EP3921407A1 - Cellule, notamment levure, résistante au phloroglucinol - Google Patents

Cellule, notamment levure, résistante au phloroglucinol

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Publication number
EP3921407A1
EP3921407A1 EP20709646.2A EP20709646A EP3921407A1 EP 3921407 A1 EP3921407 A1 EP 3921407A1 EP 20709646 A EP20709646 A EP 20709646A EP 3921407 A1 EP3921407 A1 EP 3921407A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
phloroglucinol
host cell
nucleic acid
seqid
identity
Prior art date
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Pending
Application number
EP20709646.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Odile Ramaen
Vincent LAFAQUIERE
Dominique Louis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA
Original Assignee
Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA
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Filing date
Publication date
Application filed by Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA filed Critical Compagnie Generale des Etablissements Michelin SCA
Publication of EP3921407A1 publication Critical patent/EP3921407A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention lies in the fields of cellular biochemistry and more particularly in the field of the synthesis of phloroglucinol by living cells, preferably recombinant host cells. It concerns the use of (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily, or (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily, or else (iii) transmembrane transporters of the MFS family, in particular the use of such transporters or transcription factors derived from yeasts, more particularly from Saccharomyces yeasts, to confer resistance to phloroglucinol.
  • Phloroglucinol or benzene-1,3,5-triol is an aromatic organic compound, used in the synthesis of many pharmaceuticals and also explosives. Given the wide field of application of phloroglucinol, manufacturers are always looking for means and tools to produce this compound in large quantities in an economically profitable system. To this end, certain challenges remain to be overcome, in particular because one of the main difficulties to be overcome lies in the fact that phloroglucinol has antibiotic properties and that it is thus complicated to set up an industrial in vivo production system. high yield.
  • Pdr5 and Yorl showing a wide specificity of substrates (Mahé, 1996).
  • Some members of the PDR subfamily such as PdrlOp and Pdrl5p are also linked to the general stress response (Wolfger, 2004).
  • Pdrl2p plays an essential role in the response and adaptation to adverse conditions (stress) (Piper, 1998).
  • MFS are also transmembrane proteins involved in the transport of molecules (oligosaccharides, xenobiotics, amino acids) using chemiosmotic concentration gradients (Marger, 1993).
  • MFS transporters can be divided into three main groups, depending on the mode of transport: uniport transporters which allow movement in one direction of a single molecule or ion across the membrane; symport transporters which allow the movement in the same direction of two different molecules or of a molecule and of a coupling ion (typically protons) through the membrane; and antiport transporters which allow the movement in an opposite direction of two molecules or of a molecule and an ion through the membrane, so that the binding of one depends on the prior release of the other ( Forrest, 2011).
  • MFS are classified into 74 subfamilies based on phylogenetic analysis, substrate specificity, and mode of transport. Substrate specificity is essentially determined by the side chains of amino acid residues lining the central cavity carved out by the transporter in the lipid bilayer of the membrane (Yan, 2013).
  • transmembrane transporters of the ABC family in particular of transmembrane transporters of the PDR subfamily, or (ii) of transcription factors controlling the expression of transporters.
  • transmembrane carriers of the PDR subfamily or (iii) transmembrane transporters of the MFS family, in particular of the proteins SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 or ATR1 and in particular of the SNQ2 membrane transporter, on resistance to phloroglucinol in yeasts, in particular yeasts of the Saccharomyces type, in particular yeasts of the Saccharomyces cerevisiae type.
  • transmembrane transporters of the ABC family in particular of transmembrane transporters of the PDR subfamily, or (ii) of transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily, or else (iii) of transmembrane transporters of the MFS family, in a living cell, made it possible to increase its resistance to phloroglucinol.
  • the first subject of the invention therefore relates to a living cell, preferably a host cell, resistant to phloroglucinol, characterized in that it is resistant to a concentration of phloroglucinol, in its culture medium, greater than or equal to 1 gL 1 .
  • said living cell preferably said host cell, overexpresses at least one membrane transporter, or at least one transcription factor controlling the expression of said membrane transporter, in particular chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1 and preferably the transporter SNQ2.
  • the invention also relates to a method for obtaining a recombinant host cell resistant to phloroglucinol comprising at least the steps of:
  • nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from membrane transporters of the ABC family, preferably of the PDR subfamily, and membrane transporters of the MFS family, or comprises a nucleic acid sequence encoding a transcription factor controlling the expression of a membrane transporter of the PDR subfamily, ii. cloning of said nucleic acid molecule provided in step (i) into a vector capable of allowing its integration and / or expression in said host cell, and
  • step (iii) bringing said host cell and said vector obtained in step (ii) into contact so that the latter is transfected with said vector and said host cell expresses said nucleic acid molecule, said host cell thus being resistant to phloroglucinol.
  • the present invention also relates to a method for producing phloroglucinol comprising at least the steps:
  • step (iii) incubation of the mixture obtained in step (ii) under conditions suitable for producing phloroglucinol
  • Figure 1 Growth kinetics of the bacterial strain ECAO50, derived from Escherichia coli K12 in the presence of increasing concentrations of phloroglucinol.
  • Figure 2 Growth kinetics of the yeast strain S. cerevisiae CC787-1B in the presence of increasing concentrations of phloroglucinol.
  • Figure 3A Toxicity of phloroglucinol in yeasts.
  • Figure 3B Toxicity of phloroglucinol in yeasts in the presence of ethanol added after 20 h of culture.
  • Figure 4A structure of the cluster integrated into the yeast genome at the JLP1 locus, the gene encoding the transporter of the PDR subfamily or the transcription factor controlling the expression of a transporter of the PDR subfamily being under control of the pCCW12 promoter.
  • Figure 4B For each gene, a strain was constructed bearing the number YA and two independent clones were kept for analyzes.
  • FIG. 5 Effect of overexpression of PDRs on the toxicity of phloroglucinol (20 gL 1 ).
  • the graph indicates the OD 60 0 nm at 24 h of the cultures of the different strains each overexpressing a different PDR transporter or a transcription factor regulating the expression of a different PDR transporter, in the absence or in the presence of 20 gL 1 of phloroglucinol.
  • FIG. 6A Structure of the cluster integrated into the yeast genome at the JLP1 locus, the gene encoding the transporter of the MFS family being under the control of the pCCW12 promoter.
  • Figure 6B For each transporter, a strain was constructed bearing the number YA and two independent clones were kept for analyzes.
  • Figure 7 Effect of MFS overexpression on the toxicity of phloroglucinol (20 gL-1). The graph indicates the OD 60 0 nm at 24 h of the cultures of the different strains each overexpressing a different PDR transporter in the absence or in the presence of 20 gL 1 of phloroglucinol.
  • phloroglucinol synthase is meant a multifunctional enzyme or an enzymatic complex belonging to the family of type III polyketide synthases and catalyzing the synthesis of phloroglucinol.
  • a phloroglucinol synthase catalyzes the condensation of three molecules of malonyl-CoA to form a molecule of phloroglucinol.
  • type III polyketide synthase is meant a multifunctional enzyme or an enzymatic complex producing polyketides and which does not use an acyl carrier protein domain (or ACP, for “acyl carrier protein”).
  • polyketide is meant a large family of secondary metabolites in bacteria, fungi, plants and certain lines of animals which result from the iterative condensation of acetyl or malonyl subunits by polyketide synthase enzymes. Polyketides are also used as raw materials for the manufacture of a wide range of natural and semi-synthetic products.
  • enzyme activity or “catalytic activity” or even “activity” of an enzyme is understood to mean the efficiency of an enzyme in converting a substrate into a product in a given environment.
  • the efficiency of the enzyme here takes into account the rate of conversion of the substrate into product by the enzyme and the rate of conversion of the substrate into product by the enzyme.
  • rate of conversion of the substrate into product by the enzyme here means the ratio between the quantity of final product obtained relative to the initial quantity of substrate for a defined quantity of enzyme.
  • an enzymatic activity within the meaning of the invention can be expressed as an amount of phloroglucinol produced in a given volume (in g / L or gL 1 ).
  • bacteria is meant a microscopic and prokaryotic organism present in a given medium.
  • nucleic acid molecule is meant a polymer of any length of deoxyribonucleic acid (DNA), or polydeoxyribonucleotides, including in particular complementary DNAs or cDNAs, genomic DNAs, plasmids, vectors, genomes. virals, isolated DNA, probes, primers, and any mixture thereof; or a polymer of any length of ribonucleic acid (RNA), or polyribonucleotides, including in particular messenger RNA or mRNA, antisense RNA; or mixed polyribo-polydeoxyribonucleotides. They encompass single or double-stranded, linear or circular, natural or synthetic polynucleotides. Additionally, a polynucleotide can include unnatural nucleotides and can be interrupted by non-nucleotide components.
  • nucleic acid In the context of the present invention, the terms “nucleic acid”, “nucleic acid molecule”, “polynucleotide” and “nucleotide sequence” are used interchangeably.
  • isolated or isolated is meant a molecule, in particular a protein, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid molecule, a plasmid vector, a viral vector or a host cell, which is extracted from its natural environment (i.e. 'that is to say separated from at least one other component with which it is naturally associated).
  • polypeptide polymers of amino acid residues which comprise at least nine amino acids linked by peptide bonds.
  • the polymer can be linear, branched or cyclic.
  • the polymer can comprise natural amino acids and / or amino acid analogues and it can be interrupted by non-amino acid residues.
  • the polymer of amino acids contains more than 50 amino acid residues, it is preferably called a polypeptide or a protein, whereas if the polymer consists of 50 amino acids or less, it is preferably referred to as a peptide.
  • vector is meant a vehicle, preferably a nucleic acid molecule or a viral particle, which contains the elements necessary to allow the administration, propagation and / or expression of one or more molecule (s). ) nucleic acids in a host cell or organism.
  • this term encompasses vectors for maintenance (cloning vectors), vectors for expression in various host cells or organisms (expression vectors), extrachromosomal vectors (eg multicopy plasmids ) or integration vectors (eg designed to integrate into the genome of a host cell and produce additional copies of the nucleic acid molecule it contains when the host cell replicates).
  • This term also encompasses shuttle vectors (e.g., functioning in both prokaryotic and / or eukaryotic hosts) and transfer vectors (e.g., for the transfer of nucleic acid molecule (s) into the genome of a. host cell).
  • vectors can be natural, synthetic or artificial genetic sources, or a combination of natural and artificial genetic elements.
  • vectors should be understood broadly to include plasmid (or plasmid) and viral vectors.
  • Plasmid refers to a replicable DNA construct.
  • plasmid vectors contain selection marker genes which allow host cells carrying the plasmid to be identified and / or selected positively or negatively in the presence of the compound corresponding to the selection marker.
  • selection marker genes A variety of positive and negative selection marker genes are known in the art.
  • a antibiotic resistance gene can be used as a positive selectable marker gene for selecting a host cell in the presence of the corresponding antibiotic.
  • viral vector refers to a nucleic acid vector which comprises at least one element of a virus genome and can be packaged in a viral particle.
  • Viral vectors can be replication competent or selective (eg, designed to replicate better or selectively in specific host cells), or can be genetically deactivated so as to be defective or deficient for replication.
  • living cell is understood to mean a wild-type cell, that is to say a cell existing in the natural state and not genetically modified by humans, or a cell of the recombinant type, that is to say - say genetically modified by humans. In the latter case, we will preferably speak of a host cell.
  • a living cell can be made up of a single type of cell or a group of different types of cells.
  • the living cell can belong to cultured cell lines, to primary cells, to stem cells or to proliferative cells.
  • the term “living cells” includes prokaryotic cells, bacteria or cyanobacteria, eukaryotic cells such as yeast cells, fungal cells, algae cells, insect cells, mammalian plants and cells (eg human or non-human, preferably non-human).
  • host cell is meant a cell containing at least one exogenous nucleic acid molecule.
  • the host cell has resistance to the toxicity induced by phloroglucinol.
  • the host cell is capable of expressing or overexpressing a polypeptide encoding an enzyme involved in the biosynthesis of phloroglucinol, preferably a polypeptide with phloroglucinol synthase activity, more preferably a polypeptide encoding a type III polyketide synthase and is thus capable of synthesizing phloroglucinol.
  • host cell more broadly includes cells which contain or have contained the nucleic acid molecule, as well as the progeny of such cells.
  • the host cell can for example be isolated or organized into tissue, organ or even be within a whole organism. In the case where the host cell is within a whole organism, said organism is not human.
  • a “host cell” is a recombinant host cell, i.e., a cell harboring exogenous genetic material.
  • a host cell is not a cell which exists in the natural state but is a molecular biology tool obtained by the techniques of genetic manipulation.
  • exogenous genetic material or sequence is understood to mean that said genetic material or said sequence originates from another organism, whether or not belonging to the same cell line.
  • transfected or “transfection” is meant the introduction of exogenous genetic material into eukaryotic cells, in particular those of the invention.
  • transformed or “transformation” is meant the introduction of exogenous genetic material into prokaryotic cells, in particular those of the invention.
  • transfection and “transformation” are equivalent and can be used interchangeably.
  • identity is meant an exact correspondence of sequence between two polypeptides, between two proteins, between two peptides or two molecules of amino acids.
  • the "percentage identity” between two sequences is a function of the number of identical residues common to the two sequences, and takes into account the number of intervals which must be introduced for one. optimal alignment and length of each interval.
  • Various computer programs and mathematical algorithms are available in the state of the art for determining the percentage identity between amino acid sequences, such as for example the Blast program available on the NCBI or ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff (ed.), 1981, Suppl. 3482-489).
  • nucleotide sequences Programs for determining homology between nucleotide sequences are also available in a specialized database (eg Genbank, Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FASTA, and GAP programs).
  • "at least 80% sequence identity” as used herein represents 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
  • the first subject of the invention therefore relates to a living cell, preferably a host cell, resistant to phloroglucinol, characterized in that it is resistant to a concentration of phloroglucinol, in its culture medium, greater than or equal to 1 gL 1 .
  • resistant to phloroglucinol is meant a living cell, preferably a host cell, which is not sensitive to the toxicity induced by phloroglucinol.
  • This living cell preferably this host cell, is thus capable of living, growing and multiplying despite the presence of phloroglucinol in its culture medium, in particular despite a phloroglucinol concentration of at least 1 gL 1 in its culture medium.
  • said living cell and preferably said host cell, is resistant to phloroglucinol if it is capable of living, growing and multiplying in the presence of a phloroglucinol concentration in its culture medium greater than or equal to 1 gL 1 , preferably greater than or equal to 2.5 gL 1 , preferably greater than or equal to 5 gL 1 , preferably greater than or equal to 7.5 gL 1 , preferably greater than or equal to 10 gL 1 , and even more preferably greater or equal to 15 gL 1 .
  • said living cell preferably said host cell, is resistant to phloroglucinol if it is capable of living, growing and multiplying in the presence of a phloroglucinol concentration in its culture medium greater than or equal to 20 gL 1 .
  • the resistance to phloroglucinol of a living cell preferably of a host cell, can be measured by any suitable method known to those skilled in the art, in particular by the method described in Example 1.
  • said living cell preferably said host cell, is a microorganism selected from bacteria, yeasts, fungi, algae, cyanobacteria, preferably a yeast, said yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida , Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus and Malassezia; more particularly among the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii,
  • the inventors have been able to demonstrate that some of the transporters of the ABC family, and in particular certain transporters of the PDR subfamily, as well as certain transporters of the MFS family, are capable of conferring resistance on the cell. alive with respect to the toxicity induced by phloroglucinol. Furthermore, certain transcription factors involved in the regulation of said transporters are also capable of conferring resistance to the living cell with respect to the toxicity induced by phloroglucinol.
  • the present invention relates to a host cell characterized in that it overexpresses at least one membrane transporter, or at least one transcription factor controlling the expression of said membrane transporter.
  • transporters of interest identified in the context of the present invention mention may in particular be made of the transporters of the PDR subfamily: PDR5, SNQ2, PDR10, PDR11, PDR12, PDR15, PDR18, ADP1, AUS1, STE6, YOL075C and YOR1.
  • the transcription factors of interest identified in the context of the present invention mention may in particular be made of PDR1 and PDR3 which are involved in the regulation of the expression of transporters of the PDR subfamily.
  • said host cell is characterized in that said membrane transporter or said transcription factor controlling its expression belongs to the family of ABC transporters and preferably to the PDR subfamily.
  • transporters of interest identified in the context of the present invention, there may also be mentioned the transporters of the MFS subfamily, in particular AQR1, DTR1, FLR1, HOL1, QDR1, QDR2, QDR3, TP01, TP02, TP03, TP04, YHK8, AT RI, GEX1, AZR1, SGE1, SIT1, ENB1 and GEX2.
  • said host cell is characterized in that said membrane transporter belongs to the family of MFS transporters.
  • the invention therefore also relates to a host cell resistant to phloroglucinol characterized in that it overexpresses at least one transporter or one transcription factor chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1.
  • said host cell is characterized in that it overexpresses the SNQ2 transporter.
  • the PDR transporters, the transcription factors regulating the expression of the PDR transporters, and the MFS transporters, in particular SNQ2 can be derived from any organism having a sequence encoding said transporters or transcription factors.
  • the PDR transporters, the transcription factors regulating the expression of the PDR transporters, and the MFS transporters are derived from yeasts, which yeasts are in particular selected from yeasts of the genus Saccharomyces, and more particularly from among the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces baiiii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius glasporaporata gluyensomyces, Kluyensporomyces and themporata gluyensomyces, Brettanomycces Torulasporata gluyens even more particularly, said yeasts being of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • said host cell resistant to phloroglucinol is a yeast, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae, characterized in that it overexpresses the SNQ2 transporter.
  • said host cell resistant to phloroglucinol is a yeast, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae characterized in that it overexpresses a polypeptide comprising at least one amino acid sequence having at least 70%, of preferably at least 80% identity with SEQ ID NO 2.
  • said host cell resistant to phloroglucinol is a yeast, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae, characterized in that it overexpresses the SNQ2 transporter of Saccharomyces cerevisiae of sequence SEQ ID NO 2.
  • the present invention uses isolated polypeptides chosen from (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily, or (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the subfamily.
  • transmembrane transporters of the MFS family in particular from (i) transmembrane transporters of the ABC family of yeasts, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily of yeasts, or (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily yeasts, or else (iii) transmembrane transporters of the MFS family of yeasts, in particular those of Saccharomyces yeasts, more particularly still of the Saccharomyces cerevisiae species.
  • the present invention uses isolated polypeptides chosen from (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily, or (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the subfamily.
  • transmembrane transporters of the MFS family in particular from (i) transmembrane transporters of the ABC family of yeasts, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily of yeasts, or (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily of yeasts, or else (iii) transmembrane transporters of the MFS family of yeasts, in particular those of Saccharomyces yeasts, more particularly of the Saccharomyces cerevisiae species, as means for reducing the in vivo toxicity of phloroglucinol.
  • said polypeptide comprises at least one amino acid sequence having at least 70% identity with a sequence chosen from SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 27, SEQID NO 28, SEQID NO 29, SEQID NO 30 , SEQID NO 31, SEQID NO 32 and SEQID NO 33.
  • said polypeptide is chosen from yeast PDR transporters, transcription factors regulating the expression of yeast PDR transporters, and yeast MFS transporters, said yeast being in particular selected from yeasts of the genus Saccharomyces, and so more particularly among the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomyccomycces and intermediabreasporosa glasporosa, Klettanomyccomycces and themulasporosa, Klimasporosa; even more particularly, said yeast being of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • said polypeptide comprises at least one amino acid sequence having preferably at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, more preferably at least 80% identity , still more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, even more preferably at less 96% identity, more preferably at least 97% identity, still more preferably at least 98% identity, even more preferably at least 99% identity, most preferably 100 % identity with a sequence chosen from SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 11,
  • said polypeptide comprises at least one amino acid sequence chosen from SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 and SEQID NO 27.
  • the isolated polypeptide capable of conferring resistance to the living cell against the toxicity induced by phloroglucinol has an amino acid sequence having preferably at least 70% identity, of more preferably at least 75% identity, more preferably at least 80% identity, even more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, so more preferably still at least 95% identity, even more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, still more preferably at least 98% identity, so even more preferably at least 99% identity, most preferably 100% identity with SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19 , SEQID NO 26 or SEQID NO 27.
  • the isolated polypeptide capable of to confer resistance on the living cell to the toxicity induced by phloroglucinol has an amino acid sequence preferably having at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, of more preferably at least 80% identity, even more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, even more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, even more preferably at least 98% identity, even more preferably at least 99% identity, most preferably 100% identity with SEQ ID NO 2.
  • the present invention uses isolated nucleic acid molecules encoding at least one polypeptide chosen from transporters of the PDR subfamily, transcription factors controlling the expression of transporters of the PDR subfamily, and transporters of the PDR family.
  • MFS in particular those of yeasts, in particular those of Saccharomyces yeasts, more particularly those of Saccharomyces cerevisiae.
  • said polypeptide is as defined above.
  • the present invention uses isolated nucleic acid molecules encoding at least one isolated polypeptide chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and AT RI, and preferably SNQ2.
  • the present invention therefore uses isolated nucleic acid molecules encoding at least one isolated polypeptide having an amino acid sequence chosen from SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 and SEQID NO 27, preferably SEQID NO 2.
  • the present invention uses isolated nucleic acid molecules encoding at least one isolated polypeptide whose amino acid sequence is preferably at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, more preferably at least 80% identity, still more preferably at least 85% identity, still more preferably in less 90% identity, more preferably still at least 95% identity, even more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, even more preferably in less 98% identity, even more preferably at least 99% identity, most preferably 100% identity with SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 or SEQID NO 27, preferably SEQID NO 2.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises a promoter controlling the expression of at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide as defined above.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the subfamily PDR, (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily, and (iii) transmembrane transporters of the MFS family, as defined above and further comprises a promoter controlling expression of at least one, preferably of said, nucleic acid sequence.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YFIK8 and ATR1, preferably SNQ2, and further comprises a promoter controlling the expression of at least one, preferably of said, nucleic acid sequence.
  • the promoter is an exogenous promoter, in particular a yeast promoter, preferably a promoter chosen from ADFI2 (pADFI2) and CCW12 (pCCW12), more preferably a promoter chosen from ADFI2 (pADFI2) of Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) and CCW12 (pCCW12) of S. cerevisiae, more preferably the CCW12 promoter of SEQ ID NO 34.
  • a yeast promoter preferably a promoter chosen from ADFI2 (pADFI2) and CCW12 (pCCW12), more preferably a promoter chosen from ADFI2 (pADFI2) of Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) and CCW12 (pCCW12) of S. cerevisiae, more preferably the CCW12 promoter of SEQ ID NO 34.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises a transcription terminator of at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide as defined above.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the subfamily PDR, (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily, and (iii) transmembrane transporters of the MFS family, as defined above and further comprises a terminator controlling expression of at least one, preferably of said, nucleic acid sequence.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YFIK8 and ATR1, preferably SNQ2, and further comprises a terminator controlling the expression of at least one, preferably of said, nucleic acid sequence.
  • the terminator is an exogenous terminator, in particular a yeast terminator, preferably the RPL3 terminator (tRPL15A), more preferably the RPL15A terminator of S. cerevisiae, more preferably the RPL15A terminator of SEQ ID NO 35.
  • a yeast terminator preferably the RPL3 terminator (tRPL15A)
  • RPL15A terminator of S. cerevisiae more preferably the RPL15A terminator of SEQ ID NO 35.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises both a promoter and a terminator which are as defined above.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one sequence of acids nucleic acids encoding a polypeptide chosen from (i) transmembrane transporters of the ABC family, in particular transmembrane transporters of the PDR subfamily, (ii) transcription factors controlling the expression of transmembrane transporters of the PDR subfamily, and (iii) transmembrane transporters of the MFS family, as defined above and further comprises a promoter and a terminator controlling the expression of at least one, preferably of said, nucleic acid sequence.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1, preferably SNQ2, and further comprises a promoter and a terminator controlling the expression of said at least one nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid molecule is isolated from homologous strains, in culture, in particular from strains selected from yeasts of the Saccharomyces genus, preferably chosen from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa and Torulaspora glabrata; still more particularly, the yeast of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the nucleic acid molecule is isolated from a vector or a host cell comprising said molecule, said vector or said host cell being as defined above and that described below under "Host Cells" or "Vectors”.
  • the isolated nucleic acid molecule is synthesized in vitro by nucleic synthesis techniques that a person skilled in the art knows perfectly well or will know how to determine without difficulty from his general knowledge.
  • the isolated nucleic acid molecule is recombinant.
  • the present invention uses vectors comprising at least one nucleic acid molecule as defined above.
  • the vector is a plasmid.
  • Suitable vectors within the scope of the present invention include, without limitation, bacteriophage, plasmid, or cosmid vectors for expression in prokaryotic host cells such as bacteria (eg, E. coli, or bacteria of the genus Pseudomonas); vectors for expression in yeast (eg Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), ⁇ baculovirus vectors for expression in insect cell systems (eg, Sf 9 cells); viral and plasmid vectors for expression in plant cell systems (eg, Ti plasmid, cauliflower mosaic virus, CaMV, tobacco mosaic virus TMV); as well as viral and plasmid vectors for expression in higher eukaryotic cells or organisms.
  • bacteria eg, E. coli, or bacteria of the genus Pseudomonas
  • yeast eg Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe,
  • the vectors suitable in the context of the present invention may be of the integrative type or of the replicative type.
  • the vectors of integrative type do not have a so-called “origin of replication” sequence and must therefore be integrated directly into the genome of the host cell in order to be expressed.
  • This integration can be done using dedicated genetic tools that are well known to those skilled in the art. By way of nonlimiting example, this integration can be done by homologous recombination or else via the CRE-LOX recombination system.
  • Replicative-type vectors have an autonomous origin of replication. These vectors therefore replicate from independent of the host cell genome. Thus, unlike integrative vectors, replicative vectors do not need to be integrated into the genome of the host cell.
  • vectors are generally available commercially (eg, from vendors such as Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc.), available from depository institutions such as American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.) , or have been the subject of numerous publications describing their sequence, their structures and their production methods, so that those skilled in the art can apply them without difficulty.
  • plasmid vectors include, without limitation, pREP4, pCEP4, (Invitrogen), pCI (Promega), pYES2 (ThermoFisher) and pgWiz (Gene Therapy System Inc).
  • the present invention relates to host cells resistant to phloroglucinol because they comprise at least one nucleic acid molecule or at least one vector as defined above.
  • said host cell may be a prokaryotic cell, a lower eukaryotic cell such as a yeast cell, and another eukaryotic cell such as an insect cell, a plant cell and a mammalian cell (e.g. human or non-human example, preferably non-human).
  • a prokaryotic cell such as a yeast cell
  • another eukaryotic cell such as an insect cell, a plant cell and a mammalian cell (e.g. human or non-human example, preferably non-human).
  • the host cell is a microorganism selected from bacteria, yeasts, fungi, algae and cyanobacteria.
  • the host cell is preferably a yeast, said yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettocomyccus and Malassezia.
  • yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettocomyccus and Malassezia.
  • the yeast is selected from the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomyccesomycesomeresporesporesporesporosa, Brettanomyccesomyccesoleresporespora and globasporcesporosa, Brettanomycces Torccaveraerosa, Dekkera intermedia, Brettanomyccesomyccesomyverespora and intermedia .
  • the yeast is of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the host cell comprises at least one copy of the nucleic acid molecule as defined above integrated into its genome.
  • the host cell comprises a single copy of the nucleic acid molecule as defined above integrated into its genome.
  • the present invention relates to a host cell comprising at least one copy of a nucleic acid molecule encoding a polypeptide chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1, and preferably SNQ2 .
  • the present invention relates to a host cell comprising at least one copy of a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having an amino acid sequence chosen from SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 and SEQID NO 27, preferably SEQID NO 2.
  • the present invention relates to a host cell comprising at least one copy of a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having an amino acid sequence preferably having at least 70% identity, preferably still at least 75% identity, more preferably at least 80% identity, still more more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, even more preferably at least 96% identity, of more preferably at least 97% identity, even more preferably at least 98% identity, even more preferably at least 99% identity, most preferably 100% identity with SEQID NO 2 , SEQID NO 10,
  • SEQ ID NO 14 SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 or SEQID NO 27, preferably SEQID NO 2.
  • the copy or copies of the nucleic acid molecule can be integrated at different loci, preferably at the URA3 locus, at the JLP1 locus, at the LEU2 locus, at the locus SAM2, at the MET14 locus, and / or at the TRP1 locus of the genome of said yeast cell.
  • the different copies can be integrated at the same locus, or else at different loci, preferably at any one of the combinations of the UR loci A3, JLP1, LEU2, SAM2, MET14 and / or TRP1.
  • the copy (s) of the nucleic acid molecule is (are) integrated at the JLP1 locus.
  • the codons used in the nucleic acid molecule have been adapted for optimal expression in the selected host cell.
  • Optimal expression can in particular be obtained when the codons chosen are those used preferentially by the organism of origin of the host cell.
  • the codons used in a preferential manner are known for most of the organisms commonly used in the field. Those skilled in the art will easily be able to determine the most advantageous codons to use depending on the host cell chosen.
  • codons of the nucleic acid molecule can be modified, for example, by site-directed mutagenesis in vitro from a sample of the nucleic acid molecule whose codons are to be adapted, using amplification by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid molecule can be synthesized in vitro directly with the optimized codons.
  • the host cells can be cultured in aerobic or anaerobic bioreactors, on a small and large scale, in flasks or petri dishes. Culture can be carried out at a temperature, pH, culture medium and oxygen content appropriate for a given host cell.
  • the host cells as described above can be cultured in media comprising high concentrations of phloroglucinol, in particular concentrations greater than or equal to 1 gL 1 , preferably greater than or equal to 2.5 gL 1 , preferably greater than or equal to to 5 gL 1 , preferably greater than or equal to 7.5 gL 1 , preferably greater than or equal to 10 gL 1 , preferably greater than or equal to 15 gL 1 , and more preferably greater than or equal to 20 gL 1 .
  • concentrations greater than or equal to 1 gL 1 preferably greater than or equal to 2.5 gL 1 , preferably greater than or equal to 5 gL 1 , preferably greater than or equal to 7.5 gL 1 , preferably greater than or equal to 10 gL 1 , preferably greater than or equal to 15 gL 1 , and more preferably greater than or equal to 20 gL 1 .
  • the host cell comprises at least one copy of a nucleic acid molecule encoding a polypeptide of which an amino acid sequence has at least 70% identity, more preferably at least. 75% identity, more preferably at least 80% identity, even more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at less 95% identity, even more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, more preferably at least 98% identity, still more preferably at least 98% identity less 99% identity, of most preferably 100% identity with SEQID NO 2.
  • This host cell exhibits resistance to phloroglucinol; it can in particular be cultivated in media comprising high concentrations of phloroglucinol, in particular a concentration of phloroglucinol greater than or equal to 20 gL 1 .
  • the host cell comprises at least one copy of a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having the amino acid sequence of the membrane transporter of the PDR subfamily: SNQ2.
  • This host cell exhibits resistance to phloroglucinol; it can in particular be cultivated in media comprising high concentrations of phloroglucinol, in particular a concentration of phloroglucinol greater than or equal to 20 gL 1 .
  • the invention relates to a living cell, or respectively a host cell as defined above, characterized in that it expresses, respectively overexpresses, at least one enzyme involved in the biosynthesis of phloroglucinol, of preferably at least one type III polyketide synthase, more preferably at least one phloroglucinol synthase.
  • any known sequence encoding a type III polyketide synthase preferably any known sequence encoding a phloroglucinol synthase, in particular that encoded by the PHLD gene in Pseudomonas fluorescens (Achkar et al., 2005; Zha et al., 2006) or that encoded by the PKS1 gene in Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013). It is also possible to use the sequences described in international patent applications WO 2019/002798 and WO 2019/002799.
  • the present invention further relates to a method of obtaining a host cell resistant to phloroglucinol.
  • the process for obtaining a recombinant host cell resistant to phloroglucinol comprising at least the steps of:
  • nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from membrane transporters of the ABC family, preferably of the PDR subfamily, and membrane transporters of the MFS family, or comprising at least one nucleic acid sequence encoding a transcription factor controlling the expression of a membrane transporter of the PDR subfamily, ii. cloning of said nucleic acid molecule provided in step (i) into a vector capable of allowing the integration and / or expression of said molecule in said host cell, and iii. bringing said host cell and said vector obtained in step (ii) into contact so that the latter is transfected with said vector and said host cell expresses said nucleic acid molecule, said host cell thus being resistant to phloroglucinol.
  • said polypeptide provided in step (i) is chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1.
  • said polypeptide provided in step (i) is SNQ2.
  • said polypeptide provided in step (i) comprises at least one amino acid sequence having at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, even more preferably. at least 80% identity, so again more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, even more preferably at least 96% identity, of more preferably at least 97% identity, even more preferably at least 98% identity, even more preferably at least 99% identity, most preferably 100% identity with SEQ ID NO 2.
  • said nucleic acid molecule is not integrated in step (iii) into the genome of said host cell.
  • said nucleic acid molecule is integrated in step (iii) into the genome of said host cell.
  • the method for obtaining a recombinant host cell resistant to phloroglucinol is characterized in that said host cell further overexpresses at least one enzyme involved in the biosynthesis of phloroglucinol, preferably a type III polyketide synthase, more more preferably at least one phloroglucinol synthase.
  • the process for obtaining a recombinant host cell resistant to phloroglucinol comprising at least the steps of:
  • nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid sequence encoding a polypeptide chosen from membrane transporters of the ABC family, preferably of the PDR subfamily, and membrane transporters of the MFS family, or comprises at least one nucleic acid sequence encoding a transcription factor controlling the expression of a membrane transporter of the PDR subfamily, ii. provision of a nucleic acid molecule comprising at least one nucleic acid sequence encoding a type III polyketide synthase, in particular a type III polyketide synthase having phloroglucinol synthase activity,
  • step (iii) bringing said host cell into contact with said at least one vector obtained in step (iii) so that the latter is transfected with said vector (s) and said host cell expresses said molecules of nucleic acids, said host cell thus being resistant to phloroglucinol.
  • said polypeptide provided in step (i) is chosen from SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 and ATR1.
  • said polypeptide provided in step (i) is SNQ2.
  • said polypeptide provided in step (i) comprises at least one amino acid sequence having at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, even more preferably. at least 80% identity, even more preferably at least 85% identity, still more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, still more preferably more preferably at least 96% identity, more preferably at least 97% identity, even more preferably at least 98% identity, still more preferably at least 99% identity, more preferably between all 100% identity with SEQ ID NO 2.
  • the nucleic acid molecules provided in steps (i) and (ii) are cloned in step (iii) into a single vector.
  • nucleic acid molecules provided in steps (i) and (ii) are cloned in step (iii) into two different vectors. In one embodiment, said nucleic acid molecules are not integrated in step (iv) into the genome of said host cell.
  • At least one of said nucleic acid molecules is integrated in step (iv) into the genome of said host cell.
  • said nucleic acid molecules are integrated in step (iv) into the genome of said host cell.
  • the host cell is a microorganism selected from bacteria, yeasts, fungi, algae and cyanobacteria.
  • the host cell is preferably a yeast, said yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettanoccomyces and Malassezia.
  • yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettanoccomyces and Malassezia.
  • the yeast is selected from the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomyccesomyaeromycesporosa, Brettanomyccesomeromyesporosa, Brusettanomyccesomeromyesporosa and themettanomyccesporomyesporosa, Brettanomyccesomyccesporosa and Themettanomyccesporesporosa glabrata.
  • the yeast is of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the host cell is a microorganism selected from bacteria, yeasts, fungi, algae and cyanobacteria.
  • the host cell is preferably a yeast, said yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettanoccomyces and Malassezia.
  • yeast being in particular selected from the genera Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettocomyces, Brettanoccomyces and Malassezia.
  • the yeast is selected from the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomyccesomyaeromycesporosa, Brettanomyccesomeromyesporosa, Brusettanomyccesomeromyesporosa and themettanomyccesporomyesporosa, Brettanomyccesomyccesporosa and Themettanomyccesporesporosa glabrata.
  • the yeast is of the genus Saccharomyces, preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing phloroglucinol comprising at least the steps:
  • step (iii) incubating the mixture obtained in step (ii) under conditions suitable for producing phloroglucinol; and iv. optionally, the recovery of the reaction medium comprising the phloroglucinol obtained after step (iii) and the purification of the phloroglucinol.
  • the host cell is as described above.
  • it is in particular a yeast cell, in particular of the genus Saccharomyces and preferably of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • step (iii) will be able to identify the culture conditions suitable for producing phloroglucinol according to step (iii). He will be able in particular to adjust the temperature, the pH, the amounts of 0 2 and of C0 2 and other parameters, depending on the cell type used in the implementation of the production method described above.
  • the substrate is a source of carbon.
  • the carbon source is a pure carbon source or an industrial co-product (such as molasses or poor sewage, for example from the sugar industry).
  • the substrate in the pure carbon source or the industrial co-product is a simple sugar, such as glucose (or dextrose), fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, or maltose; a complex sugar, such as a monosaccharide, a disaccharide or a trisaccharide, or else a polysaccharide such as starch; an alcohol, such as ethanol; an acid; a fatty acid and their ester derivative; or a mixture of sugars, alcohols, acids and / or fatty acids or their ester derivatives.
  • the substrate is glucose or sucrose.
  • the substrate is ethanol.
  • the method for determining phloroglucinol has been developed as detailed below. It comprises in particular a step of extracting phloroglucinol followed by a step of assaying by chromatography.
  • the method was developed using resorcinol as an internal standard (E1).
  • E1 resorcinol as an internal standard
  • Various tests have led to the development of a liquid-liquid extraction method carried out at pH 4.0 in the presence of ethyl acetate as solvent, and by saturating the aqueous phase with NaCl. The extraction is carried out for 30 min with circular stirring. The organic phase is removed and the ethyl acetate solvent is evaporated off under a flow of nitrogen N 2 at 30 ° C. The dry extract obtained after complete evaporation is then taken up in a determined volume of a 50% -50% ethanol / H 2 0 mixture.
  • the extraction yield (RDT) was measured by mass spectroscopy after high pressure chromatography on a C18 column (dimensions: 100 mm * 2.1 mm; particle size: 1.7 ⁇ m) using a 0.03% methanoic acid (HCOOH) / acetonitrile gradient. (ACN).
  • the RDTs were determined using solutions of phloroglucinol and resorcinol, prepared in the culture medium used for the growth of the yeasts.
  • the phloroglucinol concentrations correspond to the low (20 pg.mL 1 ) and high (200 pg.mL 1 ) points of the assay range.
  • the concentration of resorcinol corresponds to the concentration added as an internal standard during the assays (200 pg.mL 1 ).
  • Table 1 Extraction yield (RDT) of phloroglucinol (20 and 200 pg.mL 1 ) and resorcinol (200 pg.mL 1 ), extracted with ethyl acetate, according to the method described.
  • Quantification is performed using a range of 20 to 200 pg.mL 1 of phloroglucinol diluted in yeast culture medium (Yeast Extract 1%, BactoPeptone 2%) in the presence of a fixed amount of resorcinol, used as an internal control. .
  • the amount of phloroglucinol is determined by calculating the peak area ratios of phloroglucinol / resorcinol chromatography.
  • This assay method therefore makes it possible to measure qualitatively and quantitatively, in a reliable manner, the phloroglucinol present in a culture medium.
  • Example 2 Evaluation of the toxicity of phloroglucinol on bacteria or yeast cells
  • the experiment was carried out as follows.
  • the phloroglucinol was dissolved at a concentration of 15 gL 1 in complete medium (Yeast Extract 1% + Bacto-Peptone 2%) containing 2% glucose as carbon source (YPD medium).
  • Culture media containing lower concentrations of phloroglucinol were obtained by diluting this first medium in the same YPD medium containing 2% glucose.
  • the cells of yeast or of wild bacteria were inoculated at an OD 60 0nm of 0.05 in the various media, therefore containing, from the start of the cultures, either 0 (positive growth control indicated T +) , 1, 2.5, 5, 7.5, 10, or 15 gL 1 of phloroglucinol.
  • the cultures were carried out in 48-well microplates, at 28 ° C. for the yeasts, at 37 ° C. for the bacterial strain, with vigorous stirring for 24 hours.
  • Two strains of yeast (Saccharomyces cerevisiae) and one strain of bacteria (Escherichia coli) were tested. The results obtained are presented below.
  • the experiments were carried out in an Erlenmeyer with vigorous stirring in a complete medium containing 2% glucose as the carbon source.
  • Yeast cells were seeded at an OD 60 0 nm of 0.05 from complete medium pre-cultures. The cultures are completed with increasing concentrations of phloroglucinol (0; 1; 5; 10; 15; 20 g / L) and incubated for 48 hours. Two series of erlens have been produced. In the second series, 50 gL 1 of ethanol are added at 20 h. The growth is followed by sampling at 18h, 20h, 22h, 24h, 42h and 48h and measurement of the OD 60 0 nm ⁇ The results obtained are presented below.
  • the genes encoding the PDR proteins were amplified from yeast genomic DNA (W303-1A) by PCR (“polymerase chain reaction”) and cloned into plasmids. The correctness of the sequence was verified by sequencing. The various genes encoding the PDRs were integrated into the genome at the JLP1 locus according to the structure described in FIG. 4A. Each strain constructed bears a YA number, and a bank of 28 yeast strains overexpressing a PDR transporter was thus created, at the rate of two clones per transporter.
  • the phloroglucinol was dissolved at a concentration of 20 gL 1 in YPD medium containing 2% glucose as a carbon source.
  • the yeasts expressing each PDR were seeded at an OD 60 0 nm of 0.05.
  • the cultures were carried out in 48-well microplates, incubated with stirring at 28 ° C. for 24 hours. After 24 h, the OD 60 0 nm is measured.
  • FIG. 5 represents the OD 60 0 nm obtained at the end of the culture.
  • the genes encoding the MFS proteins were amplified from yeast genomic DNA (W303-1A) by PCR (“polymerase chain reaction”) and cloned into plasmids. The correctness of the sequence was verified by sequencing.
  • the different genes coding for MFS were integrated into the genome at the JLP1 locus according to the structure described in FIG. 6A. Each stump built carries a YA number, and a bank of 38 yeast strains overexpressing an MFS transporter was thus created, at the rate of two clones per transporter.
  • the phloroglucinol was dissolved at a concentration of 20 gL 1 in YPD medium containing 2% glucose as a carbon source.
  • the yeasts expressing each MFS were seeded at an OD 60 0 nm of 0.05.
  • the cultures were carried out in 48-well microplates, incubated with stirring at 28 ° C. for 24 hours. After 24 h, the OD 60 0 nm is measured.
  • FIG. 7 represents the OD 60 0 nm obtained at the end of the culture.

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Abstract

La présente invention concerne une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol, ladite cellule hôte étant caractérisée en ce qu'elle surexprime un polypeptide sélectionné parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR,et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS;de préférence un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1;et de préférence encore le transporteur SNQ2.La présente invention concerne également un procédé de production d'une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol. La présente invention concerne en outre une méthode de production de phloroglucinol.

Description

CELLULE, NOTAMMENT LEVURE, RESISTANTE AU PHLOROGLUCINOL
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans les domaines de la biochimie cellulaire et plus particulièrement dans le domaine de la synthèse du phloroglucinol par des cellules vivantes, de préférence des cellules hôtes recombinantes. Elle concerne l'utilisation (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, notamment l'utilisation de tels transporteurs ou facteurs de transcription issus de levures, plus particulièrement de levures Saccharomyces, pour conférer une résistance au phloroglucinol.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Le phloroglucinol ou benzène-l,3,5-triol est un composé organique aromatique, utilisé dans la synthèse de nombreux produits pharmaceutiques ou encore d’explosifs. Compte tenu du large champ d'application du phloroglucinol, les industriels sont toujours à la recherche de moyens et d'outils permettant de produire ce composé en grande quantité dans un système économiquement rentable. A cet effet, certains défis restent à relever, notamment parce que l'une des principales difficultés à surmonter réside dans le fait que le phloroglucinol possède des propriétés antibiotiques et qu'il est ainsi compliqué de mettre en place un système de production in vivo industriel à fort rendement.
De façon intéressante, Cao et al. ont montré chez les bactéries de type Escherichia coli que la surexpression du gène marA, un activateur transcriptionnel de gènes impliqués dans la résistance à de multiples antibiotiques, permettait d'augmenter leur résistance au phloroglucinol (Cao et al., 2011). Toutefois, ces effets toxiques du phloroglucinol restent à ce jour peu étudiés dans la littérature.
Ainsi, il subsiste aujourd'hui le besoin d'identifier de nouveaux moyens et outils capables de fournir une résistance accrue vis-à-vis de la toxicité conférée par le phloroglucinol.
Tous les organismes ont développé des mécanismes de transport par lesquels les substances toxiques endogènes et exogènes peuvent être sécrétées. Les deux principales classes de protéines de transport sont les transporteurs ABC (Decottignies, 1997) et les transporteurs MFS (« major facilitator superfamily ») (Del Sorbo, 2000). Les membres des deux classes présentent une spécificité large de substrats.
Chez S. cerevisiae, une trentaine de protéines ABC a été identifiée et classée en cinq sous-familles phylogénétiques (Decottignies, 1997). Ces protéines présentent une organisation structurale très conservée incluant deux domaines transmembranaires et deux domaines cytoplasmiques délivrant l'énergie nécessaire au transport. L'organisation structurale est à la base de la classification des protéines en familles notées ABC-A à ABC-G. La surexpression des PDR («pléïotropie drug résistance») est fréquemment corrélée à la multirésistance (Holland, 2003). Chez S. cerevisiae, les protéines PDR constituent une sous-famille de transporteurs ABC, impliqués dans la résistance aux xénobiotiques (E. Balzi, 1995 ; Kolaczkowski, 1998). Les PDR les plus importants sont Pdr5 et Yorl, affichant une large spécificité de substrats (Mahé, 1996). Certains membres de la sous-famille PDR comme PdrlOp et Pdrl5p sont également liés à la réponse générale au stress (Wolfger, 2004). Pdrl2p joue un rôle essentiel dans la réponse et l'adaptation à des conditions défavorables (stress) (Piper, 1998). Les MFS sont également des protéines transmembranaires impliquées dans le transport de molécules (oligosaccharides, xénobiotiques, acides aminés) utilisant les gradients de concentration chimiosmotique (Marger, 1993). Les transporteurs MFS peuvent être divisés en trois groupes principaux, en fonction du mode de transport : les transporteurs uniport qui permettent le déplacement dans une direction d'une seule molécule ou d'un seul ion à travers la membrane ; les transporteurs symport qui permettent le déplacement dans une même direction de deux molécules différentes ou d'une molécule et d'un ion de couplage (typiquement des protons) à travers la membrane; et les transporteurs antiport qui permettent le déplacement dans une direction opposée de deux molécules ou d'une molécule et d'un ion à travers la membrane, de telle sorte que la liaison de l'un dépend de la libération préalable de l'autre (Forrest, 2011). Les MFS sont classés en 74 sous-familles fondées sur l’analyse phylogénétique, la spécificité de substrat, et le mode de transport. La spécificité au substrat est déterminée essentiellement par les chaînes latérales des résidus d’acides aminés tapissant la cavité centrale creusée par le transporteur dans la bicouche lipidique de la membrane (Yan, 2013).
Les Inventeurs ont cherché des moyens et outils permettant d'augmenter la tolérance des levures au phloroglucinol. Dans le contexte de leurs travaux, ils ont étudié la surexpression de protéines appartenant à la sous-famille de transporteurs PDR. Ils ont notamment étudié les douze transporteurs présents sur la membrane cytoplasmique de la levure (Yorlp, Pdr5p, PdrlOp, Pdrl2p, Pdrl5p, Snq2, Pdrllp, Pdrl8p, Auslp, Adplp, Yol075cp et Ste6p), ainsi que deux facteurs de transcription (Pdrlp et Pdr3p). Dix des douze transporteurs sélectionnés appartiennent à la famille G, dont le chef de file est BCRP (« breast cancer résistance protein ») ; les deux autres protéines appartiennent aux familles ABC-B et ABC-C, dont les chefs de file sont respectivement MDR1 et MRP1, largement impliqués dans la résistance aux anticancéreux chez l'homme. Les Inventeurs ont également étudié 19 séquences de transporteurs de la famille MFS situés à la membrane cytoplasmique.
De manière inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence l'effet (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, en particulier des protéines SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 ou ATR1 et notamment du transporteur membranaire SNQ2, sur la résistance au phloroglucinol des levures, en particulier des levures de type Saccharomyces, en particulier des levures de type Saccharomyces cerevisiae. RESUME DE L'INVENTION
Les Inventeurs ont mis en évidence de manière tout à fait surprenante, que la surexpression (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, dans une cellule vivante, permettait d'augmenter sa résistance au phloroglucinol.
Le premier objet de l'invention porte donc sur une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu'elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L 1.
Selon la présente invention, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l'expression dudit transporteur membranaire, notamment choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1 et de préférence le transporteur SNQ2.
L'invention porte encore sur un procédé d'obtention d'une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d'une molécule d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l'expression d'un transporteur membranaire de la sous-famille PDR, ii. clonage de ladite molécule d'acides nucléiques fournie à l'étape (i) dans un vecteur apte à permettre son intégration et/ou son expression dans ladite cellule hôte, et
iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l'étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d'acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
La présente invention porte encore sur une méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d'obtention d'une cellule hôte par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, ii. de mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d'incubation du mélange obtenu à l'étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol, et
iv. optionnellement, de récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l'étape (iii) et de purification du phloroglucinol. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Cinétiques de croissance de la souche bactérienne ECAO50, dérivée de Escherichia coli K12 en présence de concentrations croissantes de phloroglucinol.
Figure2 :Cinétiques de croissance de la souche de levure S. cerevisiae CC787-1B en présence de concentrations croissantes de phloroglucinol.
Figure 3A : Toxicité du phloroglucinol chez les levures.
Figure 3B : Toxicité du phloroglucinol chez les levures en présence d'éthanol ajouté après 20h de culture.
Figure 4A : structure du cluster intégré dans le génome de la levure au locus JLP1, le gène codant pour le transporteur de la sous-famille PDR ou le facteur de transcription contrôlant l'expression d'un transporteur de la sous-famille PDR étant sous le contrôle du promoteur pCCW12.
Figure 4B : Pour chaque gène, une souche a été construite portant le numéro YA et deux clones indépendants ont été conservés pour les analyses.
Figure 5 : Effet de la surexpression des PDR sur la toxicité du phloroglucinol (20 g.L 1). Le graphe indique la DO600nm à 24h des cultures des différentes souches surexprimant chacune un transporteur PDR différent ou un facteur de transcription régulant l'expression d'un transporteur PDR différent, en absence ou en présence de 20 g.L 1 de phloroglucinol.
Figure 6A : Structure du cluster intégré dans le génome de la levure au locus JLP1, le gène codant pour le transporteur de la famille MFS étant sous le contrôle du promoteur pCCW12.
Figure 6B Pour chaque transporteur, une souche a été construite portant le numéro YA et deux clones indépendants ont été conservés pour les analyses. Figure 7 : Effet de la surexpression des MFS sur la toxicité du phloroglucinol (20 g.L-1). Le graphe indique la DO600nm à 24h des cultures des différentes souches surexprimant chacune un transporteur PDR différent en absence ou en présence de 20 g.L 1 de phloroglucinol. DESCRIPTION DETAILLEEE DE L'INVENTION
Définitions
Par « phloroglucinol », on entend un composé organique aromatique benzène-l,3,5-triol présentant la formule chimique suivante (Formule I) :
Formule I
Par « phloroglucinol synthase », on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique appartenant à la famille des polykétide synthases de type III et catalysant la synthèse du phloroglucinol. Une phloroglucinol synthase catalyse la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol.
Par « polykétide synthase de type III », on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique produisant des polykétides et qui n'utilise pas de domaine de protéine porteuse d’acyle (ou ACP, pour « acyl carrier protein »).
Par « polykétide », on entend une grande famille de métabolites secondaires chez les bactéries, les mycètes, les plantes et certaines lignées d’animaux qui proviennent de la condensation itérative de sous-unités acétyle ou malonyle par des enzymes polykétide-synthases. Les polykétides servent également de matières premières pour la fabrication d’un éventail large de produits naturels et semi-synthétiques.
Par « activité enzymatique » ou « activité catalytique » ou encore « activité » d'une enzyme, on entend l'efficacité d'une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné. L'efficacité de l'enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l'enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l'enzyme. Par « taux de conversion du substrat en produit par l'enzyme » on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d'enzyme. Par exemple, une activité enzymatique au sens de l'invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L ou g.L 1).
Par « bactérie », on entend un organisme microscopique et procaryote présent dans un milieu donné.
Par « levure » on entend un organisme microscopique et eucaryote dont certaines espèces sont aptes à provoquer la fermentation des matières organiques. Par «molécule d'acides nucléiques », on entend un polymère de n’importe quelle longueur d'acide désoxyribonucléique (ADN), ou polydésoxyribonucléotides, incluant notamment les ADN complémentaires ou ADNc, les ADN génomiques, les plasmides, les vecteurs, les génomes viraux, l’ADN isolé, les sondes, les amorces et tout mélange de ceux-ci ; ou un polymère de n’importe quelle longueur d'acide ribonucléique (ARN), ou polyribonucléotides, incluant notamment les ARN messagers ou ARNm, ARN antisens ; ou des polyribo-polydésoxyribonucléotides mélangés. Ils englobent des polynucléotides simples ou à double brins, linéaires ou circulaires, naturels ou synthétiques. En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides non naturels et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques.
Dans le cadre de la présente invention, les termes « acide nucléique », « molécule d’acides nucléiques », « polynucléotide » et « séquence nucléotidique » sont utilisés de manière interchangeable.
Par « isolé ou isolée », on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d'acides nucléiques, un vecteur plasmidique, un vecteur viral ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).
Par « polypeptide », « protéine » et « peptide », on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d'acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans la présente demande, si le polymère d’acides aminés contient plus de 50 résidus d’acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé peptide.
Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d’acides nucléiques ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l’administration, la propagation et/ou l’expression d’une ou plusieurs molécule(s) d’acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.
D'un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l’expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d’expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d’intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d'une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d’acides nucléiques qu'il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d’acides nucléiques dans le génome d'une cellule hôte).
D'un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d’éléments génétiques naturels et artificiels. Ainsi, dans le contexte de l’invention, le terme « vecteur » doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.
Un « plasmide » tel qu’utilisé ici désigne une construction d’ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d’être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positifs et négatifs sont connus dans la technique. À titre d’illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.
Le terme « vecteur viral » tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acides nucléiques qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients pour la réplication.
Par « cellule vivante », on entend une cellule de type sauvage, c'est-à-dire une cellule existant à l'état naturel et non modifiée génétiquement par l'Homme, ou une cellule de type recombinante, c'est-à-dire génétiquement modifiée par l'Homme. Dans ce dernier cas on parlera préférentiellement de cellule hôte.
La cellule vivante peut être constituée d’un type unique de cellules ou d’un groupe de différents types de cellules.
La cellule vivante peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives. Dans le cadre de l’invention, le terme « cellules vivantes » comprend des cellules procaryotes, bactéries ou cyanobactéries, des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, des cellules de champignons, des cellules d'algues, des cellules d’insectes, des plantes et des cellules de mammifères (par exemple humaines ou non humaines, de préférence non humaines).
Par « cellule hôte », on entend une cellule contenant au moins une molécule d'acides nucléiques exogène. Avantageusement, la cellule hôte a une résistance vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol.
En particulier, la cellule hôte est capable d'exprimer ou de surexprimer un polypeptide codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence un polypeptide à activité de phloroglucinol synthase, plus préférentiellement un polypeptide codant pour une polykétide synthase de type III et est ainsi capable de synthétiser du phloroglucinol.
Le terme « cellule hôte » comprend plus largement des cellules qui contiennent ou ont contenu la molécule d'acides nucléiques, ainsi que la descendance de telles cellules.
La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d'un organisme complet. Dans le cas où la cellule hôte est au sein d'un organisme complet, ledit organisme n'est pas humain.
Il est ainsi clair qu'une « cellule hôte » selon la présente invention est une cellule hôte recombinante, i.e., une cellule hébergeant un matériel génétique exogène. Ainsi, une cellule hôte n'est pas une cellule qui existe à l'état naturel mais est un outil de biologie moléculaire obtenu par les techniques de manipulations génétiques.
Par matériel génétique ou séquence « exogène », on entend que ledit matériel génétique ou ladite séquence provient d'un autre organisme, appartenant ou non à la même lignée cellulaire. Par « transfecté » ou « transfection », on entend l’introduction de matériel génétique exogène dans des cellules eucaryotes, notamment celles de l'invention. Par « transformé » ou « transformation », on entend l’introduction de matériel génétique exogène dans des cellules procaryotes, notamment celles de l'invention. Néanmoins, dans le cadre de la présente invention, les termes « transfection » et « transformation » sont équivalents et peuvent être employés de manière interchangeable.
Par « identité », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides, entre deux protéines, entre deux peptides ou deux molécules d'acides aminés. Le « pourcentage d’identité » entre deux séquences est fonction du nombre de résidus identiques communs aux deux séquences, et prend en compte le nombre d’intervalles qui doivent être introduits pour un alignement optimal et la longueur de chaque intervalle. Divers programmes informatiques et algorithmes mathématiques sont disponibles dans l'état de l'art pour déterminer le pourcentage d’identité entre les séquences d’acides aminés, comme par exemple le programme Blast disponible sur la base NCBI ou ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff (ed.), 1981, Suppl. 3 482-489). Des programmes pour déterminer l’homologie entre les séquences nucléotidiques sont également disponibles dans une base de données spécialisée (par exemple Genbank, le Wisconsin Sequence Analysis Package, les programmes BESTFIT, FASTA et GAP). À titre illustratif, « au moins 80% d’identité de séquence », tel qu’utilisé ici, représente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation pourront être pris seuls ou combinés de manière appropriée par l'homme du métier. Cellule vivante résistante au phloroglucinol
Le premier objet de l'invention porte donc sur une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu'elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L 1.
Par « résistante au phloroglucinol » on entend une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, qui n'est pas sensible à la toxicité induite par le phloroglucinol. Cette cellule vivante, de préférence cette cellule hôte, est ainsi capable de vivre, croître et se multiplier malgré la présence de phloroglucinol dans son milieu de culture, notamment malgré une concentration de phloroglucinol d'au moins 1 g.L 1 dans son milieu de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite cellule vivante, et de préférence ladite cellule hôte, est résistante au phloroglucinol si elle est capable de vivre, croître et se multiplier en présence d'une concentration en phloroglucinol dans son milieu de culture supérieure ou égale à 1 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 2.5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 7.5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 10 g.L 1, et de façon encore préférée supérieure ou égale à 15 g.L 1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est résistante au phloroglucinol si elle est capable de vivre, croître et se multiplier en présence d'une concentration en phloroglucinol dans son milieu de culture supérieure ou égale à 20 g.L 1.
En pratique, la résistance au phloroglucinol d'une cellule vivante, de préférence d'une cellule hôte, peut être mesurée par toute méthode appropriée connue de l'Homme du métier, notamment par la méthode décrite dans l'Exemple 1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, levures, champignons, algues, cyanobactéries, de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia ; de manière plus particulière parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, la levure étant du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. De façon surprenante, les Inventeurs ont pu mettre en évidence que certains des transporteurs de la famille ABC, et notamment certains transporteurs de la sous-famille PDR, de même que certains transporteurs de la famille MFS, sont capables de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol. Par ailleurs, certains facteurs de transcription impliqués dans la régulation desdits transporteurs sont également capables de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol. Ainsi, la présente invention porte sur une cellule hôte caractérisée en ce qu'elle surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l'expression dudit transporteur membranaire.
Parmi les transporteurs d'intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer les transporteurs de la sous-famille PDR : PDR5, SNQ2, PDR10, PDR11, PDR12, PDR15, PDR18, ADP1, AUS1, STE6, YOL075C et YOR1. Parmi les facteurs de transcription d'intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer PDR1 et PDR3 qui sont impliqués dans la régulation de l'expression des transporteurs de la sous-famille PDR.
Ainsi, dans un mode réalisation particulier, ladite cellule hôte est caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire ou ledit facteur de transcription contrôlant son expression appartient à la famille des transporteurs ABC et de préférence à la sous-famille PDR.
Parmi les transporteurs d'intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut également citer les transporteurs de la sous famille MFS, notamment AQR1, DTR1, FLR1, HOL1, QDR1, QDR2, QDR3, TPOl, TP02, TP03, TP04, YHK8, AT RI, GEX1, AZR1, SGE1, SIT1, ENB1 et GEX2.
Ainsi, dans un mode réalisation particulier, ladite cellule hôte est caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire appartient à la famille des transporteurs MFS.
L'invention porte donc également sur une cellule hôte résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu'elle surexprime au moins un transporteur ou un facteur de transcription choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule hôte est caractérisée en ce qu'elle surexprime le transporteur SNQ2.
Ainsi, les transporteurs PDR, les facteurs de transcription régulant l'expression des transporteurs PDR, et les transporteurs MFS, en particulier SNQ2, peuvent être issus de tout organisme possédant une séquence codant pour lesdits transporteurs ou facteurs de transcription.
Dans un mode de réalisation, les transporteurs PDR, les facteurs de transcription régulant l'expression des transporteurs PDR, et les transporteurs MFS sont issus de levures, lesquelles levures sont en particulier sélectionnées parmi les levures du genre Saccharomyces, et de manière plus particulière parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces baiiii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, lesdites levures étant de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Dans un autre mode de réalisation, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle surexprime le transporteur SNQ2.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae caractérisée en ce qu'elle surexprime un polypeptide comprenant au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70%, de préférence au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO 2. Dans un mode de réalisation préféré entre tous, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle surexprime le transporteur SNQ2 de Saccharomyces cerevisiae de séquence SEQ ID NO 2. Polypeptides
La présente invention utilise des polypeptides isolés choisis parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS ; notamment parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC de levures, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS de levures, en particulier ceux de levures Saccharomyces, plus particulièrement encore de l'espèce Saccharomyces cerevisiae .
La présente invention utilise des polypeptides isolés choisis parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS ; notamment parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC de levures, en particulier des transporteurs transmembranaires la sous-famille PDR de levures, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS de levures, en particulier ceux de levures Saccharomyces, plus particulièrement encore de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, comme moyens pour réduire la toxicité in vivo du phloroglucinol.
De manière avantageuse, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 27, SEQID NO 28, SEQID NO 29, SEQID NO 30, SEQID NO 31, SEQID NO 32 et SEQID NO 33.
Avantageusement, ledit polypeptide est choisi parmi les transporteurs PDR de levure, les facteurs de transcription régulant l'expression des transporteurs PDR de levure, et les transporteurs MFS de levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les levures du genre Saccharomyces, et de manière plus particulière parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, ladite levure étant de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d'acides aminés ayant de préférence au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec une séquence choisie parmi SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11,SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14 , SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 27, SEQID NO 28, SEQID NO 29, SEQID NO 30, SEQID NO 31, SEQID NO 32 et SEQID NO 33.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27.
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide isolé capable de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol possède une séquence d'acides aminés ayant de préférence au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27. Dans un mode de réalisation encore préféré, le polypeptide isolé capable de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol possède une séquence d'acides aminés ayant de préférence au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQ ID NO 2.
Acides nucléiques isolés
La présente invention utilise des molécules d'acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide choisi parmi les transporteurs de la sous-famille PDR, les facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs de la sous-famille PDR, et les transporteurs de la famille MFS, notamment ceux de levures, en particulier ceux de levures Saccharomyces, plus particulièrement ceux de Saccharomyces cerevisiae.
De manière avantageuse, ledit polypeptide est tel que défini ci-dessus.
Ainsi, la présente invention utilise des molécules d'acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et AT RI, et de préférence SNQ2.
La présente invention utilise donc des molécules d'acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Dans un mode de réalisation, la présente invention utilise des molécules d'acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé dont la séquence d'acides aminés a de préférence au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend un promoteur contrôlant l'expression d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide tel que défini ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci-dessus et comprend en outre un promoteur contrôlant l'expression d'au moins une, de préférence de ladite, séquence d'acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YFIK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un promoteur contrôlant l'expression d'au moins une, de préférence de ladite, séquence d'acides nucléiques.
De manière avantageuse, le promoteur est un promoteur exogène, en particulier un promoteur de levure, de préférence un promoteur choisi parmi ADFI2 (pADFI2) et CCW12 (pCCW12), de préférence encore un promoteur choisi parmi ADFI2 (pADFI2) de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et CCW12 (pCCW12) de S. cerevisiae, de préférence encore le promoteur CCW12 de SEQ ID NO 34.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend un terminateur de transcription d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide tel que défini ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci-dessus et comprend en outre un terminateur contrôlant l'expression d'au moins une, de préférence de ladite, séquence d'acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YFIK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un terminateur contrôlant l'expression d'au moins une, de préférence de ladite, séquence d'acides nucléiques.
De manière avantageuse, le terminateur est un terminateur exogène, en particulier un terminateur de levure, de préférence le terminateur RPL3 (tRPL15A), de préférence encore le terminateur RPL15A de S. cerevisiae, de préférence encore le terminateur RPL15A de SEQ ID NO 35.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend à la fois un promoteur et un terminateur qui sont tels que définis ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l'expression des transporteurs transmembranaires de la sous- famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci- dessus et comprend en outre un promoteur et un terminateur contrôlant l'expression d'au moins une, de préférence de ladite, séquence d'acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d'acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un promoteur et un terminateur contrôlant l'expression de ladite au moins une séquence d'acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques est isolée à partir de souches homologues, en culture, notamment de souches sélectionnées parmi les levures du genre Saccharomyces, de préférence choisies parmi Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, la levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques est isolée à partir d'un vecteur ou d'une cellule hôte comprenant ladite molécule, ledit vecteur ou ladite cellule hôte étant tel(le) que défini(e) plus haut et que décrit(e) ci-après dans les sections « Cellules hôtes » ou « Vecteurs ».
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée est synthétisée in-vitro par des techniques de synthèse nucléique que l'homme du métier connaît parfaitement ou saura déterminer sans difficultés à partir de ses connaissances générales.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'acides nucléiques isolée est recombinante.
Vecteurs
La présente invention utilise des vecteurs comprenant au moins une molécule d'acides nucléiques telle que définie ci-dessus.
Avantageusement, le vecteur est un plasmide.
Les vecteurs appropriés dans le cadre de la présente invention comprennent, sans limitation, des vecteurs bactériophages, plasmides ou cosmides pour l’expression dans des cellules hôtes procaryotes telles que des bactéries (par exemple E. coli, ou des bactéries du genre Pseudomonas ); des vecteurs pour l’expression chez la levure (par exemple Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris),· des vecteurs de baculovirus pour l’expression dans des systèmes de cellules d’insectes (par exemple, des cellules de Sf 9); des vecteurs viraux et plasmidiques pour l’expression dans des systèmes de cellules végétales (par exemple le plasmide Ti, le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV, le virus de la mosaïque du tabac TMV); ainsi que des vecteurs viraux et plasmidiques pour l’expression dans des cellules ou des organismes eucaryotes supérieurs.
Les vecteurs appropriés dans le cadre de la présente invention peuvent être de type intégratif ou de type réplicatif. Les vecteurs de type intégratif ne possèdent pas de séquence dite « origine de réplication » et doivent ainsi être intégrés directement dans le génome de la cellule hôte pour être exprimés. Cette intégration peut se faire au moyen d'outils génétiques dédiés et bien connus de l'Homme du métier. A titre d'exemple non limitatif, cette intégration peut se faire par recombinaison homologue ou encore via le système de recombinaison CRE-LOX. Les vecteurs de type réplicatif possèdent une origine de réplication autonome. Ces vecteurs se répliquent donc de façon indépendante par rapport au génome de la cellule hôte. Ainsi, contrairement aux vecteurs intégratifs, les vecteurs réplicatifs n'ont pas besoin d'être intégrés au génome de la cellule hôte. Ces vecteurs sont généralement disponibles dans le commerce (par exemple, auprès des fournisseurs tels Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc.), disponibles auprès d’institutions de dépôt telles que American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), ou ont fait l’objet de nombreuses publications décrivant leur séquence, leurs structures et leurs méthodes de production, de sorte que l’homme du métier peut les appliquer sans difficultés.
Des exemples représentatifs de vecteurs plasmidiques appropriés comprennent, sans limitation, pREP4, pCEP4, (Invitrogen), pCI (Promega), pYES2 (ThermoFisher) et pgWiz (Gene Therapy System Inc).
Cellules hôtes
La présente invention concerne des cellules hôtes résistantes au phloroglucinol parce qu'elles comprennent au moins une molécule d'acides nucléiques ou au moins un vecteur tel(le) que défini(e) ci-dessus.
Selon divers modes de réalisation, ladite cellule hôte peut être une cellule procaryote, une cellule eucaryote inférieure telle qu'une cellule de levures, et une autre cellule eucaryote telle qu'une cellule d’insecte, de plante et une cellule de mammifère (par exemple humaine ou non humaine, de préférence non humaine).
De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora , Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte comprend au moins une copie de la molécule d'acides nucléiques telle que définie ci-dessus intégrée dans son génome.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte comprend une copie unique de la molécule d'acides nucléiques telle que définie ci-dessus intégrée dans son génome.
Ainsi, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d'une molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, et de préférence SNQ2.
La présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d'une molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d'une molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés ayant de préférence au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10,
SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Lorsque la cellule hôte est une cellule de levure, la ou les copies de la molécule d'acides nucléiques peu(ven)t être intégrée(s) à différents loci, préférentiellement au locus URA3, au locus JLP1, au locus LEU2, au locus SAM2, au locus MET14, et/ou au locus TRP1 du génome de ladite cellule de levure. Lorsque la cellule hôte est une cellule de levure et que plusieurs copies de la molécule d'acides nucléiques sont intégrées, les différentes copies peuvent être intégrées au même locus, ou encore à différents loci, préférentiellement à l'une quelconque des combinaisons des loci U R A3, JLP1, LEU2, SAM2, MET14 et/ou TRP1.
De préférence, la ou les copies de la molécule d'acides nucléiques est(sont) intégrée(s) au locus JLP1
Avantageusement, les codons utilisés dans la molécule d'acides nucléiques ont été adaptés pour une expression optimale dans la cellule hôte sélectionnée.
Une expression optimale peut notamment être obtenue lorsque les codons choisis sont ceux utilisés de manière préférentielle par l'organisme d'origine de la cellule hôte. Les codons utilisés de manière préférentielle sont connus pour la plupart des organismes couramment utilisés dans le domaine. L'homme du métier pourra aisément déterminer les codons les plus avantageux à utiliser en fonction de la cellule hôte choisie.
A cet effet, l'homme du métier sait quelle technique utiliser pour modifier les codons de la molécule d'acides nucléiques. Les codons peuvent être par exemple modifiés par mutagénèse dirigée in vitro à partir d'un échantillon de la molécule d'acides nucléiques dont les codons sont à adapter, à l'aide d'une amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Alternativement, la molécule d'acides nucléiques peut être synthétisée in vitro directement avec les codons optimisés.
Les cellules hôtes peuvent être cultivées dans des bioréacteurs aérobie ou anaérobie, à petite et grande échelle, dans des flacons ou des boites de Pétri. La culture peut être effectuée à une température, un pH, un milieu de culture et une teneur en oxygène appropriés pour une cellule hôte donnée.
Avantageusement, les cellules hôtes telles que décrites ci-dessus peuvent être cultivées dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, notamment des concentrations supérieures ou égale à 1 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 2.5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 7.5 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 10 g.L 1, de préférence supérieure ou égale à 15 g.L 1, et de façon encore préférée supérieure ou égale à 20 g.L 1.
Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte comprend au moins une copie d'une molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide dont une séquence d'acides aminés a au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQID NO 2. Cette cellule hôte présente une résistance au phloroglucinol ; elle peut notamment être cultivée dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, en particulier une concentration en phloroglucinol supérieure ou égale à 20 g.L 1.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la cellule hôte comprend au moins une copie d'une molécule d'acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés du transporteur membranaire de la sous-famille PDR : SNQ2. Cette cellule hôte présente une résistance au phloroglucinol ; elle peut notamment être cultivée dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, en particulier une concentration en phloroglucinol supérieure ou égale à 20 g.L 1.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une cellule vivante, ou respectivement une cellule hôte telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle exprime, respectivement surexprime, au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement au moins une phloroglucinol synthase.
A cette fin, on pourra notamment utiliser toute séquence connue codant pour une polykétide synthase de type III, de préférence toute séquence connue codant pour une phloroglucinol synthase, notamment celle codée par le gène PHLD chez Pseudomonas fluorescens (Achkar et al., 2005 ; Zha et al., 2006) ou encore celle codée par le gène PKS1 chez Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013). On pourra également utiliser les séquences décrites dans les demandes de brevets internationales WO 2019/002798 et WO 2019/002799.
L'homme du métier saura adapter les moyens et méthodes développés ci-dessus aux fins de d'exprimer ou de surexprimer ladite au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol et de préférence une phloroglucinol synthase.
Procédé d'obtention d'une cellule hôte résistante au phloroglucinol et utilisation
La présente invention concerne en outre un procédé d'obtention d'une cellule hôte résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation, le procédé d'obtention une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d'une molécule d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l'expression d'un transporteur membranaire de la sous-famille PDR, ii. clonage de ladite molécule d'acides nucléiques fournie à l'étape (i) dans un vecteur apte à permettre l'intégration et/ou l'expression de ladite molécule dans ladite cellule hôte, et iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l'étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d'acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Selon un mode de réalisation encore préféré, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) est SNQ2.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) comprend au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQ ID NO 2.
Dans un mode de réalisation, ladite molécule d'acides nucléiques n'est pas intégrée à l'étape (iii) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation alternatif et préféré, ladite molécule d'acides nucléiques est intégrée à l'étape (iii) dans le génome de ladite cellule hôte.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé pour obtenir une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol est caractérisé en ce que ladite cellule hôte surexprime en outre au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement encore au moins une phloroglucinol synthase.
Ainsi, le procédé pour obtenir une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d'une molécule d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprend au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l'expression d'un transporteur membranaire de la sous-famille PDR, ii. fourniture d'une molécule d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une polykétide synthase de type III, notamment une polykétide synthase de type III ayant une activité phloroglucinol synthase,
iii. clonage desdites molécules d'acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) dans au moins un vecteur apte à permettre l'intégration et/ou l'expression desdites molécules dans ladite cellule hôte, et
iv. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit au moins un vecteur obtenu à l'étape (iii) afin que cette dernière soit transfectée par le(s)dit(s) vecteur(s) et que ladite cellule hôte exprime lesdites molécules d'acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Selon un mode de réalisation encore préféré, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) est SNQ2.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit polypeptide fourni à l'étape (i) comprend au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70% d'identité, de préférence encore au moins 75% d'identité, de manière encore préférée au moins 80% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d'identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d'identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d'identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d'identité, de manière davantage préférée au moins 97% d'identité, de manière encore préférée au moins 98% d'identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d'identité, de manière préférée entre toutes 100% d'identité avec SEQ ID NO 2.
Dans un mode de réalisation, les molécules d'acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) sont clonées à l'étape (iii) dans un seul et même vecteur.
Dans un mode de réalisation distinct et alternatif, les molécules d'acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) sont clonées à l'étape (iii) dans deux vecteurs différents. Dans un mode de réalisation, lesdites molécules d'acides nucléiques ne sont pas intégrées à l'étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation, une au moins desdites molécules d'acides nucléiques est intégrée à l'étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation alternatif et préféré, lesdites molécules d'acides nucléiques sont intégrées à l'étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Il est également décrit ici l'utilisation d'une cellule vivante, de préférence d'une cellule hôte telle que définie ci-dessus ou d'une cellule hôte issue du procédé d'obtention décrit ci-dessus, pour la production de phloroglucinol. De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Méthode de production de phloroglucinol
Un autre objet de l'invention porte sur une méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d'obtention d'une cellule hôte par la mise en oeuvre d'un procédé de production tel que défini ci-dessus,
ii. de la mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d'incubation du mélange obtenu à l'étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ; et iv. optionnellement, de la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l'étape (iii) et de la purification du phloroglucinol.
De manière avantageuse, la cellule hôte est telle que décrite ci-dessus. Il s'agit notamment dans un mode de réalisation préféré d'une cellule de levure, en particulier du genre Saccharomyces et de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
L'Homme du métier, grâce à ses connaissances générales, saura identifier les conditions de culture adaptées pour produire du phloroglucinol selon l'étape (iii). Il saura notamment ajuster la température, le pH, les quantités de 02 et de C02 et autres paramètres, en fonction du type cellulaire employé dans la mise en oeuvre de la méthode de production décrite ci-dessus.
En particulier, aux fins de la méthode de production décrite ci-dessus, le substrat est une source de carbone. Avantageusement, la source de carbone est une source de carbone pure ou un coproduit industriel (tel que la mélasse ou les égouts pauvres, par exemple issus de l'industrie sucrière). De préférence, le substrat dans la source de carbone pure ou le coproduit industriel est un sucre simple, tel que le glucose (ou dextrose), le fructose, le galactose, le mannose, le saccharose, le lactose, ou le maltose ; un sucre complexe, tel qu'un monosaccharide, un disaccharide ou un trisaccharide, ou encore un polysaccharide comme l'amidon ; un alcool, tel que l'éthanol ; un acide ; un acide gras et leur dérivé d'ester ; ou un mélange de sucres, d'alcools, d'acides et/ou d'acides gras ou leurs dérivés d'ester.
De préférence, le substrat est le glucose ou le saccharose. Alternativement, le substrat est l'éthanol.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention sans aucune limitation.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode de dosage du phloroglucinol
La méthode de dosage du phloroglucinol a été mise au point comme détaillé ci-dessous. Elle comprend notamment une étape d'extraction du phloroglucinol suivie d'une étape de dosage par chromatographie.
1.1 Extraction du phloroglucinol
La méthode a été développée en employant le résorcinol comme étalon interne (El). Différents tests ont conduit au développement d'une méthode d'extraction liquide-liquide réalisée à pH 4.0 en présence d'acétate d'éthyle comme solvant, et en saturant la phase aqueuse en NaCI. L'extraction est réalisée pendant 30 min sous agitation circulaire. La phase organique est prélevée et le solvant acétate d'éthyle est évaporé sous un flux d'azote N2 à 30°C. L'extrait sec obtenu après évaporation complète est alors repris dans un volume déterminé d'un mélange 50 % -50 % éthanol/H20.
Le rendement d'extraction (RDT) a été mesuré par spectroscopie de masse après chromatographie haute pression sur une colonne C18 (dimensions : 100 mm*2.1 mm ; granulométrie : 1.7 pm) en employant un gradient 0.03% acide méthanoïque (HCOOH)/ acétonitrile (ACN).
Les RDTs ont été déterminés en utilisant des solutions de phloroglucinol et résorcinol, préparées dans le milieu de culture utilisé pour la croissance des levures. Les concentrations de phloroglucinol correspondent aux points bas (20 pg.mL 1) et haut (200 pg.mL 1) de la gamme de dosage. La concentration du résorcinol correspond à la concentration ajoutée en tant qu'étalon interne lors des dosages (200 pg.mL 1). Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1 : Rendement d'extraction (RDT) du phloroglucinol (20 et 200 pg.mL 1) et du résorcinol (200 pg.mL 1), extraits par l'acétate d'éthyle, selon la méthode décrite.
1.2 Méthode de mesure par chromatographie : une méthode d'analyse UPLC/UV et UPLC/MS Une méthode d'analyse par chromatographie UPLC et mesure d'absorbance en UV (rayonnement ultraviolet) a été développée. L'extrait est chromatographié sur une colonne propyl- pentafluorophenyl (PFP) de dimensions 100mm*2.1 mm ; granulométrie :1.8 pm selon un gradient de 0.1% HCOOH/ACN - 0.1% HCOOH. Le phloroglucinol est détecté en UV à 230 nm. Une méthode UPLC couplée à un spectromètre de masse (UPLC/Mass) a également été développée.
La quantification est réalisée en employant une gamme de 20 à 200 pg.mL 1 de phloroglucinol dilué dans du milieu de culture de levure (Yeast Extract 1%, BactoPeptone 2 %) en présence d'une quantité fixe de résorcinol, employé comme témoin interne. La quantité de phloroglucinol est déterminée en calculant les rapports de surface des pics de chromatographie phloroglucinol / résorcinol.
Cette méthode de dosage permet donc de mesurer qualitativement et quantitativement, de manière fiable, le phloroglucinol présent dans un milieu de culture.
Exemple 2 : Evaluation de la toxicité du phloroglucinol sur les cellules de bactérie ou de levure
Afin de connaître le seuil de tolérance de bactéries ou de levures au phloroglucinol, des cinétiques de croissance ont été réalisées en présence de différentes concentrations de phloroglucinol. Ces expériences préliminaires visant à évaluer leur EC50.
L'expérience a été conduite de la manière suivante. Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 15 g.L 1 dans du milieu complet (Yeast Extract 1% + Bacto-Peptone 2%) contenant du glucose 2% comme source carbonée (milieu YPD). Les milieux de cultures contenant des concentrations inférieures de phloroglucinol ont été obtenus par dilution de ce premier milieu dans le même milieu YPD contenant 2% de glucose.
Pour réaliser l'expérience, les cellules de levure ou de bactérie sauvages ont été ensemencées à une D.O600nm de 0,05 dans les différents milieux, donc contenant, dès le démarrage des cultures, soit 0 (témoin positif de croissance indiqué T+), 1, 2.5, 5, 7.5, 10, ou 15 g.L 1 de phloroglucinol. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, à 28°C pour les levures, à 37°C pour la souche bactérienne, sous une forte agitation pendant 24h. Deux souches de levure (Saccharomyces cerevisiae) et une souche bactérienne (Escherichia coli) ont été testées. Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.
2.1 Résultats chez la bactérie
Les résultats démontrent que l'EC50 du phloroglucinol sur une souche bactérienne d'Escherichia coli se situe aux alentours de 0.75 g.L 1, une inhibition très importante de la croissance étant observée dès la concentration de 1 g.L 1, une inhibition totale de la croissance étant mesurée pour toutes les concentrations supérieures ou égales à 2,5 g.L 1 (Figure 1). 2.2 Résultats chez la levure
Les résultats démontrent que l'EC50 du phloroglucinol sur la souche de levure CC787-1B est supérieur à 10 g.L 1, une inhibition significative de la croissance des cellules de levure étant observée uniquement dans le milieu contenant 15 g.L 1 de phloroglucinol (Figure 2).
2.3 Poursuite des études de toxicité en présence d'éthanol
Lors du procédé de production du phloroglucinol par la levure, il est possible que l'éthanol soit co produit selon le régime fermentaire choisi pour ce procédé. L'éthanol est susceptible d'augmenter fraction soluble du phloroglucinol dans le milieu de croissance et est donc susceptible d'accroître la toxicité du phloroglucinol vis-à-vis des cellules de levures. La toxicité du phloroglucinol en présence d'éthanol ajouté après 20h de culture a été testée.
Les expériences ont été conduites en erlen à forte agitation en milieu complet contenant du glucose 2% comme source de carbone. Les cellules de levure ont été ensemencées à une DO600nm de 0,05 à partir de pré-cultures en milieu complet. Les cultures sont complétées avec des concentrations croissantes de phloroglucinol (0 ; 1 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 g/L) et incubées pendant 48h. Deux séries d'erlens ont été réalisées. Dans la seconde série, 50 g.L 1 d'éthanol sont ajoutés à 20 h. La croissance est suivie par prélèvement à 18h, 20h, 22h, 24h, 42h et 48h et mesure de la DO600nm· Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.
Dans ces conditions, on observe deux effets (figure 3A et 3B) :
a. Dans la culture YPDA sans phloroglucinol, l'ajout d'éthanol à 20h induit une cassure dans la courbe de croissance liée au changement du régime métabolique, puis l'éthanol consommé est utilisé comme source de carbone se traduisant par une DO600nm à 48h supérieure à celle sans éthanol.
b. En présence d'éthanol, l'inhibition du phloroglucinol est légèrement plus forte à 48h, en présence de 20 g/L de phloroglucinol.
Exemple 3 : Surexpression des PDR et mesure de l'effet sur la tolérance des levures au phloroglucinol
3.1 Intégration des gènes codant pour les différents PDR dans la levure Saccharomyces cerevisiae
Les gènes codant pour les protéines PDR ont été amplifiés à partir d'ADN génomique de levure (W303-1A) par PCR (« polymerase chain reaction ») et clonés en plasmides. L'exactitude de la séquence a été vérifiée par séquençage. Les différents gènes codant pour les PDR ont été intégrés au génome au locus JLP1 selon la structure décrite en Figure 4A. Chaque souche construite porte un numéro YA, et une banque de 28 souches de levures surexprimant un transporteur PDR a été ainsi créée, à raison de deux clones par transporteur.
Tableau 2 : Séquences protéiques des transporteurs membranaires et facteurs de transcription PDR clonés
Tableau 3 : Séquences nucléotidiques des promoteurs et terminateurs utilisés pour les clonages
3.2 Effet de la surexpression des PDR sur la tolérance des souches au phloroglucinol
Afin de tester l'impact de la surexpression des PDR sur la tolérance au phloroglucinol à haute concentration de phloroglucinol (>15 g.L 1), les souches ont été cultivées comme suit.
Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 20 g.L 1 dans du milieu YPD contenant du glucose 2% comme source carbonée. Pour réaliser l'expérience, les levures exprimant chaque PDR ont été ensemencées à une DO600nm de 0,05. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, incubées sous agitation à 28°C pendant 24h. Après 24h, la DO600nm est mesurée. La Figure 5 représente les DO600nm obtenues à l'issue de la culture.
Les résultats montrent clairement que parmi tous les PDR testés, seule la surexpression de SNQ2 permet de lever la toxicité du phloroglucinol lorsqu'il est présent dans le milieu à hauteur de 20 g.L 1. Les résultats sont confirmés dans les deux clones isolés YA2786-1 et YA2786-2. Par ailleurs, la surexpression de PDR3 ainsi que de STE6 permet, pour au moins un des deux clones de chaque lignée transgénique, d'augmenter la résistance des levures au phloroglucinol par rapport à la lignée non transgénique correspondante. Concernant les autres membres de la sous-famille PDR ici testés, on remarque que leur surexpression n'a pas d'impact sur la croissance de la levure.
Ainsi, les résultats indiquent que le phloroglucinol est un substrat de SNQ2. Dans la littérature, peu de données sont disponibles sur le spectre de molécules transportées par SNQ2.
Les expériences ont été refaites selon le même protocole en présence de 40 g.L 1 d'éthanol. Les résultats obtenus ont été comparables à ceux présentés en Figure 5. L'ajout d'éthanol (40 g.L 1) qui augmente la fraction soluble du phloroglucinol dans le milieu n'impacte pas la résistance au phloroglucinol conférée par la surexpression de SNQ2.
Exemple 4 : Surexpression des MFS et mesure de l'effet sur la tolérance des levures au phloroglucinol
4.1 Intégration des gènes codant pour les différents MFS dans la levure Saccharomyces cerevisiae
Les gènes codant pour les protéines MFS ont été amplifiés à partir d'ADN génomique de levure (W303-1A) par PCR (« polymerase chain reaction ») et clonés en plasmides. L'exactitude de la séquence a été vérifiée par séquençage. Les différents gènes codant pour les MFS ont été intégrés au génome au locus JLP1 selon la structure décrite en Figure 6A. Chaque souche construite porte un numéro YA, et une banque de 38 souches de levures surexprimant un transporteur MFS a été ainsi créée, à raison de deux clones par transporteur.
Tableau 4 : Séquences protéiques des transporteurs membranaires MFS clonés
4.2 Effet de la surexpression des MFS sur la tolérance des souches au phloroglucinol
Afin de tester l'impact de la surexpression des MFS sur la tolérance au phloroglucinol à haute concentration de phloroglucinol (> 15 g.L 1), les souches ont été cultivées comme suit.
Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 20 g.L 1 dans du milieu YPD contenant du glucose 2% comme source carbonée. Pour réaliser l'expérience, les levures exprimant chaque MFS ont été ensemencées à une DO600nm de 0,05. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, incubées sous agitation à 28°C pendant 24h. Après 24h, la DO600nm est mesurée. La Figure 7 représente les DO600nm obtenues à l'issue de la culture.
Les résultats montrent clairement que parmi tous les transporteurs MFS testés, la surexpression de AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 ainsi que ATR1 permet, pour chacun des deux clones de chaque lignée transgénique, d'augmenter de façon importante la résistance des levures au phloroglucinol par rapport à la lignée non transgénique correspondante. Concernant les autres membres de la sous-famille PDR ici testés, on remarque que leur surexpression n'a pas d'impact sur la croissance de la levure.
Contrairement à ce qui a été observé pour les transporteurs PDR, aucun des transporteurs MFS testé ne permet de lever totalement la toxicité du phloroglucinol. Conclusion
Les résultats obtenus démontrent que le phloroglucinol est toxique chez la bactérie comme chez la levure. La toxicité du phloroglucinol sur des cellules de levure étant apparente à partir d'une concentration en phloroglucinol de 15 g.L 1.
Deux banques, contenant respectivement 28 et 38 souches de levures transgéniques, ont été créées et les résultats de l'étude de toxicité du phloroglucinol montrent que la surexpression du facteur de transcription PDR3, ainsi que des transporteurs STE6, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1 permet d'augmenter la résistance des levures au phloroglucinol. De manière intéressante, la surexpression du transporteur SNQ2 confère la résistance au phloroglucinol à hauteur de 20 g.L 1 dans le milieu et ce même en présence de 40 g.L 1 d'éthanol, ce dernier augmentant la fraction soluble dans le milieu du phloroglucinol et donc sa toxicité.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule vivante, de préférence cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu'elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L 1.
2. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l'expression dudit transporteur membranaire.
3. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire appartient à la famille des transporteurs ABC, de préférence à la sous-famille PDR, ou à la famille des transporteurs MFS.
4. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ledit transporteur ou ledit facteur de transcription est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DT RI, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
5. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 20 g.L 1.
6. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ledit transporteur est SNQ2.
7. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle surexprime un polypeptide comprenant au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70%, de préférence au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO 2.
8. Cellule vivante, de préférence cellule hôte, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle exprime, ou respectivement surexprime, au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une phloroglucinol synthase.
9. Cellule vivante, de préférence cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que ladite cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, levures, champignons, algues, cyanobactéries, de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces,
Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus et Malassezia ; de manière plus particulière parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii ,
Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotoierens, Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata ; encore plus particulièrement, la levure est du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
10. Procédé d'obtention d'une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d'une molécule d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l'expression d'un transporteur membranaire de la sous-famille PDR,
11. clonage de ladite molécule d'acides nucléiques fournie à l'étape (i) dans un vecteur apte à permettre l'intégration et/ou l'expression de ladite molécule dans ladite cellule hôte, iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l'étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d'acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que ladite molécule d'acides nucléiques code pour un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11 caractérisé en ce que ledit polypeptide comprend au moins une séquence d'acides aminés ayant au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% avec SEQ ID NO 2.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que ladite cellule hôte surexprime en outre au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement une phloroglucinol synthase.
14. Méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d'obtention d'une cellule hôte par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13,
ii. de la mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d'incubation du mélange obtenu à l'étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ; et
iv. optionnellement, de la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l'étape (iii) et de la purification du phloroglucinol.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, ou méthode de production selon la revendication 14, caractérisé(e) en ce que ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est une cellule de levure, en particulier du genre Saccharomyces et de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
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