EP3824070A1 - Méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales - Google Patents

Méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales

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Publication number
EP3824070A1
EP3824070A1 EP19740582.2A EP19740582A EP3824070A1 EP 3824070 A1 EP3824070 A1 EP 3824070A1 EP 19740582 A EP19740582 A EP 19740582A EP 3824070 A1 EP3824070 A1 EP 3824070A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
wheat
cereals
trichoderma
fusarium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19740582.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie DUFRESNE
Julie OBERT
Tracy PLAINCHAMP
Olivier Besnard
Jean-Marc SENG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Universite Paris Saclay
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paris Saclay filed Critical Universite Paris Saclay
Publication of EP3824070A1 publication Critical patent/EP3824070A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/38—Trichoderma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a method of biocontrol of Fusarium wilt of cereals, and in particular of Fusarium wilt of the ear of wheat, by the use of a strain of the antagonistic fungus, Trichoderma sp.
  • Biocontrol is defined as a method of crop protection based on the use of macroorganisms, microorganisms, natural substances and chemical mediators (such as pheromones).
  • Fusarium wilt is a common fungal disease of cereals, especially caused by certain fungi of the genera Fusarium and Microdochium.
  • the development of these diseases in cereal crops varies greatly according to the species and varieties considered and according to the climatic conditions at the time of earing and beginning of flowering.
  • Fusarium head blight can cause significant yield losses (between 20 and 40% of yield in intensive farming) but above all it can cause grain contamination by the production of mycotoxins (such as my cotoxin "deoxynivalenol "Or” DON ”) and therefore a deterioration in the sanitary quality of the wheat grain.
  • FHB Fusarium head blight
  • M. nivale nivale and M. nivale majus have already been described in the literature.
  • Trichoderma harzianum a preventive application on the ear of wheat by Trichoderma harzianum was carried out by the Indian team from Panwar at al. (2014) 1 .
  • the authors manage to observe a certain protection against Fusarium head blight and propose a combination of two species of Trichoderma.
  • Trichoderma strains are Indian and the current recommendations for European regulations are to use strains from the country of origin (native strains), in this case strains from European countries. It is indeed important to be able to have native strains in order to limit the proliferation of unwanted organisms.
  • T. gamsii species has a major handicap: its sporulation is insufficient to allow aerial applications to be considered in the field. Thus, only incorporation on the ground is currently envisaged in Italy to fight against the early attacks of Fusarium.
  • One of the aims of the invention is to isolate one or more new strains of the antagonistic fungus, Trichoderma sp., which have a geographical origin in Europe, and preferably France, and which make it possible in particular to fight against Fusarium wilt of l 'ear of corn.
  • Another object of the invention is to isolate one or more new strains of Trichoderma sp. which can be applied by air (as opposed to soil) on cereal crops, including wheat crops.
  • Yet another object of the invention is to isolate one or more new strains of Trichoderma sp. which can replace (at least partially) the azole fungicidal chemicals currently used on the market to fight against Fusarium wilt in cereals, and in particular Fusarium wilt in the ear of wheat.
  • Another object of the invention is to isolate one or more new strains of Trichoderma sp. which can be used in combination with fungicides of the azole type, with the aim of significantly reducing the recommended approved dose of fungicide for an effective action in the fight against Fusarium wilt of cereals, and in particular Fusarium wilt of the ear of wheat.
  • the invention aims to find a new method of biocontrol of Fusarium wilt of cereals, and in particular of Fusarium wilt of the ear of wheat, which is an alternative or complementary method to the methods of fight against Fusarium wilt which mainly use azole fungicides.
  • Trichoderma sp After intense research carried out by the Inventors on the fungus Trichoderma sp, they have succeeded in isolating from soil of wheat crops in France strains of Trichoderma, and more particularly a strain of Trichoderma harzianum which has a very effective action in the fight against Fusarium wilt of cereals, and in particular Fusarium wilt of the ear of wheat.
  • This strain could also advantageously be used with fungicides of the azole type.
  • a first object of the invention resides in a new strain of Trichoderma harzianum.
  • a second object of the invention is the use of this new strain of Trichoderma harzianum for combating Fusarium wilt in cereals, and in particular Fusarium wilt in the ear of wheat.
  • Another object of the invention resides in a process for combating Fusarium wilt in cereals, and in particular against Fusarium wilt in the ear of wheat, characterized in that it comprises a step of bringing the new strain of Trichoderma into contact. harzianum with cereals.
  • compositions making it possible to combat fusarium wilt in cereals, said composition comprising the Trichoderma harzianum strain of the invention, a formulating agent and / or an adjuvant agent, and optionally a fungicidal agent of the type azole.
  • Another object of the invention resides in a kit comprising separately the Trichoderma harzianum strain of the invention and a fungicidal agent of the azole type.
  • the new strain of the invention is more particularly the Trichoderma harzianum strain deposited on June 12, 2018 with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 25-28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, under the number CNCM 1-5327.
  • strain in the present application more particularly designates a "filamentous fungus strain”.
  • filamentous fungus strain is understood to mean an individual of a given species composed of identical nuclei within the same cytoplasm. These identical nuclei give the strain identical and stable morphological, physiological and ecological properties. The strain is obtained after regeneration of a spore. If this spore is uninucleated, which is the case with Trichoderma, we speak of a clone.
  • the present invention also relates to the use of the strain Tr B for combating Fusarium wilt of cereals chosen from the group comprising wheat, Brachypodium distachyon, triticale, oats, rye and corn, and preferably the corn.
  • Wheat Brachypodium distachyon, triticale, oats, rye, and corn are cereals from the Poaceae family (Poaceae).
  • the above-mentioned wheat denotes both soft wheat and durum wheat.
  • varieties of soft wheat mention may be made of varieties of soft winter wheat such as Rubisko, Cellule, Apache and Boregar.
  • durum wheat varieties include varieties such as MySQL, Miradoux and Sculptur.
  • the term "combating” means a method of preventing and / or treating fusarium wilt in cereals, and preferably a method of preventing Fusarium wilt in wheat.
  • prevention method means total or partial prevention.
  • Total prevention will prevent cereals from being infected with Fusarium wilt once the Trichoderma strain of the invention has been applied to cereals.
  • Partial prevention will not prevent Fusarium wilt from developing, but nevertheless the symptoms caused by Fusarium wilt will be less severe and / or fewer ears will be infected with Fusarium wilt.
  • the Tr B strain of the invention is particularly effective in combating Fusarium wilt caused by a fungal phytopathogen of the genus Fusarium and / or Microdochium.
  • phytotopathogenic agent of the genus Fusarium mention may be made of those chosen from the group comprising Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium equiseti and their mixtures.
  • phytopathogenic agent of the genus Microdochium By way of examples of phytopathogenic agent of the genus Microdochium, mention may be made of Microdochium nivale, and more particularly the two subspecies M. nivale majus and M. nivale nivale.
  • the strain Tr B is particularly effective in combating Fusarium wilt of the ear of wheat.
  • the strain Tr B is particularly effective in reducing the content of mycotoxins present in wheat, said mycotoxins being in particular deoxynivalenol (DON).
  • DON deoxynivalenol
  • the Trichoderma Tr B strain of the invention therefore also makes it possible to fight against Fusarium wilt of the ear of wheat by reducing the content of DON mycotoxins present in wheat.
  • the application of the strain Tr B will be carried out at the level of the ear of the cereal, and preferably the ear of wheat.
  • the application of the strain Tr B will preferably be carried out from the beginning of the flowering of the cereals and until the full flowering of the cereals.
  • the application of the strain Tr B will advantageously be carried out from the BBCH 61 stage and up to the BBCH 65 stage.
  • one to two applications of the strain Tr B are sufficient for an effective action against Fusarium wilt of cereals, and in particular Fusarium wilt of the ear of wheat.
  • the “BBCH 61” stage corresponds to the start of flowering, the first anthers are visible.
  • the “BBCH 65” stage corresponds to full flowering, 50% of the anthers are out.
  • the Trichoderma Tr B strain is applied from the start of flowering of the cereals, several days before the BBCH 65 stage.
  • the strain Tr B is applied to cereals, at a concentration of spores ranging from 10 6 to 10 9 spores / ml, and preferably from 10 7 to 10 8 spores / ml, in a volume of 100 to 200 liters per hectare.
  • strain Trichoderma Tr B in combination with a fungicide of the azole type chosen from the group comprising prothioconazole, tebuconazole, metconazole, mefentrifluconazole and their mixtures.
  • a further subject of the invention is therefore the use of the Trichoderma Tr B strain for separate or sequential administration with said azole fungicide.
  • the fungicide will preferably be applied after the application of the strain Tr B on the ears.
  • the strain Tr B of the invention may be applied in a first step to the ear of wheat at the BBCH 61 stage, then a fungicide of the azole type may be applied in a second step to the ear of wheat at BBCH 65 stage.
  • the amount of fungicide is from 2% to 60%, and preferably from 4% to 35% of the recommended dose for effective action in the fight against Fusarium wilt.
  • the term “recommended dose” is understood to mean the dose usually used in agricultural practice. Thus the commercial specialties based on tebuconazole are approved at 1 l / ha (liter per hectare) but the recommended doses are rather at 0.8 l / ha, or even 0.75 l / ha.
  • the approved dose is the maximum dose authorized per treatment for a plant protection product (in this case fungicide) on a crop and for a target organism (for example a parasite or a rodent).
  • strain Tr B of the invention with the fungicide of the azole type is therefore particularly advantageous since it makes it possible to appreciably reduce the amounts of fungicide recommended for effective action.
  • the present invention also relates to a composition for combating Fusarium wilt in cereals, characterized in that it comprises:
  • the formulation agent and / or adjuvant agent is one of those usually used in compositions intended for agricultural use.
  • composition described above can be defined as a crop protection composition based on the use of living organisms and thus responds to the desire to reduce the dependence of agriculture on synthetic pesticides.
  • the invention also relates to a kit characterized in that it includes, separately:
  • a fungicide of the azole type chosen from the group comprising prothioconazole, tebuconazole, metconazole, mefentrifluconazole and their mixtures.
  • the present invention also relates to a process for combating Fusarium wilt in cereals, and preferably Fusarium wilt of the ear of wheat, said process being characterized in that it comprises a step of bringing the Trichoderma harzianum strain into contact. Tr B with cereals. As indicated above, said contact between the strain Tr B and the cereals takes place at the level of the ear of the cereals, and preferably of the ear of wheat.
  • the step of bringing the strain Tr B into contact with the cereals is carried out from the start of the flowering of the cereals and up to '' at full flowering of the cereals, i.e. from the BBCH 61 stage and up to the BBCH 65 stage.
  • the process for combating Fusarium wilt in cereals, and preferably Fusarium wilt in the ear of wheat is further characterized in that it further comprises a step of bringing the cereals into contact with an azole fungicide as defined above, said fungicide being applied separately or sequentially with the strain Tr B.
  • the fungicide will preferably be applied after the application of Trichoderma on the ears.
  • the subject of the invention is also a method of combating fusarium wilt in cereals, and preferably fusariosis in the ear of wheat, said method being characterized in that it comprises a step of bringing into contact with cereals a composition comprising:
  • Figure 1 is a symptom rating scale (scores 0, 1, 2, 3 or 4) on ears of Brachypodium distachyon (wild ecotype Bd2l-3) inoculated with the PH-1 strain of Fusarium graminearum.
  • FIG. 2 is a comparison of the scores observed 14 days after inoculation of the PH-1 strain of Fusarium graminearum on Brachypodium distachyon (wild ecotype Bd2l-3) treated or not with the strain of the invention Tr B and the comparative Trichoderma strains Tr A and Tr C.
  • Figures 3 and 4 represent the percentage of symptomatic spikelets on the Apogee variety of common wheat respectively 7 days (fig. 3) and 14 days (fig. 4) after contamination by the PH-1 strain of Fusarium graminearum.
  • Tr B is the Trichoderma strain of the invention
  • Horizon® is a commercial specialty of Bayer CropScience, the active ingredient of which is tebuconazole 250 g / l at the approved dose ("N" dose).
  • the white histograms represent the spray infection and the black histograms the point infection.
  • FIG. 5 represents the percentage of symptomatic spikelets on the Apogee variety of common wheat respectively at 7 days (black histograms) and 14 days (white histograms) after contamination by the FG1 and INRA349 strains of Fusarium graminearum.
  • Tr B is the strain of the invention.
  • Horizon® fungicide is used this time at one fifth of the registered dose (“N / 5” dose).
  • FIG. 6 represents the percentage of protection conferred by the strain Tr B of the invention against thephilsariose of the ears on the variety Apogee of soft wheat respectively at 7 days (black histograms) and at 14 days (white histograms) after contamination by the PH-1 strain of Fusarium graminearum. For all the conditions represented, the protection percentage was calculated relative to a control (Tween).
  • the strain Tr B of the invention is used alone or in combination with the fungicide Horizon®, said fungicide being used this time at twenty-fifth of the approved dose (dose "N / 25").
  • the Fusarium graminearum strain used in Examples 2, 3 and 5 is the PH-1 strain. This PH-1 strain was selected for its aggressiveness on common wheat, its production of my cotoxins and its DON / 15-acetyldeoxynivalenol chemotype (15 - ADON, only 17% of acetylated form on wheat, Goswami and Kistler, 2005) 7 .
  • the FG1 strain has characteristics similar to those of the PH-1 strain (in terms of aggressiveness and production of DON / 15-ADON mycotoxins).
  • the INRA349 strain has less aggressiveness as well as less production of mycotoxins while retaining the same DON / 15-ADON chemotype.
  • a small quantity of soil containing organic residues is sprinkled and immediately dispersed in a selective “generalist” isolation medium such as Potato Dextrose Agar (PDA) maintained by supercooling in Petri dishes (37 to 40 ° C) by stirring until solidification.
  • a selective “generalist” isolation medium such as Potato Dextrose Agar (PDA) maintained by supercooling in Petri dishes (37 to 40 ° C) by stirring until solidification.
  • PDA Potato Dextrose Agar
  • the suspension-dilution technique used is as follows: different successive dilutions of the suspension obtained are incorporated into the isolation medium. To do this, 10 ml of each of the dilutions are poured into an Erlenmeyer flask containing 90 ml of selective isolation medium maintained in supercooling in a water bath (between 37 ° C and 40 ° C).
  • the 100 ml are distributed in Petri dishes placed under the optimal conditions for isolation of Trichoderma. After an incubation time of 3 to 7 days, the dilution with a sufficient number of colonies but without confluence is identified. With the dilution chosen, the colonies can be isolated.
  • TME medium from Papavizas (1982): a mixture of glucose (1 g), agar (20 g) and distilled water (800 ml), is autoclaved. 200 ml of vegetable juice (V8® Vegetable and Fruit Juices - Campbell Soup) are added. The pH should be between 3.8 and 4. Neomycin sulfate (100 mg), bacitracin (100 mg), penicillin G (100 mg), chloroneb (100 mg), nystatin (20 mg), chlortetracycline HCl (25 mg) and sodium propionate (500 mg) are added to the still warm medium.
  • Isolation of Trichoderma populations is carried out after growth of the colonies in a Petri dish at 24 ° C, in the light for 3 to 7 days.
  • the purification is carried out by monospore isolation of each of the colonies (obtaining clones).
  • the spores are removed, then suspended in sterile water in order to dissociate them.
  • a separate culture is carried out for each spore dissociated (under a microscope) on a rich agar medium such as PDA or oat flakes in a Petri dish.
  • the morphological aspect of these strains during growth on various culture media is to be identified in order to determine a first classification of the isolated strains.
  • the characteristics observed are the evolution of the color of the colonies as a function of time, the morphological aspect of the thallus (aggregates, reverse, etc.) and of the conidia (shape, size, particle size or smooth, grouped or not, etc. ). Microscopic observation at low magnification (x40) reveals the type of trees and their forms of resistance (chlamydospores or others).
  • Trichoderma clones The optimal growth temperature for Trichoderma clones is determined on conventional media such as malt-agar, PDA, beet pulp, oat flakes, with a pH between 4 and 7.
  • Each strain was cultivated in Potato Dextrose liquid medium (PD, see composition below). 20 mL of PD medium were inoculated in a 100 mL Erlenmeyer flask by 1 mycelial implant 5 mm in diameter from a culture of the strain on a Petri dish of Potato Dextrose Agar medium (PDA, see composition below) 7 days (growth at 26 ° C). Each culture was incubated for 48 h at 20 ° C with shaking (120 rpm). At the end of this culture, the mycelium is harvested by filtration on sterile Miracloth (Calbiochem, Toulouse), dried in sterile filter paper then frozen with liquid nitrogen and stored at -80 ° C until use.
  • PD Potato Dextrose liquid medium
  • 20 mL of PD medium were inoculated in a 100 mL Erlenmeyer flask by 1 mycelial implant 5 mm in diameter from a culture of the strain on a Petri dish of Potato Dextrose Agar medium (PDA, see composition
  • Each frozen mycelium is ground into a fine powder with liquid nitrogen and then the genomic DNA is extracted according to the protocol described by Atoui et al. (2012) 4 .
  • the genomic DNA obtained is assayed by spectrophotometry (NanoDrop, Thermo Scientific) at 260 nm.
  • Amplification reactions by PCR are then carried out using 10 ng of genomic DNA from each strain of Trichoderma using two pairs of specific primers: the first is specific for the EF1 gene, a single gene encoding a factor d elongation of translation and the second of a region of ribosomal DNA, ITS 1 (Intemal Transcribed Spacer).
  • the protocol used is that described by Al-Sadi et al. (2015) 5 .
  • the nucleotide sequence of the primers is indicated in the table below:
  • the amplification products are then deposited on agarose gel (Tris Borate EDTA 0.5X - agarose 1.5%), purified using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel) and ligated into the plasmid pGEM-T Easy (Promega, France), according to the recommendations of the suppliers.
  • the ligation products are introduced by the thermal shock method into thermocompetent bacterial cells of the DH5a strain of Escherichia coli selected on Petri dishes of medium "Luria Bertani Agar" ("LBA", ThermoFischer Scientif ⁇ cs, France) supplemented with ampicillin at a final concentration of 100 pg / mL.
  • 5 independent ampicillin resistant clones are selected by amplification reaction. After growth with stirring (250 rpm) at 37 ° C overnight in 5 mL of Luria Bertani medium (LB, ThermoFischer Scientif ⁇ cs, France) + ampicillin (100 pg / mL), the cultures are pelleted then the plasmid DNA of each culture is extracted using the NucleoSpin® Plasmid kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the PCR product is then determined by sending the plasmids for sequencing (Euro fins Genomics, Germany).
  • nucleotide sequences of the 5 clones from the same amplification product is verified, it guarantees the purity of the strains (quality control of the purification step: in the case of amplification products of different sequences, the process is resumed from the purification step).
  • sequences of the specific amplification products of the EF1 gene and of the ITS 1 region are used as baits for the search for identical or very close sequences in the NCBI databases. (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) and TrichoKEY (http://www.isth.info/tools/molkey/), respectively.
  • Medium PD 1 liter of tap water containing 200 g of chopped potatoes is brought to a boil. The whole is filtered on carded cotton and supplemented with 20 g of glucose. The volume is adjusted to 1 liter before autoclaving 20 minutes at 120 ° C.
  • PDA medium same composition as PD medium with the addition of 20 g / L of agar.
  • Brachypodium distachyon (B. distachyon), studied in this example, is a monocotyledonous species of the family Poaceae, subfamily Pooideae. Its relatively small genome for a grass, its small size, its short cycle and its taxonomic proximity to major cereals determined its choice as a model organism in grass genomics. 1 Methodology
  • the seeds of B. distachyon of the wild ecotype Bd2l-3 are sterilized for ten minutes in 0.6% sodium miypochlorite with gentle stirring and then rinsed three times with sterile milli-Q® water under the same conditions.
  • the seeds are then placed at 4 ° C for 4 days, in the dark and in sterile milli-Q ® water. Sowing takes place on a 2/1 (v / v) mixture of potting soil and perlite, in pots 13 cm in diameter with a density of 5 seeds per pot.
  • the growth takes place under the following conditions: 20 h of light at 24 ° C and 4 h of darkness at 20 ° C in order to get rid of the vernalization and to synchronize the flowering.
  • the strains (Trichoderma and PH-1) are cultivated on Potato Dextrose Agar medium (PDA) supplemented with ampicillin and kanamycin at a final concentration of 100 and 50 pg / l, respectively, in an oven at 26 ° C and are transplanted every 2 to 3 weeks.
  • PDA Potato Dextrose Agar medium
  • the spore suspension is filtered through a sterile Miracloth and the conidiospores are counted on a Thoma cell and then resuspended in Tween 20 (surfactant) at 0.01% at a final concentration of 10 5 conidiospores / ml.
  • the punctual inoculation of the PH-1 strain of Fusarium graminearum is carried out on the 2nd spikelet starting from the top of the ear concerned.
  • 3 ml of the PH-1 spore suspension at a concentration of 10 5 spores / ml are inserted between the lower and upper glumellae of a flower located in the middle of the spikelet, in order to synchronize the symptoms.
  • the inoculated plants are then placed under the following controlled conditions: temperature 20 ° C, humidity of 65% and a cycle of short days (8h of day and 16h of darkness).
  • FIG. 1 illustrates the “symptoms / score” correspondence of ears of B. distachyon (wild ecotype Bd2l-3) inoculated with the PH-1 strain of F. graminearum.
  • Table 1 In planta evaluation of the efficacy of the 3 Trichoderma sp. (Tr A, Tr B and Tr C) against the PH-1 strain of F. graminearum.
  • the indigenous Tr B strain of the invention shows an efficiency greater than 36% (versus 25% for Tr A and 15% for Tr C).
  • the strain Tr B of the invention is particularly advantageous by its origin (since it comes from French wheat soil) but also by its screening on the model cereal, Brachypodium distachyon. Indeed, the screening of Trichoderma strains of interest in planta is a major advance because the majority of the work described in the literature concerns in vitro and not in planta selections. The mechanisms of action of Trichoderma are complex (secondary metabolites, enzymes, stimulation of plant defense, competitiveness) and are in favor of an in planta selection of strains, difficult to implement on wheat (too long and complex).
  • the inventors have advantageously succeeded in validating the use of the model B. distachyon cereal as a means of selecting the best candidates to test on wheat.
  • the Apogee spring variety wheat seeds are sterilized and sown under the same conditions as those of Example 2.
  • strains (Trichoderma and PH-1) are cultivated under the same conditions as those of Example 2.
  • Trichoderma Tr B 48 h before the BBCH 65 stage.
  • Trichoderma is inoculated by spraying until runoff on wheat ears using a suspension of spores calibrated at 10 7 spores / mL.
  • a spray infection allows a titrated spore suspension to be sprayed over the entire ear.
  • the plants are incubated in a climatic chamber under the following conditions: 16 hours of light at 24 ° C +/- 5 ° C under a fluorescent lamp (265 mE xm 2 xs 1 ) at ground level).
  • the symptom readings are taken as a function of time using a rating scale by counting symptomatic spikelets out of the total number of spikelets in each spike (i.e. the percentage of symptomatic spikelets).
  • the percentage of infection of the ears with PH-1 is less than 50% (compared to 100% for the Tween control) with TrB alone.
  • the TrB strain is capable of providing significant protection against fusarium wilt under the experimental conditions described, regardless of the mode of contamination of Fusarium.
  • the dose of Horizon® fungicide used is the registered dose (“N” dose) (which is 250 g / l of tebuconazole).
  • N registered dose
  • the dose N used under controlled conditions provides satisfactory protection at 7 days (fig. 3) and 14 days (fig. 4) against fusarium wilt.
  • the Apogee spring variety wheat seeds are sterilized and sown under the same conditions as those of Example 2.
  • strains (Trichoderma, FG1 and INRA349) are cultivated under the same conditions as those of Example 2.
  • Trichoderma Tr B 48 h before the BBCH 65 stage.
  • Trichoderma is inoculated by spraying until runoff on wheat ears using a suspension of spores calibrated at 10 7 spores / mL.
  • the infection is carried out by spray (spray) and allows a titrated spore suspension to be sprayed over the entire ear.
  • the plants are incubated in a climatic chamber under the same conditions as those of Example 3.
  • Trichoderma TrB strain of the invention is observed against the strain of F. graminearum FG1 as that usually measured against the strain of F. graminearum PH-1 (52% at 7 days and 40% at 14 days (fig. 5)).
  • the Apogee spring variety wheat seeds are sterilized and sown under the same conditions as those of Example 2.
  • strains (Trichoderma, PH-1) are cultivated under the same conditions as those of Example 2.
  • Trichoderma Tr B spores spore suspension calibrated at 10 7 spores / mL
  • the azole fungicide at the dose N / 25 is carried out extemporaneously in water.
  • the approved dose of Horizon® fungicide used is the “N” dose (which is 250 g / l of tebuconazole).
  • the dose "N” used under controlled conditions provides total protection, making it impossible to see differences.
  • the dose used to quantify the respective contribution of Trichoderma Tr B and of the fungicide Horizon® was determined to be “N / 25”.
  • the in planta test is thus based on a preventive inoculation of the ears, 48 h before the BBCH 65 stage, by:
  • Wheat ears are inoculated with these different preparations by spraying until runoff.
  • the infection is carried out by spray (spray) and allows a titrated spore suspension to be sprayed over the entire ear.
  • the plants are incubated in a climatic chamber under the same conditions as those of Example 3.
  • Trichoderma Tr B strain of the invention alone confers protection against fusarium wilt by 55% at 7 days after inoculation and by 40% at 14 days after inoculation (FIG. 6).
  • Horizon® fungicide at the dose "N / 25” provides 88% protection at 7 days after inoculation and 65% at 14 days (fig. 6).
  • This protective efficacy of the mixture of the Trichoderma Tr B strain of the invention with the dose “N / 25” of Horizon® fungicide is increased to 14 days after inoculation in comparison with the fungicide Horizon® alone at the dose “N / 25” .

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Abstract

La présente invention a pour objet unenouvelle souche Trichoderma harzanium déposée le 12 juin 2018 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15,sous le numéro CNCM I-5327. L'invention a également pourobjet l'utilisation de cette souche Trichoderma harzanium pour lutter contre la fusariose de céréales choisies dans le groupe comprenant le blé, Brachypodium distachyon, letriticale, l'avoineetle seigle, et plus particulièrement pour lutter contre la fusariose de l'épi de blé.

Description

Méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales
La présente invention se rapporte à une méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales, et notamment de la fusariose de l’épi de blé, par l’utilisation d’une souche du champignon antagoniste, Trichoderma sp.
Le biocontrôle est défini comme une méthode de protection des cultures basée sur le recours à des macroorganismes, des microorganismes, des substances naturelles et des médiateurs chimiques (comme les phéromones).
La volonté de réduire la dépendance de l’agriculture aux pesticides de synthèse stimule de façon croissante l’innovation dans le domaine du biocontrôle.
Les fusarioses sont des maladies fongiques courantes des céréales, notamment causées par certains champignons des genres Fusarium et Microdochium. Le développement de ces maladies dans les cultures de céréales varie beaucoup selon les espèces et variétés considérées et selon les conditions climatiques au moment de l’épiaison et début de floraison.
La fusariose de l’épi de blé peut occasionner des pertes importantes de rendement, (entre 20 et 40% du rendement en agriculture intensive) mais surtout elle peut provoquer une contamination des grains par la production de mycotoxines (telles que la my cotoxine « déoxynivalénol » ou « DON ») et donc une dégradation de la qualité sanitaire du grain de blé.
Des études concernant l’utilisation de Trichoderma pour protéger les cultures de blé à l’encontre de la fusariose de l’épi de blé (« FHB » acronyme anglais de « Fusarium Head Blight »), causée par un complexe d’espèces telles que Fusarium graminearum et Microdochium nivale (M. nivale nivale et M. nivale majus) ont déjà été décrites dans la littérature.
Ainsi, une application sur l’épi de blé en préventif par Trichoderma harzianum a été réalisée par l’équipe indienne de Panwar at al. (2014)1. Les auteurs arrivent à observer une certaine protection à l’encontre de la fusariose de l’épi et proposent une combinaison de deux espèces de Trichoderma.
Cependant, la combinaison de deux espèces est difficilement envisageable sur le plan industriel étant donné les difficultés à standardiser la production de plusieurs microorganismes vivants au sein d’une même préparation. En outre les souches de Trichoderma sont indiennes et les recommandations actuelles en matière de règlementation européenne sont d’utiliser des souches issues du pays d’origine (souches indigènes), en l’occurrence des souches provenant de pays européens. Il est en effet important de pouvoir disposer de souches indigènes afin de limiter la prolifération d’organismes non désirés.
Dans la publication de Mahmoud (2016)2 il est décrit l’utilisation de Trichoderma harzianum et de Bacillus subtilis à l’encontre de la fusariose de l’épi de blé.
Là encore, les souches isolées sont égyptiennes, ce qui compromet une mise en œuvre européenne. En outre le dispositif expérimental décrit dans Mahmoud (2016) est éloigné de la réalité agronomique puisque l’antagoniste (T. harzianum et/ou B. subtilis ) est inoculé en même temps que le pathogène Fusarium (contamination artificielle) ce qui n’est jamais le cas en culture du blé puisque les deux microorganismes ont une biologie propre et seront appliqués sur les épis à des temps différents.
Enfin, il est décrit dans la publication italienne de Sarrocco et al. (2013)3 l’utilisation de Trichoderma gamsii à l’encontre de la fusariose de l’épi de blé.
L’espèce T. gamsii possède cependant un handicap majeur : sa sporulation est insuffisante pour permettre d’envisager des applications aériennes en plein champ. Ainsi, seule une incorporation au sol est aujourd’hui envisagée en Italie pour lutter contre les attaques précoces de Fusarium.
Il existe donc toujours à ce jour le besoin de développer de nouvelles souches de Trichoderma sp. permettant de lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
Un des buts de l’invention est d’isoler une ou plusieurs nouvelles souches du champignon antagoniste, Trichoderma sp., qui ont pour origine géographique l’Europe, et de préférence la France, et qui permettent notamment de lutter contre la fusariose de l’épi de blé.
Un autre but de l’invention est d’isoler une ou plusieurs nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent être appliquées de façon aérienne (par opposition au sol) sur les cultures de céréales, et notamment les cultures de blé.
Encore un autre but de l’invention est d’isoler une ou plusieurs nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent se substituer (au moins partiellement) aux produits chimiques fongicides du type azole actuellement utilisés sur le marché pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé. Un autre but de l’invention est d’isoler une ou plusieurs nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent être utilisées en association avec les fongicides du type azole, dans le but de réduire signifîcativement la dose homologuée préconisée de fongicide pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
De façon générale, l’invention a pour but de trouver une nouvelle méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales, et notamment de la fusariose de l’épi de blé, qui soit une méthode alternative ou complémentaire aux méthodes de lutte contre la fusariose qui emploient principalement des fongicides du type azole.
Après d’intenses recherches menées par les Inventeurs sur le champignon Trichoderma sp, ces derniers ont réussi à isoler à partir de sols de cultures de blés en France des souches de Trichoderma, et plus particulièrement une souche de Trichoderma harzianum qui présente une action très efficace dans la lutte contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
Cette souche pourra encore avantageusement être utilisée avec des fongicides de type azole.
Un premier objet de l’invention réside dans une nouvelle souche de Trichoderma harzianum.
Un deuxième objet de l’invention est l’utilisation de cette nouvelle souche de Trichoderma harzianum pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
Un autre objet de l’invention réside dans un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et notamment contre la fusariose de l’épi de blé, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de mise en contact de la nouvelle souche de Trichoderma harzianum avec les céréales.
Un autre objet de l’invention réside dans une composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales, ladite composition comprenant la souche Trichoderma harzianum de l’invention, un agent de formulation et/ou un agent adjuvant, et éventuellement un agent fongicide du type azole.
Un autre objet de l’invention réside dans un kit comprenant de façon séparée la souche Trichoderma harzianum de l’invention et un agent fongicide du type azole. La nouvelle souche de l’invention est plus particulièrement la souche Trichoderma harzianum déposée le 12 juin 2018 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, sous le numéro CNCM 1-5327.
Au cours des recherches menées par les Inventeurs ces derniers ont également isolé les souches suivantes :
- Trichoderma harzianum déposée le 12 juin 2018 auprès de la CNCM sous le numéro CNCM 1-5326,
- Trichoderma longibrachiatum déposée le 12 juin 2018 auprès de la CNCM sous le numéro CNCM 1-5328.
Cependant il s’avère que ces souches sont d’une efficacité bien moindre sur la fusariose de l’épi de blé comparée à celle de la souche CNCM 1-5327 (voir exemple 2).
Dans un but de concision, les souches ci-dessus mentionnées seront respectivement dénommées dans ce qui suit :
- « Tr B » pour la souche Trichoderma harzianum objet de l’invention, déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM 1-5327,
- « Tr A » pour la souche déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM 1-5326, et
- « Tr C » pour la souche déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM 1-5328.
L’expression « souche » dans la présente demande désigne plus particulièrement une « souche de champignon filamenteux ». On entend par « souche de champignon filamenteux » un individu d’une espèce donnée composé de noyaux identiques au sein d’un même cytoplasme. Ces noyaux identiques confèrent à la souche des propriétés morphologiques, physiologiques et écologiques identiques et stables. La souche est obtenue après régénération d’une spore. Si cette spore est uninucléée, ce qui est le cas chez Trichoderma, on parle alors de clone.
La présente invention a encore pour objet l’utilisation de la souche Tr B pour lutter contre la fusariose de céréales choisies dans le groupe comprenant le blé, Brachypodium distachyon, le triticale, l’avoine, le seigle et le maïs, et de préférence le blé.
Le blé, Brachypodium distachyon, le triticale, l’avoine, le seigle, et le maïs sont des céréales de la famille des Poaceae (Poacées). Le blé ci-dessus cité désigne aussi bien le blé tendre que le blé dur. A titre d’exemples de variétés de blé tendre, on pourra citer des variétés de blé tendre d’hiver telles que Rubisko, Cellule, Apache et Boregar.
A titre d’exemples de variétés de blé dur, on pourra citer des variétés telles que Babylone, Miradoux et Sculptur.
Selon l’invention, on entend par « lutter contre » une méthode de prévention et/ou de traitement de la fusariose des céréales, et de préférence une méthode de prévention de la fusariose du blé.
On entend par « méthode de prévention » au sens de l’invention, une prévention totale ou partielle. Une prévention totale permettra d’éviter que les céréales soient contaminées par la fusariose une fois que la souche Trichoderma de l’invention aura été appliquée sur les céréales. Une prévention partielle n’empêchera pas la fusariose de se déclarer mais néanmoins les symptômes provoqués par la fusariose seront moins sévères et/ou moins d’épis seront contaminés par la fusariose.
La souche Tr B de l’invention est particulièrement efficace pour lutter contre la fusariose causée par un phytopathogène fongique du genre Fusarium et/ou Microdochium.
A titre d’exemples d’agent phytotopathogène du genre Fusarium, on pourra citer ceux choisis dans le groupe comprenant Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium equiseti et leurs mélanges.
A titre d’exemples d’agent phytopathogène du genre Microdochium, on pourra citer Microdochium nivale, et plus particulièrement les deux sous espèces M. nivale majus et M. nivale nivale.
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la souche Tr B est particulièrement efficace pour lutter contre la fusariose de l’épi de blé.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, la souche Tr B est particulièrement efficace pour diminuer la teneur en mycotoxines présentes dans le blé, lesdites mycotoxines étant notamment le déoxynivalénol (DON).
En effet, certains agents phytopathogènes du genre Fusarium comme par exemple F. graminearum sont responsables de la production de mycotoxines telles que DON. Dans l’Union européenne les valeurs maximales autorisées concernant les my cotoxines les plus courantes, comme le DON, dans les produits agricoles et alimentaires, ont été fixées par le Règlement 1881/2006.
Ainsi par voie de conséquence, la souche Trichoderma Tr B de l’invention permet donc également de lutter contre la fusariose de l’épi de blé en diminuant la teneur en mycotoxines DON présentes dans le blé.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, l’application de la souche Tr B sera effectuée au niveau de l’épi de la céréale, et de préférence l’épi de blé.
Plus particulièrement selon l’invention, l’application de la souche Tr B sera de préférence effectuée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu’à la pleine floraison des céréales.
Autrement dit, l’application de la souche Tr B sera avantageusement effectuée à partir du stade BBCH 61 et jusqu’au stade BBCH 65.
De préférence selon l’invention, une à deux applications de la souche Tr B sont suffisantes pour une action efficace contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
L’échelle « BBCH » (« BBCH » acronyme allemand de « Biologische
Bundesanstalt Bundessortenamt und CHemische Industrie ») des céréales décrit le développement phénologique des céréales à l’aide du code BBCH.
Le stade « BBCH 61 » correspond au début de la floraison, les premières anthères sont visibles.
Le stade « BBCH 65 » correspond à la pleine floraison, 50% des anthères sont sorties.
Pour une céréale telle que le blé, le risque principal d’épidémie causée par le phytopathogène Fusarium ou Microdochium se situe à la pleine floraison des céréales, au stade BBCH 65.
Cependant les épidémies ne sont pas toujours synchrones et peuvent être étalées dans le temps. Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la souche Trichoderma Tr B est appliquée dès le début de la floraison des céréales, plusieurs jours avant le stade BBCH 65.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, la souche Tr B est appliquée sur les céréales, à une concentration de spores allant de 106 à 109 spores/ml, et de préférence de 107 à 108 spores/ml, dans un volume de 100 à 200 litres par hectare.
Il est également possible selon l’invention d’utiliser la souche Trichoderma Tr B en association avec un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le métconazole, le méfentrifluconazole et leurs mélanges.
L’invention a ainsi encore pour objet une utilisation de la souche Trichoderma Tr B pour une administration séparée ou séquentielle avec ledit fongicide du type azole.
Selon l’invention le fongicide sera appliqué de préférence après l’application de la souche Tr B sur les épis.
A titre d’exemple, la souche Tr B de l’invention pourra être appliquée dans un premier temps sur l’épi de blé au stade BBCH 61, puis un fongicide du type azole pourra être appliqué dans un second temps sur l’épi de blé au stade BBCH 65.
Selon un mode de réalisation de l’invention, lorsque la souche Tr B de l’invention est utilisée en association avec le fongicide du type azole, alors la quantité de fongicide est de 2% à 60%, et de préférence de 4% à 35% de la dose préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose.
En d’autres termes, cela signifie que lorsque le fongicide du type azole est associé avec la souche Tr B de l’invention, alors sa quantité préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose peut être diminuée de 40% à 90% pour une action au moins aussi efficace, voire supérieure, que si le fongicide avait été utilisé à la dose préconisée.
On entend par « dose préconisée » la dose habituellement mise en œuvre dans la pratique agricole. Ainsi les spécialités commerciales à base de tébuconazole sont homologuées à 1 l/ha (litre par hectare) mais les doses préconisées se situent plutôt à 0,8 l/ha, voire à 0,75 l/ha. La dose homologuée est la dose maximale autorisée par traitement pour un produit phytosanitaire (en l’occurrence le fongicide) sur une culture et pour un organisme cible (par exemple un parasite ou un rongeur).
L’association de la souche Tr B de l’invention avec le fongicide du type azole est donc particulièrement avantageuse car elle permet de diminuer sensiblement les quantités de fongicide préconisées pour une action efficace.
Trouver de nouveaux moyens de réduire les doses de pesticides en les associant à d’autres produits répond notamment à la stratégie thématique de l’Union Européenne de 2006 (http ://data. europa.eu/ eli/ dir/2009/ 128/oi ) sur l’utilisation durable des pesticides.
La présente invention concerne également une composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales caractérisée en ce qu’elle comprend :
- la souche Trichoderma harzianum Tr B, et
- un agent de formulation et/ou un agent adjuvant.
L’agent de formulation et/ou agent adjuvant est un de ceux habituellement utilisé(s) dans des compositions destinées à un usage agricole.
La composition ci-dessus décrite peut être définie comme une composition de protection des cultures basée sur le recours à des organismes vivants et répond ainsi à la volonté de réduire la dépendance de l’agriculture aux pesticides de synthèse.
L’invention a encore pour objet un kit caractérisé en ce qu’il comprend, de façon séparée :
- la souche Trichoderma harzianum Tr B,
- un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le metconazole, le méfentrifluconazole et leurs mélanges.
La présente invention a encore pour objet un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l’épi de blé, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comporte une étape de mise en contact de la souche Trichoderma harzianum Tr B avec les céréales. Comme indiqué précédemment, ledit contact entre la souche Tr B et les céréales a lieu au niveau de l’épi des céréales, et de préférence de l’épi de blé.
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, dans le procédé de lutte contre la fusariose des céréales, l’étape de mise en contact de la souche Tr B avec les céréales est effectuée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu’à la pleine floraison des céréales, soit à partir du stade BBCH 61 et jusqu’au stade BBCH 65.
Le procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l’épi de blé, est encore caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de mise en contact des céréales avec un fongicide de type azole tel que défini ci-dessus, ledit fongicide étant appliqué de façon séparée ou séquentielle avec la souche Tr B.
Selon ledit procédé, le fongicide sera appliqué de préférence après l’application de Trichoderma sur les épis. L’invention a également pour objet un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l’épi de blé, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comporte une étape de mise en contact avec les céréales d’une composition comprenant :
- la souche Tr B, et
- un agent de formulation et/ou un agent adjuvant.
L’invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs et purement illustratifs suivants. Les figures 1 à 6 permetent d’illustrer lesdits exemples ci-dessous.
La figure 1 est une échelle de notation des symptômes (scores 0, 1, 2, 3 ou 4) sur épis de Brachypodium distachyon (écotype sauvage Bd2l-3) inoculés avec la souche PH-l de Fusarium graminearum.
La figure 2 est une comparaison des scores observés 14 jours après inoculation de la souche PH-l de Fusarium graminearum sur Brachypodium distachyon (écotype sauvage Bd2l-3) traités ou non avec la souche de l’invention Tr B et les souches Trichoderma comparatives Tr A et Tr C. Les figures 3 et 4 représentent le pourcentage d’épillets symptomatiques sur la variété Apogee de blé tendre respectivement 7 jours (fig. 3) et 14 jours (fig. 4) après contamination par la souche PH-l de Fusarium graminearum.
Tween est le témoin non infecté, Tr B est la souche Trichoderma de l’invention et Horizon® est une spécialité commerciale de Bayer CropScience, dont la matière active est le tébuconazole 250 g/l à la dose homologuée (dose « N »).
Les histogrammes blancs représentent l’infection par spray et les histogrammes noirs l’infection ponctuelle.
La figure 5 représente le pourcentage d’épillets symptomatiques sur la variété Apogee de blé tendre respectivement à 7 jours (histogrammes noirs) et à 14 jours (histogrammes blancs) après contamination par les souches FG1 et INRA349 de Fusarium graminearum.
Tween est le témoin non infecté, Tr B est la souche de l’invention. Le fongicide Horizon® est cette fois utilisé à un cinquième de la dose homologuée (dose « N/5 »).
Les différences significatives sont indiquées par des lettres différentes (test statistique de Mann et Whitney, a = 5%). Les lettres minuscules (histogrammes noirs) représentent les résultats 7 jours après inoculation et les lettres majuscules (histogrammes blancs) 14 jours après inoculation.
La figure 6 représente le pourcentage de protection conféré par la souche Tr B de l’invention contre la füsariose des épis sur la variété Apogee de blé tendre respectivement à 7 jours (histogrammes noirs) et à 14 jours (histogrammes blancs) après contamination par la souche PH-l de Fusarium graminearum. Pour toutes les conditions représentées, le pourcentage de protection a été calculé relativement à un contrôle (Tween).
La souche Tr B de l’invention est utilisée seule ou en association avec le fongicide Horizon®, ledit fongicide étant cette fois utilisé à un vingt-cinquième de la dose homologuée (dose « N/25 »).
Les différences significatives sont indiquées par des lettres différentes (test statistique de Mann et Whitney, a = 5%). Les lettres minuscules (histogrammes noirs) représentent les résultats 7 jours après inoculation et les lettres majuscules (histogrammes blancs) 14 jours après inoculation. Les souches isolées et étudiées dans les exemples ci-dessous sont la souche de l’invention Tr B et les deux souches comparatives Tr A ( Trichoderma harzianum ) et Tr C ( Trichoderma longibrachiatum) telles que définies ci-dessus.
La souche de Fusarium graminearum utilisée dans les exemples 2, 3 et 5 est la souche PH-l. Cette souche PH-l a été sélectionnée pour son agressivité sur blé tendre, sa production de my cotoxines et son chémotype de type DON/l5-acétyldéoxynivalénol (15 - ADON, seulement 17% de forme acétylée sur blé, Goswami et Kistler, 2005)7.
Les autres souches de Fusarium graminearum, à savoir FG1 (souche non déposée, issue de la collection de l’équipe des Inventeurs) et INRA349, sont utilisées dans l’exemple 4.
La souche FG1 présente des caractéristiques similaires à celles de la souche PH-l (en terme d’agressivité et de production de mycotoxines de type DON/15-ADON).
La souche INRA349 présente une agressivité moindre ainsi qu’une production moins importante de mycotoxines tout en conservant le même chémotype de type DON/15-ADON.
Exemple 1
Isolement et caractérisation des souches de Trichoderma Tr A, Tr B et Tr C
Différents sols cultivés avec des blés tendres ou des blés durs ont été prélevés au cours de l’été 2015 dans le département de l’Hérault. Des carottages de petits diamètres (5 cm) sont réalisés dans une même parcelle, et selon une profondeur variable de 1 à 30 cm.
L’isolement et la purification de plusieurs souches du genre Trichoderma ont été réalisés sur milieux sélectifs en laboratoire dans le but de générer une collection de différentes souches issues de blé et provenant du territoire français.
Prélèvements et isolements des Trichoderma
Une faible quantité de terre contenant des résidus organiques est saupoudrée et immédiatement dispersée dans un milieu sélectif d’isolement « généraliste » comme le Potato Dextrose Agar (PDA) maintenu en surfusion en boîtes de Pétri (37 à 40°C) par agitation jusqu’à solidification. Dans le cas des matières organiques du sol obtenues après mise en suspension dans l’eau puis tamisage, la technique des suspensions-dilutions employée est la suivante : différentes dilutions successives de la suspension obtenue sont incorporées dans le milieu d’isolement. Pour ce faire, 10 ml de chacune des dilutions sont versés dans un erlenmeyer contenant 90 ml de milieu sélectif d’isolement maintenu en surfusion au bain-marie (entre 37°C et 40°C). Après homogénéisation, les 100 ml sont répartis dans des boîtes de Pétri placées dans les conditions optimales d’isolement des Trichoderma. Après un temps d’incubation de 3 à 7 jours, la dilution présentant un nombre de colonies suffisant mais sans confluence est repérée. La dilution étant choisie, l’isolement des colonies peut être effectué.
Les milieux nutritifs sélectifs pour les Trichoderma sont décrits ci-après.
Milieu TME de Papavizas (1982) : un mélange de glucose (1 g), gélose (20 g) et d’eau distillée (800 ml), est autoclavé. 200 ml de jus de légumes (V8® Vegetable and Fruit Juices - Campbell Soup) sont ajoutés. Le pH doit être compris entre 3,8 et 4. Du sulfate de néomycine (100 mg), de la bacitracine (100 mg), de la pénicilline G (100 mg), du chloronèbe (100 mg), de la nystatine (20 mg), de la chlortétracycline HCl (25 mg) et du propionate de sodium (500 mg) sont ajoutés au milieu encore tiède.
Milieu TSM d’Elad et al. (1981) : ce milieu est constitué de MgS04, 7H20 (0,2 g) ; K2HP04 (0,9 g) ; KC1 (150 mg) ; NH4NO3 (1 g) ; glucose (3 g) ; chloramphénicol (250 mg) ; fénaminosulf (300 mg) ; quintozène (200 mg) ; rose bengale (150 mg) ; gélose (20 g) ; eau distillée (1000 ml).
Milieu de Davet (1979) : Ca(N03)2 (lg), CaCl2, 2H20 (1 g) ; KN03 (250 mg) ; MgS04, 7H20 (250 mg) ; KH2P04 (125 mg) ; saccharose (2 g) ; acide citrique (50 mg) ; gélose (25 g); eau distillée (1000 ml). Après autoclavage, le pH est ajusté à 4,5 avec du HCl 1N et du sulfate de streptomycine (30 mg), de la vinchlozoline (2,5 mg) et de l’alcool allylique (0,5 ml) est ajouté au milieu tiède.
L’isolement des populations de Trichoderma est réalisé après croissance des colonies en boîte de Pétri à 24°C, à la lumière pendant 3 à 7 jours. La purification est effectuée par isolement monospore de chacune des colonies (obtention de clones).
Pour chaque colonie, les spores sont prélevées, puis mises en suspension dans de l’eau stérile afin de les dissocier. On réalise une culture séparée pour chaque spore dissociée (au microscope) sur un milieu gélosé riche tel que le PDA ou les flocons d’avoines en boîte de Pétri.
Par la suite, l’aspect morphologique de ces souches lors des croissances sur divers milieux de cultures est à identifier afin de déterminer un premier classement des souches isolées.
Les caractéristiques observées sont l’évolution de la couleur des colonies en fonction du temps, l’aspect morphologique du thalle (agrégats, revers, etc...) et des conidies (forme, taille, granulométrie ou lisse, groupées ou non, etc...). L’observation microscopique à faible grossissement (x40) révèle le type d’arborescences et leurs formes de résistances (chlamydospores ou autres).
A plus fort grossissement, l’organisation des structures conidiogènes est étudiée (ramifications, conidiophore, phialides, conidiospores).
La température de croissance optimale des clones de Trichoderma est déterminée sur milieux classiques comme le malt-agar, le PDA, la pulpe de betterave, les flocons d’avoine, avec un pH compris entre 4 et 7.
Caractérisation moléculaire des souches Trichoderma
Chaque souche a été cultivée en milieu liquide Potato Dextrose (PD, voir composition ci-dessous). 20 mL de milieu PD ont été inoculés dans un erlen de 100 mL par 1 implant mycélien de 5 mm de diamètre issu d’une culture de la souche sur boîte de Pétri de milieu Potato Dextrose Agar (PDA, voir composition ci-dessous) âgée de 7 jours (croissance à 26°C). Chaque culture a été incubée pendant 48h à 20°C sous agitation (120 rpm). A l’issue de cette culture, le mycélium est récolté par filtration sur Miracloth (Calbiochem, Toulouse) stérile, séché dans du papier filtre stérile puis congelé à l’azote liquide et stocké à -80°C jusqu’à utilisation.
Chaque mycélium congelé est broyé en une poudre fine à l’azote liquide puis l’ADN génomique est extrait selon le protocole décrit par Atoui et al. (2012)4. L’ADN génomique obtenu est dosé par spectrophotométrie (NanoDrop, Thermo Scientific) à 260 nm.
Des réactions d’amplification par PCR sont ensuite réalisées à partir de 10 ng d’ADN génomique de chaque souche de Trichoderma à l’aide de deux couples d’amorces spécifiques : le premier est spécifique du gène EF1, gène unique codant un facteur d’élongation de la traduction et le second d’une région de l’ADN ribosomique, ITS 1 (Intemal Transcribed Spacer). Le protocole utilisé est celui décrit par Al-Sadi et al. (2015)5.
La séquence nucléotidique des amorces est indiquée dans le tableau ci-dessous :
Les produits d’amplification sont ensuite déposés sur gel d’agarose (Tris Borate EDTA 0,5X - agarose 1 ,5%), purifiés à l’aide du kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean- up kit (Macherey-Nagel) et ligués dans le plasmide pGEM-T Easy (Promega, France), selon les recommandations des fournisseurs. Les produits de ligation sont introduits par la méthode du choc thermique dans des cellules bactériennes thermocompétentes de la souche DH5a d’Escherichia coli sélectionnées sur boîtes de Pétri de milieu « Luria Bertani Agar » (« LBA », ThermoFischer Scientifïcs, France) additionné d’ampicilline à une concentration finale de 100 pg/mL.
5 clones résistants à l’ampicilline indépendants sont sélectionnés par réaction d’amplification. Après une croissance sous agitation (250 rpm) à 37°C pendant une nuit dans 5 mL de milieu Luria Bertani (LB, ThermoFischer Scientifïcs, France) + ampicilline (100 pg/mL), les cultures sont culottées puis l’ADN plasmidique de chaque culture est extrait à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel).
La séquence du produit de PCR est ensuite déterminée par envoi des plasmides pour séquençage (Euro fins Genomics, Allemagne).
L’identité des séquences nucléotidiques des 5 clones issus du même produit d’amplification est vérifiée, elle garantit la pureté des souches (contrôle qualité de l’étape de purification : dans le cas de produits d’amplification de séquences différentes, le processus est repris à partir de l’étape de purification). Afin de déterminer l’espèce de chaque souche de Trichoderma, les séquences des produits d’amplification spécifiques du gène EF1 et de la région ITS 1 sont utilisées comme appâts pour la recherche de séquences identiques ou très proches dans les bases de données NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) et TrichoKEY (http://www.isth.info/tools/molkey/), respectivement.
Milieu PD : 1 litre d’eau du robinet contenant 200 g de pommes de terre coupées en morceaux est porté à ébullition. L’ensemble est filtré sur coton cardé et complémenté de 20 g de glucose. Le volume est ajusté à 1 litre avant d’autoclaver 20 minutes à l20°C.
Milieu PDA : même composition que le milieu PD avec addition de 20 g/L d’agar. Exemple 2
Efficacité de Trichoderma sur le pathosystème Fusarium / Brachvpodium distachyon en conditions contrôlées
Brachypodium distachyon ( B . distachyon), étudié dans cet exemple, est une espèce monocotylédone de la famille des Poaceae, sous-famille des Pooideae. Son génome relativement petit pour une graminée, sa petite taille, son cycle court et sa proximité taxinomique avec des céréales majeures ont déterminé son choix comme organisme modèle en génomique des graminées. 1 Méthodologie
Matériel biologique (plantes et champignons)
Les semences de B. distachyon de l’écotype sauvage Bd2l-3 sont stérilisées dix minutes dans de Miypochlorite de sodium 0,6% sous agitation douce puis rincées trois fois à l’eau milli-Q ® stérile dans les mêmes conditions.
Les semences sont ensuite placées à 4°C durant 4 jours, dans l’obscurité et dans de l’eau milli-Q ® stérile. Le semis a lieu sur un mélange 2/1 (v/v) de terreau et de perlite, dans des pots de 13 cm de diamètre avec une densité de 5 graines par pot.
La croissance se déroule dans les conditions suivantes : 20 h de lumière à 24°C et 4h d’obscurité à 20°C afin de s’affranchir de la vernalisation et de synchroniser la floraison.
Les souches ( Trichoderma et PH-l) sont cultivées sur milieu Potato Dextrose Agar (PDA) additionné d’ampicilline et de kanamycine à une concentration finale de 100 et 50 pg/l, respectivement, dans une étuve à 26°C et sont repiquées toutes les 2 à 3 semaines.
A partir d’une culture âgée de F. graminearum (souche PH-l) de 15 jours sur milieu PDA, 30 ml de milieu Mung Bean dans un erlenmeyer de 150 ml sont inoculés avec 10 implants mycéliens d’environ 5 mm2 chacun. Le milieu est incubé 7 jours à température ambiante et sous agitation (130 rpm). A l’issue de cette incubation, un nouveau volume de Mung Bean est inoculé avec 1/10 de volume de la première suspension de conidiospores et est à nouveau incubé 7 jours à température ambiante sous agitation. La suspension de spores est filtrée sur Miracloth stérile et les conidiospores sont dénombrées sur cellule de Thoma puis resuspendues dans du Tween 20 (surfactant) à 0,01% à une concentration finale de 105 conidiospores/mL.
Des suspensions de spores de chacune des trois souches de Trichoderma sont préparées séparément à partir d’une culture sur milieu PDA de 7 jours. Les spores sont récupérées à l’aide d’un scalpel à bout rond puis déposées dans 1 ml de Tween 20 à 0,01%. Des dilutions successives sont réalisées afin de pouvoir faire un comptage de la concentration en spores à la cellule de Thoma. Chaque suspension de spores Tr A, Tr B et Tr C est ensuite ajustée à 107 sp/ml dans du Tween 20 à 0,01%.
Technique d’inoculation
L’efficacité des trois souches de Trichoderma sp. in planta contre la fusariose des épis a été visualisée en pulvérisant jusqu’à ruissellement sur l’ensemble des épis de B. distachyon une suspension de spores à 107 sp/ml 48h avant l’inoculation ponctuelle de F. graminearum réalisée, elle, au stade BBCH 65 sur la plante modèle B. distachyon.
48h après la pulvérisation de Trichoderma, l’inoculation ponctuelle de la souche PH-l de Fusarium graminearum s’effectue sur le 2ème épillet en partant du haut de l’épi concerné. Il est inséré 3m1 de la suspension de spores de PH-l à une concentration de 105 spores/ml, entre les glumelles inférieure et supérieure d’une fleur située au milieu de l’ épillet, afin de synchroniser les symptômes.
Les plantes inoculées sont ensuite placées en conditions contrôlées suivantes : température 20°C, hygrométrie de 65% et un cycle de jours courts (8h de jour et l6h d’obscurité).
Une notation des symptômes est effectuée à 7, 10 et 14 jours après inoculation de PH-l suivant une échelle de notation des symptômes (voir Figure 1). Les photos de la figure 1 illustrent la correspondance « symptômes/score » d’épis de B. distachyon (écotype sauvage Bd2l-3) inoculés par la souche PH-l de F. graminearum. 2. Résultats
Les résultats des scores obtenus 14 jours après contamination par la souche PH-l sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous et à la Figure 2.
Tableau 1 : Evaluation in planta de l’efficacité des 3 souches Trichoderma sp. (Tr A, Tr B et Tr C) à l’encontre de la souche PH-l de F. graminearum.
Pas d’application préventive de Trichoderma sp.
a Moyenne des scores des 3 tests indépendants +/- écart-type
^ erreur standard = écart-type / V(effectif)
8 p value d’après un test de Student (effectif > 30 dans chaque modalité) e % efficacité = ((score moyen Témoin - score moyen souche) / score moyen
Témoin) x 100
3. Discussion
Bien que les différents tests réalisés montrent une diminution significative de la fusariose après une application préventive des 3 souches Trichoderma Tr A, Tr B et Tr C (voir Tab. 1, Fig. 2), il s’avère que les meilleurs résultats sont ceux obtenus avec la souche Tr B objet de l’invention.
La souche indigène Tr B de l’invention montre une efficacité supérieure à 36 % (versus 25% pour Tr A et 15 % pour Tr C).
La souche Tr B de l’invention est particulièrement avantageuse de par son origine (puisqu’elle est issue de sol de blé français) mais également de par son criblage sur la céréale modèle, Brachypodium distachyon. En effet, le criblage de souches Trichoderma d’intérêt in planta est une avancée majeure car la majorité des travaux décrits dans la littérature concerne des sélections in vitro et pas in planta. Les mécanismes d’action de Trichoderma sont complexes (métabolites secondaires, enzymes, stimulation de défense des plantes, compétitivité) et sont en faveur d’une sélection in planta des souches, difficiles à mettre en œuvre sur blé (trop long et complexe).
Les Inventeurs ont avantageusement réussi à valider l’utilisation de la céréale modèle B. distachyon comme un moyen de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur blé.
Ces résultats confirment l’intérêt de la souche Tr B de l’invention pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l’épi de blé.
Les autres tests réalisés ci-après sont uniquement poursuivis sur la souche Tr B objet de l’invention dont l’efficacité est de loin supérieure à celles des souches comparatives Tr A et Tr C.
Exemple 3
Tests d’efficacité in planta de la souche Trichoderma Tr B contre le développement de la fusariose de l’épi sur blé de printemps, variété « Apogee »
Méthodologie
Les semences de blé variété de printemps Apogee sont stérilisées et ensemencées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
De même, les souches ( Trichoderma et PH-l) sont cultivées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
Test in planta
Le test in planta est basé sur une inoculation préventive des épis par Trichoderma Tr B, 48 h avant le stade BBCH 65. Trichoderma est inoculé par pulvérisation jusqu’à ruissellement sur épis de blé à l’aide d’une suspension de spores calibrée à 107 spores/mL.
Deux jours (48 h) après l’apport de Trichoderma Tr B, une infection par PH-l est réalisée.
Deux techniques d’infection ont été testées : (1) une infection ponctuelle de PH-l est réalisée entre les glumelles inférieures et supérieures d’une fleur du 2ème épillet, afin de synchroniser les symptômes ;
(2) une infection par spray (pulvérisation) permet de pulvériser une suspension de spore titrée sur l’ensemble de l’épi.
Les plantes sont incubées en chambre climatique dans les conditions suivantes : l6h de lumière à 24°C +/- 5°C sous lampe fluorescente (265 mE x m2 x s 1) au niveau du sol).
Les lectures de symptômes sont faites en fonction du temps à l’aide d’une échelle de notation par dénombrement des épillets symptomatiques sur le nombre total d’épillets de chaque épi (soit le pourcentage d’ épillets symptomatiques).
Les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4.
Discussion et conclusion
Les différents tests réalisés montrent une protection de l’épi à l’encontre de la fusariose par la souche Trichoderma Tr B de l’invention, que ce soit par apport ponctuel du Fusarium dans une fleur de chaque épi ou par pulvérisation du Fusarium sur l’ensemble des épis.
A 7 jours (fïg. 3), le pourcentage d’infection des épis par PH-l est de moins de 50% (contre 100% pour le témoin Tween) avec TrB seul.
La souche TrB est capable d’apporter une protection significative contre la fusariose dans les conditions expérimentales décrites, et ce quel que soit le mode de contamination de Fusarium.
La dose de fongicide Horizon® utilisée est la dose homologuée (dose « N ») (qui est de 250 g/l de tébuconazole). La dose N utilisée dans les conditions contrôlées apporte une protection de façon satisfaisante à 7 jours (fïg. 3) et 14 jours (fïg. 4) à l’encontre de la fusariose.
La dose N/5 est cependant nettement moins efficace puisque on observe :
- plus de 20% d’infection à 7 jours pour N/5 (contre moins de 5% pour N) (fïg. 3),
- environ 40% d’infection à 14 jours pour N/5 (contre moins de 10% d’infection pour N) (fïg. 4).
Ainsi, si on envisage, pour des contraintes économiques et écologiques de diminuer le recours aux fongicides de synthèse, on comprend aisément l’intérêt de développer des solutions alternatives et/ou complémentaires telles que celles proposées dans l’invention afin d’obtenir une protection satisfaisante des cultures, et notamment contre la fusariose du blé.
Exemple 4
Tests d’efficacité in planta de la souche Trichoderma Tr B de l’invention contre le développement de la fusariose de l’épi sur blé de printemps, variété « Apogee »
Méthodologie
Les semences de blé variété de printemps Apogee sont stérilisées et ensemencées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
De même, les souches ( Trichoderma , FG1 et INRA349) sont cultivées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
Test in planta
Le test in planta est basé sur une inoculation préventive des épis par Trichoderma Tr B, 48 h avant le stade BBCH 65. Trichoderma est inoculé par pulvérisation jusqu’à ruissellement sur épis de blé à l’aide d’une suspension de spores calibrée à 107 spores/mL.
Deux jours (48 h) après l’apport de Trichoderma Tr B, une infection par FG1 ou INRA349 est réalisée.
L’infection est réalisée par spray (pulvérisation) et permet de pulvériser une suspension de spores titrée sur l’ensemble de l’épi.
Les plantes sont incubées en chambre climatique dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 3.
Les lectures de symptômes sont faites dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 3.
Les résultats sont présentés dans la figure 5.
Discussion et conclusion
On observe le même effet de protection de la souche Trichoderma TrB de l’invention à l’encontre de la souche de F. graminearum FG1 que celui habituellement mesuré à l’encontre de la souche de F. graminearum PH-l (52% à 7j et 40% à l4j (fig.5)).
En revanche, nous constatons une baisse de protection de la souche Trichoderma TrB à l’encontre de la souche de F. graminearum INRA 349 mais cette protection reste constante (30-35% (fig.5)). Ceci peut être dû à la moindre virulence de cette souche (gamme de symptômes moins large) et/ou à son moindre potentiel de production de mycotoxines. En effet, dans l’hypothèse que la souche TrB pourrait exercer une action sur la production de mycotoxines des souches de Fusarium, cet effet sera bien plus visible sur une souche fortement productrice que sur une souche faiblement productrice.
Ainsi, si on envisage, pour des contraintes économiques et écologiques de diminuer le recours aux fongicides de synthèse, on comprend aisément l’intérêt de développer des solutions alternatives et/ou complémentaires telles que celles proposées dans l’invention afin d’obtenir une protection satisfaisante des cultures, et notamment contre la fusariose du blé, de façon étendue à différentes souches de l’agent causal.
Exemple 5
Tests d’efficacité in planta d’une combinaison entre la souche Trichoderma Tr B et dose réduite de fongicide Horizon® contre le développement de la fusariose de l’épi sur blé de printemps, variété « Apogee »
Méthodologie
Les semences de blé variété de printemps Apogee sont stérilisées et ensemencées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
De même, les souches ( Trichoderma , PH-l) sont cultivées dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 2.
Le mélange entre les spores de Trichoderma Tr B (suspension de spores calibrée à 107 spores/mL) et le fongicide de type azole à la dose N/25 est réalisé extemporanément dans de l’eau.
Test in planta
La dose homologuée de fongicide Horizon® utilisée est la dose « N » (qui est de 250 g/l de tébuconazole). La dose « N » utilisée dans les conditions contrôlées apporte une protection totale ne permettant pas de visualiser des différences. La dose utilisée pour quantifier l’apport respectif de Trichoderma Tr B et du fongicide Horizon® a été déterminée à « N/25 ».
Le test in planta est ainsi basé sur une inoculation préventive des épis, 48 h avant le stade BBCH 65, par :
- la souche de l’invention Tr B seule,
- le mélange Trichoderma Tr B / Horizon® (dose « N/25 »),
- le fongicide Horizon® seul (dose « N/25 »).
Les épis de blé sont inoculés avec ces différentes préparations par pulvérisation jusqu’à ruissellement.
Deux jours (48 h) après l’apport de chaque préparation séparément, une infection par PH- 1 est réalisée.
L’infection est réalisée par spray (pulvérisation) et permet de pulvériser une suspension de spores titrée sur l’ensemble de l’épi.
Les plantes sont incubées en chambre climatique dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 3.
Les lectures de symptômes sont faites dans les mêmes conditions que celles de l’exemple 3.
Les résultats sont présentés dans la figure 6.
Discussion et conclusion
On observe que la souche Trichoderma Tr B de l’invention seule confère une protection à l’encontre de la fusariose de 55% à 7 jours après inoculation et de 40% à 14 jours après inoculation (fïg.6).
Le fongicide Horizon® à la dose « N/25 » confère une protection de 88% à 7 jours après inoculation et de 65% à 14 jours (fïg.6).
On observe que le mélange de la souche Trichoderma Tr B de l’invention avec la dose « N/25 » de fongicide Horizon® apporte une efficacité de protection de 90% à 7 jours après inoculation et de 80% à 14 jours après inoculation (fïg.6).
Cette efficacité de protection du mélange de la souche Trichoderma Tr B de l’invention avec la dose « N/25 » de fongicide Horizon® est accrue à 14 jours après inoculation en comparaison du fongicide Horizon® seul à la dose « N/25 ».
Ainsi, si on envisage, pour des contraintes économiques et écologiques de diminuer le recours aux fongicides de synthèse, on comprend aisément l’intérêt de développer des solutions complémentaires telles que celles proposées dans l’invention afin d’obtenir une protection satisfaisante des cultures, et notamment contre la fusariose du blé.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Souche Trichoderma harzianum déposée le 12 juin 2018 auprès de la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM), 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, sous le numéro CNCM 1-5327.
2. Utilisation de la souche Trichoderma harzianum selon la revendication 1 , pour lutter contre la fusariose de céréales choisies dans le groupe comprenant le blé, Brachypodium distachyon, le triticale, l’avoine, le seigle et le maïs, et de préférence le blé.
3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle la fusariose est causée par un phytopathogène fongique du genre Fusarium et/ou Microdochium.
4. Utilisation selon la revendication 2 ou la revendication 3, pour lutter contre la fusariose de l’épi de blé.
5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, pour diminuer la teneur en mycotoxines présentes dans le blé, lesdites mycotoxines étant notamment le déoxynivalénol (DON).
6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 5, dans laquelle la souche Trichoderma harzianum est appliquée au niveau de l’épi de la céréale, et de préférence l’épi de blé.
7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans laquelle la souche Trichoderma harzianum est appliquée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu’à la pleine floraison des céréales.
8. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle la souche Trichoderma harzianum est appliquée sur les céréales, à une concentration de spores allant de 106 à 109 spores/ml, et de préférence de 107 à 108 spores/ml, dans un volume de 100 à 200 litres par hectare.
9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 8 dans laquelle la souche Trichoderma harzianum est associée avec un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le métconazole, le méfentrifuconazole et leurs mélanges.
10. Utilisation selon la revendication 9, pour une administration séparée ou séquentielle avec ledit fongicide.
11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle la quantité de fongicide est de 2% à 60%, et de préférence de 4% à 35% de la dose préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose.
12. Composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales caractérisée en ce qu’elle comprend :
- une souche Trichoderma harzianum telle que définie à la revendication 1 , et
- un agent de formulation et/ou un agent adjuvant.
13. Kit caractérisé en ce qu’il comprend, de façon séparée :
- une souche Trichoderma harzianum telle que définie à la revendication 1 ,
- un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le métconazole, le méfentrifuconazole et leurs mélanges.
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