EP3897984A1 - Procédé et système pour détecter une activité catalytique d'au moins un composé d'intérêt - Google Patents

Procédé et système pour détecter une activité catalytique d'au moins un composé d'intérêt

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Publication number
EP3897984A1
EP3897984A1 EP19848794.4A EP19848794A EP3897984A1 EP 3897984 A1 EP3897984 A1 EP 3897984A1 EP 19848794 A EP19848794 A EP 19848794A EP 3897984 A1 EP3897984 A1 EP 3897984A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
catalytic activity
interest
compound
rheological agent
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19848794.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Cathala
Malika TALANTIKITE
Céline MOREAU
Elisabeth MOYA-LECLAIR
Claire Moulis
Gabrielle VERONESE
Sophie DUSQUESNE
Sophie Bozonnet
Sandra PIZZUT-SERIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3897984A1 publication Critical patent/EP3897984A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/10—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using catalysis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/21—Polarisation-affecting properties

Definitions

  • the present invention relates, in general, to the field of methods and systems for detecting a catalytic activity of at least one compound of interest.
  • degradation enzymes are an essential tool for generating biofuels from biomass rich in lignocellulosic elements, or for degrading synthetic polymers.
  • catalytic polymerization activity is useful in many fields of application for the synthesis of texturizing agents or of agents controlling the rheological properties of industrial products.
  • document WO2018 / 220189 describes for example a method for detecting the sensitivity of one or more polymers, and or of one or more mixtures of polymers, to a compound.
  • This process consists in exposing micro-deposits to this compound, then in detecting by interferometry a variation in appearance of a set of micro-deposits exposed to the compound and / or a variation in dimensions and / or in the refractive index. at least one micro-deposit exposed to the compound.
  • the document WO2012 / 004536 describes a method for the detection of a catalytic activity which is based on a colorimetric device using an optical interference phenomenon. It is also possible to use experimental devices which have the disadvantage of being sophisticated and very expensive (mass spectrometry, nuclear magnetic resonance, etc.).
  • the present invention proposes a new approach for detecting a catalytic activity of at least one compound of interest, which relies on the self- organization of particles during the evaporation of a drop deposited on a support and on the analysis of the pattern generated on this support by the particles at the level of the dried drop.
  • a step of depositing, on a surface, at minus one drop comprising:
  • At least one rheological agent capable of being modified from an initial state to a final state in the presence of said catalytic activity, said initial / final states being capable of generating two different configurations (patterns) of said at least one deposit of particles ,
  • the present invention consists in using this self-organization of the particles during evaporation, in order to propose an original screening method (advantageously high throughput) which is intended to discover and discriminate catalytic activities .
  • the modification of the configuration of the deposition of particles is used to detect catalytic activities.
  • the initial / final states are thus capable of generating two different configurations of said at least one deposit of particles, namely for example:
  • - Said “initial” state is intended to generate a first configuration advantageously chosen from a “coffee stain” (in which the particles are distributed in a peripheral annular form), a maltese cross, the presence of aggregates, star or no pattern, and
  • - Said "final" state is intended to generate a second configuration, different from the first configuration, in which said second configuration is changed according to a pattern which can advantageously be a coffee stain, a maltese cross, a presence of 'aggregates, star or lack of pattern.
  • this catalytic activity is advantageously responsible for a modification of said at least one rheological agent (from the initial state to the final state) which results in a change in the speed of movement of the particles. linked to a change in rheology or to gelling, aggregation, interaction, etc. within the drop, because if necessary involved in reactions in particular of polymerization, depolymerization, gelation, etc.
  • said at least one rheological agent is capable of being modified from an initial state, inactive or active, to a final state, respectively active or inactive, in the presence of said catalytic activity.
  • the inactive / active states are capable of generating two different configurations of said at least one particle deposit:
  • the appearance or alteration of the "coffee stain" effect is used to detect catalytic activities which are advantageously responsible for a change in the speed of movement of the particles linked to a modification of the rheology or to phenomena of gelation, aggregation, interaction, etc. within the drop, because involved in reactions in particular of polymerization, depolymerization, gelation, etc.
  • Said at least one rheological agent is chosen from agents acting on the dynamic viscosity of said drop, with a dynamic viscosity value in the inactive state which is less than a dynamic viscosity value in the active state (for example, with in the inactive state a dynamic viscosity value lower than l OmPa.s, and in the active state a dynamic viscosity value greater than 2 mPa.s);
  • Said at least one rheological agent is in an initial inactive state and in an active final state, for detecting a catalytic activity of polymerization, crosslinking, gelling, aggregation, insolubilization, or said at least one rheological agent is in a state initial active and in an inactive final state, to detect a catalytic activity of depolymerization, hydrolysis;
  • Said at least one rheological agent is chosen from polymer precursors or polymers, advantageously biopolymers, preferably capable of forming a gel / hydrogel;
  • the particles consist of nanoparticles, for example cellulose nanoparticles
  • the particles consist of particles composed of an optically active material and / or capable of self-organizing to form optically active structures
  • the deposition step consists of depositing a plurality of drops containing different concentrations of said at least one compound of interest and / or at least two compounds of different interest (or even different concentrations of particles and / or of said at least one rheological agent);
  • the evaporation step is adjusted to run over a time of less than 5 hours, preferably ranging from 10 to 60 minutes.
  • said catalytic activity is a catalytic activity of degradation (for example lytic or depolymerization), advantageously a catalytic activity of the hydrolase type, preferably chosen from a glycosidase, amidase, esterase, ether-hydrolase activity. , phytase or phosphorylase, for example also chosen from the rheological agent / compound of interest pair:
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • catalytic activity is a catalytic polymerization activity, advantageously a catalytic activity of the polymerase type, for example also chosen from the rheological agent / compound of interest combination:
  • the invention also provides a system for detecting a catalytic activity of at least one compound of interest, by implementing a method according to the invention, which detection system comprises:
  • a support comprising a receiving surface, a solvent, particles and at least one rheological agent
  • an evaporation device to perform the evaporation step and generate said at least one deposit of particles
  • FIG. 1 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, put under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image of left) and after reaction (right image), for the high viscosity wheat (AX) / xylanase arabinoxylan couple.
  • FIG. 2 represents the images obtained by photographing plates containing the dried drops, placed under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image on the left) and after reaction (image on the right), for the xyloglucan (XG) pair / cellulase cocktail.
  • FIG. 3 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, put under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image on the left) and after reaction (image on the right), for the couple carboxymethylcellulose / cocktail of cellulases .
  • FIG. 4 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, put under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image on the left) and after reaction (image on the right), for the polylysine couple (PLL) / trypsin.
  • FIG. 5 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, put under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image on the left) and after reaction (image on the right), for the milk / rennet couple.
  • FIG. 6 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, placed under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained in the presence of sucrose alone (image on the left) or in the presence of a mixture of alternan and fructose (right image); this alternane + fructose mixture corresponds to a simulation of a reaction medium obtained at the end of the synthesis during the incubation of alternan-sucrases in the presence of sucrose.
  • FIG. 7 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, placed under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained in the presence of: - a mixture of sucrose (starting substrate of an alternane-saccharases) and of CNC (photo on the left), - a mixture of sucrose (starting substrate for an alternane-sucrases), CNC and a cell extract containing no alternane-sucrases (photo in the middle), - an ⁇ -glucan (alternan) produced by a cell extract containing an alternansucrase from sucrose in the presence of CNC (photo on the right).
  • FIG. 8 represents the images obtained by photography of plates containing the dried drops, put under a 0 ° / 90 ° cross polarizer, obtained before reaction (image on the left) and after reaction (images on the right), for the pair pectin / orange-pectin methylesterase (O-PME) and Aspergillus aculeatus pectin methylesterase (Aa-PME).
  • O-PME pectin / orange-pectin methylesterase
  • Aa-PME Aspergillus aculeatus pectin methylesterase
  • the present invention thus relates to a method and a method for detecting a catalytic activity of at least one compound of interest.
  • catalytic activity is advantageously meant a property of a compound measured by the amount of substance catalyzed per unit of time during a specified chemical or biochemical reaction and under specified operational conditions.
  • the compound of interest in the presence of such a catalytic activity, the compound of interest then consists of a catalyst, advantageously a chemical catalyst or a biotic catalyst.
  • biotic catalyst is advantageously meant an enzyme, a mixture (or cocktail) of enzymes, an unpurified cell extract or a microorganism.
  • the catalytic activity of an enzyme includes:
  • the catalytic activity of the compound of interest advantageously corresponds to a phenomenon of conversion of at least one rheological agent from an initial state to a final state causing a variation in viscosity and / or d 'interaction, resulting in a modified diffusion / mobility of particles.
  • catalytic activity is thus understood a catalytic activity advantageously chosen from the following catalytic activities: polymerization, crosslinking, gelation, aggregation, insolubilization or degradation (for example lytic or depolymerization).
  • Polymerization refers to the chemical reaction or the process by which small molecules react with each other to form molecules of higher molecular weights.
  • the initial molecules can be monomers or pre-polymers or polymer precursors; synthesis leads to polymers.
  • depolymerization is the process of converting a polymer into monomers, a mixture of monomers or a mixture of oligomers.
  • Crosslinking corresponds to the formation of one or more three-dimensional networks. Covalent bonds between the macromolecular chains are created.
  • the crosslinked structures are generally prepared from linear or branched pre-polymers.
  • the gelation advantageously corresponds to the transformation into a network of polymers forming a colloid containing liquid.
  • Aggregation is advantageously the process by which precipitating solid particles combine to form larger particles.
  • An insolubilization reaction is a process which leads, by chemical modification, to changing the nature of the compound (chemical or physical modification) causing a desolvation leading to its self-association, by means of covalent or non-covalent bonds. , to form large particles causing sedimentation.
  • detection of this catalytic activity is meant the “qualitative” discrimination between the presence, and absence, of said catalytic activity generated by said at least one compound of interest.
  • the "detection" of the catalytic activity activity consists in establishing a "quantitative” discrimination, namely determining, in the presence of said catalytic activity generated by said at least one compound of interest, a quantitative value of catalytic activity.
  • kcat number of catalytic events
  • the method comprises a succession of steps which allow obtaining a deposit of particles whose configuration / pattern ensures discrimination between a presence of catalytic activity by said at least one compound d interest or absence (defect) of catalytic activity by said at least one compound of interest.
  • a step a) consists of a step of depositing, on a surface, at least one drop comprising:
  • the surface consists of a deposition surface or a receiving surface, advantageously horizontal (advantageously the surface of a plate-shaped support).
  • This surface is advantageously inert.
  • the surface is still advantageously transparent.
  • This surface can be made of a material chosen for example from glass or a thermoplastic polymer, advantageously transparent such as poly (methyl methacrylate) (often abbreviated as PMMA).
  • drop is meant in particular a so-called “drop” or “sessile” drop (drop placed on a flat solid support).
  • the volume of the drop is advantageously between 10 and 1000 pL, advantageously between 10 and 50 pL, preferably from 15 to 25 pL.
  • solvent is advantageously meant an organic or aqueous liquid, preferably water, containing one or more compounds in solution or in suspension (called “solute (s)").
  • This solvent is able to evaporate during a following evaporation step.
  • This solvent is advantageously adapted to authorize, if necessary, the action of conversion of the rheological agent in the presence of said catalytic activity
  • the drop may then contain one or more compounds of interest, reported, of which a possible catalytic activity is sought.
  • compound of interest is meant in particular a catalyst, known or potential, advantageously a chemical catalyst or a biotic catalyst.
  • biotic catalyst is advantageously meant an enzyme or a microorganism.
  • the drop can thus contain a single compound of interest or a combination of at least two compounds of interest.
  • the aforementioned particles advantageously consist of particles composed of an optically observable material, optionally an optically active material and / or able to self-organize to form optically active structures.
  • the particles advantageously consist of nanoparticles, for example nanoparticles of polysaccharides and in particular cellulose nanoparticles.
  • a nanoparticle advantageously consists of a particle of material of which at least one dimension is between 1 to 100 nanometers.
  • the polysaccharide nanoparticles are preferably cellulose nanocrystals (NCC or CNC).
  • NCC cellulose nanocrystals
  • Such nanocrystals are for example prepared by acid hydrolysis of cotton according to the protocol described in Revol et al. (Int. J. Biol. Macromol. 1992, 14, 170-172.) Or Cranston et al. (Biomacromolecules, vol 7, 2006, p2522). They have, for example, a lateral dimension between 3 and 50 nm and a length between 30 and 1000 nm.
  • the particles are also advantageously able to self-organize to form structures / configurations / patterns which are observable by optical means on the surface, following the evaporation of the solvent.
  • these particles are advantageously capable of forming a peripheral annular pattern (or at least substantially annular) known under the name of "coffee stain” or “coffe-ring pattern”, following the solvent evaporation.
  • these particles may be able to self-organize to form optically active structures / configurations (also called “optically active patterns”) on the surface, following the evaporation of the solvent.
  • a particle or a structure is "optically active" (or has a rotary power) if it deflects the plane of polarization of the polarized light.
  • the detection of the presence of this coffee stain effect can be obtained by positioning the dried drop between two crossed polarizers; an iridescence phenomenon appears due to the self-organization of the particles (see for example “Formation of Chiral Nematic Films from Cellulose Nanocrystal Suspensions ls a Two-Stage Process ”, Xiaoyue Mu et al. Langmuir 2014, 30, 9256-9260).
  • Such a detection device would be simple, inexpensive and easily transportable or miniaturizable.
  • optical detection systems can also be envisaged by modifying the particles (colored or fluorescent particles), for example for detection visible to the naked eye.
  • rheological agent also known as “rheology additive” or “rheology agent”
  • rheology additive is meant in particular a component (different from the particles) whose presence in the drop generates a modification of the diffusion / mobility of particles (in comparison with a drop devoid of said rheological agent), advantageously by a viscosity and / or interaction phenomenon.
  • Said at least one rheological agent is chosen from agents capable of being modified from an initial state to a final state, in the presence of said catalytic activity.
  • the "initial” state corresponds to the state of the rheological agent before (and or in the absence of) a modification by catalytic activity of said at least one rheological agent.
  • the “final” state corresponds to the state of the rheological agent after (following) a modification (from said initial state) by catalytic activity of said at least one rheological agent.
  • the initial / final states are capable of generating two different configurations of said at least one particle deposit:
  • said initial state is intended to generate a first configuration (also called
  • Initial configuration in which the particles are distributed according to a first configuration / a first pattern, for example among a “coffee stain", a maltese cross, the presence of aggregates, in a star or the absence of a pattern, and
  • said final state is intended to generate a second configuration (also called “final configuration") in which the particles are distributed in a second configuration / a second pattern (different from said first configuration / from said first pattern) , for example among a "coffee stain", a maltese cross, the presence of aggregates, in a star or the absence of a motif.
  • the initial state and the final state may consist, respectively or vice versa, in a state called “inactive” or in a state called “active”.
  • the “inactive” state of said at least one rheological agent is intended to generate the so-called “coffee stain” configuration, in which the particles are grouped together in a peripheral annular form (along the outline of the drop).
  • the "active" state of said at least one rheological agent is intended to generate a so-called “alternative" configuration of the particle deposition, in which the above-mentioned "coffee stain” configuration is altered.
  • the coffee stain effect is inhibited by various mechanisms which lead to a limitation of the diffusion of the particles and a limitation of their migration towards the periphery of the drop.
  • the diffusion of the particles is reduced when the viscosity in the drop increases, for example under the effect of polymer synthesis.
  • said at least one rheological agent is chosen from agents acting on the dynamic viscosity within the drop (and as a corollary on the diffusion and on the migration of the particles during drying). If necessary, the dynamic viscosity value in its inactive state is advantageously less than a dynamic viscosity value in its active state.
  • the dynamic viscosity is a physical quantity which characterizes the resistance to laminar flow of an incompressible fluid, advantageously expressed in mPa.s.
  • said at least one rheological agent is converted from an initial inactive state (low dynamic viscosity) to an active final state (high dynamic viscosity), for example to detect a catalytic activity of polymerization, crosslinking, gelling, aggregation, insolubilization, or
  • At least one rheological agent is converted from an active initial state (high dynamic viscosity) to an inactive final state (low dynamic viscosity), for example to detect a catalytic activity of depolymerization, hydrolysis.
  • a "low" dynamic viscosity value is less than a "high” dynamic viscosity value.
  • said at least one rheological agent is advantageously chosen from polymer / polymer precursors, advantageously biopolymers, preferably able to form a gel / hydrogel.
  • Biopolymers are advantageously polymers from biomass, that is to say produced by living beings (plants, algae, animals, fungi, etc.). These biopolymers thus correspond to all of the biological macromolecules resulting from the assembly of simpler or monomeric molecules.
  • a gel is a solid material (possibly soft or ductile), consisting of a three-dimensional network of macromolecules surrounded by liquid.
  • the gel is formed by two media dispersed one inside the other: the so-called "solid” medium consists of long molecules connected together by crosslinking points to form a three-dimensional network and the liquid medium (solvent) is made up of independent molecules.
  • a hydrogel is a gel, the liquid phase of which is water. Hydrogels are made from natural or synthetic polymers.
  • said at least one rheological agent advantageously occurs:
  • said catalytic activity is a catalytic activity of polymerization, advantageously a catalytic activity of the polymerase type.
  • the rheological agent / compound of interest couple (whose catalytic activity is known or sought after) is advantageously chosen from:
  • said catalytic activity is a catalytic depolymerization activity, advantageously a catalytic activity of the hydrolase type, preferably also chosen from an amidase, esterase, glycosidase, ether hydrolase, phytase or phosphorylase activity.
  • a catalytic depolymerization activity advantageously a catalytic activity of the hydrolase type, preferably also chosen from an amidase, esterase, glycosidase, ether hydrolase, phytase or phosphorylase activity.
  • Enzymes capable of carrying out such hydrolysis reactions are in particular classified in group EC 3 of the so-called “EC” nomenclature (for "Enzyme Commission numbers” - “Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) ”).
  • hydrolase type enzymes mention may in particular be made of enzymes having hydrolytic activity towards biopolymers.
  • these enzymes capable of hydrolyzing biopolymers mention may in particular be made of polysaccharide hydrolases, also known as glycoside hydrolases or glycosidases (these enzymes are advantageously classified in group EC 3.2.1).
  • polysaccharide hydrolases is meant, for example, xylanases, cellulases, chitinases, pectinases, mannases, galactanases.
  • hydrolytic enzymes of biopolymers mention may also be made, for example, of proteases, nucleases, lignininases.
  • the rheological agent / compound of interest pair (whose catalytic activity is known or sought after) is then advantageously chosen from:
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • said catalytic activity is a gelling catalytic activity.
  • the rheological agent / compound of interest couple is for example chosen from pectins / methylesterases.
  • the methylated pectins do not form a gel in the presence of calcium (depending on the concentration of pectin and calcium, the inactive state may be different: coffee ring or precipitate). After the action of the enzyme, they form gels with calcium (active state, which also changes depending on the concentration of pectin and calcium: no coffee ring or precipitate).
  • the mixture of the solvent, the particles and said at least one rheological agent is advantageously used before the deposition step a) (prior mixing step).
  • the choice of these different components is adjusted so as to be able to observe, if necessary, the catalytic activity sought.
  • the mixture of said at least one compound of interest and of said at least one rheological agent is advantageously used: - before the deposition step a) (prior mixing step), so that any catalytic activity is advantageously initiated, or even terminated, before the deposition step a) (incubation step prior to deposition ), or
  • the deposition step a) may also consist in depositing a plurality of drops containing:
  • the deposition of drops comprising different rheological agents, with at least one compound of identical interest, is useful for screening for a possible catalytic activity of at least one compound of interest.
  • the deposition of drops comprising different concentrations of said at least one rheological agent, and or different concentrations of said particles, is useful for determining rheological agent / particle ratios which are suitable for subsequent screening for possible catalytic activity.
  • a step b) consists of a step of evaporation of the solvent present in the drop (s) deposited.
  • this evaporation step b) generates the deposition of the particles according to one of the two aforementioned configurations, depending on the initial state or the final state of said at least one rheological agent in the presence .
  • this evaporation step b) generates the deposition of the particles according to one of the two configurations, depending on the final state of said at least one rheological agent present, namely:
  • a person skilled in the art can adapt the drying time as a function of the size of the drop, the deposition surface, the temperature and the drying humidity.
  • the evaporation step b) is advantageously adjusted to run over a time of less than 5 hours, preferably ranging from 10 to 60 minutes.
  • a step c) consists of a step of analyzing said at least one deposit of particles.
  • two different configurations of said at least one particle deposit can be obtained (depending on the initial state or the final state of said at least one rheological agent present), advantageously the “coffee stain” configuration. ”Or the“ alternative ”configuration (in which the“ coffee stain ”configuration is altered).
  • this analysis step c) is advantageously carried out by means of a comparison of shots / images containing deposits of particles from the dried drops.
  • this analysis step c) further aims to make a distinction / classification of each deposit analyzed among two alternative results: absence of a catalytic activity of said at least one compound of interest or presence of a catalytic activity of said at least one compound of interest.
  • the deposit analyzed has a configuration generated by said at least one rheological agent always in its initial state (said at least a rheological agent remained in its initial state, in the absence of conversion by the compound of interest).
  • the deposit analyzed has a configuration which is identical to a "negative control" deposit, that is to say a configuration generated at the level of a dried drop lacking the catalytic activity.
  • the deposits are identical with, or without, said compound of interest.
  • the deposit analyzed has a configuration generated by said at least one rheological agent in its final state (said at least one rheological agent has thus been converted from an initial state to a final state, by said at least one compound of interest).
  • the deposit analyzed has a configuration which is identical to a "positive control" deposit, that is to say a configuration generated at the level of a dried drop having catalytic activity.
  • the deposits are different with or without the said compound of interest.
  • said at least one rheological agent was still in its initial state at the time of drying.
  • said at least one rheological agent was in its final state at the time of drying (resulting from the catalytic activity).
  • this analysis step c) thus allows detection between:
  • the method according to the invention can also be used for screening at least one second compound of interest which potentially has an inhibitory effect on catalytic activity.
  • second compound of interest includes in particular an inhibitor of catalytic activity, known or potential, advantageously a chemical inhibitor or a biotic inhibitor.
  • this second compound of interest is advantageously mixed with at least one first compound of interest having a known catalytic activity.
  • the deposit analyzed has a configuration generated by said at least one rheological agent still in its initial state (said at least one rheological agent has remained in its state initial, due to the inhibition of conversion by the first compound of interest).
  • the deposit analyzed has a configuration generated by said at least one rheological agent in its final state (said at least one rheological agent thus has been converted from its initial state to its final state, by said first at least one compound of interest).
  • System for detecting catalytic activity also relates to the system for detecting a catalytic activity of at least one compound of interest, by implementing the method according to the invention.
  • This detection system comprises, as described above, the following elements:
  • a set of reagents for carrying out the deposition step a), comprising the support comprising the receiving surface, the solvent, the particles and said at least one rheological agent,
  • an evaporation device to perform the evaporation step and generate said at least one deposit of particles
  • the set of reagents is adapted to the desired catalytic activity.
  • the user then introduces said at least one compound of interest into the solvent / particle / rheological agent mixture, this under conditions suitable for obtaining the modification of the rheological agent if necessary.
  • the evaporation device conventional in itself, consists for example of a closed enclosure, regulated in temperature and humidity.
  • the temperature control is advantageously obtained with a thermostated heated support, and the humidity with saturated salt baths.
  • the analysis device advantageously comprises optical means for taking pictures.
  • optical means consist, for example, of two crossed polarizers, in the case of particles capable of generating an iridescent appearance.
  • Such a device is simple, inexpensive and easily transportable or miniaturizable.
  • optical means can also be envisaged, advantageously by modifying the particles (colored particles for example for detection visible to the naked eye).
  • the invention has several specificities:
  • the final solutions to be deposited are prepared by mixing the solutions of polymer, or of polymer precursor, with a suspension of cellulose nanocrystals.
  • the drying takes place in a closed enclosure, regulated in temperature and humidity.
  • the temperature is controlled with a heated, thermostated support, and the humidity with saturated salt baths. This device allows us to dry 24 drops under controlled temperature and humidity conditions.
  • the drying time is approximately 30 minutes. The variations in the drying time depend on the size of the drop, the deposition surface, the temperature and the drying humidity. After the drops have dried, the data is acquired by photographing the plates containing the dried drops, placed under a 0 ° / 90 ° cross polarizer.
  • the final result is obtained by carrying out a qualitative comparison of the images obtained before and after reaction. It should be noted that in the concentration range studied, the drops of cellulose nanocrystals (dispersed in water) deposited on glass or Polymethylene Methacrylate (PMMA) plates cause a coffee stain. As an indication, the drop angle of an NCC solution on a glass plate is very small; on the PMMA, the drop angle is around 70 °.
  • the cellulose nanocrystals are produced by the acid hydrolysis of wood pulp.
  • the NCCs used are marketed by CelluForce; they have a lateral dimension between 4 and 16 nm and a length between 50 and 250 nm.
  • the dispersion of the NCCs is prepared by dropping the nanocrystals powder on ultra pure water, with vigorous stirring. The suspension is kept stirring overnight, then passed under ultrasound to maximize the dispersion of the nanocrystals. The actual concentration of the suspension of cellulose nanocrystals is obtained by measuring the dry mass.
  • polymer the polymer targeted by a depolymerization reaction
  • Precursor means the molecule targeted by a polymerization reaction.
  • the solutions were obtained by dissolving the polymers / precursors in ultra pure water, with vigorous stirring overnight.
  • the mixing of the NCC / Polymer / precursors is carried out at different concentrations of the latter (between 0.1 and 10 g / L), which makes it possible to scan a wide range of possibilities.
  • AX High viscosity wheat arabinoxylan
  • AX The high viscosity wheat arabinoxylan used was purchased from Megazyme (AX). It consists of 38% arabinose and 62% xylose; its kinematic viscosity is 42 cSt.
  • the enzyme used to degrade AX is Megazyme xylanase.
  • the xylanase was used at a concentration of 0.1 U / ml.
  • the incubation was carried out at 40 ° C, at an optimized time of 5 min.
  • the volume of the drops deposited is 20 ⁇ L.
  • Two deposition surfaces have been tested which are glass and Polymethylene Methacrylate. The drops were dried at 40 ° C, and a relative humidity of 33%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 1.
  • Xyloglucan (XG) is the most abundant hemicellulose in nature. It is made up of a main glucose chain similar to that of branched cellulose with several compounds (mainly xylans). It is known for its strong affinity with cellulose. The xyloglucan used is supplied by Megazyme. Cellulase is used as an enzyme to degrade it.
  • the cellulosic cocktail was added at a concentration of 4 mg / mL.
  • the incubation was maintained at 40 ° W for one hour.
  • the volume of the drops deposited is 20 ⁇ L.
  • Two deposition surfaces have been tested, that are glass and Polymethylene Methacrylate.
  • the drops were dried at 40 ° C and a relative humidity of 33%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 2.
  • Carboxymethylcellulose is a cellulose ether which carries negative charges (marketed by Sigma).
  • the enzyme used for the degradation of carboxymethylcellulose is cellulases.
  • the cellulases were added at a concentration of 5 mg / ml; the incubation was carried out at 40 ° C., according to an optimized time of 30 minutes.
  • the volume of the drops deposited is 20 ⁇ L.
  • Two deposition surfaces were tested: glass and Polymethylene Methacrylate. The drops were dried at 40 ° C and a relative humidity of 33%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 3.
  • Polylysine is a cationic polyelectrolyte which interacts strongly with cellulose nanocrystals (marketed by Sigma).
  • the enzyme used for the degradation of polylysine is PROMEGA trypsin. Trypsin was added at a concentration of 0.45 mg / ml. The solution was incubated for 5 days at 40 ° C. The volume of the drops deposited is 20 ⁇ L. Two deposition surfaces were tested: glass and Polymethylene Methacrylate. The drops were dried at 40 ° C and a relative humidity of 33%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 4.
  • the drops CNC + Milk
  • the drops are deposited to directly obtain the reaction in the drops.
  • Drops of 20 ⁇ L of solution were placed on PMMA plates and 2 ml of diluted rennet solution were added. Drying was done at 36 ° C at a relative humidity of 75%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 5.
  • VWR using a-transglucosylases of the family 70 of glycoside hydrolases (GH70 a-transglucosylases).
  • the GH70 a-transglucosylases used made it possible to synthesize glucose homopolysaccharides (generally called alpha-glucans), and more precisely dextrans (compounds with more than 95% of ⁇ -1, 6 bonds), alternans (mixtures of bonds a-1, 6 and a-1, 3) and reuteranes (mixture of bonds a-1, 6 and a-1, 4).
  • dextrans compounds with more than 95% of ⁇ -1, 6 bonds
  • alternans mixture of bonds a-1, 6 and a-1, 3
  • reuteranes mixture of bonds a-1, 6 and a-1, 4
  • the synthesis conditions were optimized so that the consumption of sucrose is complete after 1 h 30 of reaction at 30 ° C.
  • the ⁇ -transglucosylases (DSR-s varD4N, DSR-OK, native DSR-S, GSK, ASR) were incubated at 0.26 U / ml in the presence of 7.6 g / L of CNC and 50 g / L of sucrose.
  • the volume of the drops deposited is 20 ⁇ L.
  • Two deposition surfaces were tested: glass and Polymethylene Methacrylate. The drops were dried at 40 ° C and a relative humidity of 33%.
  • the solutions in the presence of enzymes were maintained at 50‘G, for 12 hours.
  • the volume of the drops deposited is 20 ⁇ L.
  • Two deposition surfaces were tested: glass and Polymethylene Methacrylate.
  • the drops were dried at 40 G and a relative humidity of 33%.
  • the data acquired are illustrated in FIG. 8.
  • the characteristic couples (CNC / AX) which exhibit this initial state are for example: [AX-CNC] [10.1 -5.1 / 10.1 -7.6],
  • the addition of the enzyme causes a decrease in the viscosity of the drops, this state represents the final state.
  • the addition of the enzyme causes a change from the “malta cross” motif to a “coffee stain” type motif for the ratios [AX-CNC] [10,1 -5,1 / 10,1 -7 , 6].
  • the addition of the enzyme causes a decrease in the viscosity of the drops, inducing the appearance of a coffee stain pattern. This state represents the end state.
  • concentration combinations [PLL-CNC], in which we have seen the disappearance of the "aggregates”, are for example [5.1 -5.1; 5, 1 -7.6].
  • Sucrose is the initial substrate for the polymerization of a-glucans.
  • the ratios are for example [10.1 -7.6 / 10.1 -10.1].
  • sucrose in the case of polymerization of sucrose in alternane, the sucrose alone forms a pattern of the “coffee stain” and maltese cross type.
  • the pectins gelled by ionic interactions involving the carboxylic groups in the presence of calcium.
  • the carboxylic groups are methyesterified and cannot interact with calcium.
  • Pectins methylesterases hydrolyze the acetyl group and induce gel formation, which modifies the patterns observed.
  • the results enabled us to determine the combinations for which the initial state disappears after addition of the enzyme, induced by gel formation in the final state.

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Abstract

Ce procédé comprend les étapes suivantes : a) une étape de dépôt, sur une surface, d'au moins une goutte comprenant un solvant, ledit au moins un composé d'intérêt, des particules et au moins un agent rhéologique apte à être modifié entre des états initial / final aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules, b) une étape d'évaporation dudit solvant, pour engendrer ledit au moins un dépôt de particules selon l'une desdites deux configurations particulières, c) une étape d'analyse dudit au moins un dépôt de particules pour détecter : une absence d'activité catalytique dudit au moins un composé d'intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état initial, et une présence d'activité catalytique dudit au moins un composé d'intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état final.

Description

Titre de l’invention : Procédé et système pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt
Domaine technique de l’invention
[0001] La présente invention concerne, de manière générale, le domaine des procédés et systèmes pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt.
Etat de la technique
[0002] Dans de nombreux domaines techniques et industriels, l’identification et l’étude de composés d’intérêt ayant une activité catalytique constituent un enjeu majeur.
[0003] Par exemple, les enzymes de dégradation (lytiques, hydrolytiques, etc.) constituent un outil essentiel pour générer des biocarburants à partir de la biomasse riche en éléments lignocellulosiques, ou pour dégrader des polymères synthétiques.
[0004] Inversement, la détection d’activité catalytique de polymérisation est utile dans de nombreux domaines d’application pour la synthèse d’agents texturants ou d’agents contrôlant les propriétés rhéologiques de produits industriels.
[0005] A cet effet, il est courant d’utiliser des procédés et systèmes qui sont conçus pour détecter, de manière rapide, simple et fiable, l’activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt.
[0006] Il est en particulier traditionnel de mettre en oeuvre des dispositifs colorimétriques dédiés, qui utilisent des réactions chimiques pour révéler une activité catalytique ; ces dispositifs colorimétriques chimiques emploient pour cela des indicateurs chimiques de détection, tels que des colorants.
[0007] Mais ces dispositifs colorimétriques sont souvent complexes à employer, nécessitent de nombreuses manipulations et réactifs, et obligent généralement l’emploi d’un dispositif de lecture dédié (par exemple un spectroscope).
[0008] En ce sens, le document WO2018/220189 décrit par exemple un procédé de détection de la sensibilité d’un ou plusieurs polymères, et ou d’un ou plusieurs mélanges de polymères, à un composé. Ce procédé consiste à exposer des micro-dépôts à ce composé, puis à détecter par interférométrie une variation d’aspect d’un ensemble de micro-dépôts exposé au composé et/ou une variation des dimensions et/ou de l’indice de réfraction d’au moins un micro-dépôt exposé au composé.
[0009] Par exemple encore, le document WO2012/004536 décrit un procédé pour la détection d’une activité catalytique qui s’appuie sur un dispositif colorimétrique utilisant un phénomène optique d’interférence. [0010] Il est également possible d’utiliser des dispositifs expérimentaux qui ont l’inconvénient d’être sophistiqués et très coûteux (spectrométrie de masse, résonnance magnétique nucléaire, etc.).
[001 1] Compte tenu de ce qui précède, il est toujours intéressant de disposer de nouveaux procédés et systèmes qui soient conçus pour détecter, de manière rapide, simple et fiable, l’activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt.
Présentation de l’invention
[0012] Afin de remédier à l’inconvénient précité de l’état de la technique, la présente invention propose une nouvelle approche pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, qui s’appuie sur l’auto-organisation de particules lors de l’évaporation d’une goutte déposée sur un support et sur l’analyse du motif généré sur ce support par les particules au niveau de la goutte séchée.
[0013] Plus particulièrement, on propose selon l’invention un procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, lequel procédé comprend les étapes suivantes : a) une étape de dépôt, sur une surface, d’au moins une goutte comprenant :
- un solvant,
- ledit au moins un composé d’intérêt,
- des particules, destinées à former un dépôt sur ladite surface suite à une évaporation dudit solvant, et
- au moins un agent rhéologique, apte à être modifié depuis un état initial jusqu’à un état final en présence de ladite activité catalytique, lesdits états initial / final étant aptes à engendrer deux configurations (motifs) différentes dudit au moins un dépôt de particules,
b) une étape d’évaporation dudit solvant, pour engendrer ledit au moins un dépôt de particules selon l’une desdites deux configurations différentes,
c) une étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules pour détecter :
- une absence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état initial, et
- une présence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état final.
[0014] De manière générale, il est connu que l’évaporation de fluides complexes, comme des liquides biologiques, constitue un système intéressant qui permet l’obtention de motifs sur un support. L’étude de l’apparition de fractures pendant le séchage de tels fluides a suscité beaucoup d’intérêt notamment chez les industriels, afin de pouvoir contrôler de manière plus précise les processus de séchage (par exemple la peinture).
[0015] Encore de manière générale et connue, lors de l’évaporation d’une goutte de suspension de particules, le solvant s’évapore mais les particules initialement présentes au sein de cette goutte laissent un motif final, résultant de l’auto-organisation des particules déposées sur la surface. De nombreuses applications en découlent, notamment dans les domaines de l’impression, la réalisation de dépôts de surfaces, ou encore de matériels électroniques et photovoltaïques.
[0016] Par exemple, le document Garcia-Cordero J.-L et al., « Sessile droplets for Chemical and biological assays », Lab Chip, vol. 17, n°13, 7 juillet 2017 s’intéresse au phénomène « tâche de café », notamment dans le cadre de tests de détection d’analytes.
[0017] Or, de manière innovante, la présente invention consiste à utiliser cette auto organisation des particules lors de l’évaporation, afin de proposer une méthode de criblage (avantageusement haut débit) originale qui est destinée à découvrir et à discriminer des activités catalytiques.
[0018] En effet, selon la présente invention, la modification de la configuration du dépôt de particules (dite encore « configuration de séchage ») est mise à profit pour détecter des activités catalytiques.
[0019] En pratique, les états initial / final sont ainsi aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules, à savoir par exemple :
[0020] - ledit état « initial » est destiné à engendrer une première configuration choisie avantageusement parmi une « tache de café » (dans laquelle les particules sont réparties sous une forme annulaire périphérique), une croix de malte, une présence d’agrégats, en étoile ou l’absence de motif, et
[0021] - ledit état « final » est destiné à engendrer une seconde configuration, différente de la première configuration, dans laquelle ladite seconde configuration est changée selon un motif qui peut être avantageusement une tache de café, une croix de malte, une présence d’agrégats, en étoile ou l’absence de motif.
[0022] Sans être limité par une quelconque théorie, cette activité catalytique est avantageusement responsable d’une modification dudit au moins un agent rhéologique (depuis l’état initial vers l’état final) qui résulte en un changement de vitesse de déplacement des particules lié à une modification de la rhéologie ou à des phénomènes de gélification, d’agrégation, d’interaction, etc. au sein de la goutte, car le cas échéant impliqués dans des réactions notamment de polymérisation, dépolymérisation, gélification, etc. [0023] Selon un mode de réalisation préféré, ledit au moins un agent rhéologique est apte à être modifié depuis un état initial, inactif ou actif, jusqu’à un état final, respectivement actif ou inactif, en présence de ladite activité catalytique.
[0024] Les états inactif / actif sont aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules :
[0025] - ledit état « inactif » est destiné à engendrer une configuration dite « tache de café » dans laquelle les particules sont réparties sous une forme annulaire périphérique, et
[0026] - ledit état « actif » est destiné à engendrer une configuration dite « alternative » dans laquelle ladite configuration « tache de café » est altérée.
[0027] Dans ce mode de réalisation préféré, l’apparition ou l’altération de l’effet « tache de café » est mise à profit pour détecter des activités catalytiques qui sont avantageusement responsables d’un changement de vitesse de déplacement des particules lié à une modification de la rhéologie ou à des phénomènes de gélification, d’agrégation, d’interaction, etc. au sein de la goutte, car impliqués dans des réactions notamment de polymérisation, dépolymérisation, gélification, etc.
[0028] Ainsi une réaction de polymérisation enzymatique sera détectée par une altération de l’effet « tache de café », induite par la limitation de la diffusion des particules en périphérie de la goutte, liée avantageusement à l’augmentation de la viscosité résultant de la synthèse du polymère.
[0029] Inversement, une réaction de dégradation (par exemple lytique ou dépolymérisation) sera détectée par la restauration de l’effet « tache de café », liée avantageusement à la diminution de la viscosité issue de la dégradation du polymère.
[0030] D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé de détection conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
[0031] - ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les agents agissant sur la viscosité dynamique de ladite goutte, avec une valeur de viscosité dynamique dans l’état inactif qui est inférieure à une valeur de viscosité dynamique dans l’état actif (par exemple, avec dans l’état inactif, une valeur de viscosité dynamique inférieure à l OmPa.s, et dans l’état actif, une valeur de viscosité dynamique supérieure à 2 mPa.s) ;
[0032] - ledit au moins un agent rhéologique est dans un état initial inactif et dans un état final actif, pour détecter une activité catalytique de polymérisation, réticulation, gélification, agrégation, insolubilisation, ou ledit au moins un agent rhéologique est dans un état initial actif et dans un état final inactif, pour détecter une activité catalytique de dépolymérisation, hydrolyse ;
[0033] - ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les précurseurs de polymères ou les polymères, avantageusement les biopolymères, de préférence aptes à former un gel / hydrogel ;
[0034] - les particules consistent en des nanoparticules, par exemple des nanoparticules de cellulose ;
[0035] - les particules consistent en des particules composées d’un matériau optiquement actif ou/et aptes à s’auto-organiser pour former des structures optiquement actives ;
[0036] - le mélange dudit au moins un composé d’intérêt et dudit au moins un agent rhéologique est mis en œuvre avant ou après l’étape de dépôt ;
[0037] - l’étape de dépôt consiste à déposer une pluralité de gouttes contenant des concentrations différentes dudit au moins un composé d’intérêt et/ou d’au moins deux composés d’intérêt différents (voire des concentrations différentes des particules et/ou dudit au moins un agent rhéologique) ;
[0038] - l’étape d’évaporation est ajustée pour s’écouler sur un temps inférieur à 5 heures, de préférence allant de 10 à 60 minutes.
[0039] Selon un mode de réalisation particulier, ladite activité catalytique est une activité catalytique de dégradation (par exemple lytique ou dépolymérisation), avantageusement une activité catalytique du type hydrolase, de préférence choisie parmi une activité glycosidase, amidase, estérase, éther-hydrolase, phytase ou phosphorylase, par exemple encore choisie dans le couple agent rhéologique / composé d’intérêt parmi :
[0040] - polysaccharide / polysaccharide-hydrolases,
[0041] - polysaccharide / cocktails de polysaccharide-hydrolases,
[0042] par exemple encore choisie dans le couple agent rhéologique / composé d’intérêt parmi :
[0043] - arabinoxylane (AX) / xylanase,
[0044] - arabinoxylane (AX) / xylanase, arabinofuranosidase,
[0045] - carboxymethyl cellulose (CMC) / cocktails de cellulases,
[0046] - xyloglucane (XG) / cocktails de cellulases,
[0047] - polylysine (PL) / trypsine,
[0048] - polyuréthane / polyuréthanase, [0049] - acide phytique / phytase,
[0050] - polysaccharide / oxidase,
[0051 ] - polysaccharide / phosphorylase,
[0052] ou ladite activité catalytique est une activité catalytique de polymérisation, avantageusement une activité catalytique du type polymérase, par exemple encore choisie dans le couple agent rhéologique / composé d’intérêt parmi :
[0053] les monomères ou oligomères de polysaccharide / polysaccharide-polymérase,
[0054] de préférence parmi :
[0055] - alternane (a-1 ,6/ a-1 ,3) / alternane-saccharases,
[0056] - dextrane (a-1 ,6) / dextrane-saccharases,
[0057] - reuterane (a-1 ,4/ a-1 ,6) / reuterane-saccharases,
[0058] -mutane (a-1 ,3) / mutane-saccharases,
[0059] - a-glucane / GH70 glucanotransférases,
[0060] - levan (b-2,6) / levane-saccharases,
[0061] - inulin (b-2,1 ) / inulo-saccharases,
[0062] - polysaccharide / phosphorylases,
[0063] - polysaccharide / Leloir Type Glycosyltransférases.
[0064] L’invention propose également un système pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, par la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention, lequel système de détection comprend :
- un ensemble de réactifs, pour effectuer l’étape de dépôt, comprenant un support comportant une surface de réception, un solvant, des particules et au moins un agent rhéologique,
- un dispositif d’évaporation, pour effectuer l’étape d’évaporation et engendrer ledit au moins un dépôt de particules,
- un dispositif d’analyse, pour effectuer l’étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules.
Description détaillée de l’invention
[0065] De plus, diverses autres caractéristiques de l’invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l’invention et où :
[0066] [Fig. 1 ] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (image de droite), pour le couple arabinoxylane de blé haute viscosité (AX) / xylanase.
[0067] [Fig. 2] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (image de droite), pour le couple xyloglucane (XG) / cocktail de cellulases.
[0068] [Fig. 3] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (image de droite), pour le couple carboxyméthylcellulose / cocktail de cellulases.
[0069] [Fig. 4] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (image de droite), pour le couple polylysine (PLL) / trypsine.
[0070] [Fig. 5] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (image de droite), pour le couple lait / présure.
[0071] [Fig. 6] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues en présence de saccharose seul (image de gauche) ou en présence d’un mélange de d’alternane et de fructose (image de droite) ; ce mélange alternane + fructose correspond à une simulation d’un milieu réactionnel obtenu en fin de synthèse lors de l’incubation de l’alternane-saccharases en présence de saccharose.
[0072] [Fig. 7] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues en présence : - d’un mélange de saccharose (substrat de départ d’une alternane-saccharases) et de CNC (photo de gauche), - d’un mélange de saccharose (substrat de départ d’une alternane-saccharases), de CNC et d’un extrait cellulaire ne contenant pas d’alternane-saccharases (photo du milieu), - d’un a- glucane (alternane) produit par un extrait cellulaire contenant une alternane-saccharase à partir de saccharose en présence de CNC (photo de droite).
[0073] [Fig. 8] représente les images obtenues par photographie de plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°, obtenues avant réaction (image de gauche) et après réaction (images de droite), pour le couple pectine / orange-pectine méthylestérase (O-PME) et Aspergillus aculeatus pectine méthylestérase (A.a-PME).
[0074] Il est à noter que, sur ces figures, les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références. [0075] La présente invention concerne ainsi un procédé et une méthode pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt.
[0076] Activité catalytique
[0077] De manière générale, par « activité catalytique », on entend avantageusement une propriété d’un composé mesurée par la quantité de substance catalysée par unité de temps lors d’une réaction chimique ou biochimique spécifiée et dans des conditions opérationnelles spécifiées.
[0078] En présence d’une telle activité catalytique, le composé d’intérêt consiste alors en un catalyseur, avantageusement en un catalyseur chimique ou en un catalyseur biotique.
[0079] Par « catalyseur biotique », on entend avantageusement une enzyme, un mélange (ou cocktail) d’enzymes, un extrait cellulaire non purifié ou un microorganisme.
[0080] En particulier, l’activité catalytique d’une enzyme englobe :
[0081 ] - l’accroissement du taux de conversion du substrat par unité de temps et quantité d’enzymes, ou
[0082] - la variation de la concentration de substrat par unité de temps et quantité d’enzymes, ou
[0083] - la variation de la concentration de produit par unité de temps et par quantité d’enzymes.
[0084] En l’espèce, l’activité catalytique du composé d’intérêt correspond avantageusement à un phénomène de conversion d’au moins un agent rhéologique depuis un état initial jusqu’à un état final entraînant une variation de viscosité et/ou d’interaction, résultant dans une diffusion/mobilité modifiée des particules.
[0085] Par « activité catalytique », on englobe ainsi une activité catalytique choisie avantageusement parmi les activités catalytiques suivantes : polymérisation, réticulation, gélification, agrégation, insolubilisation ou dégradation (par exemple lytique ou dépolymérisation).
[0086] La polymérisation désigne la réaction chimique ou le procédé par lesquels des petites molécules réagissent entre elles pour former des molécules de masses molaires plus élevées. Les molécules initiales peuvent être des monomères ou des pré-polymères ou des précurseurs de polymère ; la synthèse conduit à des polymères.
[0087] Inversement, la dépolymérisation est le processus de conversion d’un polymère en monomères, un mélange de monomères ou un mélange d’oligomères. [0088] La réticulation correspond à la formation d’un ou de plusieurs réseaux tridimensionnels. Des liaisons covalentes entre les chaînes macromoléculaires sont créées. Les structures réticulées sont généralement préparées à partir de pré-polymères linéaires ou ramifiés.
[0089] La gélification correspond avantageusement à la transformation en réseau de polymères formant un colloïde renfermant du liquide.
[0090] L’agrégation est avantageusement le processus par lequel des particules solides précipitantes s’associent pour former des particules plus grosses.
[0091] Une réaction d’insolubilisation est un processus qui conduit, par modification chimique, à changer la nature du composé (modification chimique ou physique) provoquant une désolvatation conduisant à son auto-association, par le bais de liaisons covalentes ou non- covalentes, pour former des particules de taille provoquant la sédimentation.
[0092] Par « détection » de cette activité catalytique, on entend la discrimination « qualitative » entre la présence, et l’absence, de ladite activité catalytique générée par ledit au moins un composé d’intérêt.
[0093] De manière alternative ou complémentaire, la « détection » de l’activité activité catalytique consiste à établir une discrimination « quantitative », à savoir déterminer, en présence de ladite activité catalytique générée par ledit au moins un composé d’intérêt, une valeur quantitative d’activité catalytique.
[0094] Cette « valeur quantitative » peut alors être exprimée en katal (kat), c’est-à-dire la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde.
[0095] Cette « valeur quantitative » peut également être exprimée :
[0096] - en « unité internationale » (IU, International Unit), correspondant à la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 pmole de substrat par minute,
[0097] - en « nombre d’évènements catalytiques » (kcat), qui est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d’enzyme par seconde (ou le nombre de moles de substrat transformé par mole d’enzyme par seconde),
[0098] - en « activité molaire » qui est le nombre de moles de substrat transformé par mole d’enzyme par minute,
[0099] - en « activité spécifique », soit l’activité par unité de masse de protéine à activité catalytique, par exemple exprimée en lU/mg d’enzyme (ou pkat/mg), ou en lU/g d’enzyme (ou pkat/g).
[0100] Procédé [0101] Selon la présente invention, le procédé comprend une succession d’étapes qui permettent l’obtention d’un dépôt de particules dont la configuration / le motif assure une discrimination entre une présence d’activité catalytique par ledit au moins un composé d’intérêt ou une absence (un défaut) d’activité catalytique par ledit au moins un composé d’intérêt.
[0102] Pour cela, une étape a) consiste en une étape de dépôt, sur une surface, d’au moins une goutte comprenant :
- un solvant,
- ledit au moins un composé d’intérêt,
- des particules, destinées à former un dépôt sur ladite surface suite à une évaporation dudit solvant, et
- au moins un agent rhéologique.
[0103] La surface consiste en une surface de déposition ou une surface de réception, avantageusement horizontale (avantageusement la surface d’un support en forme de plaque).
[0104] Cette surface est avantageusement inerte. La surface est encore avantageusement transparente.
[0105] Cette surface peut être réalisée dans un matériau choisi par exemple parmi le verre ou un polymère thermoplastique, avantageusement transparent tel que le poly(méthacrylate de méthyle) (souvent abrégé en PMMA).
[0106] Par « goutte », on englobe en particulier une goutte dite « posée » ou « sessile » (goutte posée sur un support solide plan).
[0107] Le volume de la goutte est avantageusement compris entre 10 et 1000 pL, avantageusement entre 10 et 50 pL, de préférence de 15 à 25 pL.
[0108] Par « solvant », on entend avantageusement un liquide organique ou aqueux, de préférence de l’eau, contenant un ou plusieurs composés en solution ou en suspension (appelés « soluté(s) »).
[0109] Ce solvant est apte à s’évaporer au cours d’une étape suivante d’évaporation.
[01 10] Ce solvant est avantageusement adapté à autoriser, le cas échéant, l’action de conversion de l’agent rhéologique en présence de ladite activité catalytique,
[01 1 1] La goutte peut ensuite contenir un ou plusieurs composés d’intérêts, rapportés, dont une éventuelle activité catalytique est recherchée.
[01 12] Par « composé d’intérêt », on englobe en particulier un catalyseur, connu ou potentiel, avantageusement un catalyseur chimique ou un catalyseur biotique. [01 13] Par « catalyseur biotique », on entend avantageusement une enzyme ou un microorganisme.
[01 14] La goutte peut ainsi contenir un unique composé d’intérêt ou une combinaison d’au moins deux composés d’intérêt.
[01 15] Les particules précitées consistent avantageusement en des particules composées d’un matériau observable optiquement, éventuellement un matériau optiquement actif et/ou aptes à s’auto-organiser pour former des structures optiquement actives.
[01 16] En pratique, les particules consistent avantageusement en des nanoparticules, par exemple des nanoparticules de polysaccharides et en particulier des nanoparticules de cellulose.
[01 17] Une nanoparticule consiste avantageusement en une particule de matière dont au moins une dimension est comprise entre 1 à 100 nanomètres.
[01 18] Les nanoparticules de polysaccharides sont de préférence des nanocristaux de cellulose (NCC ou CNC). De tels nanocristaux sont par exemple préparés par hydrolyse acide du coton selon le protocole décrit dans Revol et al. (Int. J. Biol. Macromol. 1992, 14, 170-172.) ou Cranston et al. (Biomacromolecules, vol 7, 2006, p2522). Ils ont par exemple une dimension latérale comprise entre 3 et 50 nm et une longueur comprise entre 30 et 1000 nm.
[01 19] Les particules sont en outre avantageusement aptes à s’auto-organiser pour former des structures / configurations / motifs qui sont observables par des moyens optiques sur la surface, suite à l’évaporation du solvant.
[0120] De tels motifs observables optiquement, résultant de l’auto-organisation des particules déposées sur la surface, sont par exemple décrits dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22-47.
[0121 ] Tel que développé par la suite, ces particules sont avantageusement aptes à former un motif annulaire périphérique (ou au moins sensiblement annulaire) connu sous le nom de « tache de café » ou « coffe-ring pattern », suite à l’évaporation du solvant.
[0122] Selon un mode de réalisation particulier, ces particules peuvent être aptes à s’auto- organiser pour former des structures / configurations optiquement actives (dites encore « motifs optiquement actifs ») sur la surface, suite à l’évaporation du solvant.
[0123] Une particule ou une structure est « optiquement active » (ou possède un pouvoir rotatoire) si elle fait dévier le plan de polarisation de la lumière polarisée.
[0124] Le cas échéant, la détection de la présence de cet effet tache de café peut être obtenue en positionnant la goutte séchée entre deux polariseurs croisés ; un phénomène d’iridescence apparaît en raison de l’auto-organisation des particules (voir par exemple « Formation of Chiral Nematic Films from Cellulose Nanocrystal Suspensions ls a Two-Stage Process », Xiaoyue Mu et al. Langmuir 2014, 30, 9256-9260). Un tel dispositif de détection serait simple, peu coûteux et aisément transportable ou miniaturisable.
[0125] D’autres systèmes de détection optique peuvent encore être envisagés en modifiant les particules (particules colorées ou fluorescente), par exemple pour une détection visible à l’œil nu.
[0126] Par « agent rhéologique » (dit encore « additif de rhéologie » ou « agent de rhéologie »), on entend en particulier un composant (différents des particules) dont la présence dans la goutte génère une modification de la diffusion/mobilité des particules (en comparaison avec une goutte dépourvue dudit agent rhéologique), avantageusement par un phénomène de viscosité et/ou d’interaction.
[0127] Ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les agents aptes à être modifiés depuis un état initial jusqu’à un état final, en présence de ladite activité catalytique.
[0128] L’état « initial » correspond à l’état de l’agent rhéologique avant (et ou en l’absence d’) une modification par activité catalytique dudit au moins un agent rhéologique. L’état « final » correspond à l’état de l’agent rhéologique après (suite à) une modification (depuis ledit état initial) par activité catalytique dudit au moins un agent rhéologique.
[0129] Les états initial / final sont aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules :
[0130] - ledit état initial est destiné à engendrer une première configuration (dite encore
« configuration initiale ») dans laquelle les particules sont réparties selon une première configuration / un premier motif, par exemple parmi une « tache de café », une croix de malte, une présence d’agrégats, en étoile ou l’absence de motif, et
[0131] - ledit état final est destiné à engendrer une seconde configuration (dite encore « configuration finale ») dans laquelle les particules sont réparties selon une seconde configuration / un second motif (différent(e) de ladite première configuration / dudit premier motif), par exemple parmi une « tache de café », une croix de malte, une présence d’agrégats, en étoile ou l’absence de motif.
[0132] De tels motifs sont par exemple décrits dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22-47.
[0133] Selon l’activité catalytique recherchée, l’état initial et l’état final peuvent consister, respectivement ou inversement, en un état dit « inactif » ou en un état dit « actif ». [0134] L’état « inactif » dudit au moins un agent rhéologique est destiné à engendrer la configuration dite « tache de café », dans laquelle les particules sont regroupées sous une forme annulaire périphérique (le long du contour de la goutte).
[0135] En effet, en présence d’un agent rhéologique dans un état final inactif et lorsque la goutte est soumise à évaporation, les particules vont se concentrer à la périphérie de cette goutte en raison d’un gradient d’évaporation, entraînant la formation d’un flux capillaire drainant les particules vers la périphérie de la goutte (ligne de contact triple). Ce phénomène est plus généralement connu sous le nom de « effet tache de café » ou « tache de café » ou « coffe-ring pattern ». Un tel phénomène, et configuration, sont encore décrits par exemple dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22-47.
[0136] Comme développé par la suite, dans le cas particulier des CNC, leur concentration à la périphérie de la goutte entraîne leur auto-organisation en phase cristal liquide, qui peut être détectée entre deux polariseurs croisés.
[0137] Alternativement, l’état « actif » dudit au moins un agent rhéologique est destiné à engendrer une configuration dite « alternative » du dépôt de particules, dans laquelle la configuration « tache de café » précitée est altérée.
[0138] Sans être limité par une quelconque théorie, en présence d’un agent rhéologique dans un état final actif et lorsque la goutte est soumise à évaporation, l’effet tache de café est inhibé par différents mécanismes qui conduisent à une limitation de la diffusion des particules et à une limitation de leur migration vers la périphérie de la goutte. En particulier, la diffusion des particules est réduite lorsque la viscosité dans la goutte augmente, par exemple sous l’effet de la synthèse de polymère.
[0139] Par « altérée », on englobe notamment :
[0140] - une disparition de ladite configuration « tache de café », ou
[0141 ] - une disposition / un motif qui est différent(e) de la configuration « tache de café » seule
(par exemple complétée avec une disposition en croix de malte), ou
[0142] - une disposition / un motif qui est différent(e) de la configuration « tache de café » (par exemple croix de malte seule, présence d’agrégats, motif en étoile ou l’absence de motif).
[0143] Ces motifs, autres que « tache de café », sont par exemple décrits dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22-47.
[0144] Selon un mode de réalisation préféré, ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les agents agissant sur la viscosité dynamique au sein de la goutte (et en corolaire sur la diffusion et sur la migration des particules lors du séchage). [0145] Le cas échéant, la valeur de viscosité dynamique dans son état inactif est avantageusement inférieure à une valeur de viscosité dynamique dans son état actif.
[0146] La viscosité dynamique est une grandeur physique qui caractérise la résistance à l’écoulement laminaire d’un fluide incompressible, avantageusement exprimée en mPa.s.
[0147] Ainsi, en fonction de l’activité catalytique recherchée, deux situations alternatives sont envisagées :
- ledit au moins un agent rhéologique est converti depuis un état initial inactif (viscosité dynamique faible) vers un état final actif (viscosité dynamique forte), par exemple pour détecter une activité catalytique de polymérisation, réticulation, gélification, agrégation, insolubilisation, ou
- ledit au moins un agent rhéologique est converti depuis un état initial actif (viscosité dynamique forte) vers un état final inactif (viscosité dynamique faible), par exemple pour détecter une activité catalytique de dépolymérisation, hydrolyse.
[0148] En l’espèce, une valeur de viscosité dynamique « faible » est inférieure à une valeur de viscosité dynamique « forte ».
[0149] En l’espèce, pour détecter une activité catalytique de polymérisation ou de dépolymérisation, ledit au moins un agent rhéologique est avantageusement choisi parmi les précurseurs de polymères / polymères, avantageusement les biopolymères, de préférence aptes à former un gel / hydrogel.
[0150] Les biopolymères sont avantageusement des polymères issus de la biomasse, c’est-à- dire produits par des êtres vivants (végétaux, algaux, animaux, fongiques, etc.). Ces biopolymères correspondent ainsi à l’ensemble des macromolécules biologiques résultant de l’assemblage de molécules plus simples ou monomères.
[0151] Un gel est un matériau solide (éventuellement mou ou ductile), constitué d’un réseau tridimensionnel de macromolécules entourées de liquide. En d’autres termes, le gel est formé de deux milieux dispersés l’un dans l’autre : le milieu dit « solide » est constitué de longues molécules connectées entre elles par des points de réticulation pour former un réseau tridimensionnel et le milieu liquide (solvant) est constitué de molécules indépendantes.
[0152] Un hydrogel est un gel dont la phase liquide est l’eau. Les hydrogels sont constitués de polymères naturels ou synthétiques.
[0153] Compte tenu de ce qui précède, pour détecter cette activité catalytique de polymérisation ou de dépolymérisation, ledit au moins un agent rhéologique se présente avantageusement :
- dans son état actif, sous la forme d’un polymère, et - dans son état inactif, sous la forme de précurseurs de polymère.
[0154] Dans un mode de réalisation, ladite activité catalytique est une activité catalytique de polymérisation, avantageusement une activité catalytique du type polymérase.
[0155] Dans ce cadre, le couple agent rhéologique / composé d’intérêt (dont l’activité catalytique est connue ou recherchée) est avantageusement choisi parmi :
[0156] les monomères ou oligomères de polysaccharide / polysaccharide-polymérase,
[0157] de préférence parmi
[0158] - alternane (a-1 ,6/ a-1 ,3) / alternane-saccharases,
[0159] - dextrane (a-1 ,6) / dextrane-saccharases,
[0160] - reuterane (a-1 ,4/ a-1 ,6) / reuterane-saccharases,
[0161 ] - mutane (a-1 , 3) / mutane-saccharases,
[0162] - a-glucane / GH70 glucanotransférases,
[0163] - levan (b-2,6) / levane-saccharases,
[0164] - inulin (b-2,1 ) / inulo-saccharases,
[0165] - polysaccharide / phosphorylase,
[0166] -polysaccharide / Leloir Type Glycosyltransférases.
[0167] Dans un autre mode de réalisation, ladite activité catalytique est une activité catalytique de dépolymérisation, avantageusement une activité catalytique du type hydrolases, de préférence encore choisie parmi une activité amidase, estérase, glycosidase, éther-hydrolase, phytase ou phosphorylase. Un tel mécanisme est donc généralement mis en oeuvre par une enzyme de type hydrolase, catalysant une réaction biochimique d’hydrolyse.
[0168] Des enzymes aptes à mettre en oeuvre de telles réactions d’hydrolyse sont en particulier classées dans le groupe EC 3 de la nomenclature dite « EC » (pour « Enzyme Commission numbers » - « Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) »).
[0169] Parmi les enzymes de type hydrolase, on peut en particulier citer les enzymes ayant une activité hydrolytique envers les biopolymères. Parmi ces enzymes aptes à hydrolyser des biopolymères, on peut citer en particulier les polysaccharides hydrolases, dénommées encore glycoside hydrolases ou glycosidases (ces enzymes sont avantageusement classifiées dans le groupe EC 3.2.1 ).
[0170] Par « polysaccharides hydrolases », on entend par exemple les xylanases, les cellulases, les chitinases, les pectinases, les mannases, les galactanases. [0171] Parmi les enzymes hydrolytiques de biopolymères, on peut encore citer par exemple les protéases, les nucléases, les lignininases.
[0172] Avantageusement encore, le couple agent rhéologique / composé d’intérêt (dont l’activité catalytique est connue ou recherchée) est alors avantageusement choisi parmi :
[0173] - polysaccharide / polysaccharide-hydrolases,
[0174] - polysaccharide / cocktails de (mélange d’au moins deux) polysaccharide-hydrolases,
[0175] par exemple encore choisie dans le couple agent rhéologique / composé d’intérêt parmi :
[0176] - arabinoxylane (AX) / xylanase,
[0177] - arabinoxylane (AX)/ xylanase, arabinofuranosidase,
[0178] - carboxymethyl cellulose (CMC)/ cocktails de cellulases,
[0179] - xyloglucane (XG) / cocktails de cellulases,
[0180] - polylysine (PL) / trypsine,
[0181 ] - polyuréthane / polyuréthanase,
[0182] - acide phytique / phytase,
[0183] - polysaccharide / oxidase,
[0184] - polysaccharide / phosphorylase.
[0185] Encore dans un autre mode de réalisation, ladite activité catalytique est une activité catalytique de gélification.
[0186] Le couple agent rhéologique / composé d’intérêt est par exemple choisi parmi les pectines / méthylestérases.
[0187] Les pectines méthylées ne forment pas de gel en présence de calcium (selon la concentration en pectine et calcium, l’état inactif peut être différents : coffee ring ou précipité). Après action de l’enzyme, elles forment des gels avec le calcium (état actif, qui change également selon la concentration en pectine et en calcium : no coffee ring ou précipité).
[0188] De manière générale, en pratique, le mélange du solvant, des particules et dudit au moins un agent rhéologique est avantageusement mis en œuvre avant l’étape de dépôt a) (étape préalable de mélange). Le choix de ces différents composants (y compris leurs concentrations respectives) est ajusté de façon à pouvoir observer, le cas échéant, l’activité catalytique recherchée.
[0189] En outre, le mélange dudit au moins un composé d’intérêt et dudit au moins un agent rhéologique est avantageusement mis en œuvre : [0190] - avant l’étape de dépôt a) (étape préalable de mélange), de sorte que l’éventuelle activité catalytique est avantageusement initiée, voire terminée, avant l’étape de dépôt a) (étape d’incubation préalable au dépôt), ou
[0191] - après l’étape de dépôt a), de sorte que l’éventuelle activité catalytique est avantageusement initiée et terminée après l’étape de dépôt a), au sein de la goutte (étape intercalaire d’incubation, in situ, entre l’étape de dépôt et l’étape d’évaporation).
[0192] L’étape de dépôt a) peut encore consister à déposer une pluralité de gouttes contenant :
[0193] - des concentrations différentes dudit au moins un composé d’intérêt, et/ou
[0194] - des composés d’intérêt différents,
[0195] voire aussi
[0196] - des agents rhéologiques différents,
[0197] - des concentrations différentes dudit au moins un agent rhéologique, et ou
[0198] - des concentrations différentes desdites particules.
[0199] Le dépôt de gouttes comportant des agents rhéologiques différents, avec au moins un composé d’intérêt identique, est utile pour le criblage d’une éventuelle activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt.
[0200] Le dépôt de gouttes comportant des concentrations différentes dudit au moins un agent rhéologique, et ou des concentrations différentes desdites particules, est utile pour déterminer des rapports agent rhéologique / particules qui sont adaptés au criblage ultérieur d’une éventuelle activité catalytique.
[0201] Suite à cette étape de dépôt a), une étape b) consiste en une étape d’évaporation du solvant présent dans la ou les gouttes déposées.
[0202] Au sein de chaque goutte, cette étape d’évaporation b) engendre le dépôt des particules selon l’une des deux configurations précitées, fonction de l’état initial ou de l’état final dudit au moins un agent rhéologique en présence.
[0203] En particulier, dans le cas d’au moins un agent rhéologique présentant des états actif / inactif, cette étape d’évaporation b) engendre le dépôt des particules selon l’une des deux configurations, fonction de l’état final dudit au moins un agent rhéologique en présence, à savoir :
[0204] - la configuration « tache de café », lorsque ledit au moins un agent rhéologique est dans un état final inactif, ou
[0205] - la configuration « alternative », lorsque ledit au moins un agent rhéologique est dans un état final actif. [0206] De manière générale, les conditions de cette opération d’évaporation b) (ou « opération de séchage ») sont par exemple décrites dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22-47.
[0207] En particulier, l’homme du métier peut adapter le temps de séchage en fonction de la taille de la goutte, de la surface de déposition, de la température et de l’humidité de séchage.
[0208] L’étape d’évaporation b) est avantageusement ajustée pour s’écouler sur un temps inférieur à 5 heures, de préférence allant de 10 à 60 minutes.
[0209] Suite à ce séchage, une étape c) consiste en une étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules.
[0210] Comme précisé précédemment, deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules peuvent être obtenues (fonction de l’état initial ou de l’état final dudit au moins un agent rhéologique en présence), avantageusement la configuration « tache de café » ou la configuration « alternative » (dans laquelle la configuration « tache de café » est altérée).
[021 1 ] L’analyse de la configuration du dépôt de particules (dit encore « motif » ou « pattern ») est par exemple décrite dans le document Parsa et al., Advances in Colloid and Interface Science 254 (2018) 22^7.
[0212] En pratique, cette étape d’analyse c) s’effectue avantageusement par le biais d’une comparaison de prises de vue / d’images contenant des dépôts de particules issus des gouttes séchées.
[0213] Selon l’invention, cette étape d’analyse c) vise en outre à effectuer une distinction / un classement de chaque dépôt analysé parmi deux résultats alternatifs : absence d’une activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt ou présence d’une activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt.
[0214] En effet, en l’absence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt (résultat négatif), le dépôt analysé présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique toujours dans son état initial (ledit au moins un agent rhéologique est resté dans son état initial, en l’absence de la conversion par le composé d’intérêt).
[0215] Dans ce cas, le dépôt analysé présente une configuration qui est identique à un dépôt « témoin négatif », c’est-à-dire une configuration engendrée au niveau d’une goutte séchée dépourvue de l’activité catalytique. Autrement dit encore, les dépôts sont identiques avec, ou sans, ledit composé d’intérêt.
[0216] Inversement, en présence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt (résultat positif), le dépôt analysé présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état final (ledit au moins un agent rhéologique a ainsi été converti depuis un état initial vers un état final, par ledit au moins un composé d’intérêt).
[0217] Dans ce cas, le dépôt analysé présente une configuration qui est identique à un dépôt « témoin positif », c’est-à-dire une configuration engendrée au niveau d’une goutte séchée présentant l’activité catalytique. Autrement dit encore, les dépôts sont différents avec, ou sans, ledit composé d’intérêt.
[0218] Autrement dit encore, dans le cas d’un composé d’intérêt dépourvu d’activité catalytique recherchée, ledit au moins un agent rhéologique était toujours dans son état initial au moment du séchage. Alternativement, dans le cas d’un composé d’intérêt pourvu de l’activité catalytique recherchée, ledit au moins un agent rhéologique était dans son état final au moment du séchage (résultant de l’activité catalytique).
[0219] Tel que développé précédemment, cette étape d’analyse c) permet ainsi une détection entre :
[0220] - la présence de l’activité catalytique associée audit au moins un composé d’intérêt, constituant ainsi un catalyseur pour l’activité catalytique recherchée, et
[0221] - l’absence d’activité catalytique associée audit au moins un composé d’intérêt, qui ne constitue ainsi pas un catalyseur pour l’activité catalytique recherchée.
[0222] Selon une variante de réalisation, le procédé selon l’invention peut également servir au criblage d’au moins un second composé d’intérêt ayant potentiellement un effet inhibiteur d’activité catalytique.
[0223] Dans ce dernier cas, par « second composé d’intérêt », on englobe en particulier un inhibiteur d’activité catalytique, connu ou potentiel, avantageusement un inhibiteur chimique ou un inhibiteur biotique.
[0224] En pratique, ce second composé d’intérêt est avantageusement mélangé avec au moins un premier composé d’intérêt ayant une activité catalytique connue.
[0225] En présence d’effet inhibiteur dudit second au moins un composé d’intérêt, le dépôt analysé présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique toujours dans son état initial (ledit au moins un agent rhéologique est resté dans son état initial, en raison de l’inhibition de la conversion par le premier composé d’intérêt).
[0226] Inversement, en l’absence d’effet inhibiteur dudit second au moins un composé d’intérêt, le dépôt analysé présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état final (ledit au moins un agent rhéologique a ainsi été converti depuis son état initial vers son état final, par ledit premier au moins un composé d’intérêt).
[0227] Système pour détecter une activité catalytique [0228] La présente invention concerne encore le système pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
[0229] Ce système de détection comprend, tels que décrits précédemment, les éléments suivants :
- un ensemble de réactifs (ou kit ou trousse), pour effectuer l’étape de dépôt a), comprenant le support comportant la surface de réception, le solvant, les particules et ledit au moins un agent rhéologique,
- un dispositif d’évaporation, pour effectuer l’étape d’évaporation et engendrer ledit au moins un dépôt de particules,
- un dispositif d’analyse, pour effectuer l’étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules.
[0230] L’ensemble de réactifs est adapté à l’activité catalytique recherchée. L’utilisateur introduit alors ledit au moins un composé d’intérêt dans le mélange solvant / particules / agent rhéologique, cela dans des conditions adaptées à obtenir la modification de l’agent rhéologique le cas échéant.
[0231] Le dispositif d’évaporation, classique en soi, consiste par exemple en une enceinte fermée, régulée en température et humidité. Le contrôle de la température est avantageusement obtenu avec un support chauffé thermostaté, et l’humidité avec des bains de sel saturés.
[0232] Le dispositif d’analyse, classique en soi, comporte avantageusement des moyens optiques pour la prise de vue.
[0233] Ces moyens optiques consistent par exemple en deux polariseurs croisés, dans le cas de particules aptes à générer un aspect iridescent. Un tel dispositif est simple, peu coûteux et aisément transportable ou miniaturisable.
[0234] D’autres moyens optiques sont également envisageables, avantageusement en modifiant les particules (particules colorées par exemple pour une détection visible à l’œil nu).
[0235] Avantages
[0236] L’invention présente plusieurs spécificités :
- sa simplicité (la mise en œuvre du test est rapide, facile et ne nécessite aucune technologie spécifique ou appareillage coûteux),
- les quantités requises de substrat et de catalyseur, pour réaliser les réactions sont faibles,
- la possibilité de cribler des activités polymérases à haut débit est une originalité forte, notamment avec un dispositif très simple et très peu onéreux. [0237] Ce dispositif peut encore être mis en place simplement, sans besoin d’appareillages sophistiques et ne nécessite que des quantités faibles de produits (le volume typique d’une goutte est de 20 mI_ et nécessite donc très peu composé d’intérêt, d’agent rhéologique ou de substrats). La méthode est rapide et peut être parallélisée dans une optique de criblage haut débit.
[0238] Les applications envisagées sont étendues, notamment dans les domaines des biotechnologies blanches ou de la chimie pour :
[0239] - réaliser du criblage haut débit car toutes les étapes sont automatisables et ne nécessitent que peu de produits,
[0240] - dans le contrôle qualité de réactifs, d’enzymes ou même de polymères,
[0241 ] - réaliser un criblage haut débit d’au moins un second composé d’intérêt ayant potentiellement un effet inhibiteur d’activité catalytique.
[0242] La simplicité de mise en oeuvre permet d’envisager la vente de la méthode sous forme de kits / ensemble prêts à l’emploi, avec un protocole standardisé.
Exemples
[0243] I. Matériel et Méthodes :
[0244] 1.1 Description générale :
[0245] Les solutions finales à déposer sont préparées en mélangeant les solutions de polymère, ou de précurseur de polymère, avec une suspension de nanocristaux de cellulose.
[0246] Les quantités adéquates de solution polymère et de suspension de nanocristaux de cellulose sont mélangées, puis l’ensemble est vortexé puis laissé au repos durant 30 minutes avant de déposer les gouttes sur des plaques (qui peuvent être de verre ou de PMMA) et de procéder au séchage.
[0247] En cas de présence d’enzyme, le volume nécessaire d’enzyme est ajouté et la solution est mise dans les conditions idéales d’incubation, avant de déposer les gouttes (sur des plaques de verre ou de PMMA) et de procéder au séchage.
[0248] Le séchage se fait dans une enceinte fermée, régulée en température et humidité. Le contrôle de la température se fait avec un support chauffé thermostaté, et l’humidité avec des bains de sel saturés. Ce dispositif nous permet le séchage de 24 gouttes sous conditions contrôlées de température et d’humidité.
[0249] Le temps de séchage est d’environ 30 minutes. Les variations du temps de séchage dépendent de la taille de la goutte, de la surface de déposition, de la température et de l’humidité de séchage. [0250] Après le séchage des gouttes, l’acquisition des données se fait en photographiant les plaques contenant les gouttes séchées, mises sous polariseur croisé 0°/90°.
[0251] Le résultat final est obtenu en effectuant une comparaison qualitative des images obtenues avant et après réaction. Il faut noter que dans la gamme de concentration étudiée, les gouttes de nanocristaux de cellulose (dispersés dans l’eau) déposées sur des plaques de verre ou de Polyméthylène Méthacrylate (PMMA) engendrent une tache de café. A titre indicatif, l’angle de goutte d’une solution de NCC sur une plaque de verre est très faible ; sur le PMMA, l’angle de goutte est de l’ordre de 70°.
[0252] I.2 Préparation des solutions
[0253] 1.2.1 Préparation de la suspension de NCC
[0254] Les nanocristaux de cellulose (NCC ou CNC) sont issus de l’hydrolyse acide de pulpe de bois. Les NCC utilisés sont commercialisés par CelluForce ; ils ont une dimension latérale comprise entre 4 et 16 nm et une longueur comprise entre 50 et 250 nm.
[0255] La dispersion des NCC est préparée en faisant tomber la poudre de nanocristaux sur de l’eau ultra pure, sous vive agitation. La suspension est maintenue sous agitation toute la nuit, puis passée sous ultrason pour maximiser la dispersion des nanocristaux. La concentration réelle de la suspension de nanocristaux de cellulose est obtenue en faisant la mesure de la masse sèche.
[0256] 1.2.2 Préparation des solutions des polvmères/précurseurs
[0257] On appellera « polymère », le polymère visé par une réaction de dépolymérisation et,
« précurseur », la molécule visée par une réaction de polymérisation.
[0258] Les solutions ont été obtenues en dissolvant les polymères/précurseurs dans l’eau ultra pure, sous vive agitation durant une nuit.
[0259] 1.2.3 Préparation des mélanges NCC + Polymère/précurseurs
[0260] Le mélange des NCC / Polymère/précurseurs est effectué à différentes concentrations de ces derniers (entre 0,1 et 10 g/L), ce qui permet de balayer une large gamme de possibilités.
[0261] I.3 Systèmes étudiés
[0262] 1.3.1 Systèmes étudiés en dépolvmérisation
[0263] Cinq systèmes ont été utilisés pour étudier la dépolymérisation à savoir : l’arabinoxylane de blé haute viscosité (AX), le xyloglucane (XG), la carboxyméthylcellulose (CMC), la polylysine (PLL) et un système complexe « le lait ».
[0264] 1.3.1.1 Arabinoxylane de blé haute viscosité (AX) [0265] L’arabinoxylane de blé haute viscosité utilisé a été acheté chez Megazyme (AX). Il se compose de 38% d’arabinose et de 62% de xylose ; sa viscosité cinématique est de 42 cSt. L’enzyme utilisée pour dégrader les AX est la xylanase de Megazyme.
[0266] La xylanase a été utilisée à une concentration de 0,1 U/mL. L’incubation a été faite à 40°C, à un temps optimisé à 5min. Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées qui sont le verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 °C, et une humidité relative de 33%.
[0267] Les données acquises sont illustrées sur la figure 1.
[0268] 1.3.1.2. Xyloalucane
[0269] Le xyloglucane (XG) est l’hémicellulose la plus abondante dans la nature. Il est composé d’une chaîne principale de glucose semblable à celle de la cellulose ramifiée avec plusieurs composés (essentiellement des xylanes). Il est connu pour sa forte affinité avec la cellulose. Le xyloglucane utilisé est fourni par Megazyme. On utilise des cellulase comme enzyme pour le dégrader.
[0270] Le cocktail cellulosique a été ajouté à une concentration de 4 mg/mL. L’incubation a été maintenue à 40 'O durant une heure. Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées, que sont le verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 °C et une humidité relative de 33%.
[0271] Les données acquises sont illustrées sur la figure 2.
[0272] 1.3.1.3. La carboxyméthylcellulose
[0273] La carboxyméthylcellulose (CMC) est un éther de cellulose qui porte des charges négatives (commercialisé par Sigma). L’enzyme utilisée pour la dégradation de la carboxyméthylcellulose est des cellulases.
[0274] Les cellulases ont été ajoutées à une concentration de 5 mg/mL ; l’incubation a été faite à 40 °C, selon un temps optimisé de 30 minutes. Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées : le verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 °C et une humidité relative de 33%.
[0275] Les données acquises sont illustrées sur la figure 3.
[0276] 1.3.1.4. La polylvsine
[0277] La polylysine est un polyélectrolyte cationique qui interagit fortement avec les nanocristaux de cellulose (commercialisé par Sigma). L’enzyme utilisée pour la dégradation de la polylysine est la trypsine de PROMEGA. [0278] La trypsine a été ajoutée à une concentration de 0,45 mg/mL. La solution a été incubée durant 5 jours à 40 °C. Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées : le verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 °C et une humidité relative de 33%.
[0279] Les données acquises sont illustrées sur la figure 4.
[0280] 1.3.1.5. Le lait
[0281] On a utilisé du lait de vache demi écrémé, l’enzyme utilisé est la présure (tous deux achetés en grande surface).
[0282] Dans ce cas, les gouttes (CNC + Lait) sont déposées pour obtenir directement la réaction dans les gouttes. Des gouttes de 20pL de solution ont été déposées sur des plaques de PMMA et 2 m\- de solution de présure diluée y ont été ajoutées. Le séchage a été fait à 36 °C à une humidité relative de 75%.
[0283] Les données acquises sont illustrées sur la figure 5.
[0284] 1.3.2. Systèmes étudiés en polymérisation
[0285] Dans cette partie, la production d’alpha-glucanes a été étudiée à partir de saccharose
(VWR), en utilisant des a-transglucosylases de la famille 70 des glycoside-hydrolases (GH70 a- transglucosylases).
[0286] Les GH70 a-transglucosylases utilisées ont permis de synthétiser des homopolysaccharides de glucose (appelés généralement alpha-glucanes), et plus précisément des dextranes (composés à plus de 95% de liaisons a-1 ,6), des alternanes (mélanges de liaisons a-1 ,6 et a-1 ,3) et reuteranes (mélange de liaisons a-1 ,6 et a-1 ,4). La synthèse d’un alpha-glucane à partir de saccharose conduit en plus à la formation de fructose (50/50).
[0287] Les conditions de synthèse ont été optimisées de la sorte que la consommation du saccharose soit complète au bout de 1 h30 de réaction à 30°C. Les a-transglucosylases (DSR-s varD4N,DSR-OK, DSR-S native, GSK, ASR) ont été incubées à 0,26 U/mL en présence de 7,6 g/L de CNC et 50 g/L de saccharose.
[0288] Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées : le verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 °C et une humidité relative de 33%.
[0289] Les données acquises sont illustrées sur les figures 6 et 7.
[0290] l.3.3.Svstème étudié en gélification [0291] Ce volet s’intéresse à gélification d’une pectine de citrus fournie par Cargil Texturizing Solutions, en présence de calcium, en utilisant deux pectines méthylestérases : une d’orange (O-PME) vendue par Sigma et une A. aculatus (A.a-PME) vendue par Novozyme.
[0292] Les solutions en présence d’enzymes ont été maintenues à 50‘G, durant 12h. Le volume des gouttes déposées est de 20pL. Deux surfaces de déposition ont été testées : verre et Polyméthylène Méthacrylate. Les gouttes ont été séchées à 40 G et une humidité relative de 33%.
[0293] Les données acquises sont illustrées sur la figure 8.
[0294] II. Résultats
[0295] 11.1 Système CNC / AX (figure 1 )
[0296] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les combinaisons de concentrations [AX- CNC] pour lesquels ont été observés un changement du motif de type « tache de café » - croix de malte (état initial) dû à l’augmentation de la viscosité en présence d’AX.
[0297] Les couples (CNC/AX) caractéristiques qui présentent cet état initial sont par exemple : [AX-CNC] [10,1 -5,1/10,1 -7,6],
[0298] L’ajout de l’enzyme provoque une diminution de la viscosité des gouttes, cet état représente l’état final. L’ajout de l’enzyme provoque un changement depuis le motif « croix de malte » vers un motif de type « tache de café » pour les ratios [AX-CNC] [10,1 -5,1/10,1 -7,6].
[0299] Tous les ratios de concentration (CNC/AX/Enzyme), où la « tache de café » réapparaît, peuvent être utilisés afin de discriminer l’activité catalytique.
[0300] II.2. Système CNC/XG (figure 2)
[0301] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les combinaisons de concentration [XG- CNC] où on observe un motif de type croix de malte ; ce changement est dû à une augmentation de la viscosité en présence de XG. Il est connu que l’ajout de XG à des solutions de CNC provoque la formation de gels, le XG interagissant fortement avec les CNC.
[0302] Les rapports [XG-CNC] qui représentent un état initial, pour lesquels un motif croix de malte a pu être observé, sont : [7,6-2,6/7,6-5, 1 ].
[0303] L’ajout de l’enzyme provoque une diminution de la viscosité des gouttes induisant l’apparition d’un motif tache de café. Cet état représente l’état final.
[0304] L’ajout d’enzyme à des solutions contenant CNC+XG provoque un changement de viscosité d’un état gel à un état liquide.
[0305] Un changement depuis le motif « croix de malte » vers un motif de type « tache de café » a été observé pour les rapports [XG-CNC] [7,6-2,677,6-5,1 ]. [0306] Tous les rapports de concentrations pour lesquels a été observée une réapparition de la « tache de café » peuvent être utilisés afin de discriminer l’activité catalytique.
[0307] 11.3. Système CNC/CMC (figure 3)
[0308] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les combinaisons de concentration [CMC-CNC] pour lesquels on observe l’absence de tache de café, ce changement étant dû à une augmentation de la viscosité en présence de CMC. Les CMC peuvent interagir avec les CNC.
[0309] Les couples [CMC-CNC] caractéristiques, où on observe l’absence de tache de café, sont par exemple : [CMC-CNC] [2, 5-7, 6 ; 2,5-10,1] ; ces rapports représentent l’état initial.
[0310] L’ajout de l’enzyme provoque une diminution de la viscosité des gouttes ; cet état représente l’état final.
[031 1] Le motif « tache de café » réapparaît pour les couples [CMC-CNC] [2, 5-7, 6 ; 2,6-10,1].
[0312] Tous les ratios de concentration (CNC/CMC/Enzyme), où on a pu voir la réapparition de la « tache de café », peuvent être utilisés afin de discriminer l’activité catalytique.
[0313] II.4. Système CNC + Polylvsine (figure 4)
[0314] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les ratios de concentration [PLL-CNC] où on voit l’apparition « d’agrégats » biréfringents sur toute la surface de la goutte. La PLL interagit fortement avec les CNC et forme des agrégats.
[0315] Les couples [PLL-CNC], où on voit un changement de motif, est par exemple : [5, 1 -5,1 ; 5, 1 -7,6]. Ces ratios représentent l’état initial.
[0316] L’ajout de l’enzyme provoque un changement de la viscosité des gouttes, qui fait disparaître les agrégats. Cet état représente l’état final.
[0317] Les combinaisons de concentration [PLL-CNC], dans lesquelles on a pu voir la disparition des « agrégats », sont par exemple [5,1 -5,1 ; 5, 1 -7,6].
[0318] Les combinaisons [PLL-CNC], dans lesquelles on voit la disparition des « agrégats », peuvent être utilisées afin de discriminer l’activité catalytique.
[0319] II.5. Système CNC + Lait (figure 5)
[0320] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les ratios de concentration [Lait-CNC] où un motif de type « tache de café » est observable.
[0321 ] Les couples [Lait-CNC] où on voit un motif de type « tache de café » sont par exemple :
[30%-5/30%-7,5] ; ces ratios représentent un état initial. [0322] L’ajout de l’enzyme provoque un changement de la viscosité des gouttes, cet état représentant l’état final.
[0323] L’enzyme provoque la formation de gel. On voit la disparition de la « tache de café ».
[0324] Les combinaisons de concentration [Lait-CNC] dans lesquelles on a pu voir la disparition de la « tache de café » sont par exemple [30%-5/30%-7,5].
[0325] Les ratios (CNC/Lait/Enzyme), dans lesquels on voit la disparition de l’effet « tache de café », peuvent être utilisés afin de discriminer l’activité catalytique.
[0326] II. 6. Système de polymérisation du saccharose (figure 6)
[0327] Le saccharose est le substrat initial pour la polymérisation d’ a-glucanes.
[0328] Les résultats obtenus ont permis de déterminer les concentrations de [saccharose-CNC], pour lesquelles un motif de type « tache de café » et croix de malte est observable.
[0329] Les couples [saccharose-CNC], pour lesquels on observe un motif de type « tache de café » et croix de malte, sont par exemple : [10,1 -7,6/10,1 -10,1 ]. Cet état représente l’état initial.
[0330] L’ajout de l’enzyme, qui convertit le saccharose en alternane, provoque un changement de la viscosité des gouttes, qui se traduit par une disparition du motif tache de café / croix de malte et l’apparition d’un pattern en étoile (état final).
[0331 ] Dans le cas de l’alternane, où on a pu voir l’apparition d’un motif en étoile, les ratios sont par exemple [10,1 -7,6/10,1 -10,1].
[0332] II.7. Comparaison des motifs obtenus en utilisant des extraits cellulaires bruts (figure 7)
[0333] Dans le cas de polymérisation du saccharose en alternane, le saccharose seul forme un motif de type « tache de café » et croix de malte.
[0334] L’ajout d’un extrait cellulaire dépourvu d’enzyme génère une tache de café et l’extrait cellulaire contenant le catalyseur génère le motif en étoile.
[0335] II.8. CNC + Pectine (figure 8)
[0336] Les pectines gélifient par des interactions ioniques impliquant les groupes carboxyliques en présence de calcium. Les groupements carboxyliques sont méthyestérifiés et ne peuvent pas interagir avec le calcium.
[0337] Suivant la concentration en pectine, on observe soit le motif « tache de café », soit une absence de motifs, soit des agrégats (état initial).
[0338] Les pectines méthylestérases (PME) hydrolysent le groupement acétyle et induisent la formation de gel, ce qui modifie les motifs observés. [0339] Les résultats nous ont permis de déterminer les combinaisons pour lesquelles l’état initial disparait après ajout de l’enzyme, induit par une formation de gel à l’état final.
[0340] Les résultats montrent encore que deux PME (O-PME et Aa PME), possédant des modes d’hydrolyse différents, peuvent être distinguées [Pectine/Calcium : 5/1 ,66 ; 10/3,33].

Claims

Revendications
[Revendication 1 ] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, lequel procédé comprend les étapes suivantes :
a) une étape de dépôt, sur une surface, d’au moins une goutte comprenant :
- un solvant,
- ledit au moins un composé d’intérêt,
- des particules, destinées à former un dépôt sur ladite surface suite à une évaporation dudit solvant, et
- au moins un agent rhéologique, apte à être modifié depuis un état initial jusqu’à un état final en présence de ladite activité catalytique, lesquels états initial / final sont aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules,
b) une étape d’évaporation dudit solvant, pour engendrer ledit au moins un dépôt de particules selon l’une desdites deux configurations,
c) une étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules pour détecter :
- une absence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état initial, et
- une présence d’activité catalytique dudit au moins un composé d’intérêt, lorsque ledit dépôt présente une configuration engendrée par ledit au moins un agent rhéologique dans son état final.
[Revendication 2] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit au moins un agent rhéologique est apte à être modifié depuis un état initial, inactif ou actif, jusqu’à un état final, respectivement actif ou inactif, en présence de ladite activité catalytique,
lesquels états inactif / actif sont aptes à engendrer deux configurations différentes dudit au moins un dépôt de particules :
- ledit état « inactif » étant destiné à engendrer une configuration dite « tache de café » dans laquelle les particules sont réparties sous une forme annulaire périphérique, et
- ledit état « actif » étant destiné à engendrer une configuration dite « alternative » dans laquelle ladite configuration « tache de café » est altérée.
[Revendication 3] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les agents agissant sur la viscosité dynamique de ladite goutte, avec une valeur de viscosité dynamique dans l’état inactif qui est inférieure à une valeur de viscosité dynamique dans l’état actif.
[Revendication 4] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que :
- ledit au moins un agent rhéologique est dans un état initial inactif et dans un état final actif, pour détecter une activité catalytique de polymérisation, réticulation, gélification, agrégation, insolubilisation, ou
- ledit au moins un agent rhéologique est dans un état initial actif et dans un état final inactif, pour détecter une activité catalytique de dépolymérisation, hydrolyse.
[Revendication 5] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit au moins un agent rhéologique est choisi parmi les précurseurs de polymères ou les polymères, avantageusement les biopolymères, de préférence aptes à former un gel / hydrogel.
[Revendication 6] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite activité catalytique est une activité catalytique de dégradation (par exemple lytique ou dépolymérisation), avantageusement une activité catalytique du type hydrolase, de préférence choisie parmi une activité glycosidase, amidase, estérase, éther-hydrolase, phytase ou phosphorylase,
ou
en ce que ladite activité catalytique est une activité catalytique de polymérisation, avantageusement une activité catalytique du type polymérase.
[Revendication 7] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les particules consistent en des nanoparticules, par exemple des nanoparticules de cellulose.
[Revendication 8] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les particules consistent en des particules composées d’un matériau optiquement actif et/ou aptes à s’auto- organiser pour former des structures optiquement actives.
[Revendication 9] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le mélange dudit au moins un composé d’intérêt et dudit au moins un agent rhéologique est mis en œuvre avant ou après l’étape de dépôt.
[Revendication 10] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’étape de dépôt consiste à déposer une pluralité de gouttes contenant :
- des concentrations différentes dudit au moins un composé d’intérêt, et/ou
- des composés d’intérêt différents.
[Revendication 1 1] Procédé pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l’étape d’évaporation est ajustée pour s’écouler sur un temps inférieur à 5 heures, de préférence allant de 10 à 60 minutes.
[Revendication 12] Système pour détecter une activité catalytique d’au moins un composé d’intérêt, par la mise en oeuvre d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 1 1 , lequel système de détection comprend :
- un ensemble de réactifs, selon l’une quelconque des revendications 1 à 1 1 , pour effectuer l’étape de dépôt, comprenant un support comportant une surface de réception, un solvant, des particules et au moins un agent rhéologique,
- un dispositif d’évaporation, pour effectuer l’étape d’évaporation et engendrer ledit au moins un dépôt de particules,
- un dispositif d’analyse, pour effectuer l’étape d’analyse dudit au moins un dépôt de particules.
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