FR3082207A1 - Nouvelle souche probiotique de lactobacillus brevis - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une nouvelle souche probiotique de Lactobacillus brevis, isolée à partir de pulque, dotée de propriétés anti-cancéreuses, ainsi que des compositions comprenant ladite souche.
Description
NOUVELLE SOUCHE PROBIOTIQUE DE LACTOBACILLUS BREVIS
La présente invention concerne une nouvelle souche probiotique de Lactobacillus brevis, isolée à partir de pulque, dotée de propriétés anti-cancéreuses, ainsi que des compositions comprenant ladite souche.
Selon la définition actuellement admise, les probiotiques sont « des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé ». Les organismes probiotiques utilisés en alimentation humaine sont généralement des bactéries lactiques, appartenant principalement aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium. Les effets bénéfiques des bactéries probiotiques ne sont toutefois pas communs à l’ensemble des bactéries d’un même genre, ni même d’une même espèce, et ne se rencontrent, le plus souvent, que chez certaines souches. En outre, les effets observés peuvent varier d’une souche probiotique à l’autre, y compris à l’intérieur d’une même espèce. Actuellement, le potentiel probiotique des bactéries lactiques isolées à partir de produits fermentés traditionnels suscite un fort intérêt, en particulier dans les pays en développement où l’accès aux probiotiques est limité et où le développement de nouveaux produits et compléments alimentaires pourrait permettre de lutter contre certaines maladies (Vinderola et al., LWT-Food Sci Technol 41:1678-1688,2008).
Le pulque est une boisson alcoolique traditionnelle mexicaine, issue de la fermentation de la sève de divers agaves, qui contient une grande diversité de bactéries lactiques, en particulier des lactobacilles et des leuconostoques (Escalante et al., Int J Food Microbiol 24:126-134, 2008). De récentes études suggèrent que certaines cultures préhispaniques du Mexique pratiquaient des lavements en utilisant le pulque pour combattre les maladies et les troubles du système digestif (Lemus-fuentes, Temas de Ciencia y Tecnologia 102:143-150, 2006). Il a d’ailleurs été démontré expérimentalement que certaines souches de lactobacilles (notamment des souches de Lactobacillus san franciscensis, Lactobacillus plantarum et Lactobacillus compostï) isolées à partir de pulque possèdent des propriétés anti-inflammatoires potentiellement bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires intestinales (Torres-Maravilla et al, Appl Microbiol Biotechnol 100:385-396,2015).
Dans ce contexte, les Inventeurs sont parvenus à isoler une nouvelle souche de Lactobacillus brevis possédant des propriétés anticancéreuses. De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont ainsi montré que ladite souche est capable de réduire la prolifération de lignées cellulaires tumorales et de modifier l’expression de certains gènes pro-apoptotiques ou certains gènes impliqués dans le développement tumoral.
La présente invention a ainsi pour objet cette souche de Lactobacillus brevis, déposée selon le Traité de Budapest, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) le 30 Mai 2018 sous le numéro 1-5321.
La souche CNCM 1-5321 a été identifiée comme appartenant à l’espèce L. brevis à l’aide d’un test API 50 CHL et par séquençage de l’ARN 16S.
| Séquence partielle de l’ARN 16S de la souche CNCM 1-5321 (SEQ ID NO : 1) | AGCCAAGTCTGATGGAGCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGT TTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTG AGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCA GGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACC GGAGAAGT GCAT C GGAAACTGGGAGACT T GAGT GCAGAAGA GGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATTA |
Table 1. Séquence partielle de l’ARN 16S de la souche CNCM 1-5321.
Cette souche présente les caractéristiques morphologiques et biochimiques suivantes :
- Morphologie : Micro-organisme à Gram positif, forme de bacille,
- Métabolisme : Catalase (-), hétérofermentaire,
- Fermentation des sucres : L-arabinose (+), ribose (+) D-xylose (+), D-glucose (+), Dfructose (+), D-mannose (+), A-methyl-deglucoside (+), N acetyl glucosamine (+), esculine (+), cellobiose (+), maltose (+), mélibiose (+), gluconate (+), ceto-gluconate (+).
Elle possède d’autre part des propriétés anti-cancéreuses, se traduisant par une capacité à inhiber la prolifération de lignées cellulaires tumorales et à modifier l’expression de certains gènes pro-apoptotiques ou certains gènes impliqués dans le développement tumoral.
Comme montré dans les exemples, les propriétés anti-câncéreuses de la souche CNCM 1-5321 sont indépendantes de son état de viabilité. Par conséquent, la présente invention englobe la souche CNCM 1-5321 quel que soit son état de viabilité, non seulement sous forme vivante, mais également sous forme morte, sous forme inactivée ou encore sous forme de lysat bactérien.
Dans la présente invention, une bactérie est considérée comme vivante si celle-ci est capable de se multiplier. A l’inverse, une bactérie est considérée comme morte ou inactivée lorsqu’elle a perdu sa capacité à se multiplier. Les techniques permettant d’inactiver des bactéries sont bien connues de l’homme de l’art. De manière non limitative, la souche CNCM 1-5321 peut être inactivée par exposition à un rayonnement ultra-violet. Par exemple, la souche CNCM 1-5321 peut être inactivée selon la méthode décrite dans Neyzi et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 53:12-19, 2017. Brièvement, la culture bactérienne est centrifugée pendant 10 min, puis le culot cellulaire est resuspendu dans du PB S et exposé au rayonnement UV pendant 15 minutes afin d’inactiver la bactérie. Pour s’assurer que la bactérie n’est plus capable de se multiplier, une culture contrôle est réalisée dans du MRS après le traitement aux UV.
La présente invention englobe également les souches susceptibles d’être obtenues par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche CNCM 1-5321. Les procédés permettant de muter ou de transformer la souche CNCM 1-5321 sont bien cornus de l’homme du métier et correspondent aux méthodes utilisées en routine pour modifier le génome des bactéries lactiques, en particulier des bactéries appartenant à l’espèce Lactobacillus brevis. De manière non limitative, de telles méthodes incluent la mutagénèse aléatoire (par exemple à l’aide de rayonnement UV ou d’un agent chimique mutagène), la mutagénèse dirigée ou la recombinaison homologue.
De préférence, ces souches conservent au moins les propriétés anti-cancéreuses de la souche CNCM 1-5321. Il peut s’agir de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes de la souche CNCM 1-5321 a (ont) été muté(s), par exemple de afin de modifier certaines propriétés métaboliques (e.g. la capacité de cette souche à résister à l’acidité, à résister au transit intestinal, à métaboliser certains sucres, ...). Il peut s’agir également de souches résultant de la transformation génétique de la souche CNCM 1-5321 par un ou plusieurs gène(s) d’intérêt, permettant par exemple de conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires ou d’exprimer des protéines d’intérêt que l’on souhaite administrer par l’intermédiaire de ladite souche.
La présente invention a également pour objet une fraction cellulaire pouvant être obtenue à partir de la souche CNCM 1-5321.
En particulier, il peut s’agir d’une préparation de paroi bactérienne obtenue à partir d’une culture de ladite souche. Il peut également s’agir de surnageants de culture ou de fractions de ces surnageants.
Les fractions cellulaires peuvent être préparées selon les méthodes connues de l’homme de l’art. De manière non-limitative, ces méthodes comprennent généralement une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation des fractions contenant les membranes desdites bactéries du lysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Par exemple, les fractions cellulaires peuvent être préparées par sonification selon la méthode décrite dans Tiptiri-Kourpeti et al., PLOS one 11(2): e0147960, 2016.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation comme médicament.
De préférence, la souche CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de la souche CNCM 1-5321 est ingérée par voie orale.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer, en particulier du cancer de l’intestin, plus particulièrement du cancer colorectal, mais aussi d’autres types de carcinomes tels que le cancer du sein, du poumon, du foie, etc.
Comme montré dans les exemples, les Inventeurs ont mis en évidence que la souche de l’invention inhibe la prolifération des lignées cellulaires tumorales, en particulier les lignées humaines HT29, HTC116 et Caco2 dérivées de cellules d’adénocarcinome colorectal.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche inhibe la prolifération des cellules cancéreuses.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche ou la fraction cellulaire de ladite souche augmente l’expression d’au moins un gène pro-apoptotique chez lesdites cellules cancéreuses.
De préférence, ledit gène pro-apototique est choisi parmi le groupe de gènes comprenant CASP8, CASP9, BCL2, BAXet BCL-XL.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne la souche L. brevis CNCM I5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite souche ou la fraction cellulaire de ladite souche diminue l’expression d’au moins un gène impliqué dans le développement d’une tumeur.
De préférence, ledit gène impliqué dans le développement d’une tumeur est choisi parmi le groupe de gènes comprenant erbB2, erbB3 et PKM2.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de traitement chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche audit sujet
La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche audit sujet
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l’utilisation de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche pour la préparation d’un médicament.
La présente invention concerne également l’utilisation de la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou d’une fraction cellulaire de ladite souche pour la préparation d’un médicament destiné au traitement du cancer.
Dans un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant la souche L. brevis CNCM 1-5321 ou une fraction cellulaire de celle-ci.
De manière non-limitative, une composition selon l’invention peut être liquide ou solide et se présenter sous différentes formes, comme par exemple une gélule, une pastille, un comprimé, une pilule, un suppositoire, un sachet de poudre, un flacon de liquide, une ampoule de liquide, etc...
Dans un mode de réalisation, une composition selon l’invention peut contenir un enrobage, notamment un enrobage gastro-résistant ou un enrobage permettant une libération entérique de la souche CNCM 1-5321.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition étant un produit pharmaceutique ou un produit alimentaire, en particulier un complément alimentaire.
Selon l’invention, le terme complément alimentaire désigne un produit alimentaire fournissant un complément de nutriments ou de substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique (tels que des vitamines, des minéraux, des acides gras ou des acides aminés) manquants ou en quantités insuffisantes dans le régime alimentaire normal d'un individu.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un élément choisi parmi le groupe comprenant les vitamines, les minéraux, les acides gras et les acides aminés.
De manière non limitative, les vitamines utilisées dans la fabrication des compléments alimentaires sont généralement les vitamines A, D, E, K, Bl, B2, B6, B12 et C, la Niacine, l’Acide pantothénique, l’Acide folique et la Biotine.
De manière non limitative, les minéraux utilisés dans la fabrication des compléments alimentaires sont généralement choisis parmi le Calcium, le Magnésium, le Fer, le Cuivre, l’iode, le Zinc, le Manganèse, le Sodium, le Potassium, le Sélénium, le Chrome, le Molybdène, le Fluorure, le Chlorure, le Phosphore.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un excipient.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition comprenant également au moins un arôme.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, ladite composition étant une boisson.
Lorsque ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, celles-ci sont de préférence présentes à raison d’au moins 105 ufc par gramme de produit, avantageusement au moins 106 ufc par gramme, plus avantageusement au moins 107 ufc par gramme, et encore
Q plus avantageusement au moins 10 ufc par gramme.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition telle que définie précédemment, dans laquelle la souche CNCM 1-5321 est en association avec un autre organisme probiotique, de préférence une bactérie lactique.
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, les exemples ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention.
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LEGENDES DES FIGURES
Figure 1. Effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), de 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321, de la souche L. casei BL23 et de la souche L. casei ATCC334. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif (P <0,05).
Figure 2. Effet anti-prolifératif de la souche CNCM 1-5321 inactivée par UV sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321, du surnageant de culture de la souche CNCM 1-5321 (milieu MRS) et de la souche CNCM I5321 inactivée par UV. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif (P <0,05).
Figure 3. Effet anti-prolifératif du culot cellulaire de la souche CNCM 1-5321 après sonication sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29, HTC116 et Caco2 sont incubées en présence de PBS (contrôle négatif), 5-FU (5 Fluorouracile) (contrôle positif), de la souche CNCM 1-5321 et du culot cellulaire de la souche CNCM 1-5321 après sonication. * indique une différence significative par rapport au contrôle négatif (P <0,05).
Figure 4. Effets pro-apoptotiques de la souche CNCM 1-5321 sur les lignées cellulaires tumorales. Les cellules HT29 et HTC116 sont incubées 24h avec la souche CNCM 1-5321. La viabilité des lignées cellulaires a été déterminée par coloration avec de l'annexine V-FITC et de l'iodure de propidium (PI) suivie d'une analyse par cytométrie de flux.
Figure 5. Expression des gènes erbB2, erbB3, Casp8, Casp9, BCL-XL, BCL2, BAX et PKM2. Les valeurs ont été calibrées par rapport à l’expression de la b-actine utilisée comme contrôle génique endogène. Les résultats sont présentés sous forme d'expression de gène relative (dR) par rapport à l’expression du gène en présence de PBS (contrôle négatif).
EXEMPLES
Matériels et méthodes
Bactéries
Les lactobacilles ont été cultivés dans du milieu Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Difco Laboratories) pendant une journée à 37 ° C.
Pour la préparation des fractions cellulaires, le culot a été lavé deux fois avec du PBS et un extrait cellulaire a été obtenu par sonication (10 cycles entre 40 et 60 watts d'amplitude). Les composants solubles et insolubles ont été séparés par centrifugation, la teneur en protéines a été quantifiée par Bradford.
Pour la préparation d’un surnageant de culture, le surnageant a été obtenu par centrifugation après une nuit de culture, puis stérilisation par filtration (0,45 pm).
Pour l’inactivation des bactéries, les bactéries ont été tuées par exposition aux rayonnements UV pendant 15 min. L'inactivation a été confirmée par incubation sur des boites de Pétri.
Lignées cellulaires
Toutes les lignées cellulaires ont été achetées auprès de l'ATCC. Des lignées cellulaires cancéreuses, HT29, HTC116 et Caco2 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco riche en glucose (DMEM) additionné de 10% (vol/vol) de sérum bovin fœtal (FBS), de 2mM de L-glutamine, de 50 mg/ml de pénicilline et de 50 mg/ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
Test de prolifération h avant la stimulation, les cellules ont été ensemencées sur des microplaques 96 puits à raison de 2 x 104 cellules par puit. Les cellules ont été fixées dans de l'acide trichloroacétique à 5% (TCA) pendant 1 heure à 4°C et lavées quatre fois dans de l'eau distillée. Les microplaques ont été colorées avec 100 pl/puit de 0,057% (poids/volume) de poudre de sulforhodamine (SRB)/eau distillée, lavées 4 fois dans de l'acide acétique à 0,1% et redéshydratées à température ambiante. Les cellules colorées ont été lysées dans du tampon Tris 10 mM et la densité optique (DO) a été mesurée à 510 nm.
Coloration à l'annexine V et propidium iodure (PI) heures avant la stimulation, les cellules HT-29 ont été ensemencées à raison de 1 x 106 cellules/ml et laissées en fixation pendant une nuit à 37°C dans un incubateur à CO2. La coo culture avec une bactérie (1x10 cellules) a été réalisée pendant 24 h. Les cellules ont été récoltées (tripsination) et lavées deux fois avec du PBS froid, puis remises en suspension dans du tampon de liaison IX à une concentration de 1 x 106 cellules/ml. Les cellules ont été incubées avec 5 μΐ de Annexine V-FITC et 5 μΐ de PI pendant 15 min à température ambiante (25°C) en conditions d'obscurité. 400 μΐ de tampon de liaison IX ont été ajoutés à chaque tube et les cellules ont été analysées par cytométrie de flux. Les contrôles utilisés sont (i) des cellules non traitées, et des cellules colorées avec (ii) de l'annexine V-FITC uniquement, (iii) de l’IP uniquement, et (iv) à la fois de l'annexine V-FITC et du PL
Tests qPCR
Des co-cultures ont été réalisées comme indiqué ci-dessus. L'ARN a été extrait en utilisant le kit RNeasy Mini de Qiagen. La qualité et la concentration de l'ARN ont été examinées par électrophorèse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium et par analyse spectrophotométrique. La matrice d'ADNc a été synthétisée à partir de 1 pg d'ARN avec le kit de transcription inverse High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La réaction de RT-qPCR a été réalisée dans un volume réactionnel de 25 μΐ (Takyon™ Rox SYBR® MasterMix dTTP blue) avec les amorces suivantes: B-actine, Caspas8, Caspas9, ErbB2, ErbB3, BCL2, BCL-XL dans le premier cycle thermique qPCR. Les valeurs d'expression ont été quantifiées et normalisées par la méthode ACt, en utilisant la moyenne géométrique Ct de la β-actine comme gène de référence endogène.
Résultats
Un test de l’activité antiproliférative de la souche CNCM 1-5321 a été réalisé sur différentes lignées cellulaires de cancer du côlon, HT-29 (adénocarcinome du côlon humain, type II), HTC116 (cancer colorectal humain), et Caco-2 (adénocarcinome colorectal). La souche CNCM 1-5321 est capable d’arrêter la prolifération cellulaire des lignées épithéliales intestinales humaines à un niveau comparable à celui du 5-fluorouracile (5-FU), médicament anticancéreux utilisé ici en tant que contrôle positif (Figure 1).
Pour déterminer le mécanisme impliqué dans l'effet anti-prolifératif de la souche CNCM I5321, le surnageant de culture (MRS), les cellules inactivées par UV, les cellules lysées par ultrasons et les cellules vivantes ont été testés. Le surnageant ne montre pas d’effet antiprolifératif (Figure 2). Cependant, les cellules inactivées par UV et les cellules traitées par 5 ultrasons ont maintenu un effet antiprolifératif indiquant que la souche CNCM 1-5321 conserve un effet antiprolifératif indépendamment de sa viabilité (Figures 2 et 3).
La souche CNCM 1-5321 est également capable d'augmenter de 25% les niveaux d'armexine V+/PI+ (cellules apoptotiques tardives, Figure 4) et d’induire la mort cellulaire apoptotique via l'activation et suppression de l'expression des gènes anti-apoptotiques ErbB2, ErbB3 (via 10 Casp8), deux gènes initiateurs de l'apoptose médiée par le TNF-α., et en modulant l’expression des gènes BAXet PKM2 impliqués dans le métabolisme cellulaire (Figure 5).
Claims (7)
- REVENDICATIONS1. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes) sous le numéro 1-5321.
- 2. Fraction cellulaire de la souche définie selon la revendication 1.
- 3. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche, pour son utilisation comme médicament.
- 4. Souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321, ou une fraction cellulaire de ladite souche, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer, en particulier du cancer de l’intestin, plus particulièrement du cancer colorectal.
- 5. Composition comprenant la souche de Lactobacillus brevis déposée le 30 Mai 2018 auprès de la CNCM sous le numéro 1-5321 ou une fraction cellulaire de ladite souche.
- 6. Composition selon la revendication 5, ladite composition étant un produit pharmaceutique ou un produit alimentaire, en particulier un complément alimentaire.
- 7. Composition selon l’une des revendications 5 et 6, dans laquelle ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, à raison d’au moins 105 ufc par gramme de produit.
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