EP3994277A1 - Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna - Google Patents

Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna

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Publication number
EP3994277A1
EP3994277A1 EP20750595.9A EP20750595A EP3994277A1 EP 3994277 A1 EP3994277 A1 EP 3994277A1 EP 20750595 A EP20750595 A EP 20750595A EP 3994277 A1 EP3994277 A1 EP 3994277A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
bisulfite
solid phase
buffer
rough surface
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP20750595.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Magdalena GRUNT
Vipul Patel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IST Innuscreen GmbH
Original Assignee
IST Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IST Innuscreen GmbH filed Critical IST Innuscreen GmbH
Publication of EP3994277A1 publication Critical patent/EP3994277A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present application relates to a method and a test kit for carrying out a reaction for bisulfite modification of DNA to determine the
  • Methylation pattern of the DNA characterized in that after
  • the modified DNA is bound to a rough solid phase and all further necessary process steps are carried out on this rough solid phase. Finally, the modified, highly pure DNA is detached from this solid phase.
  • the method can be carried out manually or automatically.
  • the rough solid phase is a non-mineral material with a rough surface.
  • a rough surface is understood to be a non-smooth or structured surface of a material that is preferably made of metal, plastic or rubber.
  • Cavity produce a structure which functions as a non-smooth surface and can therefore also be used according to the invention.
  • DNA methylation is an epigenetic mechanism that occurs in most
  • Organisms is found. Its main functions in prokaryotes are aimed at protecting against parasitic DNA and controlling the accuracy of replication. In
  • the predominant methylation site is the 5-carbon of cytosine within the CpG dinucleotide sites. More than half of the genes contain short ( ⁇ 1 kb) CpG-rich regions called CpG islands, while the rest of the genome has no CpGs. While CpG sites in CpG islands are predominantly unmethylated, most CpG sites outside of CpG islands are normally methylated. The elucidation of the function of CpG methylation has proven difficult and appears to vary with context. The CpG methylation is on several genes.
  • hypomethylation while several specific genes are methylated (gene-specific hypermethylation). Hypomethylation typically affects repetitive elements of DNA, while hypermethylation usually occurs within CpG islets. nowadays DNA methylation analysis has become an important tool for studying cancer, gene expression, genetic diseases, and many other important aspects of biology. The study of DNA methylation is also in the
  • the prior art also includes the document WO 2004/053115 A1.
  • This describes a method and kit for isolating a target cell, a cell organelle or a virus from a sample, using, inter alia, a non-specific or little specific binding between a target cell, a cell organelle or a virus with a magnetic microsphere.
  • the object of the invention was to eliminate the disadvantages of the solutions described in the prior art.
  • the aim of the present invention was to provide a
  • the present invention achieves these objects in all of the points defined.
  • the essence of the invention is the knowledge that free nucleic acids or nucleic acids released by lysis can be bound to a solid phase with a rough surface under specific binding conditions, where they are washed and finally eluted from this rough surface.
  • the term "rough surface” is to be understood as meaning that by touching the
  • Non-mineral solid phases in the sense of this
  • Invention are materials that do not consist of glass, silicon dioxide, an ion exchanger or hydroxyapatite.
  • An arrangement of per se non-rough materials in a cavity can also lead to the creation of a “rough” or structured surface due to corners or edges being formed.
  • rough surface is to be understood in such a way that by touching or looking at the surface it can be seen that it is not smooth. However, it can also be a surface that has a structure (e.g. grooves). This structure removes the smoothness of the surface, even if the structure, i.e. the grooves, itself can be smooth. According to the invention, such surfaces are referred to as “structured surfaces”. If it is not possible to tell whether a surface is smooth or rough by looking at or touching the surface, a test can be carried out in which a laser beam is aimed at that surface. If the surface is smooth, the laser will only work in
  • the process can be carried out both manually and automatically.
  • automated bisulfite modification of DNA there are currently no suitable solutions.
  • the manual method according to the invention for bisulfite modification of DNA is carried out in a preferred variant as follows.
  • Materials for binding the DNA are plastic granules with a rough surface, which are preferably paramagnetic.
  • plastic granulates, the surface of which has been mechanically roughened are placed in a 2.0 ml reaction vessel for this purpose.
  • the bisulfite modification reaction (deamination and / or desulfonation step as well as necessary washing steps) are carried out with reagents from a commercially available kit for bisulfite modification of DNA (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG).
  • the reaction mixture is transferred to the 2.0 ml reaction vessel with the granules.
  • the binding of the DNA to the surface of the rough plastic granulate is initiated by adding a binding buffer, which contains an alcoholic component and other additives, or by adding just one alcohol. After a short incubation, the supernatant is removed from the plastic granulate by placing the reaction vessel in a magnetic trap.
  • the bound modified DNA is washed with an alcoholic washing buffer
  • a desulfonation buffer is added to the reaction vessel with the granulate
  • the modified DNA is finalized by adding a low salt buffer from
  • Granules according to the invention detached.
  • Bisulfite reagent all process steps necessary for a bisulfite modification of DNA are of the kind that none of the previously used mineral
  • the means and method according to the invention also reveal further advantages. For the processing of larger sample volumes, it is necessary to parallelize processes and, in the most effective case, to automate them. With regard to the process of bisulfite modification of DNA, there are a large number of commercially available products for manual processing, but very few products for processing large sample sizes. Automated solutions cannot be found commercially and must be implemented individually by users on automation platforms.
  • the agent according to the invention is ideally suited to carry out an automated bisulfite modification of DNA.
  • the material with the rough surface is located within a pipette tip, so that reagents can flow past this material.
  • the same material that was used for manual bisulfite modification can also be placed in a pipette tip.
  • the method according to the invention runs in the form of a "walk-away process" as follows:
  • the pipette tip according to the invention is empty. 5.
  • the desulphonation reaction of the DNA bound to the plastic granulate then takes place inside the pipette tip. This is done by pipetting up and down a desulfonation buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG).
  • Rough materials can be used, modified plastic materials whose surfaces are not smooth but structured. This also includes so-called composite materials, which are mixtures of polymers and, for example, organic components or metallic components. It is only essential to provide a roughened or structured surface (not a smooth
  • the architecture of the plastic material is also not limiting (round, rectangular, etc.). It is only important that the material can be brought into a pipette tip and also remains in this position and that a liquid can be washed around it at any time without the liquid having to pass through the material introduced.
  • a pipette tip can also be used in which there is (from an injection molded part manufactured) that the binding material is already in place and no longer has to be brought into the tip.
  • a device platform that is a commercially available magnetic particle processor (e.g. KingFisher Flex for DNA / RNA extraction and processing of 96 samples) is used and misappropriated.
  • a commercially available magnetic particle processor e.g. KingFisher Flex for DNA / RNA extraction and processing of 96 samples
  • the device uses plastic combs into which magnetic bars move, which then move magnetic particles in a walk-away process and immerse them in the buffers required for a standard extraction. These plastic combs were used for the method according to the invention for purposes other than those intended by their lower end being mechanically roughened. The method according to the invention for bisulfite modification of DNA was then implemented automatically by means of the device. In contrast to the
  • the pipette tip variant binds the DNA to the rough surface of the plastic combs and goes through all the necessary steps following the initial deamination reaction in a walk-away workflow.
  • the procedure is extremely simple and allows up to 96 samples to be processed in parallel.
  • the present invention thus ideally enables the implementation of the objective already mentioned.
  • the method of bisulfite modification of DNA including all the necessary process steps does not require any mineral materials known from the prior art, but only roughened surfaces.
  • the automated bisulfite modification was carried out with the InnuPure C16 automatic extraction device (Analytik Jena AG). This automatic extraction system is based on a magnetic particle nucleic acid extraction, but was used for the process “for a different purpose” without magnetic particles.
  • Cavity 4 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
  • the reaction mixture of the cavity 1 was carried out by means of the
  • the DNA bound to the rough plastic granules was brought into contact with desulfonation buffer (4 times AuF and pipetting off). An incubation time of 2 minutes with Desulfonation Buffer was observed for each pipetting step.
  • the DNA bound to the plastic granules was then washed successively in three additional cavities containing alcoholic washing buffers (Washing Solution LS, 80% ethanol, 80% ethanol) by pipetting in and out.
  • alcoholic washing buffers Wash Solution LS, 80% ethanol, 80% ethanol
  • the tip according to the invention and the rough plastic granules contained in it were dried by pipetting air in and out 60 times and the remaining ethanol was thus removed.
  • the nucleic acids were eluted by pipetting the AuF 150 times and pipetting off with 100 ml elution buffer which had previously been tempered to 50 ° C. by the device.
  • the total volume of elution BuFfer was 100 m3.
  • Automatic extraction machines can be used for carrying out the method according to the invention with the agent according to the invention corresponding thereto.
  • the time required compared to a spin column-based extraction is less.
  • a real-time PCR assay specific for the actin beta gene locus was used to quantify the total amount of bisulfite-modified DNA.
  • the Actin Beta gene locus does not contain any CpG sites, therefore, after the bisulfite modification reaction, all cytosines from this gene locus are converted into uracils and these are detected as thymines in a real-time PCR assay. This assay was used to verify that the genomic DNA is bisulfite modified.
  • Taq-man probe 5 '-F AM- ACC ACC ACCC AACACAC AAT AACAAAC ACA-BHQ- 1 -3'
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Taq-man probe (25 pmol / m ⁇ ): 0.1 m ⁇
  • the real-time PCR was carried out in the CFX96 real-time system by the company Biorad.
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 57 ° C / 40")
  • FIG. 1 shows a real-time PCR from the ⁇ -actin assay.
  • gray curves genomic DNA
  • magenta curves no template control
  • blue and green curve samples DNA after the respective bisulfite modification reaction.
  • the cytosine free flagment (CFF-1) assay amplifies genomic and bisulfite-modified DNA with the same efficiency and is therefore suitable for quantifying the yield of bisulfite-modified DNA. It enables the direct comparison of input DNA and output DNA of the bisulite modification reaction.
  • genomic DNA the sense and the antisence strand serve as templates.
  • the antisense strand serves as a template in bisulfite-modified DNA, because the antisense strand (contains cytosines) is not available for the amplification reaction after the bisulfite modification.
  • Primem and Taq-man probe are as follows. Forward primer: 5 '-T AAG AGT AAT AATGGATGG ATG ATG-3'
  • Taq-man probe 5'- F AM- ATGGATG AAGAAAGAAAGGATG AGT-BHQ- 1 -3 'Real-Time PCR approach:
  • the real-time PCR was carried out in the CFX96 real-time system by Biorad: Amplification conditions:
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 52 ° C / 40")
  • FIG. 2 shows a real-time PCR from the CFF-1 assay. (magenta curves: No.
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 Amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 58 ° C / 40")
  • FIG. 3 shows a real-time PCR of the CFP 415 bp assay. (magenta curves: No Template Control, green and blue curves: samples DNA after
  • the automated purification was done with the magnetic particle processor
  • Plastic combs into which magnetic rods penetrate and which then move magnetic particles in a walk-away process which are used to isolate nucleic acids. These plastic combs were used outside of their normal intended use to carry out the fiction, contemporary method.
  • the plastic material of the combs is polypropylene. According to the invention, the plastic combs were roughened using a grinding machine.
  • the reagents used for bisulfite modification of the nucleic acids were partly taken from the commercial kit “innuCONVERT Bisulfite Basic Kit”; Analytik Jena AG, taken. For the bisulfite modification 5 gg of genomic DNA with 70 m ⁇ conversion
  • Deep well plate 2 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG)
  • Deep well plate 3 1 ml desulfonation buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
  • Deep well plate 4 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
  • Deep well plate 7 100 ml Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
  • the reaction mixture described above was after the incubation in the cavity 1 given, which was filled with 250 m ⁇ 99.8% ethanol. A further 5 ml Binding Optimizer (Analytik Jena AG) were added to this reaction mixture. The automated process was then carried out on the KingFisher Flex machine.
  • the reaction mixture of cavity 1 was mixed by means of the rough plastic combs according to the invention by repeating vertical movements (moving in and out within the deep well plate cavity).
  • the bisulfite-modified DNA binds to the rough plastic surface of the plastic combs.
  • After binding of the DNA it was washed by vertical movement of the comb in the cavity of the deep well plate 2 with the Washing Solution HS (Analytik Jena AG) contained therein
  • the rough plastic combs were slowly moved vertically up and down in desulfonation buffer for 8 minutes.
  • the bisulfite-modified DNA bound to the rough plastic combs was then successively transferred to three further deep-well plates containing alcoholic washing buffers (Washing Solution FS, 80% ethanol, 80% ethanol), each for 30 seconds washed slowly moving up and down vertically.
  • alcoholic washing buffers Wash Solution FS, 80% ethanol, 80% ethanol
  • the plastic combs were dried on the foot for 10 minutes and the remaining ethanol was removed.
  • the bisulfite-modified DNA was eluted from the rough plastic combs by moving the plastic combs vertically for 10 minutes in elution buffer, which had previously been heated to 80 ° C. by the device.
  • the total volume of elution buffer was 100 ml.
  • the method is extremely simple and fast and shows that with the commercially available automatic extraction KingFisher Flex an automated bisulfite modification of up to 96 sample DNAs can be carried out in parallel by modifying the plastic combs alone.
  • the modified DNA was again analyzed using various real-time PCR assays.
  • a real-time PCR assay specific for the actin beta gene locus was used to quantify the total amount of bisulfite-modified DNA.
  • the Actin Beta gene locus does not contain any CpG sites, so all cytosines from this gene locus are converted into uracils after the bisulfite modification reaction and these are detected as thymine in a real-time PCR assay. This assay was used to check whether the genomic DNA was bisulfite-modified.
  • Taq-man probe 5 '-F AM- ACC ACC ACCC AACACAC AAT AACAAAC ACA-BHQ- 1 -3'
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Taq-man probe (25 pmol / m ⁇ ): 0.1 m ⁇
  • the real-time PCR was carried out in the CFX96 real-time system from Biorad.
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 57 ° C / 40")
  • FIG. 4 shows a real-time PCR from the ⁇ -actin assay.
  • gray curves genomic DNA
  • magenta curves no template control
  • blue and green curve samples DNA after the respective bisulfite modification reaction.
  • the cytosine free fragment (CFF-1) assay amplifies genomic and bisulfite-modified DNA with the same efficiency and is therefore suitable for quantifying the yield of bisulfite-modified DNA. It enables the direct comparison of input DNA and output DNA of the bisulite modification reaction.
  • genomic DNA the sense and the antisence strand serve as templates.
  • only the sense strand is used for bisulfite modified DNA as a template because the antisense strand (contains cytosines) is not available for the amplification reaction after the bisulfite modification. That is why there is a theoretical loss of one Ct value for bisulfite-modified DNA, since the template is halved after the bisulfite modification.
  • the sequence of the primers and the Taq-man probe are as follows.
  • Taq-man probe 5'- F AM- ATGGATG AAGAAAGAAAGGATG AGT-BHQ- 1 -3 '
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 52 ° C / 40")
  • FIG. 5 shows a real-time PCR from the CFF-1 assay. (magenta curves: No.
  • a CFP 415 bp assay (cytosine-ffee primer binding site) with bisulfite-modified DNA was carried out as a further analysis. Since this assay is used to amplify long DNA sequences, this assay provides information about the degraded DNA during the bisulfite modification and during the refinement of bisulfite-modified DNA.
  • the sequences from the primers are as follows: Forward primers: 5 ATGGGT AAGGAT ATG AAGTT AAT-3 '
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 Amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 58 ° C / 40")
  • FIG. 6 shows a real-time PCR of the CFP 415 bp assay. (magenta curves: No Template Control, green and yellow curves: samples DNA after
  • Exemplary embodiment 3 Manual bisulfite modification using paramagnetic
  • the chemicals used for the bisulfite modification of the nucleic acids were partly taken from the commercial extraction kit innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG taken.
  • the reaction mixture was transferred into the 2.0 ml reaction vessel with the plastic granules.
  • 250 ml of 99.8% ethanol and 5 ml of Binding Optimizer (Analytik Jena AG) were added and the vessel was shaken for 10 minutes at room temperature and at 1400 rpm.
  • the 2.0 ml reaction vessel was placed in a magnetic trap, the paramagnetic granules were separated and the supernatant was removed
  • the 2.0 ml reaction vessel with the plastic granules was incubated at 65 ° C. for 10 minutes and 500 rpm with the lid open in order to remove the remaining alcohol.
  • the bisulfite-modified DNA was detached from the plastic granulate according to the invention by adding elution buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG). For this, 100 ml of elution buffer were added to the plastic granules and the reaction vessel was incubated for 10 minutes at 65 ° C. and at 500 rpm.
  • elution buffer innuCONVERT Bisulfite Basic Kit
  • the 2.0 ml reaction vessel with the plastic granules was placed in a magnetic trap, the granules were separated and the eluate was transferred to a new 2.0 reaction vessel.
  • the Spin Filter column-based extraction kit from Stiatec (InviGene Bisulfite Conversion Kit) was used for comparison. The instructions as described in the kit manual were followed exactly. After bisulfite modification reactions had been carried out, successful bisulfite modification was detected using various real-time PCR assays.
  • a real-time PCR assay specific for the actin beta gene locus was used to quantify the total amount of bisulfite-modified DNA.
  • the Actin Beta gene locus does not contain any CpG sites, therefore, after the bisulfite modification reaction, all cytosines from this gene locus are converted into uracils and these are detected as thymines in a real-time PCR assay. This assay was used to check whether the genomic DNA was bisulfite-modified.
  • Taq-man probe 5'-F AM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ- 1 -3 '
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Taq-man probe (25 pmol / m ⁇ ): 0.1 m ⁇
  • the real-time PCR was carried out in the CFX96 real-time system from Biorad.
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 57 ° C / 40")
  • FIG. 7 shows a real-time PCR from the ⁇ -actin assay.
  • genomic DNA magenta curves: No Template Control; red and green curve samples DNA after the respective bisulfite modification reaction). The results show that the genomic DNA could be successfully modified with the aid of the manual method of the invention.
  • the cytosine free fragment (CFF-1) assay amplifies genomic and bisulfite-modified DNA with the same efficiency and is therefore suitable for quantifying the yield of bisulfite-modified DNA. It enables the direct comparison of input DNA and output DNA of the bisulite modification reaction.
  • genomic DNA the sense and the antisence strand serve as templates.
  • the antisense strand serves as a template in bisulfite-modified DNA, because the antisense strand (contains cytosines) is not available for the amplification reaction after the bisulfite modification.
  • primers and the Taq-man probes are as follows: Forward primer: 5 '-T AAG AGT AAT AATGGATGG ATG ATG-3'
  • Taq-man probe 5'-F AM-ATGGATGAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ- 1 -3 'Real-time PCR approach:
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 52 ° C / 40")
  • FIG. 8 shows a real-time PCR from the CFF-1 assay.
  • magenta curves No Template Control
  • gray curves genomic DNA
  • red and green curves sample DNA after bisulfite modification reaction.
  • a CFP 415 bp assay cytosine-ffee primer binding site
  • this assay provides information about the degraded DNA during the bisulfite modification and during the purification of bisulfite-modified DNA.
  • the sequences from the primers are as follows:
  • Reverse primer 50 pmol / m ⁇ : 0.1 m ⁇
  • Step 1 Denaturation 95 ° C / 120 "
  • Step 2 Amplification 40 cycles (95 ° C / 4 "; 58 ° C / 40")
  • FIG. 9 shows a real-time PCR of the CFP 415 bp assay. (magenta curves: No Template Control, red and green curves: samples DNA after

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Durchführung einer Reaktion zur Bisulfitmodifizierung von DNA zur Bestimmung der Methylierungsmuster der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter Desaminierungsreaktion unter Verwendung von Bisulfit (z.B. Natriumbisulfit oder Ammoniumbisulfit) die modifizierte DNA an eine raue feste Phase gebunden wird und alle weiteren notwendigen Prozessschritte an dieser rauen festen Phase durchgeführt werden. Final erfolgt die Ablösung der modifizierten hochreinen DNA von dieser festen Phase. Das Verfahren kann manuell oder auch automatisiert durchgeführt werden Bei der rauen festen Phase handelt es sich um ein nicht-mineralisches Material mit einer rauen Oberfläche.

Description

VERFAHREN UND TESTKIT ZUR BISULFITMODIFIZIERUNG VON DNA
[0001] Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Durchführung einer Reaktion zur Bisulfitmodifizierung von DNA zur Bestimmung der
Methylierungsmuster der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter
Desaminierungsreaktion unter Verwendung von Bisulfit (z.B. Natriumbisulfit oder
Ammoniumbisulfit) die modifizierte DNA an eine raue feste Phase gebunden wird und alle weiteren notwendigen Prozessschritte an dieser rauen festen Phase durchgeführt werden. Final erfolgt die Ablösung der modifizierten hochreinen DNA von dieser festen Phase. Das Verfahren kann manuell oder auch automatisiert durchgeführt werden.
[0002] Bei der rauen festen Phase handelt es sich um ein nicht-mineralisches Material mit einer rauen Oberfläche. Unter einer rauen Oberfläche versteht man eine nicht glatte oder strukturierte Oberfläche eines Materials, das vorzugsweise aus Metall, Kunststoff oder Gummi besteht. Auch kann eine Anordnung z.B. von Kunststoffgranulaten in einem
Hohlraum eine Struktur erzeugen, welche als nichtglatte Oberfläche füngiert und damit ebenso gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann.
[0003] DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus, der in den meisten
Organismen gefünden wird. Seine Hauptfunktionen in Prokaryonten richten sich auf den Schutz gegen parasitäre DNA und die Kontrolle der Replikationsgenauigkeit. In
Wirbeltieren ist die vorherrschende Methylierungsstelle der 5-Kohlenstoff von Cytosin innerhalb der CpG-Dinukleotidstellen. Mehr als die Hälfte der Gene enthält kurze (~ 1 kb) CpG-reiche Regionen, die als CpG-Inseln bezeichnet werden, während der Rest des Genoms keine CpGs vorweist. Während CpG-Stellen in CpG-Inseln überwiegend unmethyliert sind, werden die meisten CpG-Stellen außerhalb von CpG-Inseln normalerweise methyliert. Die Aufklärung der Funktion der CpG-Methylierung hat sich als schwierig herausgestellt und scheint mit dem Kontext zu variieren. Die CpG-Methylierung ist an mehreren
fündamentalen Mechanismen beteiligt, d.h. an der Genregulation, der Inaktivierung von X- Chromosomen, dem Imprinting von Genomen und der Aufrechterhaltung der
Chromosomenstabilität. Darüber hinaus ist eine anomale DNA-Methylierung ein
Kennzeichen bösartiger Tumore und stellt ein frühes Ereignis während der Karzinogenese dar. Bei Tumoren nimmt die globale Genommethylierung ab (genomweite
Hypomethylierung), während mehrere spezifische Gene methyliert werden (genspezifische Hypermethylierung). Hypomethylierung betrifft typischerweise repetitive DNA-Elemente, während Hypermethylierung normalerweise innerhalb von CpG-Inseln auftritt. Heutzutage ist die DNA-Methylierungsanalyse zu einem wichtigen Instrument für die Untersuchung von Krebs, Genexpression, genetischen Erkrankungen und vielen anderen wichtigen Aspekten der Biologie geworden. Die Untersuchung der DNA-Methylierung ist auch in der
medizinischen Diagnostik immer wichtiger geworden.
[0004] Die meisten Techniken zur Untersuchung der DNA-Methylierung hängen von einer vorangehenden Desaminierung von Cytosin mittels Bisulfit (Natriumbisulfit oder
Ammoniumbisulfit) ab. In Gegenwart von Bisulfit wird unmethyliertes Cytosin zu Uracil umgewandelt, während methyliertes Cytosin nicht beeinflusst wird. Dementsprechend wird die epigenetische Information in DNA-Sequenzinformation umgewandelt und kann daher durch molekularbiologische Standardverfahren wie PCR und DNA-Sequenzierung bestimmt werden.
[0005] Dies wird gegenwärtig durch die "Bisulfitmodifizierungs" - Technik erreicht, die von Frommerm M., et al., Proc Natl Acad Sei U S A 89 (1992) 1827-31 beschrieben wurde. In diesem Protokoll wurde DNA mit NaOH denaturiert und anschließend für 16 Stunden in Gegenwart von 3, 1 M Natriumbisulfit und 0,5 M Hydrochinon inkubiert, um eine
Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu erreichen, während methyliertes Cytosin nicht beeinflusst wird. Nachfolgend werden die epigenetischen Informationen der DNA in
Sequenzinformationen umgewandelt, die über PCR und andere auf Hybridisierung basierende Methoden untersucht werden können. In letzter Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen der Bisulfit-Methoden entwickelt WO 01/98528 (DE 100 29 915; US Application 10/311,661), EP 1 294 945 Bl, US 7,118,868 B2, US 7,968,295 B2, US
8,241,855 B2, US 8,257,950 B2. Diese Patentschriften beschreiben eine Bisulfitumwandlung, bei der die DNA mit einer Bisulfitlösung eines Konzentrationsbereichs zwischen 0, 1 mol / 1 bis 6 mol / 1 in Gegenwart eines denaturierenden Reagens und / oder Lösungsmittels und mindestens eines Radikalfängers inkubiert wird. In dieser Patentanmeldung werden mehrere geeignete denaturierende Reagenzien und Radikalfänger beschrieben.
[0006] In der US 9,868,756 B2 wird DNA nach der Bisulfitbehandlung an eine Oberfläche auf der Basis eines silikatischen Materials gebunden. Die nachfolgenden Schritte (W aschen der gebundenen DNA, Desulfonierung der DNA, weitere Waschschritte) erfolgen an der festen Phase. Bei diesem Material (feste Phase) handelt es sich um ein Glasflies oder eine Glasmembran, um magnetische Glaspartikel oder auch um Hydroxylapatit. In der
Patentschrift EP 1394173 wird die DNA bereits vor der Inkubation mit einem Bisulfitreagenz an eine mineralische feste Phase gebunden und alle Schritte zur Bisulfitmodifizierung (Deaminierung, Waschschritte, Desulfonierung, Waschschritte) erfolgen an der festen Phase. Auch bei diesem Material handelt es sich um ein Glasflies oder eine Glasmembran, um magnetische Glaspartikel oder auch um Hydroxylapatit. In US 9,868,756 B2 wird in Spalte 6, Zeilen 15-18 explizit beschrieben, dass paramagnetische Substanzen für die Durchführung nicht geeignet sind. (“Paramagnetic substances are not useful as they are only drawn to a magnetic very weakly which is not sufficient for a method according to this invention.“)
[0007] Diese Materialien verkörpern alle sogenannte mineralische feste Phasen. Daraus folgt, dass gemäß des bekannten Stands der Technik die mineralischen Eigenschaften der festen Phase - einschließlich der Poren, die diese Materialien bilden - entscheidend sind für die Anbindung der Bisulfit-behandelten DNA.
[0008] Diese Prozesse lassen sich manuell relativ einfach durchführen. Die automatisierte Umsetzung ist jedoch extrem schwierig. Darüber hinaus sind die benutzen festen Phasen teuer und haben insbesondere bei magnetischen Glaspartikeln auch das Problem, dass sie sich oftmals sehr schlecht separieren lassen bzw. oftmals stark verklumpen, was die Effizienz der Bisulfitmodifizierung stark negativ beeinflusst.
[0009] Zum Stand der Technik zählt auch die Druckschrift WO 2004/053115 Al. Darin wird ein Verfahren und Kits zur Isolierung einer Zielzelle, eines Zellorganells oder eines Virus aus einer Probe beschrieben, wobei unter anderem eine nicht- oder wenig spezifische Bindung zwischen einer Zielzelle, einem Zellorganell oder einem Virus mit einem magnetischen Mikrokügelchen verwendet wird.
Aufgabe der Erfindung
[0010] Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen. Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein
Verfahren zur Bisulfitmodifizierung von DNA bereitzustellen, welches einfach in der Durchführung ist und welches insbesondere für eine automatisierte Durchführung bestens geeignet sein soll und in diesem Zusammenhang gänzlich auf bekannte mineralische Materialien zur Anbindung und Bisulfitmodifizierung von DNA verzichtet.
Lösung der Aufgabe
[0011] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
[0012] Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben in all den definierten Punkten. Der Kern der Erfindung ist die Erkenntnis, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren unter spezifischen Bindungsbedingungen an eine feste Phase mit einer rauen Oberfläche gebunden werden können, dort gewaschen und final von dieser rauen Oberfläche eluiert werden. Der Begriff„raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der
Oberfläche erkennbar ist, das diese nicht glatt ist (Offenlegungsschrift WO 2016/169677 Al). Vorzugsweise können als nichtmineralische feste Phasen Materialien aus Kunststoff, Metall, Nichtmetall eingesetzt wird. Nichtmineralische feste Phasen im Sinn dieser
Erfindung sind Materialien, die nicht aus Glas, Siliziumdioxid, einem Ionenaustauscher oder Hydroxylapatit bestehen. Auch kann eine Anordnung von per se nicht rauen Materialien in einem Hohlraum dazu fuhren, dass durch sich ausbildende Ecken oder Kanten eine„raue“ bzw. strukturierte Oberfläche entsteht.
Der Begriff„raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren oder durch Ansicht der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist. Dabei kann es sich aber auch um eine Oberfläche handeln, die eine Struktur aufweist (z.B. Rillen). Durch diese Struktur ist die Glattheit der Oberfläche aufgehoben, auch wenn die Struktur, also die Rillen, selbst glatt sein kann. Erfindungsgemäß werden solche Oberflächen als„strukturierte Oberflächen“ bezeichnet. Falls durch Ansicht oder Berühren der Oberfläche nicht erkennbar ist, ob eine Oberfläche glatt oder rau ist, kann ein Test durchgeführt werden, bei dem ein Laserstrahl auf diese Oberfläche gerichtet wird. Bei einer glatten Oberfläche wird der Laser nur in
Hauptrichtung an der Oberfläche reflektiert. Bei rauen Oberflächen erfolgt eine Streuung in alle Raumrichtungen. Ein solcher Test ist auf der Web-Seite der Universität Kiel beschrieben worden (http://www.tf.uni- kiel.de/ matwis/ amat/ semitech_en/kap_3/illustr/ oberflaechenstrukture.pdf), Seite 7.
[0013] Überraschenderweise zeigte sich, dass nach erfolgter Deaminierungsreaktion alle notwendigen weiteren Prozessschritte zur Bisulfitmodifizierung von DNA, welche bisher unter der Verwendung von mineralischen Festphasen durchgeführt wurden, sehr einfach und schnell mittel der rauen Oberflächen durchgeführt werden können. Angesichts der
Offenbarung von WO 2016/169677 Al war dies keinesfalls zu erwarten, da dort im Absatz [0012] daraufhingewiesen wurde, dass eine Eluierung der angebundenen Nukleinsäuren von der festen Phase mittels eines Niedrigsalzpuffers möglich ist. Es wäre daher auch möglich gewesen, dass das Bisulfit wie ein solcher Niedrigsalzpuffer wirkt und die Anbindung an eine nichtmineralische feste Phase verhindert. Umso überraschender ist es, dass die bekannten Reagenzien für die Bisufitmodifizierung der DNA dabei beibehalten werden können.
Idealerweise kann das Verfahren sowohl manuell als auch automatisiert durchgeführt werden. Gerade in Bezug auf eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA gibt es zurzeit keine geeigneten Lösungen.
[0014] Das erfindungsgemäße manuelle Verfahren zur Bisulfitmodifizierung von DNA wird in einer Vorzugsvariante wie folgt durchgeführt. Anstelle klassischer mineralischer Materialien zur Bindung der DNA wird ein Kunststoffgranulat mit rauer Oberfläche eingesetzt, welches vorzugsweise paramagnetisch ist. Mehrere Kunststoffgranulate, deren Oberfläche mechanisch angeraut wurde (Größe ca. 1-2 mm x 0.5 - 1mm), werden dazu in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß verbracht. Die Bisulfitmodifizierungsreaktion (Desaminierungs und/ oder Desulfonierungsschritts sowie notwendige Waschschritte) werden mit Reagenzien aus einem kommerziell verfügbaren Kit zur Bisulfitmodifizierung von DNA durchgeführt (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG). Mittels der erfindungsgemäßen neuartigen festen Phase auf der Basis einer rauen Oberfläche werden nachfolgend folgende Verfahrens schritte durchgefuhrt:
1. Nach erfolgter Bisulfitbehandlung einer DNA durch Mischen der DNA mit den
Reagenzien aus dem kommerziellen Kit (Conversion Reagent und Conversion Buffer) und einer nachfolgenden Inkubation des Reaktionsansatzes bei 85°C für 45 Minuten wird der Reaktionsansatz in das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Granulaten überführt. Die Bindung der DNA an die Oberfläche der rauen Kunststoffgranulate wird durch die Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere Zusätze enthält, oder durch die Zugabe nur eines Alkohols initiiert. Nach einer kurzen Inkubation wird der Überstand vom Kunststoff-Granulat entfernt, indem man das Reaktionsgefäß in eine Magnetfalle stellt.
2. Die gebundene modifizierte DNA wird mit einem alkoholischen Waschpuffer
gewaschen und der Waschpuffer danach vollständig entfernt.
3. Es folgt die Desulfonierungsreaktion der am Kunststoff-Granulat gebundenen DNA.
Dazu wird dem Reaktionsgefäß mit dem Granulat ein Desulfonation-Buffer
(innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und der Ansatz für einige Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird der Überstand vom Kunststoff- Granulat vollständig entfernt.
4. Es folgen weitere Waschschritte mit alkoholischen Waschpuffem und nachfolgend die Trocknung des Kunststoff-Granulates.
5. Final wird die modifizierte DNA durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers vom
erfindungsgemäßen Granulat abgelöst.
[0015] Wie das erfindungsgemäße Verfahren in seiner manuellen Ausführungsvariante zeigt, ist es auf einfache Weise möglich, dass nach der Behandlung einer DNA mit einem
Bisulfitreagenz alle Verfahrensschritte, die für eine Bisulfitmodifierung von DNA notwendig sind, der Art durchführt, dass keine der bisher Verwendung findenden mineralischen
Materialien in Form von Glasfließ oder Glasmembran, Glaspartikel oder Hydroxylapatit mehr benötigt werden. Ausreichend für alle notwendigen Prozessschritte ist die Verwendung von Plastikmaterial, dessen Oberfläche eine Rauigkeit aufweist.
[0016] Das erfindungsgemäße Mittel und Verfahren offenbart noch weitere Vorteile. Für die Bearbeitung von größeren Probenumfängen ist es notwendig, Prozesse zu parallelisieren und im effektivsten Fall zu automatisieren. In Bezug auf das Verfahren der Bisulfitmodifikation von DNA gibt es eine Vielzahl von kommerziell verfügbaren Produkten zur manuellen Bearbeitung, jedoch für die Bearbeitung von großen Probenumfängen nur sehr wenige Produkte. Automatisierte Fösungen sind kommerziell nicht zu finden und müssen individuell von Anwendern auf Automationsplattformen implementiert werden.
[0017] Verfahren zur parallelen Probenbearbeitung basieren auf der Nutzung von
magnetischen Glaspartikeln, an welchen die Bisulfitmodifizierungsreaktion stattfindet.
[0018] Es ist bekannt, dass die Handhabung magnetischer Partikel multiple Prozessschritte benötigt und insbesondere der jeweilige Schritt der magnetischen Separation der Partikel zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind diese Partikel sehr teuer.
[0019] Überaschenderweise zeigt sich, dass das erfmdungsgemäße Mittel in idealer Weise geeignet ist, eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA durchzuführen.
[0020] In einer bevorzugten Ausführungsvariante befindet sich das Material mit der rauen Oberfläche innerhalb einer Pipettenspitze, so dass Reagenzien an diesem Material vorbeiströmen können. Zum Beispiel kann dasselbe Material, welches für die manuelle Bisulfitmodifizierung verwendet wurde, auch in eine Pipettenspitze verbracht werden.
[oo2i] Nach erfolgter Bisulfitbehandlung der DNA werden alle weiteren Schritte des Bisulfitmodifizierungs-Prozesses innerhalb einer Pipettenspitze automatisiert durchgeführt, wobei die DNA an der Oberfläche des erfindungsgemäßen rauen Materials gebunden ist.
[0022] Das erfmdungsgemäße Verfahren läuft in Form eines„walk-away-Prozesses“ wie folgt ab:
1. Nach erfolgter Bisulfitbehandlung einer DNA durch Mischen der DNA mit den Reagenzien aus dem kommerziellen Kit (Conversion Reagent und Conversion Buffer) und einer nachfolgenden Inkubation des Reaktionsansatzes bei 85°C für 45 Minuten wird der Reaktionsansatz mit einem Bindungspuffer versetzt. 2. Der Reaktionsansatz wird mit einem Alkohol und/oder einem Alkohol und weiteren Komponenten gemischt. Die Mischung wird mit einer Pipettenspitze, in welcher sich das raue Material vertikal angeordnet befindet, aufgezogen und die Flüssigkeit durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren am rauen Material vorbeibewegt. Nach letztem Auspipettieren ist die erfindungsgemäße Pipettenspitze leer. Die zuvor Bisulfit-behandelte DNA befindet sich jetzt an der Oberflächen des in der Pipettenspitze befindlichen rauen Plastikgranulates .
3. Entfernen der erfindungsgemäßen Pipettenspitze aus der Probe.
4. Eintauchen der erfmdungsgemäßen Pipettenspitze in eine Waschpufferlösung.
Mehrmaliges Auf- und Abpipettieren (die Flüssigkeit bewegt sich dabei am Material vorbei). Nach letztem Auspipettieren ist die erfmdungsgemäße Pipettenspitze leer. 5. Danach erfolgt die Desulfonierungsreaktion der am Kunststoff-Granulat gebundenen DNA innerhalb der Pipettenspitze. Dies erfolgt wiederum über Auf- und Abpipettieren eines Desulfonation-Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG).
6. Es folgen weitere Waschschritte mit alkoholischen Waschpuffem und nachfolgend die Trocknung des Kunststoff-Granulates, immer nur durch ein mehrmaliges Auf - und
Abpipettieren.
7. Final wird die modifizierte DNA durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers vom erfmdungsgemäßen Granulat abgelöst
[0023] Die ausgewählten und vertikal in die Pipettenspitze verbrachten Materialien zur Anbindung der bisulfitbehandelten DNA für alle weiteren notwendigen Verfahrens schritte können extrem unterschiedlich sein. Es können raue Materialien eingesetzt werden, modifizierte Plastikmaterialien, deren Oberflächen nicht glatt, sondern strukturiert sind. Dazu zählen auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten bzw. strukturierten Oberfläche (keine glatte
Oberfläche). Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend (rund, rechteckig, etc.). Wichtig ist nur, dass das Material in eine Pipettenspitze verbracht werden kann und auch an dieser Position verbleibt und jederzeit von einer Flüssigkeit umspült werden kann, ohne dass die Flüssigkeit durch das eingebrachte Material hindurch muss.
Auch kann eine Pipettenspitze eingesetzt werden, in welcher sich (aus einem Spritzgussteil gefertigt), dass Bindungsmaterial schon befindet und dieses nicht mehr in die Spitze verbracht werden muss.
[0024] Überaschenderweise kann auch eine weitere automatisierte Bisulfitmodifierung durchgeführt werden. Hier wird keine Pipettenspitze genutzt.
[0025] Verwendet und zweckendfremdet wird eine Geräte-Plattform, bei welcher es sich um einen kommerziell verfügbaren Magntepartikelprozessor handelt (z.B. KingFisher Flex für die DNA/RNA Extraktion und die Bearbeitung von 96 Proben).
[0026] Es handelt sich dabei um ein Gerät zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel. Das Gerät verwendet dabei Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt, indem ihr unteres Ende mechanisch angeraut wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bisulfitmodifizierug von DNA wurde mittels des Gerätes dann automatisiert umgesetzt. Im Unterschied zur
Pipettenspitzen-Variante bindet die DNA diesmal an die raue Oberfläche der Plastikkämme und durchläuft in einem walk-away-Worklflow nacheinander alle notwendigen Schritte, die der initialen Deaminierungsreaktion folgen. Das Verfahren ist extrem einfach und erlaubt es, bis zu 96 Proben parallel zu bearbeiten.
[0027] Die vorliegende Erfindung ermöglicht damit in idealster Weise die Umsetzung der schon aufgeführten Zielstellung. Für die Methode der Bisulfitmodifizierung von DNA incl. aller dafür notwendigen Prozessschritte benötigt man keine aus dem Stand der Technik bekannten mineralischen Materialien, sondern lediglich angeraute Oberflächen.
[0028] Mit der Erfindung steht damit eine völlig neuartige Plattformtechnologie für die Bisulfitmodifizierung von DNA zur Verfügung, welche eine Vielzahl von ganz deutlichen Vorteilen gegenüber den bekannten Verfahren, welche mineralische Materialien für die Methode einsetzen, aufweist. Vor allem die automatisierte Umsetzung ist erstmals ganz einfach und schnell möglich.
[0029] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erklärt, wobei die
aufgeführten Beispiele keine Limitationen der Erfindung darstellen.
Ausfuhrungsbeispiele Ausfuhrungsbeispiel 1:
Automatisierte Bisulfitmodi fizierung von DNA mittels einer Pipettenspitze mit enthaltenem rauen Plastik-Granulat und unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten
[0030] Die automatisierte Bisulfitmodifizierung wurde mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt. Dieser Extraktions automat basiert auf einer Magnetpartikel-Nukleinsäureextraktion, wurde aber für das Verfahren„zweckentfremdet“ ohne Magnetpartikel eingesetzt.
[0031] Für die Durchführung der Reaktion wurde das erfindungsgemäße raue
Kunststoffmaterial in das untere Drittel einer 1 ml-Pipettenspitze vertikale eingebracht. Die für die Bisulfitmodifizierung der DNA notwendigen Reagenzien wurden dabei teilweise aus dem kommerziell verfügbaren Kit (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)genommen.
[0032] Für die Bisulfit- Modifizierung wurde 5 pg genomische DNA mit 70 mΐ Conversion Reagent und 30 mΐ Coversion Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß gemischt und für 45 Minuten bei 85 °C und 800 rpm inkubiert.
[0033] Während der Inkubation wurde eine Deep Well-Platte mit folgenden Reagenzien befällt:
Kavität 1: 250 mΐ Ethanol
Kavität 2: 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG)
Kavität 3: 1 ml Desulfonation Buffer ( innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
Kavität 4: 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
Kavität 5: 1 ml 80 %iger Ethanol
Kavität 6: 1 ml 80 %iger Ethanol
Kavität 7: 100 mΐ Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
[0034] Der oben beschriebene Reaktionsansatz wurde nach der Inkubation in die Kavität 1 gegeben, die mit 250 mΐ 99,8 %igem Ethanol befällt war. Zu diesem Reaktionsansatz wurden weiterhin noch 5 mΐ Binding Optimizer (Analytik Jena AG) gegeben. Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren auf dem Innupure CI 6 durchgeführt.
[0035] Der Reaktionsansatz der Kavität 1 wurde mittels der erfmdungsgemäßen
Pipettenspitze durch Auf- und Abpipettieren derart durchmischt, dass die Lösung seitlich an den in der Spitze eingebrachten rauen KunststofFgranulaten vorbeiströmt. Es wurden 100 Wiederholungen durchgeführt. Bei diesem Schritt bindet die Bisulfit-modifizierte DNA an die raue KunststofFoberfläche der in der Pipettenspitze verbrachten Granulate. Nach Bindung der DNA wurde die gebundene DNA gewaschen. Dies erfolgte in der Kavität 2, welche mit einem alkoholischen WaschpuFFer (Washing Solution HS) befällt war. Gewaschen wurde durch 10- maliges AuF- und Abpipettieren.
[0036] Für die DesulFonierungsreaktion wurde die an den rauen KunststofFgranulaten gebundene DNA mit DesulFonation Buffer in Kontakt gebracht (4-maliges AuF- und Abpipettieren). Dabei wurde eine Inkubationszeit mit DesulFonation Buffer von 2 Minuten bei jedem Pipettierschritt eingehalten.
Danach wurde sukzessive in drei weiteren Kavitäten, die alkoholische WaschpuFFer (Washing Solution LS, 80 %iger Ethanol, 80 %iger Ethanol) enthielten, die an den KunststofFgranulaten gebundene DNA durch AuF- und Abpipettieren gewaschen.
[0037] Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfmdungsgemäße Spitze und die in ihr enthaltenen rauen KunststoFfgranulate durch 60-maliges AuF- und Abpipettieren von Luft getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgte durch 150-maliges AuF- und Abpipettieren mit 100 mΐ Elution Buffer, der durch das Gerät zuvor auF 50 °C temperiert worden war. Das Gesamtvolumen an Elution BuFfer betrug 100 mΐ.
[0038] Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass kommerziell verfügbare
Extraktionsautomaten für die Durchführung des erfmdungs gemäßen Verfahrens mit dem dazu korrespondierenden erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt werden können. Der zeitliche Aufwand im Vergleich zu einer Spin Säulen-basierten Extraktion ist geringer.
[0039] Um das erfindungsgemäße Verfahren mit einem kommerziell verfügbaren Produkt, welches auf der Basis von mineralischen Materialien beruht, zu vergleichen, wurde ein Bisulfitmodifizierungs Kit (Spin Filter Säulen basiert) der Firma Stratec Molecular (InviGene Bisulfite Conversion Kit) getestet. Dabei wurde die Anleitung wie im Kit-Manual beschrieben exakt eingehalten.
[0040] Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
[0041] Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real- Time-PCR-Assay als Thymine detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
[0042] Dafür wurden folgende Primer und Taq-man Sonden genutzt.
Forward Primer: 5'-CCCTTAAAAATTACAAAAACCACAA-3'
Reverse Primer: 5'- GG AGG AGGTTT AGT AAGTTTTTT G -3'
Taq-man Sonde: 5 '-F AM- ACC ACC ACCC AACACAC AAT AACAAAC ACA-BHQ- 1 -3 '
Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0, 1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ): 0, 1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA: 1,5 mΐ
PCR- Grade H20: 5,7 mΐ
[0043] Die Real-Time PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen ( 95 °C/4"; 57 °C /40" )
[0044] Die Figur 1 zeigt eine Real-Time-PCR vom ß-Actin Assay. (graue Kurven: genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; Blaue und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0045] Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit Hilfe des automatisierten Verfahrens mit dem Extraktionsautomaten InnuPure CI 6 und einem erfindungsgemäßen rauen Kunststoffmaterial modifiziert werden konnte und die recovery- Rate der modifizierten DNA deutlich besser war, als beim Vergleichsverfahren der Firma Stratec Molecular.
[0046] Der Cytosine free flagment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit- modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input- DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit-modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifikationsreaktion zur Verfügung steht.
Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit- modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisuifit-Modifikation halbiert.
[0047] Die Sequenz des Primems und Taq-man Sonde sind wie folgt. Forward Primer: 5 '-T AAG AGT AAT AATGGATGG ATG ATG-3 '
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'- F AM- ATGGATG AAGAAAGAAAGGATG AGT-BHQ- 1 -3 ' Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/mΐ) 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena) 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA 1,5 mΐ
PCR- Grade H20 5,7 mΐ
[0048] Die Real-Time PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt: Amplifikationskonditionen:
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 52 °C /40")
[0049] Die Figur 2 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No
Template Control; graue Kurven: genomische DNA; blaue und grüne Kurven Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion). Auch hier sind die Ergebnisse besser, als mit dem V ergleichs verfahren . [0050] Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-ffee primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Aufreinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt:
Forward Primer: 5 ATGGGT AAGGAT ATG AAGTT AAT-3 '
Reverse Primer: 5'- TATCACTTAATCACCTCCTAAACTA-3'
Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0, 1 mΐ
innuMix qPCR DSgreen Standard (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA: 1,5 mΐ
PCR- Grade H20: 5,8 mΐ
[0051] Die Real-Time PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt:
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 58 °C /40" )
[0052] Die Figur 3 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, grüne und blauen Kurven: Proben DNA nach
Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0053] Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mit automatisierter Durchführung mit dem InnuPure CI 6 im Vergleich mit dem Spin Filter basierten Kit der Fa. Stratec Molecular.
[0054] Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Mittel und dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, allein unter Verwendung von Standard Reagenzien, welche für die Durchführung von Bisulfitmodifizierungsreaktionen eingesetzt werden, mittels weniger Pipettierschritte mit einem Pipettierautomaten, welcher normalerweise mit Magnetpartikeln arbeitet, Bisulfit-modifizierter DNA zu binden, zu desulfonieren und aufzureinigen. Es zeigt sich, dass die Ausbeuten nahezu 100 % sind und damit im Vergleich zu kommerziellen Produkt deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden können. Ausführungsbeispiel 2: Automatisierte Bisulfitmodifizierung von DNA unter Verwendung eines KingFisher Flex Magnetpartikelprozessors und der Verwendung angerauter Plastik- Kämme
[0055] Die automatisierte Aufreinigung wurde mit dem Magnetpartikelprozessor
KingFisher Flex (ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Dieses Instrument verwendet
Kunststoffkämme, in die Magnetstäbe eindringen und die dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen, die zur Isolierung von Nukleinsäuren verwendet werden. Diese Kunststoffkämme wurden außerhalb ihres normalen Verwendungszwecks zur Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens verwendet. Das Kunststoffmaterial der Kämme ist Polypropylen. Erfindungsgemäß wurden die Kunststoffkämme mittels einer Schleifmaschine aufgeraut. Die für die Bisulfitmodifizierung der Nukleinsäuren eingesetzten Reagenzien wurden dabei teilweise aus dem kommerziellen Kit„innuCONVERT Bisulfite Basic Kit“; Analytik Jena AG, genommen. [0056] Für die Bisulfitmodifizierung wurden 5 gg genomische DNA mit 70 mΐ Conversion
Reagent und 30 mΐ Coversion Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß zusammengemischt und für 45 Minuten bei 85 °C und bei 800 rpm inkubiert. [0057] Während der Inkubation wurden die Deep Well-Platten für den Einsatz im
KingFisher Flex- Automaten mit folgenden Reagenzien befüllt:
Deep Well-Platte 1: 250 mΐ Ethanol
Deep Well-Platte 2: 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 3: 1 ml Desulfonation Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 4: 1 ml Washing Solution LS (Analytik Jena AG)
Deep Well-Platte 5: 1 ml 80 %iger Ethanol
Deep Well-Platte 6: 1 ml 80 %iger Ethanol
Deep Well-Platte 7: 100 mΐ Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG)
[0058] Der oben beschriebene Reaktionsansatz wurde nach der Inkubation in die Kavität 1 gegeben, die mit 250 mΐ 99,8 %igem Ethanol befüllt war. Zu diesem Reaktionsansatz wurden weiterhin noch 5 mΐ Binding Optimizer (Analytik Jena AG) gegeben. Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren auf dem KingFisher Flex-Automaten durchgeführt.
[0059] Der Reaktionsansatz der Kavität 1 wurde mittels der erfindungsgemäßen rauen Plastik-Kämme durch sich wiederholende Vertikalbewegungen (Ein und Auftauchen innerhalb der Deep-Well-Platten-Kavität) durchmischt. Bei diesem Schritt bindet die Bisulfit- modifizierte DNA an die raue Kunststoffoberfläche der Plastik-Kämme. Nach erfolgter Bindung der DNA wurde diese durch vertikale Bewegung des Kammes in der Kavität der Deep-Well-Platte 2 mit enthaltener Washing Solution HS (Analytik Jena AG) gewaschen
[0060] Für die Desulfonisierungsreaktion wurden die rauen Kunststoffkämme in Desulfonation Buffer für 8 Minuten vertikal langsam auf- und ab bewegt.
[0061] Danach wurde die an den rauen Kunststoffkämmen gebundene Bisulfit-modifizierte DNA sukzessive in drei weiteren Deep-Well-Platten, die alkoholische Waschpuffer (Washing Solution FS, 80 %iger Ethanol, 80 %iger Ethanol) enthielten, je für 30 Sekunden durch langsames vertikales Auf- und Abbewegen gewaschen.
[0062] Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurden die Kunststoffkämme an der Fuft für 10 Minuten getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Bisulfit- modifizierten DNA von den rauen Kunststoffkämme erfolgte durch 10 Minuten schnelle vertikale Bewegungen der Kunststoffkämme in Elution Buffer, welcher zuvor durch das Gerät auf 80 °C temperiert worden war. Das Gesamtvolumen an Elution Buffer betrug 100 mΐ.
[0063] Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass mit dem kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten KingFisher Flex allein durch die Modifizierung der Plastik- Kämme eine automatisierte Bisulfitmodifizierung von bis zu 96 Proben-DNA‘s parallel durchgeführt werden kann. Die Analyse der modifizierten DNA erfolgte wiederum mittels verschiedener Real-Time-PCR-Assays. Als Vergleichsprodukt wurde wiederum der Kit der Fa. Stratec Molecular mitgeführt (InviGene Bisulfite Conversion Kit), welcher auf der Basis mineralischer Festphasen arbeitet.
Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
[0064] Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real- Time-PCR-Assay als Thymin detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
[0065] Dafür wurden folgende Primer und Taq-man Sonden genutzt. Forward Primer: 5'-CCCTTAAAAATTACAAAAACCACAA-3'
Reverse Primer: 5'- GG AGG AGGTTT AGT AAGTTTTTT G -3'
Taq-man Sonde: 5 '-F AM- ACC ACC ACCC AACACAC AAT AACAAAC ACA-BHQ- 1 -3 '
Real-T ime-PCR- Ansatz :
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA: 1,5 mΐ
PCR- Grade H20: 5,7 mΐ
[0066] Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 57 °C /40")
[0067] Die Figur 4 zeigt eine Real-Time-PCR vom ß-Actin Assay. (graue Kurven: genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; Blaue und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0068] Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit Hilfe des automatisierten Verfahrens mit dem Extraktionsautomaten KingFisher Flex und den angerauten Plastik-Kämmen einer Bisulfitmodifizierung von DNA unterzogen werden konnte. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besser in der Performance, als das kommerziell verfügbare Vergleichsverfahren.
[0069] Der Cytosine free ffagment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit- modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit- modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifrkationsreaktion zur Verfügung steht. Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit-modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisuifit-Modifikation halbiert.
[0070] Die Sequenz der Primer und der Taq-man Sonde sind wie folgt.
Forward Primer: 5'- TAAGAGT AATAATGGATGGATGATG-3 '
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'- F AM- ATGGATG AAGAAAGAAAGGATG AGT-BHQ- 1 -3 '
Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena) 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte e bzw. genomische DNA 1,5 mΐ
PCR- Grade H20 5,7 mΐ
[0071] Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt:
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen ( 95 °C/4"; 52 °C /40" )
[0072] Die Figur 5 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No
Template Control; graue Kurven: genomische DNA; blaue und grüne Kurven Proben DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0073] Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-ffee primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Auffeinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt: Forward Primer: 5 ATGGGT AAGGAT ATG AAGTT AAT-3 '
Reverse Primer: 5'-TATCACTTAATCACCTCCTAAACTA-3'
Real-Time PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
innuMix qPCR DSgreen Standard (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA 1,5 mΐ
PCR- Grade LEO: 5,8 mΐ
Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad
durchgeführt:
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen ( 95 °C/4"; 58 °C /40" )
[0074] Die Figur 6 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, grüne und gelbe Kurven: Proben DNA nach
Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0075] Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mittels des erfindungs gemäßen Verfahrens im Vergleich zum kommerziellen Produkt.
Ausfuhrungsbeispiel 3: Manuelle Bisulfitmodifizierung mittels paramagnetischer
Kunststoffgranulate mit angerauter Oberflächenbeschaffenheit
[0076] Für die manuelle Durchführung der Bisulfitmodifizierungsreaktion mittels des erfmdungsgemäßen Verfahrens wurden 4 mechanisch angeraute paramagnetische Kunststoffgranulate in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß verbracht.
[0077] Die für die Bisulfit-Modifizierung der Nukleinsäuren eingesetzten Chemikalien wurden dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG genommen.
[0078] Für die Bisulfit-Modifizierung wurden 5 gg genomische DNA mit 70 mΐ Conversion Reagent und 30 mΐ Coversion Buffer (beide Lösungen aus dem innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß gemischt und für 45 Minuten bei 85 °C und bei 800 rpm inkubiert.
[0079] Nach erfolgter Bisulfit-Modifizierung wurde der Reaktionsansatz in das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten überfuhrt. Für die Bindung der DNA an die Kunststoffgranulate wurden 250 mΐ 99,8 %iger Ethanol und 5 mΐ Binding Optimizer (Analytik Jena AG) zugegeben und das Gefäß für 10 Minuten bei Raumtemperatur und bei 1400 rpm geschüttelt.
[0080] Nach der Inkubation wurde das 2.0 ml Reaktionsgefäß in einer Magnetfalle platziert, die paramagnetischen Granulate separiert und der Überstand entfernt
[0081] Danach erfolgte die Zugabe von 1 ml Washing Solution HS (Analytik Jena AG). Das Gefäß wurde dreimal invertiert. Dabei wurde das Reaktionsgefäß in der Magnetfalle gelassen. Danach wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten entfernt.
[0082] Danach erfolgte die Desulfonierungsreaktion der an den Kunststoffgranulaten gebundenen DNA. Dazu wurde dem 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten 1 ml Desulfonation Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten vollständig entfernt. Dazu wurde das Reaktionsgefäß in der Magnetfalle belassen.
[0083] Zu dem 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten wurde 1 ml Washing Solution C (Puffer aus innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) zugegeben und das Reaktionsgefäß dreimal invertiert. Dazu verblieb das 2.0 ml Reaktionsgefäß in der Magnetfalle. Danach wurde der Überstand von den Kunststoffgranulaten entfernt.
[0084] Es folgten drei weitere Waschschritte mit alkoholhaltigen Waschpuffem, 1 ml Washing Solution BS (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG), 1 ml 80 %iger Ethanol und 1 ml 80 %iger Ethanol.
[0085] Nach dem letzten Waschschritt wurde das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten bei 65 °C für 10 Minuten und 500 rpm mit offenem Deckel inkubiert, um den restlichen Alkohol zu entfernen.
[0086] Final wurde die Bisulfit-modifizierte DNA durch Zugabe von Elution Buffer (innuCONVERT Bisulfite Basic Kit; Analytik Jena AG) vom erfindungsgemäßen Kunststoffgranulat abgelöst. Dafür wurden 100 mΐ Elution Buffer zu den Kunststoffgranulaten gegeben und das Reaktionsgefäß für 10 Minuten bei 65 °C und bei 500 rpm inkubiert.
[0087] Das 2.0 ml Reaktionsgefäß mit den Kunststoffgranulaten wurde in einer Magnetfalle platziert, die Granulate wurden separiert und das Eluat in ein neues 2.0 Reaktionsgefäß überführt. [0088] Der Spin Filter-Säulen-basierte Extraktion Kit von der Firma Stiatec (InviGene Bisulfite Conversion Kit) wurde zum Vergleich genutzt. Dabei wurde die Anleitung wie im Kit-Manual beschrieben exakt eingehalten. [0089] Nach durchgeführten Bisulitmodifizierungsreaktionen erfolgte der Nachweis einer erfolgreichen Bisulfitmodifizierung mittels verschiedener Real-Time PCR Assays.
[0090] Ein für den Actin Beta-Genlocus spezifisches Real-Time-PCR-Assay wurde verwendet, um die Gesamtmenge an Bisulfit-modifizierter DNA zu quantifizieren. Der Actin Beta Genlocus enthält keine CpG-Stellen daher werden alle Cytosine von diesem Genlocus nach der Bisulfitmodifizierungsreaktion in Uracile umgewandelt und diese werden in Real- Time-PCR-Assay als Thymine detektiert. Mit diesem Assay wurde überprüft, ob die genomische DNA Bisulfit-modifiziert ist.
[0091 ] Dafür wurden folgende Primer und T aq-man Sonden genutzt. Forward Primer: 5'-CCCTTAAAAATTACAAAAACCACAA-3'
Reverse Primer: 5'- GG AGG AGGTTT AGT AAGTTTTTT G -3'
Taq-man Sonde: 5'-F AM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ- 1 -3 '
Real-T ime-PCR- Ansatz :
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA: 1,5 mΐ
PCR- Grade H20: 5,7 mΐ
[0092] Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time System von der Firma Biorad durchgeführt.
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 57 °C /40")
[0093] Die Figur 7 zeigt eine Real-Time-PCR vom ß-Actin Assay. (graue Kurven:
genomische DNA, magenta Kurven: No Template Control; rote und grüne Kurven-Proben DNA nach jeweiliger Bisulfitmodifizierungsreaktion). [0094] Die Ergebnisse zeigen, dass die genomische DNA erfolgreich mit der Hilfe des erfindungsgemäßen manuellen Verfahrens modifiziert werden konnte.
[0095] Der Cytosine free ffagment (CFF-1) Assay amplifiziert genomische und Bisulfit- modifizierte DNA mit gleicher Effizient und ist daher geeignet für die Quantifizierung der Ausbeute von Bisulfit- modifizierter DNA. Er ermöglicht den direkten Vergleich von Input DNA und Output-DNA der Bisulitmodifizierungsreaktion. Bei genomischer DNA dienen der sense-und der antisence-Strang als Template. Dagegen dient nur der sense-Strang bei Bisulfit-modifizierter DNA als Template, weil der antisense-Strang (enthält Cytosine) nach der Bisuifit-Modifikation nicht für die Amplifikationsreaktion zur Verfügung steht.
Deswegen hat man den theoretischen Verlust von einem Ct-Wert bei der Bisulfit- modifizierter DNA, da sich das Template nach der Bisuifit-Modifikation halbiert.
[0096] Die Sequenz der Primer und der Taq-man Sonden sind wie folgt: Forward Primer: 5 '-T AAG AGT AAT AATGGATGG ATG ATG-3 '
Reverse Primer: 5'-CCTCCCATCTCCCTTCC-3'
Taq-man Sonde: 5'-F AM-ATGGATGAAGAAAGAAAGGATGAGT-BHQ- 1 -3' Real-Time-PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
Taq-man Sonde (25 pmol/ mΐ) 0,1 mΐ
InnuMIX qPCR MasterMix Probe (Analytik Jena) 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA 1,5 mΐ
PCR- Grade H20 5,7 mΐ
[0097] Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt:
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95 °C/4"; 52 °C /40")
[0098] Die Figur 8 zeigt eine Real-Time-PCR vom CFF-1 Assay. (magenta Kurven : No Template Control; graue Kurven: genomische DNA; rote und grüne Kurven Proben-DNA nach Bisulfitmodifizierungsreaktion) . [0099] Als weitere Analyse wurde ein CFP 415 bp- Assay (Cytosine-ffee primer binding site) mit Bisulfit-modifizierter DNA durchgeführt. Da mit diesem Assay lange DNA-Sequenz amplifiziert wird, liefert dieses Assay Information über die abgebaute DNA während der Bisulfit-Modifizierung und während der Aufreinigung von Bisulfit-modifizierter DNA. Die Sequenzen von den Primern sind wie folgt:
Forward Primer: 5 ATGGGT AAGGAT ATG AAGTT AAT-3 '
Reverse Primer: 5'-TATCACTTAATCACCTCCTAAACTA-3'
Real-Time-PCR Ansatz:
Forward Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
Reverse Primer (50 pmol/ mΐ): 0,1 mΐ
innuMix qPCR DSgreen Standard (Analytik Jena): 7,5 mΐ
Bisulfit- modifizierte bzw. genomische DNA 1,5 mΐ
PCR- Grade H20: 5,8 mΐ
[0100] Die Real-Time-PCR wurde im CFX96 Real-Time-System von der Firma Biorad durchgeführt:
Amplifikationskonditionen :
Schritt 1: Denaturierung 95 °C/120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen (95°C/4"; 58 °C /40")
[0101] Die Figur 9 zeigt eine Real-Time-PCR des CFP 415 bp- Assay. (magenta Kurven: No Template Control, rote und grüne Kurven: Proben DNA nach
Bisulfitmodifizierungsreaktion).
[0102] Die Ergebnisse zeigen weniger abgebaute DNA nach der Bisulfit-Modifizierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum kommerziellen Produkt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure durch Bisulfitbehandlung in eine Uracilbase, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure nach der Bisulfitbehandlung und einer Inkubation an eine nicht-mineralische feste Phase gebunden ist, die eine raue Oberfläche aufweist.
2. V erfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die raue Oberfläche aus Metall, Kunststoff oder Gummi, vorzugsweise aus Kunststoffgranulat besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kunststoffgranulat mit rauer Oberfläche paramagnetisch ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die raue Oberfläche durch 3 -D-Druck erzeugt wurde .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die feste Phase mit rauer Oberfläche innerhalb einer Pipettenspitze befindet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die feste
Phase mit rauer Oberfläche den unteren Teil eines Kunststoff-Kamms darstellt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Mischen der Nukleinsäure mit einer Bisulfit-Lösung und nachfolgende Inkubation des Reaktionsansatzes
b) Zugabe eines Bindungspuffers und Anbindung an die feste Phase mit rauer Oberfläche c) Inkubation und Entfernung des Überstands von der festen Phase
d) Waschen mittels eines Waschpuffers und anschließendes Entfernen des Waschpuffers e) Zugabe eines Desulfonierungspuffers und Inkubation, anschließende Entfernung des Überstands von der festen Phase
f) Waschen, Trocknen und Ablösen der modifizierten Nukleinsäure von der festen Phase.
8. Automatisiertes Verfahren nach dem„walk-away-Prinzip“ nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte 7a) bis 7f) innerhalb einer Pipettenspitze oder an dem unteren Teil eines Kunststoff-Kamms durchgeführt werden.
9. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend:
• eine feste Phase mit rauer Oberfläche
• eine Bisulfit-Lösung
• einen Bindungspuffer
• einen Desulfonierungspuffer
• mindestens einen Waschpuffer
• einen Ablösepuffer
• ein Gefäß zur Durchführung
10. Verwendung einer nicht-mineralischen festen Phase mit rauer Oberfläche zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure durch Bisulfitbehandlung in eine Uracilbase.
EP20750595.9A 2019-07-07 2020-07-07 Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna Withdrawn EP3994277A1 (de)

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