EP4133322A1 - Schiefeebenemikroskop mit verbesserter sammeleffizienz - Google Patents

Schiefeebenemikroskop mit verbesserter sammeleffizienz

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Publication number
EP4133322A1
EP4133322A1 EP21718825.9A EP21718825A EP4133322A1 EP 4133322 A1 EP4133322 A1 EP 4133322A1 EP 21718825 A EP21718825 A EP 21718825A EP 4133322 A1 EP4133322 A1 EP 4133322A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
intermediate image
erecting unit
real intermediate
field
image
Prior art date
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Pending
Application number
EP21718825.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Florian Fahrbach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP4133322A1 publication Critical patent/EP4133322A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to an inclined plane microscope, comprising a detection arrangement for collecting scattered and / or fluorescent light from areas of a sample volume illuminated by a light sheet, the detection arrangement being designed on its side facing away from the sample volume a real intermediate image of the areas illuminated by the light sheet image of the sample and wherein the real intermediate image is tilted to a focal plane of the Detekti onsanssen, and an optical erecting unit for imaging a predetermined image field of the real intermediate image on a detector, the erecting unit having a depth of field.
  • the invention also relates to a method for recording images representing planes of a sample, comprising collecting scattered and / or fluorescent light from areas of a sample volume illuminated by a light sheet with a detection arrangement, generating a real intermediate image of the areas illuminated by the light sheet Sample volume with the detection arrangement, the real intermediate image being tilted to a focal plane of the detection arrangement, and the imaging of a predetermined image field of the real intermediate image on a detector by an optical Aufrichteein.
  • the invention also relates to the use of an erecting unit in an inclined plane microscope for imaging a predetermined image field of a real intermediate image generated by a detection arrangement on a detector, the real intermediate image being tilted to a focus plane of the detection arrangement and the erecting unit having a focus depth range.
  • an erecting unit In inclined plane microscopes, such as an OPM or a SCAPE microscope, an erecting unit is used, by means of which an image of a plane of the sample illuminated obliquely by the light sheet is sharply focused on a detector, i.e. is erected.
  • the problem with an erecting unit is that a large part of the sample light that is collected by the objective facing the sample does not reach the detector.
  • the depth of field would have to be increased very greatly for large image fields.
  • the optical axes of the detection arrangement and the erecting unit can run collinear with one another, which leads to a simple structure of the entire system.
  • the erecting unit thus de facto aligns the oblique real intermediate image no longer appears and only represents an imaging optics.
  • a strong increase in the depth of field necessary for this is, however, very demanding with regard to the correction which corrects the artifacts associated with this increase and can lead to problems. If the inclination of the erecting unit is dispensed with, the optical axes of the detection arrangement and the erecting unit run collinearly or parallel to one another.
  • the object of the present invention is therefore to create an inclined plane microscope and a method which make it possible to increase the light yield.
  • the present invention solves this problem for the oblique plane microscope described above in that a focal plane of the erecting unit is tilted by an offset angle to the real intermediate image, and that the predetermined image field of the real intermediate image to be mapped by the erecting unit lies completely within the depth of field of the erecting unit.
  • the present invention solves this problem for the above-described process by tilting a focal plane of the erecting unit by an offset angle to the real intermediate image, the predetermined image field of the real intermediate image being completely within a depth of field of the erecting unit.
  • the straightening unit is used in an inclined plane microscope, a focal plane of the straightening unit being tilted by an offset angle to the real intermediate image, and the predetermined image field of the real intermediate image to be mapped by the straightening unit lies completely within the depth of field.
  • the invention thus has the advantage that tilting the erecting unit by an offset angle to the real intermediate image makes it possible to arrange the erecting unit closer to the optical axis of the detection arrangement and to reduce the angle between the optical axes of the detection arrangement and erecting unit. This in turn makes it possible to collect more scattered and / or fluorescent light with the erecting unit without, for example, having to modify optical components of the erecting unit.
  • an enlarged possible tilting of the erecting unit increases the easier replacement of the same and thus the flexibility of the inclined plane microscope.
  • the present invention thus improves inclined plane microscopes and methods from the prior art, which are subject to a limitation of the resolution in that the full aperture of the detection arrangement cannot be tapped with the erecting unit.
  • Which he- Finding improves solutions from the state of the art also with regard to their flexibility.
  • lens changes can be carried out with the invention in practice.
  • cover glasses In the solutions from the prior art, there is also no or only limited compatibility with cover glasses. For example, these cannot simply be added to the optical structure without noticeably impairing the measurement. In the inclined plane microscope according to the invention, on the other hand, cover glasses can be used without noticeably impairing the quality of the measurement.
  • the inclined plane microscope according to the invention or the method according to the invention can be further improved by the embodiments described below.
  • the additional features of the inclined plane microscope or process steps of the process described below can be combined with one another as desired.
  • device features can be transferred to a corresponding method according to the invention, and method features can be transferred to a corresponding device.
  • the term “detection arrangement” is to be understood as an optical arrangement that allows scattered and / or fluorescent light to be collected from areas of a sample volume illuminated by a light sheet.
  • a detection arrangement can also be used simultaneously to illuminate the sample. For this purpose, a beam path of the illuminating light and a beam path of the detection light (scattered light / fluorescent light) can run in different areas of the detection arrangement.
  • the optical arrangement depicting the real intermediate image is inclined to the optical axis the detection arrangement aligned.
  • the optical axis of this imaging optical arrangement is preferably perpendicular to the real intermediate image in order to achieve the sharp image.
  • This imaging optical arrangement is usually referred to as the “erecting unit”, since the inclined arrangement of the erecting unit erects the real intermediate image in this vertical position.
  • the "depth of field” is an axial extent within which a pixel to be imaged can be located without the imaging of this pixel on a detector leading to a circle of confusion that is larger than a permissible circle of confusion.
  • the permissible circle of confusion is generally defined by the detector used (for example with the aid of the pixel dimensions) and characterizes a maximum size of a circular image that can still be sharply imaged with this detector.
  • the erecting unit is preferably tilted towards an optical axis of the detection arrangement, wherein, despite the tilting, the depth of field of the erecting unit completely encompasses or includes the image field of the real intermediate image to be imaged.
  • the real intermediate image can be arranged diagonally in the depth of field.
  • the possible tilting of the erecting unit towards the optical axis of the detection arrangement is thus determined by the width of the image field to be imaged and by the depth of field of the erecting unit.
  • the width of the image field to be imaged is measured perpendicular to the optical axis of the detection system. If the real intermediate image is thus located within the depth of field, it can preferably be imaged on the detector without any loss of information.
  • an optical axis of the erecting unit can be tilted towards the optical axis of the detection arrangement.
  • the erecting unit can have at least one immersion optic.
  • This has the advantage that an optical medium adapted to the refractive index of the erecting unit, for example a liquid, is arranged between the erecting unit and the real intermediate image, which increases the acceptance angle of the erecting unit at which light can be absorbed by it. This acceptance angle is described by the numerical aperture (NA).
  • NA numerical aperture
  • the provision and / or enlargement of the depth of field of the erecting unit enables the erecting unit to be tilted by the offset angle.
  • One possibility of increasing the depth of field of the erecting unit is to generate aberrations that increase the sharpness, in particular spherical aberrations, in the erecting unit. These can be caused, for example, by a mismatching of the detection arrangement a refractive index, for example of an immersion medium, can be generated.
  • a refractive index for example of an immersion medium
  • the erecting unit can also have a phase mask and / or an amplitude mask in order to enlarge the depth of field. Both the phase mask and the amplitude mask can be arranged in the pupil of the erecting unit, so that they can be referred to as pupil filters.
  • a ring-shaped amplitude mask or a phase mask in which the phase delay is linearly dependent on the radius (the radius is the distance to the optical axis of the erecting unit) can, for example, modify the so-called point-spread function (PSF) of the erecting unit in such a way that that this has the cross-section of a Bessel function.
  • PSF point-spread function
  • phase or amplitude mask does not have to be rotationally symmetrical.
  • a linear, rotationally symmetrical phase mask can transform the PSF into a shape that corresponds to a Bessel beam (i.e. the cross-section of the PSF follows a Bessel function or can be approximately described by one). The depth of field is increased.
  • a cubic, non-rotationally symmetrical phase mask can generate a PSF that corresponds to an Airy beam and also has an increased depth of field.
  • a pupil filter can thus transform a diffraction-limited PSF in such a way that an increased depth of field and an associated reduced axial resolution are obtained.
  • the reduced axial resolution is ideally not associated with a corresponding loss of lateral resolution.
  • the straightening unit can comprise at least one lens whose positioning relative to the intermediate image deviates from a position in which the straightening unit generates the smallest spherical aberrations when imaging the intermediate image.
  • an arrangement / position with minimized aberrations can be calculated or found.
  • the refractive power is distributed over as many surfaces of the optics as possible.
  • an aberration-prone arrangement includes any arrangement / position of the lens / lens system that deviates from the aberration-minimized arrangement / position.
  • the position of the detector relative to the erecting unit can be along the optical axis of the erecting unit in comparison to the aberration-minimized arrangement / position in order to position the detector in or near the image plane of the erecting unit.
  • the erecting unit (and thus also its lenses) can be arranged at a working distance from the real intermediate image that deviates from the free working distance defined by the erecting unit (if this is set, an arrangement / position with minimized aberrations is present).
  • the defined free working distance is to be understood as the working distance for which the erecting unit has the lowest spherical aberrations.
  • the spherical aberrations that occur when this arbitrary working distance is set increase the depth of field of the erecting unit, which enables the erecting unit to be tilted.
  • An erecting unit could, for example, comprise at least two lenses. If such a lens system is optimized so that spherical aberrations are minimal when the real intermediate image is located in a front focal plane of a front lens, it is advantageous if the working distance to the real intermediate image is chosen so that it is from the focal length of the front lens deviates, for example is therefore larger.
  • the terms “front” or “front” refer to a direction from the erecting unit to the real intermediate image.
  • the front lens is thus arranged closer to the real intermediate image than the other of the two lenses. In the case of a larger working distance, this procedure consequently also enables larger lenses to be used.
  • the imaged plane (object plane) lies further away from the first lens compared to the focal plane.
  • such an erecting unit leads to an increase in the spherical aberrations and consequently to an increase in the depth of field, which in turn allows the erecting unit to be tilted.
  • the erecting unit can be designed in such a way that spherical aberrations occur, but other imaging errors (such as chromatic aberrations, distortion, vignetting, etc.) are largely avoided. For example, this can be taken into account in the optical design of the properties of the lens, since imaging errors can usually be corrected separately from one another.
  • the erecting unit can comprise a microlens array.
  • a microlens array has a larger depth of field than a single lens with the same entry surface as the microlens array due to a large number of lenses with a small diameter and large numerical aperture.
  • a detector in a further embodiment of the inclined plane microscope according to the invention, has a plurality of pixels that have a pixel size which is equal to or less than half of a scattering circle diameter, the scattering circle diameter resulting from the depth of field, the focal length and the aperture number of the erecting unit and its working distance to the real intermediate image.
  • the diameter of the circle of confusion determines whether an object is shown in focus on the detector or not. If there is - when viewed in geometric optics - an object point (sample-side point) in an object plane of a lens, light emanating from this point is focused in the associated image plane in an image point. A detector placed in this plane detects a sharp image. If the object point is no longer in the original object plane of the lens, the light cone originally converging in the image plane is, for example, cut off and a circle of confusion arises on the detector.
  • Airy disk the cross section perpendicular to the optical axis through the PSF
  • a point in the object to be reproduced i.e. the sample
  • Airy disk becomes an Airy disk in the image.
  • Disc or generally the PSF).
  • the detector is selected in such a way that the circle of confusion corresponds to a maximum tolerable diameter of the circle of confusion, so that a sharp image is obtained.
  • the depth of field of the optical system can usually be varied, the depth of field being directly proportional to the number of diaphragms.
  • the f-number relates to the image side of an optical system and can also be calculated from an image-side opening angle.
  • NA numerical aperture
  • a sharp image of the real intermediate image within the depth of field is possible solely through the geometry of the detector and its pixels as well as the scattering circle diameter achieved with the erecting unit.
  • the point-spread function can deform.
  • Such a deformed PSF can flow into the PSF of the complete system, that is, it can be taken into account in the image processing.
  • the images of a stack of images can be unfolded. Due to the tilting, the deformed PSF can vary in location within a recorded image and does not only depend on the lighting. A relative position of a detection and an illumination PSF varies due to the tilt across the image field.
  • artifacts can be reduced by unfolding the recorded images with a modified PSF.
  • a further reduction of artifacts can be achieved by further computer-aided image improvement methods (for example by so-called “computational clearing” as described in WO 2019/185174 A1).
  • the aforementioned aberrations that increase the depth of field can be generated by a mismatch of the refractive index, by pupil filters or by an errational arrangement of the erecting unit.
  • a non-telecentric system can be used.
  • the straightening unit consists of two lenses (objective and tube lens), characterized in that these two lenses are not arranged at a distance from one another which corresponds to the sum of their focal lengths.
  • the plane to be imaged by the erecting unit on the detector can be further away from the erecting unit than its focal plane, i.e. the working distance can be increased and the erecting unit can be tilted more towards the optical axis of the detection arrangement without hitting the detection arrangement.
  • recorded image data can be rearranged so that each image obtained represents a plane which is perpendicular is oriented to the optical axis of the detection arrangement.
  • a post-processing step can be used to compensate for recorded artifacts that are caused by increasing the depth of field.
  • the system PSF inherent in the inclined plane microscope corresponds to a product of the PSF for illumination and the PSF for detection and can be used for unfolding. This has the peculiarity that Illumination and detection are neither collinear nor perpendicular to each other.
  • the post-processing steps can also be combined with one another; for example, after the recorded image data have been rearranged, the image of the plane thus obtained can each be unfolded with a single (appropriately rotated) system PSF.
  • a homogeneous blurring can be assumed in these planes, which can be taken into account in the image processing.
  • the illumination and the detection do not necessarily have to be perpendicular to one another. This means that the lighting can partially run in the detection light cone. If the illumination and detection are not perpendicular to one another, then the detection can, under certain circumstances, at least partially take place in a direction that is opposite to the illumination.
  • the light sheet illuminating the sample can enclose the detection light cone in an area outside the depth of field of the erecting unit in the sample. Since the detection sometimes takes place in the opposite direction of illumination, the optical sectioning can decrease. This can lead to a loss of contrast.
  • the computational clearing and / or optical clearing of the sample can be particularly advantageous in this case, since these two methods make it possible to compensate or prevent this loss of contrast.
  • the inclined plane microscope according to the invention and the method according to the invention allow a simple change of the detection arrangement, so that an illumination beam can also be coupled into the detection arrangement for a detection arrangement with a larger or smaller aperture at the edge of the pupil. This can change the angle between the light sheet and the optical axis. As long as the change in angle of the light sheet to the optical axis and a resulting change in angle of the real intermediate image remains within the fentief Anlagenes of the erecting unit, no additional blurring of the recorded images occurs by changing the detection arrangement.
  • a penetration depth in the sample can be varied.
  • An increased depth of field according to the inclined plane microscope or the method of the present invention allows a leeway with regard to the tilting of the erecting unit to the optical axis and enables the tilt angle to be changed.
  • the possibility of increasing the offset angle between the detection arrangement and the real intermediate image is particularly advantageous if the image quality is maintained, i.e.
  • the detector used in the inclined plane microscope according to the invention or in the method according to the invention can be a camera (CCD, CMOS, etc.) known from the prior art.
  • CCD CCD
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • the present invention enables the erecting unit to be tilted by approximately 8 ° with an image field of 20 ⁇ m and for a depth of field of 5 ⁇ m. Such a possible tilting can already prevent a collision of the detection arrangement with the erecting unit.
  • spherical aberrations described in some embodiments result in the fact that high spatial frequencies are still transmitted in the area of the sample to be imaged, but are more attenuated due to a modulation transfer function (MTS) changed by the spherical aberrations.
  • MTS modulation transfer function
  • these spatial frequencies can be amplified, for example by the deconvolution with the modified PSF, and thus the higher spatial frequencies can be more clearly separated from the noise, so that they are not completely covered by noise.
  • a denoise before deployment is also conceivable.
  • FIG. 2 shows a detail of the schematic representation of FIG. 1
  • FIG. 3 shows a further embodiment of the erecting unit according to the invention.
  • FIG. 6 shows a schematic representation of the inclined plane microscope to illustrate the detection light cone.
  • 1 shows an inclined plane microscope 101 in a schematic representation.
  • the tilting plane microscope 101 comprises a detection arrangement 103, by means of which scattered and / or fluorescent light 105 is collected from areas 109 of a sample volume 111 illuminated by a light sheet 107.
  • the light sheet 107 is formed by illuminating light 107a focused in the sample volume 111.
  • the illuminating light 107a can be introduced into the inclined plane microscope 101 via a mirror arrangement 107b, for example.
  • the coupling in of the illuminating light 107a is shown purely by way of example and can take place in other configurations at other locations in the inclined plane microscope 101.
  • the detection arrangement 103 images the areas 109 of the sample 111b illuminated by the light sheet 107 on a side 113 facing away from the sample volume 111 in a real intermediate image 115.
  • This real intermediate image 115 is tilted with respect to a focal plane 117 of the detection arrangement 103.
  • the detection arrangement 103 is shown purely by way of example by two lenses 103a. In other configurations, these lenses 103a shown here can also each be an objective 103b.
  • the lens 103a which faces the sample volume 111, can be immersion optics 135.
  • a lens 103a can be a first detection optics 103c which collects the scattered and / or fluorescent light 105 originating from a sample side 111a.
  • the detection arrangement 103 can be a telescope 104 and furthermore comprise a second detection optics 103d pointing towards the side 113 facing away from the sample volume 111.
  • the inclined plane microscope 101 comprises an optical erecting unit 119, by means of which a predetermined image field 121 of the real intermediate image 115 is imaged on a detector 123.
  • the predetermined image field 121 is shown purely schematically as a one-dimensional width 121a, but can be understood as a two-dimensional area which additionally protrudes into or out of the plane of the drawing. This two-dimensional area is defined by the width 121a shown and a depth which is not shown.
  • the real intermediate image 115 can extend beyond the predetermined image field 121.
  • the erecting unit 119 has a depth of field 129 which is shown schematically as a rectangle in the enlarged area 129a.
  • the depth of field 129 also protrudes into or out of the drawing plane and can be understood as a cuboid. All of them Points located within this cuboid can be sharply imaged onto the detector 123 by the erecting unit 119.
  • the depth of field 129 is thus determined by the predetermined image field 121 and a depth of field 129b.
  • the depth of field 129 shown here is to be understood as the three-dimensional area within which the predetermined image field 121 of the real intermediate image 115 should be in order to obtain tolerable image data (not shown) with the detector 123.
  • tolerable image data can either be achieved directly by the erecting unit 119 in that a maximally tolerable circle of confusion of the mapped predetermined image field is achieved on the detector, which allows a sharp image with a given pixel size, or indirectly through an image of the erecting unit 119 and downstream post-processing steps for the recorded data, in which the system's own characteristics are taken into account in order to optimize the recorded image data.
  • PSF point spread function
  • the righting unit 119 is shown schematically with a front lens 139.
  • a classic arrangement 119a of the erecting unit 119 that is to say in an arrangement from the prior art, an optical axis 131 of the erecting unit 119 is oriented generally perpendicular to the real intermediate image 115.
  • the front lens 139 and the corresponding optical axis 131 are shown in dashed lines in the classic arrangement 119a and 131a, whereas the optical axis 133 of the detection arrangement 103 is shown in dash-dotted lines.
  • the focal plane 125 of the erecting unit 119 is tilted by an offset angle 127 to the real intermediate image 115.
  • the offset angle 127 is shown in the enlarged area 129a.
  • the predetermined image field 121 of the real intermediate image 115 to be imaged by the erecting unit 119 is located completely within the depth of field 129.
  • the erecting unit 119 according to the invention is thus in a tilted arrangement or in the positioning 119b according to the invention.
  • This tilted arrangement 119b can be assumed by the erecting unit 119, since up to this arrangement 119b, i.e. up to the offset angle 127, the real intermediate image 115 is arranged diagonally in the depth of field 119.
  • the optical axis 131 of the erecting unit 119 is tilted towards the optical axis 133 of the detection arrangement 103.
  • the erecting unit 119 is arranged at a working distance 141 from the real intermediate image 115. This is shown for the erecting unit 119 in the tilted arrangement 119b.
  • a detection light cone 105a on the sample side is shown schematically in FIG. 1.
  • This sample-side detection light cone 105a is shown dotted on the sample side 111a and can be defined, for example, by the first detection optics 103c. Since the first detection optics 103c can also be immersion optics 135, the detection light cone 105a on the sample side can be enlarged within certain limits.
  • This sample-side detection light cone 105a consequently determines the maximum amount of scattered and / or fluorescent light 105 that can be detected, i.e. collected, by the detection arrangement 103. This is determined, for example, by a numerical aperture NA of the detection arrangement 103.
  • FIG. 2 shows the area of the real intermediate image 115 in a detailed illustration, which schematically shows a separate circular section of the front lens 139 and the depth of field area 129. Due to the need to tilt the erecting unit 119 relative to the optical axis 133 of the detection arrangement 103, the erecting unit 119 only allows scattered and / or fluorescent light 105 to be collected from a second detection light cone 219c. This results from the intersection between the detection light cone 205a of the detection arrangement 103 on the image side and a (theoretical) light cone 219d of the erecting unit 119.
  • the theoretical light cone 219d of the erecting unit 119 is shown with a dashed line, the image-side detection light cone 205a with a dotted line and the resulting second detection light cone 219c as a hatched area.
  • the offset angle 127 ie by tilting the erecting unit 119 to the optical axis 133 of the detection arrangement 103
  • the second detection light cone 219c and thus the amount of scattered and / or fluorescent light 105 incident on the detector 123 are increased.
  • the straightening unit (not shown) is in the positioning 119b according to the invention.
  • the offset angle 127 largely determines which portion of the scattered and / or fluorescent light 105 is located in the second detection light cone 219c and can be available for detection. 3, 4 and 5, solutions according to the invention are shown, which allow an enlargement of the depth of field 129, which in turn allows an enlargement of the offset angle 127. These solutions thus make it possible to tilt the erecting unit 119 more towards the optical axis 133 of the detection arrangement 103, as a result of which a greater light yield can be achieved and a signal-to-noise ratio can be improved.
  • a further embodiment of the erecting unit 119 according to the invention is shown.
  • this includes two filters 343, both filters 343 being able to be pupil filters 345.
  • One of the filters 343 is a phase mask 347, while the other filter 343 is an amplitude mask 349.
  • the filters 343 modify a beam path 351 of the scattered and / or fluorescent light 105, so that a modified beam path 353 results.
  • This is shown schematically, purely by way of example and not restrictively, both after the phase mask 347 and after the amplitude mask 349.
  • further optical elements 355 are indicated in a hatched area, which image the scattered and / or fluorescent light 105 on the detector 123.
  • the phase mask 347 can be used to generate beam courses of the scattered and / or fluorescent light 105 that have a PSF that are bosom-shaped or airy-shaped.
  • the PSF can be described by a Bessel function or an Airy profile.
  • the phase mask 347 has a linear (Bessel) or a cubic (Airy) profile of the phase change as a function of a location coordinate. This change in the beam courses results in an enlarged depth of field 129, which in turn enables the possible offset angle 127 to be enlarged.
  • FIG. 3 is shown in FIG. 3, which is shown as a representative of an evaluation device 359.
  • a microcontroller or, for example, an integrated circuit can also be used.
  • the PC 357 is designed by means of post-processing modules 361 from Detector 123 to process recorded image data 363 and, for example, to unfold the recorded images with a modified PSF and / or to optimize them by means of computational clearing and / or to process the image data in such a way that each newly calculated image represents a plane which is perpendicular to the optical axis 133 of the detection arrangement 103 is oriented.
  • each image obtained represents a plane which is oriented perpendicular to the optical axis 133 of the detection arrangement 103 enables these images obtained to be intuitively understandable, since they show a plane in the sample 111b that is not inclined.
  • FIG. 4 shows a further embodiment of the erecting unit 119 according to the invention, which comprises a microlens array 465. Due to the numerical aperture NA of each of the individual microlenses 465a, the microlens array 465 has an enlarged depth of field 129 (see FIG individual point of the real intermediate image 115 is only indicated schematically. Furthermore, in the embodiment of the erecting unit 119 shown in FIG. 4, the filters 343 of FIG. 3 can also be used. Conversely, in the embodiment according to FIG. 3, microlenses 465a can also be used as phase mask 347.
  • FIG. 5 A further embodiment of the sliding plane microscope 101 according to the invention is shown schematically here.
  • the inclined plane microscope 101 comprises an erecting unit 119, which is designed as a telescope 104.
  • Fig. 5 two possible arrangements of the telescope 104 are shown, these possible positions of the telescope 104 and the resulting beam paths 351 can be distinguished by the used lines, solid or dashed.
  • the two lenses 103a are arranged in such a way that the front lens 139 is at the working distance 141 to the real intermediate image 115 is located.
  • This working distance 141 corresponds to a free working distance 142.
  • the free working distance 142 defines the working distance 141 for which the telescope 104 is optimized, that is, an image with a working distance 141 corresponding to the free working distance 142 can take place with the smallest possible optical errors .
  • An image with a different working distance 141 increases the spherical aberrations occurring in the image.
  • the spherical aberrations are used to increase the depth of field 129. Any artifacts that may arise as a result can be compensated for or at least reduced by means of post-processing.
  • an actual working distance 541a is selected as the working distance 141, which is greater than the free working distance 142, the increased spherical aberrations of the telescope 104 in such a changed position 569 increase the depth of field 129b and thus an enlarged depth of field results 129. This in turn allows a greater tilting of the erecting unit 119 in the changed position 569 towards the optical axis 133 of the detection arrangement 103.
  • the free working distance 142 in the calculated optimal position 567 corresponds to a focal length 571 (also: f) of the front lens 139.
  • the actual working distance 541a in the changed position 569 of the erecting unit 119 is greater than the focal length 571 of the front lens 139.
  • the beam path 351 cannot run in a collimated manner between the lenses 103a shown in FIG. Even in such a case, ie such an arrangement, according to the invention, deviations can be made from the (calculated and optimal) working distance 141 of the erecting unit 119 to the real intermediate image 115, the actual working distance 541a being greater than the free working distance 142 of the erecting unit 119, however is not necessarily greater than the focal length 571 of the front lens 139.
  • an erecting unit according to the invention can be designed in such a way that imaging errors such as vignetting and color errors (chromatic aberrations) are largely corrected for the actual working distance 541a, but spherical aberrations occur.
  • Fig. 6 parts of the inclined plane microscope 101 according to the invention are shown schematically Darge to explain the steps for increasing the collection efficiency of the erecting unit 119.
  • FIG. 6 only the second detection optics 103d of the detection arrangement 103 and only the front lens 139 of the erecting unit 119 are indicated schematically.
  • the erecting unit 119 is shown both in the classic arrangement 119a and in the tilted arrangement 119b. In the classic arrangement 119a, the detection arrangement 103 and the erecting unit 119 can touch in a collision area 673.
  • such a collision of the two components 103, 119 is avoided by tilting the erecting unit 119 towards the optical axis 133 of the detection arrangement 103.
  • Such a tilted arrangement 119b is drawn with a solid line to distinguish it.
  • FIG. 6 a further possibility is shown in FIG. 6 to further increase the light yield. This is made possible by the choice of a front lens 139 with a second numerical aperture NA2, which can be used in this larger form, since the tilting increases a clearance between the detection arrangement 103 and the erecting unit 119.
  • the respective second detection light cone 219c is thus enlarged from that for the classic arrangement 119a, which is marked with a capital letter A for the sake of clarity, to the second detection light cone 219c, which is achieved for the tilted arrangement 119b, which is marked with a capital letter B, the latter being able to be enlarged even further by an enlarged numerical aperture NA2 of the front lens 139 or the erecting unit 119;
  • the cone of light A is included in B and A and B are included in the cone of light C.
  • a further possibility of increasing the numerical aperture NA of the erecting unit 119 can consist in introducing an immersion medium 675 between the detection arrangement 103 and the erecting unit 119, which has a refractive index 677 that is greater than the refractive index 677 of air.
  • This can be a liquid such as an oil, for example.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Schiefeebenemikroskop (101), umfassend eine Detektionsanordnung (103) zum Aufsammeln von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht (105) aus von einem Lichtblatt (107) beleuchteten Bereichen (109) eines Probenvolumens (111), wobei die Detektionsanordnung (103) auf ihrer vom Probenvolumen (111) abgewandten Seite (113) ein reelles Zwischenbild (115) der Bereiche (109) einer Probe (111b) abbildet und wobei das reelle Zwischenbild (115) zu einer Fokusebene (117) der Detektionsanordnung (103) verkippt ist, und eine optische Aufrichteeinheit (119) zum Abbilden eines vorbestimmten Bildfeldes (121) des reellen Zwischenbildes (115) auf einen Detektor (123), wobei die Aufrichteeinheit (119) einen Schärfentiefebereich (129) aufweist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, welches ein solches Schiefeebenemikroskop (101) nutzt. Bekannte Lösungen sind in der Positionierung zwischen Detektionsanordnung (103) und Aufrichteeinheit (119) eingeschränkt, ein Austausch der Detektionsanordnung (103) und/oder der Aufrichteeinheit (119) ist nicht einfach möglich. Dies wird dadurch verbessert, dass eine Fokusebene (125) der Aufrichteeinheit (119) um einen Offsetwinkel (127) zum Zwischenbild (115) verkippt ist, und dass das vorbestimmte Bildfeld (121) des reellen Zwischenbildes (115) vollständig im Schärfentiefebereich (129) liegt.

Description

Schiefeebenemikroskop mit verbesserter Sammeleffizienz
Die Erfindung betrifft ein Schiefeebenemikroskop, umfassend eine Detektionsanordnung zum Aufsammeln von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht aus von einem Lichtblatt beleuchteten Berei chen eines Probenvolumens, wobei die Detektionsanordnung ausgestaltet ist, auf ihrer vom Pro benvolumen abgewandten Seite ein reelles Zwischenbild der vom Lichtblatt beleuchteten Berei che der Probe abzubilden und wobei das reelle Zwischenbild zu einer Fokusebene der Detekti onsanordnung verkippt ist, und eine optische Aufrichteeinheit zum Abbilden eines vorbestimmten Bildfeldes des reellen Zwischenbildes auf einen Detektor, wobei die Aufrichteeinheit einen Schär fentiefebereich aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufnahme von Ebenen einer Probe repräsentierenden Bildern, umfassend das Aufsammeln von Streu- und/oder Fluo reszenzlicht aus von einem Lichtblatt beleuchteten Bereichen eines Probenvolumens mit einer Detektionsanordnung, das Erzeugen eines reellen Zwischenbildes der vom Lichtblatt beleuchte ten Bereiche des Probenvolumens mit der Detektionsanordnung, wobei das reelle Zwischenbild zu einer Fokusebene der Detektionsanordnung verkippt ist, und das Abbilden eines vorbestimm ten Bildfeldes des reellen Zwischenbildes auf einem Detektor durch eine optische Aufrichteein heit. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer Aufrichteeinheit in einem Schiefeebene mikroskop zur Abbildung eines vorbestimmten Bildfeldes eines von einer Detektionsanordnung erzeugten reellen Zwischenbildes auf einen Detektor, wobei das reelle Zwischenbild zu einer Fo kusebene der Detektionsanordnung verkippt ist und wobei die Aufrichteeinheit einen Schärfen tiefebereich aufweist.
In Schiefeebenemikroskopen, wie beispielsweise einem OPM oder einem SCAPE-Mikroskop wird eine Aufrichteeinheit verwendet, mittels welcher ein durch das Mikroskop abgebildetes Bild einer durch das Lichtblatt schräg beleuchteten Ebene der Probe scharf auf einen Detektor abge bildet wird, d.h. aufgerichtet wird. Problematisch ist bei einer Aufrichteeinheit, dass ein großer Teil des Probenlichts, der vom der Probe zugewandten Objektiv aufgesammelt wird, den Detektor nicht erreicht.
Um auf eine schräge Anordnung der Aufrichteeinheit, bei welcher die optische Achse der Auf richteeinheit senkrecht auf dem reellen Zwischenbild steht, komplett zu verzichten, müsste die Schärfentiefe für große Bildfelder sehr stark erhöht werden. In einem solchen Fall können die optischen Achsen der Detektionsanordnung und der Aufrichteeinheit kollinear zueinander verlau fen, was zu einem einfachen Aufbau des gesamten Systems führt. In diesem, im Stand der Tech nik verfolgen Ansatz richtet die Aufrichteeinheit das schräge reelle Zwischenbild somit de facto nicht mehr auf und stellt lediglich eine Abbildungsoptik dar. Eine hierfür notwendige starke Erhö hung der Schärfentiefe ist jedoch hinsichtlich der Korrektur, welche die mit dieser Erhöhung ein hergehende Artefakte korrigiert, sehr anspruchsvoll und kann zu Problemen führen. Sofern auf die Schrägstellung der Aufrichteeinheit verzichtet wird, verlaufen die optischen Achsen der De- tektionsanordnung und der Aufrichteeinheit kollinear, bzw. parallel zueinander.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Schiefeebenemikroskop und ein Verfahren zu schaffen, welche es erlauben, die Lichtausbeute zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe für das eingangs beschriebene Schiefeebenemi kroskop dadurch, dass eine Fokusebene der Aufrichteeinheit um einen Offsetwinkel zum reellen Zwischenbild verkippt ist, und dass das vorbestimmte, durch die Aufrichteeinheit abzubildende Bildfeld des reellen Zwischenbildes vollständig innerhalb des Schärfentiefebereichs der Auf richteeinheit liegt.
Entsprechend löst die vorliegende Erfindung diese Aufgabe für das eingangs beschriebene Ver fahren durch das Verkippen einer Fokusebene der Aufrichteeinheit um einen Offsetwinkel zum reellen Zwischenbild, wobei das vorbestimmte Bildfeld des reellen Zwischenbildes vollständig in nerhalb eines Schärfentiefebereichs der Aufrichteeinheit liegt. Erfindungsgemäß wird die Auf richteeinheit in einem Schiefeebenemikroskop verwendet, wobei eine Fokusebene der Auf richteeinheit um einen Offsetwinkel zum reellen Zwischenbild verkippt ist, und wobei das vorbe stimmte, durch die Aufrichteeinheit abzubildende Bildfeld des reellen Zwischenbildes vollständig innerhalb des Schärfentiefebereichs liegt.
Die Erfindung hat somit den Vorteil, dass die Verkippung der Aufrichteeinheit um einen Offset winkel zum reellen Zwischenbild es ermöglicht, die Aufrichteeinheit näher zur optischen Achse der Detektionsanordnung anzuordnen und den Winkel zwischen den optischen Achsen von De tektionsanordnung und Aufrichteeinheit zu verkleinern. Dies wiederum erlaubt es, mehr Streu- und/oder Fluoreszenzlicht mit der Aufrichteeinheit aufzusammeln, ohne beispielsweise optische Komponenten der Aufrichteeinheit modifizieren zu müssen. Zudem erhöht eine vergrößerte mög liche Verkippung der Aufrichteeinheit den einfacheren Austausch derselben und somit die Flexi bilität des Schiefeebenemikroskops.
Die vorliegende Erfindung verbessert somit Schiefeebenemikroskope und Verfahren aus dem Stand der T echnik, welche einer Beschränkung der Auflösung dadurch unterliegen, dass die volle Apertur der Detektionsanordnung mit der Aufrichteeinheit nicht abgegriffen werden kann. Die Er- findung verbessert Lösungen aus dem Stand der Technik auch hinsichtlich ihrer Flexibilität. An ders als bei bekannten Lösungen sind mit der Erfindung in der Praxis Objektivwechsel durchführ bar.
Beispielsweise besteht in den Lösungen aus dem Stand der Technik auch keine bzw. nur eine eingeschränkte Kompatibilität mit Deckgläsern. Diese können beispielsweise nicht einfach dem optischen Aufbau hinzugefügt werden, ohne die Messung merklich zu verschlechtern. Im erfin dungsgemäßen Schiefeebenemikroskop können dahingegen Deckgläser verwendet werden, ohne die Qualität der Messung merklich zu verschlechtern.
Das erfindungsgemäße Schiefeebenemikroskop bzw. das erfindungsgemäße Verfahren kann durch die nachstehend beschriebenen Ausgestaltungen weiter verbessert werden. Die nachfol gend beschriebenen zusätzlichen Merkmale des Schiefeebenemikroskops bzw. Verfahrens schritte des Verfahrens können beliebig miteinander kombiniert werden. Hierbei können Vorrich tungsmerkmale auf ein entsprechendes erfindungsgemäßes Verfahren, sowie Verfahrensmerk male auf eine entsprechende Vorrichtung übertragen werden. Unter dem Begriff der „Detektionsanordnung“ ist im Zuge dieser Offenbarung eine optische An ordnung zu verstehen, die es erlaubt, Streu- und/oder Fluoreszenzlicht aus von einem Lichtblatt beleuchteten Bereichen eines Probenvolumens aufzusammeln. In weiteren Ausgestaltungen kann eine solche Detektionsanordnung auch simultan zur Beleuchtung der Probe verwendet wer den. Hierfür kann ein Strahlengang des Beleuchtungslichts und ein Strahlengang des Detektions- lichts (Streulicht/ Fluoreszenzlicht) in unterschiedlichen Bereichen der Detektionsanordnung ver laufen.
Da ein in der Probe zur optischen Achse der Detektionsanordnung schräg ausgebildetes Licht blatt auch zu einem schräg zur optischen Achse der Detektionsanordnung abgebildetem reellen Zwischenbild führt, welches möglichst scharf auf einem Detektor abgebildet werden soll, wird die das reelle Zwischenbild abbildende optische Anordnung schräg zur optischen Achse der Detek tionsanordnung ausgerichtet. Hierbei steht die optische Achse dieser abbildenden optischen An ordnung bevorzugt senkrecht auf dem reellen Zwischenbild, um die scharfe Abbildung zu errei chen. Diese abbildende optische Anordnung wird üblicherweise als „Aufrichteeinheit“ bezeichnet, da die schräge Anordnung der Aufrichteeinheit das reelle Zwischenbild in diese senkrechte Posi- tion aufrichtet. Der „Schärfetiefenbereich“ ist eine axiale Ausdehnung, innerhalb derer sich ein abzubildender Bildpunkt befinden kann, ohne dass die Abbildung dieses Bildpunktes auf einem Detektor zu ei nem Zerstreuungskreis führt, der größer als ein zulässiger Zerstreuungskreis ist. Der zulässige Zerstreuungskreis wird hierbei i.A. durch den verwendeten Detektor definiert (z.B. mit Hilfe der Pixelabmessungen) und kennzeichnet eine maximale Größe einer kreisförmigen Abbildung, die noch scharf mit diesem Detektor abgebildet werden kann.
Die Aufrichteeinheit ist bevorzugt zu einer optischen Achse der Detektionsanordnung hin verkippt, wobei trotz der Verkippung der Schärfentiefebereich der Aufrichteeinheit das abzubildende Bild feld des reellen Zwischenbildes vollständig umfasst bzw. einschließt. Insbesondere kann das re- eile Zwischenbild diagonal im Schärfentiefebereich angeordnet sein. Die mögliche Verkippung der Aufrichteeinheit zur optischen Achse der Detektionsanordnung hin ist somit durch die Breite des abzubildenden Bildfeldes und durch den Schärfentiefebereich der Aufrichteeinheit bestimmt. Die Breite des abzubildenden Bildfeldes wird senkrecht zur optischen Achse der Detektionsan ordnung gemessen. Sofern sich das reelle Zwischenbild somit innerhalb des Schärfentiefebereichs befindet, kann dieses bevorzugt ohne Informationsverlust auf den Detektor abgebildet werden. Hierbei wird durch die Verkippung jedoch ein erhöhter Anteil des Streu- und/oder Fluoreszenzlichtes durch die Aufrichteeinheit eingesammelt. Dies erlaubt es, ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und Messungen schneller durchzuführen. Eine optische Achse der Aufrichteeinheit kann hierfür zur optischen Achse der Detektionsanord nung hin gekippt sein.
Die Aufrichteeinheit kann wenigstens eine Immersionsoptik aufweisen. Diese hat den Vorteil, dass ein an die Brechzahl der Aufrichteeinheit angepasstes optisches Medium, beispielsweise eine Flüssigkeit, zwischen der Aufrichteeinheit und dem reellen Zwischenbild angeordnet ist, wel- che einen Akzeptanzwinkel der Aufrichteeinheit, in welchem Licht von dieser aufgenommen wer den kann, vergrößert. Dieser Akzeptanzwinkel wird durch die numerische Apertur (NA) beschrie ben.
Erfindungsgemäß wird somit durch das Bereitstellen und/oder Vergrößern des Schärfentiefebe reichs der Aufrichteeinheit eine Verkippung der Aufrichteeinheit um den Offsetwinkel ermöglicht. Eine Möglichkeit, den Schärfentiefebereich der Aufrichteeinheit zu erhöhen, ist es, die Schärfen tiefe erhöhende Aberrationen, insbesondere sphärische Aberrationen, in der Aufrichteeinheit zu erzeugen. Diese können beispielsweise durch eine Fehlanpassung der Detektionsanordnung an eine Brechzahl, beispielsweise eines Immersionsmediums, erzeugt werden. So kann beispiels weise bei Verwendung einer Immersionsoptik ohne ein Immersionsmedium oder mit einem nicht angepassten Immersionsmedium durch die Fehlanpassung der Aufrichteeinheit die Schärfentiefe der Aufrichteeinheit erhöht werden.
Ebenso kann die Aufrichteeinheit eine Phasenmaske und/oder eine Amplitudenmaske aufweisen, um den Schärfentiefebereich zu vergrößern. Sowohl die Phasenmaske als auch die Amplituden maske kann in der Pupille der Aufrichteeinheit angeordnet sein, sodass diese als Pupillenfilter bezeichnet werden können. Eine ringförmige Amplitudenmaske oder eine Phasenmaske, bei der die Phasenverzögerung linear vom Radius (Der Radius ist der Abstand zur optischen Achse der Aufrichteeinheit) abhängt können beispielsweise die sogenannte Punkt-Spreiz-Funktion (Point- Spread-Function; PSF) der Aufrichteeinheit so modifizieren, dass diese den Querschnitt einer Bessel-Funktion erhält. Neben einer linearen Abhängigkeit der Phasenverzögerung vom Radius können beispielsweise auch quadratische, kubische, quartische Phasenmasken verwendet wer den. Ebenso muss die Phasen- oder Amplitudenmaske nicht rotationssymmetrisch sein. Eine lineare, rotationssymmetrische Phasenmaske kann die PSF in eine Form transformieren, die ei nem Bessel-Strahl entspricht (d.h. der Querschnitt der PSF folgt einer Bessel-Funktion bzw. kann näherungsweise durch eine solche beschrieben werden) Hierbei wird die Schärfentiefe erhöht. Eine kubische, nicht rotationssymmetrische Phasenmaske kann eine PSF erzeugen, die einem Airy-Strahl entspricht und ebenfalls eine erhöhte Schärfentiefe aufweist. Ein Pupillenfilter kann somit eine beugungsbegrenzte PSF derart transformieren, dass eine erhöhte Schärfetiefe und eine damit einhergehende verringerte axiale Auflösung erhalten wird. Die verringerte axiale Auf lösung ist dabei idealerweise nicht mit einem entsprechenden Verlust der lateralen Auflösung verbunden.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskops kann die Auf richteeinheit wenigstens eine Linse umfassen, deren Positionierung relativ zum Zwischenbild von einer Position abweicht, bei der die Aufrichteeinheit bei der Abbildung des Zwischenbildes die geringsten sphärischen Aberrationen erzeugt. Für jede Linse und auch für jedes Linsensystem kann eine aberrationsminimierte Anordnung/Lage berechnet oder gefunden werden. In dieser ist die Brechkraft beispielsweise auf möglichst viele Flächen der Optiken verteilt. Somit führt eine Variation der Stellung der Linse zu einer nicht mehr aberrationsminimierten Anordnung/Lage. Diese soll nachfolgend als aberrationsbehaftete Anordnung bezeichnet werden und umfasst jegli che Anordnung/Lage der Linse/des Linsensystems abweichend zur aberrationsminimierten An ordnung/Lage. Um eine aberrationsbehaftete Anordnung/Lage für diese Ausgestaltung zu errei chen, kann die Position des Detektors relativ zur Aufrichteeinheit entlang der optischen Achse der Aufrichteeinheit im Vergleich zur aberrationsminimierten Anordnung/Lage verschoben sein, um den Detektor in oder nahe der Bildebene der Aufrichteeinheit zu positionieren.)
Beispielsweise kann auch die Aufrichteeinheit (und damit auch deren Linsen) in einem Arbeits abstand zum reellen Zwischenbild angeordnet sein, der vom durch die Aufrichteeinheit definierten freien Arbeitsabstand (ist dieser eingestellt, so liegt eine aberrationsminimierte Anordnung/Lage vor) abweicht. Der definierte freie Arbeitsabstand ist als jener Arbeitsabstand zu verstehen, für welchen die Aufrichteeinheit die geringsten sphärischen Aberrationen aufweist. Die auftretenden sphärischen Aberrationen bei Einstellung dieses beliebigen Arbeitsabstandes erhöhen den Schärfentiefebereich der Aufrichteeinheit, was eine Verkippung der Aufrichteeinheit ermöglicht.
Eine Aufrichteeinheit könnte beispielsweise wenigstens zwei Linsen umfassen. Falls ein solches Linsensystem so optimiert ist, dass sphärische Aberrationen minimal sind, wenn sich das reelle Zwischenbild in einer vorderen Fokusebene einer vorderen Linse befindet, ist es vorteilhaft, wenn der Arbeitsabstand zum reellen Zwischenbild so gewählt wird, dass er von der Brennweite der vorderen Linse abweicht, beispielsweise also größer ist. Die Bezeichnungen „vorn“ oder „vordere“ sind auf eine Richtung von der Aufrichteeinheit zum reellen Zwischenbild hin bezogen. Die vor dere Linse ist somit näher am reellen Zwischenbild angeordnet als die weitere der zwei Linsen. Im Fall eines größeren Arbeitsabstandes ermöglicht dieses Vorgehen folglich auch den Einsatz größerer Objektive. Die abgebildete Ebene (Objektebene) liegt hierbei im Vergleich zur Fokus ebene weiter von der ersten Linse entfernt. Wie im vorhergehend beschriebenen Beispiel führt eine solche Aufrichteeinheit zu einer Erhöhung der sphärischen Aberrationen und folglich zu einer Erhöhung der Schärfentiefe, welche wiederum eine Verkippung der Aufrichteeinheit erlaubt.
Allgemein kann die Aufrichteeinheit so gestaltet sein, dass sphärische Aberrationen auftreten, aber andere Abbildungsfehler (wie chromatische Aberrationen, Verzeichnung, Vignettierungen etc.) weitestgehend vermieden werden. Beispielsweise kann dies beim optischen Design der Ei genschaften des Objektivs berücksichtigt werden, da Abbildungsfehler in der Regel getrennt von einander korrigiert werden können.
Ferner kann die Aufrichteeinheit ein Mikrolinsenarray umfassen. Ein solches Mikrolinsenarray weist aufgrund einer Vielzahl von Linsen mit kleinem Durchmesser und großer numerischer Apertur einen größeren Schärfentiefebereich auf als eine einzelne Linse mit derselben Eintritts fläche wie das Mikrolinsenarray.
Insbesondere kann in einerweiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Schiefeebenemikro skops ein Detektor vorgesehen sein, der eine Vielzahl von Pixeln aufweist, die eine Pixelgröße aufweisen, welche gleich oder kleiner der Hälfte eines Streukreisdurchmessers beträgt, wobei sich der Streukreisdurchmesser aus dem Schärfentiefebereich, der Brennweite und der Blenden zahl der Aufrichteeinheit und deren Arbeitsabstand zum reellen Zwischenbild ergibt.
Der Streukreisdurchmesser, d.h. der Durchmesser eines Zerstreuungskreises bestimmt in Ver- bindung mit der Größe eines Pixels, ob ein Objekt auf dem Detektor scharf abgebildet wird oder nicht. Befindet sich - bei Betrachtung in der geometrischen Optik - ein Objektpunkt (probenseiti ger Punkt) in einer Objektebene einer Linse, so wird von diesem Punkt ausgehendes Licht in der zugehörigen Bildebene in einem Bildpunkt fokussiert. Ein in dieser Ebene platzierter Detektor detektiert ein scharfes Bild. Sofern der Objektpunkt sich nicht mehr in der ursprünglichen Objekt- ebene der Linse befindet, wird der ursprünglich in der Bildebene zusammenlaufende Lichtkegel beispielsweise abgeschnitten und es entsteht ein Zerstreuungskreis auf dem Detektor.
Betrachtet man eine beugungsbegrenzte optische Abbildung, so stellt das sogenannte Airy- Scheibchen (der Querschnitt senkrecht zur optischen Achse durch die PSF) die kleinstmögliche Abbildung eines probenseitigen Punktes dar. Ein Punkt im abzubildenden Objekt (also der Probe) wird im Bild zu einem Airy-Scheibchen (bzw. allgemein der PSF).
Erfindungsgemäß wird in der zuvor beschriebenen Ausgestaltung somit der Detektor derart ge wählt, dass der Zerstreuungskreis einem maximal tolerierbaren Zerstreuungskreisdurchmesser entspricht, sodass eine scharfe Abbildung erhalten wird.
Über die Blendenzahl, welche das Verhältnis der Brennweite eines optischen Systems zum Durchmesser seiner Eintrittspupille (der Apertur) beschreibt, ist gewöhnlicher Weise die Schär fentiefe des optischen Systems variierbar, wobei die Schärfentiefe direkt proportional zur Blen denzahl ist. Die Blendenzahl bezieht sich auf die Bildseite eines optischen Systems und kann auch aus einem bildseitigen Öffnungswinkel berechnet werden.
Im Gegensatz hierzu kann das optische System auch durch die numerische Apertur (NA) be- schrieben werden, welche sich aus dem Produkt des Sinus des halben objektseitigen Öffnungs winkels und dem Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Fokus ergibt. Beide Grö ßen, Blendenzahl und NA, können durch die Linsengleichung miteinander in Verbindung gesetzt werden.
In dieser Ausgestaltung ist somit allein durch die Geometrie des Detektors und dessen Pixel so- wie den mit der Aufrichteeinheit erzielten Streukreisdurchmesser eine scharfe Abbildung des re ellen Zwischenbildes innerhalb des Schärfentiefebereichs möglich. Aufgrund einer Erhöhung der Schärfentiefe der Aufrichteeinheit kann sich die Punkt-Spreiz-Funk- tion (Point-Spread-Function; PSF) verformen. Eine solche verformte PSF kann in die PSF des kompletten Systems einfließen, das heißt bei der Bildverarbeitung berücksichtigt werden. Mittels der verformten PSF können beispielsweise die Bilder eines Bilderstapels entfaltet werden. Die verformte PSF kann aufgrund der Verkippung innerhalb eines aufgenommenen Bildes ortsvariant sein und hängt nicht nur von der Beleuchtung ab. Eine relative Position von einer Detektions- und einer Beleuchtungs-PSF variiert aufgrund der Verkippung über das Bildfeld. In einer Ausgestal tung des erfindungsgemäßen Verfahrens können durch Entfalten der aufgenommenen Bilder mit einer modifizierten PSF Artefakte reduziert werden. Alternativ oder zusätzlich kann durch weitere computergestützte Bildverbesserungsverfahren (beispielsweise durch sog. „Computational Clea ring“ wie in WO 2019/185174 A1 beschrieben) eine weitere Reduktion von Artefakten erzielt wer den.
Zusammenfassend können die zuvor erwähnten, die Schärfentiefe erhöhenden Aberrationen durch eine Fehlanpassung des Brechungsindexes, durch Pupillenfilter oder aber durch eine ab errationsbehaftete Anordnung der Aufrichteeinheit erzeugt werden. In letzterem Fall kann bei spielsweise ein nicht telezentrischen System verwendet werden. Ein solches ist, wenn die Auf richteeinheit aus zwei Linsen besteht (Objektiv und Tubuslinse), dadurch charakterisiert, dass diese beiden Linsen nicht in einem Abstand voneinander angeordnet sind, der der Summe ihrer Brennweiten entspricht. Allgemein kann die durch die Aufrichteeinheit auf den Detektor abzubil dende Ebene weiter von der Aufrichteeinheit entfernt liegen als deren Fokusebene, d.h. der Ar beitsabstand kann vergrößert sein und die Aufrichteeinheit kann mehr zur optischen Achse der Detektionsanordnung hin verkippt werden, ohne an die Detektionsanordnung anzustoßen.
Neben den zusätzlich möglichen Post-Processing-Schritten des Computational Clearing bzw. des Entfaltens der aufgenommenen Bilder mit der modifizierten PSF kann in einer weiteren Ausge staltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Umsortieren aufgenommener Bilddaten durch geführt werden, sodass jedes erhaltene Bild eine Ebene repräsentiert, welche senkrecht zur op tischen Achse der Detektionsanordnung orientiert ist. Ein solches Umsortieren hat den Vorteil, dass die erhaltenen Bilder intuitiv verständlich für den Anwender sind und eine leichtere Interpre tation des Inhaltes in Bezug zur Lage der dargestellten Strukturen in der Probe ermöglichen.
Ein Post-Processing-Schritt kann der Kompensation aufgenommener Artefakte dienen, welche durch die Erhöhung der Schärfentiefe hervorgerufen werden. Die dem Schiefeebenemikroskop eigene System-PSF entspricht einem Produkt aus der PSF der Beleuchtung und der PSF der Detektion und kann für die Entfaltung genutzt werden. Diese weist die Besonderheit auf, dass Beleuchtung und Detektion weder kollinear noch senkrecht aufeinander stehen. Die Post-Proces- sing-Schritte können auch miteinander kombiniert werden, so kann beispielsweise nach dem Um sortieren der aufgenommenen Bilddaten das so erhaltene Bild der Ebene jeweils mit einer einzi gen (entsprechend gedrehten) System-PSF entfaltet werden. In diesen Ebenen kann zudem von einer homogenen Unschärfe ausgegangen werden, die in der Bildverarbeitung berücksichtigt werden kann.
Bei Schiefeebenemikroskopen (OPM / SCAPE) müssen die Beleuchtung und die Detektion nicht zwingend senkrecht aufeinander stehen. Damit kann die Beleuchtung teilweise im Detektions lichtkegel verlaufen. Wenn Beleuchtung und Detektion nicht senkrecht aufeinander stehen, dann kann die Detektion unter Umständen zumindest teilweise in einer Richtung stattfinden, die der Beleuchtung entgegengesetzt ist. Somit kann das, die Probe beleuchtende Lichtblatt den Detek tionslichtkegel in einem Bereich außerhalb der Schärfentiefe der Aufrichteeinheit in der Probe einschließen. Da die Detektion teilweise in entgegengesetzter Beleuchtungsrichtung stattfindet kann hierbei das Optical Sectioning abnehmen. Dies kann zu einem Kontrastverlust führen. Das Computational Clearing und/oder optisches Klären der Probe kann in diesem Fall besonders vor teilhaft sein, da es diese beiden Verfahren ermöglichen, diesen Kontrastverlust zu kompensieren bzw. zu verhindern.
Das erfindungsgemäße Schiefeebenemikroskop und das erfindungsgemäße Verfahren erlauben einen einfachen Wechsel der Detektionsanordnung, sodass ein Beleuchtungsstrahl auch für eine Detektionsanordnung mit größerer oder kleinerer Apertur am Rand der Pupille in die Detektions anordnung eingekoppelt werden kann. Hierdurch kann sich der Winkel zwischen Lichtblatt und optischer Achse verändern. Solange die Winkeländerung des Lichtblattes zur optischen Achse und eine daraus resultierende Winkeländerung des reellen Zwischenbildes innerhalb des Schär fentiefebereichs der Aufrichteeinheit verbleibt, tritt durch einen Wechsel der Detektionsanordnung keine zusätzliche Unschärfe der aufgenommenen Bilder auf.
Ferner kann durch eine Veränderung des Kippwinkels des Lichtblattes in der Probe eine Eindring tiefe in der Probe variiert werden. In einigen Anwendungsfällen kann es erwünscht sein, die Bild ebene gegenüber der optischen Achse unterschiedlich stark zu verkippen. Dies ist im Stand der Technik typischerweise nicht praktikabel, da in diesem Fall auch die Aufrichteeinheit mitsamt dem Detektor rotiert werden müsste, was unter Beibehaltung einer optimalen Justage sehr aufwendig ist. Eine erhöhte Schärfentiefe gemäß dem Schiefeebenemikroskop bzw. dem Verfahren der vor liegenden Erfindung räumt jedoch hinsichtlich der Verkippung der Aufrichteeinheit zur optischen Achse einen Spielraum ein und ermöglichst die Veränderung des Kippwinkels. Die Möglichkeit, den Offsetwinkel zwischen Detektionsanordnung zum reellen Zwischenbild zu erhöhen, ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Bildqualität beibehalten, also hierzu keine Reduktion der numerischen Apertur der Aufrichteeinheit notwendig ist, da diese zum einen eine geringere Lichtausbeute zur Folge hat, als auch eine geringere Auflösung nach sich zieht. Sofern die numerische Apertur der Aufrichteeinheit beibehalten werden kann, wird, selbst wenn keine Erhöhung der Auflösung möglich ist, eine höhere Lichtausbeute erzielt.
Der im erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskop bzw. im erfindungsgemäßen Verfahren ver wendete Detektor kann eine aus dem Stand der Technik bekannte Kamera (CCD, CMOS, etc.) sein. Im Allgemeinen führt eine Erhöhung der Schärfentiefe einer Aufrichteeinheit eines Schie feebenemikroskops zu einer geringeren axialen Auflösung dieser Aufrichteeinheit. Erfindungsge mäß kann es darum vorteilhaft sein, eine aufgrund der Erhöhung der Schärfentiefe verringerte axiale Auflösung durch Post-Processing-Schritte zu kompensieren. Selbst wenn diese Kompen sation keine Verbesserung der Auflösung nach sich zieht, wird aufgrund der Verkippung der Auf richteeinheit eine erhöhte Lichtausbeute ermöglicht. Die Kompensation einer verringerten axialen Auflösung der Aufrichteeinheit ist insbesondere von Vorteil, da diese maßgeblich die Auflösung des Schiefeebenemikroskops (OPM / SCAPE) bestimmt.
Rein beispielhaft ermöglicht die vorliegende Erfindung bei einem Bildfeld von 20 pm und für 5 pm Schärfentiefe eine Verkippung der Aufrichteeinheit um ca. 8°. Bereits eine solche mögliche Ver kippung kann eine Kollision der Detektionsanordnung mit der Aufrichteeinheit verhindern.
Die in einigen Ausgestaltungen beschriebene Erhöhung bzw. das Hinzufügen von sphärischen Aberrationen haben zur Folge, dass hohe Raumfrequenzen im abzubildenden Bereich der Probe zwar noch übertragen werden, aufgrund einer durch die sphärischen Aberrationen veränderten Modulationstransferfunktion (MTS) allerdings stärker gedämpft werden. In den Post-Processing- Schritten können (bevorzugt nur) diese Raumfrequenzen, beispielsweise durch die Entfaltung mit der modifizierten PSF, verstärkt und somit die höheren Raumfrequenzen stärker vom Rauschen abgegrenzt werden, sodass diese nicht gänzlich durch Rauschen überdeckt werden. Denkbar ist auch eine Entrauschung vor der Entfaltung.
Der Begriff "und/oder" umfasst alle Kombinationen von einem oder mehreren der zugehörigen aufgeführten Elemente und kann mit "/" abgekürzt werden.
Obwohl einige Aspekte im Rahmen einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist es klar, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, wobei ein Block oder eine Vorrichtung einem Verfahrensschritt oder einer Funktion eines Verfahrensschritts ent spricht. Analog dazu stellen Aspekte, die im Rahmen eines Verfahrensschritts beschrieben wer den, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Elements oder einer Eigen schaft einer entsprechenden Vorrichtung dar. Im Folgenden soll die vorliegende Erfindung anhand beigefügter Zeichnungen näher erläutert werden. Die in den Zeichnungen dargestellten Ausgestaltungen stellen lediglich beispielhafte Ausgestaltungen der Erfindung dar, wobei die in den Zeichnungen beschriebenen Merkmale be liebig miteinander kombiniert bzw. weggelassen werden können, sofern es nicht auf den mit den weggelassenen Merkmalen erzielten technischen Effekt ankommt. Gleiche, in den Figuren gezeigte technische Merkmale und technische Merkmale gleicher Funk tion werden durch gleiche Bezugszeichen beschrieben. Hierbei kennzeichnet die vorangestellte Hunderterstelle die Figur, in welcher das besagte Merkmal zuerst beschrieben wird. Sofern nicht explizit ausgeschlossen, können in höherrangigen Figuren das erste Mal genannte Merkmale auch in zuvor genannten Figuren verwendet werden. Eine solche Kombination stellt hierbei eine weitere, wenn auch nicht gezeigte Ausgestaltung der Erfindung dar.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskops;
Fig. 2 einen Ausschnitt der schematischen Darstellung der Fig. 1;
Fig. 3 eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Aufrichteeinheit;
Fig. 4 noch eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Aufrichteeinheit;
Fig. 5 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskops; und
Fig. 6 eine schematische Darstellung des Schiefeebenemikroskops zur Verdeutlichung des Detektionslichtkegels. Die Fig. 1 zeigt ein Schiefeebenemikroskop 101 in einer schematischen Darstellung. Das Schie feebenemikroskop 101 umfasst eine Detektionsanordnung 103, mittels welcher Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105 aus von einem Lichtblatt 107 beleuchteten Bereichen 109 eines Probenvo lumens 111 aufgesammelt wird. Das Lichtblatt 107 wird durch im Probenvolumen 111 fokussiertes Beleuchtungslicht 107a aus gebildet. Das Beleuchtungslicht 107a kann beispielsweise über eine Spiegelanordnung 107b in das Schiefeebenemikroskop 101 eingebracht werden. Die Einkopplung des Beleuchtungslichts 107a ist rein beispielhaft gezeigt und kann in anderen Ausgestaltungen an anderen Stellen in das Schiefeebenemikroskop 101 erfolgen.
Die Detektionsanordnung 103 bildet die vom Lichtblatt 107 beleuchteten Bereiche 109 der Probe 111b auf einer vom Probenvolumen 111 abgewandten Seite 113 in einem reellen Zwischenbild 115 ab.
Dieses reelle Zwischenbild 115 ist bezüglich einer Fokusebene 117 der Detektionsanordnung 103 verkippt.
Die Detektionsanordnung 103 ist rein beispielhaft durch zwei Linsen 103a gezeigt. In anderen Ausgestaltungen können diese hier gezeigten Linsen 103a auch jeweils ein Objektiv 103b sein. Die Linse 103a, welche dem Probenvolumen 111 zugewandt ist, kann eine Immersionsoptik 135 sein. Eine Linse 103a kann eine erste Detektionsoptik 103c sein, welche das von einer Probenseite 111a stammende Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105 einsammelt. Die Detektionsanordnung 103 kann ein T eleskop 104 sein und ferner eine zur vom Probenvolumen 111 abgewandten Seite 113 hin weisende zweite Detektionsoptik 103d umfassen.
Ferner umfasst das Schiefeebenemikroskop 101 eine optische Aufrichteeinheit 119, mittels wel- eher ein vorbestimmtes Bildfeld 121 des reellen Zwischenbildes 115 auf einem Detektor 123 ab gebildet wird.
Das vorbestimmte Bildfeld 121 ist rein schematisch eindimensional als Breite 121a dargestellt, kann jedoch als zweidimensionale Fläche, die zusätzlich in die Zeichenebene hinein- oder her ausragt, verstanden werden. Diese zweidimensionale Fläche ist durch die gezeigte Breite 121a und eine nicht gezeigte Tiefe festgelegt.
Das reelle Zwischenbild 115 kann sich über das vorbestimmte Bildfeld 121 hinaus erstrecken.
Die Aufrichteeinheit 119 weist einen Schärfentiefebereich 129 auf, der schematisch als Rechteck im vergrößerten Bereich 129a dargestellt ist. Auch der Schärfentiefebereich 129 ragt in die Zei chenebene hinein bzw. aus dieser heraus und kann als Quader verstanden werden. Alle sich innerhalb dieses Quaders befindlichen Punkte können durch die Aufrichteeinheit 119 scharf auf den Detektor 123 abgebildet werden.
Der Schärfentiefebereich 129 wird somit durch das vorbestimmte Bildfeld 121 und eine Schärfen tiefe 129b bestimmt. An dieser Stelle sei erwähnt, dass durch den hier gezeigten Schärfentiefebereich 129 jener drei dimensionale Bereich zu verstehen ist, innerhalb welchem sich das vorbestimmte Bildfeld 121 des reellen Zwischenbildes 115 befinden sollte, um mit dem Detektor 123 tolerierbare Bilddaten (nicht gezeigt) zu erhalten. Diese tolerierbaren Bilddaten können entweder unmittelbar durch die Aufrichteeinheit 119 erreicht werden, indem ein maximal tolerierbar Zerstreuungskreis des abge- bildeten vorbestimmten Bildfeldes auf dem Detektor erreicht wird, welcher mit gegebener Pi xelgröße eine scharfe Abbildung erlaubt, oder aber mittelbar durch eine Abbildung der Auf richteeinheit 119 und nachgeschaltete Post-Processing-Schritte der aufgenommenen Daten, in welchen zur Optimierung der aufgenommenen Bilddaten die systemeigenen Charakteristika be rücksichtigt werden. Diese sind beispielsweise die sogenannte Punkt-Spreiz-Funktion (PSF; eng- lisch: point spread function) der Aufrichteeinheit 119.
Die Aufrichteeinheit 119 ist schematisch mit einer vorderen Linse 139 gezeigt. In einer klassi schen Anordnung 119a der Aufrichteeinheit 119, das heißt in einer Anordnung aus dem Stand der Technik, ist eine optische Achse 131 der Aufrichteeinheit 119 im Allgemeinen senkrecht zum reellen Zwischenbild 115 orientiert. Erfindungsgemäß wird von der senkrechten Anordnung ab- gewichen und die optische Achse 131 der Aufrichteeinheit 119 und das reelle Zwischenbild 115 sind unter einem spitzen Winkel 127a zueinander orientiert. Dies stellt eine erfindungsgemäße Positionierung 119b der Aufrichteeinheit 119, bzw. 131b der optischen Achse 131 dar.
Die vordere Linse 139 bzw. die entsprechende optische Achse 131 sind in der klassischen An ordnung 119a bzw. 131a gestrichelt gezeichnet, wohingegen die optische Achse 133 der Detek- tionsanordnung 103 strichpunktiert gezeichnet ist.
Im in Fig. 1 gezeigten erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskop 101 ist die Fokusebene 125 der Aufrichteeinheit 119 um einen Offsetwinkel 127 zum reellen Zwischenbild 115 verkippt. Der Offsetwinkel 127 ist im vergrößerten Bereich 129a gezeigt.
Wie im vergrößerten Bereich 129a zu erkennen, befindet sich das vorbestimmte, durch die Auf- richteeinheit 119 abzubildende Bildfeld 121 des reellen Zwischenbildes 115 vollständig innerhalb des Schärfentiefebereichs 129. Im Vergleich zur klassischen Anordnung 119a befindet sich die Aufrichteeinheit 119 erfindungs gemäß somit in einer verkippten Anordnung bzw. in der erfindungsgemäßen Positionierung 119b.
Diese verkippte Anordnung 119b kann von der Aufrichteeinheit 119 eingenommen werden, da sich bis hin zu dieser Anordnung 119b, d.h. bis zum Offsetwinkel 127 das reelle Zwischenbild 115 diagonal im Schärfentiefebereich 119 angeordnet befindet. In der gezeigten Anordnung ist die optische Achse 131 der Aufrichteeinheit 119 zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 hin gekippt.
Die Aufrichteeinheit 119 ist in einem Arbeitsabstand 141 vom reellen Zwischenbild 115 entfernt angeordnet. Dieser ist für die Aufrichteeinheit 119 in der verkippten Anordnung 119b eingezeich- net.
Ferner ist in Fig. 1 ein probenseitiger Detektionslichtkegel 105a schematisch dargestellt. Dieser probenseitige Detektionslichtkegel 105a ist auf der Probenseite 111a punktiert dargestellt und kann beispielsweise durch die erste Detektionsoptik 103c definiert sein. Da die erste Detektions optik 103c ebenso eine Immersionsoptik 135 sein kann, ist der probenseitige Detektionslichtkegel 105a innerhalb gewisser Grenzen vergrößerbar. Dieser probenseitige Detektionslichtkegel 105a bestimmt folglich das maximal von der Detektionsanordnung 103 erfassbare, d.h. aufsammeibare Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105. Dieser wird beispielsweise durch eine numerische Apertur NA der Detektionsanordnung 103 bestimmt.
Die Fig. 2 zeigt den Bereich des reellen Zwischenbildes 115 in einer Detaildarstellung, welche einen separaten kreisförmigen Ausschnitt der vorderen Linse 139 und des Schärfentiefebereichs 129 schematisch darstellt. Durch die Notwendigkeit, die Aufrichteeinheit 119 zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 verkippt anzuordnen, erlaubt die Aufrichteeinheit 119 lediglich das Aufsammeln von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105 aus einem zweiten Detektionslichtke gel 219c. Dieser ergibt sich als Schnittmenge zwischen dem bildseitigen Detektionslichtkegel 205a der Detektionsanordnung 103 und einem (theoretischen) Lichtkegel 219d der Aufrichteein heit 119.
In Fig. 2 ist der theoretische Lichtkegel 219d der Aufrichteeinheit 119 mit einer gestrichelten Linie, der bildseitige Detektionslichtkegel 205a mit einer punktierten Linie und der sich ergebende zweite Detektionslichtkegel 219c als schraffierten Fläche dargestellt. Wie in der Fig. 1 durch den Vergleich der Lage der vorderen Linse 139 in der klassischen Anordnung 119a bzw. der erfin dungsgemäßen Positionierung 219b ersichtlich, kann durch den Offsetwinkel 127, d.h. durch das Verkippen der Aufrichteeinheit 119 zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 hin, der zweite Detektionslichtkegel 219c und somit die Menge von auf den Detektor 123 auftreffen den Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105 vergrößert werden. In Fig. 2 befindet sich die Auf richteeinheit (nicht gezeigt) in der erfindungsgemäßen Positionierung 119b.
Wie in Fig. 2 dargestellt, bestimmt der Offsetwinkel 127 maßgeblich, welcher Anteil des Streu- und/oder Fluoreszenzlichts 105 sich im zweiten Detektionslichtkegel 219c befindet und zur De tektion zur Verfügung stehen kann. In den Fig. 3, 4 und 5 werden erfindungsgemäße Lösungen dargestellt, welche eine Vergrößerung des Schärfentiefebereichs 129 ermöglichen, was wie derum eine Vergrößerung des Offsetwinkels 127 erlaubt. Diese Lösungen erlauben es somit, die Aufrichteeinheit 119 mehr zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 hin zu verkip- pen, wodurch eine größere Lichtausbeute erzielt und ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis verbes sert werden kann.
In Fig. 3 ist eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Aufrichteeinheit 119 gezeigt. Diese umfasst neben der vorderen Linse 139 zwei Filter 343, wobei beide Filter 343 Pupillenfilter 345 sein können. Einer der Filter 343 ist eine Phasenmaske 347, wohingegen der andere Filter 343 eine Amplitudenmaske 349 ist.
Die Filter 343 modifizieren einen Strahlengang 351 des Streu- und/oder Fluoreszenzlichts 105, sodass sich ein modifizierter Strahlengang 353 ergibt. Dieser ist schematisch, rein beispielhaft und nicht einschränkend sowohl nach der Phasenmaske 347, als auch nach der Amplituden maske 349 dargestellt. Ferner sind in einem schraffiert gekennzeichneten Bereich weitere opti- sehe Elemente 355 angedeutet, welche das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 105 auf dem De tektor 123 abbilden.
Rein beispielhaft können mit der Phasenmaske 347 Strahlverläufe des Streu- und/oder Fluores zenzlichts 105 erzeugt werden, die eine PSF aufweisen, die besselförmig oder airyförmig sind. Das heißt, dass die PSF durch eine Besselfunktion oder ein Airy-Profil beschreibbar sind. Hierzu weist die Phasenmaske 347 einen linearen (Bessel) bzw. einen kubischen (Airy) Verlauf der Pha senänderung in Abhängigkeit von einer Ortskoordinate auf. Diese Änderung der Strahlverläufe bewirkt einen vergrößerten Schärfentiefebereich 129, der wiederum eine Vergrößerung des mög lichen Offsetwinkels 127 ermöglicht.
Des Weiteren ist in Fig. 3 ein PC 357 gezeigt, der stellvertretend für eine Auswertevorrichtung 359 dargestellt ist. Auch ein Mikrocontroller oder beispielsweise ein integrierter Schaltkreis kön nen verwendet werden. Der PC 357 ist ausgestaltet, mittels Post-Processing-Modulen 361 vom Detektor 123 aufgenommene Bilddaten 363 zu verarbeiten und beispielsweise die aufgenomme nen Bilder mit einer modifizierten PSF zu entfalten und/oder mittels Computational Clearing zu optimieren und/oder die Bilddaten derart zu bearbeiten, dass jedes neu berechnete Bild eine Ebene repräsentiert, welche senkrecht zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 orientiert ist. Ferner kann die in Fig. 1 gezeigte Probe 111b optisch geklärt sein, d.h. hinsichtlich ihrer Brechzahl 111c an eine zweite Brechzahl 112a eines Umgebungsmediums 112 angepasst sein. Diese Verfahrensschritte reduzieren einzeln oder in Kombination das Auftreten von Artefak ten und können die Messung verbessern. Ferner ermöglicht eine Umsortierung der Bilddaten, sodass jedes erhaltene Bild eine Ebene repräsentiert, welche senkrecht zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 orientiert ist, dass diese erhaltenen Bilder intuitiv verständlich sind, da sie eine Ebene in der Probe 111b zeigen, die nicht geneigt ist.
Die Fig. 4 zeigt eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Aufrichteeinheit 119, welche ein Mikrolinsenarray 465 umfasst. Das Mikrolinsenarray 465 weist aufgrund der numerischen Apertur NA jeder der einzelnen Mikrolinsen 465a einen vergrößerten Schärfentiefebereich 129 (siehe Fig. 1) auf und ermöglicht somit eine Verkippung der Aufrichteeinheit 119 hin zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103. In Fig. 4 ist die Abbildung eines einzelnen Punktes des reellen Zwischenbildes 115 lediglich schematisch angedeutet. Ferner können in der in Fig. 4 ge zeigten Ausgestaltung der Aufrichteeinheit 119 auch die Filter 343 der Fig. 3 verwendet werden. Andersherum können in der Ausgestaltung nach Fig. 3 auch Mikrolinsen 465a als Phasenmaske 347 eingesetzt werden.
Eine weitere Möglichkeit, den Schärfentiefebereich 129 der Aufrichteeinheit zu erhöhen, um eine weitere Verkippung zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 zu ermöglichen ist in Fig. 5 gezeigt. Hier ist schematisch eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Schie feebenemikroskops 101 gezeigt. Das Schiefeebenemikroskop 101 umfasst in der gezeigten Ausgestaltung eine Aufrichteeinheit 119, die als Teleskop 104 ausgestaltet ist.
In Fig. 5 sind zwei mögliche Anordnungen des Teleskops 104 gezeigt, wobei diese möglichen Positionen des Teleskops 104 sowie die sich ergebenden Strahlengänge 351 durch die verwen deten Linien, durchgängig bzw. gestrichelt, unterschieden werden können. In der in Fig. 5 gezeigten Ausgestaltung der Aufrichteeinheit 119 werden im Stand der Technik die beiden Linsen 103a so angeordnet, dass sich die vordere Linse 139 im Arbeitsabstand 141 zum reellen Zwischenbild 115 befindet. Dieser Arbeitsabstand 141 entspricht einem freien Ar beitsabstand 142. Der freie Arbeitsabstand 142 definiert den Arbeitsabstand 141, für welchen das Teleskop 104 optimiert ist, d.h., dass eine Abbildung mit einem Arbeitsabstand 141, der dem freien Arbeitsabstand 142 entspricht, mit kleinstmöglichen optischen Fehlern erfolgen kann. Eine Abbildung mit einem hiervon abweichenden Arbeitsabstand 141 vergrößert die bei der Ab bildung auftretenden sphärischen Aberrationen. Die sphärischen Aberrationen werden ausge nutzt, um den Schärfentiefebereich 129 zu erhöhen. Dadurch gegebenenfalls auftretende Arte fakte können mittels Post-Processing kompensiert oder zumindest reduziert werden. Eine solche Anordnung, in welcher der Arbeitsabstand 141 nicht dem freien Arbeitsabstand 142 entspricht, ist in Fig. 5 gestrichelt dargestellt, wobei das Bezugszeichen 567 die berechnete optimale Lage des entsprechenden Elements, wie beispielsweise der Linsen 103a bzw. des Strahlenganges 351 beschreibt.
Wird jedoch als Arbeitsabstand 141 ein tatsächlicher Arbeitsabstand 541a gewählt, der größer ist als der freie Arbeitsabstand 142, erhöht sich aufgrund verstärkt auftretender sphärischen Aber- rationen des Teleskops 104 in einer solchen veränderten Lage 569 eine erreichte Schärfentiefe 129b und es ergibt sich somit ein vergrößerter Schärfentiefebereich 129. Diese wiederum erlaubt eine größere Verkippung der Aufrichteeinheit 119 in der veränderten Lage 569 hin zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103.
In Fig. 5 entspricht der freie Arbeitsabstand 142 in der berechneten optimalen Lage 567 einer Brennweite 571 (auch: f) der vorderen Linse 139. Dahingegen ist der tatsächliche Arbeitsabstand 541a in der veränderten Lage 569 der Aufrichteeinheit 119 größer als die Brennweite 571 der vorderen Linse 139.
In anderen Ausgestaltungen der Aufrichteeinheit kann der Strahlengang 351 zwischen den bei den gezeigten Linsen 103a nicht kollimiert verlaufen. Auch in einem solchen Fall, d.h. einer sol- chen Anordnung kann erfindungsgemäß vom (berechneten und optimalen) Arbeitsabstand 141 der Aufrichteeinheit 119 zum reellen Zwischenbild 115 abgewichen werden, wobei der tatsächli che Arbeitsabstand 541a größer ist als der freie Arbeitsabstand 142 der Aufrichteeinheit 119, jedoch nicht unbedingt größer ist als die Brennweite 571 der vorderen Linse 139.
Bevorzugt und auch unabhängig von einer der oben beschriebenen konkreten Umsetzungen kann eine erfindungsgemäße Aufrichteeinheit so gestaltet sein, dass für den tatsächlichen Ar beitsabstand 541a Abbildungsfehler wie Vignettierungen und Farbfehler (chromatische Aberra tionen) weitestgehend korrigiert sind, aber sphärische Aberrationen auftreten. In Fig. 6 sind Teile des erfindungsgemäßen Schiefeebenemikroskops 101 schematisch darge stellt, um die Schritte zur Erhöhung der Sammeleffizienz der Aufrichteeinheit 119 zu erläutern. In Fig. 6 ist von der Detektionsanordnung 103 lediglich die zweite Detektionsoptik 103d und von der Aufrichteeinheit 119 lediglich die vordere Linse 139 schematisch angedeutet. Die Aufrichteeinheit 119 ist sowohl in der klassischen Anordnung 119a, als auch in der verkippten Anordnung 119b gezeigt. In der klassischen Anordnung 119a können sich die Detektionsanord nung 103 und die Aufrichteeinheit 119 in einem Kollisionsbereich 673 berühren.
Erfindungsgemäß wird eine solche Kollision beider Komponenten 103, 119 durch die Verkippung der Aufrichteeinheit 119 zur optischen Achse 133 der Detektionsanordnung 103 hin vermieden Eine solche verkippte Anordnung 119b ist zur Unterscheidung mit einer durchgezogenen Linie gezeichnet.
Zudem ist in Fig. 6 eine weitere Möglichkeit eingezeichnet, die Lichtausbeute weiter zu erhöhen. Dies wird durch die Wahl einer vorderen Linse 139 mit einer zweiten numerischen Apertur NA2 ermöglicht, welche in dieser größeren Form einsetzbar ist, da durch die Verkippung ein Spielraum zwischen der Detektionsanordnungen 103 und der Aufrichteeinheit 119 vergrößert wurde.
Der jeweils zweite Detektionslichtkegel 219c wird somit von jenem, für die klassische Anordnung 119a, diese ist der Übersichtlichkeit halber mit einem großen Buchstaben A markiert, zu dem zweiten Detektionslichtkegel 219c vergrößert, der für die verkippte Anordnung 119b erreicht wird, dieser ist mit einem großen Buchstaben B markiert, wobei letzterer durch eine vergrößerte nu- merische Apertur NA2 der vorderen Linse 139 bzw. der Aufrichteeinheit 119 noch weiter vergrö ßert werden kann, der vergrößerte zweite Detektionslichtkegel 219c ist hierbei mit einem großen Buchstaben C markiert. Der Lichtkegel A ist in B mit umfasst und im Lichtkegel C werden A und B umfasst.
Eine weitere Möglichkeit, die numerische Apertur NA der Aufrichteeinheit 119 zu erhöhen, kann darin bestehen, zwischen die Detektionsanordnung 103 und die Aufrichteeinheit 119 ein Immer sionsmedium 675 einzubringen, welches eine Brechzahl 677 aufweist, die größer als jene Brech zahl 677 von Luft ist. Dies kann beispielsweise eine Flüssigkeit wie ein Öl sein. Bezugszeichen
101 Schiefeebenemikroskop
103 Detektionsanordnung
103a Linse
103b Objektiv
103c erste Detektionsoptik
103d zweite Detektionsoptik
104 Teleskop
105 Streu- und/oder Fluoreszenzlicht
105a probenseitiger Detektionslichtkegel
205a, bildseitiger Detektionslichtkegel
107 Lichtblatt
107a Beleuchtungslicht
107b Spiegelanordnung
109 beleuchteter Bereich
111 Probenvolumen
111a Probenseite
111b Probe
111c Brechzahl der Probe
113 vom Probenvolumen abgewandte Seite
115 reelles Zwischenbild
117 Fokusebene
119 optische Aufrichteeinheit
119a klassische Anordnung der Aufrichteeinheit
119b verkippte Anordnung der Aufrichteeinheit
219c zweiter Detektionslichtkegel
219d Lichtkegel der Aufrichteeinheit
121 vorbestimmtes Bildfeld
121a Breite
123 Detektor
125 Fokusebene
127 Offsetwinkel
127a spitzer Winkel
129 Schärfentiefebereich
129a vergrößerter Bereich 129b Schärfentiefe
131 optische Achse der Aufrichteeinheit
131a klassische Anordnung der optischen Achse
131b erfindungsgemäße Positionierung der optischen Achse 133 optische Achse der Detektionsanordnung
135 Immersionsoptik
139 vordere Linse
141 Arbeitsabstand
142 freier Arbeitsabstand 343 Filter
345 Pupillenfilter
347 Phasenmaske
349 Amplitudenmaske
351 Strahlengang 353 modifizierter Strahlengang
355 weitere optische Elemente
357 PC
359 Auswertevorrichtung
361 Post-Processing-Modul 363 Bilddaten
465 Mikrolinsenarray
465a Mikrolinse
567 berechnete optimale Lage
569 veränderte Lage 571 Brennweite der vorderen Linse
673 Kollisionsbereich
675 Immersionsmedium
677 Brechzahl f Brennweite

Claims

Ansprüche
1. Schiefeebenemikroskop (101), umfassend eine Detektionsanordnung (103) zum Aufsammeln von Streu- und/oder Fluores zenzlicht (105) aus von einem Lichtblatt (107) beleuchteten Bereichen (109) eines Probenvolumens (111), wobei die Detektionsanordnung (103) ausgestaltet ist, auf ihrer vom Probenvolumen (111) abgewandten Seite (113) ein reelles Zwischenbild (115) der vom Lichtblatt (107) beleuchteten Bereiche (109) der Probe (111b) abzu bilden und wobei das reelle Zwischenbild (115) zu einer Fokusebene (117) der De tektionsanordnung (103) verkippt ist; und - eine optische Aufrichteeinheit (119) zum Abbilden eines vorbestimmten Bildfeldes
(121) des reellen Zwischenbildes (115) auf einen Detektor (123), wobei die Auf richteeinheit (119) einen Schärfentiefebereich (129) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fokusebene (125) der Aufrichteeinheit (119) um ei nen Offsetwinkel (127) zum reellen Zwischenbild (115) verkippt ist, und dass das vorbe- stimmte, durch die Aufrichteeinheit (119) abzubildende Bildfeld (121) des reellen Zwischen bildes (115) vollständig innerhalb des Schärfentiefebereichs (129) liegt.
2. Schiefeebenemikroskop (101) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das re elle Zwischenbild (115) diagonal im Schärfentiefebereich (129) angeordnet ist.
3. Schiefeebenemikroskop (101) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Achse (131) der Aufrichteeinheit (119) zur optischen Achse (133) der Detek tionsanordnung (103) hin gekippt ist.
4. Schiefeebenemikroskop (101) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufrichteeinheit (119) wenigstens eine Immersionsoptik (135) aufweist.
5. Schiefeebenemikroskop (101) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich- net, dass die Aufrichteeinheit (119) eine Phasenmaske (347) und/oder eine Amplituden maske (349) aufweist.
6. Schiefeebenemikroskop (101) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufrichteeinheit (119) wenigstens eine Linse (103a) umfasst, deren Position zum reellen Zwischenbild (115) von einer aberrationsminimierten Position der Linse (103a) abweicht, bei welcher die Aufrichteeinheit (119) bei Abbildung des reellen Zwischenbildes
(115) auf dem Detektor (123) die geringstmöglichen Aberrationen aufweist.
7. Schiefeebenemikroskop (101) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Auf richteeinheit (119) zwei Linsen (103a) umfasst, wobei ein Arbeitsabstand (141) der Auf richteeinheit (119) zum reellen Zwischenbild (115) so eingestellt ist, dass dieser von der Brennweite (f) einer, näher am reellen Zwischenbild angeordneten, vorderen Linse (139) der beiden Linsen (103a) abweicht.
8. Schiefeebenemikroskop (101) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufrichteeinheit (119) ein Mikrolinsenarray (465) umfasst.
9. Schiefeebenemikroskop (101) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch einen Detektor (123), umfassend eine Vielzahl von Pixeln, die eine Pixelgröße aufweisen, welche gleich oder kleiner der Hälfte eines Streukreisdurchmessers beträgt, wobei sich der
Streukreisdurchmesser aus dem Schärfentiefebereich (129), der Brennweite (f) und der Blendenzahl der Aufrichteeinheit (119) und deren Arbeitsabstand (141) zum reellen Zwi schenbild (115) ergibt.
10. Verfahren zur Aufnahme von Ebenen einer Probe (111b) repräsentierenden Bildern (363), umfassend
- Aufsammeln von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht (105) aus von einem Lichtblatt (107) beleuchteten Bereichen (109) eines Probenvolumens (111) mit einer Detekti onsanordnung (103);
Erzeugen eines reellen Zwischenbildes (115) der vom Lichtblatt (107) beleuchteten Bereiche (109) des Probenvolumens (111) mit der Detektionsanordnung (103), wobei das reelle Zwischenbild (115) zu einer Fokusebene (117) der Detektionsan ordnung (103) verkippt ist; und
- Abbilden eines vorbestimmten Bildfeldes (121) des reellen Zwischenbildes (115) auf einem Detektor (123) durch eine optische Aufrichteeinheit (119), gekennzeichnet durch das Verkippen einer Fokusebene (125) der Aufrichteeinheit (119) um einen Offsetwinkel (127) zum reellen Zwischenbild (115), wobei das vorbestimmte Bild feld (121) des reellen Zwischenbildes (115) vollständig innerhalb eines Schärfentiefebe reichs (129) der Aufrichteeinheit (119) liegt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, ferner umfassend das Reduzieren von Artefakten durch min- destens eines von:
Entfalten der aufgenommenen Bilder (363) mit einer modifizierten PSF; und Computational Clearing der aufgenommenen Bilder (363).
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, ferner umfassend das Umsortieren aufgenommener Bilddaten (363), so dass jedes erhaltene Bild eine Ebene repräsentiert, welche senkrecht zur optischen Achse (133) der Detektionsanordnung (103) orientiert ist.
13. Verwendung einer Aufrichteeinheit (119) in einem Schiefeebenemikroskop (101) zur Abbil- düng eines vorbestimmten Bildfeldes (121) eines von einer Detektionsanordnung (103) er zeugten reellen Zwischenbildes (115) auf einen Detektor (123), wobei das reelle Zwischen bild (115) zu einer Fokusebene (117) der Detektionsanordnung (103) verkippt ist und wobei die Aufrichteeinheit (119) einen Schärfentiefebereich (129) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fokusebene (125) der Aufrichteeinheit (119) um einen Offsetwinkel (127) zum reellen Zwischenbild (115) verkippt ist, und dass das vorbestimmte, durch die
Aufrichteeinheit (119) abzubildende Bildfeld (121) des reellen Zwischenbildes (115) voll ständig innerhalb des Schärfentiefebereichs (129) liegt.
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