HA), calmoduline, Strep, E-tag, myc, V5, Xpress, VSV, S - tag, Avi, SBP, Softag 1, Softag 2, Softag 3, isopetag, SpyTag, tétracystéines et des combinaisons de celles-ci. Des exemples d'étiquettes protéiques utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les étiquettes Glutathion-S-Transférase (GST), protéine A de Staphlococcus aureus, Nus A, protéine de liaison à la chitine (CBP), thiorédoxine, protéine de liaison au maltose (MBP), protéines transporteuses de biotine carboxylées (BCCP), fragment constant des immunoglobulines (Fc), les étiquettes comprenant une protéine fluorescente telles que les protéines GFP (Green Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein), et des combinaisons de celles-ci. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine de fusion comprend une étiquette formée de six histidines et/ou d'un ou plusieurs motifs Flag, de préférence trois motifs Flag. Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de fusion comprend une étiquette formée de six histidines et trois motifs Flag. La protéine de fusion telle que décrite ci-dessus peut être introduite dans la cellule sous une forme protéique, notamment sous sa forme mature ou sous la forme d'un précurseur, de préférence sous sa forme mature, ou sous la forme d'un acide nucléique codant ladite protéine. Lorsque la protéine de fusion est introduite dans la cellule sous une forme protéique, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N-terminales afin d'améliorer la résistance de la protéine de fusion aux peptidases. Par exemple, le groupement protecteur à l'extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l'extrémité C-terminale peut être une amidation ou une estérification. L'action des protéases peut également être contrecarrée par l'utilisation d'acides aminés de configuration D, la cyclisation de la protéine par formation de ponts disulfures, d'anneaux lactames ou de liaisons entre les extrémités N- et C-terminales. La protéine de fusion de l'invention peut également comprendre des liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH et conférant une résistance accrue aux peptidases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2-0, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. La protéine de fusion peut également comprendre un ou plusieurs acides aminés qui sont des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la Néthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la Nméthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique ; ou des acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine. La protéine de fusion selon l'invention peut être obtenue par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide) ou par synthèse enzymatique (Kullmann W, Enzymatic peptide synthesis, 1987, CRC Press, Florida). Elle peut également être obtenue par une méthode consistant à cultiver une cellule hôte exprimant un acide nucléique codant la protéine de fusion et récupérer ladite protéine à partir de ces cellules ou du milieu de culture. Tel qu'utilisé dans la présente demande, le terme « ARN guide » ou « ARNg » désigne une molécule d'ARN capable d'interagir avec le domaine Cas9 de la protéine de fusion afin de la guider vers une région chromosomique cible. Chaque ARNg comprend deux régions : - une première région (communément appelée région « SDS »), à l'extrémité 5' de l'ARNg, qui est complémentaire de la région chromosomique cible et qui imite l'ARNcr du système CRISPR endogène, et - une seconde région (communément appelé région « handle »), à l'extrémité 3' de l'ARNg, qui mime les interactions d'appariement de bases entre l'ARNtracr (trans-activating crRNA) et l'ARNcr du système CRISPR endogène et présente une structure double brin en tige et boucle s'achevant en 3' par une séquence essentiellement simple brin. Cette seconde région est essentielle à la fixation de l'ARNg au domaine Cas9 de la protéine de fusion. La première région de l'ARNg varie selon la séquence chromosomique ciblée. En revanche, les régions « handle » des différents ARNg utilisés peuvent être identiques ou différentes.

La région « SDS » de l'ARNg qui est complémentaire de la région chromosomique cible, comprend en général entre 10 et 25 nucléotides. De préférence, cette région a une longueur de 19, 20 ou 21 nucléotides, et de manière particulièrement préférée de 20 nucléotides. La seconde région de l'ARNg a une structure en tige et boucle (ou structure en épingle à cheveux). Les longueurs de la tige et de la boucle peuvent varier. De préférence, la boucle a une longueur de 3 à 10 nucléotides et la tige une longueur de 6 à 20 nucléotides. La tige peut optionnellement présenter des régions désappariées (formant des « bosses ») de 1 à 10 nucléotides. De préférence, la longueur globale de cette région « handle » est de 50 à 100 nucléotides, et de manière plus particulièrement préférée de 82 nucléotides. La longueur totale d'un ARNg est en général de 50 à 140 nucléotides, de préférence de 80 à 125 nucléotides, et de manière plus particulièrement préférée de 90 à 110 nucléotides. Selon un mode de réalisation particulier, un ARNg tel qu'utilisé dans la présente invention a une longueur de 102 nucléotides. L'ARNg est de préférence formé d'une seule molécule d'ARN comprenant les deux domaines. De manière alternative, l'ARNg peut être formé de deux molécules d'ARN distinctes, la première molécule comprenant la région « SDS » et la moitié de la tige de la seconde région, et la deuxième molécule comprenant la deuxième moitié de la tige de l'ARNg. Ainsi, l'appariement des deux molécules d'ARN par leurs séquences complémentaires au niveau de la tige, forme un ARNg fonctionnel. L'homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l'article de Di Carlo et al, Nucleic Acids Research 2013, 1-8). Dans le procédé selon l'invention, un ou plusieurs ARNg peuvent être utilisés simultanément. Ces différents ARNg peuvent cibler des régions chromosomiques identiques ou différentes, de préférence différentes. Les ARNg peuvent être introduits dans la cellule eucaryote sous la forme de molécules d'ARNg matures, sous la forme de précurseurs ou sous la forme d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARNg. Lorsque le ou les ARNg sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d'ARN (matures ou précurseurs), ces ARNg peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d'augmenter leur résistance aux nucléases et ainsi d'augmenter leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthy1-5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Les ARNg utilisés selon l'invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2'-0-alkyl ribose ou les PNA (Peptid Nucleic Acid) (Egholm et al, 1992 J. Am. Chem. Soc., 114, 1895- 1897). Les ARNg peuvent être des ARN naturels, synthétiques ou produits par des techniques de recombinaison. Ces ARNg peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l'homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d'amplification. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend l'introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d'un ou plusieurs ARNg capables de cibler l'action de la protéine de fusion vers une région chromosomique donnée. La protéine et les ARNg peuvent être introduits dans le cytoplasme ou le noyau de la cellule eucaryote par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par microinjection. La protéine de fusion peut notamment être introduite dans la cellule en tant qu'élément d'un complexe protéine-ARN comprenant au moins un ARNg. Selon un autre mode de réalisation, le procédé comprend l'introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d'un ou plusieurs acides nucléiques codant un ou plusieurs ARNg. Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé comprend l'introduction dans la cellule eucaryote d'un acide nucléique codant la protéine de fusion et d'un ou plusieurs ARNg. Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé comprend l'introduction dans la cellule eucaryote d'un acide nucléique codant la protéine de fusion et d'un ou plusieurs acides nucléiques codant un ou plusieurs ARNg. La protéine de fusion, ou l'acide nucléique codant celle-ci, et le ou les ARNg, ou le ou les acides nucléiques codant ceux-ci, peuvent être introduits simultanément ou séquentiellement dans la cellule. Dans les modes de réalisation où la protéine de fusion et/ou le ou les ARNg sont introduits dans la cellule eucaryote sous la forme d'un acide nucléique codant pour ladite protéine et/ou le/lesdits ARNg, l'expression dedits acides nucléiques permet de produire la protéine de fusion et/ou le ou les ARNg dans la cellule.

Au sens de l'invention, on entend par « acide nucléique » toute molécule à base d'ADN ou d'ARN. Il peut s'agir de molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. De préférence, l'utilisation des codons est optimisée selon la nature de la cellule eucaryote. Les acides nucléiques codant pour la protéine de fusion et ceux codant pour les ARNg peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs identiques ou différents, constitutifs ou inductibles, en particulier de promoteurs spécifiques de la méiose. Selon un mode de réalisation préféré, les acides nucléiques sont placés sous le contrôle de promoteurs constitutifs tels que le promoteur ADH1 ou les promoteurs pRPR1 et 5NR52 dépendant de l'ARN polymérase III, de manière encore préféré le promoteur pRPR1. Les acides nucléiques codant la protéine de fusion et le ou les ARNg peuvent être disposés sur la même construction, en particulier sur le même vecteur d'expression, ou sur des constructions distinctes. De manière alternative, les acides nucléiques peuvent être insérés dans le génome de la cellule eucaryote en des régions identiques ou distinctes. Selon un mode de réalisation préféré, les acides nucléiques codant la protéine de fusion et le ou les ARNg sont disposés sur le même vecteur d'expression. Les acides nucléiques tels que décrits ci-dessus peuvent être introduits dans la cellule eucaryote par toute méthode connue par l'homme du métier, en particulier par microinjection, transfection, électroporation et biolistique. Optionnellement, l'expression ou l'activité de la protéine Spol 1 endogène de la cellule eucaryote peut être supprimée afin de mieux contrôler les phénomènes de recombinaison méiotiques. Cette inactivation peut être réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier, notamment en inactivant le gène codant la protéine Spoll endogène ou en inhibant son expression au moyen d' ARN interférents. Après l'introduction dans la cellule eucaryote de la protéine de fusion et d'un ou de plusieurs ARNg, ou des acides nucléiques codant ceux-ci, le procédé selon l'invention comprend l'induction de l'entrée en prophase I de méiose de ladite cellule. Cette induction peut se faire selon différentes méthodes, bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, lorsque la cellule eucaryote est une cellule de souris, l'entrée des cellules en prophase I de méiose peut être induite par l'ajout d'acide rétinoïque (Bowles J et al, 2006, Sciences, 312(5773), pp. 596-600).

Lorsque la cellule eucaryote est une levure, cette induction peut être réalisée par le transfert de la levure d'un milieu riche à un milieu de sporulation, de préférence dépourvu de source de carbone fermentescible ou d'azote, et l'incubation des levures dans le milieu de sporulation durant un temps suffisant pour induire des cassures double-brin Spo 1 1-dépendantes. L'initiation du cycle méiotique dépend de plusieurs signaux : la présence des deux allèles de type sexuel MATa et MATa, l'absence de source d'azote et de carbone fermentescible. Tel qu'utilisé dans ce document, le terme « milieu riche » se réfère à un milieu de culture comprenant une source de carbone fermentescible et une source d'azote ainsi que tous les éléments nutritifs nécessaires aux levures pour se multiplier par division mitotique. Ce milieu peut être aisément choisi par l'homme du métier et peut, par exemple, être sélectionné parmi le groupe constitué du milieu YPD (1% extrait de levures, 2% bactopeptone et 2% glucose), du milieu YPG (1% extrait de levures, 2% bactopeptone et 3% glycérol) et d'un milieu synthétique complet (ou milieu SC) (Treco and Lundblad, 2001, Curr. Protocol. Mol. Biol., Chapter 13, Unit 13.1). Tel qu'utilisé dans ce document, le terme « milieu de sporulation » se réfère à tout milieu induisant l'entrée en prophase de méiose des cellules de levure sans croissance végétative, en particulier à un milieu de culture ne comprenant pas de source de carbone fermentescible ni de source d'azote mais comprenant une source de carbone métabolisable par respiration telle que l'acétate. Ce milieu peut être aisément choisi par l'homme du métier et peut, par exemple, être sélectionné parmi le groupe constitué du milieu KAc 1% (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518), le milieu SPM (Kassir and Simchen, 1991, Meth. Enzymol., 194, 94-110) et des milieux de sporulation décrits dans l'article de Sherman (Sherman, Meth. Enzymol., 1991, 194, 3-21). Selon un mode de réalisation préféré, avant d'être incubées dans le milieu de sporulation, les cellules sont cultivées durant quelques cycles de division dans un milieu de pré-sporulation de façon à obtenir une sporulation efficace et synchrone. Le milieu de pré-sporulation peut être aisément choisi par l'homme du métier. Ce milieu peut être, par exemple, le milieu SPS (Wu and Lichten, 1994, Science, 263, pp. 515-518). Le choix des milieux (milieu riche, milieu de pré-sporulation, milieu de sporulation) dépend des caractéristiques physiologiques et génétiques de la souche de levure, notamment si cette souche est auxotrophe pour un ou plusieurs composés. Une fois la cellule engagée en prophase I de méiose, le processus méiotique peut se poursuivre jusqu'à produire quatre cellules filles présentant les recombinaisons recherchées.

De manière alternative, lorsque la cellule eucaryote est une levure, et en particulier une levure du genre Saccharomyces, les cellules peuvent être replacées en conditions de croissance afin de reprendre un processus mitotique. Ce phénomène appelé « return-to-growth » ou « RTG » a été décrit précédemment dans la demande de brevet WO 2014/083142 et se produit lorsque les cellules entrées en méiose en réponse à une carence nutritionnelle sont remises en présence d'une source de carbone et d'azote après la formation des cassures double-brin Spoll dépendantes mais avant la première division de méiose (Honigberg and Esposito, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1994, 91, 6559-6563). Dans ces conditions, elles interrompent leur progression dans les stades de différenciation méiotique pour reprendre un mode de croissance mitotique tout en induisant les recombinaisons recherchées lors de la réparation des cassures double-brin provoquées par Spoll (Sherman et Roman, Genetics, 1963, 48,255-261 ; Esposito et Esposito, Proc. Nat. Acad. Sci, 1974,71, pp. 3172-3176 ; Zenvirth et al, Genes to Cells, 1997, 2, pp. 487498). Le procédé peut comprendre en outre l'obtention de la ou des cellules présentant la ou les recombinaisons recherchées. Le procédé selon l'invention peut être utilisé dans toutes les applications où il est souhaitable d'améliorer et de contrôler les phénomènes de recombinaison méiotique. En particulier, l'invention permet d'associer, de manière préférentielle, des traits génétiques d'intérêt. Cette association préférentielle permet, d'une part, de réduire le temps nécessaire à leur sélection, d'autre part, de générer des combinaisons naturelles possibles mais improbables. Enfin, selon le mode de réalisation choisi, les organismes obtenus par ce procédé peuvent être considérés comme des organismes non génétiquement modifiés (non-OGM). Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé pour générer des variants d'un organisme eucaryote, à l'exception de l'homme, de préférence une levure, notamment une souche de levure d'intérêt industriel, comprenant - l'introduction dans une cellule dudit organisme: a) d'une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo 11, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et b) d'un ou plusieurs ARN guides, ou d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation au domaine Cas9 et une séquence complémentaire d'une région chromosomique ciblée; et - l'induction de l'entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ; - l'obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et - la genèse d'un variant de l'organisme à partir de ladite cellule recombinée. Dans ce procédé, le terme de « variant » doit être compris de façon large, il désigne un organisme ayant au moins une différence génotypique ou phénotypique par rapport aux organismes parents. Les cellules recombinées peuvent être obtenues en laissant la méiose se poursuivre jusqu'à l'obtention des spores, ou, dans le cas des levures, en replaçant les cellules en conditions de croissance après l'induction des cassures double-brin afin de reprendre un processus mitotique. La présente invention concerne également un procédé pour identifier ou localiser l'information génétique codant pour une caractéristique d'intérêt dans un génome de cellule eucaryote, de préférence une levure, comprenant : - l'introduction dans la cellule eucaryote: a) d'une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo 1 1, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et b) d'un ou plusieurs ARN guides, ou d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation au domaine Cas9 et une séquence complémentaire d'une région chromosomique ciblée; et - l'induction de l'entrée en prophase I de méiose de ladite cellule ; - l'obtention de cellule(s) présentant la ou les recombinaisons recherchées au niveau de la ou des régions chromosomiques ciblées ; et - l'analyse des génotypes et phénotypes des cellules recombinées afin identifier ou localiser l'information génétique codant pour la caractéristique d'intérêt. De préférence, la caractéristique d'intérêt est un caractère quantitatif d'intérêt (QTL). Selon un autre aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spoll telle que décrite ci-dessus. La présente invention concerne également un acide nucléique codant ladite protéine de fusion selon l'invention. L'acide nucléique selon l'invention peut être sous la forme d'ADN et/ou d'ARN, simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation préférée, l'acide nucléique est une molécule d'ADN isolée, synthétisée par des techniques recombinantes bien connues de l'homme du métier. L'acide nucléique selon l'invention peut être déduit de la séquence de la protéine de fusion selon l'invention et l'usage des codons peut être adapté selon la cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique doit être transcrit. La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention lié de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à son expression. Notamment, l'acide nucléique peut être sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans une cellule hôte. De manière générale, une cassette d'expression comprend, ou consiste en, un promoteur permettant d'initier la transcription, un acide nucléique selon l'invention, et un terminateur de transcription. Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle du promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de son expression. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression. La cassette d'expression peut également comprendre au moins une séquence activatrice « enhancer » liée de manière opérationnelle au promoteur. Une large variété de promoteurs utilisables pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules ou des organismes hôtes sont à la disposition de l'homme du métier. Ils incluent des promoteurs constitutifs ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes. De préférence, l'acide nucléique selon l'invention est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif ou d'un promoteur spécifique de la méiose. Des exemples de promoteurs spécifiques de la méiose utilisables dans le cadre de la présente invention comprennent, sans y être limités, les promoteurs endogènes de Spo 11, les promoteurs des partenaires de Spoll pour la formation des cassures double-brin, le promoteur Rec8 (Murakami & Nicolas, 2009, Mol. Cell. Biol, 29, 3500-16,), ou le promoteur Spo 13 (Malkova et al, 1996, Genetics, 143, 741-754,). D'autres promoteurs inductibles peuvent également être utilisés tels que le promoteur estradiol (Carlie & Amon, 2008 Cell, 133, 280-91,), le promoteur méthionine (Care et al, 1999, Molecular Microb 34, 792-798,), les promoteurs induits par les chocs thermiques, les métaux, les stéroïdes, les antibiotiques et l'alcool.

Des promoteurs constitutifs utilisables dans le cadre de la présente invention sont, à titre d'exemples non limitatifs : le promoteur des gènes immédiats précoces du cytomégalovirus (CMV), le promoteur du virus simien (SV40), le promoteur tardif majeur des adénovirus, le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur du virus de la tumeur mammaire de souris (MMTV), le promoteur de la phosphoglycerate kinase (PGK), le promoteur du facteur d'élongation ED1-alpha, les promoteurs de l'ubiquitine, les promoteurs de l'actine, les promoteurs de la tubuline, les promoteurs des immunoglobulines, le promoteur de l'alcool déshydrogénase 1 (ADH1), les promoteurs dépendants de l'ARN polymérase III tels que les promoteurs U6, U3, H1, 7SL, pRPR1 (« Ribonuclease P RNA 1 ») ou SNR52 (« small nuclear RNA 52 »). Le terminateur de transcription peut être aisément choisi par l'homme du métier. De préférence, ce terminateur est RPRlt ou la séquence flanquante du 3' du gène SUP4 de Saccharomyces cerevisiae. La présente invention concerne en outre un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique selon l'invention dans ladite cellule. Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier. Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique selon l'invention. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur d'expression comprend un acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention, placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif, de préférence le promoteur ADH1 (pADH1). Il peut également comprendre une séquence terminatrice telle que le terminateur ADH1 (tADH1). Le vecteur d'expression peut comprendre une ou plusieurs origines de réplication, bactérienne ou eucaryote. Le vecteur d'expression peut notamment comprendre une origine de réplication bactérienne fonctionnelle chez E.coli telle que l'origine de réplication Co1E1 . Alternativement, le vecteur peut comprendre une origine de réplication eucaryote, de préférence fonctionnelle chez S. cerevisiae.

Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans une cellule hôte bactérienne ou eucaryote comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur d'expression comprend un ou plusieurs gènes de résistance à des antibiotiques, de préférence un gène de résistance à l'ampicilline et/ou un gène de résistance à la kanamycine. Le vecteur d'expression peut également comprendre une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome d'une cellule hôte. De préférence, l'insertion est réalisée au niveau d'un gène dont l'inactivation permet la sélection des cellules hôtes ayant intégré le vecteur, la cassette ou l'acide nucléique, tel que le locus TRP 1. Le vecteur peut être circulaire ou linéaire, simple- ou double-brin. Il est avantageusement choisi parmi les plasmides, phages, phagemides, virus, cosmides et chromosomes artificiels. De manière préférée, le vecteur est un plasmide. La présente invention concerne en particulier un vecteur, de préférence un plasmide, comprenant une origine de réplication bactérienne, de préférence l'origine Co1E1, un acide nucléique tel que défini ci-dessus sous le contrôle d'un promoteur, de préférence un promoteur constitutif tel que le promoteur ADH1, un terminateur, de préférence le terminateur ADH1, un ou plusieurs marqueurs de sélection, de préférence des marqueurs de résistance tels que le gène de résistance à la kanamycine ou à l'ampicilline, et une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome de la cellule hôte, de préférence au niveau du locus TRP 1 du génome d'une levure. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique selon l'invention porté par le vecteur code pour une protéine de fusion comprenant une ou plusieurs étiquette, de préférence comprenant une étiquette constituée de six histidines et/ou un ou plusieurs motifs Flag, de préférence trois motifs Flag. De préférence la ou les étiquettes sont en C-terminal. Selon un mode de réalisation particulier le vecteur d'expression est le plasmide P1 de séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 ou le plasmide P2, de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2. La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur d'expression selon l'invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou intégré dans le génome de la cellule hôte. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention. De préférence, la cellule est une cellule eucaryote, en particulier une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale. De manière particulièrement préférée, la cellule hôte est une cellule de levure. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule hôte est non-humaine et/ou non-embryonnaire. La présente invention concerne également l'utilisation de la protéine de fusion, de l'acide nucléique, de la cassette d'expression ou du vecteur d'expression selon l'invention pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, (ii) générer des variants d'un organisme eucaryote, et/ou (iii) identifier ou localiser l'information génétique codant pour une caractéristique d'intérêt dans un génome de cellule eucaryote. La présente invention concerne encore une trousse comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention, ou une cellule hôte transformée ou transfectée avec un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention. Elle concerne également l'utilisation de ladite trousse pour mettre en oeuvre un procédé selon l'invention, en particulier pour (i) induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote, (ii) générer des variants d'un organisme eucaryote, et/ou (iii) identifier ou localiser l'information génétique codant pour une caractéristique d'intérêt dans un génome de cellule eucaryote. Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif. EXEMPLES 1. Conception, synthèse et clonage d'une séquence nucléotidique codant pour la protéine SpCas9 et pour sa forme SpCas9* qui est déficiente pour l'activité nucléase. Le gène SpCas9 codant la protéine Cas9 provient de la souche bactérienne Streptococcus pyogenes. La forme catalytiquement inactive de SpCas9 (SpCas9*) se distingue de celle de SpCas9 par deux mutations ponctuelles : l'aspartate 10 et l'histidine 840 ont tous les deux été substitués en alanines (Asp10->A1a1° et His840->A1a840).

En raison des variations de fréquence d'utilisation des codons génétiques entre Streptococcus pyogenes et Saccharomyces cerevisiae, les séquences des gène SpCas9 et SpCas9* ont été adaptées afin d'optimiser leur expression chez la levure (yeast optim SpCas9 et yeast optim SpCas9*). Les séquences en acides aminés des deux protéines n'ont pas été modifiées. 2. Ingénierie des séquences yeast optim SpCas9 et yeast optim SpCas9* afin de fusionner les protéines SpCas9 et SpCas9* avec la transestérase méiotique Spoll. Des étapes d'ingénierie des séquences yeast optim SpCas9 et yeast optim SpCas9* ont permis de fusionner les protéines SpCas9 et SpCas9* avec un signal de localisation nucléaire (NLS) associé à une séquence de liaison (linker 1) en N-terminus et avec une seconde séquence de liaison (linker 2) en C-terminus (qui séparera les protéines SpCas9 et SpCas9* de la protéine Spoll dans la construction finale). Les séquences nucléotidiques ainsi obtenues et codant pour les séquences protéiques NLS -linker 1-SpCas9-linker 2 et NLS -linker 1-SpCas9*-linker 2 ont été ensuite clonées dans un plasmide intégratif, contenant la forme complète de la protéine Spoll de Saccharomyces cerevisiae étiquetée avec une séquence codant pour le double motif 6xHis3xFlag en C-terminus et dont l'expression est contrôlée par le promoteur constitutif pADH1. Les constructions plasmidiques qui en résultaient, P1 et P2, contenaient donc la fusion en phase du N-terminus de NLS-linker 1-SpCas9-linker2 et NLS-linker 1-SpCas9*-linker2 à la protéine Spoll. En conséquence P1 et P2 permettaient respectivement l'expression constitutive chez la levure des protéines de fusion NLS -SpCas9-Spo 1 1-6xHis-3xFlag (SEQ ID NO : 6) et NLSSpCas9*-Spo11-6xHis-3xFlag (SEQ ID NO : 7) (Figure 1). 3. Ingénierie des vecteurs d'expression d'ARN « guides » uniques et multiples. A partir d'un plasmide 2 micron (20 (Farzadfard F et al, 2013, ACS Synth. Biol., 2, pp. 604-613 ; DiCarlo JE et al., 2013, Nucleic Acids Res., 41(7), pp. 4336-4343) contenant la région « handle » (82 nucléotides) d'un ARN « guide » (ARNg), placée sous le contrôle d'un promoteur constitutif dépendant de l'ARN polymerase III tel que pRPR1 ou SNR52, le vecteur d'expression d'un unique ARNg de 102 nucléotides a été construit en clonant la séquence de 20 nucléotides déterminant la spécificité de l'ARNg (région « SDS ») au niveau d'un site de restriction situé immédiatement en 5' de la séquence codant la région « handle » du vecteur linéarisé, par le procédé d'assemblage de Gibson (Figure 2A). Ce vecteur d'expression présentait une séquence comportant de nombreux sites de restrictions uniques (multiple cloning sites (MCS)) en aval du terminateur (RPR 1t ou séquence flanquante du 3' de SUP4. Aussi, afin d'obtenir un système permettant le ciblage multiplexé des sites de recombinaison méiotiques, plusieurs cassettes d'expression d'ARNg ont été introduites dans le vecteur d'expression au niveau de son MCS. Les cassettes d'expression d'ARNg sont composées d'un promoteur constitutif dépendant de l'ARN polymérase III (pRPR1 ou SNR52), de l'ARNg spécifique et d'un terminateur (RPRlt ou la séquence flanquante du 3' de SUP4). Ces cassettes d'expression d'ARNg ont tout d'abord été clonées dans des vecteurs d'expression d'ARNg unique (voir ci-dessus), puis ont été amplifiée par PCR avant d'être clonées successivement au niveau du site de clonages multiples (MCS) du vecteur d'expression d'un unique ARNg par des techniques d'insertion/ligature classiques (Figure 2B). Cette stratégie aboutit à concaténer plusieurs cassettes d'ARNg dans un vecteur d'expression unique. 4. Co-expression des protéines de fusion SpCas9-Spoll et SpCas9*-Spo11 avec les ARNg chez la levure. Afin d'introduire les fusions NLS-SpCas9-Spol1 ou NLS-SpCas9*-Spo11 dans le locus chromosomique TRP1, des souches de levure Saccharomyces cerevisiae ont été transformées par choc thermique avec les vecteurs Pl ou P2 linéarisés. Ces protéines de fusion portant l'étiquette C-terminale 3xFlag ont été placées sous le contrôle du promoteur constitutif ADH1 . Après transformation, les cellules ont été étalées sur des boites de Pétri contenant un milieu sélectif (adaptés aux marqueurs de sélection portés par les plasmides Pl et P2) afin de sélectionner les transformants ayant intégré la fusion dans leur génome. Le vecteur d'expression du ou des ARNg a ensuite été introduit dans des souches diploïdes de levure exprimant les protéines de fusion NLS-SpCas9-Spol1 ou NLS-SpCas9*- Spo 11 par transformation par choc thermique. Les cellules ont alors été étalées sur un milieu sélectif pour les marqueurs de sélection des plasmides Pl, P2 et 2 micron. Les plasmides d'expression d'ARNg comportaient une origine de réplication 2 micron (20 ce qui leur permettaient de se maintenir avec un nombre de copies élevé dans chaque cellule de levure (50100 copies/cellule). La formation des cassures double-brin méiotiques générées de façon unique ou multiplexée par les protéines de fusion SpCas9-Spol1 ou SpCas9*-Spo11 aux sites génomiques ciblés par des ARNg uniques ou multiples est ensuite détectée par l'analyse Southern Blot de l'ADN génomique extrait des cellules diploïdes cultivées en milieu de sporulation.

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1- Procédé pour induire des recombinaisons méiotiques ciblées dans une cellule eucaryote comprenant - l'introduction dans ladite cellule : a) d'une protéine de fusion comprenant un domaine Cas9 et un domaine Spo 1 1 ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et b) d'un ou plusieurs ARN guides ou d'un ou plusieurs acides nucléiques codant lesdits ARN guides, lesdits ARN guides comprenant une structure ARN de fixation au domaine Cas9 de la protéine de fusion et une séquence complémentaire de la région chromosomique ciblée; et - l'induction de l'entrée en prophase 1 de méiose de ladite cellule et dans lequel ladite cellule eucaryote est une cellule de levure, de plante ou de champignon.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la protéine de fusion comprend en outre une séquence signal de localisation nucléaire.
3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le domaine Cas9 est une protéine Cas9 déficiente pour l'activité nucléase.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'expression de l'acide nucléique codant ladite protéine de fusion est placée sous le contrôle d'un promoteur constitutif, inductible ou spécifique de la méiose.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre l'introduction d'un ou plusieurs ARN guides supplémentaires ciblant une ou plusieurs autres régions chromosomiques, ou acides nucléiques codant lesdits ARN guides supplémentaires.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la cellule est une levure.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'induction de l'entrée en prophase 1 est obtenue par transfert de la levure d'un milieu riche à un milieu de sporulation.. Protéine de fusion telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes. 9. Acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon la revendication
8. 8. 10. Cassette d'expression ou vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication
9. 9. 11. Vecteur selon la revendication 10, ledit vecteur étant un plasmide comprenant - une origine de réplication bactérienne, de préférence l'origine ColEl. - une cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini dans la revendication 9 sous le contrôle d'un promoteur d'expression, de préférence le promoteur ADH1, et un terminateur, de préférence le terminateur ADH1' - un ou plusieurs marqueurs de sélection, de -préférence des marqueurs de résistance tels que le gène de résistance à la kanamycine ou à l'ampicilline, et/ou - une ou plusieurs séquences permettant l'insertion ciblée du vecteur, de la cassette d'expression ou de l'acide nucléique dans le génome d'une cellule hôte, de préférence au niveau du locus TRPI du génome d'une levure. 12. Vecteur selon la revendication 11, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique sélectionnée parmi la SEQ ID NO: 1 et la SEQ ID NO :