EP3836902A1 - Verfahren zur verkapselung von wirkstoffen in liposomen - Google Patents

Verfahren zur verkapselung von wirkstoffen in liposomen

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EP3836902A1
EP3836902A1 EP19725027.7A EP19725027A EP3836902A1 EP 3836902 A1 EP3836902 A1 EP 3836902A1 EP 19725027 A EP19725027 A EP 19725027A EP 3836902 A1 EP3836902 A1 EP 3836902A1
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EP
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liquid
emulsion
amphiphilic compound
phase
active ingredient
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EP19725027.7A
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English (en)
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Inventor
Gero. LENEWEIT
Bárbara. SANTOS DE MIRANDA
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Abnoba GmbH
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Abnoba GmbH
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Publication date
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    • B01F23/4145—Emulsions of oils, e.g. fuel, and water

Definitions

  • the invention relates to a method for encapsulating active ingredients in liposomes, comprising
  • bi-layer consisting of two at least monomolecular layers of at least one first amphiphilic compound, in particular from the group of lipids, the active ingredient solution being encapsulated by the bi-layer, comprising the following steps:
  • step (b) providing a first emulsion by emulsifying the active ingredient solution according to step (a) in at least one, in particular hydrophobic, first liquid which is immiscible or poorly miscible with the at least one solvent of the active ingredient solution in the presence of the at least one first amphiphilic compound, by at least one add monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound to the drops of the active substance solution emulsified in the first liquid;
  • step (c) providing a, in particular hydrophilic, liquid phase which is immiscible or difficult to mix with the first liquid of the first emulsion in step (b);
  • step (e) centrifuging the first emulsion which is in contact with one another via the phase boundary in accordance with step (b) and the liquid phase in accordance with step (c) in order to drop the drops of the active ingredient solution contained in the first emulsion with the at least monomolecular inner layer attached to it to transfer at least one first amphiphilic compound from the first liquid of the first emulsion according to step (b) into the liquid phase according to step (c), the enriched at least one first amphiphilic compound passing through the phase boundary to form an at least monomolecular compound , outer layer of the same is attached to the at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound of the drops of the active substance solution in order to generate the bi-layer from the two at least monomolecular layers of the at least one first amphiphilic compound - and consequently the finished liposomes.
  • Liposomes which are also referred to as vesicles, are understood to mean membrane vesicles which can generally be present in a colloidal suspension in a hydrophilic, in particular aqueous, medium and which include a liquid phase, the liquid phase usually, though also not necessarily a hydrophilic, mostly aqueous phase.
  • the membrane shell which includes the liquid phase, is made of a double or bi-layer of two at least monomolecular layers either formed from one and the same or also from different NEN molecules, each of which has both an unpolar, ie hydrophobic or lipophilic, part and a polar, ie hydrophilic or lipophobic, part and are referred to as amphiphilic due to these properties.
  • amphiphilic compounds used as membrane-forming molecules are mostly lipids, such as phospholipids, sphingolipids, glycolipids, fatty acids or the like, although other amphiphilic compounds can also be used as membrane components, such as lipopolysaccharides, Tocopherols, squalenes, sterols or sterols, cholesterols etc.
  • the amphiphilic compounds are arranged according to their hydrophilic / hydrophobic properties, so that the hydrophobic parts of the amphiphilic compounds are directed towards each other in order to minimize them Have contact with the encapsulated, eg hydrophilic or aqueous phase, whereas the hydrophilic parts of the amphiphilic compounds are directed towards the eg hydrophilic or aqueous phase inside and outside the liposome.
  • the amphiphilic compounds that form the bilayer (s) of the membrane of lip osomes therefore hold together only through non-covalent binding forces, which is why the membrane has a primarily fluid character.
  • liposomes in the context of the present
  • colloid-chemical aggregates in the form of nanocapsules made from any amphiphilic substances, polymer merliposomes, lipid nanoparticles and mixtures of such aggregate formations with pure liposomes Therefore, such colloidal chemical aggregates are always included in the context of the present disclosure, even if only the term “liposome” is used.
  • liposomes largely depend on the chemical structure of the amphiphilic compound (s) forming the bilayer (s) of their membrane and on the physicochemical properties of the usually hydrophilic or aqueous phase to be encapsulated, e.g. their ionic strength, pH, osmolality and the like, and the respective manufacturing process.
  • Liposomes can on the one hand have only a single bishop layer, such liposomes being referred to as unilamellar ("unilamellar vesicles", ULV), or they can have a plurality of bishops arranged concentrically, such liposomes being multilamellar (" multilamel lare vesicles ", MLV).
  • the mean diameter is usually between about 20 nm and about 100 pm, in particular between about 25 nm and about 30 pm.
  • the amphiphilic compounds forming the bilayer (s) of the membrane of liposomes can, depending on the desired pharmacodynamic activity profile, pharmacokinetic behavior, chemical and physical properties such as size, size distribution, lamellarity, fluidity, permeability, zeta potential, Phase transition temperature of the membrane, etc., can be formed from the same or from different molecules, for example from the group of lipids, the bishicht on the one hand from the same amphiphilic compound or from the same mixture Schurgi of several amphiphilic compounds can be constructed, or the individual, at least monomolecular layers of the bishicht can each be constructed from different amphiphilic compounds or from mixtures of different amphiphilic compounds.
  • liposomes can also be used, for example, to investigate the biophysical properties of biomembranes, they are primarily used in the cosmetic and in particular in the medical field. It is in particular possible here to protect sensitive active substances from possible metabolism after the application by the liposomal formulation of active substances, such as medicaments and the like, and to bring them specifically to the cells of the organism where the active substance is supposed to develop their effect, so that any side effects of the liposomally formulated active ingredient can be reduced and the effectiveness increased in order to be able to administer lower doses of the active ingredient.
  • the encapsulation of active substances in liposomes can increase the plasma half-life.
  • the active ingredient in the liposome is usually in the form of a mostly hydrophilic, in particular aqueous or, for example also alcoholic, active ingredient solution.
  • Mainly hydrophilic active substances can be more or less completely encapsulated in the liposomes, while mainly lipophilic substances are more likely to be incorporated into the epitaph of the amphiphilic compound (s).
  • liposomes play an important role in modern pharmacy, cosmetics and food technology as transport vehicles for pharmaceutical or other active ingredients, to improve skin moisture or active ingredient intake or for high-quality food additives. Further areas of application of liposomes, which are mentioned only by way of example, include targeted drug delivery
  • Liposomes synthetic chemistry in general, nano-scale reaction chambers and general technological developments in the fields of energy, optics, electronics, microfluidics, colloid chemistry, biosensors or related areas in which liposomes can be used.
  • Liposomes can also be coated with a polymer layer, for example based on polyethylene glycol (PEG), and / or at least the amphiphilic connection of the outer layer of the bilayer (s) forming the membrane can be modified with such a polymer Case of "PEGylated liposomes" speaks.
  • the polymer layer serves for steric protection of the membrane and it protects and reduces marking (opsonization) and elimination by the immune system, as a result of which the liposomes can circulate longer in the organism and can accumulate in tumor tissue, for example.
  • the pharmacokinetics are influenced by the nature of the liposomes, in particular by the amphiphilic compound (s) forming the membrane (s) of their membrane and hardly any more by the nature of the encapsulated active substance itself
  • the so-called drug targeting can be further optimized by such a PEGylation, which means, for example for tumor therapy, a maximum concentration of the active substances in the tumor tissue.
  • chemotherapeutic agents are currently being applied as liposomal formulations (e.g.
  • Liposo are essentially based on the following three alterna ⁇ tive process:
  • a common feature of the processes under b) and c) above is that auxiliary substances increase the solubility of the amphiphilic compounds forming the episcopate, e.g. Phospholipi is improved in aqueous solutions and it comes from the separation or dilution of the excipients to the formation of the Bichivier, which form into closed liposomes.
  • auxiliary substances increase the solubility of the amphiphilic compounds forming the episcopate, e.g. Phospholipi is improved in aqueous solutions and it comes from the separation or dilution of the excipients to the formation of the Bichivier, which form into closed liposomes.
  • the term “monolayer” is usually understood to mean monomolecular layers of amphiphilic or surface-active compounds, for example lipids, an emulsion drop consisting only of a monomolecular or simple layer of an amphiphilic compound or from a group of amphiphilic compounds, differs from Li posomen in that the latter at least one ne bichticht from two at least monomolecular layers of amphiphilic compounds, the polar and non-polar areas of which are oriented opposite each other in the monolayers forming the bi harsh.
  • all substances and classes of substances which are able to form thin layers such as e.g. B.
  • polymers and proteins which also applies in particular when these substance classes and substances optionally comprise or can comprise more than a single molecular layer.
  • "bishicht” in the context of the present disclosure is always to be understood as the combination of two monolayers in the above sense.
  • pre-liposomes are to be understood as meaning emulsion drops which have a monomolecular or a multiple layer of an amphiphilic compound or of a group of amphiphilic compounds.
  • a liquid phase which is not miscible or difficult to mix with the continuous phase of the emulsion, is provided, and the pre-liposomes thus produced are transferred from the emulsion into the aqueous phase by centrifugal forces.
  • the pre-liposomes surround themselves with a second monolayer composed of at least one of the amphiphilic compounds, which has been enriched at the phase boundary, so that the liposome or the vesicle is generated while maintaining a bilayer.
  • a further problem of this concept is in particular the property of almost all amphiphilic compounds, such as phospholipids and the like, to form so-called organogels together with an organic and an aqueous phase (cf. also, for example, PL Luisi, R. Scartazzini, G. Haering, P. Schurtenberger: "Organogels from water in-oil microemulsions Colloid Polym Sei, 268: 356-374
  • this intermediate phase can be mixed with the organic water-in-oil emulsion with the pre-liposomes, it can be separated in the centrifugal field due to its density difference and contains at least one amphiphilic compound of the outer layer of the bilayer, which consequently more of the amphiphilic compound of the inner monolayer or less separated.
  • the intermediate phase thus creates a sufficient diffusion limit for the amphiphilic compounds on the
  • the processes are all based on centrifuging a hydrophobic phase together with an aqueous phase.
  • the two phases must be separated so that the aqueous phase can be used as a product and the hydrophobic phase can be reused as an auxiliary for carrying out the process.
  • the invention is therefore based on the object, a method for encapsulating active ingredients in liposomes in a simple and cost-effective manner, at least largely avoiding the aforementioned disadvantages, in such a way that the formation of organogels is minimized from the amphiphilic compounds forming the bilayer of the membrane and it is thus possible to use two monomolecular -molecular layers of amphiphilic compounds in a Bi layer-merging, in particular, a continu ous ⁇ production should be made possible by liposomes.
  • this object is achieved in a method for encapsulating active substances in liposomes of the type mentioned at the outset in that the first liquid is in accordance with the first emulsion
  • Step (b) is chosen such that the solubility of the at least one first amphiphilic compound in the first liquid is at most 1 x IO -4 mol / 1.
  • the process according to the invention consequently provides that, in a manner known as such, in one step (a) one or more active substance (s) to be encapsulated are dissolved in a solvent or in a solvent mixture in order to prepare an active substance solution of the we to produce at least one active ingredient to be encapsulated.
  • the at least one solvent can, if not necessarily, in particular be a hydrophilic solvent, with in practice mainly water-based solvents, including water, such as isotonic solutions and / or alcohol-based solvents, which are physiologically harmless. especially based on ethanol.
  • water-based solvents including water, such as isotonic solutions and / or alcohol-based solvents, which are physiologically harmless. especially based on ethanol.
  • this active ingredient solution is then obtained with a first emulsion in a first liquid which is immiscible or poorly miscible with the at least one solvent of the active ingredient solution or with a mixture of such first liquids in the presence of one or more first amphiphilic compounds ) emulsifies, so that an at least monomolecular inner layer of the at least one first amphiphilic compound is attached to the drops of the active ingredient solution emulsified in the first liquid.
  • pre-liposomes are produced in the sense of the present disclosure, whose monomolecular layer of the at least one first amphiphilic compound forms the inner layer of the bilayer of the liposomes to be produced in the subsequent steps.
  • the mean drop size and distribution of this first emulsion and consequently the mean diameter of the pre-liposomes or the liposomes to be produced therefrom can in the usual manner, for example, by corresponding mechanical forces, such as shear forces, during the production of the first emulsion can be set and varied at wide intervals.
  • the at least one first amphiphilic compound capable of pre-liposome or membrane formation then diffuses diffusively as an (inner) monolayer at the phase boundary between the drug solution drops and the first liquid of the first Training emulsion.
  • the active ingredient solution is a usually hydrophilic, for example aqueous and / or alcoholic, solution
  • the first liquid (s) are hydrophobic liquids which are immiscible or difficult to mix with them.
  • the first amphiphilic substance can be, in particular, lipids, such as, for example, phospholipids and the like, or any other amphiphilic compounds known for the production of liposomes or mixtures of such compounds, including those of the type mentioned at the outset.
  • step (c) a step is also carried out with the first liquid of this first emulsion, ie with its continuous phase, not miscible or difficult to mix liquid phase provided, which may be punching in this liquid phase, in particular a hydrophilic phase han ⁇ , provided that at least one first liquid of the pre-liposome-containing first emulsion, so the continuous phase is hydrophobic.
  • step (d) As soon as the (inner) monomolecular layer of the at least one first amphiphilic compound in the first emulsion produced according to step (b) above has reached a minimum density with which it is able to form a bilayer, in a subsequent step (d) so then the first emulsion from the first liquid with the drops of the active ingredient solution emulsified therein with the at least monomolecular inner layer attached to it
  • Step (b) Layer of the at least one first amphiphilic compound, ie with the pre-liposomes produced in step (b) above, brought into contact with the liquid phase according to step (c) above to form a phase boundary between this first emulsion and this liquid phase, the at least one first amphiphilic compound being enriched at this phase boundary.
  • a final step (e) the first emulsion is finally centrifuged in accordance with step (b) above and the liquid phase which is in contact therewith via the phase boundary in accordance with step (c) above in order to remove the drops contained in the first emulsion Active substance solution with the attached, at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound, i.e.
  • the pre-liposomes prepared in the above manner to be transferred from the first liquid of the first emulsion into the liquid phase, when passing the phase boundary the enriched there, at least a first amphiphilic compound with the formation of an at least monomolecular outer layer thereof the at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound of the drops of the active substance solution is added in order to generate the bicholite from the at least monomolecular layers of the at least one first amphiphilic compound.
  • the pre-liposomes from the drops of the active ingredient solution with the attached monomolecular (inner) layer of the first amphiphilic compound are consequently generated in the centrifugal force field due to their density difference from the first, in particular hydrophobic, liquid of the first emulsion, that is to say from its continuous phase. moved to the adjacent, in particular hydrophilic, liquid phase over the phase boundary.
  • the at least one first amphiphilic compound or at least some representatives of several first amphiphilic compounds is then continuously attached to the pre-liposomes as a monomolecular (outer) layer in order to form the finished liposomes provided with a bilayer.
  • the two at least monomolecular (inner and outer) layers of the at least one first amphiphilic compound initially come so close to one another that, owing to, in particular hydrophobic, interactions between the amphiphilic compounds of the monolayers, the finished bi-layer with a practically freely adjustable composition of the form inner and outer side. Then the encapsulated drops of the active substance solution from the first emulsion are pressed so strongly against the newly formed bishicht due to the difference in density that the latter deforms and finally surrounds the entire drop of active substance solution, which finally constricts from the bishicht and tears off the phase boundary, so that the drops of the active ingredient solution are transformed into a liposome by being coated with a layer.
  • the formation of an organogel as a result of excessive accumulation of the at least one first amphiphi compound at the phase boundary between the first emulsion and the liquid phase in contact therewith can be effectively prevented by the first Liquid of the first emulsion according to step (b) above is selected such that the solubility of the at least one first amphiphilic compound in the first liquid is at most about 1 x IO -4 mol / 1, preferably at most about 0.5 x IO - 4 mol / 1, most preferably at most about 1 x IO -5 mol / 1, in particular at most about 1 x 10 6 mol / 1, for example at most about 1 x 10 ⁇ 7 mol / 1.
  • no “barrier layer” is formed from the at least one first amphiphilic compound at the phase boundary, which block the phase boundary and could thus prevent the formation of liposomes from the drops of active substance when passing through the phase boundary, so that a high yield is obtained obtained with a layer of the at least one first liposome provided on the phiphile compound and the efficiency of the process is thus improved considerably by minimizing the reject of the active ingredient solution, which should be recovered for economic reasons.
  • the invention according to a second aspect, a method for the production of liposomes, which can be used in the same way for the production of symmetrical liposomes somen (the first amphiphilic compound or the first amphiphilic compounds is / are identical to the second amphiphilic compound or with the second amphiphilic compounds) as well as in particular for the production of asymmetric liposomes (the first amphiphilic compound or the first amphiphilic compounds is / are different from the second amphiphilic compound or from the second amphiphilic compounds).
  • a method for encapsulating active ingredients in liposomes comprising
  • At least one bi-layer from at least one monomolecular layers of at least one first amphiphilic compound and at least one second amphiphilic compound, in particular in each case from the group of lipids, the active ingredient solution being encapsulated by the bi-layer comprises the following steps:
  • step (b) providing a first emulsion by emulsifying the active ingredient solution according to step (a) in at least one, in particular hydrophobic, first liquid which is immiscible or poorly miscible with the at least one solvent of the active ingredient solution in the presence of the at least one first amphiphilic compound, by at least one add monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound to the drops of the active substance solution emulsified in the first liquid;
  • step (c) not providing a mixture of a with the first liquid of the first emulsion according to step (b) or poorly miscible, in particular hydrophilic, liquid phase with the at least one second amphiphilic compound;
  • Step (c) wherein at least the at least one second amphiphilic compound is enriched at this phase boundary;
  • step (e) centrifuging the first emulsion which is in contact with one another via the phase boundary in accordance with step (b) and the mixture in accordance with step (c), around the drops of the active ingredient solution contained in the first emulsion with the at least monomolecular inner layer of the at least attached thereto to transfer a first amphiphilic compound from the first liquid of the first emulsion according to step (b) into the liquid phase of the mixture according to step (c), the enriched at least one second amphiphilic compound passing through the phase boundary to form an at least monomolecular compound , the outer layer thereof is attached to the at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound of the drops of the active ingredient solution, in order to form the bilayer of the two at least monomolecular ones
  • one or more active ingredient (s) to be encapsulated are / are in turn first dissolved in a solvent or in a solvent mixture in a manner known per se in step (a), to generate an active ingredient solution of the at least one active ingredient to be encapsulated.
  • the at least one solvent can, although not necessarily, in particular be a hydrophilic solvent, with in practice primarily physiologically harmless aqueous-based solvents including water or isotonic solutions and, for example, also alcoholic solvents, especially based on ethanol.
  • this active ingredient solution is then obtained with a first emulsion in a first liquid which is immiscible or poorly miscible with the at least one solvent of the active ingredient solution or with a mixture such first liquids are emulsified in the presence of one or more first compounds on the phiphile, so that an at least monomolecular inner layer of the at least one first amphiphilic compound is attached to the drops of the active ingredient solution emulsified in the first liquid.
  • pre-liposomes are again generated in the sense of the present disclosure, whose monomolecular layer of the at least one first amphiphilic compound forms the inner layer of the bilayer of the liposomes to be produced in the subsequent steps. Due to the fact that the first emulsion only remedies a first amphiphilic compound to the inner monolayer ⁇ layer contains the bilayer, the formation of pre- liposomes containing (also) the at least one provided for the outer monolayer of the bilayer, second amphiphilic compound is reliably avoided, so that be already extent the greatest possible asymmetry of the bishopric can be achieved. The average droplet size and distribution of this first emulsion and consequently the average one
  • Diameters of the pre-liposomes or the liposomes to be produced therefrom can also be used in the usual way, e.g. by entering mechanical forces accordingly, e.g. Shear forces are set when the first emulsion is produced and can be varied at wide intervals.
  • the at least one first amphiphilic compound capable of pre-liposome or membrane formation is then able to diffuse as an (inner) monolayer at the phase boundary between the drops of active substance solution and the first liquid of the first emulsion train.
  • the active ingredient solution is usually a hydrophilic, e.g.
  • the first liquid (s) are hydrophobic liquids which are immiscible or difficult to mix with them.
  • the first amphiphilic substance can in particular be lipids, e.g. are phospholipids and the same, or any other amphiphilic compounds known for the production of liposomes or mixtures of such compounds, including those of the type mentioned at the beginning.
  • step (c) is now carried out a mixture which is immiscible or difficult to mix with the first liquid of this first emulsion, ie with its continuous phase, this mixture comprising a liquid phase which is immiscible or difficult to mix with the first liquid of the first emulsion according to step (b) above at least one second amphiphilic compound is formed.
  • this mixture contains only the at least one second amphiphilic compound of the outer monolayer of the bishopric, the formation of pre-liposomes which (also) contain the at least one first amphiphilic compound intended for the inner monolayer of the bishopric becomes largely avoided, so that the greatest possible asymmetry of the bi-layer can be achieved.
  • the liquid phase of this mixture is in particular a hydrophilic phase, provided that the at least one first liquid of the first emulsion containing the pre-liposomes, that is to say its continuous phase, is hydrophobic or the active ingredient solution is hydrophilic.
  • Step (b) produced pre-liposomes, in contact with the mixture of the liquid phase with the at least one second amphiphilic compound according to step (c) above, forming a phase boundary between this first emulsion and this mixture, at least the at least one second amphiphilic compound is enriched at this phase boundary.
  • any accumulation of an excess of the at least one first at the phiphile compound from the first emulsion at the phase boundary can be prevented in a simple manner at least as far as possible by adding the at least one second amphiphilic compound to the mixture in excess and / or at least one first amphiphilic compound is added to the first emulsion in a proportion which corresponds approximately to the proportion which is able to attach to the drops of the active substance solution emulsified there as the inner monolayer.
  • step (e) the first emulsion, which is in contact with one another via the phase boundary, is again centrifuged in accordance with step (b) above and the mixture in accordance with the above
  • Step (c) the drops of the active ingredient solution contained in the first emulsion with the attached, at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound, that is to say the pre-liposomes prepared in the above manner in the sense of the present the disclosure of converting from the first liquid of the first emulsion into the liquid phase of the mixture, the enriched at least one second amphiphilic compound passing through the phase boundary forming an at least monomolecular outer layer of the same to the at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound of the drops of the active ingredient solution is added in order to produce the bichicht from the two at least monomolecular layers of the at least one first and second amphiphilic compound.
  • the pre-liposomes from the drops of the drug solution with the attached monomolecular (inner) layer of the at least one first amphiphilic compound are consequently made in an analogous manner in the centrifugal force field due to their density difference from the first, in particular hydrophobic, liquid of the first emulsion, i.e. from de ren continuous phase, to which, particularly hydrophilic, liquid phase of the mixture adjoins the phase boundary.
  • the at least one second amphiphilic compound is then continuously deposited as a monomolecular (outer) layer on the pre-liposomes in order to form the finished liposomes provided with a bi Mrs.
  • the two at least monomolecular (inner and outer) layers of the at least one first and the at least one second amphiphilic compound initially come so close to one another that, owing to, in particular hydrophobic, interactions between the same ( if symmetrical liposomes are to be produced) or in particular different ones (if asymmetrical liposomes are to be produced) - first and second amphiphilic compounds of the monolayers, the finished bishicht with practically freely adjustable composition of the inner and form the outer side.
  • the encapsulated drops of the active ingredient solution from the first emulsion are pressed so strongly against the newly formed bishicht due to the difference in density that the latter deforms and finally surrounds the entire drop of active ingredient solution, which finally constricts from the bishicht and tears off from the phase boundary, so that through the envelope is transformed into a lip osome with a layer of the active substance solution drops.
  • a compound different from the at least one first amphiphilic compound is selected as at least one second amphiphilic compound, asymmetrical liposomes with a different structure of the inner and outer, at least monomolecular layer of their layer can be produced in a simple manner.
  • the formation of an organogel in particular the at least one first amphiphilic compound as a result of an enrichment of the at least one first amphiphilic compound at the phase boundary between the first emulsion and the liquid phase of the mixture in contact therewith with the at least one second to effectively prevent amphiphilic compound also provides, in this case present in a manner analogous to that the first liquid of the first emulsion is selected to according to the above step (b) that the Lös ⁇ friendliness of at least a first amphiphilic compound in the first fluid at most about 1 x 10 -4 mol / 1, preferably at most about 0.5 x 10 -4 mol / 1, most preferably at most about 1 x 10 5 mol / 1, in particular at most about 1 x 10 ⁇ 6 mol / 1, for example at most about wa 1 x 10 ⁇ 7 mol / 1.
  • the first liquid of the first emulsion according to step (b) be such is chosen so that the solubility of both the at least one first amphiphilic compound and the at least one second amphiphilic compound in the first liquid is at most about 1 x 10 4 mol / 1, preferably at most about 0.5 x 10 ⁇ 4 mol / 1, most preferably at most about 1 x 10 5 mol / 1, in particular at most about 1 x 10 6 mol / 1, for example at most about 1 x 10 7 mol / 1.
  • a second emulsion from the liquid phase and at least one immiscible or poorly miscible, in particular hydrophobic, second liquid with the at least one second amphiphilic compound is used by emulsifying the second liquid in the liquid phase in the presence of the at least one second amphiphilic compound in order to add an at least monomolecular layer of the at least one second amphiphilic compound to the drops of the second liquid emulsified in the liquid phase and the to immobilize the second amphiphilic compound on these drops in this way;
  • the drops of the second liquid with the attached, at least monomolecular, layer of the at least one a second amphiphilic compound from the liquid phase of the second emulsion is continuously transferred to the phase boundary between the first emulsion and the second emulsion in order to continuously enrich the at least one second amphiphilic compound at this phase boundary.
  • a second emulsion is consequently used in that the, in particular hydrophilic, liquid phase of this mixture with the at least one immiscible or poorly miscible with it, especially hydro phobic, second liquid is emulsified.
  • the second emulsion - in a corresponding manner as in the first emulsion - emulsion droplets erzeu ⁇ gene which of the at least one second amphiphilic from the emulsified in the liquid phase droplets of the second liquid and a thereto attached storage ten, at least monomolecular layer Connection are formed.
  • the at least one second amphiphilic compound can be immobilized in this way and is consequently no longer or less freely available in a mere mixture or suspension. If this second emulsion according to step (d) is brought into contact with the first emulsion to form a phase boundary between their continuous phases, then in the subsequent centrifugation of the first and second emulsions
  • Step (e) continuously transfers the drops of the second liquid with the at least monomolecular layer of the at least one second amphiphilic compound from the liquid phase of the second emulsion to the phase boundary between the first emulsion and the second emulsion, so that an excessive accumulation of the at least one second amphiphilic compound, let alone the formation of an organogel from the same, at the phase boundary can be reliably prevented because the immobilized on the emulsified drops of the second liquid, at least one second amphiphilic compound continuously fed to the phase boundary in this way and on this phase boundary is continuously enriched so that when the drops from the active substance solution pass through it, with the at least monomolecular (inner) layer attached to it from the at least one first amphiphilic compound through the phase boundary as the outer Sc does not attach to the inner layer and the bi- To form layer.
  • first and second amphiphilic compounds can ideally be kept separate from one another in this way (both amphiphilic compounds are each attached to emulsion drops of the first and second emulsions, which are only in contact with one another via the phase boundary, and consequently immobilized), so that Highly asymmetric liposomes can be produced provided that the second amphiphilic compound (s) is / are different from the first amphiphilic compound (s).
  • the drops emulsified in the second emulsion from the, in particular hydrophobic, second liquid with the at least monomolecular layer of the at least one second amphiphilic compound attached to them are also referred to below as “amphiphile carriers” for the sake of simplicity.
  • the immiscible or poorly miscible, in particular special hydrophobic, second liquid with the, in particular hydrophilic, liquid phase of the second emulsion, which forms the "core" of the amphiphile carrier in the sense of the present disclosure with the attached, at least one second, phiphile compound can advantageously be selected in accordance with the, in particular hydrophobic, first liquid speed of the first emulsion according to step (b), which forms the continuous phase of the first emulsion.
  • the first liquid corresponds to the second liquid, so this can be easily recovered in a consistently constant composition after the amphiphile carrier from the second liquid and the attached, at least one second amphiphilic compound, the phase boundary between the first liquid during centrifugation Emulsion and the second Emulsi on have reached the second amphiphilic compound on the Enriched phase boundary and has been attached as an outer layer to the pre-liposomes from the active ingredient solution with the attached at least one first amphiphilic compound and the drops from the second liquid of the second emulsion passed over the phase boundary into the same first liquid are.
  • the mixture present in the form of the second emulsion with the at least one second amphiphilic compound immobilized on the amphiphile supports according to step (c) can preferably be produced by:
  • Step (c) and the at least one second amphiphilic compound is provided;
  • the second liquid in this mixture is emulsified to form the second emulsion by dispersing the second liquid in this mixture.
  • amphiphilic carriers are formed in the sense of the present disclosure from the at least one second amphiphilic compound already contained in the mixture of the particularly hydrophilic, liquid phase in a reliable and reproducible manner if the, in particular hydrophobic, second liquid is dispersed into this mixture and the second amphiphilic compound attaches to its drops.
  • the first emulsion according to step (b) can advantageously be produced by first
  • step (a) a mixture of the active ingredient solution of the active ingredient to be encapsulated according to step (a) and the at least one first amphiphilic compound is provided;
  • this mixture is emulsified in the first liquid to form the first emulsion according to step (b), which the mixture is dispersed into the first liquid.
  • the size distribution of the first emulsion can be adjusted by appropriate mechanical comminution.
  • the solubility of the at least one first amphiphilic compound and preferably also the at least one second amphiphilic compound is at most approximately 1 x IO is 5 mol / 1, so that the formation of organogel structures at the phase boundary between the first liquid of the first emulsion and the, in particular hydrophilic, liquid phase or the mixture of the, in particular hydrophilic, liquid phase and the at least one second on the phiphile compound or the second emulsion is reliably avoided.
  • the active ingredient solution has a hydrophilic character and is, for example, in aqueous and / or alcoholic form, as is usually the case, the first liquid of the first emulsion according to step (b) can advantageously be a hydrophobic liquid which especially from the group of
  • each "R” is a hydrogen atom or an alkyl group and "n” is a natural number.
  • the drug solution step (a) is used as solvent according to thus preferably a hydrophilic solvent, in particular aqueous Ba ⁇ sis including water, such as isotonic solutions, and / or alcohol-based, in particular based on ethanol or glycerol or glycerol, is incorporated ⁇ .
  • a hydrophilic solvent in particular aqueous Ba ⁇ sis including water, such as isotonic solutions, and / or alcohol-based, in particular based on ethanol or glycerol or glycerol, is incorporated ⁇ .
  • the first, in particular hydrophobic, liquid of the first emulsion from the first liquid with the drops emulsified therein of the, in particular hydrophilic, active substance solution with the attached, at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound according to step (b) is chosen such that it has a lower melting point than the active ingredient solution;
  • the first emulsion according to step (b) is cooled to a temperature between the melting point of the, in particular hydrophobic, first liquid of the first emulsion and the melting point of the, in particular hydrophilic, active substance solution, by the drops of the active substance solution emulsified in the first liquid with the attached, at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound according to step (b) to convert to the solid state; and then
  • step (b) in the solid state of the drops of the active ingredient solution with the, in particular special hydrophilic, water-immiscible with the first, especially hydrophobic, liquid of the first emulsion according to step (b)
  • step (d) is brought into contact with formation of the phase boundary according to step (d) and the first emulsion which is in contact with one another via the phase boundary according to
  • the, in particular hydrophilic, active ingredient solution with the attached, at least monomolecular, inner layer of the at least one first amphiphilic compound is kept in the solid state during centrifugation in order to keep it due to a (additional) density caused thereby difference from the phase boundary in the direction of the, in particular hydrophilic,
  • the first emulsion is consequently preferably cooled to such an extent that the, for example aqueous and / or alcoholic, active substance solution drops freeze, but the surrounding, in particular hydrophobic, first liquid, that is to say the continuous phase of the first emulsion, remains liquid.
  • This can contribute to the fact that the drops of active substance with the attached (inner), at least monomolecular, layer of the at least one first amphiphilic compound are not deformed excessively or even completely at the phase boundary without penetrating the phase boundary and thus in turn a barrier layer to form at the phase boundary.
  • the frozen active substance solution drops due to centrifugal forces are not only easier or faster in the first liquid of the first emulsion move, but also in the, in particular hydrophilic, liquid phase or in the mixture of the liquid phase with the at least one second amphiphilic compound or in the second emulsion after it has passed through the phase boundary and it is coated with a layer to form the finished liposomes has occurred because the frozen active solution drops have a lower density than the, in particular hydrophilic, non-frozen liquid phase or as the mixture of the non-frozen liquid phase with the at least one second amphiphilic compound, this liquid phase as well as the solvent the drop of active substance solution can in particular be aqueous rig or alcoholic or water.
  • at least the first emulsion should preferably be tempered slightly below the freezing point of the active substance solution drops, so that they remain frozen in the first liquid
  • the active substances included in a liposome can be prevented by the bishicht from amphiphilic compounds, such as in the form of a bishicht from the same or different lipids, on the way to their destination in the organism against the destructive effect of enzymes and before premature elimination be protected from the body.
  • the liposomes must also be protected by a surface polymer layer, which is typically formed on the basis of polyethylene glycol (PEG), in order to avoid opsonization and phagocytosis by immune cells, for example in the liver, before the active ingredient has arrived at its destination.
  • PEG polyethylene glycol
  • At least one first amphiphilic compound and the at least one second amphiphilic compound in particular exclusively the outer, at least monomolecular layer of the bi-layer, is modified by reaction with hydrophilic polymer conjugates.
  • hydrophilic polymer conjugates for example, this can be done on the one hand by modifying the finished liposome in such a way that such polymer conjugates e.g. can be attached to the at least monomolecular outer layer thereof by means of electrostatic charging.
  • the method according to the invention, according to claim 3 also opens up the possibility that at least one second amphiphilic compound, e.g. in the form of lipids, to which the polymer conjugates have previously been bound.
  • the first emulsion according to step (b), on the other hand, the liquid phase or the mixture or the second emulsion according to step (c) are added to the centrifuging device, after which these are centrifuged, after which the centrifuging device on the one hand removes the liquid phase with the liposomes provided with the bilayer from the two at least monomolecular layers of the amphiphilic compound (s) and on the other hand the first liquid.
  • the first emulsion according to step (b), on the other hand, the liquid phase or the mixture or the second emulsion according to step (c) of the centrifuging device over a period of time continuously added and these are centrifuged during which the centrifuging device, on the one hand, in turn removes the liquid phase with the liposomes provided with the bilayer from the two at least monomolecular layers of the amphiphilic compound (s), and on the other hand the first liquid.
  • the method is carried out continuously in a continuous centrifuging device operated in a flow-through manner, it may be provided in particular that on the one hand the first emulsion according to step (b), on the other hand the liquid phase or the mixture or the second emulsion according to step (c) the centrifuging device is continuously fed in and centrifuged and the centrifuging device on the one hand the liquid phase with the liposomes provided with the layer of the at least monomolecular layers of the amphiphilic compound (s), and on the other hand the first liquid is continuously removed.
  • the method according to the invention - be it for the production of symmetrical or for the production of asymmetrical liposomes - offers a novel possibility of producing liposomes in a technically relatively simple and cost-effective manner, which in particular for therapeutic use, but also for all other known uses of liposomes, for example in the field of food or cosmetics or personal care, are equally suitable.
  • the arrangement of different, at least monomolecular monolayers at the phase boundary between a first emulsion, such as a "water-in-oil emulsion", and a second emulsion, such as an "oil-in-water emulsion”, also allows these two Monolayers due to hydrophobic interactions between e.g.
  • the layer of the bishop can be set freely, which opens up new possibilities for the functionality of liposome preparations.
  • the manufacturing process high encapsulation efficiency, since the generation of an emulsion in an immiscible surrounding phase enables the active ingredient to be completely enclosed in the emulsion drops.
  • the emulsion drop is coated with a second monolayer for the encapsulation of active substances into the newly generated liposome, only small losses of the active substance occur in the area surrounding the liposome after its production, so that a high utilization rate of the usually expensive active substances is achieved can be.
  • the volume ratio of the hydrophilic and hydrophobic phase and the quantity ratio of the membrane-forming amphiphilic compounds, for example in the form of phospholipids, can create the conditions for the formation of liposomes in the desired size and concentration, advantageously ensuring a corresponding excess of amphiphilic compounds should be so that a sufficient interface density of amphiphilic compounds at the phase boundary is established, which, however, does not result in the formation of an organogel according to the invention.
  • Fig. 1 is a highly schematic view
  • Fig. 2 is a highly schematic view
  • Fig. 3 is a schematic cross-sectional view of the half
  • Fig. 4 a transmission electron microscope image of symmetrical liposomes from one
  • Fig. 5 a transmission electron microscope image of symmetrical liposomes from a
  • Fig. 6 a transmission electron microscope image of symmetrical liposomes from a
  • DOPC lipids dioleoylphosphatidylcholine
  • 1 shows a situation during the formation of primarily symmetrical liposomes according to a first embodiment of a method according to the invention for encapsulating active substances in liposomes L on the basis of an enlarged detailed view in a highly schematic manner.
  • a drop for example with a diameter between approximately 0.1 pm and approximately 200 pm, can be seen from an active substance solution 1, for the generation of which the active substance was previously dissolved in a solvent according to step (a) is.
  • the solvent in the present case is, for example, a hydrophilic solvent based on water and / or alcohol.
  • a mixture of the active substance solution 1 is first, for example, according to step (b) and the first amphiphilic compound 2, after which this mixture has been dispersed into the first liquid 3 to obtain the first emulsion 4.
  • the first liquid 3 has preferably also been selected such that it has a lower melting point than the active substance solution 1 emulsified in the first emulsion 4 (see also below for this).
  • the - hydrophobic - first liquid 3 also has a different density than the active ingredient solution 1, the fluorocarbon used in the present case having a higher density than the aqueous and / or alcoholic active ingredient solution 1.
  • an active ingredient solution 1 "Lighter" first liquid 3 that is to say one with a lower density, can be used.
  • a liquid phase 5 which is not or poorly miscible with the first liquid 3 of the first emulsion 4 - here hydrophilic - has been provided, which, for example, corresponds to the solvent tel the drug solution 1 can be selected and consequently, for example can also be aqueous and / or alcoholic.
  • the first emulsion 4 is now made of the first, hydrophobic liquid 3 with the pre-liposomes M emulsified therein from the drops of the active ingredient solution 1 with the attached, monomolecular (inner) layer of the first amphiphilic compound 2 in step (b) has been brought into contact with the liquid, hydrophilic phase 5, whereupon there is between the first liquid 3, that is to say the continuous phase of the first emulsion 4, and the liquid sigen phase 5 has formed a phase boundary 6 due to their poor miscibility with one another.
  • Step (e) of the method finally provides for centrifugation of the first emulsion 4, which is in contact with one another via the phase boundary 6, and the liquid phase 5, in order to remove the drops of the active ingredient solution 1 contained in the first emulsion 4 with the monomolecular monolayer attached thereto inner layer of the first amphiphilic compound 2 in the direction of the arrows Pi from the first liquid 3 of the first emulsion 4 through the phase boundary 6 with the molecules of the first amphiphilic compound 2 enriched there to be transferred into the liquid phase 5, when passing the phase boundary 6 the first amphiphilic connection 2 with the formation of a further monomolecular - outer - layer thereof on the monomolecular inner
  • Layer of the first amphiphilic compound 2 of the drops of the active ingredient solution 1 is added in order to generate the bilayer from two monomolecular layers of the first amphiphilic compound 2, ie to form complete liposomes L from the pre-liposomes.
  • the outer layer of the bi layer of the first amphiphilic compound 2 has an opposite orientation to the inner layer, ie the non-polar regions of the first amphiphilic compound 2 of the outer layer point in the direction of the positive lar areas of the inner layer, that is, in the direction of the hydrophilic active substance solution 1 now encapsulated in a liposome L, while the polar areas of the outer layer of the bi-layer point in the direction of the - hydrophilic - liquid phase 5 surrounding the liposome L.
  • Layer of the first amphiphilic compound 2 have a lower density than the surrounding (hydrophobic) first liquid 3 of the first emulsion 4, they experience in the centrifugal field a force acting in the direction of the arrows Pi, which accelerates them in the centripetal direction and to the phase boundary 6 brings, which is covered with a largely monomolecular layer of the first amphiphilic compound 2.
  • Pre-Liposo M is pressed against this layer enriched at the phase boundary 6 of the first amphiphilic compound 2 in such a way that the monomolecular layer of the first amphiphilic compound 2 enriched at the phase boundary 6 adjoins the drop of the active ingredient solution 1 attached inner layer of the first amphiphilic compound 2 and thereby the hydrophobic interaction of two monomolecular layers creates the bilayer of the finished liposome L, which after further movement in the direction of the arrows Pi is dispersed in the centrifugal field in the (hydrophilic) liquid phase 5.
  • a drop of the active ingredient solution 1 or the pre-liposome M results in a symmetrical liposome L, which in the bilayer forming its membrane contains both an inner and an outer layer from the first one on the phiphile Compound 2 has.
  • a (single) first amphiphilic compound 2 instead of a (single) first amphiphilic compound 2, a Mixture of such compounds, for example a mixture of several lipids, can be used, which then form the inner and outer layers of the bilayer of liposome L.
  • the liquid phase 5, in which the liposomes L are dispersed can finally be separated from the first liquid 3, which is due to the very poor miscibility of the hydrophilic liquid phase 5 with the hydrophobic first Liquid 3 and their under different density is possible in a simple manner.
  • the first emulsion 4 it is also possible for the first emulsion 4 to be cooled to a temperature between the melting point of the (hydrophobic) first liquid 3 and the melting point of the (hydrophilic) active substance solution 1 in order to obtain the active substance solution 1 in the first Liquid 3 to transfer emulsified drops with the attached, monomolecular, inner layer of the first amphiphilic compound 2 into the solid state, where after the first emulsion 4 in the solid state, the drops of the active ingredient solution 1 with the (hydrophilic) liquid phase 5 is brought into contact with formation of the phase boundary 6 and the first emulsion 4, which is in contact with one another via the phase boundary 6, and the liquid phase 5, in particular with the droplets of the active substance solution 1 continuously being kept in the solid state of being centrifuged.
  • Fig. 2 in which Fig. 1 corresponding components are provided with the same reference numerals, ei ne situation during the formation of predominantly asymmetric rule liposomes according to a second embodiment of a method according to the invention for encapsulating active substances in liposomes L using a enlarged detailed view reproduced in a highly schematic manner. 2 - to the extent analogous to the right section of FIG.
  • a drop for example with a diameter between approximately 0.1 pm and approximately 200 pm, can be seen from an active ingredient solution 1, for the generation of which the Active ingredient has previously been dissolved in a solvent according to step (a).
  • the solvent is, for example, a hydrophilic solvent based on water and / or alcohol.
  • the drop from the active substance solution 1 has a monomolecular (inner) layer made of a first amphiphilic compound 2, such as a lipid, to form a pre-liposome M. , accumulated, the polar regions of the first amphiphilic compound 2 in the direction of the hydrophilic active substance solution 1 and the non-polar regions in the direction of a droplet of the active substance solution 1 surrounding, with its solvent not or only poorly miscible - here: hydrophobic - first liquid 3 have aligned.
  • a monomolecular (inner) layer made of a first amphiphilic compound 2, such as a lipid, to form a pre-liposome M.
  • the - hydrophobic - first liquid 3 also has a different density than the active substance solution 1, the fluorocarbon used in the present case having a higher density than the aqueous and / or alcoholic active substance solution 1.
  • the fluorocarbon used in the present case having a higher density than the aqueous and / or alcoholic active substance solution 1.
  • a mixture 7 of an immiscible or poorly miscible with the first liquid 3 of the first emulsion 4 - here hydrophilic - is a liquid phase with a second amphiphilic Compound 8, for example again in the form of a lipid, has been provided, the liquid phase of this mixture 7, for example, in turn being selected in accordance with the solvent of the active ingredient solution 1 and consequently, for example, can be aqueous and / or alcoholic.
  • the mixture 7 is a two-th emulsion 9 from the liquid phase of the mixture 7 and one which is immiscible or difficult to mix with it - here hydro- phobic - second liquid 10 and the second amphiphilic compound 8, which has been produced by emulsifying the second (hydrophobic) liquid 10 in the (hydrophilic) liquid phase of the mixture 7 in the presence of the second at the phiphilic compound 8, so that the continuous phase of the second emulsion 9 is formed by the (hydrophilic) liquid phase and the disperse phase of the second emulsion 9 is formed by the (hydrophobic) second liquid 10, which in particular corresponds to the (hydrophobic) first liquid 3 of the first emulsion 4 can be chosen.
  • the first emulsion 4 is now composed of the first, hydrophobic liquid 3 with the pre-liposomes M emulsified therein from the drops of the active ingredient solution 1 with the monomolecular (inner) layer attached to it the first amphiphilic compound 2 according to step (b) with the second emulsion 9 from the hydrophilic liquid phase with the amphiphile carriers M 'emulsified therein from the drops of the hydrophobic second liquid 10 in contact with the second amphiphilic compound 8 attached thereto brought, whereupon between the first liquid speed 3, that is, the continuous phase of the first emulsion 4, and the liquid phase, that is, the continuous phase of the second emulsion 9, due to their poor miscibility with each other, a phase boundary 6 has formed.
  • the enrichment of the first amphiphilic compound 2, the solubility of which in the first liquid 3 of the first emulsion 4 is also less than IO -4 mol / 1, at the phase boundary 6 is very low because the proportion of the first amphiphilic compound 2 is on the one hand such has been set so that it has been deposited as completely as possible as a monomolecular inner layer on the drops of the active ingredient solution 1, on the other hand, the very low solubility of the first amphiphilic compound 2 in the first liquid 3 of the first emulsion 4 prevents excessive accumulation thereof Phase boundary 6 or even the formation of an organ gel.
  • Step (e) of the method finally provides for centrifugation of the first emulsion 4 and the second emulsion 9, which are in contact with one another via the phase boundary 6, in order firstly to have the drops of the active ingredient solution 1 contained in the first emulsion 4 with the monomolecular inner layer attached thereto to transfer the first amphiphilic compound 2 in the direction of the arrows Pi from the first liquid 3 of the first emulsion 4 through the phase boundary 6 with the enriched molecules of the second amphiphilic compound 8 into the liquid, continuous phase of the second emulsion 9, whereby when passing the phase boundary 6 the second amphiphilic compound 8 with formation of a further monomolecular - outer - Layer of the same is attached to the monomolecular inner layer of the first amphiphilic compound 2 of the drops of the active ingredient solution 1 in order to form the bilayer consisting of two monomolecular layers, namely on the one hand the first amphiphilic compound 2 (inner layer) and on the other hand the second amphiphilic To produce compound
  • the outer layer of the bi-layer from the second amphiphilic compound 8 has an opposite orientation to the inner layer from the first amphiphilic compound 2, ie the non-polar regions of the second amphiphilic compound 8 of the outer layer point in the direction of the polar regions of the first amphiphilic compound 2 of the inner layer, i.e. in the direction of the hydrophilic active substance solution 1 now encapsulated in a liposome L, while the polar regions of the second amphiphilic compound 8 of the outer layer of the bi-layer in the direction of the - hydrophilic - liquid phase surrounding the liposome L of the second Emulsion 9 have (cf. the two upper sections of FIG. 2).
  • Layer of the first amphiphilic compound 2 have a lower density than the surrounding (hydrophobic) first liquid 3 of the first emulsion 4, they experience in the centrifugal field a force acting in the direction of the arrows Pi, which accelerates them in the centripetal direction and to the phase boundary 6 brings, which is covered with an at least monomolecular layer of the second amphiphilic compound 8.
  • the pre-liposome M is pressed against this layer of the second amphiphilic compound 8 enriched at the phase boundary 6 in such a way that the monomolecular layer of the second amphiphilic layer enriched at the phase boundary 6 phiphilen compound 8 applies to the solvent in the drops of the active ingredient ⁇ 1 annealed inner layer of the first amphiphilic compound 2 and thereby by hydrophobic interactions effect of two monomolecular layers of the bilayer of the final liposome L is produced which supply after further BEWE in the direction of arrows Pi is present in the centrifugal fluid in the (hydrophilic) liquid phase of the second emulsion 9.
  • the drop of the active ingredient solution 1 or the pre-liposome M results in a liposome L, which in the bilayer forming its membrane, on the one hand, an inner layer made of the first amphiphilic compound 2 and, on the other hand, one has outer layer of the second amphiphilic compound 8. Consequently, symmetrical liposomes L can be generated on the one hand if the first amphiphilic compound 2 is chosen corresponding to the second amphiphilic compound 8; on the other hand, in particular asymmetric liposomes L can be produced if the first amphiphilic compound 2 is chosen differently from the second amphiphilic compound 8.
  • the drops of the second liquid 10 with the attached monomolecular layer of the second are when centrifuging the first emulsion 4 and the second emulsion 9 which are in contact with one another via the phase boundary 6 amphiphilic compound 8, so the amphiphile-carrier M ', continuously transferred from the liquid phase of the two ⁇ th emulsion 9 in the direction of arrows P 2 at the phase boundary 6 between the first emulsion 4 and the two ten emulsion 9 to the second amphiphilic Verbin dung 8 in a centrifugal to be enriched continuously at the phase boundary 6, where it is consumed as an outer layer on the pre-liposomes M as a result of the attachment explained in the previous paragraph, forming the liposomes L.
  • amphiphile carrier M Since the amphiphile carrier M 'from the drops of the (hydrophobic) second liquid 10 with the attached second amphiphilic compound 8 have a higher density than the surrounding (hydrophilic) liquid phase of the second emulsion 9, they experience one in the centrifugal field force acting in the direction of arrows P 2 , which accelerates it in a centrifugal direction and brings it to the phase boundary 6. They strip their monomolecular layer from the second monomolecular compound 8 at the phase boundary 6 when it passes into the first (hydrophobic) liquid 3, that is to say into the continuous phase of the first emulsion 4.
  • the layer at the phase boundary 6 separated from the second amphiphilic compound 8 is continuously renewed as a result of the phase transition of the drops from the second (hydrophobic) liquid or the second amphiphilic compound 8 is continuously “supplied” to the phase boundary 6, whereas it is continuously consumed as an outer layer by forming the liposomes L as described above.
  • the liquid phase can finally in which the liposomes L are dispersed, separated from the first liquid 3, which is possible in a simple manner due to the very poor miscibility of the hydrophilic liquid phase with the hydrophobic first liquid 3 and its different density.
  • the first emulsion 4 it is also possible for the first emulsion 4 to be cooled to a temperature between the melting point of the (hydrophobic) first liquid 3 and the melting point of the (hydrophilic) active substance solution 1 in order to obtain the active substance solution 1 in the first Liquid 3 emulsified drops with the attached, monomolecular, inner layer of the first amphiphilic compound 2 in the solid state, after which the first emulsion 4 in the solid state drops the active ingredient solution 1 with the (hydrophilic) liquid phase of the second Emulsion 9, i.e.
  • phase boundary 6 and the first emulsion 4 and the second emulsion 9 which are in contact with one another via the phase boundary 6, in particular while continuously holding the drops of the active ingredient solution 1 in the solid state of matter , be centrifuged.
  • the second embodiment of the method according to the invention offers in particular the possibility that one or more lipids are used as the second amphiphilic compound 8, which forms the monomolecular outer layer of the bilayer of liposomes L. These lipids have previously been bound to polymer conjugates.
  • FIG. 3 shows a schematic cross-sectional view of an embodiment of a centrifuging device suitable for the continuous implementation of the method for encapsulating active substances in liposomes, FIG. 3 showing only half the cross section of the essentially rotationally symmetrical centrifuging device for illustrative purposes.
  • the continuous flow centrifuging device shown in FIG. 3 can be rotated about its longitudinal central axis 11, the centrifugal field that can be generated thereby being indicated by the arrows P 3 .
  • the centrifuging device comprises a centrifuging chamber 13 which is delimited by a peripheral wall 12 and extends over most of its axial length. At its left in FIG.
  • the centrifuging device has two separate inlets 14, 15, which are arranged, for example, essentially coaxially with one another.
  • the first inlet 14 opens into a radially outer circumferential section of the centrifuging yaw chamber 13, while the second inlet 15 opens into a radially inner central section of the centrifuging chamber 13.
  • inlet area of the Centrifugal device is located for this purpose mainly in the radial direction thereof occidentalre ⁇ ADORABLE.
  • Inlet weir 16 which on the one hand cut a radially outer, for example approximately annular through-opening between the first inlet 14 and the radially outer section of the centrifuging chamber 13, and on the other hand cut a radially inner, for example approximately circular through-opening between the second inlet 15 and the radially inner section leaves the centrifuging chamber 13 free, so that fluid media which are simultaneously applied to the first inlet 14 and the second inlet 15 are initially kept separate from one another by means of the inlet weir 16, after which they pass radially on the outside and on the other hand radially on the inside as a result of the passage of the inlet weir 16 the common centrifuging chamber 13 are transferred, on the one hand in their radially outer section and on the other hand in their radially inner section.
  • the centrifugal yaw device On its right side in FIG. 3, the centrifugal yaw device has two separate outlets 17, 18, which in turn are arranged essentially coaxially to one another.
  • the first outlet 17 opens out from the radially outer circumferential section of the centrifuging chamber 13, while the second outlet 18 opens out from the radially inner central section of the centrifuging chamber 13.
  • the second outlet 18 opens out from the radially inner central section of the centrifuging chamber 13.
  • first retaining weir 20 which extends essentially in the radial direction thereof and which, for example, is essentially annular and extends from the outer peripheral wall 12 of the centrifuge yaw device stretches inward by a radial distance Ri, this radial distance Ri, that is to say the radial width of the first retaining weir 20, usefully at least the radial width of the passage opening between the radially outer end of the outlet weir 19 and the peripheral wall 12 or preferably at least slightly exceeds this.
  • a second retaining weir 21 which also extends essentially in the radial direction thereof, which in the present case is, for example, essentially annular and is designed extends between a radially approximately central section of the centrifuging chamber 13 to close to the central axis of rotation 11 of the centrifuging device, but instead it may also be designed essentially circular and consequently cannot have central passages (not shown).
  • the radial distance R 2 of the second retaining weir from the central axis of rotation 11, al ⁇ as the radial width of the second retaining weir 21 ent, ⁇ speaks suitably at least to the radial width of the passage opening between the radially inner end of the outlet weir 19 and the central axis of rotation 11 or exceeds this preferably at least slightly ,
  • the hydrophobic first liquid of which has a higher density than the hydrophilic liquid phase 5 (FIG. 1) or as the hydrophilic continuous phase of the second emulsion 9 (Fig. 2) the first (radially outer) inlet 14 of the centrifugation device continuously; on the other hand, the hydrophilic liquid phase 5 (FIG. 1) or the second emulsion 9 (FIG. 2) is continuously fed to the second (radially inner) inlet 15 of the centrifugal device.
  • the first emulsion 4 on the other hand the hydrophilic liquid phase 5 (FIG.
  • the second emulsion 9 (FIG. 2) in the inlet area of the centrifuging device are initially kept separate from one another by the inlet weir 16 and then arrive as soon as they enter the inlet weir 16 on the one hand through its radially outer passage opening, on the other hand through its radially inner passage opening, on the one hand into the radially outer section, and on the other hand into the radially inner section of the common centrifuging chamber 13, with which they are brought into contact with one another in accordance with step (d) and the phase boundary 6 forms.
  • Another function of the underflow or overflow inlet weir 16 is not to cover the (radially outer) inlet area of the first emulsion 4 into the centrifugation chamber 13 with the hydrophilic liquid phase 5 Or over layers (Fig. 1) with the second emulsion 9 (Fig. 2) with the ⁇ compared to lower density, so that no uncontrolled bilayers of Wirkstoffaimsstrop ⁇ contained in the, first emulsion 4 in the ⁇ sem inlet region fen 1 with the thereto attached monomolecular layer of the first amphiphilic compound 2 (see. FIGS. 1 and 2) are generated.
  • the centrifugation step (e) explained in detail instead, the drops of the active ingredient solution 1 emulsified in the first liquid 3 with the monomolecular (inner) layer attached to the first amphiphilic compound 2 of the first emulsion 4 (cf. also FIG. 1 and 2) can be accumulated in the centrifuging chamber 13 by means of the first retaining weir 20.
  • a function of the first retaining weir 20 is consequently also that the emulsified and provided with a monolayer of the first amphiphilic compound 2 drops of the active ingredient solution 1 in the first emulsion 4, which have not yet been converted to a liposome L provided with a bilayer , not entrained via the first outlet 17 from the centrifugation chamber 13, but instead reach the phase boundary 6 by driving forces beforehand in order to be able to be implemented there as completely as possible to the liposomes L with a bi layer.
  • a second emulsion 9 from the hydrophilic liquid phase with the drops emulsified therein from the hydrophobic second liquid 10, which has a monomolecular layer The second If amphiphilic compound 8 is used, these drops can be accumulated in the centrifuging chamber 13 by means of the second retaining weir 21.
  • a function of the second retaining weir 21 in this case is therefore primarily that the emulsified and ver provided with a monolayer of the second amphiphilic compound 8 drops of the hydrophobic second liquid 10 in the second emulsion 9, which the second amphiphilic compound 8 is not yet have deposited at the phase boundary 6, not entrained via the second outlet 18 from the centrifugal yaw chamber 13, but instead by the induced centrifugal forces, the phase boundary 6 is reached in order to enrich the second amphiphilic connection 8 as completely as possible.
  • the hydrophilic liquid phase 5 with the liposomes provided with the bilayer from the two monomolecular layers of the first amphiphilic compound 2 (FIG. 1) or the continuous, hydrophilic liquid phase of the second emulsion 9 with the with the Bichicht from the first amphiphilic compound 2 (in the inner layer) and the second amphiphilic compound 8 (outer layer) provided liposomes L (FIG. 2) on the other hand the hydrophobic first liquid 3 from the common centrifuging chamber 13 separated from one another by means of the outlet weir 19 and removed on the one hand via the second outlet 18 and on the other hand via the first outlet 17 of the centrifuging device.
  • FIG. 1 the hydrophilic liquid phase 5 with the liposomes provided with the bilayer from the two monomolecular layers of the first amphiphilic compound 2 (FIG. 1) or the continuous, hydrophilic liquid phase of the second emulsion 9 with the with the Bichicht from the first amphiphilic compound 2 (in the inner layer) and the
  • the liquid fill levels set by means of the weirs that can be flowed under or overflow can be seen inside the centrifuging chamber 13.
  • a function of the overflow or underflow outlet weir 19 is therefore primarily there for a complete separation of phases 5 and 4 or
  • the distance of the phase boundary 6 from the radially outer end of the outlet weir 19 should advantageously be set such that the phase boundary 6 is unable to reach the radially outer end of the outlet weir 19 even in the event of vibrations.
  • Viscumin (mistletoe extract) in 15 mM phosphate buffer in a bilayer from the lipid dipalmitoyl-phosphatidylcholine (DPPC).
  • Active ingredient solution 10 pg / ml viscumin (active ingredient) in 15 mM
  • aqueous phosphate buffer (PP) hydrophilic solvent
  • the active ingredient viscumin is dissolved in a proportion of 10 pg / ml in 15 mM aqueous phosphate buffer (PP) as a hydrophilic solvent in order to provide the hydrophilic active ingredient solution.
  • PP aqueous phosphate buffer
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • the hydrophilic active ingredient solution from 10 pg / ml in 15 mM PP according to step (a) is now added to the round bottom flask with the DPPC in order to obtain a mixture of 150 mM DPPC in the active ingredient solution.
  • the DPPC first amphiphilic compound detaches in the hydrophilic active substance solution due to swelling from the glass wall of the round-bottom flask and forms polydisperse amphiphilic aggregates, which are comminuted by mechanical processing. Two alternative methods are used for this:
  • pre-liposomes are drops of solution from the active ingredient with a monomolecular layer of DPPC (disperse phase of the first emulsion) in perfluoroperperrophenanthrene (first liquid, hydrophobic as a continuous phase of the first emulsion) with an average particle size of 424 nm ⁇ 33 nm , a particle count of 643 kcounts / s ⁇ 64 kcounts / s (derived count rate) and a polydispersity index (PDI) of 0.179.
  • the size stability of the pre-liposomes was checked over 138 minutes and changed during this time by less than 10%.
  • the first emulsion is aliquoted with the pre-liposomes, with 0.55 ml of the first emulsion being filled into centrifuge tubes, for example, for the subsequent discontinuous centrifugation (see step (e) below).
  • the aliquoted portions of the first emulsion with the pre-liposomes can preferably first be frozen in a freezer at -24 ° C. for at least 4 hours become. Then the hydrophobic first liquid (perfluoroperhydrophenanthene) of the first emulsion, in which the pre-liposomes are suspended, is tempered in an ice bath with salt addition at -3 ° C ⁇ 0.5 ° C for approx. 30 minutes; the hydrophilic liquid phase according to step (c) (16 mM PP in
  • the first emulsion with the hydrophobic first liquid as a continuous phase is then brought into contact with the hydrophilic liquid phase by placing about 0.55 ml of the first emulsion with the pre-liposomes and 0.7 ml of the hydrophilic liquid phase in a centrifuge tube are pipetted, the first emulsion, which forms the heavier phase in the present exemplary embodiment, first and then very carefully the hydrophilic liquid phase, which forms the lighter phase in the present exemplary embodiment, so that a phase boundary forms on which can enrich the DPPC, without forming an organogel.
  • the filling of the Zentri ⁇ joint tube is expediently held in the pre-cooled centrifuge.
  • the centrifuge tube filled according to step (d) above is finally centrifuged at 4000 g (corresponding to approximately 39000 m / s 2 ) at a centrifuge temperature of -3 ° C for 30 to 60 minutes, the pre-liposomes from the first emulsion or are transferred from their first liquid (perfluoroperhydrophenanthrene) through the phase boundary into the liquid phase (15 mM PP in water) and the DPPC enriched at the phase boundary acts as the second (outer) monomolecular layer on the first (inner) monomolecular layer from DPPC to form the finished liposomes.
  • the hydrophilic liquid phase (15 mM PP in water) with the finished liposomes suspended therein is analyzed in order to determine the size of the liposomes thus produced.
  • TEM transmission electron microscopy
  • the hydrophilic liquid phase with the liposomes generated in it is added as a hydrophilic dye and the sample to be examined is applied to a copper grid and exposed to air and in dried in a desiccator.
  • the dried samples are by means of TEM analyzes, whereby the dye produces a negative color, ie the ammonium molybdate reduces the transmission in the purely hydrophilic areas; the liposomes remain bright.
  • FIG. 4 shows a TEM image of the liposomes produced in this way, which are spherical in shape and according to an analysis using photon correlation spectroscopy (PCS, Malvern Zetasizer Nano
  • ZS90 have a particle size of 305 nm ⁇ 46 nm, an average particle number of 257 ⁇ 17 kcounts / s (derived count rate) and a polydispersity index (PDI) of 0.915.
  • Viscumin (mistletoe extract) in 15 mM phosphate buffer in a bilayer from the lipid distearoylphosphatidylcholine (DSPC).
  • Active ingredient solution 10 pg / ml viscumin (active ingredient) in 15 mM
  • aqueous phosphate buffer (PP) hydrophilic solvent
  • Solubility DSPC in C14F24 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / 1 (detection limit).
  • the liposomes are produced analogously to
  • DPPC distearoylphosphatidylcholine
  • Viscumin (mistletoe extract) in 15 mM phosphate buffer in a layer of a mixture of the lipids dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) and cholesterol (cholesterol) in a molar ratio of 60:40.
  • DOPC lipids dioleoylphosphatidylcholine
  • cholesterol cholesterol
  • Active ingredient solution 10 pg / ml viscumin (active ingredient) in 15 mM
  • aqueous phosphate buffer (PP) hydrophilic solvent
  • Solubility cholesterol in C14F24 ⁇ IO 5 mol / 1 (detection
  • the liposomes are produced analogously to
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DOPC dioleoylphosphatidylcholine
  • 60:40 dioleoylphosphatidylcholine
  • Example 4 Preparation of symmetrical liposomes from pyranine (8-hydroxy-1,3,5-pyrentrisulfonic acid trisodium salt (HPTS) in 15 mM phosphate buffer in a bilayer from a mixture of egg lecithin with a phosphatidylcholine content of 80% ( E80) and cholesterol (cholesterol) in a mol ratio of 60:40.
  • HPTS 4-hydroxy-1,3,5-pyrentrisulfonic acid trisodium salt
  • Active ingredient marker solution pyranine (8-hydroxy-l, 3,5-pyrentrisulfonic acid trisodium salt (HPTS) (surrogate) in 15 mM aqueous phosphate buffer (PP) (hydrophilic solvent),
  • First amphiphilic compound egg lecithin with a phosphate idylcholine content of 80%
  • the drug marker HPTS (surrogate) is dissolved in 15 mM aqueous phosphate buffer (PP) as a hydrophilic solvent to provide the hydrophilic drug marker solution.
  • the first emulsion is prepared analogously to step (b) according to Example 1, with the proviso that the first amphiphilic compound instead of 150 mM DPPC 150 mM is a mixture of E80 and cholesterol in a molar ratio of 60:40 mol%. is used.
  • the first emulsion with the pre-liposomes is aliquoted to volumes of 30 ml.
  • step (c) Analogous to step (c) according to Example 1, 15 mM aqueous phosphate buffer (PP) corresponding to the solvent of the active substance marker solution is provided as the hydrophilic liquid phase.
  • PP aqueous phosphate buffer
  • the volumes of 30 ml of the first emulsion with the pre-liposomes aliquoted according to step (b) above are used uncooled at room temperature and according to the subsequent step (e) in a flow-operated, continuous centrifuging device, as explained in detail above with reference to FIG. 3, brought into contact with the hydrophilic liquid phase, a phase boundary being formed, on which the mixture of E80 and cholesterol can accumulate without forming an organogel.
  • the dead volume of the continuous centrifuge at 333 g (corresponding to approximately 3300 m / s 2 ) is obtained by continuous injection of approx.
  • the pre-liposomes being made from the first emulsion or from whose first liquid (perfluoroperhydrophenanthrene) is transferred through the phase boundary into the liquid phase (15 mM PP in water) and the E80 / cholesterol enriched at the phase boundary becomes the second (external) monomo- lecular layer attaches to the first (inner) monomolecular layer of E80 / cholesterol to form the finished liposomes.
  • the total volumes of both phases are approximately 30 ml.
  • the hydrophilic liquid phase (15 mM PP in water) with the finished liposomes suspended therein is examined analogously to Example 1 by means of photon correlation spectroscopy (PCS) in order to determine the size of the liposomes produced in this way.
  • the liposomes produced in this way are spherical in shape and have an average particle size of 254 nm ⁇ 3 nm and a particle number of 645 kcounts / s ⁇
  • Viscumin in 15 mM phosphate buffer in a layer consisting of on the one hand a mixture of egg lecithin with a phosphatidylcholine content of 80% (E80) and cholesterol (cholesterol) in a molar ratio of 60:40 (inner monomolecular layer) and on the other hand a mixture of egg lecithin with a phosphatidylcholine content of 80% (E80) and cholesterol in a molar ratio of 80:20 (outer monomolecular layer).
  • Active ingredient solution 10 pg / ml viscumin (active ingredient) in 15 mM
  • aqueous phosphate buffer (PP) hydrophilic solvent
  • First amphiphilic compound egg lecithin with a phosphate idylcholine content of 80%
  • Second amphiphilic compound egg lecithin with a phosphate idylcholine content of 80%
  • Solubility E80 in C14F24 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / 1 (detection limit),
  • the active ingredient viscumin is dissolved in a concentration of 10 pg / ml in 15 mM aqueous phosphate buffer (PP) as a hydrophilic solvent to make the hydrophilic
  • the first emulsion is prepared analogously to step (b) according to Example 1, with the proviso that the first amphiphilic compound instead of 150 mM DPPC is 150 mM a mixture of E80 and cholesterol in a molar ratio of 60:40 mol%. is used, so that the first emulsion of 1% (v / v) hydrophilic active ingredient solution (viscumin in 15 mM aqueous PP) in the first hydrophobic liquid (perfluoroperhydrophenanthrene) with 1.5 mM total portion of the first amphi- phile compound (E80 and cholesterol in the ratio of 60:40 mol%).
  • the first amphiphilic compound instead of 150 mM DPPC is 150 mM a mixture of E80 and cholesterol in a molar ratio of 60:40 mol%.
  • pre-liposomes from the drug solution drops with a monomolecular layer of E80 / cholesterol in a molar ratio of 60:40 mol% (disperse phase of the first emulsion) in perfluoroper-hydrophenanthrene (first liquid, hydrophobic as a continuous phase of the first Emulsion) with a mean particle size of 376 nm ⁇ 22 nm, a particle number of 482 kcounts / s ⁇ 35 kcounts / s (derived count rate) and a polydispersity index (PDI) of 1.0.
  • PDI polydispersity index
  • the first emulsion with the pre-liposomes is aliquoted to volumes of 30 ml.
  • E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol% as the second amphiphilic compound is dissolved in ethanol in a round bottom flask, after which the ethanol is completely evaporated by means of a rotary evaporator and subsequent storage of the round bottom flask in a desiccator, so that the second amphiphilic compound as dry film remains in the round-bottom flask.
  • the hydrophilic liquid phase of 15 mM aqueous PP is now added to the round bottom flask with the E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol% to a mixture of 150 mM E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol% (second amphiphilic compound) in 15 mM aqueous PP (hydrophilic liquid phase).
  • the E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol% detaches in the hydrophilic active ingredient solution as a result of swelling from the glass wall of the round bottom flask and forms polydisperse amphiphilic aggregates, which are comminuted by mechanical processing.
  • Two alternative methods can be used:
  • the hydrophilic liquid phase (15 mM aqueous PP) with the suspended aggregates of E80 / cholesterol in a mol ratio of 80:20 mol% (second amphiphilic compound)
  • the hydro is now used to produce the second emulsion phobic second liquid (perfluoroperhydrophenanthrene) with a volume fraction of about 1%.
  • the perfluoroperhydrophenanthrene is dispersed as a disperse phase using ultrasound (Hielscher UP 200S) for 10 seconds with a cycle component of 100% and an amplitude of 50%, followed by 30 minutes with a cycle component of 75% and an amplitude of 60%, without Cooling suspended so that the second emulsion of 1% (v / v) hydrophobic second liquid (perfluoroper hydrophenanthrene) in the hydrophilic liquid phase (15 mM aqueous PP) with a total of 1.5 mM of the second th amphiphilic compound (E80 and cholesterol in a ratio of 80:20 mol%).
  • ultrasound Hielscher UP 200S
  • amphiphile carriers are made from the perfluoroperhydrophenanthrene drops with a monomolecular layer of the second amphiphilic compound E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol% (persistent phase of the second emulsion) in 15 mM aqueous PP ( liquid phase, hydrophilic as a continuous phase of the second emulsion) with an average particle size of 127 nm ⁇ 6 nm, a particle number of
  • the second emulsion with the amphiphile carriers is aliquoted to volumes of 30 ml.
  • the volumes of 30 ml of the first emulsion with the pre-liposomes aliquoted according to step (b) above are used uncooled at room temperature and according to step (e) below in a continuous flow centrifuging device. direction, as explained in detail above with reference to FIG. 3, with the aliquoted according to step (c) above of 30 ml of the second emulsion ⁇ th brought into contact with the amphiphile carriers, whereby a phase boundary forms between the continuous phases of the first and second emulsions, on which the mixture of E80 and cholesterol can accumulate without forming an organogel.
  • the dead volume of the continuous centrifuge at 1000 g (corresponding to about 9800 m / s 2 ) by continuous injection of about 13 ml of a side of the first emulsion (hydrophobic first liquid perfluoroperhydrophenanthrene with the pre-liposomes suspended therein) with a flow rate of approximately
  • the second emulsion (hydrophilic liquid phase 15 mM PP in water with the suspended amphiphile carriers).
  • both phases hydro phil / hydrophobic
  • the amphiphile-carriers from the second emulsion be the one hand in the centering of the phase boundary rifugalfeld continuously supplied to the second amphiphilic compound (E80 / cholesterol in a molar ratio of 80:20 mol%) continually imit scorching at the Pha ⁇ enrich.
  • the pre-liposomes from the first emulsion or from their first liquid (perfluoroperhydrophenanthrene) are transferred through the phase boundary into the liquid phase (15 mM PP in water), the second amphiphilic compound enriched at the phase boundary (E80 / Cho - Lesterol in a molar ratio of 80:20 mol%) as a second (outer) monomolecular layer attached to the first (inner) monomolecular layer from the first amphiphilic compound (E80 / cholesterol in a molar ratio of 60:40) to the finished liposomes to build.
  • the total volume of both phases (hydrophilic / hydrophobic) is approx. 30 ml.
  • the hydrophilic liquid phase (15 mM PP in water) with the finished - asymmetrical - liposomes suspended therein is analyzed analogously to Example 1 by means of PCS in order to determine the average size of the liposomes thus produced.
  • the liposomes produced in this way which have a different composition of the inner and outer monomolecular layers of their bishops, are spherical in shape and have a medium particle size. large of 367 nm ⁇ 61 nm, a particle number of

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen vorgeschlagen, welche eine mit einer Bischicht aus zwei monomolekularen Schichten aus amphiphilen Verbindungen verkapselte Wirkstofflösung aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen der Wirkstofflösung; (b) Bereitstellen einer Emulsion durch Emulgieren der Wirkstofflösung in einer mit deren Lösungsmittel nicht mischbaren ersten Flüssigkeit in Gegenwart der amphiphilen Verbindung unter Erhalt von Pre-Liposomen; (c) Bereitstellen einer mit der ersten Flüssigkeit der Emulsion nicht mischbaren flüssigen Phase; (d) Inkontaktbringen der Emulsion mit der flüssigen Phase unter Ausbildung einer Phasengrenze, um die amphiphile Verbindung hieran anzureichern; und (e) Zentrifugieren der über die Phasengrenze miteinander in Kontakt stehenden Emulsion und der flüssigen Phase, um die Pre-Liposomen aus der Emulsion in die flüssige Phase zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze die dort angereicherte amphiphile Verbindung unter Bildung einer monomolekularen, äußeren Schicht an die monmolekulare, innere Schicht der Pre-Liposomen angelagert wird, um die Bischicht zu erzeugen. Um die Bildung von Organogelen infolge übermäßiger Akkumulation der amphiphilen Verbindung an der Phasengrenze zu verhindern, sieht die Erfindung vor, dass die erste Flüssigkeit der Emulsion derart gewählt wird, dass die Löslichkeit der amphiphilen Verbindung in der ersten Flüssigkeit höchstens 1 x 10-4 mol/l beträgt.

Description

Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen, umfassend
- eine, insbesondere hydrophile, Lösung des Wirkstoffes
und
- wenigstens eine Bischicht aus zwei zumindest monomoleku laren Schichten aus wenigstens einer ersten amphiphilen Verbindung, insbesondere aus der Gruppe der Lipide, wobei die Wirkstofflösung durch die Bischicht verkapselt ist, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen einer, insbesondere hydrophilen, Wirk
stofflösung des zu verkapselnden Wirkstoffes, indem der Wirkstoff in wenigstens einem, insbesondere hydrophi len, Lösungsmittel gelöst wird;
(b) Bereitstellen einer ersten Emulsion durch Emulgieren der Wirkstofflösung gemäß Schritt (a) in wenigstens einer mit dem wenigstens einen Lösungsmittel der Wirk stofflösung nicht oder schlecht mischbaren, insbesonde re hydrophoben, ersten Flüssigkeit in Gegenwart der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung, um eine zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an die in der ersten Flüssigkeit emulgierten Tropfen der Wirkstoff lösung anzulagern;
(c) Bereitstellen einer mit der ersten Flüssigkeit der ers ten Emulsion gemäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase;
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion aus der ersten
Flüssigkeit mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung gemäß Schritt (b) mit der flüssigen Phase gemäß Schritt (c) unter Ausbildung einer Phasengrenze zwischen der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) und der flüssigen Phase gemäß Schritt (c) , wobei die wenigstens eine erste amphiphile Verbindung an dieser Phasengrenze angereichert wird; und
(e) Zentrifugieren der über die Phasengrenze miteinander in Kontakt stehenden ersten Emulsion gemäß Schritt (b) und der flüssigen Phase gemäß Schritt (c), um die Tropfen der in der ersten Emulsion enthaltenen Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung aus der ersten Flüssigkeit der ersten Emul sion gemäß Schritt (b) in die flüssige Phase gemäß Schritt (c) zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze die dort angereicherte, wenigstens eine erste amphiphile Verbindung unter Bildung einer zumin dest monomolekularen, äußeren Schicht derselben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung der Tropfen der Wirkstofflösung angelagert wird, um die Bischicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung - und folglich die fertigen Liposomen - zu erzeugen.
Unter Liposomen, welche auch als Vesikel bezeichnet wer den, versteht man Membranbläschen, welche in der Regel in einem hydrophilen, insbesondere wässrigen, Milieu kolloidal suspendiert vorliegen können und eine flüssige Phase ein schließen, wobei es sich bei der flüssigen Phase üblicher weise, wenn auch nicht notwendigerweise, um eine hydrophi le, zumeist wässrige Phase handelt. Die Membranhülle, wel che die flüssige Phase einschließt, ist aus einer Doppel- bzw. Bischicht aus zwei zumindest monomolekularen Schichten entweder aus je ein und derselben oder auch aus verschiede nen Molekülen gebildet, welche jeweils sowohl einen unpola ren, also hydrophoben bzw. lipophilen, Teil als auch einen polaren, also hydrophilen bzw. lipophoben, Teil aufweisen und aufgrund dieser Eigenschaften als amphiphil bezeichnet werden. Bei den hierbei als membranbildende Moleküle zum Einsatz gelangenden amphiphilen Verbindungen handelt es sich zumeist um Lipide, wie beispielsweise um Phospholipi de, Sphingolipide, Glycolipide, Fettsäuren oder derglei chen, wobei jedoch auch andere amphiphile Verbindungen als Membrankomponenten verwendet werden können, wie beispiels weise Lipopolysaccharide , Tocopherole, Squalene, Sterine bzw. Sterole, Cholesterole etc. Anlässlich der Erzeugung der Bischicht von Liposomen ordnen sich die amphiphilen Verbindungen entsprechend ihrer hydrophilen/hydrophoben Ei genschaften an, so dass die hydrophoben Teile der amphiphi len Verbindungen jeweils zueinander gerichtet, um einen möglichst geringen Kontakt zu der zu verkapselnden, z.B. hydrophilen bzw. wässrigen Phase, haben, wohingegen die hydrophilen Teile der amphiphilen Verbindungen zu der z.B. hydrophilen bzw. wässrigen Phase innerhalb und außerhalb des Liposoms gerichtet sind. Aufgrund des thermodynamischen Bestrebens, bei einer solchen Ausrichtung eine energetisch günstige Form mit einer möglichst geringen Oberfläche ein zunehmen, weisen Liposomen üblicherweise eine im Wesentli chen kugelförmige bzw. sphärische Form auf. Die amphiphilen Verbindungen, welche die Bischicht (en) der Membran von Lip osomen bilden, halten folglich lediglich durch nicht kova lente Bindungskräfte zusammen, weshalb die Membran einen vornehmlich fluiden Charakter besitzt.
In Ergänzung zur üblichen wissenschaftlichen Verwendung der Bezeichnung "Liposom" oder des hiermit synonymen Be griffs "Vesikel" umfassen Liposomen im Rahmen der vorlie- genden Offenbarung auch kolloidchemischen Aggregate in Form von Nanokapseln aus jeglichen amphiphilen Substanzen, Poly merliposomen, Lipidnanopartikel und Mischungen solcher Ag gregatbildungen mit reinen Liposomen. Daher werden derarti ge kolloidchemische Aggregate im Rahmen der vorliegenden Offenbarung stets mit einbezogen, auch wenn nur der Begriff "Liposom" verwendet wird.
Die Größe und die genaue Form von Liposomen hängen maß geblich vom chemischen Aufbau der die Bischicht (en) ihrer Membran bildenden amphiphilen Verbindung (en) ab sowie von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu verkap selnden, üblicherweise hydrophilen bzw. wässrigen Phase, wie z.B. deren Ionenstärke, pH-Wert, Osmolalität und der gleichen, und dem jeweiligen Herstellungsverfahren. Liposo men können dabei einerseits nur eine einzige Bischicht be sitzen, wobei solche Liposomen als unilamellar ("unilamel- lare Vesikel", ULV) bezeichnet werden, oder sie können meh rere, jeweils konzentrisch angeordnete Bischichten aufwei sen, wobei solche Liposomen als multilamellar ("multilamel lare Vesikel", MLV) bezeichnet werden. Der mittlere Durch messer beträgt dabei in der Regel zwischen etwa 20 nm und etwa 100 pm, insbesondere zwischen etwa 25 nm und etwa 30 pm.
Wie bereits erwähnt, können die die Bischicht (en) der Membran von Liposomen bildenden amphiphilen Verbindungen je nach angestrebtem pharmakodynamischem Wirkprofil, pharmako kinetischem Verhalten, chemischen und physikalischen Eigen schaften, wie beispielsweise Größe, Größenverteilung, La- mellarität, Fluidität, Permeabilität, Zetapotential, Pha senübergangstemperatur der Membran etc., aus denselben oder aus unterschiedlichen Molekülen, z.B. aus der Gruppe der Lipide, gebildet sein, wobei die Bischicht einerseits aus derselben amphiphilen Verbindung oder aus denselben Mi- schungen mehrerer amphiphilen Verbindungen aufgebaut sein kann, oder die einzelnen, zumindest monomolekularen Schich ten der Bischicht können jeweils aus unterschiedlichen am phiphilen Verbindungen oder aus Mischungen von unterschied lichen amphiphilen Verbindungen aufgebaut sein. Während man im erstgenannten Fall von symmetrischen Liposomen spricht (die zumindest monomolekularen Schichten der Bischicht der Membran sind von demselben Aufbau, wobei die Moleküle der Schichten hinsichtlich ihres polaren und unpolaren Teils aber entgegengesetzt zueinander ausgerichtet sind) , spricht man im letztgenannten Fall von asymmetrischen Liposomen (die zumindest monomolekularen Schichten der Bischicht der Membran sind von unterschiedlichem Aufbau, wobei die Mole küle der Schichten hinsichtlich ihres polaren und unpolaren Teils wiederum entgegengesetzt zueinander ausgerichtet sind) .
Während Liposomen beispielsweise auch für Untersuchungen der biophysikalischen Eigenschaften von Biomembranen Ver wendung finden können, kommen sie vornehmlich im kosmeti schen sowie insbesondere im medizinischen Bereich zum Ein satz. Dabei ist es insbesondere möglich, durch die liposo- male Formulierung von Wirkstoffen, wie Arzneimitteln und dergleichen, empfindliche Wirkstoffe nach der Applikation vor einer möglichen Metabolisierung zu schützen und gezielt an die Zellen des Organismus' heranzuführen, wo der Wirk stoff seine Wirkung entfalten soll, so dass etwaige Neben wirkungen des liposomal formulierten Wirkstoffes verringert und die Wirksamkeit erhöht werden kann, um niedrigere Dosen des Wirkstoffes verabreichen zu können. Darüber hinaus kann durch die Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen die Plasmahalbwertszeit erhöht werden. Der Wirkstoff liegt hierbei in dem Liposom üblicherweise in Form einer zumeist hydrophilen, insbesondere wässrigen oder beispielsweise auch alkoholischen, Wirkstofflösung vor. Vornehmlich hydro phile Wirkstoffe können dabei mehr oder minder vollständig in die Liposomen eingekapselt sein, während vornehmlich li- pophile Stoffe eher in die Bischicht der amphiphilen Ver bindung (en) eingebaut werden.
Demzufolge spielen Liposomen in der modernen Pharmazie, Kosmetik und Lebensmitteltechnologie eine bedeutende Rolle als Transportvehikel für pharmazeutische oder andersartige Wirkstoffe, zur Verbesserung der Hautfeuchtigkeit oder Wirkstoffaufnähme bzw. für hochwertige Lebensmittelzusätze. Weitere, lediglich exemplarisch genannte Einsatzgebiete von Liposomen umfassen die gezielte Arzneistoff-Zuführung
("Drug Delivery"), die synthetische Chemie allgemein, nano- skalige Reaktionskammern sowie allgemeine technologische Entwicklungen in den Bereichen der Energie, Optik, Elektro nik, Mikrofluidik, Kolloidchemie, Biosensorik oder artver wandte Gebiete, in welchen Liposomen Verwendung finden kön nen .
Liposomen können darüber hinaus mit einer Polymer schicht, z.B. auf der Basis von Polyethylenglykol (PEG), überzogen und/oder kann zumindest die amphiphile Verbindung der äußeren Schicht der die Membran bildenden Bischicht (en) mit einem solchen Polymer modifiziert sein, wobei man in diesem Fall von "PEGylierten Liposomen" spricht. Die Poly merschicht dient dabei zum sterischen Schutz der Membran und sie schützt und verringert eine Markierung (Opsonie- rung) und Eliminierung durch das Immunsystem, wodurch die Liposomen länger im Organismus zirkulieren und sich z.B. in Tumorgewebe anreichern können. Während, wie oben bereits erwähnt, die Pharmakokinetik von der Natur der Liposomen, insbesondere von den die Bischicht (en) ihrer Membran bil denden amphiphilen Verbindung ( en ) und kaum mehr von der Na tur des verkapselten Wirkstoffes selbst beeinflusst wird, lässt sich das sogenannte Drug Targeting durch eine solche PEGylierung weiter optimieren, was z.B. für die Tumorthera pie eine maximale Anreicherung der Wirkstoffe im Tumorgewe be bedeutet. Aus diesem Grunde werden gegenwärtig viele Chemotherapeutika als liposomale Formulierungen appliziert (z.B. DaunoXome®, DepoCyt®, Doxil®/Caelyx® arqibo®, Mepact®, Myocet®) , um durch die Anreicherung im Zielgewebe die the rapeutischen Wirkungen zu erhöhen, die Nebenwirkungen durch die verringerte Freisetzung in gesundem Gewebe und Organen aber gleichzeitig zu verringern.
Bisherige kommerzielle Herstellungstechniken von Liposo men beruhen im Wesentlichen auf den folgenden drei alterna¬ tiven Verfahren:
a) den Homogenisierungsmethoden, bei welchen zunächst Roh liposomen erzeugt und diese anschließend mechanisch auf eine einheitliche Größe gebracht werden;
b) der Detergensdialyse; und
c) der Ethanol-Injektionsmethode.
Den Verfahren unter obiger Ziffer b) und c) ist gemeinsam, dass durch Hilfsstoffe die Löslichkeit der die Bischicht bildenden amphiphilen Verbindungen, wie z.B. Phospholipi den, in wässrigen Lösungen verbessert wird und es durch Ab trennung oder Verdünnung der Hilfsstoffe zur Bildung der Bischichten kommt, welche sich zu geschlossenen Liposomen formen .
Allen bisher entwickelten, kommerziellen Herstellungs techniken für Liposomen ist gemein, dass bei der Einkapse lung der üblicherweise hydrophile bzw. wässrige oder gege benenfalls auch alkoholische Innenraum identisch mit dem Außenraum ist. Bei einer üblichen Einkapselungskapazität von ca. 1 bis 15 % bedeutet dies, dass 99 bis 85% des Wirk stoffs nachträglich aus dem Außenraum entfernt und vorzugs weise wiederverwendet werden müssen. Eine nachträgliche Be- ladung ("Remote Loading") der Liposomen mittels thermischer Methoden oder pH-Gradienten ist nur für bestimmte Wirkstof fe möglich und bringt andere Nachteile mit sich, wie z.B. verringerte Lagerstabilitat , zusätzliche Bearbeitungs schritte und dergleichen. Darüber hinaus werden eine Viel zahl von biogenen pharmazeutischen Wirkstoffen, insbesonde re Proteine, durch diese Methoden denaturiert.
Eine weitere Unzulänglichkeit der bisher entwickelten, kommerziellen Herstellungsverfahren stellt die Uniformität der Membran dar, d.h. die Innen- und Außenseite der Bi- schicht sind identisch; bei den erzeugten Liposomen handelt es sich folglich um symmetrische Liposomen. Bei allen na türlich vorkommenden, biogenen Membranen sind die Innen- und Außenseiten der Membran jedoch stets unterschiedlich, was sowohl im Hinblick auf ihre Lipid- als auch auf ihre Proteinkomposition gilt. Die Asymmetrie biologischer Memb ranen besitzt eine wichtige physiologische Funktion für verschiedene zelluläre Erkennungs- und Transportmechanis men. Entsprechend wäre die uneingeschränkte Manipulierbar keit der Zusammensetzung der Innen- und Außenseite von Liposomenmembranen wünschenswert, z.B. für die Anlagerung von Wirkstoffen auf der Innenseite und von sterischen
Schutzschichten oder Rezeptoren auf der Außenseite, was derzeit nur durch nachträgliche Bearbeitungsschritte einge schränkt möglich ist.
Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass unter dem Begriff "Monoschicht" üblicherweise monomolekulare Schichten von amphiphilen bzw. grenzflächenaktiven Verbin dungen, z.B. von Lipiden verstanden werden, wobei sich ein Emulsionstropfen, welcher nur über eine monomolekulare bzw. einfache Schicht aus einer amphiphilen Verbindung oder aus einer Gruppe von amphiphilen Verbindungen verfügt, von Li posomen dadurch unterscheidet, dass letztere wenigstens ei- ne Bischicht aus zwei zumindest monomolekularen Schichten amphiphiler Verbindungen aufweisen, deren polare und unpo lare Bereiche in den die Bischicht bildenden Monoschichten jeweils entgegengesetzt zueinander orientiert sind. In Er gänzung zu dieser Definition sind im Rahmen der vorliegen den Offenbarung mit dem Begriff "Monoschicht" stets auch alle Substanzen und Substanzklassen angesprochen, welche in der Lage sind, dünne Schichten zu bilden, wie z. B. Polyme re und Proteine, was insbesondere auch dann gilt, wenn die se Substanzklassen und Substanzen gegebenenfalls mehr als eine einzige Molekülschicht umfassen oder umfassen können. Analog ist unter "Bischicht" im Rahmen der vorliegenden Of fenbarung stets auch die Zusammenfügung zweier Monoschich ten im obigen Sinne zu verstehen. Unter " Pre-Liposomen" sind im Rahmen der vorliegenden Offenbarung Emulsionstrop fen zu verstehen, welche über eine monomolekulare bzw. ein fache Schicht aus einer amphiphilen Verbindung oder aus ei ner Gruppe von amphiphilen Verbindungen verfügen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Möglichkeit, Mono schichten aus amphiphilen Verbindungen zu einer Bischicht zu synthetisieren und durch Zentrifugalkräfte zu Liposomen abzuschnüren, ist grundsätzlich aus dem Stand der Technik bekannt .
So beschreiben H. Träuble und E. Grell: "The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles", Neuroscience Research Program Bulletin, 9, 373-3801 (1971) ein Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, wobei in einem Schritt (a) ei ne wässrige Wirkstofflösung bereitgestellt wird, welche in einem Schritt (b) in einer hiermit nicht bzw. schlecht mischbaren Phase in Gegenwart von mehreren amphiphilen Ver bindungen in Form von Lipiden dispergiert wird, so dass sich zumindest eine der amphiphilen Verbindungen als eine monomolekulare Schicht an die emulgierten Tropfen der Wirk stofflösung anlagert, also Pre-Liposomen im Sinne der vor liegenden Offenbarung bildet. Ferner wird in einem Schritt (c) eine mit der kontinuierlichen Phase der Emulsion nicht bzw. schlecht mischbare flüssige - hier wässrige - Phase bereitgestellt und werden die derart erzeugten Pre-Liposo- men durch Zentrifugalkräfte aus der Emulsion in die wässri ge Phase überführt. Beim Phasendurchtritt umgeben sich die Pre-Liposomen mit einer zweiten Monoschicht aus wenigstens einer der amphiphilen Verbindungen, welche an der Phasen grenze angereichert worden ist, so dass unter Erhalt einer Bischicht das Liposom bzw. das Vesikel erzeugt wird. Wäh rend sich das Verfahren zweifellos zur Erzeugung von sym metrischen Liposomen eignet, wird in dem Aufsatz die Vermu tung aufgestellt, dass es hierdurch auch möglich ist, Lipo somen mit einer asymmetrischen Zusammensetzung der aus den verschiedenartigen ersten amphiphilen Verbindungen konsti tuierten Bischicht zu bilden, jedoch keine Nachweise für die Durchführbarkeit dieser Idee geliefert. Das ungelöste Problem dieses Konzeptes besteht nämlich darin, dass die amphiphilen Verbindungen, welche die Phasengrenzen von a) den dispergierten Tropfen und b) der Phasengrenze zwischen den beiden nicht mischbaren Phasen belegen, nicht voneinan der getrennt werden können. Aufgrund einer fehlenden Ab trennung können die amphiphilen Verbindungen somit alle Grenzflächen durch Diffusion erreichen, wodurch keine hin reichende Asymmetrie der Bischicht erreicht werden kann.
Ein weiteres Problem dieses Konzeptes besteht insbesondere in der Eigenschaft fast aller amphiphiler Verbindungen, wie z.B. Phospholipiden und dergleichen, gemeinsam mit einer organischen und einer wässrigen Phase sogenannte Organogele zu bilden (vgl. hierzu z.B. auch P. L. Luisi, R. Scartazzi- ni, G. Haering, P. Schurtenberger : "Organogels from water- in-oil microemulsions Colloid Polym Sei, 268: 356-374
(1990)) Diese Organogele reichern sich an der Phasengrenze zwischen der organischen und der wässrigen Phase an und bilden eine zunehmend schwerer zu überwindende Sperr schicht, welche den Phasendurchtritt behindert.
Eine Weiterentwicklung des oben beschriebenen Verfahrens von Träuble und Grell stellt das Verfahren gemäß dem Auf satz von S. Pautot, B. J. Frisken, D. A. Weitz: "Enginee ring asymmetric vesicles", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 100 : 10718-10721 (2003a) dar, wel ches auf dem von Träuble und Grell konzipierten Verfahren beruht, aber dieses um eine organische Zwischenphase erwei tert, welche während des Zentrifugationsschrittes zwischen der Emulsion, welche die bereits mit einer monomolekularen Schicht aus zumindest einer amphiphilen Verbindung versehe nen Pre-Liposomen enthält, und der wässrigen Phase, in wel che die Pre-Liposomen unter Anlagerung der zweiten monomo lekularen Schicht aus zumindest einer amphiphilen Verbin dung überführt werden, vorhanden ist. Diese Zwischenphase ist zwar mit der organischen Wasser-in-Öl-Emulsion mit den Pre-Liposomen mischbar, aber aufgrund ihrer Dichtedifferenz im Zentrifugalfeld separierbar und enthält zumindest eine amphiphile Verbindung der äußeren Schicht der Bischicht, welche folglich von der amphiphilen Verbindung der inneren Monoschicht mehr oder minder getrennt ist. Durch die Zwi schenphase entsteht auf diese Weise eine hinreichende Dif fusionsgrenze für die amphiphilen Verbindungen an den
Grenzschichten, womit die Bildung asymmetrischer Bischich- ten möglich ist. Allerdings besteht auch hier das Problem einer Ausbildung von Organogelen, insbesondere an der Pha sengrenze zwischen der wässrigen Phase und der Zwischenpha se. Überdies besteht insbesondere aufgrund dessen, dass die mit der (inneren) Monoschicht aus zumindest einer amphiphi- len Verbindung versehenen Pre-Liposomen die Zwischenphase passieren müssen, bevor sich hieran die (äußere) Mono schicht der weiteren amphiphilen Verbindung anlagern kann, die Gefahr einer Kontamination der Liposomen mit der orga nischen Zwischenphase, welche nachträglich praktisch nicht beseitigt werden kann. Schließlich eignet sich das Verfah ren gemäß Pautot et al. nicht für die Bildung von asymmet rischen Bischichten, bei welchen an einer Seite an die hyd rophilen Kopfgruppen weitere hydrophile Konjugate, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) gebunden sind, weil gemäß dem Ver fahren die zum Einbau in die äußere Monoschicht dienenden amphiphilen Verbindungen zuerst in der organischen Phase gelöst werden müssen, was die Löslichkeit von Konjugaten mit großen hydrophilen Molekülanteilen einschränkt.
Alle genannten Verfahren sind neben den beschriebenen ungelösten Problemen in der vorgestellten Form ferner noch nicht geeignet, um in einem kontinuierlichen Prozess ange wandt zu werden, um sie dadurch im industriellen Maßstab in wirtschaftlicher Weise großtechnisch einsetzen zu können.
Im Prinzip beruhen die Verfahren alle darauf, eine hydro phobe Phase gemeinsam mit einer wässrigen Phase zu zentri fugieren. Zum Abschluss des Herstellungsprozesses der Lipo somen sind die beiden Phasen so zu separieren, dass die wässrige Phase als Produkt genutzt und die hydrophobe Phase als Hilfsstoff für die Durchführung des Prozesses wieder verwendet werden kann.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Ver fahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen auf einfache und kostengünstige Weise unter zumindest weitest gehender Vermeidung der vorgenannten Nachteile dahingehend weiterzubilden, dass die Ausbildung von Organogelen aus den die Bischicht der Membran bildenden amphiphilen Verbindun gen minimiert wird und es somit möglich ist, zwei monomole- kulare Schichten amphiphiler Verbindungen zu einer Bi- schicht zusammenzuführen, wobei insbesondere eine kontinu¬ ierliche Herstellung von Liposomen ermöglicht sein sollte.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird diese Auf gabe bei einem Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass die erste Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß
Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslichkeit der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung in der ers ten Flüssigkeit höchstens 1 x IO-4 mol/1 beträgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht folglich vor, dass zunächst in einer als solcher bekannten Weise in einem Schritt (a) ein oder mehrere zu verkapselnde (r) Wirk stoff (e) in einem Lösungsmittel oder in einem Lösungsmit telgemisch gelöst werden, um eine Wirkstofflösung des we nigstens einen zu verkapselnden Wirkstoffes zu erzeugen.
Bei dem wenigstens einen Lösungsmittel kann es sich, wenn gleich nicht notwendigerweise, insbesondere um ein hydro philes Lösungsmittel handeln, wobei sich in der Praxis vor nehmlich physiologisch unbedenkliche Lösungsmittel auf wässriger Basis einschließlich Wasser, wie beispielsweise isotonische Lösungen, und/oder auf alkoholischer Basis, insbesondere auf Basis von Ethanol, anbieten können.
In einem Schritt (b) wird diese Wirkstofflösung sodann unter Erhalt einer ersten Emulsion in einer mit dem wenigs tens einen Lösungsmittel der Wirkstofflösung nicht oder schlecht mischbaren ersten Flüssigkeit oder mit einer Mi schung aus solchen ersten Flüssigkeiten in Gegenwart einer oder mehrerer ersten amphiphilen Verbindung (en) emulgiert, so dass eine zumindest monomolekulare innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an die in der ersten Flüssigkeit emulgierten Tropfen der Wirkstofflö sung angelagert wird. Auf diese Weise werden folglich zu- nächst Pre-Liposomen i Sinne der vorliegenden Offenbarung erzeugt, deren monomolekulare Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung die innere Schicht der Bi- schicht der in den nachfolgenden Schritten zu erzeugenden Liposomen bildet. Die mittlere Tropfengröße und -Verteilung dieser ersten Emulsion und folglich der mittlere Durchmes ser der Pre-Liposomen bzw. der hieraus zu erzeugenden Lipo somen kann dabei in üblicher Weise z.B. durch entsprechen den Eintrag mechanischer Kräfte, wie z.B. Scherkräfte, bei der Erzeugung der ersten Emulsion eingestellt und in brei ten Intervallen variiert werden. Während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden vermag sich die wenigstens eine, zur Pre-Liposomen- bzw. Membranbildung be fähigte erste amphiphile Verbindung dann als (innere) Mono schicht diffusiv an der Phasengrenze zwischen den Wirk stofflösungstropfen und der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion auszubilden. Sofern es sich bei der Wirkstofflö sung um eine üblicherweise hydrophile, z.B. wässrige und/oder alkoholische, Lösung handelt, handelt es sich bei der bzw. den ersten Flüssigkeit (en) um hiermit nicht oder nur sehr schlecht mischbare hydrophobe Flüssigkeiten. Bei der ersten amphiphilen Substanz kann es sich insbesondere um Lipide, wie z.B. um Phospholipide und dergleichen, oder auch um beliebige andere, zur Erzeugung von Liposomen be kannte amphiphile Verbindungen bzw. um Gemische solcher Verbindungen einschließlich jenen der eingangs genannten Art handeln.
Neben der Bereitstellung dieser ersten Emulsion mit den Pre-Liposomen aus in der inneren Schicht der wenigstens ei nen ersten amphiphilen Verbindung eingeschlossenen Tropfen der Wirkstofflösung wird in einem Schritt (c) ferner eine mit der ersten Flüssigkeit dieser ersten Emulsion, d.h. mit deren kontinuierlicher Phase, nicht oder schlecht mischbare flüssige Phase bereitgestellt, wobei es sich bei dieser flüssigen Phase insbesondere um eine hydrophile Phase han¬ deln kann, sofern die wenigstens eine erste Flüssigkeit der die Pre-Liposomen enthaltenden ersten Emulsion, also deren kontinuierliche Phase, hydrophob ist.
Sobald die (innere) monomolekulare Schicht der wenigs tens einen ersten amphiphilen Verbindung bei der gemäß dem obigen Schritt (b) erzeugten ersten Emulsion eine Mindest dichte erreicht hat, mit welcher sie eine Bischicht zu bil den vermag, wird in einem darauffolgenden Schritt (d) so dann die erste Emulsion aus der ersten Flüssigkeit mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung mit der hie ran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren
Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung, also mit den im obigen Schritt (b) erzeugten Pre-Liposomen, mit der flüssigen Phase gemäß dem obigen Schritt (c) unter Ausbildung einer Phasengrenze zwischen dieser ersten Emul sion und dieser flüssigen Phase in Kontakt gebracht, wobei die wenigstens eine erste amphiphile Verbindung an dieser Phasengrenze angereichert wird.
In einem abschließenden Schritt (e) erfolgt schließlich das Zentrifugieren der ersten Emulsion gemäß dem obigen Schritt (b) und der hiermit über die Phasengrenze in Kon takt stehenden flüssigen Phase gemäß dem obigen Schritt (c) , um die Tropfen der in der ersten Emulsion enthaltenen Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest mo nomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung, also den in der obigen Weise vorge fertigten Pre-Liposomen, aus der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion in die flüssige Phase zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze die dort angereicherte, we nigstens eine erste amphiphile Verbindung unter Bildung ei ner zumindest monomolekularen, äußeren Schicht derselben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung der Tropfen der Wirk stofflösung angelagert wird, um die Bischicht aus den bei den zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens ei nen ersten amphiphilen Verbindung zu erzeugen. Die Pre- Liposomen aus den Tropfen der Wirkstofflösung mit der hie ran angelagerten monomolekularen (inneren) Schicht der ers ten amphiphilen Verbindung werden folglich im Zentrifugal kraftfeld aufgrund ihrer Dichtedifferenz aus der ersten, insbesondere hydrophoben, Flüssigkeit der ersten Emulsion, also aus deren kontinuierlicher Phase, zu der über die Pha sengrenze an diese angrenzende, insbesondere hydrophile, flüssige Phase bewegt. An dieser Phasengrenze wird dann kontinuierlich die wenigstens eine erste amphiphile Verbin dung oder zumindest einige Vertreter mehrerer erster amphi philer Verbindungen als monomolekulare (äußere) Schicht an die Pre-Liposomen angelagert, um die fertigen, mit einer Bischicht versehenen Liposomen zu bilden. Dabei nähern sich die beiden zumindest monomolekularen (inneren und äußeren) Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbin dung zunächst so dicht aneinander an, dass sie aufgrund von, insbesondere hydrophoben, Wechselwirkungen zwischen den amphiphilen Verbindungen der Monoschichten die fertige Bischicht mit praktisch frei einstellbarer Komposition der inneren und äußeren Seite bilden. Sodann werden die einge kapselten Tropfen der Wirkstofflösung aus der ersten Emul sion aufgrund der Dichtedifferenz so stark gegen die neuge bildete Bischicht gedrückt, dass sich letztere deformiert und schließlich den gesamten Wirkstofflösungstropfen umgibt, welcher sich schließlich von der Bischicht ab schnürt und von der Phasengrenze abreißt, so dass durch die Umhüllung mit einer Bischicht der Wirkstofflösungstropfen in ein Liposom transformiert wird. Dabei wurde erfindungsgemäß überraschenderweise gefun den, dass die Bildung eines Organogels infolge einer über mäßigen Anreicherung der wenigstens einen ersten amphiphi len Verbindung an der Phasengrenze zwischen der ersten Emulsion und der hiermit in Kontakt stehenden flüssigen Phase in wirksamer Weise dadurch verhindert werden kann, dass die erste Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß dem obigen Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslich keit der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung in der ersten Flüssigkeit höchstens etwa 1 x IO-4 mol/1, vor zugsweise höchstens etwa 0,5 x IO-4 mol/1, höchst vorzugs weise höchstens etwa 1 x IO-5 mol/1, insbesondere höchstens etwa 1 x 10 6 mol/1, beispielsweise höchstens etwa 1 x 10~7 mol/1, beträgt. Es bildet sich erfindungsgemäß folglich keine "Sperrschicht" aus der wenigstens einen ersten amphi philen Verbindung an der Phasengrenze aus, welche die Pha sengrenze blockieren und damit die Bildung von Liposomen aus den Wirkstofflösungstropfen beim Durchtritt durch die Phasengrenze verhindern könnte, so dass eine hohe Ausbeute an mit einer Bischicht aus der wenigstens einen ersten am phiphilen Verbindung versehenen Liposomen erhalten und der Wirkungsgrad des Verfahren somit in erheblicher Weise ver bessert wird, indem der Ausschuss an Wirkstofflösung, wel cher aus wirtschaftlichen Gründen zurückgewonnen werden sollte, minimiert wird.
Im Hinblick darauf, dass auf diese Weise zwar eine ein wandfreie Erzeugung von symmetrischen Liposomen sicherge stellt wird, die Erzeugung von asymmetrischen Liposomen aber nur bedingt möglich ist (vgl. insbesondere die obigen Ausführungen in Bezug auf den Aufsatz von Träuble et al.), schlägt die Erfindung gemäß einem zweiten Aspekt ein Ver fahren zur Herstellung von Liposomen vor, welches sich in gleicher Weise sowohl zur Erzeugung von symmetrischen Lipo- somen (die erste amphiphile Verbindung bzw. die ersten am phiphilen Verbindungen ist/sind mit der zweiten amphiphilen Verbindung bzw. mit den zweiten amphiphilen Verbindungen identisch) als auch insbesondere zur Erzeugung von asymmet rischen Liposomen (die erste amphiphile Verbindung bzw. die ersten amphiphilen Verbindungen ist/sind von der zweiten amphiphilen Verbindung bzw. von den zweiten amphiphilen Verbindungen verschieden) anbietet. Ein solches Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen, umfassend
- eine, insbesondere hydrophile, Lösung des Wirkstoffes
und
- wenigstens eine Bischicht aus zwei zumindest monomoleku laren Schichten aus wenigstens einer ersten amphiphilen Verbindung und wenigstens einer zweiten amphiphilen Ver bindung, insbesondere jeweils aus der Gruppe der Lipide, wobei die Wirkstofflösung durch die Bischicht verkapselt ist, umfasst die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen einer, insbesondere hydrophilen, Wirk
stofflösung des zu verkapselnden Wirkstoffes, indem der Wirkstoff in wenigstens einem, insbesondere hydrophi len, Lösungsmittel gelöst wird;
(b) Bereitstellen einer ersten Emulsion durch Emulgieren der Wirkstofflösung gemäß Schritt (a) in wenigstens einer mit dem wenigstens einen Lösungsmittel der Wirk stofflösung nicht oder schlecht mischbaren, insbesonde re hydrophoben, ersten Flüssigkeit in Gegenwart der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung, um eine zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an die in der ers ten Flüssigkeit emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung anzulagern;
(c) Bereitstellen einer Mischung aus einer mit der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphi philen Verbindung;
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion aus der ersten
Flüssigkeit mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung gemäß Schritt (b) mit der Mischung aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung gemäß Schritt (c) unter Ausbildung einer Phasengrenze zwischen der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) und der Mischung gemäß
Schritt (c) , wobei zumindest die wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung an dieser Phasengrenze angerei chert wird; und
(e) Zentrifugieren der über die Phasengrenze miteinander in Kontakt stehenden ersten Emulsion gemäß Schritt (b) und der Mischung gemäß Schritt (c) , um die Tropfen der in der ersten Emulsion enthaltenen Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbin dung aus der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) in die flüssige Phase der Mischung gemäß Schritt (c) zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze die dort angereicherte, wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung unter Bildung einer zumindest monomolekularen, äußeren Schicht derselben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der we nigstens einen ersten amphiphilen Verbindung der Trop fen der Wirkstofflösung angelagert wird, um die Bi- schicht aus den beiden zumindest monomolekularen
Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Ver bindung und der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung - und folglich die fertigen Liposomen - zu erzeugen .
Entsprechend dem obigen Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 wird bzw. werden also wiederum zunächst in als solcher bekannter Weise in einem Schritt (a) ein oder mehrere zu verkapselnde ( r) Wirkstoff (e) in einem Lösungs mittel oder in einem Lösungsmittelgemisch gelöst, um eine Wirkstofflösung des wenigstens einen zu verkapselnden Wirk stoffes zu erzeugen. Bei dem wenigstens einen Lösungsmittel kann es sich auch in diesem Fall, wenngleich nicht notwen digerweise, insbesondere um ein hydrophiles Lösungsmittel handeln, wobei sich in der Praxis vornehmlich physiologisch unbedenkliche Lösungsmittel auf wässriger Basis einschließ lich Wasser bzw. isotonischen Lösungen sowie beispielsweise auch alkoholische Lösungsmittel, insbesondere auf Basis von Ethanol, anbieten können.
In einem Schritt (b) wird - insoweit wiederum analog zu dem obigen Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 - diese Wirkstofflösung sodann unter Erhalt einer ersten Emulsion in einer mit dem wenigstens einen Lösungsmittel der Wirkstofflösung nicht oder schlecht mischbaren ersten Flüssigkeit oder mit einer Mischung aus solchen ersten Flüssigkeiten in Gegenwart einer oder mehrerer ersten am phiphilen Verbindung (en) emulgiert, so dass eine zumindest monomolekulare innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an die in der ersten Flüssigkeit emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung angelagert wird.
Auf diese Weise werden wiederum zunächst Pre-Liposomen im Sinne der vorliegenden Offenbarung erzeugt, deren monomole kulare Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Ver bindung die innere Schicht der Bischicht der in den nach folgenden Schritten zu erzeugenden Liposomen bildet. Auf grund dessen, dass die erste Emulsion jedoch nur die we- nigstens eine erste amphiphile Verbindung der inneren Mono¬ schicht der Bischicht enthält, wird die Bildung von Pre- Liposomen, welche (auch) die wenigstens eine für die äußere Monoschicht der Bischicht vorgesehene, zweite amphiphile Verbindung enthalten, zuverlässig vermieden, so dass be reits insoweit eine größtmögliche Asymmetrie der Bischicht erzielt werden kann. Die mittlere Tropfengröße und -Vertei lung dieser ersten Emulsion und folglich der mittlere
Durchmesser der Pre-Liposomen bzw. der hieraus zu erzeugen den Liposomen kann dabei gleichfalls in üblicher Weise z.B. durch entsprechenden Eintrag mechanischer Kräfte, wie z.B. Scherkräfte, bei der Erzeugung der ersten Emulsion einge stellt und in breiten Intervallen variiert werden. Während eines Zeitraumes von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden vermag sich die wenigstens eine, zur Pre-Liposomen- bzw. Membranbildung befähigte erste amphiphile Verbindung dann als (innere) Monoschicht diffusiv an der Phasengrenze zwi schen den Wirkstofflösungstropfen und der ersten Flüssig keit der ersten Emulsion auszubilden. Sofern es sich bei der Wirkstofflösung um eine üblicherweise hydrophile, z.B. wässrige und/oder alkoholische, Lösung handelt, handelt es sich bei der bzw. den ersten Flüssigkeit (en) um hiermit nicht oder nur schlecht mischbare hydrophobe Flüssigkeiten. Bei der ersten amphiphilen Substanz kann es sich wiederum insbesondere um Lipide, wie z.B. um Phospholipide und der gleichen, oder auch um beliebige andere, zur Erzeugung von Liposomen bekannte amphiphile Verbindungen bzw. um Gemische solcher Verbindungen einschließlich jenen der eingangs ge nannten Art handeln.
Neben der Bereitstellung dieser ersten Emulsion mit den Pre-Liposomen aus in der inneren Schicht der wenigstens ei nen ersten amphiphilen Verbindung eingeschlossenen Tropfen der Wirkstofflösung wird nun in einem Schritt (c) ferner eine mit der ersten Flüssigkeit dieser ersten Emulsion, d.h. mit deren kontinuierlicher Phase, nicht oder schlecht mischbare Mischung bereitgestellt, wobei diese Mischung aus einer mit der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß dem obigen Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren flüs sigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung gebildet ist. In Abweichung zu dem Verfahren ge mäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 wird folglich nicht le diglich eine flüssige Phase, sondern eine Mischung aus ei ner solchen flüssigen Phase mit der wenigstens einen zwei ten amphiphilen Verbindung bereitgestellt , welche im Rahmen der nachfolgenden Verfahrensschritte die zumindest monomo lekulare äußere Schicht der Bischicht der zu erzeugenden Liposomen bildet, wobei die wenigstens eine zweite amphip hile Verbindung folglich räumlich getrennt von der wenigs tens einen ersten amphiphilen Verbindung gehalten wird, welche in der ersten Emulsion vorliegt und dort die zumin dest monomolekulare innere Schicht der dort emulgierten Pre-Liposomen bildet. Aufgrund dessen, dass diese Mischung nur die wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung der äußeren Monoschicht der Bischicht enthält, wird die Bildung von Pre-Liposomen, welche (auch) die wenigstens eine für die innere Monoschicht der Bischicht vorgesehene, erste am phiphile Verbindung enthalten, weitestgehend vermieden, so dass auch insoweit eine größtmögliche Asymmetrie der Bi schicht erzielt werden kann. Bei der flüssigen Phase dieser Mischung handelt es sich wiederum insbesondere um eine hyd rophile Phase, sofern die wenigstens eine erste Flüssigkeit der die Pre-Liposomen enthaltenden ersten Emulsion, also deren kontinuierliche Phase, hydrophob bzw. die Wirkstoff lösung hydrophil ist.
Sobald die (innere) monomolekulare Schicht der wenigs tens einen ersten amphiphilen Verbindung bei der gemäß dem obigen Schritt (b) erzeugten ersten Emulsion eine Mindest dichte erreicht hat, mit welcher sie später eine Bischicht zu bilden vermag, wird in einem darauffolgenden Schritt (d) sodann die erste Emulsion mit den hierin emulgierten Trop fen der Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zumin dest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung, also mit den im obigen
Schritt (b) erzeugten Pre-Liposomen, mit der Mischung aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphi philen Verbindung gemäß dem obigen Schritt (c) unter Aus bildung einer Phasengrenze zwischen dieser ersten Emulsion und dieser Mischung in Kontakt gebracht, wobei zumindest die wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung an dieser Phasengrenze angereichert wird. Eine etwaige Anreicherung auch eines Überschusses an der wenigstens einen ersten am phiphilen Verbindung aus der ersten Emulsion an der Phasen grenze kann dabei auf einfache Weise zumindest weitestge hend verhindert werden, indem die wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung der Mischung im Überschuss zugesetzt wird und/oder die wenigstens eine erste amphiphile Verbin dung der ersten Emulsion mit einem Anteil zugesetzt wird, welcher etwa dem Anteil entspricht, welcher sich an die dort emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung als innere Mo noschicht anzulagern vermag.
In einem abschließenden Schritt (e) erfolgt schließlich wiederum das Zentrifugieren der über die Phasengrenze mit einander in Kontakt stehenden ersten Emulsion gemäß dem obigen Schritt (b) und der Mischung gemäß dem obigen
Schritt (c), um die Tropfen der in der ersten Emulsion ent haltenen Wirkstofflösung mit der hieran angelagerten, zu mindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens ei nen ersten amphiphilen Verbindung, also den in der obigen Weise vorgefertigten Pre-Liposomen im Sinne der vorliegen- den Offenbarung, aus der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion in die flüssige Phase der Mischung zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze die dort angereicher te, wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung unter Bil dung einer zumindest monomolekularen, äußeren Schicht der selben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung der Tropfen der Wirkstofflösung angelagert wird, um die Bischicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigs tens einen ersten und zweiten amphiphilen Verbindung zu er zeugen. Die Pre-Liposomen aus den Tropfen der Wirkstofflö sung mit der hieran angelagerten monomolekularen (inneren) Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung werden folglich in analoger Weise im Zentrifugalkraftfeld aufgrund ihrer Dichtedifferenz aus der ersten, insbesondere hydrophoben, Flüssigkeit der ersten Emulsion, also aus de ren kontinuierlicher Phase, zu der über die Phasengrenze an diese angrenzende, insbesondere hydrophile, flüssige Phase der Mischung bewegt. An dieser Phasengrenze wird dann kon tinuierlich die wenigstens eine zweite amphiphile Verbin dung als monomolekulare (äußere) Schicht an die Pre-Liposo men angelagert, um die fertigen, mit einer Bischicht verse henen Liposomen zu bilden. Auch in diesem Fall nähern sich dabei die beiden zumindest monomolekularen (inneren und äu ßeren) Schichten der wenigstens einen ersten und der we nigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung zunächst so dicht aneinander an, dass sie aufgrund von, insbesondere hydrophoben, Wechselwirkungen zwischen den - selben (sofern symmetrische Liposomen erzeugt werden sollen) oder insbe sondere unterschiedlichen (sofern asymmetrische Liposomen erzeugt werden sollten) - ersten und zweiten amphiphilen Verbindungen der Monoschichten die fertige Bischicht mit praktisch frei einstellbarer Komposition der inneren und äußeren Seite bilden. Sodann werden die eingekapselten Tropfen der Wirkstofflösung aus der ersten Emulsion auf grund der Dichtedifferenz so stark gegen die neugebildete Bischicht gedrückt, dass sich letztere deformiert und schließlich den gesamten Wirkstofflösungstropfen umgibt, welcher sich schließlich von der Bischicht abschnürt und von der Phasengrenze abreißt, so dass durch die Umhüllung mit einer Bischicht der Wirkstofflösungstropfen in ein Lip osom transformiert wird. Wird als wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung dabei eine von der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung verschiedene Verbindung ge wählt, so lassen sich in einfacher Weise asymmetrische Lip osomen mit einem unterschiedlichen Aufbau der inneren und äußeren, zumindest monomolekularen Schicht ihrer Bischicht erzeugen .
Der Vollständigkeit halber sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass mit "nicht oder schlecht mischbar" in Be zug auf die (hydrophile) Wirkstofflösung mit der (hydropho ben) ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion bzw. in Bezug auf die (hydrophobe) erste Flüssigkeit der ersten Emulsion mit der (hydrophilen) flüssigen Phase bzw. mit der Mischung aus der (hydrophilen) flüssigen Phase und der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung eine hinreichend schlechte Mischbarkeit angesprochen ist, welche bei Verei nigung der vorgenannten Komponenten zur Bildung einer Pha sengrenze führt.
Um auch in diesem Fall die Bildung eines Organogels ins besondere der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbin dung infolge einer Anreicherung der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an der Phasengrenze zwischen der ersten Emulsion und der hiermit in Kontakt stehenden flüs sigen Phase der Mischung mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung in wirksamer Weise zu verhindern, sieht die Erfindung auch in diesem Fall in analoger Weise vor, dass die erste Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß dem obigen Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Lös¬ lichkeit der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung in der ersten Flüssigkeit höchstens etwa 1 x 10-4 mol/1, vorzugsweise höchstens etwa 0,5 x 10-4 mol/1, höchst vor zugsweise höchstens etwa 1 x 105 mol/1, insbesondere höchstens etwa 1 x 10~6 mol/1, beispielsweise höchstens et wa 1 x 10~7 mol/1, beträgt. Folglich bildet sich auch in diesem Fall keine "Sperrschicht" aus der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an der Phasengrenze aus, so dass eine hohe Ausbeute an mit einer Bischicht aus der we nigstens einen ersten amphiphilen Verbindung versehenen Li posomen erhalten und der Wirkungsgrad des Verfahren somit in erheblicher Weise verbessert wird, indem der Ausschuss an Wirkstofflösung, welcher aus wirtschaftlichen Gründen zurückgewonnen werden sollte, minimiert wird.
Um auch eine übermäßige Anreicherung der wenigstens ei nen zweiten amphiphilen Verbindung an der vorgenannten Pha sengrenze und folglich die Bildung eines Organogels aus derselben zu verhindern, kann es sich darüber hinaus insbe sondere anbieten, dass die erste Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslichkeit sowohl der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung als auch der wenigstens einen zweiten amphiphi len Verbindung in der ersten Flüssigkeit höchstens etwa 1 x 10 4 mol/1, vorzugsweise höchstens etwa 0,5 x 10~4 mol/1, höchst vorzugsweise höchstens etwa 1 x 105 mol/1, insbe sondere höchstens etwa 1 x 10 6 mol/1, beispielsweise höchstens etwa 1 x 107 mol/1, beträgt.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des sowohl zur Erzeugung von symmetrischen als auch insbesondere zur Er- zeugung von asymmetrischen Liposomen geeigneten Verfahrens der vorgenannten Art kann vorgesehen sein, dass
- als Mischung aus der, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Ver bindung gemäß Schritt (c) eine zweite Emulsion aus der flüssigen Phase und wenigstens einer hiermit nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophoben, zweiten Flüssigkeit mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung eingesetzt wird, indem die zweite Flüssigkeit in der flüssigen Phase in Gegenwart der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung emulgiert wird, um eine zumindest monomolekulare Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung an die in der flüssigen Phase emulgierten Tropfen der zweiten Flüssigkeit anzula gern und die zweite amphiphile Verbindung auf diese Weise an diesen Tropfen zu immobilisieren; und
- beim Zentrifugieren der über die Phasengrenze miteinander in Kontakt stehenden ersten Emulsion gemäß Schritt (b) und der in Form der zweiten Emulsion vorliegenden Mi schung gemäß Schritt (c) die Tropfen der zweiten Flüssig keit mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekula ren Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Ver bindung aus der flüssigen Phase der zweiten Emulsion fortwährend an die Phasengrenze zwischen der ersten Emul sion und der zweiten Emulsion überführt werden, um die wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung fortwährend an dieser Phasengrenze anzureichern.
Anstelle einer bloßen Mischung oder Suspension der we nigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung mit der flüs sigen Phase gemäß Schritt (c) wird folglich eine zweite Emulsion eingesetzt, indem die, insbesondere hydrophile, flüssige Phase dieser Mischung mit der wenigstens einen hiermit nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydro- phoben, zweiten Flüssigkeit emulgiert wird. Auf diese Weise lassen sich in der zweiten Emulsion - in entsprechender Weise wie in der ersten Emulsion - Emulsionstropfen erzeu¬ gen, welche aus den in der flüssigen Phase emulgierten Tropfen der zweiten Flüssigkeit und einer hieran angelager ten, zumindest monomolekularen Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung gebildet sind. Die wenigs tens eine zweite amphiphile Verbindung kann auf diese Weise immobilisiert werden und liegt folglich nicht mehr oder minder frei in einer bloßen Mischung bzw. Suspension vor. Wird diese zweite Emulsion gemäß dem Schritt (d) mit der ersten Emulsion unter Ausbildung einer Phasengrenze zwi schen deren kontinuierlichen Phasen miteinander in Kontakt gebracht, so werden bei der darauffolgenden Zentrifugation der ersten und der zweiten Emulsion entsprechend dem
Schritt (e) die Tropfen der zweiten Flüssigkeit mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung aus der flüssigen Phase der zweiten Emulsion fortwährend an die Phasengrenze zwischen der ersten Emulsion und der zweiten Emulsion überführt, so dass eine übermäßige Anreicherung der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung, ge schweige denn die Bildung eines Organogels aus derselben, an der Phasengrenze zuverlässig verhindert werden kann, weil die an den emulgierten Tropfen der zweiten Flüssigkeit immobilisierte, wenigstens eine zweite amphiphile Verbin dung auf diese Weise fortwährend der Phasengrenze zugeführt und an dieser Phasengrenze kontinuierlich angereichert wird, um sich beim Durchtritt der Tropfen aus der Wirk stofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest monomo lekularen (inneren) Schicht aus der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung durch die Phasengrenze hindurch als äußere Schicht an die innere Schicht anzulagern und die Bi- Schicht zu bilden. Darüber hinaus lassen sich auf diese Weise die erste und die zweite amphiphile Verbindung in idealer Weise voneinander getrennt halten (beide amphiphile Verbindung sind jeweils an Emulsionstropfen der nur über die Phasengrenze miteinander in Kontakt stehenden ersten und zweiten Emulsion angelagert und folglich immobili siert) , so dass höchst asymmetrische Liposomen erzeugt wer den können, sofern die zweite (n) amphiphile (n ) Verbin dung (en) von der/den ersten amphiphilen Verbindung ( en ) ver schieden gewählt ist/sind.
Die in der zweiten Emulsion emulgierten Tropfen aus der, insbesondere hydrophoben, zweiten Flüssigkeit mit der hier an angelagerten, zumindest monomolekularen Schicht aus der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung werden im Folgenden der Einfachheit halber auch als "Amphiphil-Trä ger" bezeichnet.
Die mit der, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase der zweiten Emulsion nicht oder schlecht mischbare, insbe sondere hydrophobe, zweite Flüssigkeit, welche den "Kern" der Amphiphil-Träger im Sinne der vorliegenden Offenbarung mit der hieran angelagerten, wenigstens einen zweiten am phiphilen Verbindung bildet, kann dabei vorteilhafterweise entsprechend der, insbesondere hydrophoben, ersten Flüssig keit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) gewählt werden, welche die kontinuierliche Phase der ersten Emulsion bil det. Entspricht die erste Flüssigkeit demnach der zweiten Flüssigkeit, so kann diese in problemloser Weise in stets gleichbleibender Zusammensetzung wiedergewonnen werden, nachdem während des Zentrifugierens die Amphiphil-Träger aus der zweiten Flüssigkeit und der hieran angelagerten, wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung die Phasen grenze zwischen der ersten Emulsion und der zweiten Emulsi on erreicht haben, die zweite amphiphile Verbindung an der Phasengrenze angereichert und als äußere Schicht an die Pre-Liposomen aus der Wirkstofflösung mit der hieran ange lagerten, wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung angelagert worden ist und die Tropfen aus der zweiten Flüs sigkeit der zweiten Emulsion über die Phasengrenze hinweg in - dieselbe - erste Flüssigkeit übergegangen sind.
Die in Form der zweiten Emulsion vorliegende Mischung mit den an den Amphiphil-Trägern immobilisierten, wenigs tens einen zweiten amphiphilen Verbindung gemäß dem Schritt (c) kann vorzugsweise dadurch erzeugt werden, indem
- zunächst eine Mischung aus der flüssigen Phase gemäß
Schritt (c) und der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung bereitgestellt wird; wonach
- die zweite Flüssigkeit in dieser Mischung unter Bildung der zweiten Emulsion emulgiert wird, indem die zweite Flüssigkeit in diese Mischung eindispergiert wird.
Auf diese Weise werden aus der in der Mischung der, insbe sondere hydrophilen, flüssigen Phase bereits enthaltenen, wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung in zuver lässiger und reproduzierbarer Weise Amphiphil-Träger im Sinne der vorliegenden Offenbarung gebildet, wenn die, ins besondere hydrophobe, zweite Flüssigkeit in diese Mischung eindispergiert wird und sich an deren Tropfen die zweiten amphiphile Verbindung anlagert.
In entsprechender Weise kann die erste Emulsion gemäß dem Schritt (b) in vorteilhafter Weise dadurch erzeugt wird, indem zunächst
- eine Mischung aus der Wirkstofflösung des zu verkapseln den Wirkstoffes gemäß Schritt (a) und der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung bereitgestellt wird; wonach
- diese Mischung unter Bildung der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) in der ersten Flüssigkeit emulgiert wird, in- dem die Mischung in die erste Flüssigkeit eindispergiert wird .
Für die Gleichmäßigkeit der Größe der Liposomen kann die Größenverteilung der ersten Emulsion dabei durch eine ent sprechende mechanische Zerkleinerung eingestellt werden.
Für die Minimierung der Größe der Wirkstofflösungstropfen und die Optimierung ihrer Monodispersität und folglich der Liposomen kann es von Vorteil sein, wenn mechanische Zer kleinerungsverfahren entweder kontinuierlich oder zyklisch angewandt werden, um den Energieeintrag durch eine Tempe rierung auszugleichen. Entsprechendes gilt für die etwaige Erzeugung der zweiten Emulsion (siehe oben) .
Wie bereits erwähnt, ist bei der Auswahl der ersten, insbesondere hydrophoben, Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) erfindungsgemäß dafür Sorge zu tragen, dass die Löslichkeit der wenigstens einen ersten amphiphi len Verbindung und vorzugsweise auch der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung höchstens etwa 1 x IO 5 mol/1 beträgt, so dass die Bildung von Organogelstrukturen an der Phasengrenze zwischen der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion und der, insbesondere hydrophilen, flüssi gen Phase oder der Mischung aus der, insbesondere hydrophi len, flüssigen Phase und der wenigstens einen zweiten am phiphilen Verbindung bzw. der zweiten Emulsion zuverlässig vermieden wird. Weist die Wirkstofflösung dabei einen hyd rophilen Charakter auf und liegt beispielsweise in wässri ger und/oder alkoholischer Form vor, wie es üblicherweise der Fall ist, so kann als erste Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) zweckmäßigerweise eine hydropho be Flüssigkeit eingesetzt, welche insbesondere aus der Gruppe der
- flüssigen, teilweise oder gänzlich halogenierten Kohlen wasserstoffe einschließlich der Fluorcarbone , - Silikonöle und
- Siloxane
einschließlich Mischungen hiervon gewählt wird, in welcher insbesondere praktisch alle amphiphilen Lipide die erfin¬ dungsgemäß nur sehr geringe Löslichkeit aufweisen. Fluo rierte oder perfluorierte Öle, d.h. Fluorcarbone , sind praktisch nicht mit Wasser oder anderen hydrophilen Flüs¬ sigkeiten mischbare Phasen, welche alle zur Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Eigenschaften mitbringen, wie bezüglich einer unterschiedlichen, insbe sondere erhöhten, Dichte gegenüber wässrigen und alkoholi¬ schen Medien, eines tiefe (re) n Gefrierpunktes (als wässrige und alkoholische Medien) , einer relativ geringen Viskosität und eben insbesondere der Vermeidung von gelbildenden In teraktionen mit amphiphilen Verbindungen einschließlich Li piden und einer hydrophilen, z.B. wässrigen und/oder alko holischen, Phase. Entsprechendes gilt für Silikonöle, womit polymerisierte Siloxane mit organischen Seitenketten in flüssiger Form angesprochen sind, und für Siloxane in flüs¬ siger Form, womit Verbindungen mit der allgemeinen Struktur
angesprochen sind, wobei jedes "R" ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe und "n" eine natürliche Zahl ist.
Nicht nur in diesem Fall wird als Lösungsmittel der Wirkstofflösung gemäß Schritt (a) folglich vorzugsweise ein hydrophiles Lösungsmittel, insbesondere auf wässriger Ba¬ sis, einschließlich Wasser, wie beispielsweise isotonische Lösungen, und/oder auf alkoholischer Basis, insbesondere auf Basis von Ethanol oder Glycerin bzw. Glycerol, einge¬ setzt . Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass
- die erste, insbesondere hydrophobe, Flüssigkeit der ers ten Emulsion aus der ersten Flüssigkeit mit den hierin emulgierten Tropfen der, insbesondere hydrophilen, Wirk stofflösung mit der hieran angelagerten, zumindest mono molekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass sie einen niedrigeren Schmelzpunkt aufweist als die Wirkstofflösung;
- die erste Emulsion gemäß Schritt (b) auf eine Temperatur zwischen dem Schmelzpunkt der, insbesondere hydrophoben, ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion und dem Schmelz punkt der, insbesondere hydrophilen, Wirkstofflösung ab gekühlt wird, um die in der ersten Flüssigkeit emulgier ten Tropfen der Wirkstofflösung mit der an diese angela gerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung gemäß Schritt (b) in den festen Zustand zu überführen; und sodann
- die erste Emulsion gemäß Schritt (b) im festen Zustand der Tropfen der Wirkstofflösung mit der mit der ersten, insbesondere hydrophoben, Flüssigkeit der ersten Emulsion gemäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren, insbe sondere hydrophilen,
• flüssigen Phase oder
• Mischung aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung
unter Ausbildung der Phasengrenze gemäß Schritt (d) in Kontakt gebracht wird und die über die Phasengrenze mit einander in Kontakt stehenden erste Emulsion gemäß
Schritt (b) und
• die flüssige Phase oder • die Mischung aus der flüssigen Phase mit der we nigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung
gemäß Schritt (e) zentrifugiert werden.
Hierbei bietet es sich vorteilhafterweise an, wenn die, insbesondere hydrophile, Wirkstofflösung mit der an diese angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung während des Zentrifugierens im festen Zustand gehalten wird, um sie aufgrund eines dadurch bedingten (zusätzlichen) Dichteun terschiedes von der Phasengrenze fort in Richtung der, ins besondere hydrophilen,
• flüssigen Phase oder
• Mischung aus der flüssigen Phase mit der wenigstens
einen zweiten amphiphilen Verbindung
zu bewegen.
Die erste Emulsion wird folglich vorzugsweise so stark abgekühlt, dass die, z.B. wässrigen und/oder alkoholischen, Wirkstofflösungstropfen einfrieren, die diese umgebende, insbesondere hydrophobe, erste Flüssigkeit, also die konti nuierliche Phase der ersten Emulsion, jedoch noch flüssig bleibt. Dies vermag dazu beizutragen, dass die Wirkstofflö sungstropfen mit der hieran angelagerten (inneren), zumin dest monomolekularen Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung an der Phasengrenze nicht übermäßig oder gar vollständig deformiert werden, ohne die Phasen grenze zu penetrieren und damit ihrerseits eine Sperr schicht an der Phasengrenze zu bilden. Wird dabei insbeson dere eine, insbesondere hydrophobe, erste Flüssigkeit aus gewählt, welche schwerer ist als die beispielsweise wässri gen und/oder alkoholischen Wirkstofflösungstropfen, so las sen sich die gefrorenen Wirkstofflösungstropfen infolge Zentrifugalkräften nicht nur einfacher bzw. schneller in der ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion bewegen, sondern auch in der, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase oder in der Mischung aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung bzw. in der zweiten Emulsion, nachdem ihr Durchtritt durch die Phasengrenze er folgt und die Umhüllung mit einer Bischicht unter Bildung der fertigen Liposomen stattgefunden hat, weil die gefrore nen Wirkstofflösungstropfen eine geringere Dichte besitzen als die, insbesondere hydrophile, nicht gefrorene flüssige Phase oder als die Mischung aus der nicht gefrorenen flüs sigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung, wobei diese flüssige Phase ebenso wie das Lö sungsmittel der Wirkstofflösungstropfen insbesondere wäss rig bzw. alkoholisch oder von Wasser gebildet sein kann. Zumindest die erste Emulsion sollte zu diesem Zweck vor zugsweise geringfügig unterhalb des Gefrierpunktes der Wirkstofflösungstropfen temperiert werden, damit diese in der sie umgebenden ersten Flüssigkeit der ersten Emulsion gefroren bleiben.
Wie bereits erwähnt, können die in ein Liposom einge- schlossenen Wirkstoffe durch die Bischicht aus amphiphilen Verbindungen, wie in Form einer Bischicht aus denselben oder unterschiedlichen Lipiden, auf dem Weg zu ihrem Be stimmungsort im Organismus gegen die zerstörende Wirkung von Enzymen und vor vorzeitiger Ausscheidung aus dem Körper geschützt werden. In manchen pharmazeutischen Produkten müssen die Liposomen allerdings auch durch eine oberflächi ge Polymerschicht, welche typischerweise auf der Basis von Polyethylenglykol (PEG) gebildet ist, geschützt werden, um die Opsonierung und Phagozytose durch Immunzellen, z.B. in der Leber, zu vermeiden, bevor der Wirkstoff an seinem Be stimmungsort angekommen ist. Mit Hilfe von Fremdmolekülen, wie beispielsweise Antikörpern, welche an das Äußere der Liposomen angeheftet werden, kann überdies versucht werden, den Bestimmungsort des Wirkstoffes durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor genau festzulegen ("Drug Targeting"). Dabei wird vermutet, dass Liposomen aufgrund ihrer zell membranähnlichen chemischen Beschaffenheit relativ leicht mit der Zellmembran oder, nach einer Pinocytose oder En- docytose, mit der Endosomen- und Lysosomenmembran ver schmelzen und sodann ihren Inhalt in das Zellinnere entlas sen. Demgemäß kann gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass die Bischicht aus
• den beiden zumindest monomolekularen Schichten der
wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung oder
• den beiden zumindest monomolekularen Schichten der
wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung und der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung, insbesondere ausschließlich die äußere, zumindest monomole kulare Schicht der Bischicht, durch Reaktion mit hydrophi len Polymerkonj ugaten modifiziert wird. Dies kann bei spielsweise einerseits dadurch geschehen, indem das fertig erzeugte Liposom derart modifiziert wird, dass solche Poly merkonjugate z.B. mittels elektrostatischer Aufladung der Bischicht an deren zumindest monomolekulare äußere Schicht angelagert werden. Insbesondere das erfindungsgemäße Ver fahren gemäß dem Anspruch 3 eröffnet darüber hinaus die Möglichkeit, dass für die zumindest monomolekulare, äußere Schicht der Bischicht wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung, z.B. in Form von Lipiden, eingesetzt wird, an welche zuvor die Polymerkonj ugate bereits angebunden worden sind.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren
- chargenweise in einer diskontinuierlichen Zentrifugier einrichtung, z.B. batchweise unter Einsatz von herkömm lichen Zentrifugenröhrchen; - semikontinuierlich in einer diskontinuierlichen Zentri-- fugiereinrichtung, z.B. gleichfalls batchweise, aber unter Zufuhr der ersten Emulsion und der hiermit nicht oder schlecht mischbaren flüssigen Phase oder der Mi schung bzw. zweiten Emulsion über einen Zeitraum hinweg; oder insbesondere auch
- kontinuierlich in einer im Durchfluss betriebenen, konti nuierlichen Zentrifugiereinrichtung
durchgeführt werden.
Im Falle einer chargenweisen Durchführung des Verfahrens in einer diskontinuierlichen Zentrifugiereinrichtung kann beispielsweise vorgesehen sein, dass einerseits die erste Emulsion gemäß Schritt (b) , andererseits die flüssige Phase oder die Mischung bzw. die zweite Emulsion gemäß Schritt (c) der Zentrifugiereinrichtung aufgegeben werden, wonach diese zentrifugiert werden, wonach der Zentrifugiereinrich tung einerseits die flüssige Phase mit den mit der Bi- schicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der amphiphilen Verbindung (en) versehenen Liposomen, ande rerseits die erste Flüssigkeit entnommen werden. Im Falle einer semikontinuierlichen Durchführung des Verfahrens in einer diskontinuierlichen Zentrifugiereinrichtung kann bei spielsweise vorgesehen sein, dass einerseits die erste Emulsion gemäß Schritt (b) , andererseits die flüssige Phase oder die Mischung bzw. die zweite Emulsion gemäß Schritt (c) der Zentrifugiereinrichtung über einen Zeitraum konti nuierlich aufgegeben und diese währenddessen zentrifugiert werden, wonach der Zentrifugiereinrichtung wiederum einer seits die flüssige Phase mit den mit der Bischicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der amphiphilen Verbindung (en) versehenen Liposomen, andererseits die erste Flüssigkeit entnommen werden. Wie weiter unten unter Bezug nahme auf die Zeichnungen noch näher erläutert, kann dar- über hinaus im Falle eine kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens in einer im Durchfluss betriebenen, kontinuier lichen Zentrifugiereinrichtung insbesondere vorgesehen sein, dass einerseits die erste Emulsion gemäß Schritt (b) , andererseits die flüssige Phase oder die Mischung bzw. die zweite Emulsion gemäß Schritt (c) der Zentrifugiereinrich tung kontinuierlich aufgegeben und zentrifugiert und der Zentrifugiereinrichtung einerseits die flüssige Phase mit den mit der Bischicht aus den beiden zumindest monomoleku laren Schichten der amphiphilen Verbindung ( en ) versehenen Liposomen, andererseits die erste Flüssigkeit kontinuier lich entnommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren - sei es zur Herstellung symmetrischer oder sei es zur Herstellung asymmetrischer Liposomen - bietet eine neuartige Möglichkeit, technisch relativ einfach und kostengünstig Liposomen herzustellen, welche insbesondere für die therapeutische Nutzung, darüber hinaus aber für alle anderen bekannten Nutzungen von Lipo somen, beispielsweise im Bereich der Nahrungsmittel oder auch der Kosmetik oder der Körperpflege, gleichermaßen ge eignet sind. Die Anordnung von unterschiedlichen, zumindest monomolekularen Monoschichten an der Phasengrenze zwischen einer ersten Emulsion, wie einer "Wasser-in Öl-Emulsion", und einer zweiten Emulsion, wie einer "Öl-in Wasser- Emul sion", erlaubt es ferner, diese beiden Monoschichten durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen z.B. Fettsäureketten zu einer stabilen Bischicht mit unterschiedlichen Eigen schaften der späteren inneren bzw. äußeren Schicht eines Liposoms zusammenzufügen, wobei sich die Substanzkompositi on der inneren und äußeren, zumindest monomolekularen
Schicht der Bischicht frei einstellen lässt, was neue Mög lichkeiten für die Funktionalität von Liposomen-Präpara- tionen eröffnet. Zusätzlich ermöglicht der Herstellungspro- zess eine hohe Einkapselungseffizienz, da durch die Erzeu gung einer Emulsion in einer nicht mischbaren umgebenden Phase ein vollständiger Einschluss des Wirkstoffs in den Emulsionstropfen möglich ist. Bei der Umhüllung des Emulsi onstropfens mit einer zweiten Monoschicht für die Einkapse lung von Wirkstoffen in das dadurch neu erzeugte Liposom treten nur geringe Verluste des Wirkstoffes in den Umge bungsbereich des Liposoms nach dessen Herstellung auf, so dass eine hohe Nutzungsrate der üblicherweise teuren Wirk stoffe erzielt werden kann. Durch das Volumenverhältnis von hydrophiler und hydrophober Phase sowie durch das Mengen verhältnis der membranbildenden amphiphilen Verbindungen, z.B. in Form von Phospholipiden, können die Voraussetzungen für die Bildung von Liposomen in der gewünschten Größe und Konzentration geschaffen werden, wobei vorteilhafterweise ein entsprechender Überschuss an amphiphilen Verbindungen gewährleistet werden sollte, damit sich eine ausreichende Grenzflächendichte an amphiphilen Verbindungen an der Pha sengrenze einstellt, was erfindungsgemäß jedoch nicht in der Ausbildung eines Organogels resultiert.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispie len unter Bezugnahme auf die Zeichnungen. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine stark schematisiert dargestellte Ansicht zur
Veranschaulichung der Erzeugung von im Wesentli chen symmetrischen Liposomen mittels einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfah rens zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposo men;
Fig. 2 eine stark schematisiert dargestellte Ansicht zur
Veranschaulichung der Erzeugung von im Wesentli- chen asymmetrischen Liposomen mittels einer zwei ten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ver fahrens zur Verkapselung von Wirkstoffen in Lipo¬ somen;
Fig . 3 eine schematische Querschnittsansicht des halben
Querschnitts einer Ausführungsform einer Zentri fugiereinrichtung zur kontinuierlichen Durchfüh rung eines Verfahrens zur Verkapselung von Wirk stoffen in Liposomen;
Fig . 4 eine transmissionselektronenmikroskopische Auf nahme von symmetrischen Liposomen aus einer
Wirkstofflösung aus 10 pg/ml des Mistelsxtraktes Viscumin in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer, wel che in einer Bischicht aus dem Lipid Dipalmitoyl- phosphatidylcholin (DPPC) verkapselt ist, herge stellt gemäß dem Ausführungsbeispiel 1;
Fig . 5 eine transmissionselektronenmikroskopische Auf nahme von symmetrischen Liposomen aus einer
Wirkstofflösung aus 10 pg/ml des Mistelextraktes Viscumin in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer, wel che in einer Bischicht aus dem Lipid Distearoyl- phosphatidylcholin (DSPC) verkapselt ist, herge stellt gemäß dem Ausführungsbeispiel 2; und
Fig . 6 eine transmissionselektronenmikroskopische Auf nahme von symmetrischen Liposomen aus einer
Wirkstofflösung aus 10 pg/ml des Mistelsxtraktes Viscumin in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer, wel- in einer Bischicht aus den Lipiden Dioleoyl- phosphatidylcholin (DOPC) und Cholesterol in einem Molverhältnis von 60:40 verkapselt ist, hergestellt gemäß dem Ausführungsbeispiel 3. In der Fig. 1 ist eine Situation während der Bildung von vornehmlich symmetrischen Liposomen gemäß einer ersten Aus führungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verkap selung von Wirkstoffen in Liposomen L anhand einer vergrö ßerten Detailansicht in stark schematisierter Weise wieder gegeben. Dabei ist in dem rechten Ausschnitt der Fig. 1 ein Tropfen, z.B. mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,1 pm und etwa 200 pm, aus einer Wirkstofflösung 1 erkennbar, zu deren Erzeugung der Wirkstoff zuvor gemäß Schritt (a) in einem Lösungsmittel gelöst worden ist. Bei dem Lösungsmit tel handelt es sich im vorliegenden Fall z.B. um ein hydro philes Lösungsmittel auf wässriger und/oder alkoholischer Basis .
Wie des Weiteren in dem rechten Ausschnitt der Fig. 1 erkennbar, hat sich an den Tropfen aus der Wirkstofflösung 1 unter Bildung eines Pre-Liposoms M eine monomolekulare (innere) Schicht aus einer ersten amphiphilen Verbindung 2, wie beispielsweise einem Lipid, angelagert, wobei sich die polaren Bereiche der ersten amphiphilen Verbindung 2 in Richtung der hydrophilen Wirkstofflösung 1 und die unpola ren Bereiche in Richtung einer den Tropfen der Wirkstofflö sung 1 umgebenden, mit dessen Lösungsmittel nicht oder nur schlecht mischbaren - hier: hydrophoben - ersten Flüssig keit 3 ausgerichtet haben. Zur Erzeugung einer derart ge bildeten ersten Emulsion 4, deren disperse Phase von den Tropfen der hydrophilen Wirkstofflösung 1 und deren konti nuierliche Phase von der hydrophoben ersten Flüssigkeit 3 gebildet ist, ist zuvor gemäß Schritt (b) z.B. zunächst ei ne Mischung aus der Wirkstofflösung 1 und der ersten amphi philen Verbindung 2 erzeugt worden, wonach diese Mischung unter Erhalt der ersten Emulsion 4 in die erste Flüssigkeit 3 eindispergiert worden ist. Die - hydrophobe - erste Flüs sigkeit 3, bei welcher es sich im vorliegenden Fall bei- spielsweise um einen flüssigen halogenierten Kohlenwasser stoff in Form eines oder mehrerer Fluorcarbone handelt, ist dabei derart ausgewählt worden, dass die Löslichkeit der ersten amphiphilen Verbindung 2 kleiner als 10~4 mol/1
- hier: kleiner als 10 5 mol/1 - beträgt (siehe hierzu wei ter unten) . Ferner ist die erste Flüssigkeit 3 vorzugsweise auch derart ausgewählt worden, dass sie einen geringeren Schmelzpunkt aufweist als die in der ersten Emulsion 4 emulgierte Wirkstofflösung 1 (siehe hierzu ebenfalls weiter unten) . Die - hydrophobe - erste Flüssigkeit 3 besitzt fer ner eine unterschiedliche Dichte als die Wirkstofflösung 1, wobei das im vorliegenden Fall eingesetzte Fluorcarbon eine höhere Dichte aufweist als die wässrige und/oder alkoholi sche Wirkstofflösung 1. Indes kann selbstverständlich grundsätzlich auch eine gegenüber der Wirkstofflösung 1 "leichtere" erste Flüssigkeit 3, also eine solche mit dem gegenüber geringerer Dichte, eingesetzt werden.
Wie aus dem linken Ausschnitt der Fig. 1 hervorgeht, ist darüber hinaus gemäß Schritt (c) eine mit der ersten Flüs sigkeit 3 der ersten Emulsion 4 nicht oder schlecht misch bare - hier hydrophile - flüssige Phase 5 bereitgestellt worden, welche beispielsweise entsprechend dem Lösungsmit tel der Wirkstofflösung 1 gewählt werden und folglich z.B. gleichfalls wässrig und/oder alkoholisch sein kann.
Wie des Weiteren aus beiden Ausschnitten der Fig. 1 er sichtlich, ist nun die erste Emulsion 4 aus der ersten, hydrophoben Flüssigkeit 3 mit den hierin emulgierten Pre- Liposomen M aus den Tropfen der Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten, monomolekularen (inneren) Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 gemäß Schritt (b) mit der flüssigen, hydrophilen Phase 5 in Kontakt gebracht worden, woraufhin sich zwischen der ersten Flüssigkeit 3, also der kontinuierlichen Phase der ersten Emulsion 4, und der flüs- sigen Phase 5 aufgrund deren schlechter Mischbarkeit mitei nander eine Phasengrenze 6 ausgebildet hat. Die erste am phiphile Verbindung 2, welche der ersten Emulsion 4 zu die sem Zweck im Überschuss zugesetzt worden ist, hat sich da bei an dieser Phasengrenze 6 angereichert, wobei aufgrund deren erfindungsgemäß geringen Löslichkeit in der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 gleichwohl kein Organo- gel infolge übermäßiger Akkumulierung der ersten amphiphi len Verbindung 2 an der Phasengrenze 6 gebildet worden ist, sondern diese nur eine oder wenige Molekülschichten ein nimmt .
Schritt (e) des Verfahrens sieht schließlich eine Zent rifugation der über die Phasengrenze 6 miteinander in Kon takt stehenden ersten Emulsion 4 und der flüssigen Phase 5 vor, um die Tropfen der in der ersten Emulsion 4 enthalte nen Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten monomole kularen inneren Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 in Richtung der Pfeile Pi aus der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 durch die Phasengrenze 6 mit den dort an gereicherten Molekülen der ersten amphiphilen Verbindung 2 hindurch in die flüssige Phase 5 zu überführen, wobei beim Passieren der Phasengrenze 6 die erste amphiphile Verbin dung 2 unter Bildung einer weiteren monomolekularen - äuße ren - Schicht derselben an die monomolekulare innere
Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 der Tropfen der Wirkstofflösung 1 angelagert wird, um die Bischicht aus zwei monomolekularen Schichten der ersten amphiphilen Ver bindung 2 zu erzeugen, d.h. um aus den Pre-Liposomen M fer tige Liposomen L zu bilden. Die äußere Schicht der Bi schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 weist dabei ei ne entgegengesetzte Orientierung wie die innere Schicht auf, d.h. die unpolaren Bereiche der ersten amphiphilen Verbindung 2 der äußeren Schicht weisen in Richtung der po- laren Bereiche der inneren Schicht, also in Richtung der nun in einem Liposom L verkapselten hydrophilen Wirkstoff lösung 1, während die polaren Bereiche der äußeren Schicht der Bischicht in Richtung der das Liposom L umgebenden - hydrophilen - flüssigen Phase 5 weisen.
Da die Pre-Liposo en M aus den Tropfen der (hydrophilen) Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten inneren
Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 eine geringere Dichte besitzen als die sie umgebende (hydrophobe) erste Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4, erfahren sie im Zent rifugalfeld eine in Richtung der Pfeile Pi wirkende Kraft, welche sie in zentripetaler Richtung beschleunigt und an die Phasengrenze 6 bringt, welche mit einer weitestgehend monomolekularen Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 belegt ist. Gegen diese, an der Phasengrenze 6 angereicher te Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 wird das Pre-Liposo M so gedrückt, dass sich die an der Phasengren ze 6 angereicherte monomolekulare Schicht der ersten amphi philen Verbindung 2 an die an dem Tropfen der Wirkstofflö sung 1 angelagerte innere Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 anlegt und dabei durch hydrophobe Wechselwir kung aus zwei monomolekularen Schichten die Bischicht des fertigen Liposoms L entsteht, welches nach weiterer Bewe gung in Richtung der Pfeile Pi im Zentrifugalfeld in der (hydrophilen) flüssigen Phase 5 dispergiert vorliegt. Bei einer vornehmlich kugelförmigen bzw. sphärischen Umhüllung entsteht folglich aus dem Tropfen der Wirkstofflösung 1 bzw. aus dem Pre-Liposom M ein symmetrisches Liposom L, welches in der seine Membran bildenden Bischicht sowohl ei ne innere als auch eine äußere Schicht aus der ersten am phiphilen Verbindung 2 aufweist. Indes sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass anstelle einer (einzigen) ersten amphiphilen Verbindung 2 selbstverständlich auch ein Ge- misch solcher Verbindungen, z.B. ein Gemisch aus mehreren Lipiden, eingesetzt werden kann, welche dann jeweils die innere und äußere Schicht der Bischicht des Liposoms L bil den .
Nach mehr oder minder vollständiger Bildung der Liposo men L kann schließlich die flüssige Phase 5, in welcher die Liposomen L dispergiert vorliegen, von der ersten Flüssig keit 3 abgetrennt werden, was aufgrund der allenfalls sehr schlechten Mischbarkeit der hydrophilen flüssigen Phase 5 mit der hydrophoben ersten Flüssigkeit 3 sowie deren unter schiedlicher Dichte in einfacher Weise möglich ist.
Aus den oben genannten Gründen ist es darüber hinaus möglich, dass die erste Emulsion 4 auf eine Temperatur zwi schen dem Schmelzpunkt der (hydrophoben) ersten Flüssigkeit 3 und dem Schmelzpunkt der (hydrophilen) Wirkstofflösung 1 abgekühlt wird, um die Wirkstofflösung 1 der in der ersten Flüssigkeit 3 emulgierten Tropfen mit der an diese angela gerten, monomolekularen, inneren Schicht der ersten amphip hilen Verbindung 2 in den festen Zustand zu überführen, wo nach die erste Emulsion 4 im festen Zustand der Tropfen der Wirkstofflösung 1 mit der (hydrophilen) flüssigen Phase 5 unter Ausbildung der Phasengrenze 6 in Kontakt gebracht wird und die über die Phasengrenze 6 miteinander in Kontakt stehenden erste Emulsion 4 und die flüssige Phase 5, insbe sondere unter fortwährendem Halten der Tropfen der Wirk stofflösung 1 im festen Aggregatzustand, zentrifugiert wer den .
Ferner ist es bedarfsweise beispielsweise möglich, die fertigen Liposomen L mit Polymerkonjugaten, z.B. solchen auf der Basis von Polyethylenglykol (PEG), zu modifizieren, indem sie z.B. elektrostatisch an die erste amphiphile Ver bbindung 2 der äußeren Schicht der Bischicht angebunden werden (nicht gezeigt) . In der Fig. 2, in welcher der Fig. 1 entsprechende Kom ponenten mit denselben Bezugszeichen versehen sind, ist ei ne Situation während der Bildung von vornehmlich asymmetri schen Liposomen gemäß einer zweiten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verkapselung von Wirkstof fen in Liposomen L anhand einer vergrößerten Detailansicht in stark schematisierter Weise wiedergegeben. Dabei ist in dem rechten oberen Ausschnitt der Fig. 2 - insoweit analog dem rechten Ausschnitt der Fig. 1 - ein Tropfen, z.B. mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,1 pm und etwa 200 pm, aus einer Wirkstofflösung 1 erkennbar, zu deren Erzeugung der Wirkstoff zuvor gemäß Schritt (a) in einem Lösungsmittel gelöst worden ist. Bei dem Lösungsmittel handelt es sich im vorliegenden Fall z.B. um ein hydrophiles Lösungsmittel auf wässriger und/oder alkoholischer Basis.
Wie des Weiteren in dem rechten oberen Ausschnitt der Fig. 2 erkennbar, hat sich an den Tropfen aus der Wirk- stofflösung 1 unter Bildung eines Pre-Liposoms M eine mono molekulare (innere) Schicht aus einer ersten amphiphilen Verbindung 2, wie beispielsweise einem Lipid, angelagert, wobei sich die polaren Bereiche der ersten amphiphilen Ver bindung 2 in Richtung der hydrophilen Wirkstofflösung 1 und die unpolaren Bereiche in Richtung einer den Tropfen der Wirkstofflösung 1 umgebenden, mit dessen Lösungsmittel nicht oder nur schlecht mischbaren - hier: hydrophoben - ersten Flüssigkeit 3 ausgerichtet haben. Zur Erzeugung ei ner derart gebildeten ersten Emulsion 4, deren disperse Phase von den Tropfen der hydrophilen Wirkstofflösung 1 und deren kontinuierliche Phase von der hydrophoben ersten Flüssigkeit 3 gebildet ist, ist zuvor gemäß Schritt (b) z.B. zunächst eine Mischung aus der Wirkstofflösung 1 und der ersten amphiphilen Verbindung 2 erzeugt worden, wonach diese Mischung unter Erhalt der ersten Emulsion 4 in die erste Flüssigkeit 3 eindispergiert worden ist. Die - hydro¬ phobe - erste Flüssigkeit 3, bei welcher es sich im vorlie genden Fall beispielsweise um einen flüssigen halogenierten Kohlenwasserstoff in Form eines oder mehrerer Fluorcarbone handelt, ist dabei derart ausgewählt worden, dass die Lös lichkeit der ersten amphiphilen Verbindung 2 kleiner als 1CT4 mol/1 - hier: kleiner als 1CT5 mol/1 - beträgt (siehe hierzu weiter unten) . Ferner ist die erste Flüssigkeit 3 vorzugsweise auch derart ausgewählt worden, dass sie einen geringeren Schmelzpunkt aufweist als die in der ersten Emulsion 4 emulgierte Wirkstofflösung 1 (siehe hierzu eben falls weiter unten) . Die - hydrophobe - erste Flüssigkeit 3 besitzt ferner eine unterschiedliche Dichte als die Wirk stofflösung 1, wobei das im vorliegenden Fall eingesetzte Fluorcarbon eine höhere Dichte aufweist als die wässrige und/oder alkoholische Wirkstofflösung 1. Indes kann selbst verständlich grundsätzlich auch eine gegenüber der Wirk stofflösung 1 "leichtere" erste Flüssigkeit 3, also eine solche mit demgegenüber geringerer Dichte, eingesetzt wer den .
Wie aus dem linken unteren Ausschnitt der Fig. 2 hervor geht, ist darüber hinaus gemäß Schritt (c) eine Mischung 7 aus einer mit der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 nicht oder schlecht mischbaren - hier hydrophilen - flüs sigen Phase mit einer zweiten amphiphilen Verbindung 8, beispielsweise wiederum in Form eines Lipides, bereitge stellt worden, wobei die flüssige Phase dieser Mischung 7 beispielsweise wiederum entsprechend dem Lösungsmittel der Wirkstofflösung 1 gewählt werden und folglich z.B. gleich falls wässrig und/oder alkoholisch sein kann. Bei der Mi schung 7 handelt es sich im vorliegenden Fall um eine zwei te Emulsion 9 aus der flüssigen Phase der Mischung 7 und einer hiermit nicht oder schlecht mischbaren - hier hydro- phoben - zweiten Flüssigkeit 10 und der zweiten amphiphilen Verbindung 8, welche dadurch erzeugt worden ist, dass die zweite (hydrophobe) Flüssigkeit 10 in der (hydrophilen) flüssigen Phase der Mischung 7 in Gegenwart der zweiten am phiphilen Verbindung 8 emulgiert worden ist, so dass die kontinuierliche Phase der zweiten Emulsion 9 von der (hyd rophilen) flüssigen Phase und die disperse Phase der zwei ten Emulsion 9 von der (hydrophoben) zweiten Flüssigkeit 10 gebildet ist, welche insbesondere entsprechend der (hydro phoben) ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 gewählt werden kann. Auf diese Weise wurde eine monomolekulare Schicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8 an die in der (hydrophilen) flüssigen Phase der Mischung 7 emulgierten Tropfen der (hydrophoben) zweiten Flüssigkeit 10 angelagert und die zweite amphiphile Verbindung 8 folglich unter Bil dung von Amphiphil-Trägern M' an diesen Tropfen immobili siert.
Wie des Weiteren aus allen vier Ausschnitten der Fig. 2 ersichtlich, ist nun die erste Emulsion 4 aus der ersten, hydrophoben Flüssigkeit 3 mit den hierin emulgierten Pre- Liposomen M aus den Tropfen der Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten, monomolekularen (inneren) Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 gemäß Schritt (b) mit der zweiten Emulsion 9 aus der hydrophilen flüssigen Phase mit den hierin emulgierten Amphiphil-Trägern M' aus den- Tropfen der hydrophoben zweiten Flüssigkeit 10 mit der hieran ange lagerten zweiten amphiphilen Verbindung 8 in Kontakt ge bracht worden, woraufhin sich zwischen der ersten Flüssig keit 3, also der kontinuierlichen Phase der ersten Emulsion 4, und der flüssigen Phase, also der kontinuierlichen Phase der zweiten Emulsion 9, aufgrund deren schlechter Mischbar keit miteinander eine Phasengrenze 6 ausgebildet hat . Die zweite amphiphile Verbindung 8, welche der zweiten Emulsion 9 zu diesem Zweck im Überschuss zugesetzt worden ist, hat sich dabei an dieser Phasengrenze 6 angereichert, wobei aufgrund deren erfindungsgemäß geringen Löslichkeit in der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 von weniger als IO-4 ol/1 gleichwohl kein Organogel infolge übermäßiger Akkumulierung der ersten amphiphilen Verbindung 2 an der Phasengrenze 6 gebildet worden ist, sondern diese nur eine oder wenige Molekülschichten einnimmt. Die Anreicherung der ersten amphiphilen Verbindung 2, deren Löslichkeit in der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 gleichfalls weniger als IO-4 mol/1 beträgt, an der Phasengrenze 6 ist al lenfalls sehr gering, da der Anteil der ersten amphiphilen Verbindung 2 einerseits derart eingestellt worden ist, dass sie möglichst vollständig als monomolekulare innere Schicht an die Tropfen der Wirkstofflösung 1 angelagert worden ist-, andererseits verhindert die sehr geringe Löslichkeit der ersten amphiphilen Verbindung 2 in der ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 eine übermäßige Anreicherung dersel ben an der Phasengrenze 6 oder gar die Bildung eines Orga- nogels .
Schritt (e) des Verfahrens sieht schließlich eine Zentrifugation der über die Phasengrenze 6 miteinander in Kon takt stehenden ersten Emulsion 4 und der zweiten Emulsion 9 vor, um einerseits die Tropfen der in der ersten Emulsion 4 enthaltenen Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten monomolekularen inneren Schicht der ersten amphiphilen Ver bindung 2 in Richtung der Pfeile Pi aus der ersten Flüssig keit 3 der ersten Emulsion 4 durch die Phasengrenze 6 mit den dort angereicherten Molekülen der zweiten amphiphilen Verbindung 8 hindurch in die flüssige, kontinuierliche Pha se der zweiten Emulsion 9 zu überführen, wobei beim Passie ren der Phasengrenze 6 die zweite amphiphile Verbindung 8 unter Bildung einer weiteren monomolekularen - äußeren - Schicht derselben an die monomolekulare innere Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 der Tropfen der Wirkstoff lösung 1 angelagert wird, um die Bischicht aus zwei monomo lekularen Schichten, nämlich zum Einen der ersten amphiphi len Verbindung 2 (innere Schicht) und zum Anderen der zwei ten amphiphilen Verbindung 8 (äußere Schicht) zu erzeugen, d.h. um aus den Pre-Liposomen M fertige Liposomen L zu bil den. Die äußere Schicht der Bischicht aus der zweiten am phiphilen Verbindung 8 weist dabei eine entgegengesetzte Orientierung wie die innere Schicht aus der ersten amphi philen Verbindung 2 auf, d.h. die unpolaren Bereiche der zweiten amphiphilen Verbindung 8 der äußeren Schicht weisen in Richtung der polaren Bereiche der ersten amphiphilen Verbindung 2 der inneren Schicht, also in Richtung der nun in einem Liposom L verkapselten hydrophilen Wirkstofflösung 1, während die polaren Bereiche der zweiten amphiphilen Verbindung 8 der äußeren Schicht der Bischicht in Richtung der das Liposom L umgebenden - hydrophilen - flüssigen Pha se der zweiten Emulsion 9 weisen (vgl. hierzu die beiden oberen Ausschnitte der Fig. 2) .
Da die Pre-Liposomen M aus den Tropfen der (hydrophilen) Wirkstofflösung 1 mit der hieran angelagerten inneren
Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 eine geringere Dichte besitzen als die sie umgebende (hydrophobe) erste Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4, erfahren sie im Zent rifugalfeld eine in Richtung der Pfeile Pi wirkende Kraft, welche sie in zentripetaler Richtung beschleunigt und an die Phasengrenze 6 bringt, welche mit einer zumindest mono molekularen Schicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8 belegt ist. Gegen diese, an der Phasengrenze 6 angereicher te Schicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8 wird das Pre-Liposom M so gedrückt, dass sich die an der Phasengren ze 6 angereicherte monomolekulare Schicht der zweiten am- phiphilen Verbindung 8 an die an dem Tropfen der Wirkstoff¬ lösung 1 angelagerte innere Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 anlegt und dabei durch hydrophobe Wechselwir kung aus zwei monomolekularen Schichten die Bischicht des fertigen Liposoms L entsteht, welches nach weiterer Bewe gung in Richtung der Pfeile Pi im Zentrifugaifeid in der (hydrophilen) flüssigen Phase der zweiten Emulsion 9 dis pergiert vorliegt. Bei einer vornehmlich kugelförmigen bzw. sphärischen Umhüllung entsteht folglich aus dem Tropfen der Wirkstofflösung 1 bzw. aus dem Pre-Liposom M ein Liposom L, welches in der seine Membran bildenden Bischicht zum Einen eine innere Schicht aus der ersten amphiphilen Verbindung 2 und zum Anderen eine äußere Schicht aus der zweiten amphi philen Verbindung 8 aufweist. Folglich können einerseits symmetrische Liposomen L erzeugt werden, wenn die erste am phiphile Verbindung 2 entsprechend der zweiten amphiphilen Verbindung 8 gewählt wird; andererseits lassen sich insbe sondere asymmetrische Liposomen L erzeugen, wenn die erste amphiphile Verbindung 2 von der zweiten amphiphilen Verbin dung 8 verschieden gewählt wird. Indes sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass anstelle einer (einzigen) ersten 2 und/oder zweiten amphiphilen Verbindung 8 selbstverständ lich auch ein Gemisch solcher Verbindungen, z.B. ein Ge misch aus mehreren Lipiden, eingesetzt werden kann, welche dann jeweils die innere bzw. die äußere Schicht der Bi schicht des Liposoms L bilden (vgl. hierzu ebenfalls die beiden oberen Ausschnitte der Fig. 2) .
Wie aus den beiden unteren Ausschnitten der Fig. 2 fer ner ersichtlich, werden beim Zentrifugieren der über die Phasengrenze 6 miteinander in Kontakt stehenden ersten Emulsion 4 und der zweiten Emulsion 9 die Tropfen der zwei ten Flüssigkeit 10 mit der hieran angelagerten monomoleku laren Schicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8, also die Amphiphil-Träger M', aus der flüssigen Phase der zwei¬ ten Emulsion 9 in Richtung der Pfeile P2 fortwährend an die Phasengrenze 6 zwischen der ersten Emulsion 4 und der zwei ten Emulsion 9 überführt, um die zweite amphiphile Verbin dung 8 im Zentrifugalfeld fortwährend an der Phasengrenze 6 anzureichern, wo sie infolge der im vorherigen Absatz er läuterten Anlagerung als äußere Schicht an die Pre-Lipo- somen M unter Bildung der Liposomen L verbraucht wird.
Da die Amphiphil-Träger M' aus den Tropfen der (hydro phoben) zweiten Flüssigkeit 10 mit der hieran angelagerten zweiten amphiphilen Verbindung 8 eine höhere Dichte besit zen als die sie umgebende (hydrophile) flüssige Phase der zweiten Emulsion 9, erfahren sie im Zentrifugalfeld eine in Richtung der Pfeile P2 wirkende Kraft, welche sie in zent rifugaler Richtung beschleunigt und an die Phasengrenze 6 bringt. Dabei streifen sie ihre monomolekulare Schicht aus der zweiten monomolekularen Verbindung 8 beim Übertritt in die erste (hydrophobe) Flüssigkeit 3, also in die kontinu ierliche Phase der ersten Emulsion 4, an der Phasengrenze 6 ab. Auf diese Weise wird die an der Phasengrenze 6 abge schiedenen Schicht aus der zweiten amphiphilen Verbindung 8 infolge des Phasenübertrittes der Tropfen aus der zweiten (hydrophoben) Flüssigkeit fortwährend erneuert bzw. wird die zweite amphiphile Verbindung 8 kontinuierlich an die Phasengrenze 6 "nachgeliefert", wohingegen sie durch die oben beschriebene Anlagerung als äußere Schicht unter Bil dung der Liposomen L kontinuierlich verbraucht wird.
Nach mehr oder minder vollständiger Bildung der Liposo men L bzw. nach mehr oder minder vollständigem Verbrauch der in der zweiten Emulsion 9 ursprünglich bereitgestellten Amphiphil-Träger M' aus der zweiten Flüssigkeit 10 mit der hieran angelagerten zweiten amphiphilen Verbindung 8 kann schließlich die flüssige Phase, in welcher die Liposomen L dispergiert vorliegen, von der ersten Flüssigkeit 3 abge trennt werden, was aufgrund der allenfalls sehr schlechten Mischbarkeit der hydrophilen flüssigen Phase mit der hydro phoben ersten Flüssigkeit 3 sowie deren unterschiedlicher Dichte in einfacher Weise möglich ist.
Aus den oben genannten Gründen ist es darüber hinaus möglich, dass die erste Emulsion 4 auf eine Temperatur zwi schen dem Schmelzpunkt der (hydrophoben) ersten Flüssigkeit 3 und dem Schmelzpunkt der (hydrophilen) Wirkstofflösung 1 abgekühlt wird, um die Wirkstofflösung 1 der in der ersten Flüssigkeit 3 emulgierten Tropfen mit der an diese angela gerten, monomolekularen, inneren Schicht der ersten amphi philen Verbindung 2 in den festen Zustand zu überführen, wonach die erste Emulsion 4 im festen Zustand der Tropfen der Wirkstofflösung 1 mit der (hydrophilen) flüssigen Phase der zweiten Emulsion 9, also mit deren kontinuierlicher Phase, unter Ausbildung der Phasengrenze 6 in Kontakt ge bracht wird und die über die Phasengrenze 6 miteinander in Kontakt stehenden erste Emulsion 4 und die zweite Emulsion 9, insbesondere unter fortwährendem Halten der Tropfen der Wirkstofflösung 1 im festen Aggregatzustand, zentrifugiert werden.
Ferner ist es bedarfsweise beispielsweise einerseits möglich, die fertigen Liposomen L mit Polymerkonj ugaten, z.B. solchen auf der Basis von Polyethylenglykol (PEG), zu modifizieren, indem sie z.B. elektrostatisch an die zweite amphiphile Verbindung 8 der äußeren Schicht der Bischicht angebunden werden (nicht gezeigt) . Andererseits bietet die zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere die Möglichkeit, dass als zweite amphiphile Verbindung 8, welche die monomolekulare äußere Schicht der Bischicht der Liposomen L bildet, ein oder mehrere Lipide eingesetzt werden, wobei an zumindest einige Moleküle die- ser Lipide bereits zuvor Polymerkonj ugate angebunden worden sind .
Während die beiden vorstehend unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 erläuterten Ausführungsformen eines erfin dungsgemäßen Verfahrens zur Verkapselung von Wirkstoffen in symmetrischen oder asymmetrischen Liposomen L grundsätz lich, wie oben erwähnt, diskontinuierlich bzw. chargenweise oder auch semikontinuierlich durchgeführt werden können, eröffnet die Erfindung insbesondere die Möglichkeit einer kontinuierlichen und folglich im großtechnischen Maßstab besonders wirtschaftlichen Durchführung beider Ausführungs formen des Verfahrens.
Die Fig. 3 zeigt eine schematische Querschnittsansicht einer Ausführungsform einer zur kontinuierlichen Durchfüh rung des Verfahrens zur Verkapselung von Wirkstoffen in Li posomen geeigneten Zentrifugiereinrichtung, wobei in der Fig. 3 aus Veranschaulichungsgründen nur der halbe Quer schnitt der im Wesentlichen rotationssymmetrischen Zentri fugiereinrichtung wiedergegeben ist. Die in der Fig. 3 dar gestellte, im Durchfluss betriebene, kontinuierliche Zent rifugiereinrichtung, ist um ihre Längsmittelachse 11 ro tierbar, wobei das hierdurch erzeugbare Zentrifugalfeld durch die Pfeile P3 angedeutet ist. Die Zentrifugierein richtung umfasst eine durch eine Umfangswand 12 begrenzte Zentrifugierkammer 13, welche sich über den Großteil ihrer axialen Länge erstreckt. An ihrer in der Fig. 3 linken Sei te weist die Zentrifugiereinrichtung zwei separate Einlässe 14, 15 auf, welche beispielsweise im Wesentlichen koaxial zueinander angeordnet sind. Dabei mündet der erste Einlass 14 in einen radial äußeren Umfangsabschnitt der Zentrifu gierkammer 13 ein, während der zweite Einlass 15 in einen radial inneren Zentralabschnitt der Zentrifugierkammer 13 einmündet. In dem (in der Fig. 3 linken) Einlassbereich der Zentrifugiereinrichtung befindet sich zu diesem Zweck ein sich im Wesentlichen in Radialrichtung derselben erstre¬ ckendes. Einlasswehr 16, welches einerseits eine radial äu ßere, beispielsweise etwa ringförmige Durchgangsöffnung zwischen dem ersten Einlass 14 und dem radial äußeren Ab schnitt der Zentrifugierkam er 13, andererseits eine radial innere, beispielsweise etwa kreisrunde Durchgangsöffnung zwischen dem zweiten Einlass 15 und dem radial inneren Ab schnitt der Zentrifugierkammer 13 freilässt, so dass dem ersten Einlass 14 und dem zweiten Einlass 15 gleichzeitig aufgegebene fluide Medien mittels des Einlasswehres 16 zu nächst voneinander getrennt gehalten werden, wonach sie in folge des Passierens des Einlasswehres 16 einerseits radial außen- und andererseits radial innenseitig desselben in die gemeinsame Zentrifugierkammer 13 überführt werden, und zwar einerseits in deren radial äußeren Abschnitt und anderer seits in deren radial inneren Abschnitt.
An ihrer in der Fig. 3 rechten Seite weist die Zentrifu giereinrichtung zwei separate Auslässe 17, 18 auf, welche beispielsweise wiederum im Wesentlichen koaxial zueinander angeordnet sind. Dabei mündet der erste Auslass 17 aus dem radial äußeren Umfangsabschnitt der Zentrifugierkammer 13 aus, während der zweite Auslass 18 aus dem radial inneren Zentralabschnitt der Zentrifugierkammer 13 ausmündet. In dem (in der Fig. 3 rechten) Auslassbereich der Zentrifugie reinrichtung befindet sich zu diesem Zweck ein sich im We sentlichen in Radialrichtung derselben erstreckendes Aus lasswehr 19, welches einerseits eine radial äußere, bei spielsweise etwa ringförmige Durchgangsöffnung zwischen dem ersten Auslass 17 und dem radial äußeren Abschnitt der Zentrifugierkammer 13, andererseits eine radial innere, beispielsweise etwa kreisrunde Durchgangsöffnung zwischen dem zweiten Auslass 18 und dem radial inneren Abschnitt der Zentrifugierkammer 13 freilässt, so dass zwei in der Zent rifugierkammer 13 zentrifugierte fluide Medien unterschied¬ licher Dichte, welche insbesondere nicht oder nur schlecht miteinander mischbar sind, nach Passieren des Auslasswehres 19 einerseits radial innen- und andererseits radial außen seitig desselben voneinander getrennt werden, wonach sie einerseits in den ersten Auslass 17, andererseits in den zweiten Auslass 18 überführt werden, um sie der Zentrifu giereinrichtung zu entnehmen.
In der Zentrifugierkammer 13 befindet sich im Bereich von deren auslassseitigem Abschnitt, aber stromauf des Aus lasswehres 19, ferner ein sich im Wesentlichen in Radial richtung derselben erstreckendes erstes Rückhaltewehr 20, welches z.B. im Wesentlichen kreisringförmig ausgestaltet ist und sich von der äußeren Umfangswand 12 der Zentrifu giereinrichtung um einen radialen Abstand Ri nach innen er streckt, wobei dieser radiale Abstand Ri, also die radiale Breite des ersten Rückhaltewehres 20, zweckmäßigerweise we nigstens der radialen Breite der Durchgangsöffnung zwischen dem radial äußeren Ende des Auslasswehres 19 und der Um fangswand 12 entspricht bzw. diese vorzugsweise zumindest geringfügig übertrifft. Darüber hinaus befindet sich in der Zentrifugierkammer 13 im Bereich von deren auslassseitigem Abschnitt, aber wiederum stromauf des Auslasswehres 19, ein sich gleichfalls im Wesentlichen in Radialrichtung dersel ben erstreckendes zweites Rückhaltewehr 21, welches im vor liegenden Fall z.B. im Wesentlichen kreisringförmig ausge staltet ist und sich zwischen einem radial etwa mittleren Abschnitt der Zentrifugierkammer 13 bis nahe der zentralen Drehachse 11 der Zentrifugiereinrichtung erstreckt, wobei es stattdessen aber auch im Wesentlichen kreisförmig ausge staltet sein und folglich keinen zentralen Durchlässe be sitzen kann (nicht gezeigt) . Der radiale Abstand R2 des zweiten Rückhaltewehres von der zentralen Drehachse 11, al¬ so die radiale Breite des zweiten Rückhaltewehres 21, ent¬ spricht zweckmäßigerweise wenigstens der radialen Breite der Durchgangsöffnung zwischen dem radial inneren Ende des Auslasswehres 19 und der zentralen Drehachse 11 bzw. über trifft diese vorzugsweise zumindest geringfügig.
Zur kontinuierlichen Durchführung der oben unter Bezug nahme auf die Fig. 1 und 2 beschriebenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun einerseits die erste Emulsion 4 gemäß Schritt (b) , deren hydrophobe erste Flüssigkeit eine höhere Dichte aufweist als die hydrophile flüssige Phase 5 (Fig. 1) oder als die hydrophile kontinu ierliche Phase der zweiten Emulsion 9 (Fig. 2), dem ersten (radial äußeren) Einlass 14 der Zentrifugiereinrichtung kontinuierlich aufgegeben; andererseits wird die hydrophile flüssige Phase 5 (Fig. 1) oder die zweite Emulsion 9 (Fig. 2) dem zweiten (radial inneren) Einlass 15 der Zentrifugie reinrichtung kontinuierlich aufgegeben. Hierbei werden ei nerseits die erste Emulsion 4, andererseits die hydrophile flüssige Phase 5 (Fig. 5) oder die zweite Emulsion 9 (Fig. 2) im Einlassbereich der Zentrifugiereinrichtung durch das Einlasswehr 16 zunächst voneinander getrennt gehalten und gelangen anschließend, sobald sie das Einlasswehr 16 einer seits durch seine radial äußere Durchgangsöffnung, anderer seits durch sein radial innere Durchgangsöffnung passiert haben, einerseits in den radial äußeren Abschnitt, anderer seits in den radial inneren Abschnitt der gemeinsamen Zent rifugierkammer 13, womit sie gemäß Schritt (d) miteinander in Kontakt gebracht werden und sich die Phasengrenze 6 aus bildet. Eine weitere Funktion des unter- bzw. überströmba- ren Einlasswehres 16 besteht dabei darin, den (radial äuße ren) Einlassbereich der ersten Emulsion 4 in die Zentrifu gierkammer 13 nicht mit der hydrophilen flüssigen Phase 5 (Fig. 1) oder mit der zweiten Emulsion 9 (Fig. 2) mit dem¬ gegenüber geringerer Dichte zu überschichten, damit in die¬ sem Einlassbereich keine unkontrollierten Bischichten der in der , ersten Emulsion 4 enthaltenen Wirkstofflösungstrop¬ fen 1 mit der hieran angelagerten monomolekularen Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 (vgl. die Fig. 1 und 2) erzeugt werden.
In der Zentrifugierkammer 13, welche in axialer Rich tung, d.h. in der Fig. 3 von links nach rechts, durchströmt wird, findet ferner der oben unter Bezugnahme auf die Fig.
1 und 2 im Einzelnen erläuterte Zentrifugierschritt (e) statt, wobei die in der ersten Flüssigkeit 3 emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung 1 mit der an diese angelagerten monomolekularen (inneren) Schicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 der ersten Emulsion 4 (vgl. auch die Fig. 1 und 2) in der Zentrifugierkammer 13 mittels des ersten Rückhaltewehres 20 akkumuliert werden können. Eine Funktion des ersten Rückhaltewehres 20 besteht folglich auch darin, dass die emulgierten und mit einer Monoschicht der ersten amphiphilen Verbindung 2 versehenen Tropfen der Wirkstoff lösung 1 in der ersten Emulsion 4, welche noch nicht zu ei ner mit einer Bischicht versehenen Liposomen L umgesetzt worden sind, nicht über den ersten Auslass 17 aus der Zent rifugierkammer 13 mitgerissen werden, sondern durch Auf triebskräfte zuvor die Phasengrenze 6 erreichen, um dort möglichst vollständig zu den Liposomen L mit einer Bi schicht umgesetzt werden zu können.
Sofern entsprechend der oben unter Bezugnahme auf die Fig. 2 geschilderten zweiten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Verfahrens gemäß Schritt (c) eine zweite Emul sion 9 aus der hydrophilen flüssigen Phase mit den hierin emulgierten Tropfen aus der hydrophoben zweiten Flüssigkeit 10, welche mit einer monomolekularen Schicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8 versehen sind, eingesetzt wird, so können diese Tropfen mittels des zweiten Rückhaltewehres 21 in der Zentrifugierkammer 13 akkumuliert werden. Eine Funk tion des zweiten Rückhaltewehres 21 besteht in diesem Fall folglich vornehmlich darin, dass die emulgierten und mit einer Monoschicht der zweiten amphiphilen Verbindung 8 ver sehenen Tropfen der hydrophoben zweiten Flüssigkeit 10 in der zweiten Emulsion 9, welche die zweite amphiphile Ver bindung 8 noch nicht an der Phasengrenze 6 abgeschieden ha ben, nicht über den zweiten Auslass 18 aus der Zentrifu gierkammer 13 mitgerissen werden, sondern durch die indu zierten Zentrifugalkräfte zuvor die Phasengrenze 6 errei chen, um dort möglichst vollständig die zweite amphiphile Verbindung 8 anzureichern.
Schließlich wird einerseits die hydrophile flüssige Pha se 5 mit den mit der Bischicht aus den beiden monomolekula ren Schichten der ersten amphiphilen Verbindung 2 versehe nen Liposomen (Fig. 1) oder wird die kontinuierliche, hyd rophile flüssige Phase der zweiten Emulsion 9 mit den mit der Bischicht aus der ersten amphiphilen Verbindung 2 (in nere Schicht) und der zweiten amphiphilen Verbindung 8 (äu ßere Schicht) versehenen Liposomen L (Fig. 2), andererseits die hydrophobe erste Flüssigkeit 3 aus der gemeinsamen Zentrifugierkammer 13 mittels des Auslasswehres 19 vonein ander getrennt und einerseits über den zweiten Auslass 18, andererseits über den ersten Auslass 17 der Zentrifugier einrichtung entnommen. In der Fig. 3 sind dabei die mittels der unter- bzw. überströmbaren Wehre eingestellten Flüssig- keitsfüllstände im Innern der Zentrifugierkammer 13 erkenn bar. Dabei fließt die "leichtere" Phase mit geringerer Dichte - hier: die hydrophile flüssige Phase 5 (Fig. 1) bzw. die kontinuierliche, hydrophile flüssige Phase der zweiten Emulsion 9 (Fig. 2) - nur dann über das Auslasswehr 19 ab, wenn die Flüssigkeitssäule beider Phasen 5 und 4 bzw. 9 und 4 bis zum radial inneren Ende des Auslasswehres 19 denselben hydrostatischen Druck erzeugt wie die Flüssig¬ keitssäule der "schweren" Phase mit demgegenüber höherer Dichte - hier: der hydrophoben ersten Flüssigkeit 3 der ersten Emulsion 4 - bis zum radial inneren Ende 17a des ersten Auslasses 17, Eine Funktion des über- bzw. unter- strömbaren Auslasswehres 19 besteht somit vornehmlich da rin, für eine vollständige Trennung der Phasen 5 und 4 bzw.
9 und 4 zu sorgen, wobei der Abstand der Phasengrenze 6 von dem radial äußeren Ende des Auslasswehres 19 mit Vorteil derart eingestellt werden sollte, dass die Phasengrenze 6 auch bei Schwingungen das radial äußere Ende des Auslass wehres 19 nicht zu erreichen vermag.
Nachstehend ist die Erfindung anhand von Ausführungsbei spielen näher erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung symmetrischer Liposomen aus 10 pg/ml
Viscumin (Mistelextrakt) in 15 mM Phosphatpuffer in einer Bischicht aus dem Lipid Dipalmitoyl- phosphatidylcholin (DPPC).
Wirkstofflösung : 10 pg/ml Viscumin (Wirkstoff) in 15 mM
wässrigem Phosphatpuffer (PP) (hydrophiles Lösungsmittel) ,
Erste amphiphile Verbindung: Dipalmitoylphosphatidylcholin
(DPPC) ,
Erste Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(CI4F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Flüssige Phase (hydrophil) : 15 mM wässriger Phosphatpuffer
(PP) ,
Löslichkeit DPPC in Ci4F24j_ < 10~5 mol/1 (Nachweisgrenze) .
( a ) Bereitstellen der Wirkstofflösung : Der Wirkstoff Viscumin wird mit einem Anteil von 10 pg/ml in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer (PP) als hyd rophilem Lösungsmittel gelöst, um die hydrophile Wirk stofflösung bereitzustellen .
(b) Bereitstellen der ersten Emulsion:
150 mM Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) als ers te amphiphile Verbindung wird in einem Rundkolben in Ethanol gelöst, wonach das Ethanol mittels eines Rota tionsverdampfers und anschließender Einlagerung des Rundkolbens in einem Exsikkator vollständig verdampft wird, so dass das DPPC als trockener Film in dem Rund kolben zurückbleibt.
Die hydrophile Wirkstofflösung aus 10 pg/ml in 15 mM PP gemäß Schritt (a) wird nun dem Rundkolben mit dem DPPC zugesetzt, um eine Mischung aus 150 mM DPPC in der Wirkstofflösung zu erhalten. Das DPPC (erste amphiphile Verbindung) löst sich hierbei in der hydrophilen Wirk stofflösung infolge Quellung von der Glaswand des Rund kolbens ab und bildet polydisperse amphiphile Aggrega te, welche durch mechanische Bearbeitung zerkleinert werden. Hierzu werden 2 alternative Methoden angewandt:
- Extrusion durch 800 nm und 400 nm Poren; und
- Anwendung von Ultraschall ( Hielscher UP 200S mit
200 W Maximalleistung und einer Ultraschallfrequenz von 26 kHz) : 10 Sekunden mit einem Anteil von 100% des Beschallungs zyklus (Zyklusdauer: je 1 Sekunde) und einer Amplitude von 50%; auf die initiale Be schallung der ersten 10 Sekunden folgt eine Beschal lung über 10 Minuten mit einem Zyklusanteil von 50% und einer Amplitude von 40% ohne Kühlung zur Zerklei nerung der amphiphilen Aggregate auf eine mittlere Partikelgröße von 276 nm ±50 nm. Die auf diese Weise erzeugte Mischung der Wirkstoff¬ lösung mit den suspendierten Aggregaten aus DPPC (erste amphiphile Verbindung) wird mit einem Volumenanteil von 1% in Perfluoroperhydrophenanthren (erste Flüssigkeit, hydrophob) eingebracht. Zur Emulgierung wird die Wirk¬ stofflösung mit dem DPPC als disperse Phase mittels Ultraschall (Hielscher UP 200S) für 10 Sekunden mit ei nem Zyklusanteil von 100% und einer Amplitude von 50%, gefolgt von 10 Minuten mit einem Zyklusanteil von 50% und einer Amplitude von 40%, ohne Kühlung suspendiert. Auf diese Weise werden Pre-Liposomen aus den Wirkstoff lösungstropfen mit einer monomolekularen Schicht aus DPPC (disperse Phase der ersten Emulsion) in Perfluoro- perhydrophenanthren (erste Flüssigkeit, hydrophob als kontinuierliche Phase der ersten Emulsion) mit einer mittleren Partikelgröße von 424 nm ± 33 nm, einer Par tikelanzahl von 643 kcounts/s ± 64 kcounts/s (derived count rate) und einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,179 erzeugt. Die Größenstabilität der Pre-Liposomen wurde über 138 Minuten geprüft und veränderte sich in dieser Zeit um weniger als 10%.
Unmittelbar anschließend wird die erste Emulsion mit den Pre-Liposomen aliquotiert, wobei für die nachfol gende diskontinuierliche Zentrifugation (siehe Schritt (e) weiter unten) beispielsweise je 0,55 ml der ersten Emulsion in Zentrifugenröhrchen abgefüllt werden.
( c ) Bereitstellen der mit der ersten Flüssigkeit (Per- fluoroperhydrophenanthren, hydrophob) der ersten Emul sion nicht oder schlecht mischbaren flüssigen Phase (hydrophil ) :
Als hydrophile flüssige Phase wird 15 mM wässriger Phosphatpuffer (PP) entsprechend dem Lösungsmittel der Wirkstofflösung bereitgestellt.
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion (kontinuierliche Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstofflösung mit monomoleku larer Schicht aus DPPC) mit der flüssigen Phase (15 mM PP in Wasser, hydrophil) :
Um für eine wirksamere Zentrifugation (siehe Schritt (e) weiter unten) infolge eines höheren Dichteunter schiedes zu sorgen, können vorzugsweise zunächst die aliquotierten Anteile der ersten Emulsion mit den Pre- Liposomen in einem Gefrierschrank bei -24 °C für mindes tens 4 Stunden eingefroren werden. Sodann wird die hyd rophobe erste Flüssigkeit ( Perfluoroperhydrophenanth- ren) der ersten Emulsion, in welcher die Pre-Liposomen suspendiert sind, in einem Eisbad unter Salzzugabe bei -3°C ± 0,5°C für ca. 30 Minuten temperiert; die hydro phile flüssige Phase gemäß Schritt (c) (16 mM PP in
Wasser) wird bei -1°C ± 0,5°C in einem thermostatisier- ten Bad für ca. 30 Minuten temperiert.
Die erste Emulsion mit der hydrophoben ersten Flüs sigkeit als kontinuierlicher Phase wird dann mit der hydrophilen flüssigen Phase in Kontakt gebracht, indem ca. 0,55 ml der ersten Emulsion mit den Pre-Liposomen sowie 0,7 ml der hydrophilen flüssigen Phase in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert werden, wobei die erste Emulsion, welche beim vorliegenden Ausführungsbeispiel die schwerere Phase bildet, zuerst und hierauf sehr vorsichtig die hydrophile flüssige Phase, welche im vorliegenden Ausführungsbeispiel die leichtere Phase bildet, aufgelagert wird, so dass sich eine Phasengren ze ausbildet, an welcher sich das DPPC anreichern kann, ohne ein Organogel zu bilden. Die Befüllung des Zentri¬ fugenröhrchens findet zweckmäßigerweise in der vorge kühlten Zentrifuge statt.
( e ) Zentrifugieren der ersten Emulsion (kontinuierliche
Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstofflösung mit monomoleku larer Schicht aus DPPC) und der hiermit über die Pha sengrenze in Kontakt stehende flüssigen Phase (15 mM PP in Wasser, hydrophil) :
Das gemäß dem obigem Schritt (d) befüllte Zentrifu genröhrchen wird schließlich mit 4000 g (entsprechend etwa 39000 m/s2) bei einer Zentrifugentemperatur von -3°C über 30 bis 60 Minuten zentrifugiert, wobei die Pre-Liposomen aus der ersten Emulsion bzw. aus deren ersten Flüssigkeit ( Perfluoroperhydrophenanthren) durch die Phasengrenze hindurch in die flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) überführt werden und sich dabei das an der Phasengrenze angereicherte DPPC als zweite (äußere) monomolekulare Schicht an die erste (innere) monomole kulare Schicht aus DPPC anlagert, um die fertigen Lipo somen zu bilden.
Die hydrophile flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) mit den hierin suspendierten fertigen Liposomen wird analy siert, um die Größe der derart erzeugten Liposomen zu be stimmen. Für die Visualisierung mittels Transmissionselek- tonenmikroskopie (TEM, Philips CM 12 mit GATAN Multiscan 400 HP Kamera) wird der hydrophilen flüssigen Phase mit den in ihr erzeugten Liposomen Ammoniummolybdat als hydrophiler Farbstoff zugesetzt und die zu untersuchende Probe auf ein Kupfergitter aufgetragen und an Luft sowie in einem Exsik kator getrocknet. Die getrockneten Proben werden mittels TEM analysiert, wobei der Farbstoff eine Negativfärbung er zeugt, d.h. das Ammoniummolybdat reduziert die Transmission in den rein hydrophilen Arealen; dadurch bleiben die Lipo somen hell. Die Fig. 4 zeigt eine TEM-Aufnähme der auf die se Weise erzeugten Liposomen, welche von sphärischer Ge stalt sind und entsprechend einer Analyse mittels Photonen korrelationsspektroskopie (PCS, Malvern Zetasizer Nano
ZS90) eine Partikelgröße von 305 nm ± 46 nm, eine mittlere Partikelanzahl von 257 ± 17 kcounts/s (derived count rate) und einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,915 aufweisen.
Beispiel 2 : Herstellung symmetrischer Liposomen aus 10 yg/ml
Viscumin (Mistelextrakt) in 15 mM Phosphatpuffer in einer Bischicht aus dem Lipid Distearoyl- phosphatidylcholin (DSPC).
Wirkstofflösung : 10 pg/ml Viscumin (Wirkstoff) in 15 mM
wässrigem Phosphatpuffer (PP) (hydrophiles Lösungsmittel) ,
Erste amphiphile Verbindung: Distearoylphosphatidylcholin
(DSPC) ,
Erste Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(CI4F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Flüssige Phase (hydrophil) : 15 mM wässriger Phosphatpuffer
(PP) ,
Löslichkeit DSPC in C14F24: < 10~5 mol/1 (Nachweisgrenze) .
Die Herstellung der Liposomen geschieht analog den
Schritten (a) bis (e) gemäß Beispiel 1 und mit entsprechen den Anteilen, aber mit der Maßgabe, dass anstelle von Di- palmitoylphosphatidylcholin (DPPC) Distearoylphosphatidyl cholin (DPPC) als erste amphiphile Verbindung eingesetzt wird. Entsprechendes gilt für die transmissionselektonen- mikroskopische Analyse. Die Fig. 5 zeigt eine TEM-Aufnahme der auf diese Weise erzeugten Liposomen, welche von sphärischer Gestalt sind und gemäß PCS-Analyse eine mittlere Partikelgröße von
183 nm ± 51 nm, eine Partikelanzahl von 549 ± 140 kcounts/s (derived count rate) und einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,9 aufweisen.
Beispiel 3: Herstellung symmetrischer Liposomen aus 10 pg/ml
Viscumin (Mistelextrakt) in 15 mM Phosphatpuffer in einer Bischicht aus einer Mischung der Lipide Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und Choleste rol (Cholesterin) in einem Molverhältnis von 60:40.
Wirkstofflösung : 10 pg/ml Viscumin (Wirkstoff) in 15 mM
wässrigem Phosphatpuffer (PP) (hydrophiles Lösungsmittel) ,
Erste amphiphile Verbindung: Dioleoylphosphatidylcholin
(DOPC) und Cholesterol im Ver hältnis von 60:40 mol-%,
Erste Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(C14F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Flüssige Phase (hydrophil) : 15 mM wässriger Phosphatpuffer
(PP) ,
Löslichkeit DOPC in C14F24: < 10~5 mol/1 (Nachweisgrenze) ,
Löslichkeit Cholesterol in C14F24: < IO 5 mol/1 (Nachweis
grenze ) .
Die Herstellung der Liposomen geschieht analog den
Schritten (a) bis (e) gemäß Beispiel 1 und mit entsprechen den Anteilen, aber mit der Maßgabe, dass anstelle von Dipal- mitoylphosphatidylcholin (DPPC) eine Mischung aus Dioleoylp- hosphatidylcholin (DOPC) und Cholesterol mit einem Molver hältnis von 60:40 als erste amphiphile Verbindung eingesetzt wird. Entsprechendes gilt für die transmissionselektonenmik- roskopische Analyse.
Die Fig. 6 zeigt eine TEM-Aufnahme der auf diese Weise erzeugten Liposomen, welche von sphärischer Gestalt sind und gemäß PCS-Analyse eine mittlere Parti elgröße von
108 nm ± 31 nm, eine Partikelanzahl von 1116 ± 32 kcounts/s (derived count rate) und einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,962 aufweisen.
Beispiel 4: Herstellung symmetrischer Liposomen aus Pyranin- ( 8-hydroxy-l , 3, 5-pyrentrisulfonsäuretrinatrium salz (HPTS) in 15 mM Phosphatpuffer in einem Bi- schicht aus einer Mischung aus Ei-Lecithin mit einem Phosphatidylcholin-Gehalt von 80% (E80) und Cholesterol (Cholesterin) in einem Molver hältnis von 60:40.
Wirkstoffmarkerlösung : Pyranin- (8-hydroxy-l, 3, 5-pyrentri- sulfonsäuretrinatriumsalz (HPTS) (Surrogat) in 15 mM wässrigem Phos phatpuffer (PP) (hydrophiles Lösungs mittel) ,
Erste amphiphile Verbindung: Ei-Lecithin mit einem Phosphat idylcholin-Gehalt von 80%
(E80) und Cholesterol im Ver hältnis von 60:40 mol-%,
Erste Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(CI4F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Flüssige Phase (hydrophil): 15 mM wässriger Phosphatpuffer
(PP) ,
Löslichkeit E80 in C14F24: < 10~5 mol/1 (Nachweisgrenze),
Löslichkeit Cholesterol in CI4F24: < 10~5 mol/1 (Nachweis
grenze) .
(a) Bereitstellen der Wirkstoffmarkerlösung: Der Wirkstoffmarker HPTS (Surrogat) wird in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer (PP) als hydrophilem Lösungs mittel gelöst, um die hydrophile Wirkstoffmarkerlösung bereitzusteilen .
(b) Bereitstellen der ersten Emulsion:
Die Bereitstellung der ersten Emulsion geschieht analog dem Schritt (b) gemäß Beispiel 1, mit der Maßga be, dass als erste amphiphile Verbindung anstelle von 150 mM DPPC 150 mM eine Mischung aus E80 und Choleste rol in einem Molverhältnis von 60:40 mol-% eingesetzt wird .
Ferner wird abweichend von dem Schritt (b) gemäß Beispiel 1 die erste Emulsion mit den Pre-Liposomen auf Volumina von 30 ml aliquotiert.
(c) Bereitstellen der mit der ersten Flüssigkeit (Per- fluoroperhydrophenanthren, hydrophob) der ersten Emul sion nicht oder schlecht mischbaren flüssigen Phase (hydrophil) :
Als hydrophile flüssige Phase wird analog dem Schritt (c) gemäß Beispiel 1 15 mM wässriger Phosphat puffer (PP) entsprechend dem Lösungsmittel der Wirk stoffmarkerlösung bereitgestellt .
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion (kontinuierliche Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstoffmarkerlösung mit mono- molekularer Schicht aus E80 /Cholesterol ) mit der flüs sigen Phase (15 mM PP in Wasser, hydrophil):
Die gemäß dem obigen Schritt (b) aliquotierten Volu mina von 30 ml der ersten Emulsion mit den Pre-Liposo- men werden ungekühlt bei Raumtemperatur verwendet und gemäß dem nachfolgenden Schritt (e) in einer im Durch fluss betriebenen, kontinuierlichen Zentrifugierein richtung, wie sie oben unter Bezugnahme auf die Fig. 3 im Einzelnen erläutert ist, mit der hydrophilen flüssi gen Phase in Kontakt gebracht, wobei sich eine Phasen grenze ausbildet, an welcher sich die Mischung aus E80 und Cholesterol anreichern kann, ohne ein Organogel zu bilden .
(e ) Zentrifugieren der ersten Emulsion (kontinuierliche
Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstoffmarkerlösung mit mono molekularer Schicht aus E80/Cholesterol) und der hier mit über die Phasengrenze in Kontakt stehende flüssigen Phase (15 mM PP in Wasser, hydrophil) :
Zunächst wird das Totvolumen der kontinuierlichen Zentrifuge bei 333 g (entsprechend etwa 3300 m/s2) durch kontinuierliche Injektion von einerseits ca.
13 ml der ersten Emulsion (hydrophobe erste Flüssigkeit Perfluoroperhydrophenanthren mit den hierin suspendier ten Pre-Liposomen) mit einer Flussrate von ca.
1 ml/min, andererseits der hydrophilen flüssigen Phase (15 mM PP in Wasser) befüllt. Ab dem Überlaufen der Zentrifugierkammer werden beide Phasen (hydrophil/hyd rophob) mit einer Flussrate von ca. 0,3 ml/min kontinu ierlich zugeführt und weiterhin mit 333 g kontinuier lich zentrifugiert, wobei die Pre-Liposomen aus der ersten Emulsion bzw. aus deren ersten Flüssigkeit (Per- fluoroperhydrophenanthren) durch die Phasengrenze hin durch in die flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) über führt werden und sich dabei das an der Phasengrenze an gereicherte E80/Cholesterol als zweite (äußere) monomo- lekulare Schicht an die erste (innere) monomolekulare Schicht aus E80 /Cholesterol anlagert, um die fertigen Liposomen zu bilden. Die Gesamtvolumina beider Phasen (hydrophil/hydrophob) betragen dabei ca. 30 ml. Nach Abschluss der kontinuierlichen Zuführung der beiden
Phasen (hydrophil/hydrophob) nach ca. 70 min. werden die beiden Phasen noch für weitere 20 Minuten bei 333 g zentrifugiert. Die über die Auslasswehre (vgl. die Fig.
3) abfließenden Phasen werden gesammelt.
Die hydrophile flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) mit den hierin suspendierten fertigen Liposomen wird analog dem Beispiel 1 mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) untersucht, um die Größe der derart erzeugten Liposomen zu bestimmen. Die auf diese Weise erzeugten Liposomen sind von sphärischer Gestalt und weisen eine mittlere Partikelgröße von 254 nm ± 3 nm, eine Partikelanzahl von 645 kcounts/s ±
6 kcounts/s (derived count rate) sowie einen Polydispersi tätsindex (PDI) von 0,380 auf.
Beispiel 5 : Herstellung asymmetrischer Liposomen aus 10 pg/ml
Viscumin (Mistelextrakt) in 15 mM Phosphatpuffer in einem Bischicht aus einerseits einer Mischung aus Ei-Lecithin mit einem Phosphatidylcholin- Gehalt von 80% (E80) und Cholesterol (Choleste rin) in einem Molverhältnis von 60:40 (innere monomolekulare Schicht) und andererseits einer Mischung aus Ei-Lecithin mit einem Phosphatidyl- cholin-Gehalt von 80% (E80) und Cholesterol in einem Molverhältnis von 80:20 (äußere mono molekulare Schicht) .
Wirkstofflösung : 10 pg/ml Viscumin (Wirkstoff) in 15 mM
wässrigem Phosphatpuffer (PP) (hydrophiles Lösungsmittel) , Erste amphiphile Verbindung: Ei-Lecithin mit einem Phosphat- idylcholin-Gehalt von 80%
(E80) und Cholesterol im Ver hältnis von 60:40 mol-%,
Zweite amphiphile Verbindung: Ei-Lecithin mit einem Phosphat- idylcholin-Gehalt von 80%
(E80) und Cholesterol im Ver hältnis von 80:20 mol-%,
Erste Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(CI4F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Zweite Flüssigkeit (hydrophob) : Perfluoroperhydrophenanthren
(CI4F24, CAS-Nummer 306-91-2),
Flüssige Phase (hydrophil) : 15 mM wässriger Phosphatpuffer
(PP) ,
Löslichkeit E80 in C14F24 : < 10~5 mol/1 (Nachweisgrenze) ,
Löslichkeit Cholesterol in J3I4F24L < 105 mol/1 (Nachweis¬ grenze) .
(a) Bereitstellen der Wirkstofflösung :
Der Wirkstoff Viscumin wird mit einem Anteil von 10 pg/ml in 15 mM wässrigem Phosphatpuffer (PP) als hydrophilem Lösungsmittel gelöst, um die hydrophile
Wirkstofflösung bereitzustellen.
(b) Bereitstellen der ersten Emulsion:
Die Bereitstellung der ersten Emulsion geschieht analog dem Schritt (b) gemäß Beispiel 1, mit der Maßga be, dass als erste amphiphile Verbindung anstelle von 150 mM DPPC 150 mM einer Mischung aus E80 und Choleste rol in einem Molverhältnis von 60:40 mol-% eingesetzt wird, so dass die erste Emulsion aus 1% (v/v) hydrophi ler Wirkstofflösung (Viscumin in 15 mM wässrigem PP) in der ersten hydrophoben Flüssigkeit ( Perfluoroperhydro phenanthren) mit 1,5 mM Gesamtanteil der ersten amphi- philen Verbindung (E80 und Cholesterol im Verhältnis von 60:40 mol-%) besteht.
Auf diese Weise werden Pre-Liposomen aus den Wirk stofflösungstropfen mit einer monomolekularen Schicht aus E80/Cholesterol im Molverhältnis von 60:40 mol-% (disperse Phase der ersten Emulsion) in Perfluoroper- hydrophenanthren (erste Flüssigkeit, hydrophob als kon tinuierliche Phase der ersten Emulsion) mit einer mitt leren Partikelgröße von 376 nm ± 22 nm, einer Partikel anzahl von 482 kcounts/s ± 35 kcounts/s (derived count rate) und einem Polydispersitätsindex (PDI) von 1,0 er zeugt .
Ferner wird abweichend von dem Schritt (b) gemäß Beispiel 1 die erste Emulsion mit den Pre-Liposomen auf Volumina von 30 ml aliquotiert.
(c) Bereitstellen der Mischung - hier: in Form der zweiten Emulsion - aus der mit der ersten Flüssigkeit (Per- fluoroperhydrophenanthren, hydrophob) der ersten Emul sion nicht oder schlecht mischbaren flüssigen Phase (hydrophil) mit der zweiten amphiphilen Verbindung mit hierin emulgierter zweiter Flüssigkeit (hydrophob) :
E80 /Cholesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-% als zweite amphiphile Verbindung wird in einem Rundkolben in Ethanol gelöst, wonach das Ethanol mittels eines Ro tationsverdampfers und anschließender Einlagerung des Rundkolbens in einem Exsikkator vollständig verdampft wird, so dass die zweite amphiphile Verbindung als tro ckener Film in dem Rundkolben zurückbleibt.
Die hydrophile flüssige Phase aus 15 mM wässrigem PP wird nun dem Rundkolben mit dem E80 /Cholesterol im Mol verhältnis von 80:20 mol-% zugesetzt, um eine Mischung aus 150 mM E80 /Cholesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-% (zweite amphiphile Verbindung) in 15 mM wässrigem PP (hydrophile flüssige Phase) zu erhalten. Das E80/ Cholesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-% löst sich hierbei in der hydrophilen Wirkstofflösung infolge Quellung von der Glaswand des Rundkolbens ab und bildet polydisperse amphiphile Aggregate, welche durch mecha nische Bearbeitung zerkleinert werden. Hierzu können wiederum 2 alternative Methoden angewandt werden:
- Extrusion durch 800 nm und 400 nm Poren; und
- Anwendung von Ultraschall ( Hielscher UP 200S mit
200 W Maximalleistung und einer Ultraschallfrequenz von 26 kHz) : 10 Sekunden mit einem Anteil von 100% des Beschallungszyklus (Zyklusdauer: je 1 Sekunde) und einer Amplitude von 50%; auf die initiale Be schallung der ersten 10 Sekunden folgt eine Beschal lung über 10 Minuten mit einem Zyklusanteil von 50% und einer Amplitude von 40% ohne Kühlung zur Zerklei nerung der amphiphilen Aggregate.
In die auf diese Weise erzeugte Mischung der hydro philen flüssigen Phase (15 mM wässriger PP) mit den suspendierten Aggregaten aus E80/Cholesterol im Molver hältnis von 80:20 mol-% (zweite amphiphile Verbindung) wird nun zur Erzeugung der zweiten Emulsion die hydro phobe zweite Flüssigkeit ( Perfluoroperhydrophenanthren) mit einem Volumenanteil von etwa 1% eindispergiert. Zur Emulgierung wird das Perfluoroperhydrophenanthren als disperse Phase mittels Ultraschall ( Hielscher UP 200S) für 10 Sekunden mit einem Zyklusanteil von 100% und ei ner Amplitude von 50%, gefolgt von 30 Minuten mit einem Zyklusanteil von 75% und einer Amplitude von 60%, ohne Kühlung suspendiert, so dass die zweite Emulsion aus 1% (v/v) hydrophober zweiter Flüssigkeit ( Perfluoroper hydrophenanthren) in der hydrophilen flüssigen Phase (15 mM wässriger PP) mit 1,5 mM Gesamtanteil· der zwei ten amphiphilen Verbindung (E80 und Cholesterol im Verhältnis von 80:20 mol-%) besteht.
Auf diese Weise werden Amphiphil-Träger aus den Per- fluoroperhydrophenanthren-Tropfen mit einer monomoleku laren Schicht aus der zweiten amphiphilen Verbindung E80/Cholesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-% (dis perse Phase der zweiten Emulsion) in 15 mM wässrigem PP (flüssige Phase, hydrophil als kontinuierliche Phase der zweiten Emulsion) mit einer mittleren Partikelgröße von 127 nm ± 6 nm, einer Partikelanzahl von
1411 kcounts/s + 52 kcounts/s (derived count rate) und einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,298 erzeugt.
Unmittelbar anschließend wird auch die zweite Emul sion mit den Amphiphil-Trägern auf Volumina von 30 ml aliquotiert .
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion (kontinuierliche Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstofflösung mit monomoleku larer Schicht aus E80 /Cholesterol im Molverhältnis von 60:40 mol-%) mit der zweiten Emulsion (kontinuierliche Phase aus der flüssigen Phase 15 mM PP in Wasser, hyd rophil; disperse Phase aus Amphiphil-Trägern aus der hydrophoben zweiten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren mit monomolekularer Schicht aus E80/Cho- lesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-%) :
Die gemäß dem obigen Schritt (b) aliquotierten Volumina von 30 ml der ersten Emulsion mit den Pre-Liposo- men werden ungekühlt bei Raumtemperatur verwendet und gemäß dem nachfolgenden Schritt (e) in einer im Durch fluss betriebenen, kontinuierlichen Zentrifugierein- richtung, wie sie oben unter Bezugnahme auf die Fig. 3 im Einzelnen erläutert ist, mit den gemäß dem obigen Schritt (c) aliquotierten Volumina von 30 ml der zwei¬ ten Emulsion mit den Amphiphil-Trägern in Kontakt ge bracht, wobei sich eine Phasengrenze zwischen den kon tinuierlichen Phasen der ersten und zweiten Emulsion ausbildet, an welcher sich die Mischung aus E80 und Cholesterol anreichern kann, ohne ein Organogel zu bil den .
(e) Zentrifugieren der ersten Emulsion (kontinuierliche
Phase aus der ersten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren, hydrophob; disperse Phase aus Pre-Liposo- men aus der hydrophilen Wirkstofflösunq mit monomoleku larer Schicht aus E80/Cholesterol im Molverhältnis von 60:40 mol-%) mit der hiermit über die Phasengrenze in Kontakt stehenden zweiten Emulsion (kontinuierliche Phase aus der flüssigen Phase 15 mM PP in Wasser, hyd rophil; disperse Phase aus Amphiphil-Trägern aus der hydrophoben zweiten Flüssigkeit Perfluoroperhydro- phenanthren mit monomolekularer Schicht aus E80/Cho- lesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-%) :
Zunächst wird das Totvolumen der kontinuierlichen Zentrifuge bei 1000 g (entsprechend etwa 9800 m/s2) durch kontinuierliche Injektion von ca. 13 ml einer seits der ersten Emulsion (hydrophobe erste Flüssigkeit Perfluoroperhydrophenanthren mit den hierin suspendier ten Pre-Liposomen) mit einer Flussrate von ca.
1 ml/min, andererseits der zweiten Emulsion (hydrophile flüssige Phase 15 mM PP in Wasser mit den hierin sus pendierten Amphiphil-Trägern) befüllt. Ab dem Überlau fen der Zentrifugierkammer werden beide Phasen (hydro phil/hydrophob) mit einer Flussrate von ca. 0,3 ml/min kontinuierlich zugeführt und weiterhin mit 1000 g kon tinuierlich zentrifugiert. Hierbei werden einerseits die Amphiphil-Träger aus der zweiten Emulsion im Zent rifugalfeld kontinuierlich der Phasengrenze zugeführt, um die zweite amphiphile Verbindung (E80/Cholesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-%) fortwährend an der Pha¬ sengrenze anzureichern. Andererseits werden die Pre- Liposomen aus der ersten Emulsion bzw. aus deren ersten Flüssigkeit ( Perfluoroperhydrophenanthren) durch die Phasengrenze hindurch in die flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) überführt, wobei sich die an der Phasengrenze angereicherte zweite amphiphile Verbindung (E80/Cho- lesterol im Molverhältnis von 80:20 mol-%) als zweite (äußere) monomolekulare Schicht an die erste (innere) monomolekulare Schicht aus der ersten amphiphilen Ver bindung (E80/Cholesterol im Molverhältnis von 60:40) anlagert, um die fertigen Liposomen zu bilden. Die Ge samtvolumina beider Phasen (hydrophil/hydrophob) betra gen dabei ca. 30 ml. Nach Abschluss der kontinuierli chen Zuführung der beiden Phasen (hydrophil/hydrophob) nach ca. 70 min. werden die beiden Phasen noch für weitere 20 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Die über die Auslasswehre (vgl. die Fig. 3) abfließenden Phasen wer den gesammelt.
Die hydrophile flüssige Phase (15 mM PP in Wasser) mit den hierin suspendierten fertigen - asymmetrischen - Lipo somen wird analog dem Beispiel 1 mittels PCS analysiert, um die mittlere Größe der derart erzeugten Liposomen zu be stimmen. Die auf diese Weise erzeugten Liposomen, welche eine unterschiedliche Zusammensetzung der inneren und äuße ren monomolekularen Schicht ihrer Bischicht besitzen, sind von sphärischer Gestalt und weisen eine mittlere Partikel- große von 367 nm ± 61 nm, eine Partikelanzahl von
3207 kcounts/s ± 52 kcounts/s (derived count rate) sowie einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,30 auf.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen
(L) , umfassend
- eine, insbesondere hydrophile, Lösung (L) des Wirk stoffes und
- wenigstens eine Bischicht aus zwei zumindest mono molekularen Schichten aus wenigstens einer ersten amphiphilen Verbindung (2), insbesondere aus der Gruppe der Lipide,
wobei die Wirkstofflösung (1) durch die Bischicht ver kapselt ist, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen einer, insbesondere hydrophilen,
Wirkstofflösung (1) des zu verkapselnden Wirkstof fes, indem der Wirkstoff in wenigstens einem, ins besondere hydrophilen, Lösungsmittel gelöst wird;
(b) Bereitstellen einer ersten Emulsion (4) durch Emul gieren der Wirkstofflösung (1) gemäß Schritt (a) in wenigstens einer mit dem wenigstens einen Lösungs mittel der Wirkstofflösung (1) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophoben, ersten Flüs sigkeit (3) in Gegenwart der wenigstens einen ers ten amphiphilen Verbindung (2), um eine zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) an die in der ersten Flüssigkeit (3) emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) anzulagern;
(c) Bereitstellen einer mit der ersten Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase (5);
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion (4) aus der ersten Flüssigkeit (3) mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) mit der hieran an gelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) gemäß Schritt (b) mit der flüssigen Phase (5) gemäß Schritt (c) unter Ausbildung einer Phasengrenze (6) zwischen der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und der flüssigen Phase (5) gemäß Schritt (c) , wobei die wenigstens eine erste amphi phile Verbindung (2) an dieser Phasengrenze (6) an gereichert wird; und
(e) Zentrifugieren der über die Phasengrenze (6) mit einander in Kontakt stehenden ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und der flüssigen Phase (5) gemäß Schritt (c) , um die Tropfen der in der ersten Emul sion (4) enthaltenen Wirkstofflösung (1) mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphi philen Verbindung (2) aus der ersten Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) in die flüssige Phase (5) gemäß Schritt (c) zu über führen, wobei beim Passieren der Phasengrenze (6) die dort angereicherte, wenigstens eine erste am phiphile Verbindung (2) unter Bildung einer zumin dest monomolekularen, äußeren Schicht derselben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) der Tropfen der Wirkstofflösung (1) angelagert wird, um die Bischicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens einen ers ten amphiphilen Verbindung (2) zu erzeugen,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) derart ge- wählt wird, dass die Löslichkeit der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) in der ersten Flüs sigkeit (3) höchstens 1 x 10~4 mol/1 beträgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslichkeit der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) in der ersten Flüssigkeit (3) höchstens 0,5 x IO 4 mol/1, insbesondere höchstens 1 x 105 mol/1, vorzugs weise höchstens 1 x 10 6 mol/1, beträgt.
3. Verfahren zur Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen (L) , umfassend
- eine, insbesondere hydrophile, Lösung (1) des Wirk stoffes und
- wenigstens eine Bischicht aus zwei zumindest mono molekularen Schichten aus wenigstens einer ersten amphiphilen Verbindung (2) und wenigstens einer zwei ten amphiphilen Verbindung (8), insbesondere jeweils aus der Gruppe der Lipide,
wobei die Wirkstofflösung (1) durch die Bischicht ver kapselt ist, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen einer, insbesondere hydrophilen,
Wirkstofflösung (1) des zu verkapselnden Wirkstof fes, indem der Wirkstoff in wenigstens einem, ins besondere hydrophilen, Lösungsmittel gelöst wird;
(b) Bereitstellen einer ersten Emulsion (4) durch Emul gieren der Wirkstofflösung (1) gemäß Schritt (a) in wenigstens einer mit dem wenigstens einen Lösungs mittel der Wirkstofflösung (1) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophoben, ersten Flüs sigkeit (3) in Gegenwart der wenigstens einen ers- ten amphiphilen Verbindung (2), um eine zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) an die in der ersten Flüssigkeit (3) emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) anzulagern;
(c) Bereitstellen einer Mischung (7) aus einer mit der ersten Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) ge mäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) ;
(d) Inkontaktbringen der ersten Emulsion (4) aus der ersten Flüssigkeit (3) mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) mit der hieran an gelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) gemäß Schritt (b) mit der Mischung (7) aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) gemäß Schritt (c) unter Ausbildung einer Phasengrenze (6) zwischen der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und der Mischung (7) gemäß Schritt (c), wobei zu mindest die wenigstens eine zweite amphiphile Ver bindung (8) an dieser Phasengrenze (6) angereichert wird; und
(e) Zentrifugieren der über die Phasengrenze (6) mit einander in Kontakt stehenden ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und der Mischung (7) gemäß
Schritt (c) , um die Tropfen der in der ersten Emul sion (4) enthaltenen Wirkstofflösung (1) mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphi philen Verbindung (2) aus der ersten Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) in die flüssige Phase der Mischung (7) gemäß Schritt (c) zu überführen, wobei beim Passieren der Phasen grenze (6) die dort angereicherte, wenigstens eine zweite amphiphile Verbindung (8) unter Bildung einer zumindest monomolekularen, äußeren Schicht derselben an die zumindest monomolekulare, innere Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) der Tropfen der Wirkstofflösung (1) angelagert wird, um die Bischicht aus den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) und der we nigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) zu erzeugen,
wobei die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Lös lichkeit der wenigstens einen ersten amphiphilen Ver bindung (2) in der ersten Flüssigkeit (3) höchstens 1 x 1CT4 mol/1 beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslichkeit sowohl der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbin dung (2) als auch der wenigstens einen zweiten amphip hilen Verbindung (8) in der ersten Flüssigkeit (3) höchstens 1 x IO-4 mol/1 beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeich net, dass die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass die Löslichkeit zumindest der wenigstens einen ersten am phiphilen Verbindung (2), insbesondere sowohl der we- nigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) als auch der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbin dung (8), in der ersten Flüssigkeit (3) höchstens
0,5 x 10-4 mol/1, insbesondere höchstens 1 x 10 5 mol/1, vorzugsweise höchstens 1 x 10 6 ol/1, beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, dass
- als Mischung (7) aus der, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) gemäß Schritt (c) eine zweite Emulsion (9) aus der flüssigen Phase und wenigstens einer hiermit nicht oder schlecht misch baren, insbesondere hydrophoben, zweiten Flüssigkeit (10) mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) eingesetzt wird, indem die zweite Flüssigkeit (10) in der flüssigen Phase in Gegenwart der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) emulgiert wird, um eine zumindest monomolekulare Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Ver bindung (8) an die in der flüssigen Phase emulgierten Tropfen der zweiten Flüssigkeit (10) anzulagern und die zweite amphiphile Verbindung (8) auf diese Weise an diesen Tropfen zu immobilisieren; und
- beim Zentrifugieren der über die Phasengrenze (6) miteinander in Kontakt stehenden ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und der in Form der zweiten Emulsi on (9) vorliegenden Mischung (7) gemäß Schritt (c) die Tropfen der zweiten Flüssigkeit (10) mit der hieran angelagerten, zumindest monomolekularen
Schicht der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) aus der flüssigen Phase der zweiten Emulsion (9) fortwährend an die Phasengrenze (6) zwi- sehen der ersten Emulsion (4) und der zweiten Emulsi on (9) überführt werden, um die wenigstens eine zwei te amphiphile Verbindung (8) fortwährend an dieser Phasengrenze (6) anzureichern.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mit der, insbesondere hydrophilen, flüssigen Phase der zweiten Emulsion (9) nicht oder schlecht mischbare, insbesondere hydrophobe, zweite Flüssigkeit (10) ent sprechend der, insbesondere hydrophoben, ersten Flüs sigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) gewählt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich net, dass die Mischung (7) in Form der zweiten Emulsion (9) gemäß Schritt (c) dadurch erzeugt wird, indem
- zunächst eine Mischung aus der flüssigen Phase gemäß Schritt (c) und der wenigstens einen zweiten amphi philen Verbindung (8) bereitgestellt wird; wonach
- die zweite Flüssigkeit (10) in dieser Mischung unter Bildung der zweiten Emulsion (9) emulgiert wird, in dem die zweite Flüssigkeit (10) in diese Mischung eindispergiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge kennzeichnet, dass die erste Emulsion (4) gemäß Schritt (b) dadurch erzeugt wird, indem zunächst
- eine Mischung aus der Wirkstofflösung (1) des zu ver kapselnden Wirkstoffes gemäß Schritt (a) und der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) bereitgestellt wird; wonach
- diese Mischung unter Bildung der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) in der ersten Flüssigkeit (3) emul- giert wird, indem die Mischung in die erste Flüssig keit (3) eindispergiert wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, dass als erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) eine hydrophobe Flüssig keit eingesetzt wird, welche insbesondere aus der Grup pe der
- flüssigen, teilweise oder gänzlich halogenierten
Kohlenwasserstoffe einschließlich der Fluorcarbone ,
- Silikonöle und
- Siloxane
einschließlich Mischungen hiervon gewählt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel der Wirkstofflö sung (1) gemäß Schritt (a) ein hydrophiles Lösungsmit tel, insbesondere auf wässriger und/oder alkoholischer Basis, eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass
- die erste Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) mit den hierin emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) mit der hieran angelagerten, zumindest monomole kularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) gemäß Schritt (b) derart gewählt wird, dass sie einen niedrigeren Schmelzpunkt aufweist als die Wirkstofflösung (1);
- die erste Emulsion (4) gemäß Schritt (b) auf eine
Temperatur zwischen dem Schmelzpunkt der ersten Flüs sigkeit (3) der ersten Emulsion (4) und dem Schmelz punkt der Wirkstofflösung (1) abgekühlt wird, um die in der ersten Flüssigkeit (3) emulgierten Tropfen der Wirkstofflösung (1) mit der an diese angelagerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) gemäß Schritt (b) in den festen Zustand zu überfüh ren; und sodann
- die erste Emulsion (4) gemäß Schritt (b) im festen Zustand der Wirkstofflösung (1) mit der mit der ers ten Flüssigkeit (3) der ersten Emulsion (4) gemäß Schritt (b) nicht oder schlecht mischbaren
• flüssigen Phase (5) oder
• Mischung (7) aus der flüssigen Phase mit der we nigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) unter Ausbildung der Phasengrenze (6) gemäß Schritt (d) in Kontakt gebracht wird und die über die Pha sengrenze (6) miteinander in Kontakt stehenden erste Emulsion (4) gemäß Schritt (b) und
• die flüssige Phase (5) oder
• die Mischung (7) aus der flüssigen Phase mit der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8)
gemäß Schritt (e) zentrifugiert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
dass die Wirkstofflösung (1) mit der an diese angela gerten, zumindest monomolekularen, inneren Schicht der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) wäh rend des Zentrifugierens im festen Zustand gehalten wird, um sie aufgrund eines dadurch bedingten Dichteun terschiedes von der Phasengrenze (6) fort in Richtung
• der flüssigen Phase (5) oder
• der Mischung (7) aus der flüssigen Phase mit der
wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbindung (8) zu bewegen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Bischicht aus
• den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) oder
• den beiden zumindest monomolekularen Schichten der wenigstens einen ersten amphiphilen Verbindung (2) und der wenigstens einen zweiten amphiphilen Verbin dung ( 8 ) ,
insbesondere ausschließlich die äußere, zumindest mono molekulare Schicht der Bischicht, durch Reaktion mit hydrophilen Polymerkonj ugaten modifiziert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es
- chargenweise in einer diskontinuierlichen Zentrifu giereinrichtung;
- semikontinuierlich in einer diskontinuierlichen Zent rifugiereinrichtung; oder
- kontinuierlich in einer im Durchfluss betriebenen, kontinuierlichen Zentrifugiereinrichtung
durchgeführt wird.
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