EP4010702A1 - Testsystem zur erkennung von legionellen - Google Patents

Testsystem zur erkennung von legionellen

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Publication number
EP4010702A1
EP4010702A1 EP20756815.5A EP20756815A EP4010702A1 EP 4010702 A1 EP4010702 A1 EP 4010702A1 EP 20756815 A EP20756815 A EP 20756815A EP 4010702 A1 EP4010702 A1 EP 4010702A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
test system
test
protein
legionella
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP20756815.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Torsten Stadthagen
Patrick Gruber
Hannelore MEYER
Nina WANTIA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Securetec Detektions Systeme AG
Technische Universitaet Muenchen
Original Assignee
Securetec Detektions Systeme AG
Technische Universitaet Muenchen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Securetec Detektions Systeme AG, Technische Universitaet Muenchen filed Critical Securetec Detektions Systeme AG
Publication of EP4010702A1 publication Critical patent/EP4010702A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a test system for the detection of legionella.
  • the present invention also relates to a test system for detecting an infection with Legionella, and the use of a test system in a method for detecting Legionella.
  • the invention also relates to a method for detecting an infection with Legionella.
  • legionnaires can be detected by a number of methods.
  • Legionella is currently detected mainly (in 73% of cases) via the immunological detection of lipopolysaccharide (LPS). In these tests, however, the sensitivity of 75% is not satisfactory, so that a legionella infection cannot be reliably ruled out if the result is negative. Furthermore, the tests available on the market can only detect infection with Legionella pneumophila of serogroup 1. Legionella pneumophila is the cause of severe Legionella diseases in over 90% of cases, but the serogroup is the cause in only two thirds of cases. Nosocomial infections, in particular, are often strains of other groups of pathogens that cannot be detected by this method.
  • PCR-based tests are carried out from airway samples (mostly bronchial lavage). Although the sensitivity and specificity are high, these diagnostic methods are complex, expensive and can only be used to a limited extent due to the invasive sampling with a considerable risk for a subsequent necessary intubation of the patient. In addition, highly qualified and trained personnel are required to detect Legionella via PCR, so that these methods are mainly used in the clinical sector.
  • Serological tests detect antibodies against Legionella in the patient's serum. However, these are only detectable 3 to 10 weeks after infection. Due to its low sensitivity, the method is not suitable for rapid diagnosis. Other methods for direct pathogen detection (microscopy, culture) only play a subordinate role and are of limited use due to the complex sampling, implementation or long culture duration (several days).
  • the antigen test from urine is the most frequently used test (73.1%), followed by the PCR method (12.8%), the serological detection ( 9.3%) and the direct pathogen detection in culture with 4.4% (based on 841 mentions in 806 cases).
  • Legionnaires' disease (Legionellosis) is a serious and, if left untreated, often fatal, bacterial pneumonia, which, however, only represents a small proportion of atypical pneumonia.
  • LFT lateral flow test
  • Saliva should be used as sample material because of its simple, non-invasive availability. This can, among other things, reduce the development of resistance and support diagnostics at the family doctor.
  • Legionellosis is a severe form of pneumonia caused by the bacterium Legionella pneumophila. Every year in Germany around 200,000 patients with pneumonia are treated in hospitals. These are checked for Legionella infection as standard. Until a result is available, broad-spectrum antibiotics are administered as a preventative measure.
  • the aim of the project is to develop a reliable rapid test for the detection of Legionella in saliva.
  • the present invention is intended to provide a quick test result with simple handling and non-invasive sampling.
  • the area of application should also be countries with a weak medical infrastructure.
  • the object of the present invention is to provide a test system for the detection of an infection with Legionella, in particular a test system which allows reliable and rapid detection.
  • test system with the features of claim 1. It is then provided that a test system is provided for the detection of Legionnaires' disease.
  • Legionnaires' disease can alternatively be referred to as legionellosis.
  • the invention is based on the fundamental idea that the prophylactic administration of antibiotics against legionellosis, or the administration of antibiotics due to false negative test results from unreliable tests, should be reduced and / or avoided and thus the development of antibiotic resistance can be at least partially counteracted.
  • the test system can be set up for the detection of an infection of a subject with Legionella.
  • a subject can be a mammal, in particular a human.
  • the subject can be a patient.
  • the test system also detects an infection of a subject before the disease breaks out (legionellosis).
  • an essential advantage is that the prophylactic administration of antibiotics against legionnaires' disease is to be reduced and / or avoided and thus the development of antibiotic resistance can be at least partially counteracted.
  • the test system is or comprises a lateral flow test (LFT).
  • LFT lateral flow test
  • a lateral flow test is to be understood as an immunological method for the qualitative detection of substances with corresponding binding partners.
  • Such a lateral flow test can also be carried out at any conceivable location, in particular no laboratory environment and no laboratory personnel or medically trained personnel is required.
  • a lateral flow test thus enables a test to be carried out quickly, easily and inexpensively to detect an infection with legionella or to detect legionnaires. This also helps the family doctor with the diagnosis enables.
  • the test duration from the sampling can be less than an hour, in particular less than 30 minutes.
  • the test system can be set up to detect legionnaires' disease and / or to detect an infection with legionella in saliva and / or sputum.
  • a sample e.g. airway samples obtained via bronchial lavage, blood or lymph
  • the test system according to the invention is also advantageous over test systems which are set up for the detection of pathogens in urine and / or stool, because no toilets and associated intimate activities are required for the use of the test system according to the invention.
  • the saliva sample or sputum sample comprises a freshly taken sample or a stored, chilled or frozen sample.
  • sample can be used as an untreated sample or a pretreated sample.
  • the detection and / or the detection to take place at least partially via the binding of at least one protein, in particular a protein of the Legionella bacterial genus, to a specific binding partner.
  • the protein can also be referred to as a marker protein. This achieves a high specificity of the test system.
  • the test system is a test system for the detection of Legionellosis in a saliva sample, wherein the test system comprises a lateral flow test and wherein the detection of the FLA marker by the test system speaks for the presence of the Legionellosis.
  • the test system is a test system for detecting legionellosis in a saliva sample, the test system comprising a lateral flow test and the detection of the MIP marker by the test system indicating the presence of the legionellosis.
  • the test system is a test system for the detection of legionellosis in a saliva sample, wherein the test system comprises a lateral flow test and wherein the detection of the PAL marker by the test system speaks for the presence of legionellosis.
  • Two or more markers can also be combined in one test system.
  • a protein can include a peptide, lipoprotein, glycoprotein, peptidoglycan, filament, antigen and / or epitope.
  • the at least one protein is a protein of the species Legionella pneumophila, Legionella micadei, Legionella bozmanii, Legionella dumoffii and / or Legionella longbeachae.
  • different and / or all (of the approximately 57) serotypes of Legionella pneumophila can be recognized and / or detected with the test system, in particular serotypes 1, 4 and / or 6.
  • serotypes 1, 4 and / or 6 This has the advantage that not just one disease / infection which can be traced back to Legionella pneumophila serotype 1 - the most common cause of Legionnaires' disease - detected and / or recognized. This avoids false negative results through tests which are specific for only one serotype.
  • the at least one protein or also several proteins comprises macrophage inflammatory protein (MIP and / or (Legionella pneumophila) peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL) and / or flagellin (FLA).
  • MIP macrophage inflammatory protein
  • PAL peptidoglycan-associated lipoprotein
  • FLA flagellin
  • Macrophage inflammatory protein is a 24-kDa protein (pl 9.8).
  • MIP can include MIP-1 alpha and / or MIP-1 beta.
  • PAL Peptidoglycan-associated lipoprotein
  • Flagellin is a component of the flagellum of Legionella pneumophila and is also involved in the invasion of host cells.
  • other marker proteins of high conservation, prevalence and immunogenicity are also conceivable for the detection of an infection with Legionella and / or the detection of Legionnaires' disease.
  • surface proteins are conceivable.
  • the test system comprises a test element with microfluidic structures, preferably a chromatographic test strip.
  • the test element optionally comprises a first area which is set up for the absorption of eluent, a second area which is set up for the application of a sample, a third area which is used for the detection, preferably for the optical detection, of the protein, in particular of MIP , PAL and / or FLA, is set up, optionally a fourth area which is set up for the absorption of excess eluent.
  • the test system can further optionally include a housing.
  • a test system of this type has the advantage that it is very compact and the use of the test is thus made considerably easier.
  • the housing also protects against external disruptive factors such as damage to the test or contamination.
  • test element can comprise a further (fifth) area, the further (fifth) area at least temporarily including the specific binding partner for the protein, in particular MIP, PAL and / or FLA.
  • the test system and / or test element can comprise a porous material, in particular a fiber fabric made of cellulose, glass fiber, polymer fiber, nylon, silk, wool, felt and / or cotton linter and / or a sponge.
  • the test system further comprises a control system, in particular an optical control system.
  • the control system can also be referred to as a control unit or control element.
  • the control system can advantageously indicate whether the test system has been used in such a way that it is technically possible to detect legionella and / or detect legionella. In other words, the likelihood of false results due to incorrectly performed tests using the test system is reduced.
  • the control system can comprise the specific binding partner of the at least one protein connected to the marker element and / or at least one specific binding partner of the specific one Binding partner of the at least one protein.
  • the control system can comprise at least one antibody.
  • the test system can furthermore comprise a sampling element which is set up to receive a sample containing the protein.
  • a sampling element can be a saliva collector and / or sputum collector, for example.
  • the invention also relates to the use of a test system for detecting an infection with Legionella.
  • the invention also relates to a method for the detection of Legionella in a sample, comprising the following steps: a) Providing a test system,
  • the test system comprising at least one specific binding partner to which the at least one protein, in particular MIP, PAL and / or FLA binds, the Detection takes place at least partially via the binding of the at least one protein, in particular MIP, PAL and / or FLA, to the specific binding partner.
  • the method according to the invention is a method for detecting legionellosis in a saliva sample, with a lateral flow test being carried out and with the detection and / or detection of the FLA marker indicating the presence of legionellosis.
  • the method according to the invention is a method for detecting legionellosis in a saliva sample, with a lateral flow test being carried out, and with the detection and / or the detection of the MIP marker indicating the presence of legionellosis.
  • the method according to the invention is a method for detecting legionellosis in a saliva sample, with a lateral flow test being carried out, and with the detection and / or detection of the PAL marker indicating the presence of legionellosis.
  • the method prefferably comprises lysing the bacteria in the sample. This has the advantage that the method and / or the test system possibly becomes more sensitive and / or more sensitive.
  • Some bacterial proteins for example MIP and PAL, are located in / on the cell membrane of bacteria (Legionella) and are partially covered by lipopolysaccharide. Therefore, contact with specific binding partners on the intact bacterium is sterically at least partially difficult. Breaking the cell membrane (lysing) can make the targets, i.e. the proteins (legionella proteins) to which the specific binding partners are supposed to bind, more accessible.
  • the sample comprises a saliva sample or sputum.
  • the test system can be set up to recognize and / or detect legionella in saliva and / or sputum. The advantages of such a test system have already been mentioned.
  • enzyme inhibitors are added to the saliva samples in order to prevent degradation of the marker proteins in saliva (analogous to Fung et al. “Quantitative detection of Pf HRP2 in saliva of malaria patients in the Philippines”, Malaria Journal, 2012, 11: 175).
  • other inhibitors are also conceivable, in particular protease inhibitors.
  • the specific binding partner can comprise a monoclonal antibody, polyclonal antibody affinity-purified antibody, an antibody fragment, peptide, protein, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin, lectin, affibody and / or chemical ligand, wherein the specific binding partner is linked to a marker element.
  • a specific binding partner for at least one protein (marker protein) with a marker element enables detection and / or detection, in particular optical detection and / or optical detection.
  • the marking element can comprise a dye, a fluorochrome, fluorophore, luminophore, enzyme, peptide, biotin, oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide, a nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot .
  • a binding partner specific for a marker protein to bind to a corresponding marker protein and the ability of a marker element to give a detectable and / or recognizable signal can thus be present in combination.
  • a combination of a specific binding partner of a marker protein with a nanoparticle e.g. a gold nanoparticle, can have the advantage of being visible to the naked eye.
  • nanoparticle or “nanoparticle” can denote a composite of a few to a few thousand atoms or molecules, the size of which is typically 1 to 200 nanometers, but can also be expanded to 1000 nanometers if necessary. However, the nanoparticle can also have a size ⁇ 1 nm.
  • the nanoparticle can be a plastic, natural substance or metallic nanoparticle, in particular a gold nanoparticle (also referred to as nanogold). In general, it is also possible that gold nanoparticles are colloidal gold nanoparticles.
  • the specific binding partner is an antibody and the marking element is a nanoparticle, in particular gold nanoparticles (also referred to as nanogold).
  • the specific binding partner is present in soluble form.
  • the specific binding partner can in particular be temporarily immobilized on the test element, in particular in a defined area of the test element.
  • the specific binding partner is in dried form. So far, two different Legionella marker proteins have been produced recombinantly. Various antibodies were generated against these marker proteins and checked for their usability in the lateral flow technology. Initial test setups show that the simple and sensitive detection of both markers is possible in the lateral flow format. Further steps will be the optimization of the test in terms of sensitivity and a feasibility study with patient samples.
  • Another Legionella marker protein was also produced recombinantly.
  • PoC saliva test point-of-care saliva test
  • test system Simple, user-friendly handling and non-invasive sampling. This makes the test system suitable for use in regions with a poorly developed medical infrastructure.
  • 3 schematically shows the basic mode of operation of the test system; 4 shows the use of marker proteins;
  • FIG. 6 shows the structure of a lateral flow test strip
  • Fig. 7 schematically the operation of an LFT system that is used in the invention
  • Figure 8 shows the production of conjugation of gold and antibodies
  • Figure 10 shows the specificity of polyclonal a-MIP and a-PAL
  • FIG. 11 shows an exemplary laboratory sample of a lateral flow test according to the invention
  • FIG. 13a shows, by way of example, the selection of antibody pairings for PAL for use in a test system according to the invention
  • FIG. 13b shows, by way of example, the selection of antibody pairings for PAL for use in a test system according to the invention, using a test membrane;
  • 16 schematically shows a method according to the invention for detecting Legionella in a sample.
  • 1 shows a schematic drawing with the use of the test system 10 according to the invention.
  • saliva is taken from a possible patient in the area of the oral cavity or in another suitable manner.
  • sampling by a sampling element is shown.
  • the saliva can be removed by a sampling element, for example a wiper, or the test system itself.
  • a sampling element for example a wiper, or the test system itself.
  • the test system 10 is a lateral flow test (LFT).
  • LFT lateral flow test
  • a sputum sample can be used.
  • FIG. 2 shows a further schematic drawing with the use of the test system 10 according to the invention.
  • the droplet of saliva is applied, for example, to a saliva collector and with this applied to the LFT lateral flow test.
  • test system 10 here comprises a lateral flow test LFT.
  • the saliva collector can also be referred to as a sampling element.
  • test system 10 here comprises a sampling element.
  • test system 10 with two test strips 12 is shown here.
  • test system 10 can also comprise only one test strip 12 or more than two test strips 12.
  • FIG 3 shows schematically the basic mode of operation of the test system 10, which is designed here as a lateral flow test (LFT).
  • LFT lateral flow test
  • the proven DrugWipe ® technology from Securetec Detektions-Systeme AG is used for highly sensitive and fast PoC detection.
  • the rapid saliva test DrugWipe ® has been used very successfully by police and customs authorities around the world for the detection of drugs in saliva for more than 20 years. This technology is adapted to the detection of Legionella in saliva.
  • test system 10 is a test system 10 for the detection of legionnaires' disease.
  • the test system 10 is set up to detect Legionnaires' disease and / or to detect an infection with Legionella in saliva and / or sputum.
  • the detection can take place at least partially via the binding of at least one protein M, in particular a protein of the bacterial genus Legionella, to a specific binding partner B.
  • the protein M can also be referred to as a marker protein, see FIG. 4.
  • M1-M3 Three marker proteins (M1-M3) were selected based on distribution, immunogenicity and homology between Legionella pneumophila strains. M1 and M2 were produced as recombinant proteins in E. coli and purified on a mg scale. They are used to obtain antibodies.
  • M1 can be MIP (macrophage inflammatory protein), in particular MIP 1-alpha (macrophage inflammatory protein 1-alpha).
  • M2 can be PAL.
  • M3 can be FLA.
  • Polyclonal antibodies a-MIP and a-PAL) have shown high sensitivity and specificity.
  • MIP and PAL form stable conjugates (immunoconjugates) with gold particles N.
  • MIP and PAL are also stable in saliva.
  • MIP 23mg
  • PAL 61mg
  • Fig. 5 shows the characterization of poly- and monoclonal antibodies.
  • the seven antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies, respectively.
  • antibodies against FLA were generated and selected for specificity, sensitivity and stability.
  • FIG. 6 shows the structure of a lateral flow test strip 12.
  • M1 MIP was detected in saliva surrogate.
  • red-colored “nanoprobes” are created, which enable the immunological detection of Legionella.
  • the first laboratory samples achieved a sensitivity of approx. 10 ng / ml (440 pM) marker protein.
  • FIG 7 shows schematically the mode of operation of an LFT system which is used in the test system 10 according to the invention.
  • a sample to be examined (in this example saliva) is applied to the test element 12 (here indicated by the wiper, which can also be referred to as the sampling element).
  • the sample After the eluent (here buffer) has been added, the sample begins to spread over the test element 12 due to capillary forces (thin layer chromatography).
  • eluent here buffer
  • the sample moves with the liquid to an area where immunoconjugates (antibody B with Nanogold N) are located.
  • the immunoconjugates are initially in a dried form.
  • the liquid dissolves the immunoconjugates from the test element 12.
  • the liquid migrates further into the capillary area, where an antibody has been immobilized in a small section (can also be called antibody from test line), which binds to a different location on the surface of the marker protein to be detected than the immunoconjugate does, causing the marker protein to be detected in this area binds and accumulates while the fluid moves on. Due to the enrichment of the protein M to be detected and the immunoconjugate bound to it, the bound immunoconjugate with the nanogold N produces a color on the test element 12, here in the form of a line.
  • a small section can also be called antibody from test line
  • the recognition and / or the detection of the protein M is carried out at least partially via the binding of at least one protein M to a specific binding partner B.
  • the liquid migrates further into the capillary area, where another antibody has been immobilized in a further small section (can also be referred to as a control line antibody), which binds the immunoconjugate (directly) and thereby accumulates it in this area while the liquid moves on.
  • a control line antibody binds the immunoconjugate (directly) and thereby accumulates it in this area while the liquid moves on.
  • the enrichment of immunoconjugates creates a color on the test element 12 via the nanogold N, here in the form of a line.
  • control system 16 This can also be referred to as control system 16.
  • the test system 10 accordingly comprises a test element 12 with microfluidic structures, in particular a chromatographic test strip 12.
  • the test strip 12 comprises a first area which is set up to absorb eluant (in this example a buffer),
  • this first area can be missing.
  • the test tire 12 comprises a second area which is set up for the application of a sample.
  • the test strip 12 comprises a third area which is set up for the detection, preferably for the optical detection, of the protein M,
  • test strip 12 comprises a fourth area which is set up for the absorption of excess eluent (fleece).
  • this fourth area can be omitted.
  • the test strip can comprise a further (fifth) area, the further (fifth) area at least temporarily including the specific binding partner for the protein M, in particular MIP and / or PAL and / or FLA.
  • the test system 10 also includes a housing 14.
  • test element 12 is built into a housing 14.
  • the housing 14 can be omitted.
  • a specific binding partner B can generally comprise a monoclonal antibody, polyclonal antibody, affinity-purified antibody, an antibody fragment, peptide, protein, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin, lectin, affibody and / or chemical ligands.
  • the marking element N generally has at least one dye, a fluorochrome, fluorophore, luminophore, enzyme, peptide, biotin, oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide, a nanoparticle, in particular gold May include nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • the specific binding partner B for the protein M to be detected
  • the LFT lateral flow test shown can be used to detect an infection of a subject with Legionella.
  • the at least one or more proteins M MIP and / or PAL and / or FLA can comprise.
  • test system 10 is suitable at least partially to carry out a method according to FIG. 17.
  • Figure 8 shows the production of conjugation of gold N and antibodies B.
  • Fig. 9 shows the stability of antigens in saliva.
  • the stability of bacterial antigens was examined by means of Western blot.
  • the Western Blot is a method for the detection of proteins, for example in a protein mixture.
  • the protein mixture is determined by means of gel electrophoresis in a carrier matrix (SDS-PAGE, native-PAGE, isoelectric focusing, 2D gel electrophoresis, etc.) ) separated into individual protein bands according to protein size, charge or other properties.
  • the separated protein bands are then transferred from the gel to a solid support membrane (eg made of nitrocellulose, nylon or PVDF) for the Western blot. This process is called blotting. Due to charge interactions, the proteins adhere to the membrane surface in the pattern of the electrophoretic separation and are accessible for antibody binding for detection.
  • the Western blot was carried out under standard conditions.
  • the antigens M MIP and PAL recombinant proteins were incubated in saliva (150 ng / pl).
  • Saliva without the addition of recombinant protein, negative control
  • recombinant protein ng, positive control
  • a marker (molecular weight marker) (was used to clearly identify the marker proteins MIP and PAL.
  • the antigens M are stable in saliva both with and without a protease inhibitor, in particular also at 37.degree.
  • Figure 10 shows the specificity of polyclonal a-MIP and a-PAL.
  • the pathogens were used as samples in the Western blot analysis.
  • a marker (molecular weight marker) was used to clearly identify the marker proteins M MIP and PAL on the basis of their size.
  • the recombinant proteins (antigens) MIP and PAL were used as positive controls.
  • recombinant MIP was used for ⁇ -PAL and recombinant PAL was used for ⁇ -MIP.
  • FIG. 11 shows an exemplary laboratory sample of a lateral flow test LFT according to the invention.
  • the figure shows the determination of the lower detection limit of simple lateral flow test strips LFT for MIP (quadruple determination).
  • the principle of the test is essentially based on the system described in FIG. 7 (without control system 16 and sampling element).
  • a reddish spot on the membrane indicates the specific detection of the marker protein M MIP.
  • Saliva surrogate was used as a sample.
  • the immunoconjugates are shown as dots, not stripes.
  • the most sensitive test strips 12 achieved a sensitivity of approx. 2 ng / ml - 20 ng / ml (440 pM) per marker protein M in saliva surrogate.
  • the detection limit of PAL was determined in a comparable test. This is less than 2 ng / ml in saliva surrogate.
  • test systems 10 for MIP each comprising a control system 16.
  • test systems 10 function essentially in accordance with the description of FIG. 7. Four MIP development patterns are shown, each after the end of the test (approx. 20 minutes).
  • the test systems 10 each include an internal control system 16. This forms an additional band / line if the test (regardless of the test result) has been carried out correctly and has run correctly.
  • Test systems 10 for the following samples are shown from left to right: human saliva as negative sample, 5x10 6 Legionella pneumophila in saliva, 5x10 5 Legionella pneumophila in saliva, 5x10 4 Legionella pneumophila in saliva.
  • the control system 16 provided a signal after 10 minutes (upper of the two lines).
  • the lower detection limit of MIP is approx. 1 x 10 5 intact Legionella pneumophila bacteria in human saliva per test element 12.
  • a (red) control line can be seen in all tests, and a (red) test line can also be seen in the positive samples (greater than / equal to the detection limit).
  • the sample shows no false-positive signal in the negative sample (even after an extended readout time of up to two hours, not shown).
  • the lower detection limit for PAL is approx. 1 x 10 7 intact Legionella pneumophila bacteria in human saliva per test strip,
  • FIG. 13a and 13b show, by way of example, the selection of antibody pairings for PAL for use in a test system 10 according to the invention.
  • the aim is to select the pairs from the antibodies or immunoconjugates with which a sandwich assay for the lateral flow test can be set up (so-called “matching pairs”) (sandwich assay, cf. Fig. 7).
  • test golds were used and the test line AKs were spotted.
  • +++ stands for strong binding
  • ++ for moderate binding
  • Test gold AK # 1 is aggregated with nanogold. It is therefore necessary to find a stable test gold with this antibody in order to keep all combinations open
  • FIG. 13a or 13b shows, by way of example, the selection of antibody pairings for MIP for use in a test system 10 according to the invention.
  • the selection process for MIP is basically identical to the selection process for PAL, see FIGS. 13a and 13b.
  • the aim is to select the pairs from antibodies or conjugates with which a sandwich assay can be set up (so-called “matching pairs”). All available MIP combinations were set up in the form of spot tests. This was done on different membranes in conjunction with different RP systems.
  • the MIP pairings most suitable for the sandwich assay are:
  • test gold AK # 4 with test line AK # 2 and vice versa test gold AK # 2 * with test line AK # 4
  • the pairing AK # 5 / AK # 6 can also be used if, contrary to expectations, no sensitive and stable test can be set up with the above pairings.
  • 15 shows exemplary conditions for the conjugation of polyclonal antibodies and nanogold.
  • FIG. 16 shows schematically a method according to the invention for detecting Legionella in a sample.
  • the method can be carried out at least partially with a test system 10 according to the invention, for example as shown in FIG. 7.
  • the method comprises at least steps S1-S3.
  • a test system 10 is provided.
  • the test system 10 comprises a test element 12.
  • a sample is applied to the test element 12.
  • a third step S3 the presence of at least protein M, in particular MIP, PAL and / or FLA, is detected in the sample.
  • the test system 10 comprises at least one specific binding partner B to which the at least one protein M binds.
  • the detection takes place at least partially via the binding of the at least one protein M, in particular MIP, PAL and / or FLA, to the specific binding partner B.
  • the method can furthermore comprise the step of determining the amount of the at least one protein.
  • the method further comprises the step of lysing the sample.
  • Lysing can take place, for example, with detergents (e.g. Triton X-100), SDS and / or Tween) or by means of ultrasound.
  • detergents e.g. Triton X-100
  • SDS styrene-maleic anhydride
  • Tween styrene-maleic anhydride
  • the method may further comprise the step of liquefying the sample.
  • Liquefaction can take place at least partially by detergents and / or liquefiers.
  • the aim of liquefaction can be to improve the chromatography of the sample using a lateral flow test.
  • the sample can be saliva or sputum, for example.
  • the lower detection limit of MIP is approx. 1 x 10 5 intact Legionella pneumophila bacteria in human saliva per test element 12.
  • the lower detection limit for PAL is approx. 1 x 10 7 intact Legionella pneumophila bacteria in human saliva per test element 12.

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Abstract

Ferner betrifft die vorliegenden Erfindung ein Testsystem (10) zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen, sowie der Verwendung eines Testsystems (10) in einem Verfahren zum Nachweis von Legionellen. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen.

Description

Testsvstem zur Erkennung von Leqionellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem zur Erkennung von Legionellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Testsystem zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen, sowie der Verwendung eines Testsystems in einem Verfahren zum Nachweis von Legionellen. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen.
Zum Nachweis der Legionellose muss derzeit eine spezifische Erregerdiagnostik durchgeführt werden, da das Krankheitsbild unspezifisch ist und somit keinen Schluss auf den Erreger zulässt. Nach dem Stand der Technik können Legionellosen durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen werden.
Der Nachweis der Legionellen erfolgt derzeit hauptsächlich (in 73% der Fälle) über den immunologischen Nachweis von Lipopolysaccharid (LPS). Bei diesen Tests ist die Sensitivität mit 75% jedoch nicht zufriedenstellend, sodass bei negativem Ergebnis eine Legionellen- Infektion nicht zuverlässig ausgeschlossen werden kann. Weiterhin können die am Markt erhältlichen Tests nur die Infektion mit Legionella pneumophila der Serogruppe 1 nachweisen. Legionella pneumophila ist zwar bei über 90% der Fälle der Verursacher von schweren Legionellenkrankheiten, jedoch ist die Serogruppe nur bei zwei Dritteln der Fälle ursächlich. Insbesondere bei nosokomialen Infektionen handelt es sich oft um Stämme anderer Erregergruppen, die von diesem Verfahren nicht detektiert werden können.
Alternativ werden PCR-basierte Tests aus Atemwegsproben (meist Bronchiallavage) durchgeführt. Obgleich die Sensitivität und Spezifität hoch sind, sind diese diagnostischen Methoden jedoch aufwändig, teuer und durch die invasive Probennahme mit einem erheblichen Risiko für eine nachfolgend erforderliche Intubation der Patienten nur eingeschränkt einsetzbar. Zudem bedarf es hochqualifiziertes und geschultes Personal zum Nachweis der Legionellen über PCR, sodass diese Verfahren hauptsächlich für den Klinikbereich in Frage kommen.
Serologische Tests weisen Antikörper gegen Legionellen im Serum des Patienten nach. Diese werden allerdings erst nach 3 bis 10 Wochen nach Ansteckung nachweisbar. Aufgrund der geringen Sensitivität ist das Verfahren für die Schnelldiagnostik nicht geeignet. Andere Verfahren zum direkten Erregernachweis (Mikroskopie, Kultur) spielen nur eine untergeordnete Rolle und sind durch aufwändige Probennahme, Durchführung bzw. lange Kulturdauer (mehrere Tage) von eingeschränktem Nutzen.
Laut eines Überblicks zur Legionellose des Robert-Koch-Instituts von Ende März 2015 ist der Antigen-Test aus dem Urin der am häufigsten verwendete Test (73,1%), gefolgt vom PCR Verfahren (12,8%), dem serologischen Nachweis (9,3%) und dem direkten Erregernachweis in Kultur mit 4,4% (Zugrunde lagen 841 Nennungen bei 806 Fällen).
Insgesamt ist festzustellen, dass für den zuverlässigen und schnellen Nachweis einer Legionellen-Infektion kein geeigneter Test für eine klinische Anwendung oder Diagnose beim Hausarzt zur Verfügung steht.
Die Legionärskrankheit (Legionellose) ist eine schwere und unbehandelt oft tödliche, bakterielle Lungenentzündung, die allerdings nur einen geringen T eil der atypischen Pneumonien darstellt. Zum Nachweis der bakteriellen Erreger, der Legionellen, soll ein Diagnostikverfahren auf der Grundlage eines Lateral-Flow-Tests (LFT) entwickelt werden, der die bisherigen diagnostischen Verfahren hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität, wie auch der Testschnelligkeit übertrifft. Die bislang bei Pneumonien veranlasste und aufgrund der Seltenheit von Legionellosen unnötige Gabe von Makrolid- und Fluorchinolon-Antibiotika soll somit vermieden werden. Als Probenmaterial soll Speichel wegen der einfachen, nicht invasiven Verfügbarkeit verwendet werden. Dadurch kann u.a. die Ausbildung von Resistenzen verringert werden, sowie die Diagnostik bereits beim Hausarzt unterstützt werden.
Die Legionellose ist eine durch das Bakterium Legionella pneumophila verursachte schwere Form der Lungenentzündung. Jährlich werden in Deutschland etwa 200.000 Patienten mit Lungenentzündung im Krankenhaus behandelt. Diese werden standardmäßig hinsichtlich einer Legionellen-Infektion untersucht. Bis zum Vorliegen eines Ergebnisses werden vorbeugend Breitbandantibiotika verabreicht. Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines zuverlässigen Schnelltests für den Nachweis von Legionellen in Speichel. Die vorliegende Erfindung soll ein schnelles Testresultat bei einfacher Handhabung und nicht-invasiver Probenahme liefern. Einsatzgebiet sollen auch Länder mit schwacher medizinischer Infrastruktur sein. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Testsystem für den Nachweis einer Infektion mit Legionellen bereitzustellen, insbesondere ein Testsystem, welches einen zuverlässigen und schnellen Nachweis erlaubt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Testsystem mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Danach ist vorgesehen, dass ein Testsystem bereitgestellt wird, zur Erkennung der Legionärskrankheit.
Die Legionärskrankheit kann alternativ als Legionellose bezeichnet werden.
Die Erfindung beruht auf der grundlegenden Idee, dass eine prophylaktische Vergabe von Antibiotika gegen die Legionellose, oder die Gabe von Antibiotika wegen falsch negativer Testergebnisse von unzuverlässigen Tests, verringert und/oder vermieden werden soll und somit der Entstehung von Antibiotikaresistenzen zumindest teilweise entgegengewirkt werden kann.
Das Testsystem kann alternativ und/oder zusätzlich für den Nachweis einer Infektion eines Subjekts mit Legionellen eingerichtet sein. Ein Subjekt kann dabei ein Säugetier, insbesondere ein Mensch sein. Insbesondere kann das Subjekt ein Patient sein. Insbesondere ist es möglich, dass das Testsystem auch eine Infektion eines Subjekts vor dem Ausbrechen der Erkrankung (Legionellose) nachweist. Auch hier ist ein wesentlicher Vorteil, dass eine prophylaktische Vergabe von Antibiotika gegen die Legionellose verringert und/oder vermieden werden soll und somit der Entstehung von Antibiotikaresistenzen zumindest teilweise entgegengewirkt werden kann.
In einer Ausführungsform ist oder umfasst das Testsystem einen Lateral-Flow-Test (LFT). Insbesondere ist unter einem Lateral Flow Test eine immunologische Methode zum qualitativen Nachweis von Stoffen mit entsprechenden Bindungspartnern zu verstehen. Ein derartiger Lateral-Flow Test kann auch an jedem erdenklichen Ort durchgeführt werden, insbesondere wird keine Laborumgebung und kein Laborpersonal oder medizinisch geschultes Personal benötigt. Ein Lateral-Flow Test erlaubt damit eine schnelle, einfache und kostengünstige Durchführung eines Tests zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen oder zum Erkennen einer Legionellose. Somit wird auch eine Unterstützung des Hausarztes bei der Diagnose ermöglicht. Die Testdauert von der Probennahme kann unter einer Stunde, insbesondere unter 30 Minuten betragen.
Das Testsystem kann zur Erkennung einer Legionärskrankheit und/oder zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen in Speichel und/oder Sputum eingerichtet sein. Somit können eine vorteilhafte, anwenderfreundliche Verwendung des Testsystems oder ein anwenderfreundliches Durchführen des Verfahrens ohne invasive Entnahme einer Probe (z,B. Atemwegsproben, die über Bronchiallavage erhalten werden, Blut oder Lymphe) von dem zu untersuchenden Subjekt erfolgen. Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Testsystem auch gegenüber Testsystemen, welche für den Nachweis von Erregern in Urin und/oder Stuhl eingerichtet sind, denn für die Verwendung des erfindungsgemäßen Testsystems werden keine Toiletten und damit verbundene intime Tätigkeiten benötigt. Denkbar ist generell, dass die Speichelprobe oder Sputumprobe eine frisch entnommene Probe oder eine gelagerte, gekühlte oder gefrorene Probe umfasst.
Ein Einsatz von Blut, Atemswegsproben (insbesondere der unteren Atemwege), Lymphe, Urin und/oder anderen Körperflüssigkeiten und/oder Stuhl ist jedoch alternativ und/oder zusätzlich denkbar und/oder möglich. Insbesondere kann die Probe als unbehandelte Probe oder vorbehandelte Probe eingesetzt werden.
Insbesondere ist es möglich, dass die Erkennung und/oder der Nachweis zumindest teilweise über die Bindung mindestens eines Proteins, insbesondere eines Proteins der Bakteriengattung Legionella, an einen spezifischen Bindungspartner erfolgt. Insbesondere kann das Protein auch als Markerprotein bezeichnet werden. Dadurch wird eine hohe Spezifität des Testsystems erreicht.
In einer Ausführungsform ist das Testsystem ein Testsystem zum Nachweis einer Legoinellose in einer Speichelprobe, wobei das Testsystem einen Lateral-Flow-Test umfasst und wobei der Nachweis des Markers FLA durch das Testsystem für das Vorliegen der Legionellose spricht.
In einer Ausführungsform ist das Testsystem ein Testsystem zum Nachweis einer Legionellose in einer Speichelprobe, wobei das Testsystem einen Lateral-Flow-Test umfasst und wobei der Nachweis des Markers MIP durch das Testsystem für das Vorliegen der Legionellose spricht. In einer Ausführungsform ist das Testsystem ein Testsystem zum Nachweis einer Legionellose in einer Speichelprobe, wobei das Testsystem einen Lateral-Flow-Test umfasst und wobei der Nachweis des Markers PAL durch das Testsystem für das Vorliegen der Legionellose spricht.
Es können auch zwei oder mehr Marker in einem Testsystem vereint sein.
Ein Protein kann dabei ein Peptid, Lipoprotein, Glykoprotein, Peptidoglycan, Filament, Antigen und/oder Epitop umfassen.
Generell ist es möglich, dass das mindestens eine Protein ein Protein der Art Legionella pneumophila, Legionella micadei, Legionella bozmanii, Legionella dumoffii und/oder Legionella longbeachae ist. Insbesondere können auch verschiedene und/oder alle (der etwa 57) Serotypen von Legionella pneumophila mit dem Testsystem erkannt und/oder nachgewiesen werden, insbesondere die Serotypen 1, 4 und/oder 6. Das hat den Vorteil, dass nicht nur eine Erkrankung/Infektion, die auf Legionella pneumophila Serotyp 1 - den häufigsten Verursacher für die Legionärskrankheit - zurückzuführen ist, nachgewiesen und/oder erkannt werden kann. Somit werden falsch negative Ergebnisse, durch Tests, welche spezifisch für nur einen Serotyp sind, vermieden.
Denkbar ist, dass das mindestens eine Protein oder auch mehrere Proteine Makrophage inflammatory Protein (MIP und/oder ( Legionella pneumophila) peptidoglycan-assoziiertes Lipoprotein (PAL) und/oder Flagellin (FLA) umfasst.
Macrophage inflammatory protein (MIP) ist ein 24-kDa Protein (pl 9.8). MIP kann MIP-1 alpha und/oder MIP-1 beta umfassen.
(Legionella pneumophila) Peptidoglycan-assoziiertes Lipoprotein (PAL) ist eines der am höchsten konservierten Proteine von Legionellen, und erreicht in diagnostischen Anwendungen Sensitivitäts- und Spezifitätswerte von ca. 90%.
Flagellin (FLA) ist ein Bestandteil des Flagellums von Legionella pneumophila und auch an der Invasion von Wirtszellen beteiligt. Denkbar sind generell auch andere Markerproteine hoher Konservierung, Prävalenz und Immunogenität für den Nachweise einer Infektion mit Legionellen und/oder die Erkennung der Legionärskrankheit verwendet werden. Insbesondere sind Oberflächenproteine denkbar.
In einer Ausführungsform umfasst das Testsystem ein Testelement mit mikrofluidischen Strukturen, vorzugsweise einen chromatographischen Teststreifen. Das Testelement umfasst gegebenenfalls einen ersten Bereich, der zur Absorption von Elutionsmittel eingerichtet ist, einen zweiten Bereich, der für die Aufbringung einer Probe eingerichtet ist, einen dritten Bereich, der für den Nachweis, vorzugsweise für den optischen Nachweis, des Proteins, insbesondere von MIP, PAL und/oder FLA, eingerichtet ist, optional einen vierten Bereich, der für die Absorption überschüssigen Elutionsmittels eingerichtet ist. Das Testsystem kann ferner wahlweise ein Gehäuse umfassen. Ein derartiges Testsystem hat den Vorteil, dass es sehr kompakt ist und die Anwendung des Tests somit erheblich erleichtert wird. Das Gehäuse schützt zusätzlich vor äußeren Störfaktoren wie Beschädigungen des Tests oder Kontaminationen. Zudem ist nur ein sehr geringes Probevolumen von 1-20 pl Speichel, insbesondere 2-16 pl Speichel, insbesondere 4 mI Speichel notwendig.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Testelement einen weiteren (fünften) Bereich umfassen, wobei der weitere (fünfte) Bereich zumindest vorübergehend den spezifischen Bindungspartner für das Protein, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA umfasst.
Das T estsystem und/oder T estelement kann ein poröses Material umfassen, insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwoll-Linter und/der einen Schwamm.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Testsystem ferner ein Kontrollsystem, insbesondere ein optisches Kontrollsystem. Insbesondere kann das Kontrollsystem auch als Kontrolleinheit oder Kontrollelement bezeichnet werden. Das Kontrollsystem kann vorteilhaft anzeigen, ob das Testsystem so verwendet wurde, dass eine Erkennung einer Legionellose und/oder der Nachweis von Legionellen technisch möglich ist. In anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit von falschen Ergebnissen aufgrund von falsch durchgeführten Tests unter Verwendung des Testsystems wird verringert. Insbesondere kann das Kontrollsystem den mit dem Markierungselement verbundenen spezifischen Bindungspartner des mindestens einen Proteins umfassen und/oder mindestens einen spezifischen Bindungspartner des spezifischen Bindungspartners des mindestens einen Proteins. Insbesondere kann das Kontrollsystem mindestens einen Antikörper umfassen.
Das Testsystem kann ferner ein Probennahmeelement umfassen, welches für die Aufnahme einer das Protein enthaltenden Probe eingerichtet ist. Ein Probennahmeelement kann beispielsweise ein Speichelkollektor und/oder Sputum kollektor sein. Somit kann die Erkennung und/oder der Nachweis einer Legionellose und/oder einer Infektion mit Legionellen von der Probennahe bis zur Erkennung/dem Nachweis mit nur einem Testsystem durchgeführt werden, was eine vorteilhafte, sichere, schnelle und einfache Anwendung des Testsystems bedeutet.
Die Erfindung betrifft Ferner die Verwendung eines Testsystems zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Legionellen in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Testsystems,
(b) Aufbringen der Probe auf ein Testelement, und
(c) Nachweis des Vorhandenseins mindestens eines Proteins, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA in der Probe, wobei das Testsystem mindestens einen spezifischen Bindungspartner umfasst, an welchen das mindestens eine Protein, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA bindet, wobei der Nachweis zumindest teilweise über die Bindung des mindestens einen Proteins, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA, an den spezifischen Bindungspartner erfolgt.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis einer Legionellose in einer Speichelprobe, wobei ein Lateral- Flow-Test durchgeführt wird, und wobei die Detektion und/oder der Nachweis des Markers FLA für das Vorliegen der Legionellose spricht.
In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis einer Legionellose in einer Speichelprobe, wobei ein Lateral-Flow-Test durchgeführt wird, und wobei die Detektion und/oder der Nachweis des Markers MIP für das Vorliegen der Legionellose spricht. In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis einer Legionellose in einer Speichelprobe, wobei ein Lateral-Flow-Test durchgeführt wird, und wobei die Detektion und/oder der Nachweis des Markers PAL für das Vorliegen der Legionellose spricht.
Es ist generell möglich, dass das Verfahren ferner das Lysieren der Bakterien in der Probe umfasst. Dies hat den Vorteil, das Verfahren und/oder das Testsystem ggf. empfindlicher, und/oder sensitiver wird.
Manche bakteriellen Proteine, beispielsweise MIP und PAL sind in/auf der Zellmembran der Bakterien (Legionellen) lokalisiert und teilweise vom Lipopolysaccharid überdeckt. Daher ist der Kontakt mit spezifischen Bindungspartnern am intakten Bakterium sterisch zumindest teilweise erschwert. Das Aufbrechen der Zellmembran (Lysieren) kann die Targets, also die Proteine (Legionellenproteine), an welche die spezifischen Bindungspartner binden sollen besser zugänglich machen.
Generell ist es möglich, dass die Probe eine Speichelprobe oder Sputum umfasst. In anderen Worten, das Testsystem kann zum Erkennen und/oder Nachweis von Legionellen in Speichel und/oder Sputum eingerichtet sein. Die Vorteile eines derartigen Testsystems sind bereits genannt.
Es ist denkbar, beispielsweise in einem weiteren Verfahrensschritt, dass um Abbau der Markerproteine in Speichel zu unterbinden, den Speichelproben Enzym-Inhibitoren zugesetzt werden (analog Fung et al. “Quantitative detection of Pf HRP2 in saliva of malaria patients in the Philippines”, Malaria Journal, 2012, 11:175). Dabei ist beispielsweise der Einsatz eines Inhibitoren-Cocktails aus Aprotinin, PMSF und Natriumorthovanadat denkbar. Denkbar sind generell auch andere Inhibitoren, insbesondere Proteaseinhibitoren.
Der spezifische Bindungspartner kann einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper affinitätsaufgereinigten Antikörper, ein Antikörperfragment, Peptid, Protein, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Liganden umfassen, wobei der spezifische Bindungspartner mit einem Markierungselement verbunden ist. In anderen Worten, es liegt ein Konjugat aus spezifischem Bindungspartner und Markierungselement vor. Durch die Verbindung eines spezifischen Bindungspartners für mindestens ein Protein (Markerprotein) mit einem Markierungselement wird der Nachweis und/oder die Erkennung, insbesondere der optische Nachweis und/oder die optische Erkennung ermöglicht.
Das Markierungselement kann einen Farbstoff, ein Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfassen. Die Fähigkeit eines für ein Markerprotein spezifischen Bindungspartners an ein entsprechendes Markerprotein zu binden und die Fähigkeit eines Markierungselements ein detektierbares und/oder erkennbares Signal zu geben kann also kombiniert vorliegen. Insbesondere kann eine Verbindung eines spezifischen Bindungspartners eines Markerproteins mit einen Nanopartikel, z.B. einem Gold- Nanopartikel, den Vorteil haben, per bloßem Auge erkennbar zu sein.
Ein „Nanopartikel“ bzw. „Nanoteilchen“ kann einen Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen bezeichnen, dessen Größe typischerweise bei 1 bis 200 Nanometern liegt, ggf. aber auch bis 1000 Nanometer erweitert werden kann. Der Nanopartikel kann jedoch auch eine Größe <1nm haben.
Der Nanopartikel kann ein Kunststoff, Naturstoff oder metallischer Nanopartikel sein, insbesondere ein Gold-Nanopartikel (auch als Nanogold bezeichnet). Generell ist es auch möglich, dass Gold-Nanopartikel kolloidale Gold-Nanopartikel sind.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der spezifische Bindungspartner ein Antikörper und das Markierungselement ein Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel (auch als Nanogold bezeichnet).
Insbesondere ist es denkbar, dass der spezifische Bindungspartner in löslicher Form vorliegt.
Der spezifische Bindungspartner kann insbesondere vorübergehend auf dem Testelement immobilisiert sein, insbesondere in einem definierten Bereich des Testelements.
In einer weiteren, vorteilhaften Ausführungsform liegt der spezifische Bindungspartner in getrockneter Form vor. Bislang wurden zwei unterschiedliche Legionella-Markerproteine rekombinant hergestellt. Gegen diese Markerproteine wurden verschiedene Antikörper generiert und auf deren Einsetzbarkeit in der Lateral-Flow Technologie überprüft. Erste Versuchsaufbauten zeigen, dass der einfache und sensitive Nachweis beider Marker im Lateral-Flow Format möglich ist. Weitere Schritte werden die Optimierung des Tests hinsichtlich Sensitivität und eine Machbarkeitsstudie mit Patientenproben sein.
Ferner wurde ein weiteres Legionella Markerprotein rekombinant hergestellt.
Vorteile:
PoC-Speicheltest (Point-of-Care Speicheltest) kann die prophylaktische Vergabe von Antibiotika gegen die Legionellose verringern und somit der Entstehung von Resistenzen entgegenwirken.
Unterstützung des Hausarztes bei der Diagnose.
Einfache, anwenderfreundliche Handhabung und nicht-invasive Probenahme. Dadurch ist das Testsystem geeignet auch in Regionen mit wenig entwickelter medizinischer Infrastruktur eingesetzt zu werden.
Schnelle Diagnose, da das Messergebnis bereits nach maximal 30 Minuten vorliegt.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen nun anhand eines in den Zeichnungen näher dargestellten Ausführungsbeispiels erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Zeichnung mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Testsystems;
Fig. 2 eine weitere schematische Zeichnung mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Testsystems;
Fig. 3 schematisch die grundsätzliche Arbeitsweise des Testsystems; Fig. 4 den Einsatz der Markerproteine;
Fig. 5 die Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern;
Fig. 6 den Aufbau eines Lateral-Flow Teststreifens;
Fig. 7 schematisch die Arbeitsweise eine LFT Systems, das beim erfindungsgemäßen
Testsystem verwendet wird;
Fig. 8 die Produktion von Konjugation von Gold und Antikörpern;
Fig. 9 die Stabilität von Antigenen in Speichel;
Fig. 10 die Spezifität von polyklonalem a-MIP und a-PAL;
Fig. 11 ein beispielhaftes Labormuster eines erfindungsgemäßen Lateral-Flow-Tests;
Fig. 12 beispielhafte Testsysteme für MIP umfassend jeweils ein Kontrollsystem;
Fig. 13a beispielhaft die Auswahl von Antikörper-Paarungen für PAL für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Testsystem;
Fig. 13b beispielhaft die Auswahl von Antikörper-Paarungen für PAL für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Testsystem, anhand einer Testmembran;
Fig. 14 beispielhaft die Auswahl von Antikörper-Paarungen für MIP für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Testsystem;
Fig. 15 beispielhafte Bedingungen für die Konjugation von polyklonalen Antikörpern und Nanogold, und
Fig. 16 schematisch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von Legionellen in einer Probe. Fig. 1 zeigt eine schematische Zeichnung mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Testsystems 10. Hier wird Speichel eines möglichen Patienten im Bereich der Mundhöhle oder in sonst geeigneter Weise entnommen.
Insbesondere ist die Probennahme durch ein Probennahmeelement gezeigt.
Generell kann die Entnahme des Speichels durch ein Probennahmeelement, beispielsweise einen Wischer, oder das Testsystem selbst erfolgen.
Bei dem Testsystem 10 handelt es sich hier um einen Lateral- Flow-Test (LFT).
Alternativ kann beispielsweise eine Sputumprobe verwendet werden.
Fig. 2 zeigt weitere schematische Zeichnung mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Testsystems 10. Der Speicheltropfen wird beispielsweise auf einen Speichelkollektor aufgebracht und mit diesem auf den Lateral-Flow-Test LFT aufgebracht.
In anderen Worten, das Testsystem 10 umfasst hier einen Lateral-Flow-Test LFT.
Der Speichelkollektor kann auch als Probennahmeelement bezeichnet werden.
In anderen Worten, das Testsystem 10 umfasst hier eine Probennahmeelement.
Gezeigt ist hier ein Testsystem 10 mit zwei Teststreifen 12.
Generell kann ein Testsystem 10 auch nur einen Teststreifen 12 oder mehr als zwei Teststreifen 12 umfassen.
Fig. 3 zeigt schematisch die grundsätzliche Arbeitsweise des Testsystems 10, das hier als Lateral-Flow-Test (LFT) ausgebildet ist.
Für den hochsensitiven und schnellen PoC-Nachweis wird die bewährte DrugWipe®- Technologie der Securetec Detektions-Systeme AG verwendet. Der Speichel-Schnelltest DrugWipe® wird seit mehr als 20 Jahren weltweit von Polizei und Zoll sehr erfolgreich zum Nachweis von Drogen in Speichel eingesetzt. Diese Technologie wird an den Nachweis von Legionellen im Speichel angepasst.
In anderen Worten, das Testsystem 10 ist ein Testsystem 10 zur Erkennung der Legionärskrankheit.
Das Testsystem 10 ist zur Erkennung der Legionärskrankheit und/oder zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen in Speichel und/oder Sputum eingerichtet.
Der Nachweis kann zumindest teilweise über die Bindung mindestens eines Proteins M, insbesondere eines Proteins der Bakteriengattung Legionella, an einen spezifischen Bindungspartner B erfolgen.
Das Protein M kann auch als Markerprotein bezeichnet werden, vgl. Fig. 4.
Fig. 4 zeigt den Einsatz der Markerproteine.
Drei Markerproteine (M1-M3) wurden anhand von Verbreitung, Immunogenität and Homologie zwischen Legionella pneumophila Stämmen ausgewählt. M1 und M2 wurden als rekombinante Proteine in E. coli erzeugt und im mg-Maßstab aufgereinigt. Sie dienen der Gewinnung von Antikörpern.
M1 kann MIP (macrophage inflammatory protein) sein, insbesondere MIP 1-alpha (macrophage inflammatory protein 1-alpha).
M2 kann PAL sein.
M3 kann FLA sein.
Polyklonale Antikörper a-MIP und a-PAL) haben eine hohe Sensitivität und Spezifität gezeigt.
Sie bilden stabile Konjugate (Immunkonjugate) mit Goldpartikeln N. MIP und PAL sind zudem stabil in Speichel.
Selbiges gilt für FLA.
Zu Versuchszwecken im Rahmen der Erprobung der Erfindung wurden MIP (23mg) und PAL (61mg) produziert mit >95% Reinheit und mit den entsprechenden Antikörpern (d.h. MIP und PAL) nachgewiesen.
Bisherige Ergebnisse:
Markerproteine erfolgreich rekombinant hergestellt (MIP, PAL, FLA);
- Antikörper entwickelt;
Nachweis von 10 ng/ml Markerprotein auf Lateral-Flow Teststreifen (Prototypen).
Fig. 5 zeigt die Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern.
Bislang wurden je 7 Antikörper gegen M1 (MIP) und M2 (PAL) generiert und hinsichtlich Spezifität, Sensitivität und Stabilität selektiert.
Durch Ausschluss von Kreuzreaktionen wird gewährleistet, dass der LegioWipe keine anderen Erreger der Lungenentzündung und keine Mikro-organismen der normalen Mundflora erkennt.
Die sieben Antikörper umfassen jeweils polyklonale und monoklonale Antikörper.
Ferner wurden Antikörper gegen FLA generiert und hinsichtlich Spezifität, Sensitivität und Stabilität selektiert.
Fig. 6 zeigt den Aufbau eines Lateral-Flow Teststreifens 12.
Es wurde M1 (MIP) in Speichelsurrogat nachgewiesen.
Durch Konjugation der Antikörper mit Gold-Nanopartikeln entstehen rot gefärbte „Nanosonden“, welche den immunologischen Nachweis der Legionellen erlauben. Erste Labormuster erreichten eine Sensitivität von ca. 10 ng/ml (440 pM) Markerprotein.
Weitere Labormuster erreichten eine Sensitivität von ca. 2 ng/ml - 20 ng/ml Markerprotein.
Modellversuche zeigten zudem, dass die Markerproteine in humanem Speichel stabil sind, vgl. Fig. 9.
Fig. 7 zeigt schematisch die Arbeitsweise eine LFT Systems, das beim erfindungsgemäßen Testsystem 10 verwendet wird.
Es handelt sich hierbei um ein Lateral-Flow-Test LFT im Sandwich Format.
Eine zu untersuchende Probe (in diesem Beispiel Speichel) wird auf das Testelement 12 aufgetragen (hier angezeigt durch den Wischer, welcher auch als Probennahmeelement bezeichnet werden kann).
Die Probe beginnt nach Zugabe des Laufmittels (hier Puffer) mit der Ausbreitung über das Testelement, 12 aufgrund von Kapillarkräften (Dünnschichtchromatographie).
Die Probe wandert mit der Flüssigkeit zu einem Bereich, wo sich Immunkonjugate (Antikörper B mit Nanogold N) befinden.
In diesem Ausführungsbeispiel liegen die Immunkonjugate zunächst in getrockneter Form vor. Die Flüssigkeit löst die Immunkonjugate vom Testelement 12.
Es wird eine spezifische Bindung jeweils eines Immunkonjugats an jeweils ein nachzuweisendes Protein in der Probe, sofern vorhanden, ermöglicht.
Die Flüssigkeit wandert weiter in den Kapillarbereich, wo in einem kleinen Abschnitt ein Antikörper immobilisiert wurde (kann auch aus Testlinie Antikörper bezeichnet werden), der an einer anderen Stelle auf der Oberfläche des nachzuweisenden Markerproteins bindet als es das Immunkonjugat macht, wodurch das nachzuweisende Markerprotein in diesem Bereich bindet und anreichert wird, während die Flüssigkeit weiterwandert. Durch die Anreicherung des nachzuweisenden Proteins M und des daran gebundenen Immunkonjugats entsteht anhand des gebundenen Immunkonjugats mit dem Nanogold N eine Färbung auf dem Testelement 12, hier in Form einer Linie.
Die Erkennung und/oder der Nachweis des Proteins M erfolgen demnach zumindest teilweise über die Bindung mindestens eines Proteins M an einen spezifischen Bindungspartner B.
Die Flüssigkeit wandert weiter in den Kapillarbereich, wo in einem weiteren kleinen Abschnitt ein weiterer Antikörper immobilisiert wurde (kann auch als Kontrolllinienantikörper bezeichnet werden), der das Immunkonjugat (direkt) bindet und dieses dadurch in diesem Bereich anreichert, während die Flüssigkeit weiterwandert.
Durch die Anreicherung von Immunkonjugaten entsteht über das Nanogold N eine Färbung auf dem Testelement 12, hier in Form einer Linie.
Dies kann auch als Kontrollsystem 16 bezeichnet werden.
Alternativ ist ein Lateral-Flow-Test LFT im kompetitiven Format denkbar.
Denkbar ist auch ein Nachweis mittels eines nicht-kompetitiv aufgebauten LFT mit negativer Anzeige.
Das Testsystem 10 umfasst demnach ein Testelement 12 mit mikrofluidischen Strukturen, insbesondere einen chromatographischen Teststreifen 12.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst der Teststreifen 12 einen ersten Bereich, der zur Absorption von Elutionsmittel (in diesem Beispiel ein Puffer) eingerichtet ist,
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann dieser erste Bereich fehlen.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst der Testreifen 12 einen zweiten Bereich, der für die Aufbringung einer Probe eingerichtet ist. In diesem Ausführungsbeispiel umfasst der Testreifen 12 einen dritten Bereich, der für den Nachweis, vorzugsweise für den optischen Nachweis, des Proteins M eingerichtet ist,
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst der Testreifen 12 einen vierten Bereich, der für die Absorption überschüssigen Elutionsmittels eingerichtet ist (Vlies).
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann dieser vierte Bereich fehlen.
Der Teststreifen kann einen weiteren (fünften) Bereich umfassen, wobei der weitere (fünfte) Bereich zumindest vorübergehend den spezifischen Bindungspartner für das Protein M, insbesondere MIP und/oder PAL und/oder FLA umfasst.
Das Testsystem 10 umfasst zudem ein Gehäuse 14.
Insbesondere ist das Testelement 12 in ein Gehäuse 14 eingebaut.
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann das Gehäuse 14 fehlen.
Nicht gezeigt in Fig. 7 ist, dass ein spezifische Bindungspartner B generell ein monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper affinitätsaufgereinigter Antikörper, ein Antikörperfragment, Peptid, Protein, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischer Liganden umfassen kann.
Nicht gezeigt in Fig. 7 ist auch, dass das Markierungselement N generell mindestens einen Farbstoff, ein Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfassen kann.
Nicht gezeigt in Fig. 7 ist auch, dass der spezifische Bindungspartner B (für das nachzuweisende Protein M) generell in löslicher Form und/oder getrocknet (in getrockneter Form) vorliegt. Der gezeigte Lateral- Flow-Test LFT kann zum Nachweis einer Infektion eines Subjekts mit Legionellen verwendet werden.
Nicht gezeigt in Fig. 7 ist, dass das mindestens eine oder auch mehrere Proteine M MIP und/oder PAL und/ oder FLA umfassen kann.
Nicht gezeigt in Fig. 7 ist auch, dass das Testsystem 10 geeignet ist zumindest teilweise ein Verfahren entsprechend Fig. 17 durchzuführen.
Fig. 8 zeigt die Produktion von Konjugation von Gold N und Antikörpern B.
Insbesondere ist die Produktion von stabilen Immunkonjugaten aus Antikörpern B (Schaf anti- PAL bzw. Schaf anti-MIP) und Nanogold N dargestellt.
Die Produktion von stabilen Immunkonjugaten aus anti-PAL kann analog dazu durchgeführt werden.
Fig. 9 zeigt die Stabilität von Antigenen in Speichel.
Die Stabilität von bakteriellen Antigenen wurde mittels Western Blot untersucht.
Insbesondere wurde die Stabilität von MIP und PAL im Speichel über einen Zeitraum von 10 min bis zu 18h (bei Raumtemperatur RT oder 37°C) untersucht.
Der Western Blot stellt ein Verfahren zum Nachweis von Proteinen, z.B. in einem Proteingemisch, dar. Im ersten Schritt wird das Proteingemisch mittels einer Gel- Elektrophorese in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, Native-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese, usw.) entsprechend der Protein-Größe, -Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt in einzelne Proteinbanden. Die getrennten Proteinbanden werden danach für den Western Blot aus dem Gel auf eine feste Trägermembran (z.B. aus Nitrozellulose, Nylon oder PVDF) transferiert. Dieser Vorgang wird Blotting genannt. Aufgrund Ladungswechselwirkungen bleiben die Proteine an der Membranoberfläche im Muster der elektrophoretischen Auftrennung haften und sind für die Antikörper-Bindung zur Detektion zugänglich. Der Western Blot wurde unter Standardbedingungen durchgeführt. Die Antigene M MIP und PAL (rekombinante Proteine) wurden in Speichel Inkubiert (150 ng/pl).
Die Stabilität von MIP und PAL wurde mit und ohne Zugabe des unspezifischen Proteaseinhibitors PMSF untersucht.
Nach der Inkubation wurden 600ng Protein pro Linie aufgetragen.
Als Kontrollen wurden Speichel (ohne Zugabe von rekombinantem Protein, Negativkontrolle) und rekombinantes Protein (ng, Positivkontrolle) aufgetragen.
Ein Marker (Molekulargewichtsmarker) (wurde verwendet um die Markerproteine MIP und PAL eindeutig identifizieren zu können.
Die Antigene M sind in Speichel sowohl mit als auch ohne Proteaseinhibitor stabil, insbesondere auch bei 37°C.
Nicht gezeigt in Fig. 9 ist, dass die Stabilität von FLA im Speichel analog gemessen werden kann.
Fig. 10 zeigt die Spezifität von polyklonalem a-MIP und a-PAL.
Die Spezifität von polyklonalem a-MIP (anti-MIP) und a-PAL (anti-PAL) wurde mittels Western Blot (vgl. Fig. 9) untersucht.
Untersucht wurde insbesondere die Fähigkeit von a-MIP und a-PAL unterschiedliche Vertreter der oralen Mikroflora ( Haemophilus parainfluenzae, Staphylococcus epidermidis, Rothia mucilaginosa, Neisseria perflava, Streptocccus mitis, Streptococcus salvarius, Legionalla pneumophila) zu detektieren.
Die Erreger wurden als Proben in die Western Blot Analyse eingesetzt.
Ein Marker (Molekulargewichtsmarker) wurde verwendet um die Markerproteine M MIP und PAL eindeutig anhand ihrer Größe identifizieren zu können. Als Positivkontrollen wurden die rekombinanten Proteine (Antigene) MIP bzw. PAL eingesetzt.
Als weitere Kontrolle wurde für a -PAL rekombinantes MIP und für a-MIP rekombinantes PAL eingesetzt.
Beide Antikörper zeigten keine oder nur eine minimale, zu vernachlässigende Kreuzreaktivität.
Nicht gezeigt in Fig. 10 ist, dass die Analyse der Spezifität von polyklonalem a-FLA analog stattfinden kann.
Fig. 11 zeigt ein beispielhaftes Labormuster eines erfindungsgemäßen Lateral-Flow-Tests LFT.
Gezeigt ist die Ermittlung der unteren Nachweisgrenze einfacher Lateral Flow Teststreifen LFT für MIP (Vierfachbestimmung).
Das Prinzip des Tests beruht im Wesentlichen auf dem in Fig. 7 beschriebenen System (ohne Kontrollsystem 16 und Probennahmeelement).
Ein rötlicher Fleck auf der Membran zeigt den spezifischen Nachweis des Markerproteins M MIP an.
Als Probe wurde Speichelsurrogat eingesetzt.
Die Immunkonjugate werden in diesem Fall als Punkte, nicht als Streifen angezeigt. Die empfindlichsten Teststreifen 12 erreichten eine Sensitivität von ca. 2 ng/ml - 20 ng/ml (440 pM) pro Markerprotein M in Speichelsurrogat.
In einem vergleichbaren Test wurde die Nachweisgrenze von PAL ermittelt. Diese liegt bei weniger als 2 ng/ml in Speichelsurrogat.
Fig. 12 zeigt Testsysteme 10 für MIP umfassend jeweils ein Kontrollsystem 16.
Die Testsysteme 10 funktionieren im Wesentlichen gemäß der Beschreibung von Fig. 7. Gezeigt sind vier MIP-Entwicklungsmuster, jeweils nach Testende (ca. 20 Minuten).
Die Testsysteme 10 umfassen jeweils ein internes Kontroll System 16. Dieses bildet eine zusätzliche Bande/ Linie aus, wenn der Test (unabhängig vom Testergebnis) korrekt durchgeführt und korrekt abgelaufen ist.
Von links nach rechts sind Testsysteme 10 für folgende Proben gezeigt: humaner Speichel als Negativ-Probe, 5x106 Legionella pneumophila in Speichel, 5x105 Legionella pneumophila in Speichel, 5x104 Legionella pneumophila in Speichel.
Die Übertragung der Probe vom Probennahmeelement auf das Testelement 12 sowie die Chromatographie funktionierten ordnungsgemäß.
Das Kontrollsystem 16 lieferte nach 10 Minuten ein Signal (obere der beiden Linien).
Die untere Nachweisgrenze von MIP liegt bei ca. 1 x 105 intakten Legionella pneumophila Bakterien in humanem Speichel pro Testelement 12.
Bei allen Versuchen ist eine (rote) Kontrolllinie, bei den Positiv- Proben (größer/gleich Nachweisgrenze zusätzlich eine (rote) Testlinie zu erkennen.
Das Muster zeigt kein falsch-positives Signal in der Negativprobe (auch nach verlängerter Auslesezeit von bis zu zwei Stunden, nicht gezeigt).
Nicht gezeigt in Fig. 12 ist, dass in analogen Tests vergleichbare Ergebnisse für das Markerprotein M PAL oder FLA erhalten wurden.
Die untere Nachweisgrenze für PAL liegt bei ca. 1 x 107 intakten Legionella pneumophila Bakterien in humanem Speichel pro Teststreifen,
Fig. 13a und Fig. 13b zeigen beispielhaft die Auswahl von Antikörper-Paarungen für PAL für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Testsystem 10. Ziel ist es, aus den Antikörpern bzw. Immunkonjugaten die Paare auszuwählen, mit denen ein Sandwich Assay für den Lateral Flow Test aufgebaut werden kann (sog. „matching pairs“) (Sandwich Assay, vgl. Fig. 7).
Alle verfügbaren Kombinationen (für PAL) von einem Testlinie Antikörper AK und einem Antikörper Nanogold-Konjugat (Testgold AK) wurden auf der Membran () aufgebaut und die Bindung an die Antigene (PAL) untersucht.
Es wurden dispensierte Testgolde verwendet und die Testlinien-AKs wurden gespottet.
Es wurden 10 ng/ml PAL in gepoolten Speichel als Proben verwendet.
Für den Analyten PAL deutet sich an, dass es (mindestens) zwei passende Antikörper- Paarungen gibt:
• Testgold AK #4 mit Testlinie AK #1 und umgekehrt Testgold AK #1 mit Testlinie AK #4
• Testgold AK #6 mit Testlinie AK#1 und umgekehrt Testgold AK#1 mit Testlinie AK #6
+++ steht für starke Bindung, ++ für mäßige Bindung, + für schwache Bindung, NSB steht für nicht spezifische Bindung (=falsch positiv, bedeutet AK konnte nicht getestet werden (vgl. Fig. 13a).
Fig. 13b zeigt beispielhaft eine entsprechende Membran für Testlinie AK#1 mit Testgold AK #4 und #6; alle Versuche in doppelter Ausführung, ist die Negativkontrolle (10 pl Wasser) „+“ ist die Positivprobe mit PAL (10 pl mit c = 100 ng/ml)
Testgold AK #1 ist mit Nanogold aggregiert. Daher ist es notwendig, ein stabiles Testgold mit diesem Antikörper zu finden, um sich alle Kombinationen offen zu halten
Nicht gezeigt in Fig. 13a oder 13b ist, dass unter Verwendung von Testgold Antikörpern (Immunkonjugaten) mit Gold-Nanopartikeln von anderen Herstellern weitere geeignete Antikörperpaarungen gefunden werden konnten. Fig. 14 zeigt beispielhaft die Auswahl von Antikörper-Paarungen für MIP für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Testsystem 10.
Das Auswahlverfahren für MIP ist in den Grundzügen mit dem Auswahlverfahren für PAL, vgl. Fig. 13a und 13b, identisch.
Demnach ist das Ziel, aus Antikörpern bzw. Konjugaten die Paare auszuwählen, mit denen ein Sandwich Assay aufgebaut werden kann (sog. „matching pairs“). Alle verfügbaren MIP- Kombinationen wurden in Form von Spot-Tests aufgebaut. Dies wurde auf verschiedenen Membranen in Verbindung mit verschiedenen RP-Systemen gemacht.
Die für den Sandwich-Assay am besten geeigneten MIP-Paarungen sind:
• Testgold (TG) AK #1 mit Testlinie AK #4 und umgekehrt Testgold AK #4 mit Testlinie AK #1
• Testgold AK#6 mit Testlinie AK #4 und umgekehrt Testgold AK +#4 mit Testlinie AK #6
• Ferner: Testgold AK#4 mit Testlinie AK #2 und umgekehrt Testgold AK #2* mit Testlinie AK #4
Die Paarung AK#5/AK#6 kann ebenso eingesetzt werden, falls mit den obigen Paarungen wider Erwarten kein empfindlicher und stabiler Test aufgebaut werden kann.
Fig. 15 zeigt_beispielhafte Bedingungen für die Konjugation von polyklonalen Antikörpern und Nanogold.
Aus polyklonalem Anti- MIP- bzw. Anti-PAL-Antikörper und Nanogold wurden mehrere Bedingungen gefunden, unter welchen mehrere stabile Immunkonjugate hergestellt werden können (Puffer, pH-Wert, Nanogold Hersteller, Beladung).
Nicht gezeigt in Fig. 15 ist, dass_ein kompetitiver wie auch ein Sandwich-Test grundsätzlich mit den polyklonalen AK bzw. entsprechenden Immunkonjugaten funktionieren.
Fig. 16 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von Legionellen in einer Probe. Das Verfahren kann zumindest teilweise mit einem erfindungsgemäßen Testsystem 10, beispielsweise wie in Fig. 7 dargestellt, durchgeführt werden.
Das Verfahren umfasst mindestens die Schritte S1-S3.
In einem ersten Schritt S1 wird ein Testsystem 10 bereitgestellt.
Das Testsystem 10 umfasst ein Testelement 12.
In einem zweiten Schritt S2 wird eine Probe auf das Testelement 12 aufgetragen.
In einem dritten Schritt S3 wird das Vorhandensein mindestens Proteins M, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA in der Probe nachgewiesen.
Das Testsystem 10 umfasst mindestens einen spezifischen Bindungspartner B, an welchen das mindestens eine Protein M bindet.
Der Nachweis erfolgt zumindest teilweise über die Bindung des mindestens einen Proteins M, insbesondere MIP, PAL und/oder FLA, an den spezifischen Bindungspartner B.
Ferner kann das Verfahren den Schritt der Bestimmung der Menge des mindestens einen Proteins umfassen.
Es ist außerdem möglich, dass das Verfahren ferner den Schritt des Lysierens der Probe umfasst.
Das Lysieren kann beispielsweise mit Detergenzien (z.B. Triton X-100), SDS und/oder Tween) oder mittels Ultraschall stattfinden.
Es ist zudem möglich, dass das Verfahren ferner den Schritt des Verflüssigens der Probe umfasst.
Das Verflüssigen kann zumindest teilweise durch Detergenzien und/oder Liquilzer erfolgen. Ziel der Verflüssigung kann es sein, dass die Probe besser über einen Lateral-Flow-Test chromatographiert.
Die Probe kann beispielsweise Speichel oder Sputum sein.
Die untere Nachweisgrenze von MIP liegt bei ca. 1 x 105 intakten Legionella pneumophila Bakterien in humanem Speichel pro Testelement 12.
Die untere Nachweisgrenze für PAL liegt bei ca. 1 x 107 intakten Legionella pneumophila Bakterien in humanem Speichel pro Testelement 12.
Bezuqszeichen
10 T estsystem
12 Testelement/ Teststreifen
14 Gehäuse
16 Kontrollsystem
AK Antikörper
B spezifischer Bindungspartner für Protein M
M Protein/ Antigen
N Markierungselement
LFT Lateral Flow Test/ Lateral Flow Assay
TG Testgold/ Immunkonjugat Antikörper und Nanogold
TL Testlinien Antikörper
51 Schritt 1
52 Schritt 2
53 Schritt 3

Claims

Ansprüche
1. Testsystem (10) zur Erkennung der Legionärskrankheit.
2. Testsystem (10) zum Nachweis einer Infektion eines Subjekts mit Legionellen.
3. Testsystem (10) nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem (10) ein Lateral-Flow-Test (LFT) ist oder umfasst.
4. Testsystem (10) nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem (10) zur Erkennung der Legionärskrankheit und/oder zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen in Speichel oder Sputum eingerichtet ist.
5. Testsystem (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennung und/oder der Nachweis zumindest teilweise über die Bindung mindestens eines Proteins (M), insbesondere eines Proteins der Bakteriengattung Legionella, an einen spezifischen Bindungspartner (B) erfolgt.
6. Testsystem (10) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein (M) ein Protein der Art Legionella pneumophila, Legionella micadei, Legionella. bozmanii, Legionella dumoffii und/oder Legionella longbeachae ist.
7. Testsystem (10) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine oder auch mehrere Proteine (M) MIP und/oder PAL und/ oder FLA umfasst.
8. Testsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem (10) umfasst: a) ein Testelement (12) mit mikrofluidischen Strukturen, vorzugsweise einen chromatographischen Teststreifen, umfassend:
(i) gegebenenfalls einen ersten Bereich, der zur Absorption von Elutionsmittel eingerichtet ist,
(ii) einen zweiten Bereich, der für die Aufbringung einer Probe eingerichtet ist, (iii) einen dritten Bereich, der für den Nachweis, vorzugsweise für den optischen Nachweis, des Proteins (M), insbesondere von MIP, PAL und/oder FLA, eingerichtet ist,
(iv) optional einen vierten Bereich, der für die Absorption überschüssigen Elutionsmittels eingerichtet ist, und b) wahlweise ein Gehäuse (14).
9. Testsystem (10) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Testelement (10) einen weiteren Bereich umfasst, wobei der weitere Bereich zumindest vorübergehend den spezifischen Bindungspartner (B) für das Protein (M), insbesondere MIP, PAL und/oder FLA umfasst.
10. Testsystem (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem (10) ferner ein Kontroll System (16), insbesondere ein optisches Kontrollsystem (16) umfasst.
11. Testsystem nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem ferner ein Probennahmeelement umfasst, welches für die Aufnahme einer das mindestens eine Protein (M) enthaltenden Probe eingerichtet ist.
12. Verwendung eines Testsystems (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis einer Infektion mit Legionellen.
13. Verfahren zum Nachweis von Legionellen in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Testsystems (10),
(b) Aufbringen der Probe auf ein Testelement (12), und
(c) Nachweis des Vorhandenseins mindestens eines Proteins (M), insbesondere MIP, PAL und/oder FLA in der Probe, wobei das Testsystem (10) mindestens einen spezifischen Bindungspartner (B) umfasst, an welchen das mindestens eine Protein (M), insbesondere MIP, PAL und/oder FLA bindet, wobei der Nachweis zumindest teilweise über die Bindung des mindestens einen Proteins (M), insbesondere MIP, PAL und/oder FLA, an den spezifischen Bindungspartner (B) erfolgt.
14. Testsystem (10) nach einem der Ansprüche 8-11 oder Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Speichelprobe oder Sputum umfasst.
15. Testsystem (10) nach einem der Ansprüche 5-11 oder 14 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische Bindungspartner (B) einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper affinitätsaufgereinigten Antikörper, ein Antikörperfragment, Peptid, Protein, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Liganden umfasst, wobei der spezifische Bindungspartner mit einem Markierungselement verbunden ist.
16. Testsystem (10) oder Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungselement (N) mindestens einen Farbstoff, ein Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
17. Testsystem (10) nach einem der Ansprüche 5 bis 11 oder 14 bis 16 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische Bindungspartner (B) in löslicher Form und/oder getrocknet vorliegt.
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