EP4152943A1 - Procédé de décontamination - Google Patents

Procédé de décontamination

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Publication number
EP4152943A1
EP4152943A1 EP21728855.4A EP21728855A EP4152943A1 EP 4152943 A1 EP4152943 A1 EP 4152943A1 EP 21728855 A EP21728855 A EP 21728855A EP 4152943 A1 EP4152943 A1 EP 4152943A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
bacteria
food
strains
nol11
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21728855.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Victor PAUMELLE
Typhaine MORISSET
Florian BLANCHET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mixscience SAS
Original Assignee
Mixscience SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mixscience SAS filed Critical Mixscience SAS
Publication of EP4152943A1 publication Critical patent/EP4152943A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/16—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using chemical substances
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a decontamination process, in particular for the decontamination of food production lines.
  • Salmonella spp and Escherichia coli are the most dangerous bacteria both for humans and animals when they are found in food, either because they cause serious pathologies, or because an asymptomatic carriage can be a source of foodborne outbreaks in humans.
  • compositions do not appear to be effective in providing hygiene and contamination pressure to a level below any risk to the health of animals and humans.
  • compositions do not meet the need for prevention or decontamination of finished products, tools and production lines, storage areas or even food product transport routes.
  • the invention aims to overcome the drawbacks of the prior art.
  • One of the aims of the invention is to provide an effective means of limiting the pressure of contamination, in particular by salmonella or E. coli , not only in food, but also in buildings and equipment where and with which the food is manufactured, stored and transported.
  • the invention relates to the use of a food composition
  • a food composition comprising at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , said strain being dispersed in said food composition, for decontamination or the prevention of contamination of surfaces, in particular the surfaces of devices for preparing, storing and conveying food, that is to say devices intended to receive food, in particular animal feed .
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that the use of a food comprising a strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , makes it possible not only to prevent the development of pathogenic or undesirable bacteria within said food, but that this food itself can be used in prevention of contamination, or as a decontaminating product for surfaces with which it is in contact.
  • composition according to the invention is more advantageous than the liquid solutions for the application of bacteria proposed in the prior art because it makes it possible to decontaminate all the surfaces of devices intended to receive food, which applications do not allow.
  • liquid decontamination solutions such as atomization, spraying, misting, nebulization or thermonebulization or even vaporization, inside production lines. It is obviously inconceivable to replace feed in the production chain with a flow of liquid, without damaging said feed production chain. Also, the only way to decontaminate such production lines is to use traps or openings located in certain specific places.
  • composition according to the invention is advantageous in terms of production and yield, since the surfaces of the devices are decontaminated during manufacture and not at shutdown.
  • composition according to the invention over liquid applications is to provide, at the same time as the positive bacteria, nutrients (from the food) allowing the development of the latter. Therefore, positive bacteria will be able to develop and exert a superior decontamination power on pathogenic bacteria.
  • a food or a food composition is used as a preventive or decontamination agent.
  • This food is composed of one or more substances capable of being ingested and digested, and of being used for the nutrition of a living being.
  • the food which is defined in the invention can take all possible solid or semi-solid forms, such as powders, including flours, granules, crumbs, pebbles, boluses, tablets, pasta, gels considered by those skilled in the art in the field in question as being solids, rehydrated foods, etc.
  • the form of the food of the invention is in no way a liquid form or a liquid intended for to the drink.
  • the food according to the invention therefore consists of one or more substances which provide nutrients for humans or animals. It can therefore be substances consisting or essentially consisting of carbohydrates, lipids, proteins, or minerals, or a mixture of two to two of these, or a mixture of three to three of these , or a mixture of all of these.
  • the food can be a simple mixture of simple elements (lipids, carbohydrates, proteins, minerals), one or more raw materials, that is to say initial products resulting from agriculture (such as fruits, leaves, seeds, stems, bark or roots, etc ...) or from mining (such as clays, carbonates, etc ...), in the raw, semi-processed state or processed, or a more complex product such as products derived from animals (flesh, soft organs, bones, cartilages, etc.), products derived from plants (fibers, seeds, flowers, roots, etc.) or even by-products derived from the agro-food industry (cheese whey, brewing grains, etc.), all of which may optionally be supplemented with food additives and / or technological aids.
  • the food used in the context of the invention comprises at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis .
  • This means that one or more bacteria of said strain are found in said food, in particular in a dispersed form, in a more or less homogeneous manner. It is possible to disperse bacteria of a strain within the food by operating a simple mixing so that the bacteria of the strain are evenly distributed from the surface of the food to the heart of it. .
  • a step of heating, humidifying, grinding, or any other type of pretreatment that is to say of treatment prior to the implementation of the invention, alone or in combination, can be deemed necessary by those skilled in the art.
  • bacterial strain is meant in the invention all the individuals (bacteria) resulting from the multiplication of a bacterial colony itself resulting from isolation by subculturing, this group being essentially homogeneous, that is, that is to say that the vast majority of bacteria that make up the strain have the same genotype.
  • a strain is a part of a bacterial species different from other bacteria of the same species by a minor but identifiable difference.
  • a strain is also defined as a population of bacteria that descends from a single organism or pure isolate culture. Strains of the same species may differ slightly from each other in many ways.
  • the food may contain a single strain of bacteria according to the above definition, or two, or three or more strains of bacteria, all of these strains, although the species may differ, belong to the genus Bacillus .
  • the food comprises bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , said food does not require that the nutrients which constitute the food are themselves decontaminated. In any event, it is however essential that the food does not contain an antibacterial agent (bacteriostatic or bacteriolytic) so as not to kill the bacteria of the genus Bacillus contained in said food.
  • an antibacterial agent bacteriostatic or bacteriolytic
  • the food described above can therefore, in the context of the invention, be used to decontaminate or prevent the contamination of surfaces.
  • the aforementioned food is capable, when it is applied to said surface which is contaminated, of removing bacterial contamination, and in particular of removing bacterial contamination liable to cause disorders in humans or the human body. animal, such as contamination with salmonella or e. coli .
  • This decontamination can be total, so that once the food according to the invention is brought into contact with the contaminated surface, the result is that the bacteria of the salmonella or E. coli eventually go away.
  • the decontamination can also be partial, that is to say that bringing the food according to the invention into contact with a contaminated surface will not eliminate all of the salmonella or E. coli present, but will maintain or reduce their number so that the amount of Salmonella or E. coli will be such that the risks to human or animal health will be limited.
  • the food can also prevent contamination, which means that if a surface uncontaminated, for example by salmonella or E. coli , is initially treated, or brought into contact with the food according to the invention, when in a second step the surface is put in the presence of salmonella or E. coli , the latter will not be able to develop in such a way as to become so numerous that they would represent a risk for animal or human health or in the event of development proven pathogenic or undesirable bacteria, this development will be less than without the food according to the invention.
  • contamination means that if a surface uncontaminated, for example by salmonella or E. coli , is initially treated, or brought into contact with the food according to the invention, when in a second step the surface is put in the presence of salmonella or E. coli , the latter will not be able to develop in such a way as to become so numerous that they would represent a risk for animal or human health or in the event of development proven pathogenic or undesirable bacteria, this development will be less than without the food according to the invention.
  • the aforementioned decontamination can be assimilated to a "cleaning" of a contaminated surface, while the prevention of contamination can be assimilated to a "protection” against contamination, or against the expansion of residual or minimal contamination. already present.
  • surface is meant here all internal or external surfaces located in a building where a food product is manufactured, in particular a production line, or in a building where it is used, in particular a feed screw in breeding.
  • This therefore includes, without being limiting, the walls, windows, doors, ceilings of the building, including the various moldings, complaints, beams, hatches, and all other constituent elements of the building that may be visible.
  • This also includes, without being limiting, all surfaces directly in contact with the food, internal or external, devices such as for example tubes, silos, storage or guide cones, presses, crushers.
  • screw or belt conveyors pneumatic transfer installations, vertical or horizontal coolers, mixers and their dosing installations such as bag-pourers, mixers, receiving pits and their filters, systems loaders and their unloading hatches, sandblasting machines, sifters, crumbling devices (crumblers), crumbling devices (lump breakers), automatic samplers, coating devices (coaters), sprayers, extruders, ovens, cookers, extractors, refrigerators, ovens, etc., all of these devices being considered individually and with their constituent parts.
  • the invention relates to the use of the aforementioned food composition, said composition further comprising at least one strain of lactic acid bacteria.
  • the food that is used for decontamination or the prevention of contamination as defined in the invention is all the more effective if at least one strain of bacteria of the genus Bacillus is combined, in particular of the species Bacillus subtilis , and at least one strain of lactic acid bacteria.
  • the invention advantageously relates to the use of a food composition
  • a food composition comprising at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , and at least one strain of lactic acid bacteria, said strains being dispersed in said composition.
  • food for decontamination or prevention of contamination of surfaces, in particular the surfaces of devices for preparing, storing and conveying food, in particular animal food.
  • the invention relates to the above-mentioned use, where said strain of bacteria is present in an amount of at least 10 4 cfu per gram of food composition.
  • colony-forming unit or even “cfu” ( colony forming unit ) is meant in the invention a unit used to estimate the number of viable bacteria in a sample. Viability is defined as the ability to multiply, that is, to divide. Counting with colony-forming units requires culturing the microorganisms and thus only counts viable cells.
  • the composition according to the invention is in dehydrated or non-aqueous form (in solid or semi-solid form), and said composition preferably comprises from 10 4 to 10 11 viable bacteria of Bacillus per g of composition. , or cfu per g of composition, and this for each of the strains when the composition comprises at least two strains.
  • "from 10 4 to 10 11 viable bacteria, or cfu" means: about 10 4 , about 5.10 4 , about 10 5 , about 5.10 5 , about 10 6 , about 5.10 6 , about 10 7 , about 5.10 7 , about 10 8 , about 5.10 8 , about 10 9 , about 5.10 9 , about 10 10 , about 5.10 10 or about 10 11 viable bacteria.
  • Viable bacteria are expressed in grams of bacterial culture. Those skilled in the art easily know how to determine this number of bacteria, in particular by counting either manually (using a Malassez slide), or by using an automatic cell counter, or by dilution then inoculation on agar and counting, in particular visually, colonies, or by measuring the optical density.
  • the food composition comprises both bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , and lactic acid bacteria
  • each of these bacteria is present at a rate of at least 10 4 cfu per gram of food composition, in particular at a rate of 10 4 to 10 11 cfu per g of food composition.
  • said one or more strains of bacteria of the genus Bacillus are in vegetative or spore form, or both.
  • the invention relates to the use as defined above, where said strain of bacteria of the genus Bacillus is chosen from one of the following strains:
  • a strain of Bacillus belonging to the same operational taxonomic unit (OTU) as said strain NOL01, or said strain NOL02 or said strain NOL03 or by "a similar strain” to NOL01, or NOL02, or NOL03, or else
  • the strains having a very similar genome or “very close” to NOL01, or NOL02, or NOL03, is meant in the invention all the strains of Bacillus , in particular of Bacillus subtilis , having at least 97% of similar genomic sequences with the sequence of genes encoding the 16S rRNA of the strain NOL01, or NOL02, or NOL03.
  • the operational taxonomic unit is the basic unit of phylogenetic analysis used to group together individuals who are phylogenetically related.
  • the DNA sequences of a given gene which then serves as a taxonomic marker, are grouped together by data partitioning (clustering) according to their identity.
  • One mainly used gene is 16S rRNA for bacteria.
  • the OTUs are defined on the basis of an identity threshold chosen by a person skilled in the art which is commonly 97%.
  • the invention relates to the above-mentioned use, where said strain of lactic acid bacteria is chosen from one of the following strains:
  • the invention relates to the above-mentioned use, where said food composition comprises:
  • strains NOL01, NOL02, or NOL03 chosen from strains NOL01, NOL02, or NOL03, or any of the strains of bacteria of the genus Bacillus belonging to the same OTU as said strain NOL01, or said strain NOL02 or said strain NOL03, and
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein said composition comprises at least any one of the following combinations of bacteria:
  • the invention further relates to the aforementioned use where said composition comprises at least any one of the following combinations of bacteria:
  • the invention relates to the above-mentioned use, where said surfaces are contaminated or contaminable by enterobacteria, in particular by strains of the genus Salmonella or Escherichia , in particular bacteria of the Salmonella species. enterica or Escherichia coli .
  • the aforementioned food composition is particularly useful for decontamination, or the prevention of contamination, or even the control of the contamination of surfaces contaminated or which could be contaminated by enterobacteria.
  • the Enterobacteriaceae family is a very heterogeneous family in terms of pathogenesis and ecology.
  • the species that make up this family are in fact either parasitic ( Shigella , Yersinia pestis ) or commensal ( Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella sp ) or saprophytic ( Serratia sp , Enterobacter sp ).
  • Salmonella spp. are enterobacteria whose essential characteristics are not to ferment lactose and not to produce urease. Salmonella spp. are parasites of humans, mammals (rodents), birds (poultry) and cold-blooded animals (reptiles). They are responsible, after oral ingestion, for many infections (salmonellosis), in particular typhoid and paratyphoid fevers (notifiable diseases n ° 1), gastroenteritis and collective food poisoning (notifiable diseases n ° 1). ° 2).
  • the main mode of contamination in humans is ingestion from water ( S almonella enterica Typhi serotype in particular) or foods (eg dairy products, eggs, meat).
  • Salmonella spp. non-typhoid Salmonella enterica serotype Typhimurium serotype Enteritidis serovar Dublin, etc .
  • Salmonella enterica serotype Typhimurium serotype Enteritidis serovar Dublin, etc ubiquitous, ingested with a drink or a contaminated food (sporadic cases) or after fecal-oral contamination, often dirty hands (epidemics communities). It can follow purely digestive infections, gastroenteritis. These result in diarrhea, vomiting and fever.
  • Their development is generally benign. Some subjects remain healthy carriers of Salmonella spp. in their digestive tract and can in certain circumstances (food profession for example) disseminate their strain.
  • E. coli Some strains of E. coli are associated with diarrhea and are clearly enteropathogenic (EPEC) thanks to special adhesion properties. They are neither enterotoxin secretaries nor enteroinvasive. They form pili, which form "bundles” which attach themselves to the villi of enterocytes. The villi are gradually destroyed (“attachment-erasure”). The enterocyte cytoskeleton is altered and water leaks very quickly, the biochemical mechanism of which is not fully understood.
  • the invention in another aspect, relates to a method for decontaminating or preventing contamination of surfaces of a device intended to receive food, said method comprising a step of bringing a food composition into contact with the surfaces of said device.
  • said food composition comprising at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , said strain being dispersed in said food composition.
  • device intended to receive food any device for preparing, conveying or storing food, including the walls, the floor, the windows, and the ceiling of a room. room or building containing one or more devices for preparing, transporting or storing food.
  • the objective is therefore to bring a device intended to receive food into contact with a view to decontaminating it or protecting it from potential contamination, or even limiting the development of existing contamination.
  • the contacting of a food composition with the surfaces to be decontaminated, or for which prevention of contamination is desired, can be done using tools facilitating the application, in particular using tools of the type sandy.
  • the invention advantageously relates to the aforementioned method, wherein said food composition further comprises at least one strain of lactic acid bacteria.
  • the invention also relates to a method for decontaminating or preventing contamination of surfaces of a device intended to receive food, said method comprising a step of bringing a food composition into contact with the surfaces of said device, said food composition.
  • a food composition comprising at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , and a strain of lactic acid bacteria, said strains being dispersed in said food composition.
  • the invention relates to the aforementioned method, where said strain of bacteria is present in an amount of at least 10 4 cfu per gram of food composition.
  • the composition according to the invention is in dehydrated or non-aqueous form (in solid or semi-solid form), and said composition preferably comprises from 10 4 to 10 11 viable bacteria of Bacillus per g of composition. , or cfu per g of composition, and this for each of the strains when the composition comprises at least two strains.
  • "from 10 4 to 10 11 viable bacteria, or cfu" means: about 10 4 , about 5.10 4 , about 10 5 , about 5.10 5 , about 10 6 , about 5.10 6 , about 10 7 , about 5.10 7 , about 10 8 , about 5.10 8 , about 10 9 , about 5.10 9 , about 10 10 , about 5.10 10 or about 10 11 viable bacteria.
  • the food composition comprises both bacteria of the genus Bacillus , in particular of the species Bacillus subtilis , and lactic acid bacteria
  • each of these bacteria is present at a rate of at least 10 4 cfu per gram of food composition, in particular at a rate of 10 4 to 10 11 cfu per g of food composition.
  • said one or more strains of bacteria of the genus Bacillus are in vegetative or spore form, or both.
  • the invention relates to the aforementioned method, where said strain of bacteria of the genus Bacillus is chosen from one of the following strains:
  • the invention relates to the aforementioned method, where said strain of lactic acid bacteria is chosen from one of the following strains: the NOL11 strain, deposited at the CNCM on March 14, 2012 under the number CNCM I-4609, and one any of the lactic acid bacteria strains belonging to the same operational taxonomic unit as said strain NOL11,
  • strains ie NOL strains or strains belonging to said OTU.
  • the invention also relates to a food composition in which is dispersed at least one strain of bacteria of the genus Bacillus, in particular Bacillus subtilis .
  • the invention relates to the aforementioned food composition, in which is dispersed at least one strain of bacteria of the genus Bacillus , in particular Bacillus subtilis , and at least one strain of lactic acid bacteria.
  • the aforementioned composition is such that said strain of bacteria of the genus Bacillus is chosen from one of the following strains:
  • the composition is such that said strain of lactic acid bacteria is chosen from one of the following strains: the strain NOL11, deposited at the CNCM on March 14, 2012 under the number CNCM I-4609, and any one strains of lactic acid bacteria belonging to the same operational taxonomic unit as said strain NOL11, or a mixture of two or more of these strains.
  • the invention relates to the aforementioned food composition, where said strain of bacteria is present in an amount of at least 10 4 cfu per gram of food composition, that is to say where said at least one strain of Bacillus is present at a rate of at least 10 4 cfu per gram of food composition, and where appropriate, said strain of lactic acid bacteria is present at a rate of at least 10 4 cfu per gram of food composition.
  • said one or more strains of bacteria of the genus Bacillus in particular Bacillus subtilis , is in vegetative or sporulated form, or both.
  • the invention relates to the food composition as defined above, where said strain of bacteria of the genus Bacillus is chosen from one of the following strains:
  • strains ie NOL strains or strains belonging to said OTU.
  • the invention relates to the aforementioned food composition, where said strain of lactic acid bacteria is chosen from one of the following strains:
  • FIG. 1 schematically represents a device after application of the food compositions to cans contaminated with X the sampling zone and Y the sedimentation zone of the composition.
  • FIG. 2 represents a graph showing the quantity of Salmonella Typhimurium in Log 10 CFU / g as a function of the time in hours for a composition of pig feed type, comprising (B) or not (A) the Bacillus and lactic bacteria (Test 1 ).
  • FIG. 3 represents a graph showing the quantity of E. coli in Log 10 CFU / g as a function of time in hours for a composition of pig feed type, comprising (B) or not (A) the B acillus and lactic bacteria ( Test 3).
  • Figure 4 is a graph showing the amount of Salmonella Enteritidis in Log 10 CFU / g as a function of the time in hours for a composition of the crushed corn type, comprising (B) or not (A) the Bacillus and lactic bacteria (Test 5).
  • FIG. 5 represents a graph showing the quantity of Salmonella Typhimurium in Log 10 CFU / g as a function of the time in hours for a composition of the soybean meal type, comprising (B) or not (A) the Bacillus and lactic bacteria (Test 8 ).
  • FIG. 6 represents a graph showing the evolution after 24 hours of the quantity of Salmonella Typhimurium in Log 10 CFU / g as a function of time after the application of a food composition, comprising (1.) or not (2.) the bacteria according to the invention (NOL01-03 and NOL11), on 6 series of tests: A and B crushed corn matrix, C and D sow feed matrix, or E and F without feed matrix.
  • Example 1 test s in vitro
  • the objective of these experiments was to test the capacity of the food composition according to the invention to prevent, reduce or control the expansion of enterobacteria in vitro .
  • the peptone water necessary for the preparation and enumeration of the cultures, and the tap water used were sterilized at 121 ° C for 20 minutes to avoid the presence of undesirable microorganisms.
  • Frozen isolates of pathogens S. enterica or E. coli , were thawed then dissolved in a culture medium for heart-brain infusion with yeast extracts (3.7% medium for heart-brain infusion (Merck, Darmstadt, Germany); 0.1% extracts of yeasts (Merck)) at 37 ° C for 24 hours under aerobic conditions and without agitation.
  • yeast extracts 3.7% medium for heart-brain infusion (Merck, Darmstadt, Germany); 0.1% extracts of yeasts (Merck)) at 37 ° C for 24 hours under aerobic conditions and without agitation.
  • the inocula were then diluted in peptone water (0.85% sodium chloride (VWR, Langenfeld, Germany); 0.1% peptone (G-Science, Saint Louis, USA)) to reach an initial concentration of 1 x 10 6 CFU / mL.
  • the initial concentrations of S. enterica or E. coli were measured by counting according to the Pasteurian method on agar for brain-heart infusion with yeast extracts, after incubation for 24 hours at 37 ° C.
  • the bacteria were mixed for 5 minutes (TopMix94323, Heidolph) in the food preparation so as to reach a minimum concentration of 1 x 10 6 CFU / g in Bacillus subtilis (NOL01-NOL03) and minimum 1 x 10 6 CFU / g in Lactococcus lactis (NOL11).
  • base matrix 1 Pork food 2.75 Ground corn 0.00 Soybean meal 0.00
  • the pork feed used in this example is a feed whose composition is given in the following table:
  • the enumeration of pathogenic bacteria was carried out at time 0 (T0), then at different time steps depending on the experiments carried out. At each time point, the samples were analyzed for the enumeration of S. enterica or E. coli according to at least one of the following reference methods:
  • the effect of the treatment with the food according to the invention on the quantity of pathogen at each time step and for each test is measured by the Wilcoxon test with a threshold significance set at 5% (p value less than or equal to 0.05), and a trend threshold set at 10% (p-value less than or equal to 0.1).
  • the peptone water necessary for the preparation and counting of the cultures, and the tap water used are sterilized at 121 ° C for 20 minutes to avoid the presence of undesirable microorganisms.
  • Frozen isolates of pathogens S. enterica or E. coli , are thawed and then dissolved in a culture medium for heart-brain infusion with yeast extracts (3.7% medium for heart-brain infusion (Merck, Darmstadt, Germany ); 0.1% yeast extracts (Merck)), at 37 ° C for 24 hours, under aerobic conditions and without stirring.
  • yeast extracts 3.7% medium for heart-brain infusion (Merck, Darmstadt, Germany ); 0.1% yeast extracts (Merck)
  • the inocula are then diluted in peptone water (0.85% sodium chloride (VWR, Langenfeld, Germany); 0.1% peptone (G-Science, Saint Louis, United States)) to reach an initial concentration of 1 x 10 2 CFU / mL.
  • the initial concentrations of S. enterica or E. coli are checked by counting according to the Pasteurian method on agar for heart-brain infusion with yeast extracts, after incubation for 24 hours at 37 ° C.
  • the mix of NOL bacteria (NOL01, NOL02, NOL03 and NOL11) is mixed manually for 5 minutes in the food composition to be tested so as to achieve a minimum concentration of 1 x 10 6 CFU / g in Bacillus subtilis (NOL01-NOL03) and a minimum of 1 x 10 6 CFU / g in Lactococcus lactis (NOL11).
  • NOL01-NOL03 Bacillus subtilis
  • NOL11 Lactococcus lactis
  • sterile smooth polystyrene petri dishes flat and 14 cm in diameter (Sarstedt, Nümbreccht, Germany) are used, considered representative of the surfaces encountered in a cattle feed factory.
  • the dishes are swabbed manually (Sodibox, Névez, France) with 1 mL of solution containing S. enterica or E. coli at 2 x 10 4 CFU / mL, to reach a target concentration of approximately 1.3 x 10 6 CFU / m2 of surface, thus representing a surface tested for contamination by pathogens.
  • the box is put to dry under the Microbiological Safety Station (PSM) then swabbed again by turning it a quarter of a turn clockwise.
  • PSM Microbiological Safety Station
  • composition of bacteria according to the invention was dissolved in 1 ml and applied according to the same experimental protocol, namely swabbing until the 1 ml of solution corresponding to the dose was used up.
  • composition of bacteria according to the invention present in the 15 g of food matrix (tests A, B, C, D)
  • Each contaminated surface is the subject of an application of 15g of food matrix (control or test) distributed over the dish by horizontal agitation in order to obtain a homogeneous layer over the entire surface.
  • the cans will then be sprayed manually (Style 1.5, Matabi) with 8 mL of physiological water, thus modeling an incorporation of water during the manufacturing process.
  • the boxes are placed in an oven at 25 ° C for a period of 4 hours in order to model the action of the food composition containing at least one Bacillus in a retention zone recognized as favorable to the development of pathogens by the skilled in the art.
  • the petri dish closed by a lid and a paraffin seal (Parafilm, Sigma-Aldricht) is then tilted vertically until the complete elimination of the food composition at the level of the sampling area on the surface ie the upper 75% of the total surface (the petri dish in vertical position), or up to 4.2cm in height.
  • Figure 1 shows the device used.
  • a surface swab (Sodibox, Névez, France) is carried out at the level of the sampling surface, ie the upper 75% of the total surface of the petri dish in vertical position, for each dish according to standard NF EN ISO 18593, before being stored at 4 ° C for analysis.
  • the samples are analyzed for the enumeration of S. enterica or E. coli according to at least one of the following reference methods:
  • the effect of the treatment with the food according to the invention on the difference in the evolution of the quantity of pathogen after 24 hours is measured by the Wilcoxon test with a threshold significance set at 5% (p value less than or equal to 0.05), and a trend threshold set at 10% (p-value less than or equal to 0.1).
  • composition according to the invention has a significant effect on the reduction of pathogenic bacteria present on a surface. It even seems notable that the more complex the feed, the greater the efficiency;

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, ladite souche étant dispersée dans ladite composition alimentaire, pour la décontamination ou la prévention de la contamination des surfaces.

Description

    Procédé de décontamination
  • L’invention concerne un procédé de décontamination, notamment de décontamination des chaines de production d’aliments.
  • La prévention, la limitation voire l’éradication de la contamination croisée des denrées alimentaires lors de leur préparation ou encore de leur stockage est un challenge pour l’industrie agro-alimentaire. En particulier, Salmonella spp et Escherichia coli sont les bactéries les plus dangereuses à la fois pour l’homme ou pour les animaux lorsqu’elles sont retrouvées dans l’alimentation, soit parce qu’elles provoquent des pathologies graves, soit car un portage asymptomatique peut être une source d'épidémies d'origine alimentaire chez l'homme.
  • Plusieurs voies de contamination des denrées alimentaires sont connues comme le manque de traitement thermique des aliments, des conditions de stockage inappropriées, la contamination pendant le transport, la contamination par des rongeurs, des oiseaux, ou des insectes, le développement de condensation, la présence de poussières contaminées, l'hygiène du personnel, mais aussi la contamination via la multiplication des pathogènes dans tous milieux chauds et humides ou via la dissémination et la présence persistante de ces pathogènes dans les installations de stockage des aliments.
  • Aussi, il existe un besoin de décontaminer les locaux, les machines, le matériel voire les denrées elles-mêmes.
  • On connaît déjà de l’état de la technique différentes techniques permettant de décontaminer les locaux et les chaines de fabrications d’aliments, utilisant des acides organiques ou des composés chimiques. De tels composés ne sont toutefois plus souhaités par le consommateur qui recherche des produits naturels et sans danger pour la santé. De plus, certains de ces composés accélèrent l’usure des outils industriels.
  • Aussi, l’industrie agroalimentaire s’est tournée vers d’autres moyens de décontamination.
  • Afin de limiter les contaminations, il a été proposé de fournir aux animaux des compositions probiotiques ingérées via l’aliment, et limitant, au sein même de l’animal, le développement de bactéries pathogènes potentiellement présentes dans les aliments, et ainsi limiter voire éradiquer les risques de maladie. C’est le cas notamment de la demande WO2009/155711 qui décrit l’utilisation de composés sécrétés par des bactéries lactiques, en vue de prévenir les infections par des salmonelles ou des Escherichia coli. Toutefois, de telles méthodes ne traitent que les conséquences des contaminations et ne s’attaquent pas aux origines de la contamination.
  • Toutefois, de telles compositions ne semblent pas efficaces pour permettre une hygiène et une pression de contamination à un niveau en-dessous de tout risque pour la santé des animaux et des humains.
  • De plus, de telles compositions ne répondent pas au besoin de prévention ou de décontamination des produits finis, des outils et chaînes de production, zones de stockage ou encore voies d’acheminement des produits alimentaires.
  • Aussi, l’invention a-t-elle pour but de pallier les inconvénients de l’art antérieur.
  • Un des buts de l’invention est de proposer un moyen efficace de limiter la pression de contamination, notamment par les salmonelles ou les E. coli, non seulement dans les aliments, mais aussi dans les bâtiments et les matériels où et avec lesquels sont fabriqués, stockés et transportés lesdits aliments.
  • Aussi, l’invention concerne-t-elle l’utilisation d’une composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, ladite souche étant dispersée dans ladite composition alimentaire, pour la décontamination ou la prévention de la contamination des surfaces, en particulier les surfaces des dispositifs de préparation, de stockage et d’acheminement d’un aliment, c’est-à-dire des dispositifs destinés à recevoir des aliments, notamment d’un aliment pour animaux.
  • L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que l’utilisation d’un aliment comprenant une souche de bactérie du genre Bacillus , notamment de l’espèce Bacillus subtilis, permet non seulement de prévenir le développement de bactéries pathogènes ou indésirables au sein dudit aliment, mais que cet aliment lui-même peut être utilisé en prévention de la contamination, ou comme produit décontaminant des surfaces avec lequel il est en contact.
  • La composition selon l’invention est plus avantageuse que les solutions liquides pour l’application de bactéries proposées dans l’art antérieur car elle permet de décontaminer l’intégralité des surfaces de dispositifs destinés à recevoir des aliments, ce que ne permettent pas les applications liquides de solutions de décontamination, comme l’atomisation, la pulvérisation, brumisation, nébulisation ou thermonébulisation ou encore la vaporisation, à l’intérieur des chaines de production. Il est bien évidemment inconcevable de remplacer l’aliment dans la chaine de production par un flux de liquide, sans endommager ladite chaine de production d’aliments pour animaux. Aussi, le seul moyen de décontaminer de telles chaines de production consiste à utiliser des trappes ou des ouvertures localisées à certains endroits spécifiques.
  • Toutefois, du fait de certaines sections hermétiques et impossible d’accès pour l’utilisateur, les applications de liquides par pulvérisation, atomisation ou vaporisation, ne permettent pas la diffusion des bactéries au niveau de l’ensemble du circuit de transit du produit alimentaire. Seule la composition alimentaire pourrait parcourir l’ensemble du réseau de production. Il est donc avantageux d’y intégrer des bactéries exerçant un pouvoir décontaminant.
  • En outre, la production d’aliments n’est pas arrêtée lors de la décontamination puisque le produit alimentaire exerce un pouvoir décontaminant lors de sa fabrication, alors qu’une décontamination avec une solution liquide nécessite l’arrêt de la chaine de production, et éventuellement son séchage avant la remise en service.
  • Aussi, économiquement, l’utilisation de la composition selon l’invention est-elle avantageuse en termes de production et de rendement, puisque les surfaces des dispositifs sont décontaminées lors de la fabrication et non pas à l’arrêt.
  • Un autre avantage de la composition selon l’invention par rapport aux applications liquides est de fournir en même temps que les bactéries positives, des nutriments (issus de l’aliment) permettant le développement de ces dernières. Dès lors, les bactéries positives pourront se développer et exercer un pouvoir de décontamination supérieur sur des bactéries pathogènes.
  • Dans l’invention, on utilisera uniformément les termes « aliment » ou « composition alimentaire » pour désigner le même produit.
  • Dans l’invention lorsqu’il est fait référence à une bactérie pathogène, il est également fait référence à une bactérie indésirable.
  • Dans l’invention, un aliment ou une composition alimentaire est utilisé comme agent de prévention ou de décontamination. Cet aliment est composé d’une ou plusieurs substances susceptibles d'être ingérées et digérées, et de servir à la nutrition d'un être vivant. Aussi, l’aliment qui est défini dans l’invention peut prendre toutes les formes possibles solides ou semi-solides, comme des poudres, dont des farines, des granulés, des miettes, des galets, des bolus, des comprimés, des pâtes, des gels considérés par l’homme du métier du domaine en cause comme étant des solides, des aliments réhydratés, ... Toutefois, la forme de l’aliment de l’invention n’est en aucun cas une forme liquide ou un liquide destiné à la boisson.
  • L’aliment selon l’invention est donc constitué d’une ou plusieurs substances qui ont un apport nutritif pour l’homme ou l’animal. Il peut donc s’agir de substances constituées ou essentiellement constituées de glucides, de lipides, de protéines, ou de minéraux, ou d’un mélange deux à deux de ceux-ci, ou d’un mélange trois à trois de ceux-ci, ou un mélange de tous ceux-ci. L’aliment peut être un simple mélange d’éléments simples (lipides, glucides, protéines, minéraux), une ou plusieurs matières premières, c’est-à-dire des produits initiaux issus de l’agriculture (tels que des fruits, des feuilles, des graines, des tiges, des écorces ou encore des racines, etc...) ou issus d’extraction minière (tels que les argiles, les carbonates, etc...), à l’état brut, semi-transformé ou transformé, ou un produit plus complexe comme des produits dérivés des animaux, (chairs, organes mous, os, cartilages...), des produits dérivés de végétaux (fibres, graines, fleurs, racines, etc...) ou encore des coproduits dérivés de l’industrie agro-alimentaire (lactosérum fromager, drêches de brasseries, etc...), le tout pouvant éventuellement être complété d’additifs alimentaires et/ou d’auxiliaires technologiques. Aussi, toutes les formes de produits consommables par l’homme ou l’animal disponibles sur le marché correspondent à l’aliment décrit dans l’invention. Il est à noter que les aliments susmentionnés peuvent, bien que consommables, ne pas être consommés après utilisation selon l’invention, pour diverses raisons (ex : lots de rinçage).
  • L’aliment utilisé dans le cadre de l’invention comprend au moins une souche de bactérie du genre Bacillus , notamment de l’espèce Bacillus subtilis. Cela signifie qu’une ou plusieurs bactéries de ladite souche se retrouvent dans ledit aliment, notamment sous une forme dispersée, de manière plus ou moins homogène. Il est possible de disperser des bactéries d’une souche au sein de l’aliment en opérant un simple mélange de sorte que les bactéries de la souche soient réparties de manière uniforme de la surface de l’aliment jusqu’au cœur de celui-ci. Pour obtenir cette dispersion, une étape de chauffage, d’humidification, de broyage, ou tout autre type de prétraitement, c’est-à-dire de traitement préalable à la mise en œuvre de l’invention, seul ou en combinaison, peuvent être jugés nécessaires par l’homme du métier.
  • Avantageusement, on parlera d’une dispersion homogène de sorte que macroscopiquement les bactéries de la souche de Bacillus sont présentes dans toute la matière de l’aliment de sa surface jusqu’au cœur de celui-ci, de sorte qu’en moyenne une bactérie ou un groupe de bactéries soit équidistant d’une autre bactérie ou d’un autre groupe de bactéries et de sorte qu’il soit garanti qu’une concentration minimale de bactéries peut être mesurée par prélèvement aléatoire dans l’aliment.
  • Par « souche de bactérie », on entend dans l’invention l’ensemble des individus (bactéries) issus de la multiplication d’une colonie bactérienne elle-même issue d’un isolement par repiquage, cet ensemble étant essentiellement homogène, c’est-à-dire que la très grande majorité des bactéries qui composent la souche ont le même génotype. En d’autres termes, une souche est une partie d'une espèce bactérienne différente des autres bactéries de la même espèce par une différence mineure mais identifiable. Une souche est également définie comme une population de bactéries qui descend d'un seul organisme ou de la culture isolat pur. Les souches d'une même espèce peuvent différer légèrement les unes des autres à bien des égards.
  • Par « au moins une souche de bactérie du genre Bacillus », il est défini dans l’invention que l’aliment peut contenir une seule souche de bactérie selon la définition ci-dessus, ou deux, ou trois ou plus de souches de bactéries, toutes ces souches, bien que les espèces puissent différer, appartenant au genre Bacillus.
  • Il est important de noter qu’il n’est pas nécessaire de prendre des précautions particulières lors de la fabrication de l’aliment selon l’invention, en particulier des précautions bactériologiques. En effet, puisque l’aliment comprend des bactéries du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, ledit aliment ne nécessite pas que les substances nutritives qui constituent l’aliment soient elles-mêmes décontaminées. En tout état de cause, il est toutefois essentiel que l’aliment ne contienne pas d’agent antibactérien (bactériostatique ou bactériolytique) afin de ne pas tuer les bactéries du genre Bacillus contenues dans ledit aliment.
  • L’aliment décrit ci-dessus peut donc, dans le cadre de l’invention, être utilisé pour décontaminer ou prévenir la contamination de surfaces. Cela signifie que l’aliment susmentionné est capable, lorsqu’il est appliqué sur ladite surface qui est contaminée, d’éliminer une contamination bactérienne, et en particulier d’éliminer une contamination bactérienne susceptible de causer des désordres chez l’homme ou l’animal, telles qu’une contamination par des salmonelles ou des E . coli. Cette décontamination peut être totale, de sorte qu’une fois l’aliment selon l’invention est mis en contact avec la surface contaminée, il en résulte que les bactéries de type salmonelles ou E. coli finissent par disparaître. La décontamination peut également être partielle, c’est-à-dire que la mise en contact de l’aliment selon l’invention avec une surface contaminée n’éliminera pas la totalité des salmonelles ou des E. coli présentes, mais maintiendra ou réduira leur nombre de sorte que la quantité de salmonelles ou des E. coli sera telle queles risques pour la santé humaine ou animale seront limités.
  • L’aliment peut également prévenir une contamination, ce qui signifie que si une surface non contaminée, par exemple par des salmonelles ou des E. coli , est dans un premier temps traitée, ou mise en contact avec l’aliment selon l’invention, lorsque dans une second temps la surface sera mise en présence de salmonelles ou d’E. coli, ces dernières ne pourront pas se développer de sorte à devenir si nombreuses qu’elles représenteraient un risque pour la santé animale ou humaine ou en cas de développement avéré de ces bactéries pathogènes ou indésirables, ce développement sera moindre que sans l’aliment selon l’invention.
  • Aussi, la décontamination susmentionnée peut être assimilée à un « nettoyage » d’une surface contaminée, alors que la prévention de la contamination peut être assimilée à une « protection » contre une contamination, ou contre l’expansion d’une contamination résiduelle ou minime déjà présente.
  • Dans l’invention, il est fait référence à la prévention de la contamination ou la décontamination de surface. On entend ici par surface, toutes les surfaces internes ou externes se trouvant dans un bâtiment où un produit alimentaire est fabriqué, notamment une chaine de fabrication, ou dans un bâtiment où il est utilisé, notamment une vis d’alimentation en élevage. Cela inclut donc, sans pour autant être limitatif, les murs, les fenêtres, les portes, les plafonds du bâtiment, y compris les différents moulages, plaintes, poutres, trappes, et tous autres éléments constitutifs du bâtiment qui pourraient être apparents. Cela inclut également, sans pour autant être limitatif, toutes les surfaces directement en contact avec l’aliment, internes ou externes, des dispositifs tels que par exemple des tubes, des silos, des cônes de stockage ou de guidage, des presses, des broyeurs, des convoyeurs à vis ou à tapis, des installations de transfert pneumatique, des refroidisseurs verticaux ou horizontaux, des mélangeurs et leurs installations de dosage telles que des verse-en-sacs, des malaxeurs, des fosses de réception et leurs filtres, des systèmes de chargement vrac et leurs trappes de déchargement, des sableuses, des tamiseurs, des dispositifs pour émietter (émietteurs), des dispositifs pour émotter (émotteurs), des préleveurs automatiques, des dispositifs pour enrober (enrobeurs), des pulvérisateurs, des extrudeurs, des fours, des cuiseurs, des extracteurs, des réfrigérateurs, des étuves, etc., l’ensemble de ces dispositifs étant considéré individuellement et avec leurs pièces constitutives.
  • Avantageusement, l’invention concerne l’utilisation de la composition alimentaire susmentionnée, ladite composition comprenant en outre au moins une souche de bactérie lactique.
  • Les inventeurs ont remarqué que l’aliment que l’on utilise pour la décontamination ou la prévention de la contamination tel que défini dans l’invention est d’autant plus efficace si l’on combine au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, et au moins une souche de bactérie lactique.
  • Aussi, l’invention concerne avantageusement l’utilisation d’une composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, et au moins une souche de bactérie lactique, lesdites souches étant dispersées dans ladite composition alimentaire, pour la décontamination ou la prévention de la contamination des surfaces, en particulier les surfaces des dispositifs de préparation, de stockage et d’acheminement d’un aliment, notamment d’un aliment pour animaux.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, où ladite souche de bactérie est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire.
  • Par « ufc » ou « unité formant colonie » ou encore « cfu » (colony forming unit en anglais), on entend dans l’invention une unité utilisée pour estimer le nombre de bactéries viables dans un échantillon. La viabilité est définie comme la capacité de se multiplier, c’est-à-dire se diviser. Le comptage avec des unités formant colonie nécessite la culture des microorganismes et ne dénombre ainsi que les cellules viables.
  • Dans ce mode de réalisation avantageux, la composition selon l’invention est sous forme déshydratée ou non aqueuse (sous forme solide ou semi-solide), et ladite composition comprend de préférence de 104 à 1011 bactéries viables de Bacillus par g de composition, ou ufc par g de composition, et cela pour chacune des souches lorsque la composition comprend au moins deux souches.
  • Dans l’invention, « de 104 à 1011 bactéries viables, ou cfu » signifie : environ 104, environ 5.104, environ 105, environ 5.105, environ 106, environ 5.106, environ 107, environ 5.107, environ 108, environ 5.108, environ 109, environ 5.109, environ 1010, environ 5.1010 ou environ 1011 bactéries viables.
  • Les bactéries viables s’entendent en gramme de culture bactérienne. L’homme du métier sait aisément comment déterminer ce nombre de bactéries, notamment par comptage soit manuel (en utilisant une lame de Malassez), ou en utilisant un compteur automatique de cellules, ou par dilution puis ensemencement sur gélose et comptage, notamment visuel, des colonies, ou encore par mesure de la densité optique.
  • Dans un mode de réalisation avantageux où la composition alimentaire comprend à la fois des bactéries du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, et des bactéries lactiques, chacune de ces bactéries est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire, notamment à raison de 104 à 1011 ufc par g de composition alimentaire.
  • De manière avantageuse, ladite une ou plusieurs souches de bactéries du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis, sont sous forme végétative ou sous forme sporulée, ou les deux.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation telle que définie précédemment, où ladite souche de bactérie du genre Bacillus est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL01, déposée à la Collection nationale des cultures de microorganismes (CNCM, 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France) le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4606,
  • - la souche NOL02, déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I-5043, et
  • - la souche NOL03, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4607,
  • ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03,
  • ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL susdécrites ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • Par « une souche de Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU en anglais) que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03 » ou par « une souche similaire » à NOL01, ou NOL02, ou NOL03, ou encore par « les souches ayant un génome très similaire » ou « très proche » à NOL01, ou NOL02, ou NOL03, on entend dans l’invention toutes les souches de Bacillus, notamment de Bacillus subtilis , ayant au moins 97% de séquences génomiques similaires avec la séquence de gènes codant l’ARNr 16S de la souche NOL01, ou NOL02, ou NOL03.
  • En biologie, l’unité taxonomique opérationnelle (OTU) est l’unité de base de l'analyse phylogénétique utilisée pour regrouper des individus phylogénétiquement proches. Les séquences d'ADN d'un gène donné, qui sert alors de marqueur taxonomique, sont regroupées par partitionnement de données (clustering) en fonction de leur identité. Un gène principalement utilisé (gène de référence) est l'ARNr 16S pour les bactéries. Ainsi, les OTU sont définies à partir d'un seuil d’identité choisi par l’homme du métier qui est communément de 97%.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, où ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL11, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4609,
  • - l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle que ladite souche NOL11,
  • - et un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire de la souche NOL11 ou des souches appartenant à ladite OTU.
  • Aussi, dans un mode de réalisation avantageux, l‘invention concerne l’utilisation susmentionnée, où ladite composition alimentaire comprend :
  • - au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, choisie parmi les souches NOL01, NOL02, ou NOL03, ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même OTU que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03, et
  • - au moins une souche de bactérie lactique, choisie parmi la souche NOL011, ou l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même OTU que ladite souche NOL11,
  • - et un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, où ladite composition comprend au moins l’une quelconque des combinaisons de bactéries suivantes :
  • - NOL01 et NOL11,
  • - NOL02 et NOL11,
  • - NOL03 et NOL11,
  • - NOL01, NOL02 et NOL11,
  • - NOL01, NOL03 et NOL11,
  • - NOL02, NOL03 et NOL11,
  • - NOL01, NOL02, NOL03 et NOL11.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne en outre l’utilisation susmentionnée où ladite composition comprend au moins l’une quelconque des combinaisons de bactéries suivantes :
  • NOL01 NOL02 NOL03 NOL11 OTU NOL01 OTU NOL02 OTU NOL03 OTU NOL11
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  • De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, où lesdites surfaces sont contaminées ou contaminables par des entérobactéries, en particulier par des souches de genre Salmonella ou Escherichia, notamment des bactéries des espèces Salmonella enterica ou Escherichia coli.
  • La composition alimentaire susmentionnée est particulièrement utile pour la décontamination, ou la prévention de la contamination, ou encore la maitrise de la contamination de surfaces contaminées ou qui pourraient être contaminées par des entérobactéries.
  • La famille des entérobactéries se définit par les caractères suivants :
  • - bacilles à Gram négatif (2 à 4 microns de long sur 0,4 à 0,6 microns de large),
  • - bactéries mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles,
  • - poussant sur milieux de culture ordinaires,
  • - bactéries essentiellement aérobies, voire anaérobies facultatives,
  • - bactéries fermentant le glucose avec ou sans production de gaz,
  • - bactéries réduisant les nitrates en nitrites,
  • - bactéries oxydase négatif.
  • La famille des entérobactéries est une famille très hétérogène pour ce qui est de la pathogénie et de l’écologie. Les espèces qui composent cette famille sont en effet soit parasites (Shigella , Yersinia pestis), soit commensales (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella sp), soit encore saprophytes (Serratia sp , Enterobacter sp).
  • Les Salmonella spp. sont des entérobactéries dont les caractères essentiels sont de ne pas fermenter le lactose et de ne pas produire d'uréase. Les Salmonella spp. sont des parasites de l'homme, des mammifères (rongeurs), des oiseaux (volailles) et des animaux à sang froid (reptiles). Elles sont responsables, après pénétration par voie orale, de nombreuses infections (salmonelloses), notamment des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes (maladies à déclaration obligatoire n° 1), des gastro-entérites et des toxi-infections alimentaires collectives (maladies à déclaration obligatoire n° 2).
  • Le principal mode de contamination chez l'homme est l'ingestion à partir de l'eau (S almonella enterica sérotype Typhi en particulier) ou des aliments (ex. produits laitiers, œufs, viande).
  • Les Salmonella spp. non typhiques (Salmonella enterica sérotype Typhimurium, sérotype Enteritidis, sérotype Dublin, etc…), ubiquitaires, sont ingérées avec une boisson ou un aliment contaminé (cas sporadiques) ou après contamination fécale-orale, souvent par les mains sales (épidémies de collectivités). Il peut s'ensuivre des infections purement digestives, les gastro-entérites. Celles-ci se traduisent par de la diarrhée, des vomissements et de la fièvre. Leur évolution est en général bénigne. Certains sujets restent porteurs sains de Salmonella spp. dans leur tube digestif et peuvent dans certaines circonstances (profession de l'alimentation par exemple) disséminer leur souche.
  • Certaines souches d'E. coli sont associées à des diarrhées et sont clairement entéropathogènes (EPEC) grâce à des propriétés d'adhésion particulières. Elles ne sont ni sécrétrices d'entérotoxine, ni entéro-invasives. Elles forment des pili, qui forment des « faisceaux » (« bundle ») qui se fixent sur les villosités des entérocytes. Les villosités sont progressivement détruites (« attachement-effacement »). Le cytosquelette des entérocytes est altéré et il se produit très rapidement une fuite hydrique dont le mécanisme biochimique n'est pas complètement élucidé.
  • Dans un autre aspect, l’invention concerne une méthode de décontamination ou de prévention de la contamination de surfaces d’un dispositif destiné à recevoir des aliments, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact d’une composition alimentaire avec les surfaces dudit dispositif, ladite composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, ladite souche étant dispersée dans ladite composition alimentaire.
  • Dans la méthode, ou l’utilisation susmentionnée, on entend par « dispositif destiné à recevoir des aliments » tout dispositif permettant de préparer, acheminer ou stocker des aliments, y compris les murs, le sol, les fenêtres, et le plafond d’un local ou d’un bâtiment contenant un ou des dispositifs permettant de préparer, acheminer ou stocker des aliments.
  • L’objectif est donc de mettre en contact un dispositif destiné à recevoir des aliments en vue de le décontaminer ou de le protéger d’une contamination potentielle, voire de limiter le développement d’une contamination existante. La mise en contact d'une composition alimentaire avec les surfaces à décontaminer, ou pour lesquelles une prévention de la contamination est souhaitée peut se faire à l'aide d'outils facilitant l'application, notamment à l’aide d’outils de type sableuse.
  • L’invention concerne avantageusement la méthode susmentionnée, où ladite composition alimentaire comprend en outre au moins une souche de bactérie lactique.
  • Aussi l’invention concerne une méthode de décontamination ou de prévention de la contamination de surfaces d’un dispositif destiné à recevoir des aliments, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact d’une composition alimentaire avec les surfaces dudit dispositif, ladite composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, et une souche de bactérie lactique, lesdites souches étant dispersées dans ladite composition alimentaire.
  • Dans un mode de réalisation avantageux, l’invention concerne la méthode susmentionnée, où ladite souche de bactérie est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire.
  • Dans ce mode de réalisation avantageux, la composition selon l’invention est sous forme déshydratée ou non aqueuse (sous forme solide ou semi-solide), et ladite composition comprend de préférence de 104 à 1011 bactéries viables de Bacillus par g de composition, ou ufc par g de composition, et cela pour chacune des souches lorsque la composition comprend au moins deux souches.
  • Dans l’invention, « de 104 à 1011 bactéries viables, ou cfu » signifie : environ 104, environ 5.104, environ 105, environ 5.105, environ 106, environ 5.106, environ 107, environ 5.107, environ 108, environ 5.108, environ 109, environ 5.109, environ 1010, environ 5.1010 ou environ 1011 bactéries viables.
  • Dans un mode de réalisation avantageux où la composition alimentaire comprend à la fois des bactéries du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, et des bactéries lactiques, chacune de ces bactéries est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire, notamment à raison de 104 à 1011 ufc par g de composition alimentaire.
  • De manière avantageuse, ladite une ou plusieurs souches de bactéries du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis, sont sous forme végétative ou sous forme sporulée, ou les deux.
  • Avantageusement, l’invention concerne la méthode susmentionnée, où ladite souche de bactérie du genre Bacillus est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL01, déposée à la Collection nationale des cultures de microorganismes (CNCM, 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France) le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4606,
  • - la souche NOL02, déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I-5043, et
  • - la souche NOL03, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4607,
  • ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03,
  • ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • Avantageusement, l’invention concerne la méthode susmentionnée, où ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi l’une des souches suivantes : la souche NOL11, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4609, et l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle que ladite souche NOL11,
  • ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • L’invention concerne également une composition alimentaire dans laquelle est dispersée au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne la composition alimentaire susmentionnée, dans laquelle est dispersée au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis , et au moins une souche de bactérie lactique.
  • De manière encore plus avantageuse, la composition susmentionnée est telle que ladite souche de bactérie du genre Bacillus est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL01, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4606,
  • - la souche NOL02, déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I-5043, et
  • - la souche NOL03, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4607,
  • ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03,
  • ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches.
  • En outre, avantageusement, la composition est telle que ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi l’une des souches suivantes : la souche NOL11, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4609, et l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle que ladite souche NOL11, ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne la composition alimentaire susmentionnée, où ladite souche de bactérie est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire, c’est-à-dire où ladite au moins une souche de Bacillus est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire, et le cas échéant, ladite souche de bactérie lactique est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire.
  • De manière avantageuse, ladite une ou plusieurs souches de bactéries du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis, est sous forme végétative ou sous forme sporulée, ou les deux.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne la composition alimentaire telle que définie précédemment, où ladite souche de bactérie du genre Bacillus est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL01, déposée à la Collection nationale des cultures de microorganismes (CNCM, 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France) le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4606,
  • - la souche NOL02, déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I-5043, et
  • - la souche NOL03, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4607,
  • ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03,
  • ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • De manière avantageuse, l’invention concerne la composition alimentaire susmentionnée, où ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi l’une des souches suivantes :
  • - la souche NOL11, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4609,
  • - l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle que ladite souche NOL11,
  • - et un mélange de deux ou plusieurs de ces souches, c’est-à-dire des souches NOL ou des souches appartenant auxdites OTU.
  • L’invention sera mieux comprise à la lumière des exemples et des figures qui suivent.
    • Brève description des figures
  • la figure 1 représente schématiquement un dispositif après application des compositions alimentaires sur des boîtes contaminées avec X la zone de prélèvement et Y la zone de sédimentation de la composition.
  • la figure 2 représente un graphique montrant la quantité de Salmonella Typhimurium en Log10 UFC/g en fonction du temps en heure pour une composition de type Aliment pour porc, comprenant (B) ou non (A) les bactéries Bacillus et lactiques (Essai 1).
  • la figure 3 représente un graphique montrant la quantité de E. coli en Log10 UFC/g en fonction du temps en heure pour une composition de type Aliment pour porc, comprenant (B) ou non (A) les bactéries B acillus et lactiques (Essai 3).
  • la figure 4 représente un graphique montrant la quantité de Salmonella Enteritidis en Log10 UFC/g en fonction du temps en heure pour une composition de type maïs broyé, comprenant (B) ou non (A) les bactéries Bacillus et lactiques (Essai 5).
  • la figure 5 représente un graphique montrant la quantité de Salmonella Typhimurium en Log10 UFC/g en fonction du temps en heure pour une composition de type tourteau de soja, comprenant (B) ou non (A) les bactéries Bacillus et lactiques (Essai 8).
  • la figure 6 représente un graphique montrant l’évolution après 24h de la quantité de Salmonella Typhimurium en Log10 UFC/g en fonction du temps après l’application d’une composition alimentaire, comprenant (1.) ou non (2.) les bactéries selon l’invention (NOL01-03 et NOL11), sur 6 séries d’essais : A et B matrice maïs broyé, C et D matrice aliment truie, ou E et F sans matrice alimentaire.
    • Exemples
  • Exemple 1 : test s in vitro
  • L’objectif de ces expériences était de tester la capacité de la composition alimentaire selon l’invention à prévenir, diminuer ou contrôler l’expansion d’entérobactéries in vitro.
    1. Préparation des inocul a
  • Avant utilisation, l’eau peptonée nécessaire à la préparation et au dénombrement des cultures, et l’eau du robinet utilisée ont été stérilisée à 121°C durant 20 minutes pour éviter la présence de microorganismes indésirables.
  • Des isolats congelés de pathogènes, S. enterica ou E. coli, ont été décongelés puis mis en solution dans un milieu de culture pour infusion cœur- cervelle avec extraits de levures (3.7% de milieu pour infusion cœur-cervelle (Merck, Darmstadt, Allemagne) ; 0.1% d’extraits de levures (Merck)) à 37°C pendant 24 heures dans des conditions aérobies et sans agitation. Les inoculums ont ensuite été dilués dans l’eau peptonée (0.85% chlorure de sodium (VWR, Langenfeld, Allemagne) ; 0.1% peptone (G-Science, Saint Louis, États-Unis)) pour atteindre une concentration initiale de 1 x 106 UFC/mL.
  • Les concentrations initiales en S. enterica ou E. coli ont été mesurées par dénombrement selon la méthode pasteurienne sur gélose pour infusion cœur-cervelle avec extraits de levures, après une incubation de 24h à 37°C.
    1. Préparation des matrices alimentaires
  • Pour la préparation des échantillons comprenant les souches NOL01, NOL02, NOL03 et NOL11, les bactéries ont été mélangées durant 5 minutes (TopMix94323, Heidolph) dans la préparation alimentaire de manière à atteindre une concentration minimum de 1 x 106 UFC/g en Bacillus subtilis (NOL01-NOL03) et minimum 1 x 106 UFC/g en Lactococcus lactis (NOL11).
  • Les différentes matrices ont ensuite fait l’objet ou non d’une incorporation en eau correspondant aux recommandations des fabricant d’aliment quant à leur utilisation :
  • Préparation alimentaire Facteur massique d’incorporation en eau pour obtenir la préparation, base matrice = 1
    Aliment porc 2.75
    Maïs broyé 0.00
    Tourteau de soja 0.00
  • L’aliment porc utilisé dans cet exemple est un aliment dont la composition est donnée dans le tableau suivant :
  • Composant s Taux d’incorporation
    (en masse par rapport
    à la masse totale de de l’aliment)
    Blé 50.77%
    Pois 14.38%
    Son de blé 12.92%
    Maïs 9.85%
    Tourteau de tournesol 5.13%
    Sel 2.00%
    Gluten de blé 2.00%
    Carbonate de calcium 1.63%
    Eau 0.50%
    Sulfate de Lysine 70% 0.43%
    Prémélange en vitamine et minéraux 0.20%
    Sulfate de sodium 0.10%
    L-thréonine 0.07%
    DL-méthionine 0.02%
  • Pour chaque échantillon, de 2.5 g d’aliment ont été pesés (Precision Series, Fisher Scientific), dans un pot stérile de 120 mL (Sarstedt, Nümbreccht, Allemagne) à partir d’un même pool préparé. Un pot correspondant à un pas de temps de mesure des pathogènes dans un échantillon. Les échantillons ont ensuite fait l’objet d’une incorporation d’eau stérilisée pour modéliser des conditions dégradées de process, stockage et d’utilisation, à raison de 2 mL d’eau stérilisée par pot.
  • 250µL d’inoculum de S. enterica ou E. coli ont été ajoutés à l’aide d’une pipette (Finnpipette F2, Thermoscientific) aux échantillons traités et aux échantillons témoins. Chaque échantillon a été vortexé durant 1 minute pour obtenir un mélange homogène (TopMix94323, Heidolph). Les échantillons ont ensuite été incubés en conditions aérobies dans un incubateur (BE500, Memmert) durant une période allant jusqu’à 7 jours à 25°C pour modéliser la température ambiante en élevage, en usine de production, ou dans une zone de stockage et de transport.
  • Pour des raisons techniques lié à la réalisation d’une partie des dénombrements en laboratoire d’analyse externe, les quantités de chaque matrice ont été multipliées par 10 lors de la réalisation de certaines expériences. Il s’agit donc pour chaque échantillon, de pots de 120 mL contenant 25g d’aliment, auquel on ajoute 20 mL d’eau stérilisée et 2,5 mL d’inoculum de S. enterica ou E. coli .
    1. Suivi des pathogènes
  • Le dénombrement des bactéries pathogènes a été effectué au temps 0 (T0), puis à différents pas de temps en fonction les expériences réalisées. À chaque temps, les échantillons ont été analysés pour le dénombrement de S. enterica ou E. coli selon au moins l’une des méthodes de référence suivante :
  • - Norme ISO 21528-2:2017 adaptée – Microbiologie alimentaire – Méthode horizontale de détection et de dénombrement des Enterobacteriaceae - Partie 2: Technique de comptage des colonies
  • - Norme ISO 6579-1:2017 Microbiologie alimentaire – Méthode horizontale de détection, dénombrement et sérotypage des Salmonella – Partie 1 : Détection de Salmonella spp.
  • - Norme ISO 16649-2:2001 Microbiologie pour l’alimentation humaine et l’aliment du bétail – Méthode horizontale de dénombrement des Escherichia coli beta-glucuronidase-positive - Partie 2: comptage des colonies à 44°C en utilisant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide.
    1. Analyse statistique des résultats
  • Au vu du faible effectif d’échantillons lors de chaque essai, l’effet du traitement avec l’aliment selon l’invention sur la quantité de pathogène à chaque pas de temps et pour chaque essai est mesuré par le test de Wilcoxon avec un seuil de significativité fixé à 5% (p valeur inférieure ou égal à 0.05), et un seuil de tendance fixé à 10% (p-valeur inférieure ou égale à 0.1).
    1. Synthèse des essais réalisés
  • Essai Matrice Pathogène Norme de dénombrement Échantillons par traitement
    1 Aliment porc Salmonella Typhimurium ISO 6579-1 :2017 5
    2 Aliment porc Salmonella Typhimurium ISO 21528-2 :2017 3
    3 Aliment porc Escherichia
    coli     		ISO 16649-2:2001 5
    4 Aliment porc Escherichia
    coli     		ISO 21528-2 :2017 3
    5 Maïs broyé Salmonella
    Enteritidis    		 ISO 21528-2 :2017 3
    6 Tourteau de soja Salmonella Typhimurium ISO 21528-2 :2017 6
    1. Synthèse des résultats d’essais
  • Essai Matrice Pathogène Temps final (heures) Effet produit au temps final (p-valeur de test) Différence moyenne Témoin - Essai
    ( Log 10 UFC/g)
    1 Aliment porc Salmonella Typhimurium 120 0.010 3.9
    2 Aliment porc Salmonella Typhimurium 120 0.100 2.1
    3 Aliment porc Escherichia
    coli     		48 0.060 3.1
    4 Aliment porc Escherichia
    coli     		120 0.100 1.3
    5 Maïs broyé Salmonella
    Enteritidis    		 48 0.100 3.6
    6 Tourteau de soja Salmonella Typhimurium 120 0.026 1.9
  • Les résultats sont présentés aux Figures 2 à 5.
  • Ces différents résultats in vitro mettent en évidence une différence de développement des pathogènes supérieure à 1 Log10 UFC/g grâce à l’utilisation des bactéries Bacillus et lactiques. Cet effet est également présent dans des matrices favorables au développement des entérobactéries, qui dans la pratique sont souvent à l’origine de nouvelles contaminations en cascade.
  • L’utilisation industrielle des bactéries Bacillus et lactiques dans des compositions alimentaires est donc prometteuse. En effet, la mise en contact de ces bactéries Bacillus et lactiques avec des surfaces de dispositifs de préparation, de stockage et d’acheminement d’un aliment par l’intermédiaire de compositions alimentaires comme défini dans l’invention va permettre une diffusion de ces bactéries Bacillus et lactiques sur lesdites surfaces de manière privilégiée, limitant ainsi la prolifération des entérobactéries et réduisant donc le risque de recontaminations ultérieures.
  • Exemple 2 : test sur surface
  • Objectif : mise en évidence d’un effet d’une composition alimentaire contenant au moins un Bacillus sur la maîtrise de la contamination d’une surface. Pour des raisons pratiques, ce protocole peut être adapté dans sa réalisation.
    1. Préparation des inocul a
  • Avant utilisation, l’eau peptonée nécessaire à la préparation et au dénombrement des cultures, et l’eau du robinet utilisée sont stérilisées à 121°C durant 20 minutes pour éviter la présence de microorganismes indésirables.
  • Des isolats congelés de pathogènes, S. enterica ou E. coli, sont décongelés puis mis en solution dans un milieu de culture pour infusion cœur-cervelle avec extraits de levures (3.7% de milieu pour infusion cœur-cervelle (Merck, Darmstadt, Allemagne) ; 0.1% d’extraits de levures (Merck)), à 37°C pendant 24 heures, dans des conditions aérobies et sans agitation. Les inoculums sont ensuite dilués dans l’eau peptonée (0.85% chlorure de sodium (VWR, Langenfeld, Allemagne) ; 0.1% peptone (G-Science, Saint Louis, États-Unis)) pour atteindre une concentration initiale de 1 x 102 UFC/mL.
  • Les concentrations initiales en S. enterica ou E. coli sont contrôlées par dénombrement selon la méthode pasteurienne sur gélose pour infusion cœur-cervelle avec extraits de levures, après une incubation de 24h à 37°C.
    1. Préparation des matrices alimentaires
  • Pour la préparation des échantillons Essai c’est-à-dire des compositions alimentaires selon l’invention, le mix de bactéries NOL (NOL01, NOL02, NOL03 et NOL11) est mélangé manuellement durant 5 minutes dans la composition alimentaire à tester de manière à atteindre une concentration minimum de 1 x 106 UFC/g en Bacillus subtilis (NOL01-NOL03) et minimum 1 x 106 UFC/g en Lactococcus lactis (NOL11). Pour chaque échantillon, 15 g de matrice alimentaire brute sont pesés (Precision Series, Fisher Scientific), dans un pot stérile de 40 mL (Sarstedt, Nümbreccht, Allemagne).
  • Pour la préparation des échantillons Témoins, 15 g de composition alimentaire brute à tester sont pesés (Precision Series, Fisher Scientific), dans un pot stérile de 40 mL (Sarstedt, Nümbreccht, Allemagne).
    1. Préparation des surfaces
  • Pour la préparation surfaces de test sont utilisées des boîtes de pétri stériles en polystyrène lisse, planes et de 14 cm de diamètre (Sarstedt, Nümbreccht, Allemagne), considérées représentatives des surfaces rencontrées en usine d’aliment du bétail.
  • Les boîtes sont écouvillonnées manuellement (Sodibox, Névez, France) avec 1 mL de solution contenant S. enterica ou E. coli à 2 x 104 UFC/mL, pour atteindre une concentration cible d’environ 1.3 x 106 UFC/m² de surface, représentant ainsi une surface testée pour la contamination en pathogènes. Entre chaque passage d’écouvillon, la boite est mise à sécher sous le Poste de Sureté Microbiologique (PSM) puis écouvillonnée à nouveau en la tournant d’un quart de tour dans le sens horaire.
  • L’opération est répétée jusqu’à étalement complet des 1mL de solution sur la boîte.
  • Dans le cadre des essais E et F sans composition alimentaire, la composition de bactéries selon l’invention a été mise en solution dans 1mL et appliquée selon le même protocole expérimental, à savoir écouvillonnage jusqu’à épuisement des 1mL de solution correspondant à la dose de la composition de bactéries selon l’invention présente dans les 15g de matrice alimentaire (essais A, B, C, D)
    1. Application des matrices alimentaires et mesures
  • Chaque surface contaminée fait l’objet d’une application de 15g de matrice alimentaire (témoin ou test) répartis sur la boite par agitation horizontale afin d’obtenir une couche homogène sur toute la surface. Les boîtes seront ensuite pulvérisées manuellement (Style 1.5, Matabi) avec 8 mL d’eau physiologique modélisant ainsi une incorporation d’eau au cours du procédé de fabrication. Puis, les boîtes sont mises à en étuve à 25°C pour une durée de 4h afin de modéliser l’action de la composition alimentaire contenant au moins un Bacillus au niveau d’une zone de rétention reconnue propice au développement des pathogènes par l’homme du métier.
  • Pour représenter l’effet d’une composition alimentaire contenant au moins un Bacillus sur la maîtrise de la contamination d’une surface à l’aide d’une sableuse en milieu industriel, la boîte de pétri fermée par un couvercle et une jointure en paraffine (Parafilm, Sigma-Aldricht) est ensuite inclinée verticalement jusqu’à l’élimination complète de la composition alimentaire au niveau la zone de prélèvement sur la surface i.e. les 75% supérieur de la surface totale la boîte de pétri en position verticale), soit jusqu’à 4.2cm de hauteur. La figure 1 représente le dispositif utilisé.
  • Pour chaque groupe témoin et traitement avec la composition selon l’invention, réalisés en paires, 8 boîtes sont réalisées afin de pouvoir mesurer l’évolution des pathogènes aussitôt après application (4 boites) et 24h après application (4 boites).
  • Un écouvillon de surface (Sodibox, Névez, France) est réalisé au niveau de la surface de prélèvement, i.e. les 75% supérieurs de la surface totale de la boîte de pétri en position verticale, pour chaque boîte selon la norme NF EN ISO 18593, avant d’être stockée à 4°C pour analyse.
    1. Suivi des pathogènes
  • À chaque pas de temps, les échantillons sont analysés pour le dénombrement de S. enterica ou E. coli selon au moins l’une des méthodes de référence suivantes :
  • - Norme ISO 21528-2:2017 adaptée – Microbiologie alimentaire – Méthode horizontale de détection et de dénombrement des Enterobacteriaceae - Partie 2: Technique de comptage des colonies,
  • - Norme ISO 6579-1 :2017 Microbiologie alimentaire – Méthode horizontale de détection, dénombrement et sérotypage des Salmonella – Partie 1 : Détection de Salmonella spp., et
  • - Norme ISO 16649-2:2001 Microbiologie pour l’alimentation humaine et l’aliment du bétail – Méthode horizontale de dénombrement des Escherichia coli beta-glucuronidase-positive - Partie 2: comptage des colonies à 44°C en utilisant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide.
    1. Synthèse des résultats
  • L’ensemble des résultats de l’essai est présenté dans le tableau ci-dessous et la .
  • Matrice Pathogène Temps final (heures) Différence d’évolution moyenne
    Témoin - Essai
    (Log10 UFC/g)
    Maïs broyé Salmonella Typhimurium 24 1.2
    Aliment Truie
    (voir exemple 1 pour la composition)    		 Salmonella Typhimurium 24 3.0
    Pas de matrice alimentaire Salmonella Typhimurium 24 0
  • Au vu du faible effectif d’échantillons lors d’un essai, l’effet du traitement avec l’aliment selon l’invention sur la différence d’évolution de la quantité de pathogène après 24h est mesuré par le test de Wilcoxon avec un seuil de significativité fixé à 5% (p valeur inférieure ou égal à 0.05), et un seuil de tendance fixé à 10% (p-valeur inférieure ou égale à 0.1). L’effet du traitement est significatif pour les 4 essais comprenant une matrice alimentaire (p-valeur = 0.02857)
  • De ces expériences on peut tirer les conclusions suivantes :
  • - quelle que soit la matrice alimentaire utilisée simple (maïs broyé) ou complexe (alimentation porc/truie), on constate que la composition selon l’invention a un effet significatif sur la diminution des bactéries pathogènes présentes sur une surface. Il semble même notable que plus l’alimentation est complexe, plus l’efficacité sera importante ;
  • - que la simple pulvérisation des bactéries selon l’invention, sans matrice alimentaire, n’a pas d’effet. Ceci est dû notamment au fait que sans apport nutritif les bactéries ne sont pas capables de se multiplier pour exercer leur effet inhibiteur de la croissance des bactéries pathogènes.
    •

Claims (10)

  1. Utilisation d’une composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, ladite souche étant dispersée dans ladite composition alimentaire,
    pour la décontamination ou la prévention de la contamination des surfaces, en particulier les surfaces des dispositifs de préparation, de stockage et d’acheminement d’un aliment, notamment d’un aliment pour animaux.
  2. Utilisation selon la revendication 1, ladite composition comprenant en outre au moins une souche de bactérie lactique.
  3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où ladite souche de bactérie est présente à raison d’au moins 104 ufc par gramme de composition alimentaire.
  4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite souche de bactérie est choisie parmi l’une des souches suivantes :
    - la souche NOL01, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4606,
    - la souche NOL02, déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I-5043, et
    - la souche NOL03, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4607,
    ou l’une quelconque des souches de bactéries du genre Bacillus appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle, ou OTU, que ladite souche NOL01, ou ladite souche NOL02 ou ladite souche NOL03,
    ou un mélange de deux ou plusieurs de ces souches.
  5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, où ladite souches de bactérie lactique est choisie parmi l’une des souches suivantes : la souche NOL11, déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I-4609, l’une quelconque des souches de bactéries lactiques appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle que ladite souche NOL11, et un mélange de deux ou plusieurs de ces souches.
  6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où ladite composition comprend au moins l’une quelconque des combinaisons de bactéries suivantes :
    - NOL01 et NOL11,
    - NOL02 et NOL11,
    - NOL03 et NOL11,
    - NOL01, NOL02 et NOL11,
    - NOL01, NOL03 et NOL11,
    - NOL02, NOL03 et NOL11,
    - NOL01, NOL02, NOL03 et NOL11.
  7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où lesdites surfaces sont contaminées ou contaminables par des entérobactéries, en particulier par des souches de genre Salmonella ou Escherichia, notamment des bactéries des espèces Salmonella enterica ou Escherichia coli.
  8. Méthode de décontamination ou de prévention de la contamination de surfaces d’un dispositif destiné à recevoir des aliments, ladite méthode comprenant une étape de mise en contact d’une composition alimentaire avec les surfaces dudit dispositif, ladite composition alimentaire comprenant au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment de l’espèce Bacillus subtilis, ladite souche étant dispersée dans ladite composition alimentaire.
  9. Méthode selon la revendication 8, où ladite composition alimentaire comprend en outre au moins une souche de bactérie lactique.
  10. Composition alimentaire dans laquelle est dispersée au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis, éventuellement comprenant au moins une souche de bactérie lactique.
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