EP3920957A1 - Kardioprotektiver effekt des vasokonstriktion-inhibierenden faktors (vif) - Google Patents

Kardioprotektiver effekt des vasokonstriktion-inhibierenden faktors (vif)

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Publication number
EP3920957A1
EP3920957A1 EP20703987.6A EP20703987A EP3920957A1 EP 3920957 A1 EP3920957 A1 EP 3920957A1 EP 20703987 A EP20703987 A EP 20703987A EP 3920957 A1 EP3920957 A1 EP 3920957A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
vif
nucleic acid
vasoconstriction
heart disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20703987.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Elisa-Anamaria LIEHN
Joachim Jankowski
Vera Jankowski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Publication of EP3920957A1 publication Critical patent/EP3920957A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • VAF vasoconstriction-inhibiting factor
  • the invention lies in the field of cardiovascular medicaments, in particular with regard to those therapeutic agents which can be used specifically in the prevention and / or therapy of the consequences of a heart disease, in particular a heart attack.
  • High blood pressure and its consequences are one of the most common causes of death worldwide. High blood pressure often remains undetected as a hidden danger until it manifests itself in critical secondary diseases and / or damage. High blood pressure puts a particular strain on the cardiovascular system. On the one hand, high blood pressure puts a particular strain on the heart itself, especially the left ventricle, which applies / has to apply the high pressure and therefore has to do a constant extra work. To further ensure this, the thick muscle layer of the heart (myocardium) is enlarged further. With increasing thickness, however, the oxygen supply to the inner muscle layers becomes increasingly difficult. Over a longer period of time this can ultimately lead to cardiac insufficiency, in which the heart is no longer able to supply the body with a sufficient amount of oxygen-rich blood.
  • the blood vessels wear out or harden and thus enable arteriosclerosis to develop, in which in particular cholesterol esters and other fats are deposited in the vessel wall.
  • the blood vessels constrict, which in turn can lead to a further increase in blood pressure due to the associated increased vascular resistance.
  • this dramatically increases the risk of coronary heart disease, angina pectoris, myocardial infarction and stroke.
  • ACC American College of Cardiology
  • AHA American Heart Association
  • the renin-angiotensin system (or the entire renin-angiotensin-aldosterone system) and in particular the underlying angiotensin peptides are essential for the regulation of blood pressure.
  • the enzyme renin activates a cascade in which renin converts the previously inactive angiotensinogen into angiotensin I through its protease function.
  • Angiotensin I is finally converted into angiotensin I I by the angiotensin converting enzyme (ACE), which has a strong vasoconstrictive effect and the release of other substances, e.g. of the hormone vasopressin, which in turn have an antihypertensive effect.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • VIF Vasoconstriction-Inhibiting Factor
  • the object of the present invention is the targeted uncovering of the mechanisms of action and the molecular mechanisms of the VIF, in particular in the context of cardiac events such as angina pectoris and myocardial infarction, in order to develop its therapeutic potential.
  • a special focus here is on targeted studies to utilize the VIF in a possible treatment of patients with cardiac diseases.
  • specific technical modifications of the VIF and its smaller peptides should be used to investigate further properties and VIF mutants.
  • the aim of this discovery and investigation is to provide a preparation or combination preparation that can be used in the treatment and prevention of cardiac diseases.
  • the previous treatment of heart diseases, especially a heart attack often includes chronic lowering of blood pressure and thus lifelong drug therapy.
  • Examples of this are therapy with beta blockers, statins, ACE inhibitors or peptides such as serelaxin.
  • serelaxin for example, the phase III study RELAX-AHF-2 was unable to provide evidence of a clinical benefit of the corresponding active ingredient RLX030 (serelaxin).
  • Possible side effects or long-term consequential damage from all established therapies cannot be ruled out.
  • the primary object of the present invention was to discover new, improved forms of therapy for patients with cardiac diseases to facilitate therapy, for which VIF was not previously described.
  • amino acid molecule / sequence protein
  • amino acid sequence amino acid sequence
  • amino acid molecule includes all natural or chemically synthesized proteins, peptides or polypeptides or a modified protein, peptide, polypeptide and enzyme (polypeptide with a catalytic activity), where the term “mod “includes any recombinant, chemical or enzymatic modification of the protein, peptide, polypeptide and enzyme or the nucleic acid sequence that encodes them.
  • sequence (s) and “molecule (s)” are used interchangeably herein when referring to nucleic acid or amino acid sequences / molecules.
  • the term "pharmaceutically acceptable” refers to those ingredients, materials, compositions and / or dosage forms which, within the scope of a medical consideration or within the definition of any medical regulatory and / or regulatory agency, are suitable for contact with cells, tissues, or the like - that of the constituent parts of a subject, ie humans and animals, including contact with malignant cells or tissues of a subject, without excessive toxicity, irritation, allergic reaction or other complications or side effects with an appropriate risk-benefit ratio for a subject / patient is.
  • one or more auxiliaries as described below, are used.
  • subject refers to a human or a non-human animal. The term includes mammals (e.g.
  • the subject is a human.
  • rodents e.g. mice, rats or hamsters
  • rabbits guinea pigs, cows, horses, cats, dogs, sheep and goats
  • the subject is a human.
  • heart disease preferably also includes pathological conditions and events of the heart and thus among others also in particular a heart attack, angina pectoris and ischemia in the heart tissue.
  • sequences of heart disease does not include the occurrence of the disease itself, e.g. the occurrence of a heart attack, but rather the associated functional and / or pathological phenomena, e.g. a restriction in cardiac output or the area affected by the ischemia of the infarct.
  • heart tissue includes, but is not limited to, the pericardium, the epicardium, the pericardium, the fat layer located under the heart (Te / a subepicardiaca), the myocardium with the heart muscle cells and the endocardium, as well as the arterial and venous vascular accesses to the heart tissue, especially the coronary arteries.
  • infarction describes the destruction of tissue - especially through necrosis - as a result of an insufficient supply of oxygen (hypoxia), preferably through insufficient blood flow (ischemia).
  • treating describes treatment in a mammal, e.g. in a human including (a) preventing the consequences of a disease, i. to stop their development; (b) alleviating the consequences of illness, i.e. to bring about a declining development of the functions impaired by the disease or of the tissue affected by it; and / or (c) curing the consequences of the disease.
  • treatment and “therapy” are used interchangeably and include any form of preventive and / or curative treatment or therapy.
  • prevention means that prophylactic treatment was given before the onset of the disease or before the symptoms associated with a disease to be prevented appeared. However, prevention does not always lead to a complete one Absence of the disease and its symptoms; ameliorating or delaying the disease or its symptoms is thus likewise encompassed by prevention, as described herein.
  • partial sequence as used herein in the context of nucleic acid, amino acid and / or peptide sequences, relates to a coherent / contiguous fragment that can be derived from a matrix sequence according to the present application.
  • a partial sequence therefore usually comprises 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more contiguous positions according to the matrix sequence, possibly including additional modifications.
  • nucleotide http: //www.ebi. ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html
  • protein http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/
  • the pharmaceutical composition can be applied systemically or, if relevant, also locally.
  • the pharmaceutical composition or its active ingredients are transferred via direct (eg intravenous injection) or indirect (eg orally via the gastrointestinal tract) route into the blood and / or lymphatic system, which means that it is distributed throughout the whole Body or areas not separated by a special barrier (e.g. blood-brain barrier).
  • the pharmaceutical composition is applied to the tissue in which it is intended to act.
  • topical application or injection can take place.
  • local application can also take place in an adjacent tissue.
  • the pharmaceutical composition is in an orally administrable form.
  • the known pharmaceutical forms are particularly preferred for such an application, e.g.
  • an orally administrable form is particularly advantageous, since there is a high level of patient compliance.
  • the pharmaceutical composition can be present in a form which can be administered intravenously, for example as a solution.
  • forms which can be administered can be obtained from a mixture of the active ingredient and auxiliaries.
  • auxiliaries can, for example, fillers (such as sugar, sugar alcohols and cyclodextrins, thus for example sucrose, lactose, fructose, maltose, raffinose, sorbitol, lactitol, mannitol, maltitol, erythritol, inositol, trehalose, isomalt, inulin, maltodextrin, ß- Cyclodextrin, hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, sulfobutyl ether-cyclodextrin or combinations thereof; calcium phosphate); Carriers (such as polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polyvinylpyrrolidone (PVP), poly
  • Polymers such as polyvinylpyrrolidone, vinylpyrrolidone / vinyl acetate copolymer, polyalkylene glycol (e.g. polyethylene glycol), hydroxyalkyl cellulose (e.g. hydroxypropyl cellulose), hydroxyalkylmethyl cellulose (e.g. hydroxypropylmethyl cellulose), carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl acrylate, e.g. polyvinyl acrylate, e.g.
  • Vinyl alcohol / vinyl acetate copolymer polyglycosylated glycerides, xanthan gum, carrageenan, chitosan, chitin, polydextrin, dextrins, starch and starch derivatives, proteins and combinations thereof); Surfactants (such as sodium dodecyl sulfate, Brij 96, Tween 80); Disintegrants (such as starch such as sodium starch glycolate, corn starch or their derivatives); Binders (such as, for example, povidone, crosspovidone, polyvinyl alcohols, hydroxypropylmethyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone); Lubricants (such as stearic acid or its salts such as magnesium stearate, silicon dioxide, talc); Sweeteners (such as aspartame); Flavorings (such as ß-carotene); Plasticizers (such as triethyl citrate, dibutyl phthalate);
  • a pharmaceutical composition according to the invention can also contain preservatives, solvents, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for adjusting the osmotic pressure, buffers or other components and substances customary for pharmaceutical compositions.
  • FIG. 1 shows the increased plasma concentration of VIF in patients with heart failure (NYHA levels III and IV) compared to control persons (NYHA level ⁇ II).
  • the NYHA classification is a scheme originally published by the New York Heart Association for classifying heart diseases according to their severity. Most often it is used to classify heart failure into different stages according to the patient's ability to perform.
  • NYHA I heart disease without physical limitations. Daily physical exertion does not cause inadequate exhaustion, arrhythmia, shortness of breath or angina pectoris.
  • NYHA II Heart disease with slight physical impairment. No complaints in peace. Daily physical exertion causes exhaustion, arrhythmias, shortness of breath or angina pectoris.
  • NYHA III heart disease with severe impairment of physical performance during normal activity. No complaints in peace. Low physical exertion causes exhaustion, arrhythmias, shortness of breath or angina pectoris.
  • NYHA IV Heart disease with discomfort in all physical activity and at rest. Bedridden.
  • FIG. 2 shows the antihypertensive effect of VIF on male Wistar rats after subcutaneous application of angiotensin II (0.4 mg per kg and day) with (A) or without ( ⁇ ) intraperitoneal application of VIF (1 mg per ml).
  • FIG. 3 shows the size of the area affected by an induced myocardial infarction (as a percentage of the ventricle) and the ejection fraction after the induced myocardial infarction (as a percentage of the ejection fraction before myocardial infarction) in mice with prior and subsequent 2-day treatment with VIF and mice without treatment with VIF.
  • FIG. 4 shows the size of the area affected by an induced myocardial infarction in the form of histological sections.
  • FIG. 5 shows (A) the influence of the VIF treatment (A) on the ejection fraction of the heart after a myocardial infarction and (B) the influence of VIF on the blood pressure.
  • FIG. 6 (A) to (E) shows the results, explained in more detail in Example 7, of immunohistochemical analyzes using VIF, which in (D) and (E) clearly demonstrate the positive influence of VIF on the formation of new vessels.
  • FIG. 7 (A) and (B) show the results of promoting the mitochondrial oxygen consumption rate as induced by VIF, which were explained in more detail in Example 8.
  • the primary object is achieved according to the invention by the provision of a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it, for use in the prevention and / or treatment of the consequences of a heart disease, preferably selected from the group consisting of coronary heart diseases, Myocarditis, myocardial infarction, myocardial ischemia, and myocardial hypoxia.
  • VIP vasoconstriction-inhibiting factor
  • Previous therapies for heart disease specialize in lowering blood pressure over the long term in order to avoid recurrence of the same or similar heart diseases. Acute treatment strategies as well as compatible and safe prevention strategies for high-risk patients are urgently needed. There is also a great need for maintenance therapies after heart disease, which for example prevent the deterioration of the condition of the heart tissue.
  • Such damage that has already occurred cannot, however, be treated satisfactorily and sustainably by the previous forms of therapy.
  • treatment with previous forms of therapy is still unsatisfactory today. Patients often show no improvement in cardiac function, which is why further, invasive therapies are often necessary.
  • Such therapies include cardiac resynchronization therapy (CRT), a biventricular pacemaker or an implantable cardioverter / defibrillator (ICD), which in turn carry a high risk of bleeding and infection.
  • CTR cardiac resynchronization therapy
  • ICD implantable cardioverter / defibrillator
  • VIF in addition to its influence on the renin-angiotensin system - and thus also on the regulation of blood pressure - has a protective effect in, for example, a heart attack.
  • a protective effect of VIF on heart muscles during persistent circulatory disorders was discovered and further characterized.
  • the protective effect was shown by the fact that in pilot studies (pre-) treatment with VIF significantly reduced the area affected by an infarction.
  • Such an effect is not described in the prior art for VIF and represents an enormous potential in the prevention of the consequences of a heart disease, in particular through a new approach which is aimed specifically at prevention or attenuation of the consequences of heart disease.
  • the therapy for the affected patients is also facilitated (e.g. by a lower drug dose or by weaker drugs with fewer side effects and thus higher compliance for the patient).
  • VIF leads to an improvement in the ejection fraction (ejection fraction) of the heart after a persistent circulatory disorder.
  • the ejection fraction serves as a measure of the heart function.
  • Such an effect is also not described in the prior art for VIF and represents a great advantage for a possible treatment, since previous therapies have so far failed to improve cardiac function.
  • RLX030 Steelaxin
  • Serelaxin cannot be provided.
  • Serelaxin could neither reduce cardiovascular mortality in the first 180 days nor any further deterioration in initially stabilized patients in hospital in the first 5 days after the first episode of heart failure.
  • VIF surprisingly leads to the formation of new vessels as well as to an increased mitochondrial oxygen consumption rate after an induced infarction. It is known that after an acute infarction, significant metabolic changes occur not only in the infarcted but also in the surviving, non-infarcted segment (Mathes et al., 1974 Decreased contractility of the non-infarcted myocardium after an experimental infarction. In: Thauer R. , Pleschka K. (Ed.) The Arterial System, Edition 40), among others to a lower contractility due to a decreased oxygen supply. As part of the data collection for the present invention, it has now surprisingly been shown that VIF does not only play a role in vasoconstriction.
  • VIF also have specific properties that can play an important role in therapy both in the prevention and treatment of heart disease. It could be shown that VIF increases the oxygen consumption rate of the mitochondrial respiratory chain in relevant cell types of the heart muscle, and thus can contribute to an increased contractility of the heart muscle.
  • VIF vasoconstriction-inhibiting factor
  • SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence with at least 95% sequence identity to the sequence according to SEQ ID NO: 1 is preferred. Also preferred is an amino acid sequence in which an amino acid has been specifically substituted for the sequence according to SEQ ID NO: 1, for example in order to examine the effect / the mechanism of action of VIF.
  • SEQ ID NO: 1 describes the amino acid sequence of the vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) in its entire length.
  • the VIF preferably contains an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO : 8 or an amino acid sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sequence identity to the sequence according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence with at least 95% sequence identity to the sequence according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence in which one amino acid is specifically opposite to the sequence according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 was substituted, for example to investigate the effect / the mechanism of action of VIF.
  • SEQ ID NOs: 2 to 8 describe the amino acid sequences of individual peptides within the VIF (SEQ ID NO: 1).
  • the present invention also relates to a nucleic acid for use according to the invention, the nucleic acid having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sequence Identity to the sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO : 8 coded.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence according to is preferred SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, or one Amino acid sequence with at least 95% sequence identity to the sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence in which one amino acid is specifically opposite to the sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 was substituted, for example in order to investigate the effect / the mechanism of action of VIF.
  • the present invention preferably relates to a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it, for use according to the invention, the prevention and / or treatment reducing the area of the heart tissue affected by the heart disease and / or reducing the restriction of the Cardiac output involves heart disease.
  • VIP vasoconstriction-inhibiting factor
  • the present invention relates to a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it for use according to the invention, the prevention and / or treatment of the consequences of a heart disease being achieved by increased neovascularization as a result of the administration of VIF.
  • VIP vasoconstriction-inhibiting factor
  • the present invention relates to a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it for use according to the invention, the prevention and / or treatment of the consequences of a heart disease being achieved by an increased mitochondrial oxygen consumption rate as a result of the administration of VIF becomes.
  • VIP vasoconstriction-inhibiting factor
  • the present invention relates to a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it, for use according to the invention, the prevention and / or treatment of the consequences of a heart disease through an increased contractility of the heart muscle cells as a result of the VIF Gift is achieved.
  • VIF vasoconstriction-inhibiting factor
  • the property of VIF, through its influence on the respiratory chain of the mitochondria and thus the oxygen turnover of a cell, of directly influencing the metabolism of cardiac muscle cells suggests dual therapeutic use of VIF: on the one hand for prevention in patients with a risk and / or predisposition the development of coronary heart disease, as well as treatment after a heart attack to strengthen the cells affected by the infarct.
  • the present invention relates to a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding this for use according to the invention, the treatment of the consequences of a heart disease being achieved by increased monocyte infiltration into the infarcted tissue as a result of administration of VIF becomes.
  • VIF vasoconstriction-inhibiting factor
  • the restriction of the cardiac output is one of the most important and therefore most dangerous impairments, since a restricted cardiac output can endanger the oxygen supply to the entire body. The less the cardiac output is restricted, the less the loss of function of the heart is.
  • a vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid encoding it is further preferred for use according to the invention, the amino acid sequence or the nucleic acid sequence encoding it being produced by a fully synthetic process, by a biotechnological process or a combination of such processes, or wherein the production of the amino acid sequence, or the nucleic acid sequence encoding it, comprises a fully synthetic process, a biotechnological process or a combination of such processes.
  • vasoconstriction-inhibiting factor or a nucleic acid that codes for this is preferred for use according to the invention
  • the VIF as a peptide, protein, optionally as a partial sequence of the VIF amino acid sequence and / or corresponding mimetics or as nucleic acid and / or a mixture thereof is used or applied, optionally together with at least one further pharmaceutically acceptable agent.
  • the dosage form of the VIF or its form when used can have an influence on the spatial distribution of the VIF, its Have concentration in blood or its half-life.
  • auxiliaries as described herein, are used as pharmaceutically acceptable agents, in particular to achieve the properties of the VIF described in to influence the corresponding interest.
  • the properties described have an influence in particular on the amount of VIF available in the blood or in the heart tissue.
  • the too fast or too slow degradation of VIF, or its half-life plays a major role. It is preferred that larger fluctuations in the VIF concentration are avoided in order to avoid possible over- or under-dosing.
  • the nucleic acid sequence or the amino acid sequence optionally contains at least one additional sequence as a partial sequence of the VIF amino acid sequence and / or corresponding mimetics, preferably where the at least one additional sequence has a stabilizing function, a marker function, an interaction function, a modulation function, or a Has a localizing function.
  • the additional sequence in the direction from the 5 'to the 3' end of the nucleic acid, or in the direction from the C-terminal to the N-terminal end, is preferred before or after the sequence of the VIF or the sequence encoding the VIF , and not within this sequence.
  • the at least one additional sequence does not adversely affect the activity of VIF.
  • the one or more of the at least one additional sequence (s) can positively or negatively influence the activity of VIF.
  • the at least one additional sequence does not influence the activity of VIF.
  • Additional functions such as a stabilizing function are of great advantage in order to counteract possible degradation or degradation processes in the desired area of application (e.g. the human body, especially in the blood vessels and heart tissue), which results in longer-lasting and greater availability in terms of area.
  • Marker functions allow tracking and thus marking of the already treated tissue, or the distribution in the application area can also be studied and analyzed by tracking.
  • An interaction function can enable interaction with previously selected other substances or fabrics. Modulation functions allow an influence on the activity, for example, which can for example be tied to a certain length of stay in the application area, whereby an activity before and / or after a previously selected time frame is no longer possible or is only then possible.
  • a localizing function is, for example, a signal peptide, or a nucleic acid or amino acid sequence that encodes it, which triggers or initiates transport into a previously selected tissue.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition containing or consisting of a) vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) as defined above, b) optionally at least one auxiliary and / or additive, preferably wherein the at least one auxiliary and / or additive is selected from the group consisting of fillers, carriers, polymers, surfactants, disintegrants, binders, lubricants, sweeteners, flavorings, plasticizers, coating materials, coolants, re / recrystallization inhibitors, fluxes, defoamers, antioxidants, adsorbents, colorants, pH value changes Substances, preservatives, solvents, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for setting the osmotic pressure or buffers, and c) at least one further pharmaceutically active substance, the at least one further pharmaceutically active substance being selected from statins, anticoagulants, beta blockers n, ACE inhibitors, platelet aggregation inhibitors,
  • the protective effects of VIF on cardiac muscle cells described above can advantageously be used in therapy for the prevention and / or treatment of the consequences of a heart disease. It is particularly advantageous to combine the therapy with other pharmaceutically active substances.
  • the antihypertensive effects of the substances used to date can be combined with the protective effects of VIF.
  • the consequences of heart disease, as described above can be reduced or even prevented.
  • high blood pressure - an important cause of heart disease - is not discovered in time before heart disease occurs. The risk of heart disease can then be reduced by lowering blood pressure, but it is by no means eliminated.
  • An additional, preferably joint therapy with VIF, preferably as part of a pharmaceutical composition according to the invention, can in this situation at least reduce or even prevent the consequences of a heart disease, as described above, for example as part of long-term therapy, but also as part of short-term treatment .
  • the pharmaceutical composition for use in treating the consequences of a heart disease is one that is used in the context of post-infarction secondary prevention, VIF in combination with a statin and / or a beta blocker and / or an anticoagulant and / or optional is given an ACE inhibitor.
  • VIF post-infarction secondary prevention
  • the administration of an ACE inhibitor and / or an angiotensin II receptor blocker can preferably be reduced with the simultaneous administration of VIF.
  • a pharmaceutical composition for use in the prevention of a heart disease, in particular in high-risk and high-risk patients for the development of a coronary heart disease, or a heart failure wherein VIF in combination with a statin and / or a beta blocker and / or a Anticoagulant and / or optionally an ACE inhibitor is administered.
  • VIF can in particular be administered together with a statin, or another lipid-lowering agent, in order to counteract synergistic atherosclerosis and plaque formation caused by the statin, as well as directly the reduced activity of the cells of the heart tissue due to VIF. This can prevent the risk of a heart attack, but also the risk of a perioperative heart attack as a complication.
  • Patients who have suffered a heart attack are usually treated simultaneously with different drug groups as a result of a heart attack, usually in a combination of four or more preparations, often in a four-fold combination of an anticoagulant to inhibit blood clotting, such as ASA or clopidogrel , a statin to lower cholesterol, an ACE inhibitor or angiotensin II receptor blocker to lower blood pressure and a beta blocker to lower your heart rate.
  • an anticoagulant to inhibit blood clotting such as ASA or clopidogrel
  • statin to lower cholesterol
  • an ACE inhibitor or angiotensin II receptor blocker to lower blood pressure
  • beta blocker to lower your heart rate.
  • the additional administration of VIF can, on the one hand, reduce the use of antihypertensive agents because of its vasodilatory properties.
  • VIF can significantly contribute to the faster regeneration of infarcted and neighboring heart tissue and thus have a direct positive influence on the treatment of acute coronary heart disease.
  • VIF is therefore used preventively for cardio- or vasculoprotective strategies, alone or in combination.
  • VIF preferably in a pharmaceutical composition according to the invention
  • Therapy with VIF can be carried out in the context of acute treatment, prevention and / or maintenance therapy.
  • components a) and c) are preferably used in a pharmaceutically effective amount.
  • This amount is typically about a concentration of 1 to 1,000 pg / kg body weight.
  • the dosage / dose of a VIF peptide according to the present invention is 1, 10, 30, 50, 100 or 250 pg / kg / day.
  • the use of a higher concentration per day in the range from about 250 pg / kg to 15,000 pg / kg, depending on the extent of the acute symptoms to be treated and furthermore depending on individual patient factors, the concentration can also be about 500 pg / kg to 10,000 pg / kg, about 750 pg / kg to 7,500 pg / kg, or about 500 pg / kg to 5,000 pg / kg) are preferred, for long-term or maintenance therapy a lower dose per day ( ⁇ 5,000 pg / kg , or also ( ⁇ 1000 pg / kg)
  • the dose can vary from application form to application form, as is known to the person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be applied systemically or locally.
  • Preferred systemic applications are oral or parenteral such as intravenous, subcutaneous or endobronchial applications, applications per os, or an injection directly into the target tissue to be treated, preferably to induce a topical effect.
  • the pharmaceutical composition of the invention is in solid form, e.g. as powder, in liquid form, e.g. as a solution for injection or as an aerosol.
  • the present invention relates to a kit for non-therapeutic in-vitro use, containing the vasoconstriction-inhibiting factor (VIF) or a nucleic acid that encodes this, as defined above.
  • VIF vasoconstriction-inhibiting factor
  • Such a kit is used in particular in uncovering the mechanisms of action and the molecular mechanisms of VIF.
  • other content can also be present. These include, for example, further compounds, substances or reagents that can be used for the detection work.
  • a kit can be provided in such a way that the contents are present in already measured amounts and / or concentrations so that they can be used directly or can simply be diluted to a usable concentration. If further contents are present in addition to the VIF or the nucleic acid encoding it, these are preferably provided in a quantity or weight ratio to the VIF or the nucleic acid encoding it, in which they are actually or approximately used.
  • VIF blood pressure lowering effect of the VIF
  • VIF Intraperitoneally (1 mg per ml) and angiotensin II subcutaneously (0.4 mg per kg and day).
  • the control group received only angiotensin II.
  • the blood pressure was then measured every 5 minutes for 30 to 45 minutes using a microcatheter and determined using the ADInstruments software (Miliar, Germany).
  • mice were treated with VIF for 2 days before and 2 days after the investigation. Control animals received no treatment.
  • a heart attack was triggered on the day of the examination.
  • the mice were anesthetized and ventilated by an intraperitoneal injection of 100 mg / kg body weight ketamine and 10 mg / kg body weight xylazine.
  • the heart attack was triggered by an occlusion of the LAD (left anterior descending artery).
  • the area of the affected tissue was then determined via histological sections. For this, the heart was removed, perfused with 1% Evans Blue, frozen for 2 h at -20 ° C. and then cut into 5 sections. The sections were incubated for 10 min with preheated TTC solution and fixed in formalin. Then recordings were made and the infarct area was calculated using DISKUS (Hilgard, Germany).
  • peptide-containing pharmaceutical compositions are conditioned by the solubility profile of the particular peptide of interest, its stability and the isoelectric point of the peptide as active ingredient. These characteristics also determine the optimal pH value, which is used in the context of development and formulation. In particular, the choice of the correct buffer system can be of great importance.
  • peptide-containing pharmaceutical compositions are then dissolved in a suitable physiologically compatible buffer / solvent system immediately prior to their use, provided that they are provided in powder form or in lyophilized form.
  • stabilizers and preservatives is also important, for example to prevent contamination of the peptide active ingredient.
  • Stabilization can be of great importance in particular for non-parenteral administration if a certain half-life of the peptide in the patient must be achieved so that the peptide active ingredient can develop its activity over a given period of time.
  • aids may be available.
  • the use of aids for delayed release can also be of importance in the context of the VIF peptides of the present invention, in particular when these are used in long-term therapy.
  • Suitable pharmaceutical compositions based on peptides are familiar to pharmacologists (see Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, edited by Lars Hovgaard, Sven Frokjaer, Marco van de Weert, Taylor & Francis, 2012).
  • the substances were provided in powder form, solution or emulsion and mixed one after the other and optionally brought into solution.
  • Different buffer systems were used under physiological conditions, depending on whether a full-length VIF peptide or a of the truncated variants was used (cf. Swain et al., Recent Patents on Biotechnology, 2013, 7).
  • the mixture was then sterile filtered.
  • the stability and functionality of the peptides was checked over time by means of analytical in vitro tests.
  • mice Male wild-type C57BL / 6N mice (Charles River, Germany) were 8 to 10 weeks old under anesthesia (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine, ip) and analgesia (0.1 mg / kg buprenorphine) intubated. The mice were ventilated using a rodent respirator (Harvard Apparatus, Germany) with positive pressure and oxygen.
  • a left thoracotomy was then performed and the Ml ("myocardial infarction") was performed by occlusal ligature of the left anterior descending artery (LAD) with 0/7 silk, as previously described in Curaj et al. (Minimally invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice. J Vis Exp. 2015: e52197).
  • the rib, muscle and skin incisions were closed with separate sutures.
  • Analgesia was continued for five days after the indicated infarction using 0.1 mg / kg buprenorphine every eight hours.
  • the hearts were then removed at defined times (after 0, 1, 4, 7, 14, 21, 28 days) and prepared for further analysis.
  • VIF was dissolved at 6.7 pg / ml (1 mmol / l) in NaCl and loaded into 100 ⁇ l osmotic pumps of the Alzet type 1002 (0.25 ml / hour, Charles River, Cologne, Germany), resulting in one dose of 0.8 pg / kg per 24 hours.
  • the Alzet pumps were implanted 24 hours prior to MI induction.
  • the pumps for the controls were accordingly only filled with NaCl. All mice were kept under standardized conditions in the specially designated animal rooms at the University Hospital Aachen (Germany). All animal experiments and test protocols were approved by the local authorities in compliance with the European and German animal welfare laws (84-02.04.2016.A315). All mice were included in the analysis, unless the animals had died in the course of the experiment.
  • Two-dimensional and M-mode echocardiography measurements were made with an ultrasound image converter especially for small animals (Vevo 770, FUJIFILM Visualsonics, Toronto, Canada). Both measurements were taken before and after a heart attack. For this purpose, the mice were anesthetized with 1.5-2% isoflurane and placed on their backs on a heat pad. The ejection fraction, cardiac output volume and heart rate were analyzed. The results are shown in FIG.
  • VIF significantly increases the ejection fraction of the heart after treatment post-infarction (FIG. 5A), which on this scale was not expected whether the properties described for VIF and a significant contribution to future treatments after a myocardial infarction can enable. There is also a slight decrease in blood pressure (FIG. 5B).
  • Gr1 -high expressing (high) monocytes are characterized like human CD14 hi9h CD16 monocytes, dominate the early phase of myocardial infarction and show phagocytic, proteolytic and inflammatory functions.
  • Gr1 -highly expressing monocytes digest the infarct heart tissue and remove cell debris from this area.
  • the number of monocytes (anti-ADC3 visualized) in VIF-treated animals was predominantly the same as in the control group. However, on day 7, a slight, but statistically significant, increase was found in the individual coloration (FIG. 6B).
  • VIF can be used as a therapeutic agent after an acute heart attack to promote and accelerate cell regeneration.
  • VIF vasoconstrictive factor
  • 6D and E show the number of SMA- and CD31-positive cells in the field of view, CD31 being used as a marker for endothelial cells and SMA as a marker for smooth muscle cells.
  • a statistically significant amount of increased myofibroblast count and angiogenesis both as an indication of vascularization, could be observed in the groups treated with VIF on day 7.
  • VIF administration leads to accelerated neovascularization as the basis for healing the tissue damaged by the infarction.
  • This makes VIF an interesting candidate in the treatment of an acute heart attack in order to specifically promote the formation of new blood vessels and thus minimize the damage that occurs.
  • FCCP-stimulated OCR can therefore be used to determine the delta between maximal and basal activity. This delta, in turn, is a measure of how well a cell can react to increased energy requirements (e.g. after stress).
  • VIF-treated cells (VIF in each case titrated from 0.1 to 1 mM) were always able to achieve significantly higher OCR values than the untreated control cells (CTRL).
  • VIFs increase the maximum myocardial oxygen turnover and thereby the contractility, among other things. of heart muscle cells can increase. This can make a decisive contribution both to the prophylaxis as well as the therapy of coronary heart diseases, since it can specifically influence the relevant OCR values by modulating the respiratory chain reaction.
  • the statistical data shown in the figures represent the mean ⁇ SEM (standard error of the mean). Statistical analysis was performed using Prism 7 software (GraphPad). The means of two groups were compared using Student's unpaired t-test using Welch's correction by significant variance. More than two groups were assessed using a one-way ANOVA analysis of variance followed by a Newman-Keuls post-hoc test, or a two-way ANOVA analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test, in the case of more than two variable parameters as indicated analyzed. P values of ⁇ 0.05 were considered significant.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor(VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend den VIF und zielführende (Kombinations-)Therapien, insbesondere mit den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Kitzur nicht-therapeutischen in-vitro Anwendung, enthaltend den VIF oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert.

Description

Kardioprotektiver Effekt des Vasokonstriktion-inhibierenden Faktors (VIF)
Technisches Gebiet
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Medikamente, insbesondere betreffend solche Therapeutika, die gezielt bei der Prävention und/oder Therapie der Folgen einer Herzerkrankung, insbesondere eines Herzinfarkts, zur Anwendung kommen können.
Hintergrund der Erfindung
Bluthochdruck und seine Folgen stellen eine der häufigsten Todesursachen weltweit dar. Oftmals bleibt Bluthochdruck als stille Gefahr unerkannt, bis sich dieser in kritischen Folgeerkrankungen und/oder -Schäden äußert. Hoher Blutdruck belastet dabei insbesondere das Herz-Kreislauf-System. Einerseits belastet hoher Blutdruck besonders das Herz selbst, allen voran die linke Herzkammer, welche den hohen Druck aufbringt / aufbringen muss und damit eine ständige Mehrarbeit leisten muss. Um dies weiter zu gewährleisten, wird die dicke Muskelschicht des Herzens (Myokard) weiter vergrößert. Mit einer zunehmenden Dicke jedoch wird die Sauerstoffversorgung der inneren Muskelschichten zunehmend erschwert. Über einen längeren Zeitraum kann dies schließlich zu einer Herzschwäche (Herzinsuffizienz) führen, bei welcher das Herz nicht länger fähig ist, den Körper mit einer ausreichenden Menge an sauerstoffreichem Blut zu versorgen. Durch den hohen Druck in den Blutgefäßen andererseits verschleißen oder verhärten die Blutgefäße und ermöglichen somit die Entstehung von Arteriosklerose, bei welcher sich insbesondere Cholesterinester und andere Fette in die Gefäßwand einlagern. Durch diese Einlagerungen werden die Blut- gefäße verengt, was wiederum durch den damit einhergehenden erhöhten Gefäßwiderstand einen weiteren Blutdruckanstieg zur Folge haben kann. Besonders auf längere Sicht wird dadurch das Risiko für koronare Herzerkrankungen, Angina pectoris, Herzinfarkt und Schlaganfall drastisch erhöht.
Das„American College of Cardiology“ (ACC) und die„American Heart Association“ (AHA) beschreiben seit dem 13. November 2017 die folgende Klassifizierung der Blutdruckwerte (“New ACC/ AHA High Blood Pressure Guidelines Lower Definition of Hypertension")·.
Systolisch [mmHg] Diastolisch [mmHg]
Normal <120 und <80
Erhöht <130 und <80
Stage i 130-139 oder 80-89
Stage 2 ^140 oder ^90
Hypertensive Krise ^180 oder § 20
Die„European Society of Cardiology“ (ESC) und die European Society of Hypertension (ESH) beziehen sich weiterhin auf die bereits in 2003 veröffentlichte Klassifizierung (Tran et Giang,„Changes in blood pressure Classification, blood pressure goals and pharmaco- logical treatment of essential hypertension in medical guidelines from 2003 to 2013“, IJC Metabolie & Endocrine 2 (2014), 1-10)\
Systolischer Diastolischer
Blutdruckwert Blutdruckwert
[mmHg] [mmHg]
Optimal <120 <80
Normal 120-129 80-84
Erhöht 130-139 85-89
Stage i 140-159 90-99
Stage 2 160-170 100-109
Stage 3 ^180 ^1 10
Isolierte systolische ^140 <90
Hypertonie Das Renin-Angiotensin-System (bzw. das gesamte Renin-Angiotensin-Aldosteron-Sys- tem) und insbesondere die zugrundeliegenden Angiotensin-Peptide sind essentiell für die Regulierung des Blutdrucks.
Das Enzym Renin sorgt für die Aktivierung einer Kaskade, in welcher Renin durch seine Protease-Funktion das bislang inaktive Angiotensinogen in Angiotensin I umwandelt. Angiotensin I wird schließlich durch das Angiotensin Converting Enzyme (ACE) in Angiotensin I I umgewandelt, welches eine stark gefäßverengende (vasokonstriktive) Wirkung hat und die Freisetzung von weiteren Stoffen, z.B. des Hormons Vasopressin, fördert, die wiederum blutdrucksteigernde Wirkung haben.
Salem et al., Identification of the Vasoconstriction-Inhibiting Factor (VIF),„A Potent Endo- genous Cofactor of Angiotensin II Acting on the Angiotensin II Type 2 Receptor“, Circula- tion, 2015 beschreibt ein neues Peptid, Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF), welches durch einen Effekt auf den Angiotensin II Typ 2 Rezeptor in die vasokonstriktiven Eigenschaften von Angiotensin II eingreifen kann. Das VIF-Peptid als solches und dessen Entstehung im menschlichen Körper wird grundsätzlich beschrieben. Jedoch werden mögliche Effekte auf die humane Pathophysiologie, insbesondere im Hinblick auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und damit die therapeutische Anwendbarkeit und Nutzbarmachung des Peptids nicht studiert.
Zudem wurde gefunden, dass in Patienten mit Herzinsuffizienz die Plasmakonzentration von u.a. VIF erhöht war (Fig. 1). Unklar war dabei jedoch, ob und wie man das auftretende Phänomen technisch nutzbar machen kann. Ferner beschreibt Salem et al. ausschließlich den Effekt von VIF auf die Vasokonstriktion. Spezifische Wirkungen, oder der gezielte Einsatz von VIF für konkrete Erkrankungen, werden nicht offenbart.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der gezielten Aufdeckung der Wirkmechanismen und der molekularen Mechanismen des VIF, insbesondere im Rahmen kardialer Ereignisse wie Angina pectoris und Herzinfarkt, um dabei dessen therapeutisches Potential zu erschließen. Besonderer Fokus liegt hierbei auf gezielten Studien zur Nutzbarmachung des VIF in einer möglichen Behandlung von Patienten mit kardialen Erkrankungen. Insbesondere sollten durch gezielte technische Modifikationen des VIF und dessen kleinere Peptide weitere Eigenschaften sowie VIF-Mutanten untersucht werden. Ziel dieser Aufdeckung und Untersuchung ist dabei die Bereitstellung eines Präparats oder Kombipräparats, welches in der Behandlung und Vorbeugung kardialer Erkrankungen eingesetzt werden kann. Die bisherige Behandlung von Herzerkrankungen, insbesondere einem Herzinfarkt, sieht häufig die chronische Senkung des Blutdrucks und damit eine lebenslange medikamentöse Therapie vor. Beispiele hierfür sind eine Therapie mit Betablockern, Statinen, ACE- Hemmern oder Peptiden wie Serelaxin. Für Serelaxin etwa konnte jedoch in der Phase-Ill- Studie RELAX-AHF-2 der Nachweis eines klinischen Nutzens des entsprechenden Wirkstoffs RLX030 (Serelaxin) nicht erbracht werden. Mögliche Nebenwirkungen oder Langzeit- Folgeschäden sämtlicher etablierter Therapien sind dabei nicht auszuschließen. Basierend hierauf war es die primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue, verbesserte Therapieformen für Patienten mit Herzerkrankungen zur Therapieerleichterung aufzudecken, wofür VIF bislang nicht beschrieben war.
Definitionen
Die Begriffe„Aminosäure-Molekül/-Sequenz“,„Protein“,„Peptid“ oder Polypeptid werden hierin austauschbar verwendet, ohne darauf einzugehen, welche Länge eine spezifische Aminosäure-Sequenz umfasst. Der Begriff„Aminosäure“ oder„Aminosäure-Sequenz“ oder „Aminosäure-Molekül“ umfasst alle natürlichen oder chemisch synthetisierten Proteine, Peptide oder Polypeptide oder ein modifiziertes Protein, Peptid, Polypeptid und Enzym (Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität), wobei der Begriff„modifiziert“ jegliche rekom- binante, chemische oder enzymatische Modifikation des Proteins, Peptids, Polypeptids und Enzyms oder der Nukleinsäure-Sequenz, die diese kodiert, umfasst.
Die Begriffe„Sequenz(en)“ und„Molekül(e)“ werden hierin austauschbar verwendet, wenn auf Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen/-Moleküle bezogen wird.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich“ bezieht sich hierin auf diejenigen Bestandteile, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen, die, im Umfang einer medizinischen Betrachtung oder innerhalb der Definition jeglicher medizinischen Aufsichtsund/oder Zulassungsbehörde, geeignet für einen Kontakt mit den Zellen, dem Gewebe o- der den Bestandteilen eines Subjekts, d.h. Menschen und Tiere, inklusive Kontakt mit malignen Zellen oder Geweben eines Subjekts, ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Reaktion oder anderen Komplikationen oder Nebenwirkungen entsprechend mit einem angemessenen Nutzen-Risiko-Verhältnis für ein Subjekt / einen Patienten ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden dabei ein oder mehrere Hilfsstoffe, wie unten beschrieben, verwendet. Der Begriff „Subjekt”, wie hierin verwendet, bezeichnet einen Menschen oder ein nicht menschliches Tier. Der Begriff enthält Säuger (z.B. Menschen, andere Primaten, Schweine, Nager (z.B. Mäuse, Ratten oder Hamster), Hasen, Meerschweinchen, Kühe, Pferde, Katzen, Hunde, Schafe und Ziegen), ist hierauf jedoch nicht beschränkt. In einer Ausführungsform ist das Subjekt ein Mensch.
Der Begriff„Herzerkrankung“ umfasst neben den klassischen Erkrankungen wie koronaren Herzerkrankungen vorzugsweise auch pathologische Zustände und Ereignisse des Herzens und damit u.a. auch insbesondere einen Herzinfarkt, Angina pektoris und Ischämien im Herzgewebe.
Der Begriff„Folgen einer Herzerkrankung“, wie hierin verwendet, beinhaltet nicht das Auftreten der Erkrankung selbst, z.B. das Auftreten eines Herzinfarkts, sondern vielmehr die damit verbundenen funktionalen und/oder pathologischen Erscheinungen, z.B. eine Einschränkung der Herzleistung oder den durch die Ischämie des Infarkts betroffenen Bereich.
Der Begriff„Herzgewebe“ umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, das Perikard, das Epikard, den Herzbeutel, die unter dem Herzen befindliche Fettschicht (Te/a subepicardiaca), das Myokard mit den Herzmuskelzellen und das Endokard, sowie die arteriellen und venösen Gefäßzugänge zum Herzgewebe, insbesondere die Koronargefäße.
Der Begriff„Infarkt“ beschreibt einen Untergang von Gewebe - insbesondere durch Nekrose - infolge einer Sauerstoffunterversorgung (Hypoxie), vorzugsweise durch einen unzureichenden Blutfluss (Ischämie).
Die Begriffe„behandeln”,„behandelnd”,„Behandlung” und„Therapie“, wie hierin verwendet, beschreiben die Behandlung in einem Säuger, z.B. in einem Menschen, inklusive (a) dem Verhindern der Folgen einer Erkrankung, d.h. deren Entwicklung aufzuhalten; (b) dem Lindern der Folgen einer Erkrankung, d.h. eine rückläufige Entwicklung der durch die Erkrankung verschlechterten Funktionen bzw. des davon betroffenen Gewebes zu erwirken; und/oder (c) dem Heilen der Folgen der Erkrankung. Die Begriffe„Behandlung“ und„Therapie“ werden dabei austauschbar verwendet und beinhalten jegliche Form der präventiven und/oder kurativen Behandlung bzw. Therapie.
Die Begriffe„Vorbeugen“,„vorbeugend“ oder„Prävention“ bedeuten, dass eine prophylaktische Behandlung vor dem Ausbruch der Erkrankung oder vor dem Auftreten der Symptome, die mit einer vorzubeugenden Erkrankung assoziiert sind, stattgefunden hat. Eine Prävention führt jedoch nicht in jedem Fall und nicht zwangsläufig zu einem vollständigen Ausbleiben der Erkrankung und deren Symptome; ein Abmildern oder Verzögern der Erkrankung bzw. deren Symptome ist somit ebenfalls von einer Prävention, wie hierin beschrieben, umfasst.
Der Begriff„Teilsequenz“, wie hierin im Kontext von Nukleinsäure-, Aminosäure- und/oder Peptidsequenzen verwendet, bezieht sich auf ein kohärentes/zusammenhängendes Fragment, das von einer Matrixsequenz gemäß der vorliegenden Anmeldung abgeleitet werden kann. Eine Teilsequenz umfasst daher üblicherweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr zusammenhängende Positionen gemäß der Matrixsequenz, gegebenenfalls umfassend zusätzliche Modifikationen.
Sofern in der vorliegenden Anmeldung auf einen Prozentsatz der Homologie oder Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen bezogen wird, definieren diese Werte diejenigen Werte, die durch Verwendung des EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nukleotide) Programms (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) für Nukleinsäuren oder das EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (protein) Programm (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) für Aminosäuren erhalten wurden. Diese Programme, die von dem European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institut (EBI) für lokale Sequenz-Alignments bereitgestellt werden, verwenden einen modifizierten Smith-Waterman Algorithmus (siehe http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ und Smith, T.F. & Waterman, M.S.„Identification of common molecular subsequences” Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1 ): 195-197). Bei der Durchführung eines Alignments werden die Standardparameter, die durch EMBL-EBI definiert sind, verwendet. Diese Parameter liegen (i) für Aminosäure-Sequenzen bei: Matrix = BLOSUM62, gap open penalty = 10 and gap extend penalty = 0.5 oder (ii) für Nukleinsäure-Sequenzen bei: Matrix = DNAfull, gap open penalty = 10 and gap extend penalty = 0.5.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, wie hierin beschrieben, kann systemisch oder bei Relevanz auch lokal appliziert werden. Bei einer systemischen Anwendung wird die pharmazeutische Zusammensetzung, bzw. deren Wirkstoffe, über direkten (z.B. intravenöse Injektion) oder indirekten (z.B. oral über den Magen-Darm-Trakt) Weg in das Blut- und/oder Lymphsystem übertragen, was eine Verteilung im gesamten Körper bzw. die nicht von einer speziellen Barriere (z.B. Blut-Hirn-Schranke) abgetrennten Bereiche, ermöglicht. Bei einer lokalen Anwendung wird die pharmazeutische Zusammensetzung in das Gewebe appliziert, in welchem es wirken soll. Beispielsweise kann dabei eine topische Auftragung oder eine Injektion erfolgen. In manchen Ausführungsformen kann eine lokale Applikation auch in ein benachbartes Gewebe erfolgen. In einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung in oral applizierbarer Form vor. Besonders bevorzugt sind hierbei die bekannten pharmazeutischen Formen für eine solche Anwendung, z.B. Tabletten (nicht-überzogene sowie überzogene Tabletten, bspw. mit magensaftresistenten Überzügen), Kapseln, Dragees, Sprays, Gels, Riegel, Dosierbeutel, Granulate, Pellets, Sirups, Feststoffmischungen, Dispersionen in flüssigen Phasen, Emulsionen, Lösungen, Pasten oder andere schluck- oder kaubare pharmazeutische Zubereitungen und wässrige oder ölige Suspensionen. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, bei einer Präventionstherapie ist eine oral applizierbare Form besonders vorteilhaft, da hierbei eine hohe Compliance der Patienten gegeben ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung in intravenös applizierbarer Form, z.B. als Lösung, vorliegen. Sofern anwendbar, können applizierbare Formen aus einer Mischung aus dem aktiven Wirkstoff sowie Hilfsstoffen erhalten werden. Solche Hilfsstoffe können beispielsweise Füllstoffe (wie z.B. Zucker, Zuckeralkohole und Cyclodextrine, somit z.B. Saccharose, Laktose, Fruktose, Maltose, Raffinose, Sorbitol, Lactitol, Mannitol, Maltitol, Erythritol, Inositol, Trehalose, Isomalt, Inulin, Malto- dextrin, ß-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, Sulfobutylether-Cyclodextrin oder deren Kombinationen; Kalziumphosphat); Trägerstoffe (wie z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polyethylenoxid (PEO), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Hydroxypropy- Imethylcellulose (HMPC), Hydroxypropylcellulose (HPC), Carboxymethylethylcellulose (CMEC), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat (HPMCP), Polyacrylat, Polymethylacrylat, Urea und Zucker (z.B. Mannitol)); Polymere (wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Vinylpyrrolidon / Vinylacetat Copolymer, Polyalkylenglykol (z.B. Polyethylenglykol), Hydroxyalkylcellulose (z.B. Hydroxypropylcellulose), Hydroxyalkylmethylcellulose (z.B. Hydroxypropylmethylcel- lulose), Carboxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose, Polyme- thacrylate (z.B. Eudragit® Typen), Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, Vinylalkohol / Vinylacetat Copolymer, polyglykosylierte Glyceride, Xanthangummi, Carrageenan, Chitosan, Chitin, Polydextrin, Dextrine, Stärke und Stärkederivate, Proteine und deren Kombinationen); Tenside (wie z.B. Natrium-dodecylsulfat, Brij 96, Tween 80); Sprengmittel (wie z.B. Stärke, wie beispielsweise Natrium-Stärke-Glykolat, Maisstärke oder deren Derivate); Bindemittel (wie z.B. Povidon, Crosspovidon, Polyvinylalkohole, Hydroxypropylmethylcellu- lose, microcrystalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon); Schmiermittel (wie z.B. Stearinsäure oder deren Salze wie z.B. Magnesiumstearat, Siliziumdioxid, Talk); Süßstoffe (wie z.B. Aspartam); Aromastoffe (wie z.B. ß-Carotin); Weichmacher (wie z.B. Triethylcitrat, Dibutylph- thalat); Beschichtungsmaterial (wie z.B. Polyvinylacetatphtalat, Hydroxypropylmethylcellu- losephtalat); Kühlstoffe (wie z.B. Mentholderivate (z.B. L-mentyllactat, L-menthylalkylcar- bonat, Menthonketale); Re-/Umkristallisierungshemmer; Flussmittel; Entschäumer; Antioxidantien; Adsorptionsmittel; Farbstoffe; Stoffe, die den pH-Wert verändern, sein.
Ebenfalls kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung Konservierungsmittel, Lösungsmittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Salze für die Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer oder weitere, für pharmazeutische Zusammensetzungen übliche Bestandteile und Substanzen beinhalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt die erhöhte Plasmakonzentration von VIF in Patienten mit Herzinsuffizienz (NYHA Stufen III und IV) gegenüber Kontrollpersonen (NYHA Stufe <ll). Die NYHA- Klassifikation ist ein ursprünglich von der New York Heart Association veröffentlichtes Schema zur Einteilung von Herzkrankheiten nach ihrem Schweregrad. Am häufigsten wird sie zur Einteilung der Herzinsuffizienz in verschiedene Stadien entsprechend der Leistungsfähigkeit des Patienten verwendet. NYHA I: Herzerkrankung ohne körperliche Limitation. Alltägliche körperliche Belastung verursacht keine inadäquate Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris. NYHA II: Herzerkrankung mit leichter Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit. Keine Beschwerden in Ruhe. Alltägliche körperliche Belastung verursacht Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris. NYHA III: Herzerkrankung mit höhergradiger Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit bei gewohnter Tätigkeit. Keine Beschwerden in Ruhe. Geringe körperliche Belastung verursacht Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris. NYHA IV: Herzerkrankung mit Beschwerden bei allen körperlichen Aktivitäten und in Ruhe. Bettlägerigkeit.
Figur 2 zeigt den blutdrucksenkenden Effekt von VIF auf männliche Wistar-Ratten nach subkutaner Applikation von Angiotensin II (0,4 mg pro kg und Tag) mit (A) oder ohne (■) intraperitonealer Applikation von VIF (1 mg pro ml).
Figur 3 zeigt die Größe des von einem induzierten Herzinfarkt betroffenen Bereichs (als Prozent des Ventrikels) und die Ejektionsfraktion nach dem induzierten Herzinfarkt (in Prozent zu der Ejektionsfraktion vor Herzinfarkt) in Mäusen mit vorausgehender sowie nachfolgender, jeweils 2-tägiger Behandlung mit VIF und Mäusen ohne Behandlung mit VIF.
Figur 4 zeigt die Größe des von einem induzierten Herzinfarkt betroffenen Bereichs in Form von histologischen Schnitten. Figur 5 zeigt (A) den Einfluss der VIF Behandlung (A) auf die Ejektionsfraktion des Herzens nach einem Herzinfarkt und (B) den Einfluss von VIF auf den Blutdruck. CTR = Kontrolle; preOP = Kontrollmessung vor dem operativen Eingriff im Tiermodell, wie in den Beispielen, insbesondere Beispiel 6, näher erläutert.
Figur 6 (A) bis (E) zeigt die in Beispiel 7 näher erläuterten Ergebnisse von immunhistoche- mischen Analysen unter Einsatz von VIF, die in (D) und (E) anschaulich den positiven Einfluss von VIF auf die Gefäßneubildung demonstrieren.
Figur 7 (A) und (B) zeigen die in Beispiel 8 näher erläuterten Ergebnisse der Förderung der mitochondrialen Sauerstoff-Verbrauchsrate, wie durch VIF induziert.
Ausführliche Beschreibung
Die primäre Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Vasokon- striktion-inhibierenden Faktors (VIF) oder einer Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus koronaren Herzerkrankungen, Herzmuskelentzündung, Herzinfarkt, myokardialer Ischämie und myokardialer Hypoxie.
Bisherige Therapien für Herzerkrankungen spezialisieren sich auf die langfristige Senkung des Blutdrucks, um so ein Wiederauftreten der gleichen oder ähnlichen Herzerkrankungen zu vermeiden. Akute Behandlungsstrategien sowie verträgliche und sichere Präventionsstrategien für Risikopatienten werden dringend benötigt. Ein ebenfalls hoher Bedarf besteht auch an Erhaltungstherapien nach einer Herzerkrankung, die beispielsweise eine Verschlechterung des Zustands des Herzgewebes verhindern.
Bei beispielsweise einem Herzinfarkt ist die Durchblutung von Teilen des Herzmuskels gestört, bzw. unterbrochen. Dadurch treten Hypoxien als Folge der mangelnden Sauerstoffversorgung auf, die zu einem Absterben von Herzmuskelzellen und somit zu Entzündungsreaktionen im Herzgewebe führen können. Solche bereits entstandenen Schäden können von den bisherigen Therapieformen jedoch nicht oder nicht zufriedenstellend und nachhaltig behandelt werden. Zudem erfolgt die Behandlung mit bisherigen Therapieformen auch heute noch nicht zufriedenstellend. Patienten zeigen oft keine Verbesserung der Herzfunktion, weshalb häufig weitere, invasive Therapien notwendig werden. Zu solchen Therapien zählen u.a. die kardiale Resynchronisationstherapie (cardiac resynchronization therapy (CRT), ein biventrikulärer Schrittmacher oder ein implantierbarer Kardioverter/De- fibrillator (ICD), die wiederum ein hohes Risiko an Blutungen und Infektionen mit sich bringen.
Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass VIF neben seinem Einfluss auf das Renin-Angiotensin-System - und damit auch auf die Regulation des Blutdrucks - einen protektiven Effekt bei beispielsweise einem Herzinfarkt aufweist. So wurde überraschend ein protektiver Effekt durch VIF auf Herzmuskeln während einer anhaltenden Durchblutungsstörung entdeckt und weiter charakterisiert. Der protektive Effekt zeigte sich darin, dass in Pilotstudien durch eine (Vor-)Behandlung mit VIF die von einem Infarkt betroffene Fläche signifikant verringert wurde. Ein solcher Effekt ist im Stand der Technik für VIF nicht beschrieben und stellt ein enormes Potential in der Prävention von Folgen einer Herzerkrankung dar, insbesondere durch einen neuen Ansatz, der gezielt auf eine Verhinderung bzw. Abmilderung der Folgen einer Herzerkrankung gerichtet ist. Durch die Verringerung des betroffenen Bereiches werden die daraus entstehenden Folgen abgemildert und letztendlich auch die Therapie für die betroffenen Patienten erleichtert (z.B. durch eine niedrigere Medikamentendosis oder durch schwächere Medikamente mit geringeren Nebenwirkungen und somit einer höheren Compliance bei den Patienten).
Weiter wurde festgestellt, dass VIF zu einer Verbesserung der Ejektionsfraktion (Auswurffraktion) des Herzens nach einer anhaltenden Durchblutungsstörung führt. Die Ejektionsfraktion dient dabei als Maß für die Herzfunktion. Auch ein solcher Effekt ist im Stand der Technik für VIF nicht beschrieben und stellt einen großen Vorteil für eine mögliche Behandlung dar, da bisherige Therapien bei einer Verbesserung der Herzfunktion bislang scheitern. So konnte z.B. ein klinischer Nutzen des Wirkstoffs RLX030 (Serelaxin) nicht erbracht werden. In der RELAX-AHF-2 Studie von Novartis konnte durch Serelaxin weder die kardiovaskuläre Mortalität in den ersten 180 Tagen noch eine erneute Verschlechterung bei initial stabilisierten Patienten im Krankenhaus in den ersten 5 Tagen nach der ersten Herzinsuffizienz-Episode reduziert werden.
Durch Studien im Tiermodell konnte ferner gezeigt werden, dass VIF überraschenderweise nach einem induzierten Infarkt sowohl zur Gefäßneubildung als auch zur erhöhten mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate führt. Es ist bekannt, dass es nach einem akuten Infarkt nicht nur im infarzierten, sondern auch im überlebenden, nicht infarzierten Segment zu deutlichen metabolischen Veränderungen kommt (Mathes et al., 1974 Herabgesetzte Kontraktilität des nicht infarzierten Herzmuskels nach experimentellem Infarkt. In: Thauer R., Pleschka K. (Hrsg.) Das Arterielle System, Ausgabe 40), u.a. zu einer geringeren Kontraktilität auf Grund einer erniedrigten Sauerstoffversorgung. Im Rahmen der Datenerhebung zur vorliegenden Erfindung konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, dass VIF nicht nur eine Rolle bei der Vasokonstriktion spielt. Vielmehr kommen VIF auch spezifische Eigenschaften zu, die sowohl in der Prävention wie in der Behandlung von Herzerkrankungen eine tragende Rolle in der Therapie spielen können. So konnte gezeigt werden, dass VIF die Sauerstoffverbrauchsrate der mitochondrialen Atmungskette in relevanten Zelltypen des Herzmuskels erhöht, und damit zu einer erhöhten Kontraktilität des Herzmuskels beitragen kann.
Gleichzeitig führt die Gabe von VIF nicht zu einer erhöhten Entzündungsreaktion, was das Peptid interessant für den prophylaktischen wie kurativen Einsatz macht. Diese spezifischen Effekte des VIF wurden bis dato nicht beschrieben, und waren in Anbetracht der bereits beschriebenen globalen Wirkmechanismen von VIF nicht zu erwarten. Bevorzugt ist zudem ein Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei der VIF eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 (aus homo sapiens) oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthält. Bevorzugt ist dabei eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 95 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 . Weiter bevorzugt ist eine Aminosäuresequenz, bei der gezielt eine Aminosäure gegenüber der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 substituiert wurde, beispielsweise um die Wirkung / den Wirkmechanismus von VIF zu untersuchen. SEQ ID NO: 1 beschreibt dabei die Aminosäuresequenz des Vasokonstriktion-inhibierenden Faktors (VIF) in seiner gesamten Länge.
Vorzugsweise enthält der VIF in einer anderen Ausführungsform eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8. Bevorzugt ist dabei eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 95 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 . Weiter bevorzugt ist eine Aminosäuresequenz, bei der gezielt eine Aminosäure gegenüber der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 substituiert wurde, beispielsweise um die Wirkung / den Wirkmechanismus von VIF zu untersuchen. Die SEQ ID NOs: 2 bis 8 beschreiben dabei die Aminosäuresequenzen einzelner Peptide innerhalb des VIF (SEQ ID NO: 1).
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine Nukleinsäure zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Nukleinsäure eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 codiert. Bevorzugt ist dabei eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 95 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8. Weiter bevorzugt ist eine Aminosäuresequenz, bei der gezielt eine Aminosäure gegenüber der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 substituiert wurde, beispielsweise um die Wirkung / den Wirkmechanismus von VIF zu untersuchen.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung einen Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Prävention und/oder Behandlung eine Verringerung des von der Herzerkrankung betroffenen Bereiches des Herzgewebes und/oder eine Verringerung der Einschränkung der Herzleistung durch die Herzerkrankung beinhaltet.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch erhöhte Gefäßneubildung in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch eine erhöhte mitochondriale Sauerstoffverbrauchsrate in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch eine erhöhte Kontraktilität der Herzmuskelzellen in Folge der VIF Gabe erzielt wird. Insbesondere die Eigenschaft von VIF durch seinen Einfluss auf die Atmungskette der Mitochondrien und damit den Sauerstoffumsatz einer Zelle, den Stoffwechsel von Herzmuskelzellen direkt zu beeinflussen, legt einen dualen therapeutischen Einsatz von VIF nahe: einerseits zur Prävention bei Patienten mit einem Risiko und/oder der Veranlagung der Entwicklung einer koronaren Herzerkrankung, darüber hinaus zur Behandlung nach einem Herzinfarkt zur Stärkung der vom Infarkt betroffenen Zellen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vasokonstrik- tion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch erhöhte Monozyteninfiltration in das infarzierte Gewebe in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
Besonders vorteilhaft für die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung ist es, die betroffene Fläche des Herzgewebes, insbesondere nach Ischämie, möglichst klein zu halten, um so nur wenig Gewebe behandeln zu müssen und um den zu erwartenden Funktionsverlust so gering wie möglich zu halten. Dies ermöglicht es, die benötigte Menge an Medikamenten und somit die potentiellen Nebenwirkungen oder Langzeitfolgen niedrig zu halten. Die Einschränkung der Herzleistung stellt eine der wichtigsten und somit gefährlichsten Beeinträchtigungen dar, da durch eine eingeschränkte Herzleistung die Sauerstoffversorgung des gesamten Körpers gefährdet werden kann. Je geringer die Einschränkung der Herzleistung ausfällt, desto geringer ist auch der Funktionsverlust des Herzens.
Weiter bevorzugt ist ein Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung, wobei die Aminosäuresequenz, oder die diese codierende Nukleinsäuresequenz, durch ein vollsynthetisches Verfahren, durch ein biotechnologisches Verfahren oder einer Kombination solcher Verfahren hergestellt wird, oder wobei die Herstellung der Aminosäuresequenz, oder die diese codierende Nukleinsäuresequenz, ein vollsynthetisches Verfahren, ein biotechnologisches Verfahren oder eine Kombination solcher Verfahren umfasst.
Zudem ist ein Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, zur erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wobei der VIF als Peptid, Protein, optional als Teilsequenz der VIF-Aminosäure-Sequenz und/oder entsprechender Mimetika oder als Nukleinsäure und/oder eine Mischung daraus verwendet, oder appliziert wird, optional zusammen mit mindestens einem weiteren pharmazeutisch verträglichen Mittel.
Die Darreichungsform des VIF oder dessen Form bei der Verwendung, ob als Peptid, Protein oder Nukleinsäure optional als Teilsequenz der VIF-Aminosäure-Sequenz und/oder entsprechender Mimetika und/oder einer Mischung daraus, kann einen Einfluss auf die räumliche Verteilung des VIF, dessen Konzentration im Blut oder dessen Halbwertszeit haben. Vorzugsweise werden Hilfsstoffe, wie hierin beschrieben, als pharmazeutisch verträgliche Mittel verwendet, um insbesondere die beschriebenen Eigenschaften des VIF in entsprechendem Interesse zu beeinflussen. Die beschriebenen Eigenschaften haben insbesondere einen Einfluss auf die verfügbare Menge an VIF im Blut bzw. im Herzgewebe. Der zu schnelle oder zu langsame Abbau von VIF, bzw. dessen Halbwertszeit, spielt dabei eine große Rolle. Bevorzugt ist dabei, dass größere Schwankungen in der VIF Konzentration vermieden werden, um eine mögliche Über- oder Unterdosierung zu vermeiden.
Vorzugsweise enthält die Nukleinsäuresequenz oder die Aminosäuresequenz optional als Teilsequenz der VIF-Aminosäure-Sequenz und/oder entsprechender Mimetika mindestens eine zusätzliche Sequenz, vorzugsweise wobei die mindestens eine zusätzliche Sequenz eine stabilisierende Funktion, eine Marker-Funktion, eine Interaktionsfunktion, eine Modulationsfunktion, oder eine lokalisierende Funktion aufweist. Bevorzugt ist die zusätzliche Sequenz in der Richtung vom 5‘- zum 3‘-Ende der Nukleinsäure, bzw. in der Richtung vom C-terminalen zum N-terminalen Ende vor oder nach der Sequenz des VIF, bzw. der Sequenz die den VIF codiert, und nicht innerhalb dieser Sequenz. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beeinflusst die mindestens eine zusätzliche Sequenz die Aktivität von VIF nicht negativ. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die eine oder können mehrere der mindestens einen zusätzlichen Sequenz(en) die Aktivität von VIF positiv oder negativ beeinflussen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beeinflusst die mindestens eine zusätzliche Sequenz die Aktivität von VIF nicht.
Zusätzliche Funktionen wie eine stabilisierende Funktion sind von großem Vorteil, um möglichen Abbau- oder Degradierungsprozessen im gewünschten Anwendungsbereich (z.B. dem menschlichen Körper, insbesondere in den Blutgefäßen und dem Herzgewebe) entgegenzuwirken, was eine länger anhaltende und flächenmäßig größere Verfügbarkeit mit sich bringt. Marker-Funktionen erlauben die Nachverfolgung und somit eine Kennzeichnung der bereits behandelten Gewebe, bzw. kann durch eine Nachverfolgung auch die Verteilung im Anwendungsbereich studiert und analysiert werden. Eine Interaktionsfunktion kann eine Interaktion mit zuvor ausgewählten, weiteren Stoffen oder Geweben ermöglichen. Modulationsfunktionen erlauben einen Einfluss auf z.B. die Aktivität, die beispielsweise an eine gewisse Verweildauer im Anwendungsbereich gebunden sein kann, wobei eine Aktivität vor und/oder nach einem zuvor gewählten Zeitrahmen nicht mehr oder gerade erst dann ermöglicht wird. Eine lokalisierende Funktion stellt beispielsweise ein Signalpeptid, bzw. eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, die dieses codiert, dar, das einen Transport in ein zuvor gewähltes Gewebe veranlasst oder initiiert. Durch solche Funktionen kann die Anwendbarkeit, die Verfügbarkeit und die Aktivität des VIF, bzw. auch der Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz gezielt beeinflusst werden, um ein optimales Ergebnis zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend oder bestehend aus a) Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) wie oben definiert, b) optional mindestens einen Hilfs- und/oder Zusatzstoff, vorzugsweise wobei der mindestens eine Hilfs- und/oder Zusatzstoffe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Füllstoffen, Trägerstoffen, Polymeren, Tensiden, Sprengmitteln, Bindemitteln, Schmiermitteln, Süßstoffen, Aromastoffen, Weichmachern, Beschichtungsmaterialien, Kühlstoffen, Re-/Umkristallisie- rungshemmern, Flussmitteln, Entschäumern, Antioxidantien, Adsorptionsmitteln, Farbstoffen, pH-Wert verändernden Stoffen, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Emulgatoren, Salzen für die Einstellung des osmotischen Drucks oder Puffern, und c) mindestens eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz, wobei die mindestens eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz ausgewählt ist aus Statinen, Antikoagulantien, Betablockern, ACE-Hemmern, Thrombozytenaggregationshemmern, Sartanen, Calciumantagonisten, Diuretika, bevorzugt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus koronaren Herzerkrankungen, Herzmuskelentzündung, Herzinfarkt, myokardialer Ischämie und myokardialer Hypoxie, geeignet ist, bevorzugt wobei die Prävention und/oder Behandlung eine Verringerung des von der Herzerkrankung betroffenen Bereiches des Herzgewebes und/oder eine Verringerung der Einschränkung der Herzleistung durch die Herzerkrankung beinhaltet.
Die oben beschriebenen protektiven Effekte des VIF auf Herzmuskelzellen lassen sich vorteilhaft in einer Therapie zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung einsetzen. Besonders vorteilhaft ist es dabei, die Therapie mit weiteren pharmazeutisch aktiven Substanzen zu kombinieren. So können beispielsweise die blutdrucksenkenden Effekte der bisherigen verwendeten Substanzen mit den protektiven Effekten von VIF kombiniert werden. Dabei kann einerseits das Auftreten von Herzerkrankungen, wie oben beschrieben, verhindert oder hinausgezögert werden. Zudem können dabei die Folgen der Herzerkrankungen, wie oben beschrieben, verringert oder gar verhindert werden. Häufig wird ein hoher Blutdruck - als eine wichtige Ursache für Herzerkrankungen - nicht rechtzeitig entdeckt, bevor eine Herzerkrankung auftritt. Das Risiko einer Herzerkrankung lässt sich durch Blutdrucksenkung dann zwar senken, jedoch bei weitem nicht ausräumen. Eine zusätzliche, vorzugsweise gemeinsame Therapie mit VIF, vorzugsweise im Rahmen einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, kann in dieser Situation jedoch zumindest die Folgen einer Herzerkrankung, wie oben beschrieben, verringern oder gar verhindern, etwa im Rahmen einer Langzeittherapie, ebenso aber auch im Rahmen einer Kurzzeitbehandlung.
In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung eine solche, die im Rahmen der post-lnfarkt Sekundärprävention eingesetzt wird, wobei VIF in Kombination mit einem Statin und/oder einem Betablocker und/oder einem Antikoagulans und/oder optional einem ACE-Hemmer verabreicht wird. Bevorzugt kann in der Erhaltungstherapie nach einem Herzinfarkt die Gabe eines ACE-Hemmers und/oder eines Angiotensin-Il-Rezeptor-Blockers bei der gleichzeitigen Gabe von VIF erniedrigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Prävention einer Herzerkrankung, insbesondere bei Risiko- und Hochrisikopatienten für die Entwicklung einer koronaren Herzerkrankung, oder einer Herzinsuffizienz, bereitgestellt, wobei VIF in Kombination mit einem Statin und/oder einem Betablocker und/oder einem Antikoagulans und/oder optional einem ACE-Hemmer verabreicht wird. In der Prophylaxe kann VIF insbesondere zusammen mit einem Statin, oder einem anderen Lipidsenker, verabreicht werden, um synergistisch der Atherosklerose und Plaquebildung durch Einfluss des Statins, wie auch direkt der verringerten Aktivität der Zellen des Herzgewebes durch VIF, entgegenzuwirken. Damit kann dem Risiko eines Herzinfarkts, aber ebenso dem Risiko eines perioperativen Herzinfarkts als Komplikation vorgebeugt werden.
Dem Fachmann ist bewusst, dass die Auswahl des mit VIF in Kombination verabreichten mindestens einen weiteren arzneilich wirksamen Bestandsteils, wie auch die Konzentration von VIF selbst und des mindestens einen weiteren arzneilich wirksamen Bestandsteils und das Behandlungs- und Dosierungsregime, von etwaigen Grunderkrankungen, etwa Hyper- cholesterinämie, abhängen kann.
Die derzeitigen Therapien zur Behandlung eines Herzinfarkts sind alle nicht dazu in der Lage, die akute Nekrose im Herzgewebe zu mildern und die Regeneration des infarzierten Gewebes zu fördern. Hypoxie führt zu einem induzierten Absterben von Kardiomyozyten in Folge eines Infarkts. Diese unmittelbaren Schäden werden jedoch von den Sekundärtherapien nach einem Herzinfarkt derzeit nur unzureichend mitbehandelt.
Patienten, die einen Herzinfarkt erlitten haben, werden in der Regel in Folge eines Herzinfarkts gleichzeitig mit verschiedene Arzneistoffgruppen behandelt, meist in einer Kombination aus vier oder mehr Präparaten, oft in einer Vierfachkombination aus einem Antikoa- gulans zur Hemmung der Blutgerinnung, wie ASS oder Clopidogrel, einem Statin zur Senkung des Cholesterinspiegels, einem ACE-Hemmer oder Angiotensin-Il-Rezeptor-Blocker zur Blutdrucksenkung und einem Betablocker zur Senkung der Herzfrequenz. Die zusätzliche Gabe von VIF kann einerseits ob seiner vasodilatativen Eigenschaften den Einsatz von Blutdrucksenkern herabsetzen. Gleichzeitig kann VIF darüber hinaus durch seinen Einfluss auf die Gefäßneubildung, wie auch auf die mitochondriale Atmungskette, und die Rekrutierung von Monozyten signifikant dazu beitragen, dass infarziertes und benachbartes Herzgewebe schneller regeneriert und somit unmittelbar einen positiven Einfluss bei der Behandlung einer akuten koronaren Herzerkrankung haben.
Ebenso können kardiale Risikopatienten heute bereits lange vor einem Infarkt identifiziert und adäquat behandelt werden. In einer Ausführungsform wird VIF daher präventiv für kar- dio- bzw. vaskuloprotektive Strategien, alleine, oder in Kombination, eingesetzt.
Eine Therapie mit VIF, vorzugsweise in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, kann dabei im Rahmen einer akuten Behandlung, einer Prävention und/oder einer Erhaltungstherapie erfolgen.
Vorzugsweise werden in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung die Bestandteile a) und c) in einer pharmazeutisch wirksamen Menge eingesetzt. Diese Menge beträgt typischerweise etwa eine Konzentration von 1 bis 1 .000 pg/kg Körpergewicht. In einer Ausführungsform beträgt die Dosierung/Dosis eines VIF Peptides gemäß der vorliegenden Erfindung 1 , 10, 30, 50, 100 oder 250 pg/kg/Tag. Bei der akuten Gabe wird die Anwendung einer höheren Konzentration pro Tag (im Bereich von etwa 250 pg/kg bis 15.000 pg/kg, abhängig vom Ausmaß der akut zu behandelnden Symptome und ferner abhängig von patientienindividiuellen Faktoren kann die Konzentration auch etwa 500 pg/kg bis 10.000 pg/kg, etwa 750 pg/kg bis 7.500 pg/kg, oder etwa 500 pg/kg bis 5.000 pg/kg betragen) bevorzugt, bei der Langzeit- oder Erhaltungstherapie kann eine niedrigere Dosis je Tag (<5.000 pg/kg, bzw. auch (<1 .000 pg/kg) verabreicht werden. Die Dosis kann von Applikationsform zu Applikationsform variieren, wie dem Fachmann bekannt ist. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei systemisch oder lokal appliziert werden. Bevorzugte systemische Applikationen sind dabei orale oder parenterale wie z.B. intravenöse, subkutane oder endobronchiale Applikationen, Applikationen per os, oder eine Injektion unmittelbar in das zu behandelnde Zielgewebe, vorzugsweise zur Induzierung eines topischen Effekts.
Vorzugsweise liegt die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in fester Form, z.B. als Pulver, in flüssiger Form, z.B. als Injektionslösung, oder als Aerosol vor.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur nicht-therapeutischen in-vitro Anwendung, enthaltend den Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, wie oben definiert.
Ein solcher Kit wird insbesondere in der Aufdeckung der Wirkmechanismen und der molekularen Mechanismen des VIF verwendet. Dabei können neben dem VIF oder der Nukleinsäure, die diesen codiert, auch weitere Inhalte vorhanden sein. Diese umfassen beispielsweise weitere Verbindungen, Substanzen oder Reagenzien, die für die Aufdeckungsarbeiten eingesetzt werden können.
Ein Kit kann dabei derart bereitgestellt sein, dass die Inhalte in bereits abgemessenen Mengen und/oder Konzentrationen vorliegen, so dass diese direkt verwendet werden können oder einfach auf eine einsetzbare Konzentration verdünnt werden können. Sofern neben dem VIF oder der Nukleinsäure, die diesen codiert, weitere Inhalte vorhanden sind, werden diese vorzugsweise in einem Mengen- oder Gewichts-Verhältnis zu VIF oder der Nukleinsäure, die diesen codiert, bereitgestellt, in welchem sie tatsächlich oder ungefähr verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die beigefügten nicht-limitierenden Beispiele, die Zeichnungen sowie das Sequenzprotokoll beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1 : Synthese des VIF
Der VIF wurde automatisch mittels der solid-phase Methode und standardisierten Fluore- nylmethyloxycarbonylchlorid-Chemie über die continuous-flow Peptidsynthese synthetisiert. Beispiel 2: Blutdrucksenkender Effekt des VIF
Zur Untersuchung des in-vivo Effekts des VIF wurden männliche Wistar-Ratten herangezogen. Alle Tiere hatten freien Zugang zu Standard-Rattenfutter und Leitungswasser ad libitum. Der mittlere arterielle Druck wurde bei Bewusstsein über einen tail-cuff Sphygmomanometer gemessen. Fünf Bestimmungen wurden durchgeführt, wobei der Mittelwert als Basalwert diente. Anschließend erhielten die Tiere VIF intraperitoneal (1 mg pro ml) und Angiotensin II subkutan (0,4 mg pro kg und Tag). Die Kontrollgruppe hingegen erhielt lediglich Angiotensin II.
Anschließend wurde der Blutdruck für 30 bis 45 Minuten jeweils alle 5 Minuten über einen Mikrokatheter gemessen und über die Software ADInstruments (Miliar, Deutschland) bestimmt.
Die Ergebnisse der Blutdruckmessungen sind in Fig. 2 ersichtlich, wobei die die Gruppen mit (▲) und ohne (■) Applikation von VIF aufgetragen sind.
Beispiel 3: Protektiver Effekt des VIF auf Herzqewebe
Für die Untersuchung protektiver Effekte des VIF wurden Mäuse für 2 Tage vor und 2 Tage nach der Untersuchung mit VIF behandelt. Kontrolltiere erhielten dabei keine Behandlung.
Am Tag der Untersuchung wurde ein Herzinfarkt ausgelöst. Hierzu wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin narkotisiert und beatmet. Der Herzinfarkt wurde durch einen Verschluss der LAD (left anterior descending artery) ausgelöst.
Anschließend wurde über histologische Schnitte der Bereich des betroffenen Gewebes bestimmt. Hierzu wurde das Herz entnommen, mit 1 % Evans Blue perfundiert, für 2 h bei -20 °C gefroren und anschließend in 5 Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden für 10 min mit vorgewärmter TTC-Lösung inkubiert und in Formalin fixiert. Anschließend wurden Aufnahmen gemacht und das Infarktareal mittels DISKUS (Hilgard, Deutschland) berechnet.
Es zeigte sich, dass in den mit VIF behandelten Tieren die Infarktgröße nur etwa halb so groß war wie in der Kontrollgruppe. Bei mit VIF behandelten Tieren zeigte sich, dass das von dem Infarkt betroffene Gewebe etwa 25 % des Ventrikels einnahm. Bei Kontrolltieren lag das betroffene Gewebe bei etwa 50 % des Ventrikels. Die Ergebnisse sind Fig. 3 und 4 zu entnehmen.
Durch die anschließende 2-tägige Behandlung mit VIF konnte zudem auch die Ejektions- fraktion nach dem Infarkt signifikant verbessert werden. Die Ejektionsfraktion der Kontroll- tiere lag bei der Messung bei knapp 20 % der Funktion im gesunden Zustand, wohingegen die mit VIF behandelten Tiere eine Ejektionsfraktion von durchschnittlich 30 % der Funktion im gesunden Zustand aufwiesen. Die Ergebnisse sind Fig. 3 zu entnehmen.
Beispiel 4: Pharmazeutische Zusammensetzung
Die Formulierung von Peptid-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen wird bedingt durch das Löslichkeitsprofil des jeweiligen Peptids von Interesse, dessen Stabilität und den isoelektrischen Punkt des Peptids als Wirkstoff. Diese Charakteristika bestimmen maßgeblich auch den optimalen pH-Wert, der im Rahmen der Entwicklung und Formulierung verwendet wird. Insbesondere die Wahl des korrekten Puffersystems kann von großer Bedeutung sein. Je nach Applikationsroute werden Peptid-enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen dann unmittelbar vor ihrer Anwendung in einem geeigneten physiologisch verträglichen Puffer-/Solvenssystem gelöst, sofern in Pulverform oder in lyophiliser- ter Form bereitgestellt. Ferner ist die Zugabe von Stabilisierungs- und Konservierungsmitteln von Bedeutung, etwa um Kontaminationen des Peptid-Wirkstoffs vorzubeugen. Die Stabilisierung kann insbesondere für die nicht-parenterale Gabe von großer Bedeutung sein, sofern eine bestimmte Halbwertszeit des Peptides im Patienten erreicht werden muss, damit der Peptid-Wirkstoff seine Aktivität über einen gegebenen Zeitraum entfalten kann. Darüber hinaus können weitere Hilfsmittel vorhanden sein. Auch die Verwendung von Hilfsmitteln zur verzögerten Freigabe kann im Kontext der VIF-Peptide der vorliegenden Erfindung von Bedeutung sein, insbesondere dann, wenn diese in der Langzeittherapie zum Einsatz kommen. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen basierend auf Peptiden sind dem Pharmakologen vertraut (s. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Herausgegeben von Lars Hovgaard, Sven Frokjaer, Marco van de Weert, Taylor & Francis, 2012).
Für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wurden die Substanzen in Pulverform, Lösung oder Emulsion bereitgestellt und nacheinander vermischt und gegebenenfalls in Lösung gebracht. Es wurde mit unterschiedlichen Puffersystemen unter physiologischen Bedingungen gearbeitet, je nachdem, ob ein Volllängen-VIF-Peptid, oder eine der trunkierten Varianten verwendet wurde (vgl. Swain et al., Recent Patents on Biotechnology, 2013, 7). Anschließend wurde das Gemisch steril filtriert. Stabilität und Funktionalität der Peptide wurde durch analytische in vitro Versuche im Zeitverlauf kontrolliert.
Beispiel 5: Tiermodell-Studie zum Herzinfarkt
Um die neu identifizierten Wirkungen von VIF (gemäß SEQ ID NO: 1) näher, und insbesondere auch in vivo, zu studieren, wurden 8 bis 10 Wochen alte männliche Wildtyp C57BL/6N Mäuse (Charles River, Deutschland) unter Anästhesie (100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin, i.p.) und Analgesie (0,1 mg/kg Buprenorphin) intubiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung eines Nagetier-Respirators (Harvard Apparatus, Deutschland) mit Überdruck und Sauerstoffgabe beatmet. Anschließend wurde eine linksseitige Thorakotomie durchgeführt, und der Ml („myocardial infarction“, Herzinfarkt) wurde durch Okklusionsligatur der linken anterioren absteigenden Arterie (LAD) mit 0/7 Seide, wie zuvor beschrieben in Curaj et al. (Minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice. J Vis Exp. 2015:e52197), induziert. Die Rippen-, Muskel- und Hautschnitte wurden mit separaten Nähten verschlossen. Die Analgesie wurde für fünf Tage nach dem indizierten Infarkt unter Verwendung von 0,1 mg/kg Buprenorphin alle acht Stunden fortgesetzt. Danach wurden die Herzen zu definierten Zeitpunkten (nach 0, 1 , 4, 7, 14, 21 , 28 Tagen) entnommen und für die weitere Analyse vorbereitet.
VIF wurde mit 6,7 pg/ml (1 mmol/l) in NaCI gelöst und in 100 pl osmotische Pumpen des Alzet-Typs 1002 (0,25 mI/Stunde, Charles River, Köln, Deutschland) geladen, was zu einer Dosis von 0,8 pg/kg je 24 Stunden führt. Die Alzet-Pumpen wurden 24 Stunden vor der Ml- Induktion implantiert. Die Pumpen für die Kontrollen wurden entsprechend nur mit NaCI gefüllt. Alle Mäuse wurden unter standardisierten Bedingungen in den dafür eigens vorgesehenen Tierräumen des Universitätsklinikums Aachen (Deutschland) gehalten. Alle Tierversuche und Versuchsprotokolle wurden von den örtlichen Behörden unter Beachtung der europäischen und deutschen Tierschutzgesetze genehmigt (84-02.04.2016.A315). Alle Mäuse wurden bei der Analyse berücksichtigt, es sei denn, die Tiere waren im Laufe des Experiments verstorben.
Beispiel 6: Echokardiographie
Zweidimensionale sowie M-Mode-Echokardiographie-Messungen wurden mit einem Ultraschall-Bildwandler speziell für kleine Tiere (Vevo 770, FUJIFILM Visualsonics, Toronto, Kanada) durchgeführt. Beide Messungen wurden vor und nach einem Herzinfarkt durchgeführt. Die Mäuse wurden hierzu mit 1 ,5-2 % Isofluran anästhesiert und in Rückenlage auf ein Wärmekissen gelegt. Die Ejektionsfraktion, das Herzauswurfvolumen und die Herzfrequenz wurden analysiert. Die Ergebnisse sind in Figur 5 dargestellt.
Den Ergebnissen lässt sich entnehmen, dass VIF einerseits signifikant die Ejektionsfraktion des Herzens nach der Behandlung post-lnfarkt erhöht (Fig. 5A), was in diesem Maßstab ob der für VIF beschriebenen Eigenschaften nicht erwartet wurde und einen signifikanten Beitrag für zukünftige Behandlungen nach einem Herzinfarkt ermöglichen kann. Ferner erfolgt eine leichte Blutdruckabsenkung (Fig. 5B).
Beispiel 7: Histologie und Immunhistochemie
Um die Infarktgröße zu bestimmen, wurde eine Gömöri-Trichrom-Färbung durchgeführt. Anschließend wurden mit Hilfe von ImageJ. je drei Schnitte pro Maus von 3 bis 5 verschiedenen Mäusen nach einer von anti-SMA Antikörper (Aktin der glatten Muskulatur, DAKO, Fig. 6D), anti-MAC3-Antikörper (BD Pharmingen, Fig. 6B), anti-MPO-Antikörper (Neomarkers, Fig. 6A) und Anti-CD31 -Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Fig. 6E) Färbung, gefolgt von einer Färbung mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) - oder einem Cy3-konju- giertem Sekundärantikörper (DAKO, Deutschland), analysiert. Positiv gefärbte Zellen oder doppelt-positiv gefärbte Zellen (Fig. 6C für anti-MAC3/MPO) wurden in drei verschiedenen Feldern je Schnitt gezählt und als Zellen je Gesichtsfeld angegeben (200-fache Vergrößerung).
Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt. Diese Daten belegen einerseits eindeutig (Fig. 6A und Fig. 6C), dass die VIF Behandlung nicht zu einer erhöhten Infiltration von mit anti-MPO visualisierten Neutrophilen im Vergleich zu nicht-behandelten Kontrollen (CTR) führt. Dies ist ein wichtiges Indiz für die therapeutische Verwendbarkeit von VIF dahingehend, dass dieses keine akuten Zell-mediierten Entzündungsreaktionen hervorruft. Nach der Invasion von Neutrophilen erfolgt in einer zweiten Phase nach einem Herzinfarkt die Invasion einer speziellen Subpopulation von Monozyten. Diese Gr1 -hochexprimierenden (high) Monozyten (Gr1 + CCR2 + CX3CR1 niedrig) sind wie humane CD14hi9h CD16-Monozyten charakterisiert, dominieren die Frühphase des Herzinfarkts und zeigen phagozytische, proteolytische und entzündliche Funktionen. Gr1 -hochexprimierenden Monozyten verdauen das Infarkte Herzgewebe und entfernen Zelltrümmer aus diesem Bereich. Die Anzahl an Monozyten (anti-MAC3 visualisiert) in VIF-behandelte Tieren verhielt sich überwiegend wir in der Kontrollgruppe. Jedoch war an Tag 7 in der Einzelfärbung (Fig. 6B) eine leichte, jedoch statistisch signifikante, Erhöhung festzustellen. Dies kann positiv dahin bewertet werden, als dass die infiltrierenden Monozyten zur Beseitigung von abgestorbenem Gewebe und in Folge zu einer verbesserten Regeneration beitragen, was unmittelbar durch die Gabe von VIF positiv beeinflusst werden kann. Dies bekräftigt, dass VIF als Therapeutikum nach einem akuten Herzinfarkt zum Einsatz kommen kann, um die Zellregeneration zu fördern und zu beschleunigen.
Grundsätzlich waren die Ergebnisse daher für VIF-behandelte Tiere und für die Kontrollgruppe im beobachten Zeitraum von 28 Tagen nach induziertem Infarkt nahezu gleich.
Überraschend hinsichtlich der ursprünglich für das VIF-Peptid beschriebenen Funktion als vasokonstriktivem Faktor war nun der neu entdeckte Effekt der Gefäßneubildung, der nach einem induzierten Infarkt durch den Einsatz von VIF erzielt werden konnte (Fig. 6D SMA und E CD31). Fig. 6D und E zeigen die Anzahl an SMA- bzw. CD31 -positiven Zellen im Sichtfeld, wobei CD31 als Marker für Endothelzellen verwendet wurde und SMA als Marker für glatte Muskelzellen. Für beide Marker konnte ein statistisch signifikantes Maß an erhöhter Myofibroblastenanzahl bzw. an Angiogenese, beides als Indiz für eine Gefäßneubildung, in den VIF behandelten Gruppen an Tag 7 beobachtet werden.
Damit führt die VIF Gabe überraschenderweise in der kritischen Phase nach einem Infarkt, der große Teile des Herzgewebes schädigen kann, zu einer beschleunigten Neovaskularisation als Grundlage für eine Heilung des durch den Infarkt geschädigten Gewebes. Dies macht VIF zu einem interessanten Kandidaten in der Behandlung nach einem akuten Herzinfarkt, um die Gefäßneubildung gezielt zu fördern und damit die entstandenen Schäden zu minimieren.
Beispiel 8: Enerqiekatabolismus Messungen
Um weiter die Rolle von VIF post-lnfarkt im oben geschilderten Tiermodell zu untersuchen, wurde eine Messung des 02-Verbrauchs im Gewebe (OCR für„oxygen consumption rate“) von VIF-behandelten und nicht behandelten Tieren nach dem induzierten Infarkt durchgeführt (Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit; Seahorse Bioanalyzer, Seahorse Bioscience). Dabei wird die mitochondriale Funktion von Zellen bestimmt. Als Modulator wird FCCP (Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon) eingesetzt. Die Versuche wurden sowohl unter Einsatz von 5 pM FCCP (Fig. 7A), als auch von 2,5 pM FCCP (Fig. 7B) an HL-1 Zellen (Herzmuskelzelllinie) als durchgeführt. Die FCCP Gabe führt dabei zu einem induzierten Zusammenbruch des Protonengradienten und unterbricht dadurch das mitochondriale Membranpotential. FCCP-stimulierte OCR kann daher verwendet werden, um das Delta zwischen maximaler und Basal-Aktivität zu bestimmen. Dieses Delta wiederum ist ein Maß dafür, wie gut eine Zelle auf erhöhte Energieerfordernisse (etwa nach Stress) reagieren kann.
Wie Figuren 7A und B veranschaulichen, so waren VIF-behandelte Zellen (VIF jeweils titriert von 0,1 bis 1 mM) stets dazu in der Lage, deutlich höhere OCR-Werte zu erzielen, als die nicht behandelten Kontrollzellen (CTRL).
Dies bedeutet, dass VIF den maximalen myokardialen Sauerstoffumsatz erhöhen, und dadurch die Kontraktilität u.a. von Herzmuskelzellen erhöhen kann. Dies kann einen entscheidenden Beitrag sowohl bei der Prophylaxe, wie auch der Therapie von koronaren Herzerkrankungen bedeuten, da hierdurch gezielt die relevanten OCR-Werte durch die Modulation der Atmungskettenreaktion beeinflussen kann. Diese Ergebnisse belegen, dass VIF unerwartet neben seiner Rolle als vasokonstriktiver Faktor noch weitere stoffwechselphysiologische Vorgänge als spezifischer Modulator beeinflussen kann. Derzeit werden diese Wirkungen auch für die weiteren VIF-Varianten (gemäß SEQ ID NOs: 2 bis 8) durch in vitro und in vivo Analysen weiter überprüft.
Beispiel 9: Statistische Analyse
Die in den Abbildungen gezeigten statistischen Daten stellen den Mittelwert ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) dar. Die statistische Analyse wurde mit der Prism 7-Software (GraphPad) durchgeführt. Die Mittelwerte von zwei Gruppen wurden mit dem ungepaarten Student-t-Test verglichen, wobei die Welch-Korrektur durch signifikante Varianz angewendet wurde. Mehr als zwei Gruppen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA Varianzanalyse, gefolgt von einem Newman-Keuls-Post-Hoc-Test, oder einer zweifaktoriellen ANOVA Varianzanalyse, gefolgt von einem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest, im Falle von mehr als zwei variablen Parametern, wie angegeben, analysiert. P-Werte von <0,05 wurden als signifikant erachtet.

Claims

Ansprüche
1. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus koronaren Herzerkrankungen, Herzmuskelentzündung, Herzinfarkt, myokardialer Ischämie und myo- kardialer Hypoxie.
2. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei der VIF eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthält.
3. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei der VIF eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 enthält.
4. Nukleinsäure zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Nukleinsäure eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % Sequenz-Identität zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 codiert.
5. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Prävention und/oder Behandlung eine Verringerung des von der Herzerkrankung betroffenen Bereiches des Herzgewebes und/oder eine Verringerung der Einschränkung der Herzleistung durch die Herzerkrankung beinhaltet.
6. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch erhöhte Gefäßneubildung in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
7. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch eine erhöhte mitochondriale Sauerstoffverbrauchsrate in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
8. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch eine erhöhte Kontraktilität der Herzmuskelzellen in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
9. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung durch erhöhte Monozyteninfiltration in das infarzierte Gewebe in Folge der VIF Gabe erzielt wird.
10. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz, oder die diese codierende Nukleinsäuresequenz, durch ein vollsynthetisches Verfahren, durch ein biotechnologisches Verfahren oder einer Kombination solcher Verfahren hergestellt wird, oder wobei die Herstellung der Aminosäuresequenz, oder die diese codierende Nukleinsäuresequenz, ein vollsynthetisches Verfahren, ein biotechnologisches Verfahren oder eine Kombination solcher Verfahren umfasst.
11. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der VIF als Peptid, Protein, oder als Nukleinsäure und/oder eine Mischung daraus verwendet, oder appliziert wird, optional zusammen mit mindestens einem weiteren pharmazeutisch verträglichen Mittel.
12. Vasokonstriktion-inhibierender Faktor (VIF) oder Nukleinsäure, die diesen codiert, zur Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz oder die Aminosäuresequenz mindestens eine zusätzliche Sequenz enthält, vorzugsweise wobei die mindestens eine zusätzliche Sequenz eine stabilisierende Funktion, eine Marker-Funktion, eine Interaktionsfunktion, eine Modulationsfunktion, oder eine lokalisierende Funktion aufweist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend oder bestehend aus a) Vasokonstriktion-inhibierenden Faktor (VIF) wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert, b) optional mindestens einen Hilfs- und/oder Zusatzstoff, vorzugsweise wobei der mindestens eine Hilfs- und/oder Zusatzstoffe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Füllstoffen, Trägerstoffen, Polymeren, Tensiden, Sprengmitteln, Bindemitteln, Schmiermitteln, Süßstoffen, Aromastoffen, Weichmachern, Beschichtungsmaterialien, Kühlstoffen, Re-/Umkristallisie- rungshemmern, Flussmitteln, Entschäumern, Antioxidantien, Adsorptionsmitteln, Farbstoffen, pH-Wert verändernden Stoffen, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Emulgatoren, Salzen für die Einstellung des osmotischen Drucks oder Puffern, und c) mindestens eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz, wobei die mindestens eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz ausgewählt ist aus Statinen, Antikoagulantien, Betablockern, ACE-Hemmern, Thrombozytenaggregationshemmern, Sartanen, Calciumantagonisten, Diuretika, bevorzugt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus koronaren Herzerkrankungen, Herzmuskelentzündung, Herzinfarkt, myokardialer Ischämie und myokardialer Hypoxie, geeignet ist, bevorzugt wobei die Prävention und/oder Behandlung eine Verringerung des von der Herzerkrankung betroffenen Bereiches des Herzgewebes und/oder eine Verringerung der Einschränkung der Herzleistung durch die Herzerkrankung beinhaltet.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Behandlung der Folgen einer Herzerkrankung im Rahmen der post-lnfarkt Sekundärprävention eingesetzt wird, wobei VIF in Kombination mit einem Statin und/oder einem Betablocker und/oder einem Antikoagulans und/oder optional einem ACE-Hemmer verabreicht wird, oder wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung zur Prävention einer Herzerkrankung verwendet wird, wobei VIF in Kombination mit einem Statin und/oder einem Betablocker und/oder einem Antikoagulans und/oder optional einem ACE- Hemmer verabreicht wird, bevorzugt, wobei VIF in Kombination mit einem Statin verabreicht wird.
15. Kit zur nicht-therapeutischen in-vitro Anwendung, enthaltend den Vasokonstriktioninhibierenden Faktor (VIF) oder eine Nukleinsäure, die diesen codiert, wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert.
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