EP3999075A1 - Sequences siarn ciblant l'expression des genes jak1 ou jak3 humains pour une utilisation therapeutique - Google Patents
Sequences siarn ciblant l'expression des genes jak1 ou jak3 humains pour une utilisation therapeutiqueInfo
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- EP3999075A1 EP3999075A1 EP20740302.3A EP20740302A EP3999075A1 EP 3999075 A1 EP3999075 A1 EP 3999075A1 EP 20740302 A EP20740302 A EP 20740302A EP 3999075 A1 EP3999075 A1 EP 3999075A1
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Definitions
- the sense strand consists of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 6; or
- the sense strand consists of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7 and the antisense strand consists of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 8;
- the DNA plasmids for the expression of dsRNA are typically introduced into the target cells by transfection according to the techniques and with the aid of vehicles well known to those skilled in the art.
- the efficiency of transfection can be monitored, for example, by using a fluorescent label such as GFP as a reporter gene.
- step (a) at. the introduction into said cell of the dsRNA according to the invention; and B. maintaining the cell produced in step (a) for a time sufficient to cause degradation of the mRNA of a JAK1 or JAK3 gene, thereby inhibiting the expression of JAK1 or JAK3 in the cell.
- PC3 cells overexpressing JAK3-GFP were finally transfected with different concentrations of siRNA (from 0.5 pM to 12.5 pM) using Lipofectamine RNAimax for 48 h. cells were lysed using standard lysis buffer. The protein lysates were then analyzed by Western blotting for the expression of JAK3 or JAK1 and GAPDH.
- Figure 8 shows the results of a Western blot experiment representative of 3 independent experiments.
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Abstract
L'invention concerne un acide ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens dans lequel : le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2; ou le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4; ou le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6; ou le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8. L'invention concerne également l'ARNdb selon l'invention pour son utilisation comme médicament.
Description
TITRE : SEQUENCES SIARN CIBLANT L'EXPRESSION DES GENES JAK1 OU JAK3 HUMAINS POUR UNE UTILISATION THERAPEUTIQUE
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne les séquences nucléotidiques de petits ARN interférents spécifiques des gènes JAK1 et JAK3 humains, respectivement. Ces séquences ont été sélectionnées afin de présenter le moins d’effets indésirables possibles tout en maximisant leur potentiel d’inhibition fonctionnelle de l’expression du gène JAK1 ou JAK3, pour permettre une utilisation thérapeutique chez l’homme.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
L’ARN interférence a été décrite pour la première fois en 1998 par Andrew Fire et Craig Mello. Ce processus a lieu lorsqu’un ARN double brin présente une séquence nucléotidique complémentaire d’un ARNm. L’ARN double brin active alors la dégradation de l’ARNm dont il est complémentaire, diminuant ainsi l’expression du gène correspondant. Dans le détail, les ARN double brins présents dans une cellule sont tout d’abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l’« éminceuse ». Celle-ci clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les petits ARN interférents (pARNi) à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-induced silencing complex). Un des brins du pARNi, dit « passager », est éliminé tandis que l’autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm (ARN messagers, ARN codant transmettant le message du gène dans le cytoplasme) possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le pARNi et l’ARNm cible est parfaite, le complexe RISC clive l’ARNm cible qui est alors dégradé et n’est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage.
Les petits ARN interférents, « siARN », sont des duplexes synthétiques de 21 nucléotides qui présentent notamment en position 2 à 8 du brin guide dans le sens 5’ - 3’ une séquence « graine » particulièrement importante pour assurer leur spécificité. Ces séquences respectent certaines règles de thermodynamique telles que la présence d’une guanine ou d’une cytosine en position 1 du brin passager, une adénine ou un uracile en position 1 du brin guide, d’une composition de la séquence « graine » du brin guide avec un taux minimal de guanine / cytosine, d’un équilibre guanine / cytosine pour les nucléotides 8 à 16 du brin guide.
En 2018, le siARN « Patisiran », commercialisé par la société Alnylam a été approuvé pour une mise sur le marché. Ce siARN est le premier siARN thérapeutique approuvé pour
une utilisation chez l’homme. Les concentrations in vitro classiquement utilisées sur lignées cellulaires sont de 10 à 20 nM.
La famille JAK (Janus kinase) comprend quatre tyrosine kinases non réceptrices, JAK1 , JAK2, JAK3 et Tyk2, qui jouent un rôle essentiel dans la transduction du signal induite par les cytokines et les facteurs de croissance. Les kinases JAK phosphorylées se lient et activent diverses protéines transducteur de signal et activateur de transcription (STAT). Ces protéines STAT se dimérisent et migrent ensuite vers le noyau où elles agissent à la fois comme molécules de signalisation et facteurs de transcription et se lient finalement à des séquences d’ADN spécifiques présentes dans les promoteurs de gènes sensibles aux cytokines. Diverses immunodéficiences et maladies auto-immunes telles que les allergies, l'asthme, l'alopécie areata, le rejet d'allogreffe (allogreffe), l'arthrite rhumatoïde, la sclérose latérale amyotrophique et la sclérose en plaques, ainsi que des cancers solides et hématologiques résultent d'une perturbation de la signalisation dans la voie JAK/STAT.
RESUME DE L’INVENTION
L’invention concerne un acide ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8.
L’invention concerne également l’ARNdb selon l’invention pour son utilisation comme médicament.
L’invention concerne en particulier l’ARNdb selon l’invention pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK).
L’invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant au moins un ARNdb selon l’invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L’invention concerne aussi une méthode in vitro pour inhiber l’expression de la Janus kinase 1 (JAK1 ) ou la Janus kinase 3 (JAK3) dans une cellule, la méthode comprenant : a. l’introduction dans ladite cellule humaine de l’ARNdb selon l’invention ; et
b. le maintien de la cellule produite à l’étape (a) pendant un temps suffisant pour obtenir la dégradation de l’ARNm d’un gène JAK1 ou JAK3, inhibant ainsi l’expression de JAK1 ou JAK3 dans la cellule.
DESCRIPTION DETAILLEE
Les inventeurs ont généré plusieurs séquences de siARN respectant les grands principes de l’interférence à ARN. Les siARN selon l’invention ont ainsi été conçus de manière à ce que :
i. Le brin guide du siARN présente une homologie de séquence de 50% à 100% avec l’ARNm d’intérêt (JAK1 ou JAK3 humain) ;
ii. Les motifs nucléotidiques connus d’activation des récepteurs Toll-like (TLR) soient éliminés ;
iii. La composition GC / AU en 3’ et en 5’ soit optimisée afin de favoriser la prise en charge du brin guide dans le complexe RISC par rapport au brin passager ;
iv. Les homologies de séquence potentielles entre la région « graine » du brin guide du siRNA et les séquences ARNm 3’UTR de l’ensemble du génome soient réduites au maximum, afin de minimiser le risque d’obtenir des effets de régulations géniques de type microARN ;
v. De préférence, un phosphate soit ajouté à l’extrémité 5’ du brin guide du siARN, afin de favoriser la prise en charge du brin guide par le complexe RISC.
Une stratégie de criblage a ensuite été mise au point consistant à comparer en parallèle différentes séquences siARN, basée sur leur efficacité fonctionnelle d’inhibition de l’expression génique, leur spécificité (pas de modulation directe d’autres gènes), la réduction de leurs effets indésirables (effets off-target, effets immunogènes, effets non spécifiques potentiels). Les inventeurs ont ainsi sélectionné deux séquences de siARN chacune capables de diminuer spécifiquement l’expression du gène et donc de la protéine JAK1 ou JAK3 humaine, sans présenter d’effets indésirables (en particulier pas d’effet sur l’expression de JAK2), dont le point commun est le potentiel thérapeutique, pour traiter une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases, notamment les maladies inflammatoires (dont les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) ou certains cancers.
Définitions
Le terme « ARN double brin » ou « ARNdb » désigne un complexe de molécules d’acide ribonucléiques ayant une structure en duplex comprenant deux brins d’acides nucléiques anti-parallèles, essentiellement complémentaires. En général, chaque brin est
constitué en majorité ou en totalité de ribonucléotides, mais l’un ou les deux brins peuvent inclure au moins une base non ribonucléotidique, par exemple un désoxyribonucléotide et/ou un nucléotide modifié, par exemple par modification chimique. Les deux brins formant la structure en duplex peuvent être des parties différentes d’une molécule d’ARN plus grande ou peuvent être des molécules d’ARN séparées (siARN). Lorsque les deux brins sont des parties différentes d’une molécule d’ARN plus grande, l’extrémité 3’ d’un brin peut être connectée par une chaîne nucléotidique à l’extrémité 5’ de l’autre brin pour former une structure en épingle à cheveux (shARN). Alternativement les deux brins peuvent être connectés un moyen de liaison (« linker ») autre qu’une chaîne nucléotidique.
Le « brin antisens » désigne le brin de l’ARNdb qui inclut une région de complémentarité qui est essentiellement complémentaire d’une séquence cible, selon l’invention une séquence cible sur un ARNm de JAK1 ou JAK3.
Le « brin sens » désigne le brin de ARNdb qui inclut une région qui est essentiellement complémentaire d’une région du brin antisens.
Deux séquences dont les bases s’apparient sur toute leur longueur sont totalement complémentaires. Une séquence peut également être essentiellement complémentaire d’une deuxième séquence lorsque les deux séquences s’hybrident et sont totalement complémentaires, ou sont totalement complémentaires sur une partie de leur longueur (par exemple dans le cas d’un complexe double brin avec débordement), ou lorsqu’elles comportent au plus 4, 3, 2, ou 1 mésappariement de base.
Dans l'ensemble de la présente demande, le terme "comprenant" doit être interprété comme englobant toutes les caractéristiques spécifiquement mentionnées, ainsi que des caractéristiques facultatives, additionnelles, non spécifiées. Tel qu'utilisé ici, l'utilisation du terme "comprenant" décrit également le mode de réalisation dans lequel aucune caractéristique autre que les caractéristiques spécifiquement mentionnées n'est présente (c'est-à-dire "consistant en").
Acide ribonucléiaue double brin
Comme il sera décrit plus en détail ci-après, des molécules d’acide ribonucléique (ARN) double brin (db) sont fournies pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT, en particulier chez un être humain ayant une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK), dans lesquelles l’ARNdb comprend un brin antisens qui est complémentaire à un ARNm résultant de la transcription d’un gène JAK1 ou JAK3.
Selon un mode de réalisation, les deux brins de l’ARNdb sont des molécules d’ARN séparées (siARN). Chaque brin de l’ARNdb comprend 21 nucléotides, et comprend de
préférence au plus 24, 23, ou 22 nucléotides. Les deux brins de l’ARNdb sont de longueurs identiques ou différentes, de préférence de même longueur.
De préférence, chaque brin de l’ARNdb comporte un débordement en 3’ de 2 nucléotides ou plus, de préférence de 2 nucléotides.
Selon un mode de réalisation, les deux brins de l’ARNdb sont des parties d’une molécule d’ARN plus grande et constituent par exemple la partie tige d’une structure en épingle à cheveux. Selon ce mode de réalisation, l’ARNdb comprend de préférence au plus 60 nucléotides, par exemple entre 55 et 60 nucléotides au total.
Selon un mode de réalisation l’ARNdb comprend ou consiste en un brin sens et un brin antisens, dans lequel :
le brin sens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 ;
et dans lequel le nucléotide à l’extrémité 5’ du brin antisens est phosphorylé.
Selon un mode de réalisation, l’ARNdb est un ARNdb qui réduit l’expression du gène Janus kinase 3 (JAK3) humain et dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 (HJ3D41 ), ou le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 (HMJ3D1 ). De préférence, dans ledit ARNdb, le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 (HJ3D41 ). L’ARNdb qui comprend le brin sens comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 (HMJ3D1 ) est en outre spécifique du gène JAK3 murin et est capable de réduire l’expression de ce gène.
Selon un mode de réalisation, l’ARNdb est un ARNdb qui réduit l’expression du gène Janus kinase 1 (JAK1 ) humain et dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 (HJ1 D2), ou le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 (HJ1 D8). De préférence, dans ledit ARNdb, le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 (HJ1 D8).
L’ARNdb peut être modifié chimiquement, en particulier pour augmenter sa stabilité ou augmenter la prise en charge du brin guide par le complexe RISC. Des exemples de molécules d’ARNdb modifiée incluent des ARNdb contenant des modifications du squelette ou des liaisons internucléotidiques non naturelles, ou contenant des bases nucléotidiques modifiées.
De manière préférentielle, l’ARNdb est un ARNdb dans lequel le nucléotide à l’extrémité 5’ du brin antisens est phosphorylé.
L’ARNdb selon l’invention peut aussi être modifié chimiquement pour former un conjugué, c’est à dire lier de manière covalente un ou plusieurs groupements qui augmentent l’activité, la distribution cellulaire ou l’incorporation cellulaire de l’ARNdb.
L’ARNdb peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple par synthèse chimique ou par génie génétique. Dans ce dernier cas, les ARNdb sont exprimés à partir d’unités transcriptionnelles insérées dans un ou des vecteurs à ADN ou ARN. Ces transgènes peuvent être introduits sous forme de construction linéaire, de plasmide circulaire, ou de vecteur viral puis incorporés dans une cellule hôte où ils sont intégrés au génome cellulaire hôte, ou bien présent sous forme de plasmide extra chromosomique. N’importe quel vecteur viral capable d’accepter les séquences codant l’ARNdb peut être utilisé, par exemple des vecteurs dérivés d’adénovirus (AV), des virus associés à l’adénovirus (AA V), des rétrovirus (par exemple lentivirus, rhabdovirus), herpes virus, etc. Le tropisme du virus peut être modifié par pseudotypage du vecteur par exemple avec des protéines d’enveloppe ou d’autres antigènes de surface provenant d’autres virus.
Les deux brins du ARNdb peuvent être transcrits sous le contrôle de promoteurs à partir de deux vecteurs d’expression distincts qui sont co-transfectés dans une cellule hôte, ou bien sous le contrôle de promoteurs qui sont chacun sur un même vecteur d’expression. L’ARNdb peut également être exprimé sous forme de deux séquences répétées inversées jointes par une séquence polynucléotidique de liaison pour former une structure en tige et boucle (petit ARN en épingle à cheveux, ou shARN).
Les promoteurs contrôlant l’expression de l’ARNdb présents dans un plasmide ADN ou un vecteur viral peuvent être un promoteur d’ARN polymérase I, Il ou III (par exemple U6) eucaryote ou un promoteur procaryote (par exemple le promoteur T7).
Les plasmides ADN pour l’expression d’ARNdb sont typiquement introduits dans les cellules cibles par transfection selon les techniques et à l’aide de véhicules bien connus de l’homme du métier. L’efficacité de transfection peut être contrôlée par exemple en utilisant un marqueur fluorescent tel que la GFP en tant que gène rapporteur.
Indications médicales
Un ARNdb selon l’invention est utilisable comme médicament, en thérapie, en particulier en thérapie humaine, du fait des propriétés i-v listées ci-dessus ayant guidé sa conception et de la sélection qui a été opérée par les inventeurs parmi les 43 siRNA initialement générés pour bloquer l’expression du gène JAK1 ou JAK3 humain et/ou murin.
L’ARNdb est plus particulièrement indiqué pour le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK), en particulier JAK1 et/ou JAK3.
Une méthode de traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK) est ainsi proposée, dans laquelle une quantité thérapeutiquement efficace d’au moins un ARNdb selon l’invention est administré à un sujet souffrant d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation JAK, en particulier JAK1 et/ou JAK3
Le sujet est un mammifère, de préférence un primate, et de manière préférentielle un sujet humain. Le sujet peut également être un rongeur, de préférence une souris.
Les maladies associées à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK), en particulier de JAK1 et/ou JAK3, incluent en particulier les maladies inflammatoires à médiation immunitaire, dont notamment les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (maladie de Crohn et rectocolite hémorragique), la polyarthrite rhumatoïde, l’alopécie areata, l’uvéite, la dermatite atopique, la spondylarthrite ankylosante, le psoriasis, lupus érythémateux, néphrite lupique, la myélofibrose, le rejet de greffe et la maladie du greffon contre l’hôte ; et les cancers, notamment les leucémies (en particulier leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), et leucémie aiguë myéloblastique (LAM)) et les cancers à tumeurs solides. De manière préférentielle, un ARNdb selon l’invention est indiqué pour le traitement des maladies inflammatoires à médiation immunitaire, dont notamment les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de la myélofibrose, du rejet de greffe, et des cancers.
Pour son utilisation thérapeutique, l’ARNdb est généralement formulé dans une composition pharmaceutique qui comprend au moins un ARNdb selon l’invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend au moins un ARNdb inhibiteur de JAK 1 selon l’invention.
Selon un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend au moins un ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention.
Selon encore un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend au moins un ARNdb inhibiteur de JAK 1 et au moins un ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention, par exemple :
- un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 (HJ3D41 ), et (i) un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 (HJ1 D8) ou (ii) un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 (HJ1 D2) ; ou
- un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 (HMJ3D1 ), et (i) un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 (HJ1 D8) ou (ii) un ARNdb dans lequel le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 (HJ1 D2).
La composition pharmaceutique selon l’invention peut également comprendre au moins un ARNdb selon l’invention, au moins un autre principe actif, par exemple un agent anticancéreux, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon encore un autre mode de réalisation, l’invention concerne un ARNdb inhibiteur de JAK 1 selon l’invention pour son utilisation comme médicament, ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK), en combinaison avec un ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention ou un autre principe actif, par exemple un agent anticancéreux. Selon ce mode de réalisation, l’ARNdb inhibiteur de JAK 1 , et l’ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention ou l’autre principe actif, peuvent être formulés dans une même composition pharmaceutique ou bien de manière séparée, dans des compositions pharmaceutiques distinctes. Ils peuvent être administrés simultanément ou séparément, par exemple de manière espacée dans le temps. Selon ce mode de réalisation, l’ARNdb inhibiteur de JAK 1 est administré à un sujet qui traité un ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention ou un autre principe actif.
Selon encore un autre mode de réalisation, l’invention concerne un ARNdb inhibiteur de JAK 3 selon l’invention pour son utilisation comme médicament, ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation des Janus kinases (JAK), en combinaison avec
un ARNdb inhibiteur de JAK 1 selon l’invention ou un autre principe actif, par exemple un agent anticancéreux. Selon ce mode de réalisation, l’ARNdb inhibiteur de JAK 3, et l’ARNdb inhibiteur de JAK 1 selon l’invention ou l’autre principe actif, peuvent être formulés dans une même composition pharmaceutique ou bien de manière séparée, dans des compositions pharmaceutiques distinctes. Ils peuvent être administrés simultanément ou séparément, par exemple de manière espacée dans le temps. Selon ce mode de réalisation, l’ARNdb inhibiteur de JAK 3 est administré à un sujet qui traité un ARNdb inhibiteur de JAK 1 selon l’invention ou un autre principe actif.
La composition pharmaceutique est formulée en fonction de sa voie d’administration qui peut être par exemple une administration locale ou une administration systémique, telle que la voie parentérale, ou la voie intraveineuse (iv).
La composition pharmaceutique est administrée avec un dosage suffisant en ARNdb pour induire une inhibition de l’expression de JAK1 et/ou JAK3.
La détermination de la voie d’administration et du dosage adapté en fonction du sujet est à la portée de l’homme du métier.
Méthode pour inhiber JAK1 ou JAK3 dans une cellule
La demande décrit également une méthode, in vivo ou in vitro, pour inhiber l’expression de la Janus kinase 1 (JAK1 ) ou la Janus kinase 3 (JAK3) dans une cellule, la méthode comprenant :
a. l’introduction dans ladite cellule de l’ARNdb selon l’invention ; et b. le maintien de la cellule produite à l’étape (a) pendant un temps suffisant pour obtenir la dégradation de l’ARNm d’un gène JAK1 ou JAK3, inhibant ainsi l’expression de JAK1 ou JAK3 dans la cellule.
La cellule est de préférence une cellule humaine ou murine.
Selon un mode de réalisation, à l’étape a, l’ARNdb est mis en contact avec ladite cellule à une concentration supérieure ou égale à 5 pM, de préférence de 5 pM à 10 nM, ou encore de 5 pM à 1 nM, ou encore de 5 pM à 100 pM, ou encore de 5 pM à 50 pM de préférence encore de 5 pM à 25 pM.
Un réactif de transfection (par exemple des lipides cationiques, tels que la Lipofectamine) est typiquement utilisé pour faciliter la transfection de la cellule par l’ARNdb.
Lorsque la méthode est mise en oeuvre in vitro, à l’étape b) la cellule est maintenue dans un milieu de culture approprié à sa survie et/ou propagation. Le choix d’un tel milieu est à la portée de l’homme du métier.
La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.
FIGURES
La Figure 1 représente la structure typique d’un si AFIN selon l’invention, comportant un débordement en 3’, de 2 nucléotides non appariés, et de préférence un groupement phosphate à l’extrémité 5’ du brin guide. Le brin passage correspond au brin sens, et le brin guide au bris antisens.
La Figure 2 représente les régions d’hybridation, sur la partie codante du gène JAK1, des différents si AFIN inhibiteurs de JAK1 testés.
La Figure 3 représente les régions d’hybridation, sur la partie codante du gène JAK3, des différents siAFIN inhibiteurs de JAK3 testés
La Figure 4 représente les résultats de 3 expériences indépendantes de mesure du niveau d’expression génique JAK1, JAK2, JAK3 ou TYK2 dans des cellules Caco-2 transfectées avec 10 nM de siAFIN (ciblant JAK1).
La Figure 5 représente les résultats de 3 expériences indépendantes de mesure du niveau d’expression génique JAK1, JAK2, JAK3 ou TYK2 dans des cellules Caco-2 transfectées avec 10 nM de siAFIN (ciblant JAK3).
La Figure 6 représente les résultats de quantification de l’expression de JAK1 dans des cellules PC3 transfectées avec 12,5 pM de siAFIN.
La Figure 7 représente les résultats de quantification de l’expression de JAK3 dans des cellules PC3 surexprimant de façon stable JAK3 transfectées avec 1 nM de siAFIN.
La Figure 8 représente l’analyse de l’expression de JAK1, JAK3, ou de GAPDH, par Western blot dans des cellules PC3 surexprimant de façon stable JAK3 transfectées avec 0,5 pM à 12,5 pM de siAFIN.
La Figure 9 représente l’expression de gènes cibles potentiels dans des cellules T47D transfectées avec 10nM de siAFIN HJ1D2 ciblant JAK1 ou d’un siAFIN contrôle (siAS).
La Figure 10 représente l’expression de gènes cibles potentiels dans des cellules T47D transfectées avec 10nM de siAFIN HJ1D8 ciblant JAK1 ou d’un siAFIN contrôle (siAS).
La Figure 11 représente l’expression de gènes cibles potentiels dans des cellules T47D ou PC3 transfectées avec 10nM de siAFIN HJ3D41 ciblant JAK3 ou d’un siAFIN contrôle (siAS).
La Figure 12 représente l’expression de gènes cibles potentiels dans des cellules T47D transfectées avec 10nM de siAFIN HMJ3D1 ciblant JAK3 ou d’un siAFIN contrôle (siAS).
La Figure 13 montre l’effet des si AFIN selon l’invention ou contrôle sur la prolifération cellulaire (a), le métabolisme de GATR (b), et l’apoptose (c), et (d). « opti » désigne le milieu OPTI-MEM utilisé pour réaliser le mixte lors de la transfection, et « lipo » désigne l’agent de transfection utilisé (LipofectamineRNAimax).
EXEMPLES
Exemple 1 : Identité des siARN.
Plusieurs séquences siARN conçues pour inhiber l’expression du gène JAK1 ou J1 K3 humain, ou humain et murin, ont été comparées entre elles ainsi qu’avec plusieurs séquences siARN commercialisées connues pour inhiber l’expression des gènes JAK1 ou JAK3 humains. La nomenclature des siARN est la suivante : H pour Homo Sapiens (espèce concernée), M pour Mus musculus, J1 pour JAK1 : transcrit ciblé (et J3 pour JAK3), puis un numéro unique Dx pour caractériser la séquence. Ainsi siHJ1 D8 est la séquence siARN qui cible le gène humain JAK1 , dont le numéro unique est D8. siHMJ3D1 est la séquence siARN qui cible les gènes humain et murin JAK3, dont le numéro unique est D8. « A », « Q », et « H » désignent les siARN commercialisés respectivement par la société Ambion, Qiagen, ou Dharmacon.
Plusieurs approches expérimentales ont été combinées afin de proposer deux séquences de siARN les plus efficaces et spécifiques possibles tout en présentant le moins d’effets indésirables possibles afin de permettre leur utilisation thérapeutique (voir Tableaux 1 -2).
Tableau 2. Séquences siARN ciblant JAK1 humain
Les inventeurs ont comparé des dizaines de séquences, originales ou déjà commercialisées, afin de faire émerger deux siARN pouvant cibler JAK1 ou JAK3 pour une utilisation thérapeutique.
Il est intéressant de remarquer que parmi les siARN générés selon les principes de l’interférence à ARN, la séquence siARN siHJ1 D64 n’était en fait pas efficace pour inhiber l’expression de JAK1 .
Le positionnement des siARN testés sur les gènes JAK1 et JAK3 est montré en Figures 2 et 3.
Tableau 3 : Synthèse des expériences réalisées pour tester les siARN dirigés contre JAK1 humain.
*PC3 = cellules 3C3-Hs. ak3-GFP clone E8
Tableau 4 : Synthèse des expériences réalisées pour tester les siARN dirigés contre JAK3 humain.
Exemple 2 : Efficacité des siARN.
a. Contrôle de la spécificité d’inhibition génique :
La spécificité des séquences siARN a été évaluée par des approches de biologie moléculaire, en analysant l’expression génique par RTqPCR des 4 membres de la famille de protéines JAK : JAK1 , JAK2, JAK3 et TYK2. Les expériences ont été réalisées avec une concentration de 10 nM de siARN pour favoriser de potentiels effets non-spécifiques qui sont connus pour être dose-dépendants.
Des cellules Caco-2 ont été transfectées avec 10nM de siARN ciblant JAK1 ou JAK3 en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. Les siARN siHJ1 D8 et siHJ1 D2 ciblent JAK1 et les siHJ3D41 et HMJ3D1 ciblent JAK3. Les ARN ont été extraits, retro- transcrits en ADNc et testés en RTqPCR. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène interne et les cellules n’ayant subi aucun traitement ont servi de calibrateur externe. Le siARN « siAS » est un contrôle de transfection qui n’a pas d’homologie pour le génome humain. Les résultats de 3 expériences indépendantes de mesure du niveau d’expression génique JAK1 , JAK2, JAK3 ou TYK2 dans les cellules Caco-2 sont montrés en Figures 4 et 5.
Ces résultats ont également été confirmés au niveau protéique par Western-blot. Des cellules PC3 transfectées avec un vecteur pCDNA3.1 dans lequel la séquence codant JAK3 fusionnée à son extrémité C-terminale avec la GFP, ont été transfectées avec 10nM de siARN ciblant JAK1 ou JAK3 en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h pour permettre le suivi de la protéine JAK3 notamment. Les siARN-JAK impactent uniquement l’expression de leur cible. b. Contrôle de la sensibilité :
La dose utile de siARN minimale nécessaire pour bloquer l’expression endogène des gènes JAK1 ou JAK3 a été recherchée (si-JAK1 : <12,5 pM dans la lignée humaine épithéliale PC3 ; si-JAK3 : <1 nM dans la lignée humaine épithéliale PC3 surexprimant JAK3 à l’aide de l’introduction d’un plasmide).
Les cellules PC3 ont été transfectées avec 12,5 pM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. les cellules ont été lysées en utilisant un tampon de lyse classique. Les lysats protéiques ont ensuite été analysés par Western-blot pour l’expression de JAK1 et de la GAPDFI. La Figure 6 représente la quantification de l’expression de JAK1 , normalisée vis-à-vis de la GAPDFI.
Des cellules PC3 surexprimant JAK3-GFP ont été transfectées avec 1 nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. les cellules ont été lysées en utilisant un tampon de lyse classique. Les lysats protéiques ont ensuite été analysés par
Western-blot pour l’expression de JAK3 et de la GAPDH. La Figure 7 représente la quantification de l’expression de JAK3.
Des cellules PC3 surexprimant JAK3-GFP ont enfin été transfectées avec différentes concentrations de siARN (de 0,5 pM à 12,5 pM) en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. les cellules ont été lysées en utilisant un tampon de lyse classique. Les lysats protéiques ont ensuite été analysés par Western-blot pour l’expression de JAK3 ou JAK1 et de la GAPDH. La Figure 8 représente les résultats d’une expérience de Western-blot représentative de 3 expériences indépendantes.
Les séquences siARN proposées restent donc efficaces à des doses bien en dessous de celles préconisées pour les séquences déjà commercialisées (rarement moins de 10 nM). A la concentration de 5 pM, les séquences générées présentent encore une forte efficacité d’inhibition de l’expression de JAK1 ou JAK3 (voir Figure 8). c. Recherche des effets indésirables :
i. Effets micro ARN
La présence de séquences nucléotidiques en 3’UTR de l’ensemble du génome humain pouvant être reconnues par les séquences « graines » des siARN a été recherchée.
Tableau 5. Le nombre de fois où la séquence « graine » des si-JAK1 pouvait présenter une complémentarité de séquences avec une séquences nucléotidiques 3’UTR a été recherché in silico sur l’ensemble du génome humain.
Tableau 6. Le nombre de fois où la séquence « graine » des si-JAK3 pouvait présenter une complémentarité de séquences avec une séquences nucléotidiques 3’UTR a été recherché in silico sur l’ensemble du génome humain.
Les résultats obtenus ont été synthétisés dans le Tableau 5 pour les si-JAK1 et dans le Tableau 6 pour les si-JAK3. Les si-JAK sélectionnés présentent un risque très modéré d’activer une réponse microARN. ii. Effets directs potentiels sur d’autres gènes
L’homologie de séquence des si-JAK pour l’ensemble des gènes humains a été analysée in silico à l’aide du programme BLASTN 2.7.0+ (disponible en libre accès) du NCBI. Cette approche a permis d’étudier les homologies de séquences des brins passager et guide des siARN avec l’ensemble du génome humain.
Des cibles potentielles possédant une homologie de séquence partielle avec les siARN ont été mises en évidence.
L’ensemble des gènes possédant une homologie partielle de séquence avec le siHJ1 D2 a été compilé dans le Tableau 7.
Tableau 7. Les gènes présentant une homologie de séquence partielle avec les brins passager et guide du siHJ1 D2 ont été compilés dans ce tableau. La séquence « graine » du siHJ1 D2 est soulignée, l’homologie de séquence entre le gène et le siHJ1 D2 est en italique et en gras.
Certaines cibles potentielles trouvées par l’analyse in silico ont été validées expérimentalement par RTqPCR. Pour cela, des cellules T47D ont été transfectées avec 10nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. Les ARN ont été extraits, retro-transcrits en ADNc et testés en RTqPCR. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène interne et les cellules n’ayant subi aucun traitement ont servi de calibrateur externe. Le siARN « siAS » est un contrôle de transfection qui n’a pas d’homologie pour le
génome humain. Les résultats montrés en Figure 9 représentent 4 expériences indépendantes en dot plot avec la moyenne en surimpression.
Bien qu’une homologie de séquence partielle entre les gènes FECH, TAF4 et ABLIM1 et le siHJ1 D2 ait été détectée in silico, ce siARN n’impacte pas l’expression de ces gènes.
L’ensemble des gènes possédant une homologie partielle de séquence avec le siHJ1 D8 a été compilé dans le Tableau 8.
Tableau 8. Les gènes présentant une homologie de séquence partielle avec les brins passager et guide du siHJ1 D8 ont été compilés dans ce tableau. La séquence « graine » du siHJ1 D8 est soulignée, l’homologie de séquence entre le gène et le siHJ1 D8 est en italique et en gras.
Certaines cibles potentielles trouvées par l’analyse in silico ont été validées expérimentalement par RTqPCR. Pour cela des cellules T47D ont été transfectées avec 10nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. Les ARN ont été extraits, retro-transcrits en ADNc et testés en RTqPCR. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène interne et les cellules n’ayant subi aucun traitement ont servi de calibrateur externe. Le siARN « siAS » est un contrôle de transfection qui n’a pas d’homologie pour le génome humain. Les résultats montrés en Figure 10 représentent 4 expériences indépendantes en dot plot avec la moyenne en surimpression.
Bien qu’une homologie de séquence partielle entre les gènes ZNF782, ZFYVE1 , ARL14EP, CADPS2, OAS1 et ZDHHC23 et le siHJ1 D8 ait été détectée in silico, ce siARN n’impacte pas l’expression de ces gènes. L’ensemble des gènes possédant une homologie partielle de séquence avec le
SÎHJ3D41 a été compilé dans le Tableau 9.
Tableau 9. Les gènes présentant une homologie de séquence partielle avec les brins passager et guide du siHJ3D41 ont été compilés dans ce tableau. La séquence « graine » du siHJ3D41 est soulignée, l’homologie de séquence entre le gène et le siHJ3D41 est en italique et en gras.
Certaines cibles potentielles trouvées par l’analyse in silico ont été validées expérimentalement par RTqPCR. Pour cela des cellules T47D (gènes ZSWIM4, RNPEP et PHF21 A) ou PC3 (gène LRCH2 car il n’est pas exprimé par les cellules T47D et ne pouvait donc pas être étudié dans cette lignée) ont été transfectées avec 10nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. Les ARN ont été extraits, retro- transcrits en ADNc et testés en RTqPCR. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène interne et les cellules n’ayant subi aucun traitement ont servi de calibrateur externe. Le siARN « siAS » est un contrôle de transfection qui n’a pas d’homologie pour le génome humain.
Les résultats montrés en Figure 1 1 représentent 4 expériences indépendantes en dot plot avec la moyenne en surimpression.
Le SÎHJ3D41 semble diminuer l’expression génique de ZSWIM4 et LRCH2, mais pas celles de RNPEP et PHF21A.
L’ensemble des gènes possédant une homologie partielle de séquence avec le siHMJ3D1 a été compilé dans le T ableau 10.
Tableau 10. Les gènes présentant une homologie de séquence partielle avec les brins passager et guide du siHMJ3D41 ont été compilés dans ce tableau. La séquence « graine » du siHMJ3D41 est soulignée, l’homologie de séquence entre le gène et le siHMJ3D41 est en italique et en gras.
Certaines cibles potentielles trouvées par l’analyse in silico ont été validées expérimentalement par RTqPCR. Pour cela, des cellules T47D ont été transfectées avec 10nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax pendant 48h. Les ARN ont été extraits, retro-transcrits en ADNc et testés en RTqPCR. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène interne et les cellules n’ayant subi aucun traitement ont servi de calibrateur externe. Le siARN « siAS » est un contrôle de transfection qui n’a pas d’homologie pour le génome humain. Les résultats montrés en Figure 12 représentent 4 expériences indépendantes en dot plot avec la moyenne en surimpression.
Bien qu’une homologie de séquence partielle entre les gènes FAM213A, KANK3, TMEM120B et POLDIP3 et le siHMJ3D1 ait été détectée in silico, ce siARN n’impacte pas l’expression de ces gènes.
iii. Effets phénotypiques
L’impact de l’utilisation des siARN sur les grandes fonctions cellulaires (la prolifération, l’apoptose, et le métabolisme de l’ATP) a été analysé.
Les cellules Caco-2 ont été transfectées avec 10 nM de siARN en utilisant de la Lipofectamine RNAimax.
Les cellules transfectées ont ensuite été incubées en présence d’EdU (5mM) pendant 5h, qui est un agent fluorescent qui s’intercale dans l’ADN des cellules qui prolifèrent. Les cellules ont ensuite été décollées puis perméabilisées avant d’être analysées en cytométrie de flux. Le siRNA ciblant le gène EG5 est un contrôle interne d’expérience puisque ce gène est directement impliqué dans la prolifération cellulaire. Les résultats en Figure 13a représentent 4 expériences indépendantes en dot plot avec la moyenne en surimpression, « * » signifie une p-value significative en test statistique apparié non paramétrique. Les siARN d’intérêt n’ont quant à eux aucun impact sur la prolifération.
Par ailleurs, après 48h de transfection, le niveau d’ATP cellulaire a été mesuré à l’aide d’un kit Vialight (Figure 13b.)
Lors de la transfection des cellules ont été mises en présence de CellEvent, un marqueur des capases3/7 activées. Ce marqueur permet de quantifier l’apoptose. Les cellules ont été analysées après perméabilisation en cytométrie de flux. La Figure 13c représente le pourcentage de cellules en apoptose alors que Figure 13d représente le nombre de molécule fluorescente à la surface des cellules positives.
Les siARN n’ont pas réduit la prolifération cellulaire, ni augmenté l’apoptose ou modifié le métabolisme de l’ATP de manière statistiquement significative.
Claims
1. Acide ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens, dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 ;
pour son utilisation comme médicament.
2. Acide ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens, dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 ;
pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie associée à un dysfonctionnement en gain de fonction de la voie de signalisation de la Janus kinase 1 (JAK1 ) ou de la Janus kinase 3 (JAK3).
3. ARNdb pour l’utilisation selon la revendication 2, où la maladie est sélectionnée dans le groupe constitué des maladies inflammatoires à médiation immunitaire et des cancers.
4. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où ledit ARNdb réduit l’expression de la Janus kinase 3 (JAK3) et dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4.
5. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où ledit ARNdb réduit l’expression de la Janus kinase 1 (JAK1 ) et dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8.
6. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour une utilisation chez un sujet humain.
7. Acide ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens, utilisable en thérapie humaine, dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8.
8. Composition pharmaceutique comprenant au moins un ribonucléique (ARN) double brin (db) comprenant un brin sens et un brin antisens dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 ;
et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
9. Méthode in vitro pour inhiber l’expression de la Janus kinase 1 (JAK1 ) ou la Janus kinase 3 (JAK3) dans une cellule, la méthode comprenant :
a. l’introduction dans ladite cellule d’un acide ribonucléique (ARN) double brin (db), ledit ARNdb comprenant un brin sens et un brin antisens dans lequel :
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 6 ; ou
le brin sens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7 et le brin antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 ; et
b. le maintien de la cellule produite à l’étape (a) pendant un temps suffisant pour obtenir la dégradation de l’ARNm d’un gène JAK1 ou JAK3, inhibant ainsi l’expression de JAK1 ou JAK3 dans la cellule.
10. Méthode in vitro selon la revendication 9, dans laquelle, à l’étape a, ledit ARNdb est mis en contact avec ladite cellule à une concentration de 5 pM à 10 nM.
11. ARNdb pour l'utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, ARNdb selon la revendication 7, composition pharmaceutique selon la revendication 8, ou méthode selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ou laquelle le nucléotide à l’extrémité 5’ du brin antisens de l’ARNdb est phosphorylé.
12. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 1 1 , ARNdb selon la revendication 7 ou 1 1 , composition pharmaceutique selon la revendication 8 ou 1 1 , ou méthode selon l’une quelconque des revendications 9 à 1 1 , dans lequel ou laquelle chaque brin de l’ARNdb comprend au plus 24, 23 ou 22 nucléotides.
13. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 1 1 -12, ARNdb selon la revendication 7, 1 1 ou 12, composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 8 et 1 1 à 12, ou méthode selon l’une quelconque des revendications 9 à 12, dans lequel ou laquelle les deux brins de l’ARNdb sont de longueur identique.
14. ARNdb pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 1 1 à 14, ARNdb selon l’une quelconque des revendications 7 et 1 1 à 13, composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 8 et 1 1 à 13, ou méthode selon l’une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel ou laquelle l’ARNdb comprend au plus 60 nucléotides.
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