FR3116062A1 - Neolectine specifique et son utilisation pour detecter des microorganismes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une néolectine reconnaissant spécifiquement un hexofuranoside, consistant en une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside dont l’activité hydrolytique est réduite.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une néolectine spécifique, et son utilisation pour détecter la présence de microorganismes dans un échantillon, lesdits microorganismes présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les glycanes sont des molécules impliquées dans de nombreux phénomènes biologiques, et plus particulièrement dans la communication cellulaire et la reconnaissance moléculaire, grâce à leurs parties saccharidiques. De par leur grande diversité structurale, de nombreuses combinaisons peuvent être obtenues en combinant plusieurs unités monosaccharidiques.
Le nombre de combinaisons possibles est encore plus élevé si l’on considère la capacité naturelle des unités osidiques à cycliser sous deux formes :
- la forme pyranose, comprenant un hétérocycle à 6 atomes : 5 de carbone et un d'oxygène, qui est thermodynamiquement favorisée, et
- la forme furanose, comprenant un hétérocycle à 5 atomes, consistant en 4 atomes de carbone et un atome d'oxygène.
Les pentoses, unités osidiques constituées de 5 atomes de carbone, existent sous l’une des deux formes pyranose ou furanose. On peut citer comme exemples :
- le ribose : le ribofuranose est la forme présente dans les acides nucléiques de tous les organismes ; dans l'eau, la forme prédominante est le β-D-ribopyranose ;
- le xylose, sucre présent dans les plantes et le bois : la forme xylopyranose est majoritaire dans les polysaccharides (pectine, etc) des plantes ; dans l'eau, la forme prédominante est le β-D-xylofuranose.
En ce qui concerne les hexoses de formule brute C6H12O6, ces unités osidiques peuvent également exister sous les deux formes. Par exemple, le beta-galactose existe sous la forme D-galactofuranose (I, Galf), et sous la forme D-galactopyranose (II, Galp), comme cela est présenté dans les formules développés (I) et (II) ci-dessous :
Formule (I) Formule (II)
Toutefois, dans les cellules mammifères, les hexoses sont exclusivement présents sous la forme pyranose : ils sont désignés hexopyranosides.
Alors que les hexofuranosides sont totalement absents des cellules mammifères, leur présence a été observée dans certains polysaccharides extraits de microorganismes, notamment de microorganismes pathogènes tels queMycobacterium, Trypanosoma, LeishmaniaetAspergillus(Peltieret al., 2008).
Cette présence spécifique de certains oses, et donc des glycoprotéines les comprenant, pourrait être utilisée pour détecter, dans des échantillons biologiques, la présence de microorganismes présentant lesdites glycoprotéines à leur surface. Les hexofuranosides étant absents des cellules mammifères, celles-ci deviendraient ainsi distinguables des autres cellules présentes dans un échantillon complexe.
Toutefois, à ce jour, aucun procédé de détection de ce type n’a été décrit, faute d’outil moléculaire adéquat permettant une telle détection spécifique d’hexofuranosides.
Les protéines de reconnaissance des sucres sont dénommées lectines. De par leur spécificité pour les glycanes présentées à la surface des cellules, les lectines peuvent servir de sonde moléculaire pour détecter spécifiquement certaines cellules.
Récemment, la notion de « néolectines », lectines synthétiques produites dans un but spécifique, en particulier pour reconnaitre certains sucres, a été développée. Ces néolectines peuvent être synthétiséesde novo, ou être dérivées, par mutations ponctuelles, de glycosidases ou de lectines naturelles (Arnaudet al., 2013).
A ce jour, peu de lectines naturelles capables de reconnaitre des oses sous forme furanose (tels que D-galactofuranose, D-arabinofuranose) ont été identifiées.
Dans l’espèce humaine, deux lectines ont été identifiées, l’intelectine (Tsuji et al., 2001) et le DC-SIGN (Chiodo et al., 2013), qui reconnaissent le D-galactofuranose avec une faible spécificité.
Toutefois, ces deux lectines ne sont pas spécifiques exclusivement des formes furanoses :
- la lectine DC-SIGN est exprimée à la surface des cellules dendritiques, et interagit avec le D-galactofuranose ; cette interaction induit une réponse pro-inflammatoire du système immunitaire. Toutefois, DC-SIGN interagit également avec de nombreux autres oses, notamment avec le D-mannopyranose, avec la forme D-galactopyranose Galp, ainsi qu’avec le glucoside 6 ;
- l’intelectine humaine (ou Omentine) reconnait le D-galactofuranose (β-Galf) et donc les glycanes le comprenant, mais également d’autres glycanes qui comprennent les unités osidiques suivantes: des motifs D-phospho-glycerol (Gro-P), des heptoses, le D-glycero-D-talo-oct-2- ulosonic acide (KO) et le 3-deoxy-D-manno-oct–2-ulosonic acide (KDO) (Weseneret al., 2015).
Le brevet US 10,082,506 décrit une méthode de détection de microorganismes basée sur cette capacité de l’intelectine humaine à se lier à ces glycanes, exclusivement exprimés par des microorganismes. Toutefois, il ne s’agit pas d’une méthode de détection spécifique des formes furanoses.
La demande internationale WO 2018/208977 décrit une autre méthode de détection de D-galactofuranose dans un échantillon biologique, basée sur l’utilisation d’un anticorps spécifique du D-galactofuranose, après inhibition de la liaison intelectine / D-galactofuranose.
Toutefois, il est malaisé de produire des anticorps contre des unités osidiques, qui sont par nature très peu immunogènes. L’utilisation d’anticorps pour détecter des sucres n’est donc pas privilégiée.
Par contre, les lectines sont des outils adaptés pour la détection d’unités osidiques.
Toutefois, il n’existe pas, à ce jour, de méthode mettant en œuvre une lectine, permettant de détecter uniquement et manière spécifique la présence d’un hexofuranose dans un échantillon biologique.
Les inventeurs de la présente invention ont généré pour la première fois une néolectine ayant une excellente spécificité pour les hexofuranoses. La présente demande décrit également l’utilisation de cette néolectine pour détecter la présence de microorganisme(s) exprimant lesdits hexofuranoses dans un échantillon.
La présente invention concerne une néolectine reconnaissant spécifiquement un hexofuranoside, consistant en une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside dont l’activité hydrolytique est réduite.
Plus spécifiquement, la présente invention concerne une néolectine reconnaissant spécifiquement un hexofuranoside, consistant en une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside dont le site catalytique a été modifié pour réduire l’activité hydrolytique de ladite enzyme.
Plus particulièrement, ladite néolectine peut consister en la galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp., dont l’activité hydrolytique a été réduite par rapport à son activité naturelle d’origine.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une néolectine telle que décrite ci-dessus, pour détecter la présence de microorganisme(s) dans un échantillon, le(s)dit(s) microorganisme(s) présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside.
La présente invention est également relative à un kit de détection pour identifier la présence de microorganismes présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside, comprenant les éléments suivants :
- au moins une néolectine telle que décrite ci-dessus, ou un acide nucléique codant pour ladite néolectine;
- des réactifs adaptés pour la détection de ladite néolectine.
DESCRIPTION DES FIGURES
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une néolectine reconnaissant spécifiquement un hexofuranoside, consistant en une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside dont l’activité hydrolytique est réduite.
Le terme « lectine » désigne une protéine capable d’interagir spécifiquement avec des sucres ou des glycoprotéines comprenant des unités osidiques. Les lectines interviennent dans divers processus biologiques, notamment au niveau de la reconnaissance entre les cellules, en se liant avec des glycoprotéines membranaires.
Au sens de l’invention, le terme « néolectine » désigne une lectine non naturelle, synthétiséede novoou, plus souvent, obtenue à partir d’une lectine naturelle qui a été modifiée de manière dirigée pour présenter des caractéristiques spécifiques. Cette notion de néolectine est notamment présentée dans l’article (Arnaudet al., 2013).
Au sens de l’invention, les termes « hexofuranose » et « hexofuranoside », utilisés indifféremment dans la présente demande, désignent des unités sucres libres (« ose ») ou glycosylés en position anomérique (« oside ») cyclisées sous la forme « furanose » c’est-à-dire comprenant un cycle constitué de 5 atomes, 4 de carbone et un d’oxygène. Un exemple est notamment le D-galactofuranose (Galf), forme furanose du galactose, dont la formule développée est présentée en formule (I).
Par « enzyme hydrolytique » ou « hydrolase », utilisés indifféremment dans la demande, on entend une enzyme possédant une activité d’hydrolyse de molécules suivant la réaction générale :
R-R' + H2O ⇌ R-OH + R'-H
Plus spécifiquement, l’hydrolase considérée au sens de l’invention est une glycosidase, classifiée dans le groupe EC 3.2.1.x.
Au sens de l’invention, « une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside » désigne une enzyme dont le substrat est un hexofuranoside. Cette hydrolase possède donc un site catalytique, constitué d’une « poche » de fixation dudit hexofuranoside, où a lieu la réaction d’hydrolyse présentée à l’équation 1.
Cette hydrolase est également qualifiée, dans la présente demande, d’« enzyme initiale » ou « enzyme d’origine » ou « hydrolase d’origine » ou encore « enzyme avant modification ».
L’expression « réduire l’activité hydrolytique d’une enzyme » fait référence à une ou plusieurs modifications de la séquence peptidique d’une enzyme, permettant de diminuer voire d’éliminer totalement son activité catalytique.
L’expression « hydrolase dont l’activité hydrolytique est réduite » désigne une hydrolase dont la séquence peptidique a été modifiée pour réduire voire éliminer totalement son activité enzymatique, notamment en modifiant sa séquence primaire.
La réduction de l’activité hydrolytique peut être évaluée de manière chiffrée grâce à la constante catalytique kCatde l’enzyme.
La relation entre une enzyme et son substrat peut être qualifiée selon plusieurs paramètres, et notamment selon deux constantes : la constante catalytique kCatet la constance de Michaelis KM.
La constante catalytique kCatreprésente le nombre maximum de molécules de substrat transformées par unité de temps et par molécule d'enzyme ; cette valeur est exprimée en sec-1ou min-1, c’est-à-dire en nombre de molécules de substrat transformées (dans le cas présent, hydrolysées selon l’équation 1) en une seconde ou une minute.
Selon l’invention, l’expression « réduire l’activité hydrolytique d’une enzyme » signifie diminuer la valeur de kCatde cette enzyme, par exemple réduire sa valeur de kCatd’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de sa valeur initiale, voire d’éliminer totalement l’activité soit une diminution de 100% de la valeur initiale de kCat. Une réduction d’au moins 50% de la valeur initiale de kCatsignifie que la valeur de kCatde l’hydrolase avant toute modification a été divisée par deux. Comme cela est présenté dans les exemples, des hydrolases modifiées ont été obtenues avec des valeurs de kCatdivisées par 80 fois ou même par 2000 fois par rapport à la valeur initiale de l’enzyme d’origine.
Selon l’invention, une hydrolase dont l’activité hydrolytique est réduite est notamment une hydrolase dont la valeur de kCatest égale ou inférieure à 10% de la valeur de kCatde l’hydrolase d’origine, les deux valeurs étant mesurées dans des conditions équivalentes (de pH, température, milieu réactionnel, durée d’incubation, …), bien connues de l’Homme du métier.
En particulier, une hydrolase dont l’activité hydrolytique est réduite présente une valeur de kCatégale ou inférieure à 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de la valeur de kcatde l’hydrolase d’origine, mesurées dans des conditions équivalentes.
Cette réduction ou élimination de l’activité hydrolytique d’une enzyme est réalisée sans modifier de manière significative la valeur de la constante de Michaelis de l’enzyme considérée.
La constante de Michaelis, désignée par l’abréviation KM, est une valeur exprimée en mole/litre, qui correspond à la valeur de la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction enzymatique est égale à la moitié de la vitesse maximale Vmax ; cette constante est reliée à la constante de dissociation (Kd) de l'enzyme pour son substrat, valeur qui représente la force de l’interaction entre les deux, mais n'est en général pas strictement égale à celle-ci. En effet, la constante KMdépend également de la valeur de kCat, selon l’équation suivante :
KM= (kCat+ k-1)/k1
où k1représente la vitesse de formation du complexe enzyme-substrat et k-1la vitesse de la réaction inverse de dissociation de l’enzyme et du substrat.
Plus le KMest élevé, plus la concentration de substrat nécessaire à une activité importante de l'enzyme est élevée. Cela traduit une faible affinité de l'enzyme pour son substrat.
Plus le KMest faible, plus l'activité enzymatique maximale est atteinte pour un faible niveau de concentration de substrat. L'affinité de l'enzyme pour le substrat est forte. C’est souvent le cas d'enzymes sélectives et/ou très actives.
Dans le cas présent d’une hydrolase ayant une activité catalytique représentée par la valeur kCatréduite, voire très réduite, la valeur du KMest impactée par cette valeur de kCattrès faible, mais sans que cela n’ait d’incidence sur la réelle affinité de l’enzyme modifiée pour son substrat.
De préférence, la valeur de KMde la néolectine sera du même ordre de grandeur que la valeur KMinitiale de l’enzyme avant modification, les deux valeurs de KMétant mesurées dans des conditions équivalentes (pH, température, milieu réactionnel, durée d’incubation…) qui pourront être choisies par l’Homme du métier sur la base de ses connaissances générales.
La valeur de KMde la néolectine sera de préférence égale à environ 50%, 60%,70%, 80%, 90% ou 95% de la valeur KMde l’hydrolase d’origine.
D-galactofuranose et hydrolase spécifique
Les hexoses, monosaccharides comportant 6 carbones, ont tous la même formule brute C6H12O6. Ils possèdent tous un groupement carbonyle :
- soit une fonction aldéhyde en position 1 (aldohexoses) ;
- soit une fonction cétone en position 2 (principalement), 3, 4 ou 5 (cétohexoses ou dihydroxycétone).
On peut citer comme exemple d’hexose : le glucose, le galactose, le fucose et le mannose, naturellement présents dans la nature.
Parmi ces hexoses, peu d’entre eux ont été identifiés comme adoptant une structure de type furanose ; ainsi, parmi les hexofuranoses, le D-galactofuranose est le composé majoritaire.
Selon une mise en œuvre préférée, la présente invention concerne une néolectine reconnaissant spécifiquement le D-galactofuranose (Galf).
Récemment, une galactofuranosidase a été identifiée dans l’espèce JHA 19Streptomyces sp.(Matsunagaet al.,2015). Après purification de cette enzyme, il a été mis en évidence qu’elle hydrolyse de manière exclusive le substrat D-galactofuranose (Senicaret al., 2019). Cet article rapporte l’utilisation de 21 monosaccharides différents testés comme substrat de l’enzyme ; les résultats obtenus démontrent que seul le D-galactofuranose est hydrolysé, même les analogues du Galftels que Araf(arabinofuranose) ou Ribf(ribofuranose) ne sont pas hydrolysés par cette enzyme.
Par ailleurs, les caractéristiques cinétiques de cette enzyme ont été déterminées :
- la constance de Michaelis KMavec le substrat Galfest égale à 250 µM ;
- la constance catalytique kCatest de 213 min-1.
Selon une mise en œuvre particulière, la néolectine de l’invention consiste en la galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp., dont l’activité catalytique a été réduite, et plus spécifiquement dont le site catalytique a été modifié.
La séquence de cette galactofuranosidase, avant modification du site catalytique, est présentée en SEQ ID NO. 1.
Selon une autre mise en œuvre particulière, la néolectine de l’invention consiste en une galactofuranosidase ayant une séquence peptidique présentant au moins 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO. 1.
Modifications du site catalytique de l’hydrolase
Tous les moyens connus de l’Homme du métier pour réduire l’activité hydrolytique d’une hydrolase pourront être mis en œuvre pour obtenir la néolectine selon la présente invention.
Par exemple, l’activité hydrolytique d’une hydrolase peut être réduite par des actions de mutagenèse dirigée ou aléatoire, ou encore par des techniques d’évolution dirigée.
Dans le cas où la réduction de l’activité hydrolytique de l’hydrolase est réalisée par mutagenèse dirigée, les mutations ponctuelles introduites pourront concerner toutes les portions de la protéine. En particulier, des mutations pourront être introduites à la périphérie du site catalytique, ou même dans des portions éloignées du site catalytique, lesdites mutations permettant de réduire l’activité du site catalytique de par les modifications structurelles induites.
Selon une mise en œuvre particulière, l’activité hydrolytique de l’hydrolase spécifique d’origine est réduite par une modification du site catalytique de ladite hydrolase, i.e. d’au moins un résidu dudit site catalytique.
Le site catalytique, aussi dénommé site actif, fait référence à une structure tridimensionnelle au sein de l’enzyme, qui a la forme d'une cavité aussi dite « poche ». Les molécules sur lesquelles agit l’enzyme se fixent dans le site actif de l'enzyme en formant des interactions avec la surface de la cavité du site actif. Certaines acides aminés formant la cavité du site actif peuvent participer à la réaction d’hydrolyse : on dénomme ces acides aminés des résidus catalytiques.
L’Homme du métier connait de multiples moyens de modifier le site catalytique d’une enzyme dont la séquence peptidique et l’activité enzymatique sont connues.
En ce qui concerne les glycosidases, les mécanismes réactionnels prenant place dans le site catalytique ont été décrits (Atiet al., 2017). Il a notamment été montré que la réaction d’hydrolyse implique des résidus d’acide glutamique (E) ou d’acide aspartique (D), dont les chaines latérales sont chargées négativement.
Dans le cadre de la présente invention, la néolectine est obtenue à partir d’une hydrolase dont le site catalytique a été modifié de manière à en réduire l’activité catalytique, et donc la valeur kCat, tout en maintenant une affinité significative pour le substrat, c’est-à-dire une valeur de KMdu même ordre de grandeur que la valeur de KMde l’hydrolase d’origine, toutes ces constantes étant mesurées indépendamment mais dans des conditions expérimentales équivalentes voire similaires pour pouvoir être comparées.
Selon une mise en œuvre de l’invention, au moins un résidu du site catalytique de l’hydrolase a été remplacé par un autre résidu. « Au moins un résidu » signifie qu’un, deux, trois voire quatre résidus ou plus du site catalytique peuvent être remplacés.
En particulier, un résidu d’acide glutamique (E) et/ou un résidu d’acide aspartique (D), situé dans le site catalytique de l’enzyme, est remplacé par un autre résidu dont la chaine latérale n’est pas chargée négativement.
Ce résidu E ou D pourra notamment être remplacé :
- par un résidu dont la chaine latérale peut être chargée suivant le pH local : sérine (S), thréonine (T), asparagine (N), glutamine (Q) ; ou bien
- par un résidu choisi parmi l’alanine (A), la glycine (G), la proline (P) ou la cystéine (C).
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, le site catalytique de l’hydrolase est modifié par le remplacement d’au moins un résidu d’acide glutamique (E). Plus précisément, ce résidu d’acide glutamique pourra être remplacé par une sérine, une cystéine ou une glutamine, de manière préférée par une cystéine ou une glutamine. Dans le cas de la galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp., ce résidu d’acide glutamique pourra notamment être celui situé en position 464, et/ou en position 573. En particulier, le résidu E464 sera remplacé par une sérine, une cystéine ou une glutamine.
Selon une autre mise en œuvre de l’invention, le site catalytique de l’hydrolase est modifié par le remplacement d’au moins un résidu d’acide aspartique (D). Plus précisément, ce résidu d’acide aspartique pourra être remplacé par une sérine, une cystéine ou une glutamine, de manière préférée par une cystéine ou une glutamine.
Comme cela est présenté dans l’exemple 1, les remplacements du résidu suivant de la galactofuranosidase issue de JHA 19Streptomyces sp. ont été testés :
- E464S soit le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une sérine ;
- E464C soit le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une cystéine ;
- E464Q le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une glutamine.
Les caractéristiques cinétiques (constante de Michaelis KMet constante catalytique kCat) de chaque hydrolase modifiée ont été déterminées et sont présentées dans le tableau 1 suivant :
| Enzyme | SEQ ID NO. | KM(mM) | kCat(min-1) |
| Galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp« E464 » | 1 | 0.25 | 213 |
| E464S | 2 | 0.036 | >0.01 |
| E464C | 3 | 0.17 | 0.1 |
| E464Q | 4 | 0.166 | 2.5 |
Parmi ces enzymes mutées, dans le but d’obtenir une néolectine reconnaissant spécifiquement le D-galactofuranose mais possédant une activité d’hydrolyse réduite, le choix se porte sur les protéines présentant à la fois un KM(constante liée à l’affinité pour le substrat) du même ordre de grandeur que celui de l’enzyme d’origine, et une kCatréduite à moins de 10% de la valeur de kCatde l’hydrolase d’origine.
Dans le cas présent, les galactofuranosidases présentant les mutations ponctuelles E464S, E464C et E464Q présentent ces caractéristiques de kCatet de KM.
Ainsi, selon une mise en œuvre particulière de l’invention, la néolectine est une protéine présentant une séquence peptidique choisie parmi les suivantes : SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, et SEQ ID No. 4. Plus spécifiquement, la néolectine selon l’invention est une protéine présentant la séquence peptidique SEQ ID No. 4.
D’autres modifications du site catalytique d’une hydrolase peuvent être envisagés et sont inclus dans la présente invention, comme par exemple la suppression totale (sans remplacement) d’un résidu du site catalytique, notamment d’un résidu d’acide glutamique ou d’acide aspartique.
Ces modifications seront réalisées par génie génétique, en modifiant l’acide nucléique codant pour la séquence peptidique de l’enzyme en question.
Avantageusement, la néolectine selon l’invention conserve les propriétés d’origine de l’hydrolase dont elle est issue. Par exemple, l’hydrolase issue deJHA 19 Streptomyces sp., un microorganisme thermophile, est originellement thermostable. Avantageusement, la néolectine dérivée de cette hydrolase est particulièrement thermostable, comme cela est présenté dans la partie expérimentale de la demande.
Néolectine multimérique et/ou multifonctionnelle
La présente invention concerne également une néolectine couplée à au moins une protéine présentant une autre fonction, par exemple à une enzyme ou à une protéine cytotoxique. Une telle construction protéique est désignée « néolectine multifonctionnelle ». Cette néolectine multifonctionnelle comprend au moins deux monomères liés de manière covalente ou non-covalente, dont l’un est la néolectine selon l’invention.
La présente invention concerne également une néolectine multimérique constituée d’au moins deux néolectines, dont au moins une néolectine selon l’invention.
Par « néolectine multimérique », on entend au sens de l’invention une néolectine composée d’au moins deux monomères, liés de manière covalente ou non-covalente.
De telles néolectines multimériques ont par exemple été décrites dans la demande internationale WO 2015/132699.
Chaque monomère est constitué d’une chaine peptidique comprenant un site reconnaissant de manière spécifique une unité osidique particulière.
Parmi les protéines monomériques, on distingue les dimères (qui sont constitués de deux sous-unités), les trimères (trois sous-unités), les tétramères (quatre sous-unités), etc.
Selon une mise en œuvre, une néolectine multimérique selon l’invention comprend au moins deux, trois ou quatre monomères, tous constitués d’une néolectine selon l’invention, et donc contient au moins deux, trois ou quatre sites actifs identiques.
Selon une autre mise en œuvre, une néolectine multimérique selon l’invention comprend un seul monomère constitué d’une néolectine selon l’invention, couplé à un ou plusieurs autres monomères consistant en d’autres lectines, ayant chacun un site de reconnaissance ayant une spécificité différente et donc reconnaissant d’autres unités osidiques que le D-galactofuranose.
Par exemple, la néolectine multimérique comprendra un monomère spécifique d’une entité furanose, et un autre monomère spécifique d’une entité pyranose. En modulant ainsi la spécificité d’une néolectine multimérique, il sera possible de créer des néolectines capables de reconnaitre avec une grande spécificité un microorganisme particulier, ayant une signature originale d’entités osidiques exprimées en surface.
Néolectine marquée
Selon une mise en œuvre particulière, la néolectine selon l’invention peut être couplée à un marqueur et/ou à une étiquette moléculaire.
Ce couplage pourra être covalent ou non covalent, et sera de préférence un couplage covalent. Ce couplage sera réalisé par génie génétique, en associant les acides nucléiques codant d’une part la néolectine selon l’invention, et d’autre part le marqueur ou/et l’étiquette moléculaire.
Le marqueur peut être une biotine (reconnue par la streptavidine), ou un marqueur coloré ou fluorescent, comme par exemple une protéine fluorescente (GFP, RFP, CFP, YFP).
Une étiquette moléculaire pourra notamment être choisie parmi les « tags » bien connus de l’Homme du métier, ajoutés par modification génétique : étiquettes poly-histidine (5 ou 6 histidines), étiquette FLAG (DYKDDDK), étiquette HA (YPYDVPDYA), glutatione-S-tranférase, Calmodulin Binding Peptide (étiquette de 26 acides aminés), etc.
La néolectine selon l’invention est couplée soit à un marqueur, soit à une étiquette moléculaire, soit à un marqueur et une étiquette moléculaire.
Utilisation des néolectines selon l’invention
La présente invention concerne également l’utilisation d’une néolectine telle que décrite ci-dessus, pour détecter la présence de microorganisme(s) dans un échantillon, le(s)dit(s) microorganisme(s) présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside.
Autrement dit, la présente invention concerne un procédé de détection de la présence de microorganisme(s) dans un échantillon, le(s)dit(s) microorganisme(s) présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside, comprenant une étape de mise en contact de la néolectine telle que décrite ci-dessus avec l’échantillon, et une étape de détection des interactions de cette néolectine avec des unités osidiques présentes dans l’échantillon.
Par « microorganisme », on entend au sens de l’invention tout être vivant microscopique, c’est à dire invisible à l’oeil nu. Ce terme désigne notamment les bactéries, les virus, les parasites et les champignons microscopiques.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l’utilisation d’une néolectine telle que décrite ci-dessus, pour détecter la présence de microorganisme(s) choisis parmi des bactéries et des parasites microscopiques et/ou unicellulaires.
Les unités osidiques détectées à la surface desdits microorganismes sont en général intégrées à des glycoconjugués (glycoprotéines, glycolipides, protéo- et glycosaminoglycannes) ou oligo-/polysaccharides, présents à la surface de certains microorganismes présents dans l’échantillon.
Dans le cadre de cette utilisation, la néolectine sera de préférence couplée à un marqueur et/ou à une étiquette moléculaire.
En particulier, cette utilisation est particulièrement adaptée pour détecter les microorganismes appartenant à l’une des espèces suivantes :Leishmania, Mycobacterium, Trypanosoma cruzi, Aspergillus, Renibacterium salmoninarum, Actinobacillus, Pleuropneumoniae, Yersinia pestis, Lachnoanaerobaculum saburreumetCryphonectria parasitica.
Cette utilisation pourra être réalisée sur toute type d’échantillons, notamment d’échantillons biologiques.
Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, l’échantillon analysé sera choisi parmi la liste suivante :
- un fluide biologique (sang, lymphe, larmes, sécrétions respiratoires, urine, liquide céphalo-rachidien) ou un échantillon de tissu issu d’un organisme vivant, humain ou animal (obtenu par biopsie),
- un échantillon prélevé dans des produits de consommation tels que produits alimentaires ou d’hygiène,
- un échantillon prélevé dans des produits techniques tels que réactifs de laboratoire et réactifs industriels,
- un échantillon prélevé dans des eaux stagnantes (marais, étangs) ou des eaux circulantes, par exemple eaux de rivière, eaux marines, et eaux circulant dans des canalisations, et
- un échantillon prélevé sur tout type de surface (sol, plans de travail, parois de réacteurs).
Selon une mise en œuvre particulière, l’échantillon analysé est issu d’un organisme humain, et l’utilisation de la néolectine permet de détecter la présence de microorganismes pathogènes dans cet échantillon. La néolectine selon l’invention est ainsi utilisée dans une méthode de diagnostic d’infections microbiennes.
Kit de détection
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un kit de détection pour identifier la présence de microorganismes présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside, comprenant les éléments suivants :
- au moins une néolectine selon l’invention, de préférence une néolectine couplée à un marqueur et/ou à une étiquette moléculaire, ou un acide nucléique codant pour ladite néolectine ;
- des réactifs adaptés pour la détection de ladite néolectine.
Ce kit pourra également comprendre une notice explicative, et/ou du matériel, adapté(e) pour réaliser le procédé de détection de microorganismes décrit ci-dessus.
De préférence, la néolectine sera couplée à un marqueur coloré ou fluorescent, et le kit comprendra les réactifs adaptés pour la détection de ce marqueur coloré ou fluorescent.
Selon une mise en œuvre particulière, le kit comprend un vecteur d’expression, constitué d’acide nucléique, codant pour une néolectine selon l’invention ; ce vecteur d’expression sera introduit dans des cellules hôtes, notamment des cellules bactériennes, pour permettre l’expression de la néolectine. Avantageusement, le kit comprend alors des réactifs permettant l’introduction du vecteur d’expression dans des cellules hôtes.
EXEMPLES
Exemple 1. Génération d’une néolectine à partir d’une hydrolase
Nous avons donc utilisé cette excellente activité enzymatique et muté cette enzyme pour supprimer son activité hydrolytique et ne conserver que ses propriétés de reconnaissance pour en faire une lectine synthétique spécifique du D-galactofuranose appellée néolectine.
Les néolectines suivantes ont été caractérisées :
- E464S soit le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une sérine ;
- E464C soit le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une cystéine ;
- E464Q soit le remplacement de l’acide glutamique en position 464 avec une glutamine.
Les caractéristiques cinétiques (constante de Michaelis KMet constante catalytique kCat) ont été déterminées et sont présentées en et dans le tableau 2 suivant :
| Enzyme | SEQ ID NO. | KM(mM) | kCat(min-1) |
| Galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp« E464 » | 1 | 0.25 | 213 |
| E464S | 2 | 0.036 | >0.01 |
| E464C | 3 | 0.17 | 0.1 |
| E464Q | 4 | 0.166 | 2.5 |
La séquence de la galactofuranosidase WT (sauvage) issue de JHA 19 Streptomyces sp., d’une longueur de 786 acides aminés, est la suivante (SEQ ID NO.1) ; le résidu E464 est souligné :
MRRVPAGRQRFAWLRRRARWATTALAVFALAAGTALTATGSATAAPRAWTPKPSPMTTPWTDQVPVDNPLPEYPRPQLTRPDWANLNGIWDFAVTSANAGQPATFPEQIRVPFVAESALSGIQRKITQNDKLWYKRTFTVPSNWNGRRVQLNFGASDWRTTVWVNGRQAGAVHSGGYDAFSYDVTDLLTAGTNTLVVSVWDPTETGTQAVGKQRIRDVAPHPGGGILYTAASGIWQTVWLEPTAAAHVTRLDLVPDPANSRLKVTVRGAGISGHQARVTVSTGGTTVGTATGPVGTEFTVPVPNPRLWTPEDPFLYDVRADPLSGGTTVDSVGSYTGMRTIALASVGGHQRPVLNGKFVFQTGTLDQGYWPDGIYTAPTDAALRHDLQKHKDLGFNMVRKHIKVEPQRWFYWADRLGLLVWQDMPNMERTPDAAARTQWEAEYDRIIDQHRSSPSLVLWVNQN E GWGQYDQARLADKVKAYDPTRLVDNMSGVNCCGAVDGGNGDVVDHHVYVGPGTTVPSATRAAVLGEFGGLGFKVAGHEWYPGGGFSYEDQPDLAHLNNRFVGLIDAIREVRMPRGLSASVYTEITDVENEVNGLLTYDRQVVKVDEARVRAANRALIDASRGTTAPLTLPVDQYRSLRVTTPGYTDRFMRHKDGAAFTEVVNAGSDSLLKNDATWRIVPGLANGTCYSFESRNYPGQYLRHREYRVYKEAGSGDLYRADATFCPVRGADGGVRLSAYNFPEQYLRHYDAELWLATPGGTHTWDNAALFTQDTTWAVEAPWAP
Dans les exemples de la présente demande, la séquence peptidique utilisée comprend un tag histidine et présente donc la séquence peptidique SEQ ID NO. 5, d’une longueur de 822 acides aminés, présentée ci-dessous, les caractères soulignés étant les résidus du tag histidine ainsi que le résidu E464 :
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSNSMRRVPAGRQRFAWLRRRARWATTALAVFALAAGTALTATGSATAAPRAWTPKPSPMTTPWTDQVPVDNPLPEYPRPQLTRPDWANLNGIWDFAVTSANAGQPATFPEQIRVPFVAESALSGIQRKITQNDKLWYKRTFTVPSNWNGRRVQLNFGASDWRTTVWVNGRQAGAVHSGGYDAFSYDVTDLLTAGTNTLVVSVWDPTETGTQAVGKQRIRDVAPHPGGGILYTAASGIWQTVWLEPTAAAHVTRLDLVPDPANSRLKVTVRGAGISGHQARVTVSTGGTTVGTATGPVGTEFTVPVPNPRLWTPEDPFLYDVRADPLSGGTTVDSVGSYTGMRTIALASVGGHQRPVLNGKFVFQTGTLDQGYWPDGIYTAPTDAALRHDLQKHKDLGFNMVRKHIKVEPQRWFYWADRLGLLVWQDMPNMERTPDAAARTQWEAEYDRIIDQHRSSPSLVLWVNQN E GWGQYDQARLADKVKAYDPTRLVDNMSGVNCCGAVDGGNGDVVDHHVYVGPGTTVPSATRAAVLGEFGGLGFKVAGHEWYPGGGFSYEDQPDLAHLNNRFVGLIDAIREVRMPRGLSASVYTEITDVENEVNGLLTYDRQVVKVDEARVRAANRALIDASRGTTAPLTLPVDQYRSLRVTTPGYTDRFMRHKDGAAFTEVVNAGSDSLLKNDATWRIVPGLANGTCYSFESRNYPGQYLRHREYRVYKEAGSGDLYRADATFCPVRGADGGVRLSAYNFPEQYLRHYDAELWLATPGGTHTWDNAALFTQDTTWAVEAPWAP
Les exemples suivants utilisent la néolectine « E464Q » qui présente une constante kcatd’environ 1% de la valeur kCatde l’hydrolase d’origine.
L’activité hydrolytique de cette néolectine E464Q (SEQ ID No. 4) a été mesurée en fonction du pH et est présentée en bas à droite de la . Le taux de 100% est représentatif de la meilleure activité obtenue.
Exemple 2. Caractéristiques de liaison de cette néolectine à Gal
f
, en comparaison avec celles des lectines DC-SIGN et intelectine-1.
Une sonde fluorescente présentant de multiples entités D-galactofuranose a été utilisée pour ces études, elle est dénommée BSA-Galf.
DC-SIGN n’est pas capable de reconnaitre l’entité D-galactofuranose (portée par cette sonde), contrairement à ce qui a été publié ( ). En effet, DC-SIGN n’est pas capable de déplacer la sonde : il n’y a donc pas d’intensité de fluorescence mesurée.
La seconde lectine ayant été rapportée dans la littérature comme interagissant avec le D-galactofuranose est l’Intelectine-1 (ou Omentine ou Intelectin). Les résultats obtenus sont présentés en , et montrent que l’interaction de la lectine avec la sonde BSA-Galf est bien détectée et est spécifique de ce sucre (pas d’interaction avec les sondes BSA-Fuc et BSA-αGal).
Les résultats présentés en montrent que la néolectine selon l’invention interagit avec la sonde BSA-Galf ( ).
Sur la base de ces résultats, l’IC50 pour la sonde Galf (qui représente la quantité nécessaire d’inhibiteur pour obtenir 50% d’inhibition de la liaison enzyme/substrat, qui est donc une autre constante en lien avec l’affinité) des néolectines testées a été déterminé :
- 16 nM pour l’intelectine-1 ;
- 24 nM pour la néolectine selon l’invention, soit un IC50 du même ordre de grandeur que celui déterminé dans des conditions similaires pour l’intelectine-1.
Exemple 3. Spécificité de la liaison au D-D-galactofuranose de la néolectine selon l’invention
Des tests d’inhibition ont été réalisés également sur la néolectine avec les oses suivants : PNP-βGalf, PNPβDGalp, PNPαLAraf, GalfN3, GalfTolyl (inhibiteur Galf), dont les structures chimiques sont présentées en .
Le protocole expérimental pour la réalisation des tests d’inhibition sur la néolectine a été décrit dans l’article (Landemarre et al., 2013). La néolectine est tout d’abord immobilisée au fond d’une plaque 96 puits. Les profils d'interaction de chaque composé ont été déterminés par une méthode indirecte basée sur l'inhibition par le composé de l'interaction entre la néolectine et la néoglycoprotéine NeoGalf spécifique de cette dernière. En bref, un mélange de néoglycoprotéines (concentration fixe) et des composés correspondants (gamme de concentrations) préparés dans du PBS supplémenté avec CaCl2 (1 mM) et MgCl2 (0,5 mM) est déposé dans chaque puits (50 µL chacun) en triple et incubé deux heures à température ambiante. Après lavage avec du tampon PBS, le conjugué streptavidine-DTAF est ajouté (50 µL) et incubé 30 min. La plaque est ensuite lavée de nouveau avec du PBS. Enfin, 100 µL de PBS ont été ajoutés pour la lecture de la plaque fluorescente réalisée avec un lecteur de fluorescence (λex = 485 nm, λem = 530 nm, Fluostar OPTIMA, BMG LABTECH, France). L'intensité du signal est inversement corrélée à la capacité du composé à être reconnu par la lectine et exprimée en pourcentage d'inhibition par comparaison avec le traceur correspondant seul (Néoglycoprotéine).
La montre les résultats obtenus. Aucune inhibition n’a lieu dans le cas des oses suivants : PNPβDGalp, PNPαLAraf, ce qui démontre la spécificité de la néolectine de l’invention pour le D-galactofuranose. La néolectine de l’invention ne reconnait ni le D-galactopyranose, ni l’arabinose, qui sont les 2 sucres structurellement les plus proches. Seuls sont reconnus le GalfN3 et le Galf-Tolyle.
Exemple 4. Utilisation de la néolectine selon l’invention pour détecter des microorganismes dans un échantillon biologique
Un premier test concluant et encourageant a été réalisé avecAspergillus niger, en démontrant l’interaction directe entre la néolectine et le microorganisme ( ) ou bien en inhibant cette interaction par la BSA-Galf ( ).
La néolectine est tout d’abord immobilisée au fond d’une plaque 96 puits. Une culture bactérienned’Aspergillus nigerest réalisée en suivant les exigences propres à ce type microbien. Après centrifugation, et numération, le culot microbien est repris dans du PBS et marqué à l’aide de carboxyfluorescéine diacétate succinimidylester (CFDA-SE, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pendant 1h à 37°C. Puis la suspension bactérienne est centrifugée et lavée à deux reprises à l’aide de tampon PBS. Les bactéries marquées sont ajoutées dans chaque puits de la microplaque immobilisée avec la néolectine et incubées 2 h à 37 °C sous agitation douce. Après lavage avec du PBS, l'intensité de fluorescence est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (λex = 485 nm, λem = 530 nm, Fluostar OPTIMA, BMG LABTECH, France). En parallèle, une courbe d'étalonnage est réalisée avec la solution de bactéries marquées pour déterminer le nombre de bactéries restées en interaction avec la néolectine.
Exemple 5. Autres caractéristiques des néolectines selon l’invention
Les neolectines présentent une thermostabilité jusqu’à 60-70 °C, ce qui constitue un avantage pour l’étude de fluides biologiques complexes.
On notera qu’en particulier, les lectines endogènes de type intelectin-1 ne sont pas thermostables.
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Claims (11)
- Néolectine reconnaissant spécifiquement un hexofuranoside, consistant en une hydrolase spécifique dudit hexofuranoside dont l’activité hydrolytique est réduite.
- Néolectine selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’activité hydrolytique de l’hydrolase spécifique est réduite par une modification du site catalytique de ladite hydrolase.
- Néolectine selon la revendication 2, caractérisée en ce que au moins un résidu du site catalytique de l’hydrolase spécifique a été remplacé par un autre résidu.
- Néolectine selon l’une des revendications 1 à 3, reconnaissant spécifiquement le D-galactofuranose.
- Néolectine selon la revendication 3, consistant en la galactofuranosidase issue deJHA 19 Streptomyces sp., dont l’activité hydrolytique a été réduite.
- Néolectine multimérique constituée d’au moins deux néolectines, dont au moins une néolectine selon l’une des revendications 1 à 5.
- Néolectine selon l’une des revendications 1 à 6, couplée à un marqueur et/ou à une étiquette moléculaire.
- Utilisation d’une néolectine selon l’une des revendications 1 à 7, pour détecter la présence de microorganisme(s) dans un échantillon, le(s)dit(s) microorganisme(s) présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside.
- Utilisation selon la revendication 8, lesdits microorganismes détectés appartenant à l’une des espèces suivantes :Leishmania, Mycobacterium, Trypanosoma cruzi, Aspergillus, Renibacterium salmoninarum, Actinobacillus, Pleuropneumoniae, Yersinia pestis, Lachnoanaerobaculum saburreumetCryphonectria parasitica.
- Utilisation selon l’une des revendications 8 ou 9, dans laquelle l’échantillon est choisi parmi :
- un fluide biologique (sang, lymphe, larmes, sécrétions respiratoires, urine, liquide céphalo-rachidien) ou un échantillon de tissu issu d’un organisme vivant, humain ou animal,
- un échantillon prélevé dans des produits de consommation tels que produits alimentaires ou d’hygiène,
- un échantillon prélevé dans des produits techniques tels que réactifs de laboratoire et réactifs industriels,
- un échantillon prélevé dans des eaux stagnantes (marais, étangs) ou des eaux circulantes, par exemple eaux de rivière, eaux marines, et eaux circulant dans des canalisations, et
- un échantillon prélevé sur tout type de surface (sol, plans de travail, parois de réacteurs). - Kit de détection pour identifier la présence de microorganismes présentant à leur surface au moins une unité osidique de type hexofuranoside, comprenant les éléments suivants :
- au moins une néolectine selon l’une des revendications 1 à 7, de préférence selon la revendication 7, ou un acide nucléique codant pour ladite néolectine; et
- des réactifs adaptés pour la détection de ladite néolectine.
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| WO2022096829A1 (fr) | 2022-05-12 |
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