EP3802785A1 - Nouvelle souche probiotique de lactobacillus brevis - Google Patents

Nouvelle souche probiotique de lactobacillus brevis

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Publication number
EP3802785A1
EP3802785A1 EP19727895.5A EP19727895A EP3802785A1 EP 3802785 A1 EP3802785 A1 EP 3802785A1 EP 19727895 A EP19727895 A EP 19727895A EP 3802785 A1 EP3802785 A1 EP 3802785A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
cncm
cells
lactobacillus brevis
cancer
Prior art date
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Pending
Application number
EP19727895.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Luis BERMUDEZ HUMARAN
Edgar TORRES MARAVILLA
Philippe Langella
Maria Elena SANCHEZ-PARDO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Instituto Politecnico Nacional Ipn
Original Assignee
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Instituto Politecnico Nacional Ipn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement, Instituto Politecnico Nacional Ipn filed Critical Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Publication of EP3802785A1 publication Critical patent/EP3802785A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/24—Lactobacillus brevis

Definitions

  • the present invention relates to a novel probiotic strain of Lactobacillus brevis, isolated from pulque, with anti-cancer properties, as well as compositions comprising said strain.
  • probiotics are “live microorganisms that, when ingested in sufficient quantity, have positive effects on health".
  • Probiotic organisms used in human nutrition are generally lactic acid bacteria, mainly belonging to the genera Lactobacillus and Bifidobacterium.
  • the beneficial effects of probiotic bacteria are not, however, common to all the bacteria of the same genus, or even the same species, and are found, in most cases, only in certain strains.
  • the observed effects may vary from one probiotic strain to another, including within the same species.
  • Pulque is a traditional Mexican alcoholic beverage derived from fermentation of the sap of various agaves, which contains a wide variety of lactic acid bacteria, particularly lactobacilli and leuconostocci (Escalante et al., Int J Food Microbiol 24: 126- 134, 2008). Recent studies suggest that some pre-Hispanic cultures in Mexico used enemas using pulque to fight diseases and disorders of the digestive system (Lemus-Fuentes, Temas de Ciencia y Tecnologia 102: 143-150, 2006).
  • lactobacilli including strains of Lactobacillus san franciscensis, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus composti
  • lactobacilli isolated from pulque have anti-inflammatory properties potentially beneficial for the treatment of inflammatory bowel diseases (Torres Maravilla et al., Appl Microbiol Biotechnol 100: 385-396, 2015).
  • the inventors have succeeded in isolating a new strain of Lactobacillus brevis possessing anticancer properties. Surprisingly and unexpectedly, the inventors have thus shown that said strain is capable of reducing the proliferation of lines tumor cells and modify the expression of certain pro-apoptotic genes or genes involved in tumor development.
  • the present invention thus relates to this strain of Lactobacillus brevis, deposited according to the Budapest Treaty, with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15) on May 30, 2018 under the number 1-5321.
  • the CNCM 1-5321 strain was identified as belonging to the L. brevis species using a CHL API 50 test and by sequencing G 16S RNA.
  • the anticancer properties of the CNCM 1-5321 strain are independent of its viability state. Therefore, the present invention encompasses the CNCM 1-5321 strain regardless of its viability state, not only in living form, but also in dead form, in inactivated form or in the form of a bacterial lysate.
  • the CNCM 1-5321 strain may be in the exponential or stationary growth phase, preferably in the exponential phase.
  • a bacterium is considered alive if it is able to multiply. Conversely, a bacterium is considered dead or inactivated when it has lost its ability to multiply.
  • Techniques for inactivating bacteria are well known to those skilled in the art.
  • the CNCM 1-5321 strain can be inactivated by exposure to ultraviolet radiation or by heating.
  • the CNCM 1-5321 strain can be inactivated according to the method described in Neyzi et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 53: 12-19, 2017. Briefly, the bacterial culture is centrifuged for 10 min, then the cell pellet is resuspended in PBS and exposed to UV radiation for 15 minutes to inactivate the bacterium. To ensure that the bacteria is no longer able to multiply, a control culture is performed in SRM after UV treatment.
  • the present invention also encompasses strains that can be obtained by mutagenesis or by genetic transformation of the CNCM 1-5321 strain.
  • the methods for mutating or transforming the CNCM 1-5321 strain are well known to those skilled in the art and correspond to the methods used routinely to modify the genome of lactic acid bacteria, in particular bacteria belonging to the Lactobacillus brevis species. Such methods include, but are not limited to, random mutagenesis (e.g., using UV radiation or a mutagenic chemical agent), site-directed mutagenesis, or homologous recombination.
  • these strains retain at least the anti-cancer properties of the CNCM 1-5321 strain.
  • These may be strains in which one or more of the genes of the CNCM 1-5321 strain have been mutated, for example to modify certain metabolic properties (eg the ability of this strain to resist acidity, resist intestinal transit, metabolize certain sugars, ). It may also be strains resulting from the genetic transformation of the CNCM 1-5321 strain by one or more gene (s) of interest, allowing, for example, to confer on said strain additional physiological characteristics or to express proteins. of interest that it is desired to administer via said strain.
  • the present invention also relates to a cell fraction obtainable from the CNCM 1-5321 strain.
  • it may be a bacterial wall preparation obtained from a culture of said strain. More particularly, it may be a preparation of peptidoglycan obtained from said strain. They may also be culture supernatants or fractions of these supernatants.
  • Cell fractions can be prepared according to methods known to those skilled in the art. In a nonlimiting manner, these methods generally comprise a step of lysis of the bacteria obtained after cultivation and a step of separation of the fractions containing the membranes of said bacteria from the total lysate obtained after the lysis step, in particular by centrifugation or filtration.
  • cell fractions can be prepared by sonification according to the method described in Tiptiri-Kourpeti et al., PLOS one 11 (2): e0l47960, 2016.
  • the present invention relates to L. brevis strain CNCM 1-5321 or a cell fraction of said strain for use as a medicament.
  • the CNCM 1-5321 strain or a cell fraction of the CNCM 1-5321 strain is ingested orally or administered mucosally, in particular intranasally.
  • L. brevis CNCM 1-5321 strain or a cell fraction thereof is administered daily to the patient.
  • L. brevis CNCM 1-5321 strain or a cell fraction thereof is administered at least once a day.
  • L. brevis CNCM 1-5321 strain or a cell fraction thereof is administered at least once a week.
  • the present invention relates to the L. brevis CNCM 1-5321 strain or a cell fraction of said strain for use in the prevention and / or treatment of cancer, particularly bowel cancer, more particularly colorectal cancer, but also other types of carcinoma such as breast cancer, lung cancer, liver cancer, etc.
  • the strain of the invention inhibits the proliferation of tumor cell lines, in particular human lines HT29, HTC116 and Caco2 derived from colorectal adenocarcinoma cells.
  • the present invention relates to L. brevis strain CNCM I-5321 or a cell fraction of said strain for its use as defined above, wherein said strain inhibits the proliferation of cancer cells.
  • the present invention relates to the L. brevis strain CNCM I-5321 or a cell fraction of said strain for its use as defined above, wherein said strain or the cell fraction of said strain increases the expression of at least one pro-apoptotic gene in said cancer cells.
  • said pro-apototic gene is selected from the group of genes comprising CASP8, CASP9, BCL2, BAX and BCI.-XI.
  • the present invention relates to L. brevis strain CNCM I-5321 or a cell fraction of said strain for its use as defined above, in which said strain or the cell fraction of said strain decreases the expression of at least one gene involved in the development of a tumor.
  • said gene involved in the development of a tumor is selected from the group of genes comprising erbB2, erbB3 and PKM2.
  • the present invention relates to a method of treatment in a subject in need comprising administering L. brevis strain CNCM 1-5321 or a cell fraction of said strain to said subject.
  • the present invention also relates to a method of treating cancer in a subject in need comprising administering L. brevis strain CNCM 1-5321 or a cell fraction of said strain to said subject.
  • the present invention relates to the use of L. brevis strain CNCM 1-5321 or a cell fraction of said strain for the preparation of a medicament.
  • the present invention also relates to the use of L. brevis CNCM 1-5321 strain or a cell fraction of said strain for the preparation of a medicament for the treatment of cancer.
  • the present invention provides a composition comprising L. brevis strain CNCM 1-5321 or a cell fraction thereof.
  • a composition according to the invention can be liquid or solid and be in various forms, such as for example a capsule, a tablet, a tablet, a pill, a suppository, a powder bag, a bottle of liquid, a liquid ampoule, etc ...
  • a composition according to the invention may contain a coating, in particular a gastro-resistant coating or a coating allowing enteric release of the CNCM 1-5321 strain.
  • the present invention relates to a composition as defined above, said composition being a pharmaceutical product or a food product, in particular a food supplement.
  • the term "food supplement” refers to a food product providing a complement of nutrients or substances having a nutritional or physiological effect (such as vitamins, minerals, fatty acids or amino acids) missing or in quantities insufficient in the normal diet of an individual.
  • the present invention relates to a composition as defined above, said composition also comprising at least one element selected from the group consisting of vitamins, minerals, fatty acids and amino acids.
  • the vitamins used in the manufacture of food supplements are generally vitamins A, D, E, K, B1, B2, B6, B12 and C, Niacin, Pantothenic acid, folic acid and Biotin.
  • the minerals used in the manufacture of food supplements are generally chosen from calcium, magnesium, iron, copper, iodine, zinc, manganese, sodium, potassium, selenium, Chromium, Molybdenum, Fluoride, Chloride, Phosphorus.
  • the present invention relates to a composition as defined above, said composition also comprising at least one excipient.
  • the present invention relates to a composition as defined above, said composition also comprising at least one flavoring.
  • the present invention relates to a composition as defined above, said composition being a beverage.
  • strains When said strain is present in the form of living bacteria, these are preferably present in an amount of at least 10 5 cfu per gram of product, preferably least 10 6 CFU per gram, more preferably at least 10 7 CFU per gram, and even more preferably at least 10 cfu per gram.
  • the present invention relates to a composition as defined above, in which the CNCM 1-5321 strain is in association with another probiotic organism, preferably a lactic acid bacterium.
  • FIG. 1 Antiproliferative effect of the CNCM 1-5321 strain on tumor cell lines.
  • the HT29, HTC116 and Caco2 cells are incubated in the presence of PBS (negative control), 5-FU (5 Fluorouracil) (positive control), strain CNCM 1-5321, L. casei strain BL23 and the strain. L. casei ATCC334. * indicates a significant difference from the negative control (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 1 Antiproliferative effect of UV inactivated strain CNCM 1-5321 on tumor cell lines.
  • the HT29, HTC116 and Caco2 cells are incubated in the presence of PBS (negative control), 5-FU (5 Fluorouracil) (positive control), the CNCM 1-5321 strain, the culture supernatant of the CNCM 1-5321 strain ( MRS medium) and UV inactivated strain CNCM I-5321. * indicates a significant difference from the negative control (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 3 Anti-proliferative effect of the cell pellet of the CNCM 1-5321 strain after sonication on the tumor cell lines.
  • the HT29, HTC116 and Caco2 cells are incubated in the presence of PBS (negative control), 5-FU (5 Fluorouracil) (positive control), the CNCM 1-5321 strain and the cell pellet of the CNCM 1-5321 strain after sonication. . * indicates a significant difference from the negative control (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 4 Pro-apoptotic effects of the CNCM 1-5321 strain on tumor cell lines.
  • the HT29 and HTC116 cells are incubated 24h with the CNCM 1-5321 strain.
  • the viability of the cell lines was determined by staining with annexin V-FITC and propidium iodide (PI) followed by flow cytometric analysis.
  • PI propidium iodide
  • FIG. 6 Specificity of the antiproliferative effect of the CNCM 1-5321 strain on tumor lines.
  • the colon cancer cells (HT29 line) are incubated in the presence of PBS (negative control), 5-FU (positive control) and CNCM 1-5321 strain.
  • Non-cancerous colon cells (FHC line) are incubated in the presence of PBS (negative control), 5-FU (positive control) and CNCM 1-5321 strain. * indicates a significant difference from the negative control (P ⁇ 0.05).
  • Lactobacilli were grown in Man-Rogosa-Sharpe (MRS) medium (Difco Laboratories) for one day at 37 ° C.
  • MRS Man-Rogosa-Sharpe
  • the pellet was washed twice with PBS and a cell extract was obtained by sonication (10 cycles between 40 and 60 watts amplitude).
  • the soluble and insoluble components were separated by centrifugation, the protein content was quantified by Bradford.
  • the supernatant was obtained by centrifugation after one night of culture, followed by filtration sterilization (0.45 ⁇ m).
  • the bacteria were killed by exposure to UV radiation for 15 min. Inactivation was confirmed by incubation on Petri dishes.
  • DMEM glucose-rich Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • 2mM L-glutamine 50 mg / ml penicillin and 50 mg / ml streptomycin in a humidified atmosphere containing 5% C0 2 .
  • the non-cancerous FHC cell line was cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% (vol / vol) FBS, 2mM L-glutamine, 50mg / ml penicillin and 50mg / ml streptomycin, 0.005 mg / ml insulin, 0.005 mg / ml transferrin, 0.00067 mg / ml hydrocortisone, 20ng / ml human epidermal growth factor (EGF) in a humidified atmosphere containing 5% C0 2 .
  • DMEM / F12 medium supplemented with 10% (vol / vol) FBS, 2mM L-glutamine, 50mg / ml penicillin and 50mg / ml streptomycin, 0.005 mg / ml insulin, 0.005 mg / ml transferrin, 0.00067 mg / ml hydrocortisone, 20ng / ml human epidermal growth factor (EGF) in
  • the cells were seeded on 96-well microplates at a rate of 2 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the co-culture with a bacterium (2 ⁇ 10 6 cells) was then carried out for 24 and 48 h.
  • the cells were fixed in 5% trichloroacetic acid (TCA) for 1 hour at 4 ° C and washed four times in distilled water.
  • TCA 5% trichloroacetic acid
  • the microplates were stained with 100 ⁇ l / well of 0.057% (w / v) sulforhodamine (SRB) / distilled water, washed 4 times in 0.1% acetic acid and re dehydrated at room temperature.
  • the stained cells were lysed in 10 mM Tris buffer and the optical density (OD) was measured at 510 nm.
  • HT-29 cells were seeded at 1 x 10 6 cells / ml and allowed to fix overnight at 37 ° C in a CO 2 incubator.
  • the culture with a bacterium (1 x 10 8 cells) was carried out for 24 h.
  • the cells were harvested (tripsination) and washed twice with cold PBS, and resuspended in IX binding buffer at a concentration of 1 x 10 6 cells / ml.
  • the cells were incubated with 5 ⁇ l of Annexin V-FITC and 5 ⁇ l PI for 15 min at room temperature (25 ° C) under dark conditions. 400 ⁇ l of IX binding buffer was added to each tube and the cells were analyzed by flow cytometry.
  • the controls used are (i) untreated cells, and cells stained with (ii) Annexin V-FITC only, (iii) GIR only, and (iv) both Annexin V-FITC. and PI.
  • RNA was extracted using the Qiagen RNeasy Mini Kit. The quality and concentration of the RNA were examined by ethidium bromide agarose gel electrophoresis and spectrophotometric analysis.
  • the cDNA template was synthesized from 1 ⁇ g of RNA with the High-Capacity Reverse Transcription Kit cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).
  • RT-qPCR The reaction of RT-qPCR was carried out in a reaction volume of 25 ml (Takyon TM Rox SYBR® MasterMix dTTP blue) with the following primers: B-actin, Caspas8, Caspas9, ErbB2, ErbB3, BCL2, BCL-XL in the first heat cycle qPCR. Expression values were quantified and normalized by the ACt method, using the geometric mean Ct of b-actin as the endogenous reference gene.
  • CNCM 1-5321 A test for the antiproliferative activity of the CNCM 1-5321 strain was performed on various colon cancer cell lines, HT-29 (human colon adenocarcinoma, type II), HTC116 (human colorectal cancer), and Caco-2 (colorectal adenocarcinoma).
  • the CNCM 1-5321 strain is able to stop the cellular proliferation of epithelial lineages human intestinal tract at a level comparable to that of 5-fluorouracil (5-FU), an anticancer drug used here as a positive control ( Figure 1).
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • the CNCM 1-5321 strain is also capable of increasing annexin V + / PI + levels (late apoptotic cells, FIG. 4) by 25% and inducing apoptotic cell death by activating and suppressing the expression of anti-apoptotic genes ErbB2, ErbB3 (via Casp8), two genes initiating apoptosis mediated by TNF- ⁇ , and modulating the expression of BAX and PKM2 genes involved in cellular metabolism (Figure 5).
  • CNCM 1-5321 strain To determine whether the anti-proliferative effect of the CNCM 1-5321 strain is specific to the tumor lines, a test of the antiproliferative activity was carried out on the HT29 tumor line (human colon adenocarcinoma, type II) and on the line non-cancerous FHC (fetal human colon cells).
  • the CNCM 1-5321 strain inhibits cell proliferation of the tumor line, but has no significant effect on non-cancer cell growth ( Figure 6).

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle souche probiotique de Lactobacillus brevis, isolée à partir de pulque, dotée de propriétés anti-cancéreuses, ainsi que des compositions comprenant ladite souche.

Description

NOUVELLE SOUCHE PROBIOTIQUE DE LACTOBACILLUS BREVIS
La présente invention concerne une nouvelle souche probiotique de Lactobacillus brevis, isolée à partir de pulque, dotée de propriétés anti-cancéreuses, ainsi que des compositions comprenant ladite souche.
Selon la définition actuellement admise, les probiotiques sont « des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé ». Les organismes probiotiques utilisés en alimentation humaine sont généralement des bactéries lactiques, appartenant principalement aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium. Les effets bénéfiques des bactéries probiotiques ne sont toutefois pas communs à l’ensemble des bactéries d’un même genre, ni même d’une même espèce, et ne se rencontrent, le plus souvent, que chez certaines souches. En outre, les effets observés peuvent varier d’une souche probiotique à l’autre, y compris à l’intérieur d’une même espèce. Actuellement, le potentiel probiotique des bactéries lactiques isolées à partir de produits fermentés traditionnels suscite un fort intérêt, en particulier dans les pays en développement où l’accès aux probiotiques est limité et où le développement de nouveaux produits et compléments alimentaires pourrait permettre de lutter contre certaines maladies (Vinderola et al., LWT-Food Sci Technol 41:1678-1688, 2008).
Le pulque est une boisson alcoolique traditionnelle mexicaine, issue de la fermentation de la sève de divers agaves, qui contient une grande diversité de bactéries lactiques, en particulier des lactobacilles et des leuconostoques (Escalante et al., Int J Food Microbiol 24:126-134, 2008). De récentes études suggèrent que certaines cultures préhispaniques du Mexique pratiquaient des lavements en utilisant le pulque pour combattre les maladies et les troubles du système digestif (Lemus-fuentes, Temas de Ciencia y Tecnologia 102:143-150, 2006). Il a d’ailleurs été démontré expérimentalement que certaines souches de lactobacilles (notamment des souches de Lactobacillus san franciscensis, Lactobacillus plantarum et Lactobacillus composti) isolées à partir de pulque possèdent des propriétés anti-inflammatoires potentiellement bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires intestinales (Torres-Maravilla et al., Appl Microbiol Biotechnol 100:385-396, 2015).
Dans ce contexte, les Inventeurs sont parvenus à isoler une nouvelle souche de Lactobacillus brevis possédant des propriétés anticancéreuses. De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont ainsi montré que ladite souche est capable de réduire la prolifération de lignées cellulaires tumorales et de modifier l’expression de certains gènes pro-apoptotiques ou certains gènes impliqués dans le développement tumoral.
La présente invention a ainsi pour objet cette souche de Lactobacillus brevis, déposée selon le Traité de Budapest, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) le 30 Mai 2018 sous le numéro 1-5321.
La souche CNCM 1-5321 a été identifiée comme appartenant à l’espèce L. brevis à l’aide d’un test API 50 CHL et par séquençage de G ARN 16S.
Table 1. Séquence partielle de l’ARN 16S de la souche CNCM 1-5321.
Cette souche présente les caractéristiques morphologiques et biochimiques suivantes :
- Morphologie : Micro-organisme à Gram positif, forme de bacille,
- Métabolisme : Catalase (-), hétérofermentaire,
- Fermentation des sucres : L-arabinose (+), ribose (+) D-xylose (+), D-glucose (+), D- fructose (+), D-mannose (+), A-methyl-deglucoside (+), N acetyl glucosamine (+), esculine (+), cellobiose (+), maltose (+), mélibiose (+), gluconate (+), ceto-gluconate (+).
Elle possède d’autre part des propriétés anti-cancéreuses, se traduisant par une capacité à inhiber la prolifération de lignées cellulaires tumorales et à modifier l’expression de certains gènes pro-apoptotiques ou certains gènes impliqués dans le développement tumoral.
Comme montré dans les exemples, les propriétés anti-cancéreuses de la souche CNCM 1-5321 sont indépendantes de son état de viabilité. Par conséquent, la présente invention englobe la souche CNCM 1-5321 quel que soit son état de viabilité, non seulement sous forme vivante, mais également sous forme morte, sous forme inactivée ou encore sous forme de lysat bactérien. En particulier, la souche CNCM 1-5321 peut être en phase de croissance exponentielle ou stationnaire, de préférence en phase exponentielle.
Dans la présente invention, une bactérie est considérée comme vivante si celle-ci est capable de se multiplier. A l’inverse, une bactérie est considérée comme morte ou inactivée lorsqu’elle a perdu sa capacité à se multiplier. Les techniques permettant d’inactiver des bactéries sont bien connues de l’homme de l’art. De manière non limitative, la souche CNCM 1-5321 peut être inactivée par exposition à un rayonnement ultra-violet ou par chauffage. Par exemple, la souche CNCM 1-5321 peut être inactivée selon la méthode décrite dans Neyzi et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 53:12-19, 2017. Brièvement, la culture bactérienne est centrifugée pendant 10 min, puis le culot cellulaire est resuspendu dans du PBS et exposé au rayonnement UV pendant 15 minutes afin d’inactiver la bactérie. Pour s’assurer que la bactérie n’est plus capable de se multiplier, une culture contrôle est réalisée dans du MRS après le traitement aux UV.
La présente invention englobe également les souches susceptibles d’être obtenues par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche CNCM 1-5321. Les procédés permettant de muter ou de transformer la souche CNCM 1-5321 sont bien connus de l’homme du métier et correspondent aux méthodes utilisées en routine pour modifier le génome des bactéries lactiques, en particulier des bactéries appartenant à l’espèce Lactobacillus brevis. De manière non limitative, de telles méthodes incluent la mutagénèse aléatoire (par exemple à l’aide de rayonnement UV ou d’un agent chimique mutagène), la mutagénèse dirigée ou la recombinaison homologue.
De préférence, ces souches conservent au moins les propriétés anti-cancéreuses de la souche CNCM 1-5321. Il peut s’agir de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes de la souche CNCM 1-5321 a (ont) été muté(s), par exemple de afin de modifier certaines propriétés métaboliques ( e.g . la capacité de cette souche à résister à l’acidité, à résister au transit intestinal, à métaboliser certains sucres, ...). Il peut s’agir également de souches résultant de la transformation génétique de la souche CNCM 1-5321 par un ou plusieurs gène(s) d’intérêt, permettant par exemple de conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires ou d’exprimer des protéines d’intérêt que l’on souhaite administrer par l’intermédiaire de ladite souche.
La présente invention a également pour objet une fraction cellulaire pouvant être obtenue à partir de la souche CNCM 1-5321. En particulier, il peut s’agir d’une préparation de paroi bactérienne obtenue à partir d’une culture de ladite souche. Plus particulièrement, il peut s’agir d’une préparation de peptidoglycane obtenue à partir de ladite souche. Il peut également s’agir de surnageants de culture ou de fractions de ces surnageants.
Les fractions cellulaires peuvent être préparées selon les méthodes connues de l’homme de l’art. De manière non-limitative, ces méthodes comprennent généralement une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation des fractions contenant les membranes desdites bactéries du lysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Par exemple, les fractions cellulaires peuvent être préparées par sonification selon la méthode décrite dans Tiptiri-Kourpeti et al., PLOS one 11(2): e0l47960, 2016.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation comme médicament.
De préférence, la souche CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de la souche CNCM 1-5321 est ingérée par voie orale ou administrée par voie muqueuse, en particulier par voie intranasale.
Dans un mode de réalisation, la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de celle-ci est administrée quotidiennement au patient.
Dans un mode de réalisation, la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de celle-ci est administrée au moins une fois par jour.
Dans un mode de réalisation, la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de celle-ci est administrée au moins une fois par semaine.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer, en particulier du cancer de l’intestin, plus particulièrement du cancer colorectal, mais aussi d’autres types de carcinomes tels que le cancer du sein, du poumon, du foie, etc.
Comme montré dans les exemples, les Inventeurs ont mis en évidence que la souche de l’invention inhibe la prolifération des lignées cellulaires tumorales, en particulier les lignées humaines HT29, HTC116 et Caco2 dérivées de cellules d’adénocarcinome colorectal. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I- 5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche inhibe la prolifération des cellules cancéreuses.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I- 5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche ou la fraction cellulaire de ladite souche augmente l’expression d’au moins un gène pro-apoptotique chez lesdites cellules cancéreuses.
De préférence, ledit gène pro-apototique est choisi parmi le groupe de gènes comprenant CASP8, CASP9, BCL2, BAX et BCI.-XI..
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I- 5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche ou la fraction cellulaire de ladite souche diminue l’expression d’au moins un gène impliqué dans le développement d’une tumeur.
De préférence, ledit gène impliqué dans le développement d’une tumeur est choisi parmi le groupe de gènes comprenant erbB2, erbB3 et PKM2.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de traitement chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche audit sujet.
La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche audit sujet.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l’utilisation de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche pour la préparation d’un médicament.
La présente invention concerne également l’utilisation de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche pour la préparation d’un médicament destiné au traitement du cancer.
Dans un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de celle-ci.
De manière non-limitative, une composition selon l’invention peut être liquide ou solide et se présenter sous différentes formes, comme par exemple une gélule, une pastille, un comprimé, une pilule, un suppositoire, un sachet de poudre, un flacon de liquide, une ampoule de liquide, etc...
Dans un mode de réalisation, une composition selon l’invention peut contenir un enrobage, notamment un enrobage gastro-résistant ou un enrobage permettant une libération entérique de la souche CNCM 1-5321.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition étant un produit pharmaceutique ou un produit alimentaire, en particulier un complément alimentaire.
Selon l’invention, le terme "complément alimentaire" désigne un produit alimentaire fournissant un complément de nutriments ou de substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique (tels que des vitamines, des minéraux, des acides gras ou des acides aminés) manquants ou en quantités insuffisantes dans le régime alimentaire normal d'un individu.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un élément choisi parmi le groupe comprenant les vitamines, les minéraux, les acides gras et les acides aminés.
De manière non limitative, les vitamines utilisées dans la fabrication des compléments alimentaires sont généralement les vitamines A, D, E, K, Bl, B2, B6, B 12 et C, la Niacine, l’Acide pantothénique, l’Acide folique et la Biotine.
De manière non limitative, les minéraux utilisés dans la fabrication des compléments alimentaires sont généralement choisis parmi le Calcium, le Magnésium, le Fer, le Cuivre, l’Iode, le Zinc, le Manganèse, le Sodium, le Potassium, le Sélénium, le Chrome, le Molybdène, le Fluorure, le Chlorure, le Phosphore.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un excipient.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un arôme.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition étant une boisson.
Forsque ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, celles-ci sont de préférence présentes à raison d’au moins 105 ufc par gramme de produit, avantageusement au moins 106 ufc par gramme, plus avantageusement au moins 107 ufc par gramme, et encore plus avantageusement au moins 10 ufc par gramme.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, dans laquelle la souche CNCM 1-5321 est en association avec un autre organisme probiotique, de préférence une bactérie lactique.
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, les exemples ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1. Effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), de 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321, de la souche L. casei BL23 et de la souche L. casei ATCC334. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif ( P <0,05).
Figure 2. Effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 inactivée par UV sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321, du surnageant de culture de la souche CNCM 1-5321 (milieu MRS) et de la souche CNCM I- 5321 inactivée par UV. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif (P <0,05).
Figure 3. Effet anti-prolifératif du culot cellulaire de la souche CNCM 1-5321 après sonication sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321 et du culot cellulaire de la souche CNCM 1-5321 après sonication. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif ( P <0,05).
Figure 4. Effets pro-apoptotiques de la souche CNCM 1-5321 sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29 et HTC116 sont incubées 24h avec la souche CNCM 1-5321. La viabilité des lignées cellulaires a été déterminée par coloration avec de l'annexine V-FITC et de l'iodure de propidium (PI) suivie d'une analyse par cytométrie de flux.
Figure 5. Expression des gènes erbB2, erbB3, Casp8, Casp9, BCL-XH BCL2, BAX et PKM2. Les valeurs ont été calibrées par rapport à l’expression de la b-actine utilisée comme contrôle génique endogène. Les résultats sont présentés sous forme d'expression de gène relative (dR) par rapport à l’expression du gène en présence de PBS (contrôle négatif).
Figure 6. Spécificité de l’effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 sur les lignées tumorales. Les cellules de cancer du côlon (lignée HT29) sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (contrôle positif) et de la souche CNCM 1-5321. Les cellules de côlon non-cancéreuses (lignée FHC) sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (contrôle positif) et de la souche CNCM 1-5321. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif ( P <0,05). EXEMPLES
Matériels et méthodes
Bactéries
Les lactobacilles ont été cultivés dans du milieu Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Difco Laboratories) pendant une journée à 37 0 C.
Pour la préparation des fractions cellulaires, le culot a été lavé deux fois avec du PBS et un extrait cellulaire a été obtenu par sonication (10 cycles entre 40 et 60 watts d'amplitude). Les composants solubles et insolubles ont été séparés par centrifugation, la teneur en protéines a été quantifiée par Bradford.
Pour la préparation d’un surnageant de culture, le surnageant a été obtenu par centrifugation après une nuit de culture, puis stérilisation par filtration (0,45 pin).
Pour l’inactivation des bactéries, les bactéries ont été tuées par exposition aux rayonnements UV pendant 15 min. L'inactivation a été confirmée par incubation sur des boites de Pétri.
Lignées cellulaires
Toutes les lignées cellulaires ont été achetées auprès de l'ATCC. Des lignées cellulaires cancéreuses, HT29, HTC116 et Caco2 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco riche en glucose (DMEM) additionné de 10% (vol/vol) de sérum bovin fœtal (FBS), de 2mM de L-glutamine, de 50 mg/ml de pénicilline et de 50 mg/ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02. La lignée cellulaire non-cancéreuse FHC a été cultivée dans du milieu DMEM/F12 additionné de 10% (vol/vol) de FBS, 2mM de L- glutamine, 50 mg/ml de pénicilline et de 50 mg/ml de streptomycine, de 0.005 mg/ml insuline, 0.005 mg/ml transferrine, 0.00067 mg/ml hydrocortisone, 20ng/ml de facteur de croissance épidermique humain (EGF) dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02.
Test de prolifération
24 h avant la stimulation, les cellules ont été ensemencées sur des microplaques 96 puits à raison de 2 x 104 cellules par puit. La co-culture avec une bactérie (2 x 106 cellules) a été réalisée ensuite pendant 24 et 48 h. Les cellules ont été fixées dans de l'acide trichloro acétique à 5% (TCA) pendant 1 heure à 4°C et lavées quatre fois dans de l'eau distillée. Les microplaques ont été colorées avec 100 pl/puit de 0,057% (poids/volume) de poudre de sulforhodamine (SRB)/eau distillée, lavées 4 fois dans de l'acide acétique à 0,1% et re déshydratées à température ambiante. Les cellules colorées ont été lysées dans du tampon Tris 10 mM et la densité optique (DO) a été mesurée à 510 nm. Coloration à l’annexine Y et propidium iodure (PI)
24 heures avant la stimulation, les cellules HT-29 ont été ensemencées à raison de 1 x 106 cellules/ml et laissées en fixation pendant une nuit à 37°C dans un incubateur à C02. La co culture avec une bactérie (1 x 108 cellules) a été réalisée pendant 24 h. Les cellules ont été récoltées (tripsination) et lavées deux fois avec du PBS froid, puis remises en suspension dans du tampon de liaison IX à une concentration de 1 x 106 cellules/ml. Les cellules ont été incubées avec 5 pl de Annexine V-FITC et 5 mΐ de PI pendant 15 min à température ambiante (25°C) en conditions d'obscurité. 400 mΐ de tampon de liaison IX ont été ajoutés à chaque tube et les cellules ont été analysées par cytométrie de flux. Les contrôles utilisés sont (i) des cellules non traitées, et des cellules colorées avec (ii) de l'annexine V-FITC uniquement, (iii) de GIR uniquement, et (iv) à la fois de l'annexine V-FITC et du PI.
Tests qPCR
Des co-cultures ont été réalisées comme indiqué ci-dessus. L'ARN a été extrait en utilisant le kit RNeasy Mini de Qiagen. La qualité et la concentration de l'ARN ont été examinées par électrophorèse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium et par analyse spectrophotométrique. La matrice d'ADNc a été synthétisée à partir de 1 pg d'ARN avec le kit de transcription inverse High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La réaction de RT-qPCR a été réalisée dans un volume réactionnel de 25 mΐ (Takyon™ Rox SYBR® MasterMix dTTP blue) avec les amorces suivantes: B-actine, Caspas8, Caspas9, ErbB2, ErbB3, BCL2, BCL-XL dans le premier cycle thermique qPCR. Les valeurs d'expression ont été quantifiées et normalisées par la méthode ACt, en utilisant la moyenne géométrique Ct de la b-actine comme gène de référence endogène.
Résultats
Un test de l'activité antiproliférative de la souche CNCM 1-5321 a été réalisé sur différentes lignées cellulaires de cancer du côlon, HT-29 (adénocarcinome du côlon humain, type II), HTC116 (cancer colorectal humain), et Caco-2 (adénocarcinome colorectal). La souche CNCM 1-5321 est capable d’arrêter la prolifération cellulaire des lignées épithéliales intestinales humaines à un niveau comparable à celui du 5 -fluorouracile (5-FU), médicament anticancéreux utilisé ici en tant que contrôle positif (Figure 1).
Pour déterminer le mécanisme impliqué dans l'effet anti-prolifératif de la souche CNCM I- 5321, le surnageant de culture (MRS), les cellules inactivées par UV, les cellules lysées par ultrasons et les cellules vivantes ont été testés. Le surnageant ne montre pas d’effet anti prolifératif (Figure 2). Cependant, les cellules inactivées par UV et les cellules traitées par ultrasons ont maintenu un effet antiprolifératif indiquant que la souche CNCM 1-5321 conserve un effet antiprolifératif indépendamment de sa viabilité (Figures 2 et 3).
La souche CNCM 1-5321 est également capable d'augmenter de 25% les niveaux d'annexine V+/PI+ (cellules apoptotiques tardives, Figure 4) et d’induire la mort cellulaire apoptotique via l'activation et suppression de l'expression des gènes anti-apoptotiques ErbB2, ErbB3 {via Casp8 ), deux gènes initiateurs de l'apoptose médiée par le TNF-a, et en modulant l’expression des gènes BAX et PKM2 impliqués dans le métabolisme cellulaire (Figure 5).
Pour déterminer si l’effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 est spécifique des lignées tumorales, un test de l'activité antiproliférative a été réalisé sur la lignée tumorale HT29 (adénocarcinome du côlon humain, type II) et sur la lignée non-cancéreuse FHC (cellules de colon humain fœtal). La souche CNCM 1-5321 inhibe la prolifération cellulaire de la lignée tumorale, mais n’a aucun effet significatif sur la croissance des cellules non- cancéreuses (Figure 6).

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes) sous le numéro 1-5321.
2. Fraction cellulaire de la souche définie selon la revendication 1.
3. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche, pour son utilisation comme médicament.
4. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321, ou une fraction cellulaire de ladite souche, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer, en particulier du cancer de l’intestin, plus particulièrement du cancer colorectal.
5. Composition comprenant la souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche.
6. Composition selon la revendication 5, ladite composition étant un produit pharmaceutique ou un produit alimentaire, en particulier un complément alimentaire.
7. Composition selon l’une des revendications 5 et 6, dans laquelle ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, à raison d’au moins 105 ufc par gramme de produit.
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