EP4069822A1 - Procede de lyophilisation d'une composition cellulaire cryogenisee et contenant du gaz dissous - Google Patents

Procede de lyophilisation d'une composition cellulaire cryogenisee et contenant du gaz dissous

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Publication number
EP4069822A1
EP4069822A1 EP20828541.1A EP20828541A EP4069822A1 EP 4069822 A1 EP4069822 A1 EP 4069822A1 EP 20828541 A EP20828541 A EP 20828541A EP 4069822 A1 EP4069822 A1 EP 4069822A1
Authority
EP
European Patent Office
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cells
gas
composition
pressure
cellular composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP20828541.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Guillaume Gillet
Sarah KUYLLE
François Paul
Manon CAYET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Larena SAS
Genialis SAS
Original Assignee
Larena SAS
Genialis SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Larena SAS, Genialis SAS filed Critical Larena SAS
Publication of EP4069822A1 publication Critical patent/EP4069822A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to the field of lyophilisates of biological materials. More particularly, the invention relates to a new process for preparing a lyophilizate of cells comprising a step of “pressurized” cryogenics. In a preferred embodiment, this method is applied to lactic acid bacteria.
  • the cells can be lyophilized. Lyophilization is a process of drying a product previously frozen, by sublimation. By this process a dry product is therefore obtained which can be stored at 4 ° C. or at room temperature. However, this process is long, expensive and very energy intensive.
  • a method for lyophilizing cells comprises the steps of preparing a sample comprising the cells, centrifuging the sample and taking up the cell pellet in a cryoprotective medium and allowing dehydration, freezing of the sample and then lyophilization.
  • the freezing step is generally carried out at temperatures between -20 ° C (slow freezing) and -80 ° C (rapid freezing); rapid freezing is less deleterious for the cells but more difficult to implement on an industrial scale.
  • application WO2018 / 138461 describes a process for cooling biological material by cryogenics under high pressure, namely at a pressure of between 10 and 1000 bars. This process improves the survival rate of a strain of Lactobacillus bulgaricus by a factor of almost 400.
  • the inventors have shown that the quality and long-term viability of lyophilized cells, in particular probiotic bacterial strains, can be significantly improved when the freezing step is carried out via cryogenics under pressure, allowing gas to dissolve within the cell. matrix to be frozen before lyophilization.
  • the invention relates to a process for lyophilization of a cellular composition characterized in that the freezing step is coupled with a significant dissolution of gas in the product, occurring just before said freezing. Dissolution is carried out either by carrying out freezing in a pressurized chamber, or by subjecting the product to a very high density of gas molecules without necessarily an overpressure being observed.
  • Dissolution is carried out either by carrying out freezing in a pressurized chamber, or by subjecting the product to a very high density of gas molecules without necessarily an overpressure being observed.
  • the inventors have shown the interest of pressurized cryogenics as a method of freezing biological materials, in particular bacteria such as lactic acid bacteria. Indeed, this method allows better preservation of the cells during the freezing and lyophilization steps and therefore an improvement in the production yields of frozen cell preparations.
  • pressurized cryogenics is in itself advantageous over other freezing methods for the preservation of the integrity and / or viability of the cells.
  • the production yield is better, a lyophilized composition richer in cells is recovered at the end of the process. Therefore, the cell concentration of the lyophilisate is improved;
  • the cells are less damaged, their membrane integrity is maintained; this is advantageous for preserving the viability of the cells but also in the case of damaged or dead cells whose membrane or wall is damaged. Indeed, it has been shown for several years that non-viable bacteria can retain certain probiotic activities (adhesion, stimulation of the immune system, etc.).
  • the viability of the cells is increased at the end of the lyophilization step by comparison with products obtained by conventional lyophilization methods.
  • the stability of the cell lyophilisates is also observed over the long term, namely for several months, at 4 ° C. as at room temperature.
  • cryoprotectants very interestingly, they can also be observed in the absence of cryoprotectant with certain cells, in particular certain bacteria; by dispensing with the use of cryoprotectants, the addition of additives which are increasingly criticized is limited.
  • this process makes it possible to treat matrices of which the size of the beads formed can reach 7 to 8 mm as well as aggregates; the size parameter does not influence the efficiency of the process, nor the quality of the lyophilized product obtained.
  • the method according to the invention makes it possible to control the three critical parameters linked to the quality of a preparation of lyophilized cells: the cell concentration, the oxidation and the quantity of free water (the presence of water being harmful to -vis of the stability of lyophilized cells at room temperature and at 4 ° C), and thus allows the preparation of lyophilizate of bacteria of probiotic interest whose properties are preserved in the long term.
  • storage at 4 ° C is more or less suitable.
  • storage at room temperature makes use easier (transport, storage, use). It is therefore advantageous to have a preparation of bacteria of probiotic interest which can be stored at room temperature.
  • This process can be applied to many cell types: bacteria of interest probiotic and food (used for the manufacture of cheese in particular), yeasts, plant cells, micro-algae, microorganisms from the intestinal or faecal microbiota (for microbiota transplantation fecal in the treatment of Clostridium difficile infections), reproductive cells (oocytes and sperm) for animal and human reproduction, blood cells and stem cells.
  • bacteria of interest probiotic and food used for the manufacture of cheese in particular
  • yeasts plant cells
  • micro-algae microorganisms from the intestinal or faecal microbiota (for microbiota transplantation fecal in the treatment of Clostridium difficile infections)
  • reproductive cells oocytes and sperm
  • the inventors consider that the benefits of the process according to the invention for the preparation of frozen and / or lyophilized cells are based on the fact that cryogenics “under pressure” makes it possible to obtain frozen non-porous products containing a large quantity of perfectly dissolved gas. As this gas is not oxygen, oxidation reactions are avoided. In addition, the lyophilization of such products makes it possible to eliminate the major part of the water contained in the product. As a result, the conditions used in this process are on the whole gentler, less aggressive and less destructuring for the cells.
  • This process makes it possible to lyophilize fragile bacterial strains, which are not resistant to conventional lyophilization conditions. It also makes it possible to prepare bacterial lyophilisates which are stable at temperatures of 20 ° C, or even 25 ° C over long periods of up to 24 months in order to meet the expectations of manufacturers wishing to have lyophilized products more resistant to temperature changes. so as to reduce the constraints during transport, storage and conservation.
  • cryogenics is an almost instantaneous process, making it possible to continuously produce and at high rates (several hundred kg per hour with current equipment) balls of initially fluid product.
  • the time saving is considerable compared to freezing in a cold room, even if it operates at very low temperatures (-40 ° C to -80 ° C in general).
  • the cryogenized beads are extracted at temperatures generally between -80 ° C and -120 ° C, which makes it possible to start freeze-drying directly, with products whose temperature is around -60 ° C, without a prior cooling step.
  • the lyophilization time itself is very greatly reduced (at least by a factor of 2).
  • this process makes it possible to process larger quantities of raw materials while reducing the processing time. This last advantage makes it possible to obtain quality products even in the absence of cryoprotectant.
  • This process opens up new perspectives for the conservation of cells in the form of a lyophilizate, the properties of which are preserved during the lyophilization process and restored after redissolution, both in terms of active molecules and in terms of the viability of whole cells.
  • a first object of the invention relates to a method of lyophilization of a cellular composition characterized in that the freezing step is carried out by cryogenics and which comprises the steps of a) having a cellular composition comprising cells in a medium. watery; b) dissolving a gas in said composition by passing through an area dense in gas molecules, such a density being obtained (i) either by the gas flow generated by the evaporation of a cryogenic fluid, (ii) or by a pressure rise, (iii) either by a combination of the two phenomena; c) cryogenizing said gas-rich composition obtained in step b) at a pressure making it possible to maintain said dissolved gas in order to obtain frozen granules, particles or beads; d) lyophilization of said granules, particles or frozen beads to obtain a lyophilized cell preparation.
  • This process is therefore characterized by the fact of freezing the matrix consisting of a cellular composition by cryogenics in contact with a gas so as to dissolve gas in said matrix. Dissolution is obtained by passing said matrix through a zone dense in gas molecules.
  • the zone rich in gas molecules within the enclosure containing the cryogenic gas can be obtained in three ways: i) either by the gas flow generated by the evaporation of a cryogenic fluid, (ii) or by an elevation pressure, (iii) or by combining the two phenomena.
  • the quantity of gas dissolved in the matrix is typically equivalent, when no pressure is applied, to that which l 'one would obtain by the application of relative pressures of between 0.001 bars and 2 bars. This condition is called “cryozero" in the experimental part.
  • this pressure is greater than atmospheric pressure, and may in particular be greater than 0.1 bar, 0.5 bar, 1 bar, 2 bars, 5 bars, 10 bars, 15 bars, 20 bars, 25 bars, 30 bars, 50 bars or 100 bars.
  • under pressure within the meaning of the invention, is meant conditions which allow the dissolution of a gas in a matrix and / or the maintenance of the gas dissolved in said matrix during deep freezing. Pressurization can be obtained either by increasing the pressure or by bringing the matrix into contact with a cryogenic fluid, the evaporation of this gas creating a gas molecule density equivalent to pressurization so that the gas molecules dissolve in the matrix, or by a combination of the first two phenomena.
  • putting “under pressure” corresponds to the application of relative pressures, that is to say that atmospheric pressure is considered as a pressure of 0 bar. All pressures expressed in this document are relative pressures. In a preferred embodiment of the invention, the process is not carried out under partial vacuum.
  • step b) takes place at a relative pressure sufficient to allow the dissolution of gas in the matrix and an equivalent pressure is maintained in step c) to keep the dissolved gas at inside the matrix during cryonics.
  • the pressure applied in step c) is greater than or equal to atmospheric pressure.
  • the gas can be an inert gas.
  • the gas can be nitrogen, nitrous oxide, carbon dioxide, a rare gas such as argon, or a mixture of these gases.
  • the gas used is nitrogen
  • the cryogenic fluid is liquid nitrogen
  • the process As regards the implementation of the process as a whole, it is possible to chain the stages of the process one after the other and in particular to carry out the lyophilization stage immediately after the cryogenics stage. In addition, the process can be carried out continuously. It is also possible to keep the product in frozen form at the end of step c) and to carry out the lyophilization subsequently, after a negative cold storage time to keep the products in the solid state (for example at - 40 ° C). In both cases, the advantages of the process are retained.
  • the conditions of the process can be adapted according to the product to be dehydrated, in particular the pressure during the cryogenics step, and the lyophilization parameters. Those skilled in the art will know how to make such adaptations.
  • cell within the meaning of the invention, is meant a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • prokaryotic cells mention may be made of lactic acid bacteria, bacteria of probiotic interest, bacteria constituting the microbiota (intestinal, fecal, etc.).
  • eukaryotic cells mention may be made of yeasts, reproductive cells, blood cells and stem cells, plant cells and microalgae.
  • Cells treated according to the methods described herein may or may not be alive. They may in particular be tyndallized bacteria, that is to say bacteria previously killed by heat. Cells can be isolated from each other or organized as tissues.
  • the cellular composition consists of bacteria of probiotic interest for humans and animals.
  • the cellular composition consists of a sample of fecal microbiota.
  • aqueous medium water, a culture medium, an aqueous extract of plants.
  • This aqueous medium may or may not contain cryoprotectants.
  • the cellular composition does not contain a cryoprotectant.
  • a second subject of the invention relates to a process for preparing a composition of frozen cells by cryogenics under pressure comprising the steps: a) providing a cellular composition comprising cells in an aqueous medium in the form of a matrix; b) dissolving a gas in said matrix by passing through a zone dense in gas molecules, such a density being obtained (i) either by the gas flow generated by the evaporation of a cryogenic fluid, (ii) or by a increase in pressure up to 10 bars, (iii) either by combining a flow of gas as mentioned in (i) with an increase in pressure; c) cryogenizing said gas-rich matrix obtained in step b) at a pressure making it possible to maintain said gas dissolved in said matrix to obtain frozen granules, particles or beads.
  • This method makes it possible to obtain frozen cells whose survival is increased compared with the freezing methods described previously.
  • the pressure applied in step b) is less than 10 bars, but may in certain embodiments be less than 5 bars, or even 2 bars.
  • the pressure making it possible to maintain said gas dissolved in said matrix is greater than or equal to atmospheric pressure.
  • a third subject of the invention relates to a lyophilized cellular composition obtained by the lyophilization process as defined above.
  • the composition comprises a lyophilizate and overdried maltodextrins.
  • the lyophilized cellular composition comprises lyophilized and stabilized probiotic bacteria of interest obtained by the process as defined above and overdried maltodextrins.
  • such a composition comprises 20-25% lyophilizate and 75-80% overdried maltodextrins.
  • Figure 1 Viability of the strain Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209 after freezing by cryogenics "under pressure".
  • Figure 2 A - Concentrations of CFU and Cl of lyophilisates of the strain Lactobacillus plantarum BL3504. B — Viability and Cl yields of lyophilisates of the strain Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209. C- Cytometric profiles of lyophilisates of the strain Lactobacillus salivarius BL2201.
  • Figure 3 A- Loss of viability under accelerated aging conditions (30 ° C / 65% RH) of the lyophilisates of the strain Bifidobacterium animalis ssp lactis BL3803 over 3 months.
  • Figure 4 Comparison of the yields of intact cells of lyophilisates of a strain Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209 with or without cryoprotectant.
  • the samples are prepared from the commercial strain Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209.
  • the bacteria are solubilized in a reconstituted MRS Plant medium without carbohydrate + 1% sucrose + 5% maltodextrins (cryoprotectants), so that the concentration of intact cells is adjusted to 5.10 9 cells / mL.
  • the -80 ° C control corresponds to the freezing of 40mL at -80 ° C for a minimum of 48h.
  • the -20 ° C control corresponds to the freezing of 40mL at -20 ° C for a minimum 48h.
  • different pressures were tested.
  • the samples are obtained using equipment making it possible to implement the method as described in patent EP07858410, under a relative pressure of 8 bars in the cryogenic chamber. At the end of the freezing step, all the samples are stored in an enclosure at -80 ° C. before being analyzed. The samples are then thawed (1 h at 37 ° C) and the viability is measured.
  • a bacterial sample is cultured for 24 hours in 500 ml of culture medium of the MRS Plant type (Ref BK176HA from Biokar Diagnostics). The culture medium is then centrifuged for 10 min at a speed of 3400 g. The pellet, containing the microorganisms studied, is taken up in fresh culture medium so that the concentration of intact cells is adjusted to 5.10 9 cells / ml.
  • the preparation is then separated into 4 fractions allowing the 4 different freezing methods to be tested:
  • the “standard process control” sample is made by aliquoting the preparation in 30mL bottles and placing them in an enclosure at -80 ° C for at least 48h so as to ensure that all of the product is frozen and has reached the temperature of -80 ° C;
  • the "nitrogen bead witness" sample is produced by manually producing a drip, using a syringe, over an open container, such as a bowl or a bowl, containing water. liquid nitrogen, at atmospheric pressure and ambient temperature;
  • the “5 bar cryogenics” sample is obtained using equipment making it possible to implement the method as described in patent EP07858410, under a relative pressure of 5 bar in the cryogenic chamber;
  • the "cryozero” sample is obtained using equipment making it possible to implement a cryogenics step under a relative pressure of 0 bars, such that the dissolved nitrogen saturation obtained is approximately 3 times greater than that which would be obtained at this same pressure with the "nitrogen ball indicator".
  • the samples frozen according to the 4 methods are further lyophilized in a Drywinner CT60 freeze-dryer (Heto Holten) for a period of 48h to 72h.
  • the samples are carefully ground using a mortar and pestle in order to put them in powder form.
  • the latter are then stored in sterile jars at -20 ° C before being analyzed.
  • the powdered samples are dispersed beforehand in a buffered peptone water supplemented with 1% (w / v) Tween 80 and homogenized using a Stomacher.
  • the amounts of CFU and Cl are obtained by counting in MRS agar and by cytometric analysis (protocol B of standard ISO 19344 IDF 232 v2015).
  • CFU viability test consisting of testing the ability of bacteria to form colonies on an agar medium
  • the bacteria are dissolved at 10% dry matter in buffered peptone water (tryptone 1.0g / L + NaCl 8.5g / L + K2HPO4 2.5 g / L + KH2PO4 2.5g / L) added of 5% (w / w) maltodextrins (cryoprotectant).
  • the -80 ° C control corresponds to the freezing of lOmL at -80 ° C for a minimum of 48 hours.
  • the -40 ° C control corresponds to the freezing of lOmL at -40 ° C for a minimum of 48 hours. For cryogenically frozen samples, different pressures were tested.
  • cryogenic samples are obtained using equipment making it possible to implement the method as described in patent EP07858410, under a relative pressure of 0 and 5 bars in the cryogenic chamber (“Cryozero” and “5 bar Cryogenics” samples) .
  • Cryogenically frozen samples are stored in an enclosure at -80 ° C before being analyzed. Part of the samples is then thawed (30 min at room temperature) and the viability is measured.
  • the samples frozen according to the 4 methods are further lyophilized, in a Drywinner CT60 freeze-dryer (Heto Holten) for a period of 72 hours.
  • the samples are carefully ground using a mortar and pestle in order to put them in powder form. These are then stored in an aluminum bag at -20 ° C before being analyzed.
  • the powdered samples are dispersed beforehand in a buffered peptone water supplemented with 1% (w / v) Tween 80 and homogenized using a Stomacher.
  • the amounts of CFU and Cl are obtained by counting in MRS agar and by cytometric analysis (protocol B of standard ISO 19344 IDF 232 v2015).
  • This graph presents 3 yields, calculated either from the concentration of living cells measured by viability (CFU), or from the concentration of intact cells measured by flow cytometry (Cl):
  • Freezing yield concentration of the frozen samples compared to the concentration before freezing
  • “Overall” yield concentration of lyophilisates relative to the concentration before freezing.
  • the results show that the use of cryogenics as a method of freezing samples of lactic acid bacteria makes it possible to increase the yields in viability and in intact cells at the level of the lyophilization step as well as on the overall process. Indeed, the yields after the freezing step are not affected by the method used, 100% yield in CFU and Cl is obtained regardless of the sample.
  • the positive effect of freezing by cryogenics occurs clearly during lyophilization with yields of 70 to 80% against 30 to 50% for the -40 ° C and -80 ° C controls. This effect is also observed for the entire process (overall yield).
  • cryogenics under pressure under the molecular density conditions described above is a means of better preserving intact cells and therefore of improving the viability of samples of lactic acid bacteria produced by lyophilization.
  • the samples are prepared from the Lactobacillus salivarius BL2201 strain, according to the method described in Example 2-B.
  • This graph shows the composition of the samples in intact cells, damaged cells and dead cells, measured by flow cytometry, at each step of the process (sample before freezing, frozen sample and lyophilizate).
  • Example 2-A The samples are prepared according to the method described in Example 2-A.
  • the powdered lyophilisates are stored for 3 months, after dilution in overdried corn maltodextrins, in three-layer paper / aluminum / PE bags and placed at 30 ° C. and 65% RH before being analyzed.
  • the powdered samples are dispersed beforehand as indicated in Example 2-A.
  • the samples are prepared according to the method described in Example 2-A.
  • the powdered lyophilisates are stored for 12 months, after dilution in overdried corn maltodextrins, in three-layer paper / aluminum / PE bags and placed at 30 ° C. and 65% RH before being analyzed.
  • the powdered samples are dispersed beforehand as indicated in Example 2-A.
  • the experiments were carried out using the strain Lactobacillus plantarum BL3504.
  • the samples are prepared from the commercial strain Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209, according to the method described in Example 2-B, with or without cryoprotectants (maltodextrins 5% (W / W))
  • This graph shows the yields of the overall process, calculated from the concentration of intact cells (Cl) of the lyophilisates (measured by flow cytometry) versus the concentration before freezing. Since the tests were carried out in triplicate, error bars corresponding to the standard deviation of each condition are shown.

Abstract

L'invention se rapporte au domaine des lyophilisats de matières biologiques. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau procédé de préparation d'un lyophilisat de cellules comprenant une étape de cryogénie « sous pression ». Dans un mode de réalisation préféré, ce procédé est appliqué à des bactéries lactiques.

Description

PROCEDE DE LYOPHILISATION D'UNE COMPOSITION CELLULAIRE CRYOGENISEE ET CONTENANT DU
GAZ DISSOUS
L'invention se rapporte au domaine des lyophilisats de matières biologiques. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau procédé de préparation d'un lyophilisât de cellules comprenant une étape de cryogénie « sous pression ». Dans un mode de réalisation préféré, ce procédé est appliqué à des bactéries lactiques.
Etat de la technique
La conservation des cellules sous forme congelée est connue de longue date. Cette méthode requiert peu d'équipement. Le principe est simple : la congélation induit une baisse de température qui ralentit puis arrête toutes les réactions biochimiques de la cellule. Ces dernières sont susceptibles d'être réactivées après décongélation. On constate cependant, quelle que soit la méthode utilisée, une perte significative de viabilité à la décongélation causée notamment par la formation de cristaux intracellulaires, et d'autant plus que la durée de la phase de congélation est longue.
Alternativement, les cellules peuvent être lyophilisées. La lyophilisation est un procédé de dessiccation d'un produit préalablement congelé, par sublimation. Par ce procédé on obtient donc un produit sec qui peut être conservé à 4°C ou à température ambiante. Cependant, ce procédé est long, coûteux et très consommateur d'énergie.
Classiquement, un procédé de lyophilisation de cellules comprend les étapes de préparation d'un échantillon comprenant les cellules, centrifugation de l'échantillon et reprise du culot cellulaire dans un milieu cryoprotecteur et permettant la déshydratation, congélation de l'échantillon puis lyophilisation. L'étape de congélation est généralement réalisée à des températures comprises entre -20°C (congélation lente) et -80°C (congélation rapide) ; une congélation rapide est moins délétère pour les cellules mais plus difficile à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle.
Des tentatives de congélation des cellules par cryogénie, seule ou en vue d'une lyophilisation, ont été effectuées mais les résultats se sont révélés peu probants du fait d'une détérioration importante des cellules. Cette détérioration résulte probablement du fait que les procédés de l'art antérieur ne permettent pas de contrôler les quantités d'eau et d'oxygène présentes dans le produit lors des étapes de congélation et de lyophilisation. Or, l'eau et l'oxygène sont deux facteurs qui altèrent la qualité des cellules et leur viabilité à long terme. Ainsi, aucune des solutions de cryogénie proposées à ce jour n'a permis d'améliorer de façon significative les propriétés des produits lyophilisés. En particulier la plupart des solutions proposées s'appuient sur une dépression appliquée lors de la phase de congélation. Au contraire, la demande WO2018/138461 décrit un procédé de refroidissement de matière biologique par cryogénie sous haute pression, à savoir à une pression comprise entre 10 et 1000 bars. Ce procédé permet une amélioration du taux de survie d'une souche de Lactobacillus bulgaricus d'un facteur de presque 400.
Parmi les nombreux inconvénients associés aux procédés disponibles à ce jour, il est regrettable de ne pouvoir obtenir des préparations de bactéries lactiques d'intérêt probiotique qui soient stables à long terme à température ambiante.
Plus généralement, il existe un besoin de disposer d'une méthode de conservation à long terme des cellules de tout type, notamment des cellules vivantes.
Exposé de l'invention
Les inventeurs ont montré que la qualité et la viabilité à long terme des cellules lyophilisées, notamment des souches bactériennes probiotiques, peut être significativement améliorée lorsque l'étape de congélation est réalisée via une cryogénie sous pression, permettant la dissolution de gaz au sein de la matrice à congeler avant lyophilisation.
Ainsi, l'invention concerne un procédé de lyophilisation d'une composition cellulaire caractérisée en ce que l'étape de congélation est couplée à une dissolution importante de gaz dans le produit, intervenant juste avant ladite congélation. La dissolution est réalisée soit par réalisation de la congélation dans une enceinte sous pression, soit par soumission du produit à une très forte densité de molécules de gaz sans pour autant qu'une surpression ne soit forcément observée. Ces deux modes de réalisations sont équivalents en termes de résultat dans le sens où la matrice traverse une zone dense en molécules de gaz (étape de dissolution de gaz dans la matrice) avant d'être congelée par cryogénie.
Avantages de l'invention
Les inventeurs ont montré l'intérêt de la cryogénie sous pression en tant que méthode de congélation des matières biologiques, notamment des bactéries telles que les bactéries lactiques. En effet, cette méthode permet une meilleure préservation des cellules lors des étapes de congélation et de lyophilisation et donc une amélioration des rendements de production de préparations cellulaires congelées.
On constate tout d'abord que la cryogénie sous pression est à elle seule avantageuse par rapport aux autres méthodes de congélation pour la préservation de l'intégrité et/ou viabilité des cellules.
D'autre part, il est très avantageux de combiner une étape de congélation par cryogénie sous pression avec une lyophilisation et ce pour plusieurs raisons :
Le rendement de production est meilleur, on récupère une composition lyophilisée plus riche en cellules à l'issue du procédé. Par conséquent, on améliore la concentration cellulaire du lyophilisât ;
Les cellules sont moins abîmées, leur intégrité membranaire est maintenue ; ceci est avantageux pour préserver la viabilité des cellules mais également dans le cas de cellules abîmées ou mortes dont la membrane ou paroi est endommagée. En effet, il a été montré depuis plusieurs années, que des bactéries non-viables peuvent conserver certaines activités probiotiques (adhésion, stimulation du système immunitaire...).
La viabilité des cellules est augmentée à l'issue de l'étape de lyophilisation par comparaison avec des produits obtenus par les procédés classiques de lyophilisation.
La stabilité des lyophilisats de cellules est également observée sur le long terme, à savoir pendant plusieurs mois, à 4°C comme à température ambiante.
Les avantages associés à ce procédé sont observés lorsque la composition cellulaire de départ contient des cryoprotecteurs. De manière tout à fait intéressante, ils peuvent être également observés en absence de cryoprotecteur avec certaines cellules, notamment certaines bactéries ; en s'affranchissant de l'utilisation de cryoprotecteur, on limite l'ajout d'additifs qui sont de plus en plus décriés.
D'autre part, ce procédé permet de traiter des matrices dont la taille des billes formées peut atteindre 7 à 8 mm ainsi que des agrégats ; le paramètre de taille n'influe pas sur l'efficacité du procédé, ni sur la qualité de produit lyophilisés obtenus.
A l'issue de ce procédé, il est proposé de conditionner les lyophilisats sous atmosphère protectrice, en particulier pour éviter l'altération causée par l'oxydation. Afin de limiter autant que possible le contact avec l'oxygène, il est avantageux de réaliser un balayage du lyophilisât avec un gaz inerte avant scellage du conditionnement, de sorte à augmenter encore la stabilité des lyophilisats dans le temps. En procédant ainsi, il est attendu une stabilité accrue pouvant atteindre plus d'une année.
Ainsi, grâce à l'incorporation de gaz couplée à un refroidissement très rapide permettant de maintenir le gaz dissous et au maintien de l'anaérobiose pendant tout le procédé, la qualité des cellules lyophilisées est fortement améliorée.
Le procédé selon l'invention permet de maîtriser les trois paramètres critiques liés à la qualité d'une préparation de cellules lyophilisées : la concentration cellulaire, l'oxydation et la quantité d'eau libre (la présence d'eau étant délétère vis-à-vis de la stabilité des cellules lyophilisées à température ambiante et à 4°C), et permet ainsi la préparation de lyophilisât de bactéries d'intérêt probiotique dont les propriétés sont conservées à long terme. En fonction du produit, la conservation à 4°C est plus ou moins adaptée. Dans le cas des préparations de bactéries d'intérêt probiotique, une conservation à température ambiante rend l'usage plus facile (transport, stockage, utilisation). Il est donc avantageux de disposer de préparation de bactéries d'intérêt probiotique pouvant être conservées à température ambiante.
Ce procédé peut être appliqué à de nombreux types cellulaires : bactéries d'intérêt probiotiques et agroalimentaires (utilisées pour la fabrication de fromages notamment), levures, cellules végétales, micro-algues, microorganismes issus du microbiote intestinal ou fécal (pour la transplantation de microbiote fécal dans le traitement des infections à Clostridium difficile), cellules reproductrices (ovocytes et spermatozoïdes) pour la reproduction animale et humaine, des cellules sanguines et des cellules souches.
Sans être liés par cette théorie, les inventeurs considèrent que les bénéfices du procédé selon l'invention pour la préparation de cellules congelées et/ou lyophilisées repose sur le fait que la cryogénie « sous pression » permet d'obtenir des produits surgelés non poreux contenant une grande quantité de gaz parfaitement dissous. Ce gaz n'étant pas de l'oxygène, les réactions d'oxydation sont évitées. De plus, la lyophilisation de tels produits permet d'éliminer la majeure partie de l'eau contenue dans le produit. Il en résulte que les conditions mises en oeuvre dans ce procédé sont dans l'ensemble plus douces, moins agressives et moins déstructurantes pour les cellules.
Ce procédé permet de lyophiliser des souches bactériennes fragiles, qui ne résistent pas aux conditions de lyophilisation classiques. Il permet également de préparer des lyophilisats bactériens stables à des températures de 20°C, voire 25°C sur de longues périodes allant jusqu'à 24 mois afin de répondre aux attentes des industriels désireux de disposer de produits lyophilisés plus résistants aux changements de températures de sorte à diminuer les contraintes lors du transport, du stockage et de la conservation.
Du point de vue du procédé de lyophilisation en tant que tel et de son industrialisation, l'étape de cryogénie « sous pression » permet également des améliorations conséquentes. Le temps de préparation est tout d'abord beaucoup plus rapide. La cryogénie est un procédé quasi-instantané, permettant de produire en continu et à des cadences élevées (plusieurs centaines de kg par heure avec les équipements actuels) des billes de produit initialement fluide. Le gain de temps est considérable par rapport à de la congélation en chambre froide, y compris si celle-ci fonctionne à des températures très basses (-40°C à -80°C en général). Les billes cryogénisées sont extraites à des températures généralement comprises entre -80°C et -120°C, ce qui permet de démarrer directement la lyophilisation, avec des produits dont la température avoisine -60°C, sans étape préalable de refroidissement. Le temps de lyophilisation lui-même est très fortement réduit (au moins d'un facteur 2). Enfin, ce procédé permet de traiter de plus grandes quantités de matières premières en réduisant le temps de traitement. Ce dernier avantage permet d'obtenir des produits de qualité même en l'absence de cryoprotecteur.
Ce procédé ouvre de nouvelles perspectives pour la conservation de cellules sous forme de lyophilisât dont les propriétés sont préservées pendant le procédé de lyophilisation et restaurées après remise en solution, tant au niveau des molécules actives qu'au niveau de la viabilité de cellules entières.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un procédé de lyophilisation d'une composition cellulaire caractérisée en ce que l'étape de congélation est réalisée par cryogénie et qui comprend les étapes de a) disposer d'une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux ; b) dissoudre un gaz dans ladite composition par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression, (iii) soit par une combinaison des deux phénomènes ; c) cryogéniser ladite composition riche en gaz obtenue à l'étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissous pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées ; d) lyophilisation desdites granules, de particules ou de billes surgelées pour obtenir une préparation cellulaire lyophilisée.
Ce procédé est donc caractérisé par le fait de congeler la matrice constituée d'une composition cellulaire par cryogénie au contact d'un gaz de sorte à dissoudre du gaz dans ladite matrice. La dissolution est obtenue par passage de ladite matrice dans une zone dense en molécules de gaz.
La zone riche en molécules de gaz au sein de l'enceinte contenant le gaz cryogénique peut être obtenue de trois manières : i) soit grâce au flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression, (iii) soit en combinant les deux phénomènes.
Lorsque la zone dense en molécules est obtenue grâce à un flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, la quantité de gaz dissoute dans la matrice est typiquement équivalente, lorsqu'aucune pression n'est appliquée, à celle que l'on obtiendrait par l'application de pressions relatives comprises entre 0,001 bars et 2 bars. Cette condition est appelée « cryozéro » dans la partie expérimentale.
Lorsque la zone dense en molécules est obtenue par une élévation de la pression, cette pression est supérieure à la pression atmosphérique, et peut notamment être supérieure à 0,1 bar, 0,5 bar, 1 bar, 2 bars, 5 bars, 10 bars, 15 bars, 20 bars, 25 bars, 30 bars, 50 bars ou 100 bars.
Par les termes « sous pression » au sens de l'invention, on entend des conditions qui permettent la dissolution d'un gaz dans une matrice et/ou le maintien du gaz dissous dans ladite matrice pendant la surgélation. La mise sous pression peut être obtenue soit par une élévation de la pression, soit par la mise en contact de la matrice avec un fluide cryogénique, l'évaporation de ce gaz créant une densité de molécule de gaz équivalente à une mise sous pression de sorte que les molécules de gaz se dissolvent dans la matrice, soit par une combinaison des deux premiers phénomènes. De plus, la mise « sous pression » correspond à l'application de pressions relatives, c'est-à-dire que l'on considère la pression atmosphérique comme une pression de 0 bar. Toutes les pressions exprimées dans le présent document sont des pressions relatives. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé n'est pas mis en oeuvre sous vide partiel.
Ainsi, l'étape b) s'opère à une pression relative suffisante pour permettre la dissolution de gaz dans la matrice et une pression équivalente est maintenue à l'étape c) pour conserver le gaz dissous à l'intérieur de la matrice lors de la cryogénisation. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la pression appliquée à l'étape c) est supérieure ou égale à la pression atmosphérique.
Le gaz peut être un gaz inerte. Le gaz peut être de l’azote, du protoxyde d’azote, du dioxyde de carbone, un gaz rare comme l’argon ou un mélange de ces gaz.
Dans un mode de réalisation préféré, le gaz utilisé est de l'azote, et le fluide cryogénique de l'azote liquide.
Concernant la mise en oeuvre du procédé dans sa globalité, il est possible d'enchaîner les étapes du procédé à la suite les unes des autres et notamment de réaliser l'étape de lyophilisation immédiatement après l'étape de cryogénie. De plus, le procédé peut être mené en continu. Il est également possible de conserver le produit sous forme surgelée à l'issue de l'étape c) et de réaliser la lyophilisation ultérieurement, après un temps de stockage en froid négatif pour conserver les produits à l'état solide (par exemple à -40°C). Dans les deux cas, les avantages du procédé sont conservés.
Les conditions du procédé peuvent être adaptées en fonction du produit à déshydrater, notamment la pression lors de l'étape de cryogénie, et les paramètres de lyophilisation. L'homme du métier saura réaliser de telles adaptations.
Par « cellule » au sens de l'invention, on entend une cellule procaryote ou eucaryote. Parmi les cellules procaryotes, on peut citer les bactéries lactiques, les bactéries d'intérêt probiotique, les bactéries constitutives du microbiote (intestinal, fécal...). Parmi les cellules eucaryotes, on peut citer les levures, cellules reproductrices, les cellules sanguines et les cellules souches, les cellules végétales et les micro algues. Les cellules traitées selon les procédés décrits dans le présent document peuvent être vivantes, ou non. Il peut s'agir en particulier de bactéries tyndallisées, c'est-à-dire préalablement tuées par la chaleur. Les cellules peuvent être isolées les unes des autres ou être organisées sous forme de tissus. Dans un mode de réalisation préféré, la composition cellulaire est constituée de bactéries d'intérêt probiotique pour l'Homme et l'animal.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la composition cellulaire est constituée d'un échantillon de microbiote fécal.
Par « milieu aqueux », on entend de l'eau, un milieu de culture, un extrait aqueux de plantes. Ce milieu aqueux peut contenir des cryoprotecteurs ou ne pas en contenir. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la composition cellulaire ne contient pas de cryoprotecteur.
Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition de cellules congelées par cryogénie sous pression comprenant les étapes : a) disposer d'une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux sous forme d'une matrice ; b) dissoudre un gaz dans ladite matrice par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression pouvant aller jusqu'à 10 bars, (iii) soit en combinant un flux de gaz tel que mentionné au (i) avec une élévation de la pression ; c) cryogéniser ladite matrice riche en gaz obtenue à l'étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissous dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées.
Ce procédé permet d'obtenir des cellules congelées dont la survie est augmentée par rapport aux procédés de congélation décrits antérieurement.
La pression appliquée à l'étape b) est inférieure à 10 bars, mais peut dans certains modes de réalisation être inférieure à 5 bars, voire à 2 bars.
Dans un mode de réalisation préféré, la pression permettant de maintenir ledit gaz dissous dans ladite matrice est supérieure ou égale à la pression atmosphérique.
Un troisième objet de l'invention concerne une composition cellulaire lyophilisée obtenue par le procédé de lyophilisation tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend un lyophilisât et des maltodextrines surséchées.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition cellulaire lyophilisée comprend des bactéries d'intérêt probiotiques lyophilisées et stabilisées obtenues par le procédé tel que défini précédemment et des maltodextrines surséchées. Dans un mode de réalisation préféré, une telle composition comprend 20-25% de lyophilisât et 75-80% de maltodextrines surséchées. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Viabilité de la souche Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209 après congélation par cryogénie « sous pression ».
Figure 2 : A - Concentrations en UFC et Cl des lyophilisats de la souche Lactobacillus plantarum BL3504. B- Rendements en viabilité et Cl des lyophilisats de la souche Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209. C- Profils cytométriques des lyophilisats de la souche Lactobacillus salivarius BL2201.
Figure 3 : A- Perte de viabilité en conditions de vieillissement accéléré (30°C / 65% HR) des lyophilisats de la souche Bifidobacterium animalis ssp lactis BL3803 sur 3 mois. B- Perte de viabilité en conditions de vieillissement accéléré (30°C / 65% HR) des lyophilisats de la souche Lactobacillus plantarum BL3504 sur 12 mois.
Figure 4 : Comparaison des rendements en cellules intactes des lyophilisats d'une souche Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209 avec ou sans cryoprotecteur.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Impact de la cryogénie sur les propriétés d'une composition de bactéries lactiques congelée
Les échantillons sont préparés à partir de la souche commerciale Lactobacillus plantarum ATCC SD- 5209.
Les bactéries sont solubilisées dans un milieu MRS Végétal reconstitué sans glucide + saccharose 1 % + maltodextrines 5% (cryoprotecteurs), de telle sorte que la concentration en cellules intactes soit ajustée à 5.109 cellules/mL. Le témoin -80°C correspond à la congélation de 40mL à -80°C pendant un minimum de 48h. Le témoin -20°C correspond à la congélation de 40mL à -20°C pendant un minimum de 48h. Pour les souches congelées par cryogénie, différentes pressions ont été testées. Les échantillons sont obtenus grâce à un équipement permettant de mettre en oeuvre le procédé tel que décrit dans le brevet EP07858410, sous une pression relative de 8 bars dans l'enceinte de cryogénie. A l'issue de l'étape de congélation, tous les échantillons sont conservés dans une enceinte à -80°C avant d'être analysés. Les échantillons sont ensuite décongelés (lh à 37°C) et la viabilité est mesurée.
Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 1.
On observe que la perte de viabilité du témoin congelé à -20°C est bien plus importante que pour l'échantillon congelé par cryogénie à 8 bars. Ce résultat est tout à fait significatif et montre un réel apport de la cryogénie.
EXEMPLE 2 : Impact de la cryogénie sur les propriétés d'une composition de bactéries lactiques lyophilisée
A - Etude d'une composition de Lactobacillus plantarum BL3504 fraîchement cultivée
Un échantillon bactérien est cultivé pendant 24h dans 500mL de milieu de culture de type MRS Végétal (Ref BK176HA de Biokar Diagnostics). Le milieu de culture est ensuite centrifugé pendant 10 min à une vitesse de 3400 g. Le culot, contenant les microorganismes étudiés, est repris dans un milieu de culture frais de telle sorte que la concentration en cellules intactes soit ajustée à 5.109 cellules/mL.
La préparation est alors séparée en 4 fractions permettant de tester les 4 méthodes de congélation différentes :
L'échantillon « témoin procédé standard » est réalisé en aliquotant la préparation en flacons de 30mL et en plaçant ces derniers dans une enceinte à -80°C pendant au moins 48h de manière à garantir que l'ensemble du produit soit congelé et ait atteint la température de -80°C ;
L'échantillon « témoin billes azote » est réalisé en produisant manuellement un goutte-à- goutte, à l'aide d'une seringue, au-dessus d'un récipient ouvert, tel qu'un bol ou un saladier, contenant de l'azote liquide, à pression atmosphérique et température ambiante ;
L'échantillon « cryogénie 5 bars » est obtenu grâce à un équipement permettant de mettre en oeuvre le procédé tel que décrit dans le brevet EP07858410, sous une pression relative de 5 bars dans l'enceinte de cryogénie ; L'échantillon « cryozéro » est obtenu grâce à un équipement permettant de mettre en oeuvre une étape de cryogénie sous une pression relative de 0 bars, de telle sorte que la saturation en azote dissous obtenue soit environ 3 fois supérieure à celle qui serait obtenue à cette même pression avec le « témoin billes azote ».
A l'issue de l'étape de congélation, tous les échantillons sont conservés dans une enceinte à -80°C avant d'être analysés.
Les échantillons congelés selon les 4 méthodes sont de plus lyophilisés, dans un lyophilisateur Drywinner CT60 (Heto Holten) pour une durée de 48h à 72h. Les échantillons sont broyés précautionneusement à l'aide d'un mortier et d'un pilon afin de les mettre sous forme de poudre. Ces dernières sont ensuite conservées dans des pots stériles à -20°C avant d'être analysées. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés dans une eau peptonée tamponnée additionnée de Tween 80 à 1% (p/v) et homogénéisés à l'aide d'un Stomacher. Les quantités d'UFC et de Cl sont obtenues par dénombrement en gélose MRS et par analyse cytométrique (protocole B de la norme ISO 19344 IDF 232 v2015).
Les résultats de la Figure 2-A sont obtenus avec la souche Lactobacillus plantarum BL3504.
Ce graphique montre les résultats obtenus selon 2 paramètres :
- la concentration de cellules vivantes du lyophilisât, en UFC (test de viabilité consistant à tester la capacité des bactéries à former des colonies sur un milieu gélosé),
- l'intégrité membranaire des cellules du lyophilisât, exprimée en cellules intactes (Cl) mesurées par cytométrie en flux.
Les résultats montrent que l'utilisation d'une vitesse de refroidissement plus rapide (cryogénie : « Témoin billes azote ») permet de doubler et tripler les concentrations en UFC et Cl du lyophilisât par rapport au « Témoin procédé standard (-80°C) ». La condition « Cryozéro » permet d'augmenter encore ces concentrations, puisqu'on atteint le triple et le quadruple des concentrations en UFC et Cl du « Témoin procédé standard (-80°C) ». Enfin, la condition « Cryogénie 5 bars » permet d'atteindre les concentrations les plus élevées en UFC et Cl, 4 et 6 fois plus élevées que celles du procédé standard.
B - Etude d'une composition de Lactobacillus plantarum ATCC SD-5209 commerciale Les échantillons sont préparés à partir de la souche commerciale Lactobacillus plantarum ATCC SD- 5209.
Les bactéries sont solubilisées à hauteur de 10% de matière sèche dans de l'eau peptonée tamponnée (tryptone l,0g/L + NaCI 8,5g/L + K2HPO4 2,5 g/L + KH2PO4 2,5g/L) additionnée de 5% (p/p) de maltodextrines (cryoprotecteur). Le témoin -80°C correspond à la congélation de lOmL à -80°C pendant un minimum de 48h. Le témoin -40°C correspond à la congélation de lOmL à -40°C pendant un minimum de 48h. Pour les échantillons congelés par cryogénie, différentes pressions ont été testées. Les échantillons sont obtenus grâce à un équipement permettant de mettre en oeuvre le procédé tel que décrit dans le brevet EP07858410, sous une pression relative de 0 et 5 bars dans l'enceinte de cryogénie (échantillons « Cryozéro » et « Cryogénie 5 bars »). Les échantillons congelés par cryogénie sont conservés dans une enceinte à -80°C avant d'être analysés. Une partie des échantillons est ensuite décongelée (30min à température ambiante) et la viabilité est mesurée.
Les échantillons congelés selon les 4 méthodes sont de plus lyophilisés, dans un lyophilisateur Drywinner CT60 (Heto Holten) pour une durée de 72h. Les échantillons sont broyés précautionneusement à l'aide d'un mortier et d'un pilon afin de les mettre sous forme de poudre. Ces dernières sont ensuite conservées dans un sachet alu à -20°C avant d'être analysées. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés dans une eau peptonée tamponnée additionnée de Tween 80 à 1% (p/v) et homogénéisés à l'aide d'un Stomacher. Les quantités d'UFC et de Cl sont obtenues par dénombrement en gélose MRS et par analyse cytométrique (protocole B de la norme ISO 19344 IDF 232 v2015).
Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 2-B.
Ce graphique présente 3 rendements, calculés soit à partir de la concentration en cellules vivantes mesurée par viabilité (UFC), soit à partir de la concentration en cellules intactes mesurée par cytométrie en flux (Cl) :
Rendement « Congélation » : concentration des échantillons congelés par rapport à la concentration avant congélation,
Rendement « Lyophilisation » : concentration des lyophilisats par rapport à la concentration des échantillons congelés,
Rendement « Global » : concentration des lyophilisats par rapport à la concentration avant congélation. Les résultats montrent que l'utilisation de la cryogénie comme méthode de congélation d'échantillons de bactéries lactiques permet d'augmenter les rendements en viabilité et en cellules intactes au niveau de l'étape de lyophilisation ainsi que sur le procédé global. En effet, les rendements après l'étape de congélation ne sont pas affectés par la méthode utilisée, on obtient 100% de rendement en UFC et Cl quel que soit l'échantillon. L'effet positif de la congélation par cryogénie intervient nettement lors la lyophilisation avec des rendements de 70 à 80% contre 30 à 50% pour les témoins -40°C et -80°C. Cet effet est également observé pour l'ensemble du procédé (rendement global). Cependant, ces résultats ne permettent pas de discriminer les deux conditions de cryogénie, on obtient les mêmes rendements pour les échantillons « Cryozéro » et « Cryogénie 5 bars ». On peut donc en déduire que la cryogénie sous pression dans les conditions de densité moléculaire décrites précédemment, est un moyen de mieux préserver les cellules intactes et donc d'améliorer la viabilité d'échantillons de bactéries lactiques produits par lyophilisation.
C - Etude d'une composition de Lactobacillus salivarius BL2201
Les échantillons sont préparés à partir de la souche Lactobacillus salivarius BL2201, selon la méthode décrite dans l'Exemple 2-B.
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 2-C.
Ce graphique présente la composition des échantillons en cellules intactes, cellules endommagées et cellules mortes, mesurée par cytométrie en flux, à chaque étape du procédé (échantillon avant congélation, échantillon congelé et lyophilisât).
Ces essais ont pour but de montrer le gain apporté par la congélation par cryogénie sous pression, même pour une souche considérée comme fragile, puisque la préparation initiale utilisée contient 45% de cellules endommagées et mortes. Les résultats obtenus montrent également que l'effet de la cryogénie intervient au niveau de l'étape de lyophilisation. En effet, le profil cytométrique des différents échantillons congelés est le même que celui de la préparation avant congélation, avec environ 55% de cellules intactes. On observe cependant des différences sur les profils cytométriques des échantillons lyophilisés : les lyophilisats des témoins -80°C et -40°C contiennent respectivement 4 et 5% de Cl, alors que les lyophilisats des échantillons cryogénisés en conditions cryozéro et 5 bars contiennent 13% de CL On peut donc conclure que réaliser l'étape de congélation par cryogénie « sous pression » est un moyen de préserver le taux de cellules intactes d'une préparation lyophilisée d'une souche fragile supportant difficilement le procédé de lyophilisation standard. EXEMPLE 3 : Impact du procédé de lyophilisation sur la viabilité d'une composition de bactéries lyophilisée (poudre sèche) au cours du temps
A - Etude de la stabilité d'une composition de Bifidobacterium animalis spp lactis BL3803 fraîchement cultivée
Les échantillons sont préparés selon la méthode décrite dans l'Exemple 2-A. Les lyophilisats en poudre sont conservés 3 mois, après dilution dans des maltodextrines de maïs surséchées, dans des sachets tricouches papier/alu/PE et placés à 30°C et 65% HR avant d'être analysés. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés comme indiqué dans l'Exemple 2-A. Les quantités d'UFC sont obtenues par dénombrement en gélose MRS, à t=0 juste après la production des échantillons, puis après respectivement 1,5 mois et 3 mois de stockage. La perte de viabilité est calculée par différence entre la quantité d'UFC à un temps t et celle correspondante à t=0.
Les expériences ont été réalisées en utilisant la souche Bifidobacterium animalis spp lactis BL3803.
Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 3-A.
On observe que la perte de viabilité est très importante dans les conditions standards (« Témoin - 80°C ») puisque cette perte est proche de la moitié des UFC présentes initialement. A contrario, la perte observée pour l'échantillon issu de la cryogénie sous 5 bars est très faible et proche de 0. Les résultats obtenus pour le témoin billes azote et pour la condition « Cryozéro » sont comparables et intermédiaires, ce qui montre également l'impact positif de la cryogénie « sous pression » sur le procédé proposé pour la conservation de souches sous forme lyophilisée.
B - Etude de la stabilité d'une composition de Lactobacillus plantarum BL3504 fraîchement cultivée
Les échantillons sont préparés selon la méthode décrite dans l'Exemple 2-A. Les lyophilisats en poudre sont conservés 12 mois, après dilution dans des maltodextrines de maïs surséchées, dans des sachets tricouches papier/alu/PE et placés à 30°C et 65% HR avant d'être analysés. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés comme indiqué dans l'Exemple 2-A. Les quantités d'UFC sont obtenues par dénombrement en gélose MRS, à t=0 juste après la production des échantillons, puis après 1,5 mois, 3 mois, 4,5 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois de stockage. La perte de viabilité est calculée par différence entre la quantité d'UFC à un temps t et celle correspondante à t=0. Les expériences ont été réalisées en utilisant la souche Lactobacillus plantarum BL3504.
Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 3-B.
On observe que la perte de viabilité est très importante dans les conditions standards (« Témoin - 80°C ») puisque cette perte est déjà supérieure à 50% après 1,5 mois de stockage et que le pourcentage de cellule viable est inférieur à 20% à partir de 4,5 mois. A contrario, la perte observée pour les échantillons issus de la cryogénie est beaucoup plus lente. Elle n'est significative (>20%) qu'à partir du sixième mois et environ 60% des cellules sont encore viables après 12 mois de stockage. Comparativement, à peine plus de 10% des cellules sont encore viables dans les conditions de congélation à -80°C.
Les résultats obtenus pour le témoin billes azote et la cryogénie sous pression sont comparables. La perte de viabilité est suffisamment lente dans les trois conditions pour que la différence entre elles ne soit pas significative.
EXEMPLE 4 : Impact de la présence de cryoprotecteur sur l'intégrité membranaire d'une composition de bactéries lactiques lyophilisée
Les échantillons sont préparés à partir de la souche commerciale Lactobacillus plantarum ATCC SD- 5209, selon la méthode décrite dans l'Exemple 2-B, avec ou sans cryoprotecteurs (maltodextrines 5% (P/P))·
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 4.
Ce graphique présente les rendements du procédé global, calculés à partir de la concentration en cellules intactes (Cl) des lyophilisats (mesurée par cytométrie en flux) par rapport à la concentration avant congélation. Les essais ayant été réalisés en triplicat, des barres d'erreurs correspondant à l'écart -type de chaque condition sont représentées.
Ces résultats montrent que la présence de cryoprotecteurs dans les échantillons permet une meilleure préservation des cellules intactes au cours du procédé de congélation et lyophilisation. On observe en effet des rendements en Cl plus élevées pour les échantillons contenant des maltodextrines, quelle que soit la condition de congélation. On peut donc en déduire que l'utilisation combinée de cryoprotecteurs et de la cryogénie permet une amélioration de la qualité des lyophilisats de bactéries lactiques.
Conclusion : Le procédé de lyophilisation d'une composition cellulaire comprenant une étape de congélation réalisée par cryogénie « sous pression » permet une amélioration tant qualitative que quantitative de la production de lyophilisats de cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de lyophilisation d'une composition cellulaire caractérisée en ce que l'étape congélation est réalisée par cryogénie sous pression, ledit procédé comprenant les étapes de : a) disposer d'une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux ; b) dissoudre un gaz dans ladite composition par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression, (iii) soit par la combinaison des deux phénomènes ; c) cryogéniser ladite composition riche en gaz obtenue à l'étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite composition pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées ; d) lyophilisation desdites granules, de particules ou de billes surgelées pour obtenir une préparation cellulaire lyophilisée.
2. Procédé de préparation d'une composition de cellules congelées par cryogénie sous pression comprenant les étapes : a) disposer d'une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux sous forme d'une matrice ; b) dissoudre un gaz dans ladite matrice par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l'évaporation d'un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression pouvant aller jusqu'à 10 bars, (iii) soit par la combinaison d'un flux de gaz tel que mentionnée au (i) avec une élévation de la pression ; c) cryogéniser ladite matrice riche en gaz obtenue à l'étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées.
3. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit gaz est de l'azote.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite composition cellulaire comprend des bactéries lactiques et d'intérêt probiotique, des bactéries formant le microbiote, des levures, des cellules végétales, des micro-algues, des cellules reproductrices, des cellules sanguines, des cellules souches.
5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite composition cellulaire comprend des bactéries d'intérêt probiotique pour l'homme et l'animal.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel la composition cellulaire ne contient pas de cryoprotectant.
7. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite composition cellulaire est un échantillon de microbiote fécal.
8. Composition cellulaire lyophilisée obtenue par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1, 3 à 7.
9. Composition selon la revendication 8 comprenant en outre des maltodextrines surséchées.
10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9 dans laquelle la composition cellulaire comprend des bactéries d'intérêt probiotique.
EP20828541.1A 2019-12-02 2020-12-02 Procede de lyophilisation d'une composition cellulaire cryogenisee et contenant du gaz dissous Pending EP4069822A1 (fr)

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