EP3768788A1 - Substrat pour l'impression de proteines - Google Patents

Substrat pour l'impression de proteines

Info

Publication number
EP3768788A1
EP3768788A1 EP19716080.7A EP19716080A EP3768788A1 EP 3768788 A1 EP3768788 A1 EP 3768788A1 EP 19716080 A EP19716080 A EP 19716080A EP 3768788 A1 EP3768788 A1 EP 3768788A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
layer
benzophenone
substrate
solvent
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19716080.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Vincent Studer
Louise BONNEMAY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alveole
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Original Assignee
Alveole
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alveole, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Bordeaux filed Critical Alveole
Publication of EP3768788A1 publication Critical patent/EP3768788A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/045—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers using devices to improve synthesis, e.g. reactors, special vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709—Type of synthesis
    • B01J2219/00711—Light-directed synthesis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present application relates to the general field of grafting proteins onto a substrate and, in particular, grafting proteins in a predefined pattern onto a substrate by optical means.
  • the international application published under the number WO 2016/050980 (hereinafter referred to as the "Studer publication”) concerns a micro-structured or pattern-based grafting method of proteins on a printing or photochemical substrate, in which the The substrate is covered with a nano-scale antifouling layer (between 1 nm and 20 nm), that is to say a nonstick layer for living cells.
  • This type of nonstick layer is particularly a polymer brush or a polymer and in particular a PEG brush (polyethylene glycol).
  • a nonstick layer for proteins is intended to be contacted with protein solutions, necessarily aqueous solutions in this known process, and is therefore insoluble in water to the extent necessary for its use.
  • Such a layer is also intended to be illuminated by radiation in the absorption spectrum of benzophenone (between 300 nm and 400 nm) and is therefore resistant to this radiation, to the extent necessary for its printing.
  • the method of the Studer publication essentially consists in putting in contact with or depositing on a surface-treated substrate with a PEG brush a drop of an aqueous solution of a benzophenone and then illuminating the nanometric layer of the brush, in the presence of the drop, with wavelength radiation included in the absorption spectrum of the benzophenone (between 300 nm and 400 nm) in a predefined pattern.
  • the substrate obtained is selectively adhesive for the proteins in the illuminated areas; it then makes it possible to print or deposit proteins and then cells on the substrate and their multiplication only in the zones of the reason, ie according to a specific adhesion.
  • the benzophenone used in the Studer publication is necessarily a benzophenone soluble in a solvent which is water, so that it can be put into the form of an aqueous solution.
  • the invention relates to a product for the printing of proteins, comprising a substrate, a first nanometric, non-stick polymer layer for the proteins deposited on the substrate, and a second solid layer of benzophenone deposited on the substrate.
  • first layer The second solid layer is soluble in a solvent, and the first layer is insoluble in the solvent.
  • soluble will be understood in this specification as the property for a solid material to be able to be dissolved in a given solvent.
  • solvent will be understood herein to mean a liquid capable of dissolving a solid or dispersing its molecules or atoms.
  • layer will be understood in the present disclosure as a film of material which is solid, in particular pasty or gelled, with the exclusion of a film of liquid material.
  • the thickness of a layer may be either constant for a film with flat and parallel faces, or variable for a curved or curved film (in particular, dome).
  • deposited will be understood in this presentation as "in mechanical contact”.
  • this word will designate a form of mechanical contact without relative displacement of the atoms of the material with respect to the substrate or without flow and will mean “hooked”
  • this word will designate a mechanical contact with possible flow or relative displacement of the atoms of the material and the liquid, relative to the substrate.
  • thin or “nanometric” layer will be understood in this specification as a layer of thickness between 1 nm and 2000 nm, without excluding layers thinner than one nanometer and anti-adhesive for proteins.
  • the second layer is soluble in a polar solvent
  • the first layer is a brush of a polymer
  • the substrate is a glass
  • the second layer is soluble in water, in ethanol or in isopropanol;
  • the polymer is a polyethylene glycol (PEG).
  • the invention also relates to a method comprising the following steps:
  • first nanometric, nonstick polymer layer for proteins depositing on the substrate a first nanometric, nonstick polymer layer for proteins; depositing on the first layer a second layer of a benzophenone, the second layer being soluble in a solvent and the first layer being insoluble in this solvent.
  • This method makes it possible to obtain or manufacture a product for the printing of proteins as previously described.
  • the second layer is deposited on the first layer according to the following steps:
  • the second layer is deposited on the first layer by a physical deposition of the benzophenone, vapor phase (PVD).
  • PVD vapor phase
  • the method comprises the following additional steps:
  • the method comprises the following additional steps:
  • Figure 1 shows an example of a product for printing proteins.
  • the first nonstick layer 3 is in mechanical contact with the substrate 1 and the benzophenone layer 2, and the first nonstick layer 3 is disposed between the second layer 2 and the glass substrate 1.
  • the substrate 1 may be flat, as shown.
  • the substrate 1 is, in a manner known from the prior art, covered with the first non-stick polymer layer 3 for living cells, or non-stick layer, or antifouling layer ("antifouling"). English) within the meaning of the Studer publication mentioned above.
  • This first layer is in this first embodiment, a polymer brush and the polymer is a PEG (polyethylene glycol).
  • This first layer 3 is deposited on the substrate 1 by means known from the prior art.
  • a liquid solution of a water-soluble benzophenone is prepared from a crystalline powder of the soluble benzophenone, non-transparent in the visible in this powdery form, and de-ionized water.
  • Soluble benzophenone is, for example, of the chemical formula: (4-benzoylbenzyl) trimethylammonium chloride.
  • One drop or several drops of the solution is then deposited on the first layer 3 until the liquid solution is spread on the substrate, ie on the substrate covered with the first layer, to obtain on its surface a solution film. , with parallel faces or undulating or curved.
  • the resulting system can be baked, for example at 70 ° C. or allowed to dry naturally at room temperature, to dry the solution by evaporation.
  • the same method would apply for a solvent that would not be water provided that the solvent used is compatible with the first layer 3. This gives, after drying, a second layer 2 more or less hard transparent benzophenone, ie not crystallized.
  • any benzophenone having, once deposited in a layer, a transparency in the visible or a non-crystallization is in accordance with the teaching of the present disclosure and can therefore be used in the context of the invention.
  • the layer may be obtained by evaporation of a solution of benzophenone in a solvent, or by any other method of depositing a layer of this benzophenone on the first layer 3.
  • the non-crystallization of the benzophenone layer obtained allows the photo-printing of patterns by illumination of the first layer 3, without degradation of the layer 3 due to the crystals.
  • the photo-printing is carried out with a radiation in the absorption spectrum of the benzophenone, through the second layer 2 or through the substrate 1, chosen sufficiently transparent to the illumination radiation.
  • an illumination for example in the visible, at grazing incidence, of this second layer 2 conveniently reveals, on the external surface of the second layer 2, the patterns that have been imaged on the first layer 3, disposed at the internal surface of the second layer 2, without having to access the first layer 3.
  • the photoprinting of patterns is thus durable and recognizable to the naked eye on the surface of the second layer 2, which makes it easy to distinguish a photo-printed layer from a non-photo-printed layer.
  • the radiation used to illuminate the patterns will be of a wavelength or a spectrum located in the absorption band of benzophenone, which is between 300 nm and 400 nm.
  • the layer can be scratched to measure its thickness and layers greater than 100 microns can be easily obtained. It is also possible to control the initial amount of benzophenone solution to obtain a controlled layer thickness. Those skilled in the art will be able to determine in each case the finest layer that can be reached by simple execution operations.
  • reducing the thickness of the layer makes it possible to avoid or minimize interference of the radiation between the faces of the layers, and errors of printing of the patterns. It is also possible to use solvent mixtures to homogenize the spreading of the layer, these solvents then being removed.
  • the product once the benzophenone layer obtained, can be stored and transported easily without special precautions. It can be insolated on an optical system without means of microfluidic or fluidic, to oppose the drying or evaporation of a drop of aqueous benzophenone solution, which would be necessary in the method of publication Studer, to obtain a constant concentration of benzophenone above the first layer during illumination, so as to also obtain a controlled subsequent adhesion for the proteins in the illuminated areas.
  • This advantage is obtained thanks to the second layer 2 of benzophenone, which is solid (eg pasty or gelled) and in which the concentration of benzophenone is more stable, on the time scale of the illumination, than in a drop of solution benzophenone liquid.
  • This solvent may be a deionized water but it has been found that ethanol or isopropanol which are polar solvents are well suited to the invention. A benzophenone soluble in a polar solvent will therefore be particularly suitable for the invention.
  • the first release layer rendered adhesive for the proteins
  • the first release layer can be brought into contact, according to the patterns, by means of illumination, with a solution of proteins to obtain a printed protein pattern on the first layer, according to the illuminated patterns.
  • a non-water soluble benzophenone may also be used if a solvent is found in which no crystallization is observed by drying the layer.
  • Benzoin ethyl ether can thus be used using acetone as a solvent.
  • the second layer is deposited in a better controlled thickness, in a PVD (physical vapor deposition) frame or by any technique (PVD, CVD, ...) for depositing a layer of transparent (non-crystallized) benzophenone on a substrate, without destroying the nonstick layer.
  • PVD physical vapor deposition
  • Physical vapor deposition may allow the production of thin layers of benzophenone, very regular thickness and thus inducing less interference during the photo-printing. This deposit mode is therefore particularly interesting.
  • This mode is preferred for thin layers less than 1000 nm thick or submicron, which can be difficult to obtain by drying, at least without crystallization, for a particular benzophenone.
  • a benzophenone suitable for this type of vapor phase submicron deposition will be, for example, a soluble benzophenone such as sulisobenzone or benzophenone 4 or a benzophenone type (4-benzoylbenzyl) trimethylammonium chloride.
  • a soluble benzophenone such as sulisobenzone or benzophenone 4
  • a benzophenone type (4-benzoylbenzyl) trimethylammonium chloride.
  • any thin film deposition method known from the prior art and compatible with the deposition of a layer of soluble benzophenone, the most regular and controlled thickness before the wavelength of illumination can be used to produce the product of the invention.
  • the solvent used for rinsing, ie the dissolution, of the second layer may be arbitrary provided that it is compatible with the substrate and the release layer, in particular the release layer will be insoluble in this solvent and the substrate.
  • water will be the preferred solvent for the rinsing operation, the non-stick layers for proteins and the glass generally used as a substrate being water resistant.
  • the operation of depositing a solid layer, in particular in the form of a gel increases the concentration of the benzophenone with respect to a liquid and that the photo-printing time, all other things being equal, is shortened. .
  • a printing time of a 40 second pattern with a drop of aqueous solution in contact with the first layer a printing time of 0.5 seconds is easily obtained with a second layer obtained by evaporation of the drop. according to the present application.
  • the deposition of a benzophenone layer makes it possible to have a better renewal of oxygen at the level of the first layer 3, with a drop of aqueous solution, thicker and therefore less permeable to oxygen than the second layer 2, and improve the homogeneity and instant reproducibility of the photo-printing.
  • the deposited layer of benzophenone deposited according to the invention by drying or CVD or PVD is of stable concentration, which improves the long-term reproducibility of the printing of proteins on the release layer of the substrate.
  • the benzophenone layer may be deposited in the form of a transparent cluster, without seeking to make it immediately of substantially uniform thickness, for example by depositing a drop of benzophenone solution with a pipette, to obtain a film of typical thickness of 100 microns and variable shape, substantially circular, in particular curved or domed and drying the drop without spreading, thus maintaining the transparency or non-crystallization.
  • deposit a drop of solvent on the solid deposit or cluster above to dissolve and re-spread the reformed solution on the first layer 3.
  • a non-crystallized layer After evaporation of the solvent, a non-crystallized layer , transparent, reappears.
  • a layer of benzophenone, initially spread, deposited according to this third mode it is noted that it is possible later to deposit a drop of solvent on the cluster or the layer, to reconstitute a solution and dry it in the form of a thin layer of uniform thickness of the order, for example of a few microns. It is thus possible to compensate or repair with this method, a spread defect of the thin layer benzophenone gel deforming its surface on the first layer 3 nonstick for proteins.
  • this method of compensation or repair by adding a drop of solvent applies to all modes of the invention, i.e. to any layer of benzophenone deposited.
  • the invention is susceptible of industrial application or useful in the field of protein printing on a substrate.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Application Of Or Painting With Fluid Materials (AREA)
  • Laminated Bodies (AREA)
  • Materials For Photolithography (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Paints Or Removers (AREA)
  • Printing Methods (AREA)

Abstract

Produit pour l'impression de protéines comprenant un substrat (1), une première couche de polymère (3), nanométrique, antiadhésive pour les protéines, déposée sur le substrat (1), et une deuxième couche d'une benzophénone (2), déposée sur la première couche (3), dans lequel la deuxième couche (2) est solide et soluble dans un solvant, et la première couche (3) est insoluble dans le solvant.

Description

SUBSTRAT POUR L’IMPRESSION DE PROTÉINES
DOMAINE TECHNIQUE
La présente demande concerne le domaine général du greffage de protéines sur un substrat et, en particulier, le greffage de protéines selon un motif prédéfini sur un substrat par un moyen optique.
ARRIÈRE-PLAN
La demande internationale publiée sous le numéro WO 2016/050980 (appelée ci-après la « publication Studer »), concerne un procédé de greffage micro-structuré ou selon un motif, de protéines sur un substrat d’impression ou photochimique, dans lequel le substrat est recouvert d’une couche anti-salissures (en anglais « antifouling ») nanométrique (entre 1 nm et 20 nm), c’est-à-dire une couche antiadhésive pour les cellules vivantes. Ce type de couche antiadhésive est tout particulièrement une brosse de polymère ou d’un polymère et notamment une brosse d’un PEG (Polyéthylène glycol). Une couche antiadhésive pour les protéines est destinée à être mise en contact avec des solutions de protéines, solutions nécessairement aqueuses dans ce procédé connu, et est donc insoluble dans l’eau dans la mesure nécessaire à son utilisation. Une telle couche est aussi destinée à être illuminée par un rayonnement dans le spectre d’absorption de la benzophénone (entre 300 nm et 400 nm) et est donc résistante à ce rayonnement, dans la mesure nécessaire à son impression.
Le procédé de la publication Studer consiste essentiellement à mettre en contact ou déposer sur un substrat traité en surface avec une brosse de PEG, une goutte d’une solution aqueuse d’une benzophénone, puis à éclairer la couche nanométrique de la brosse, en présence de la goutte, avec un rayonnement de longueur d’onde comprise dans le spectre d’absorption de la benzophénone (entre 300 nm et 400 nm) selon un motif prédéfini. Après rinçage de la benzophénone en solution, le substrat obtenu est sélectivement adhésif pour les protéines dans les zones éclairées ; il permet alors l’impression ou le dépôt de protéines puis de cellules sur le substrat et leur multiplication seulement dans les zones du motif, i.e. selon une adhésion spécifique.
La benzophénone utilisée dans la publication Studer est nécessairement une benzophénone soluble dans un solvant qui est l’eau, de façon à pouvoir être mise sous forme de solution aqueuse.
Toutefois, dans le procédé de la publication Studer, la présence d’une goutte de solution aqueuse au moment de l’éclairement de la couche nécessite de compenser l’évaporation inévitable de la goutte pendant le temps d’éclairement pour stabiliser la concentration de la benzophénone dans la solution aqueuse, afin d’obtenir une reproductibilité de l’impression d’un motif de protéines sur le substrat. Le séchage de la goutte de solution aqueuse de benzophénone constitue donc un problème dans ce procédé connu. Une solution pourrait consister à prévoir une alimentation en eau de la goutte, par des moyens micro-fluidiques, pour compenser la perte de liquide occasionnée par le séchage ou l’évaporation de la goutte, de façon à maintenir son volume constant. Une telle solution complique cependant le dispositif expérimental. Ainsi, dans le procédé de la publication Studer, maintenir une concentration de benzophénone constante dans la goutte apparaît donc comme souhaitable mais difficile.
PRÉSENTATION GÉNÉRALE
Dans ce contexte, l’invention concerne un produit pour l’impression de protéines, comprenant un substrat, une première couche de polymère, nanométrique, antiadhésive pour les protéines, déposée sur le substrat, et une deuxième couche solide de benzophénone, déposée sur la première couche. La deuxième couche solide est soluble dans un solvant, et la première couche est insoluble dans le solvant.
Le mot « soluble » sera entendu, dans le présent exposé, comme la propriété pour un matériau solide de pouvoir être dissout dans un solvant donné.
Le mot « solvant » sera entendu, dans le présent exposé, comme désignant un liquide apte à dissoudre un solide ou à disperser ses molécules ou atomes. Le mot « couche » sera entendu, dans le présent exposé, comme un film de matière qui est solide, notamment pâteux ou gélifié, à l’exclusion d’un film de matière liquide. L’épaisseur d’une couche peut être soit constante pour un film à faces planes et parallèles, soit variable pour un film ondulé ou bombé (notamment, en dôme).
Le mot « déposé(e) », sera entendu, dans le présent exposé, comme « en contact mécanique ». Pour une couche d’un matériau disposée sur un substrat solide, ce mot désignera une forme de contact mécanique sans déplacement relatif des atomes du matériau par rapport au substrat ou sans écoulement et signifiera « accrochée », alors que pour une solution d’un matériau dans un liquide, disposée sur un substrat solide, ce mot désignera un contact mécanique avec écoulement ou déplacement relatif possible des atomes du matériau et du liquide, par rapport au substrat.
Le mot couche « mince » ou « nanométrique » sera entendu, dans le présent exposé, comme une couche d’épaisseur comprise entre 1 nm et 2000 nm, sans exclure des couches plus minces qu’un nanomètre et antiadhésives pour les protéines.
Dans des variantes du produit, les dispositions suivantes sont adoptées, de manière indépendante ou combinées entre elles :
- la deuxième couche est soluble dans un solvant polaire;
- la première couche est une brosse d’un polymère;
- le substrat est un verre;
- la deuxième couche est soluble dans l’eau, dans l’éthanol ou dans l’isopropanol;
- le polymère est un polyéthylène glycol (PEG).
L’invention concerne aussi un procédé comprenant les étapes suivantes:
- fournir un substrat,
- déposer sur le substrat une première couche de polymère, nanométrique, antiadhésive pour des protéines ; - déposer sur la première couche une deuxième couche d’une benzophénone, la deuxième couche étant soluble dans un solvant et la première couche étant insoluble dans ce solvant.
Ce procédé permet d'obtenir, ou fabriquer, un produit pour l’impression de protéines telle que précédemment décrit.
Dans une variante du procédé la deuxième couche est déposée sur la première couche selon les étapes suivantes:
- déposer, sur la première couche, la benzophénone en solution dans le solvant; et
- faire s’évaporer le solvant.
Dans une autre variante du procédé, la deuxième couche est déposée, sur la première couche, par un dépôt physique de la benzophénone, en phase vapeur (PVD).
Pour la photo-impression, sur la première couche, d’un motif adhésif pour des protéines, le procédé comprend les étapes supplémentaires suivantes :
- illuminer la première couche, dans un spectre d’absorption de la benzophénone, selon le motif;
- dissoudre la deuxième couche dans le solvant;
- rincer le solvant.
Pour l’impression des protéines, selon le motif, sur la première couche, le procédé comprend les étapes supplémentaires suivantes:
- déposer, sur la première couche, une solution aqueuse des protéines;
- rincer la solution aqueuse des protéines.
Les caractéristiques et avantages précités, ainsi que d'autres, apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, d'exemples de réalisation de l'invention. Cette description détaillée fait référence aux dessins annexés. Il est toutefois rappelé que l'invention ne se limite pas à ces exemples.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les dessins annexés sont schématiques et ne sont pas nécessairement à l'échelle, ils visent avant tout à illustrer les principes de l'invention.
La figure 1 représente un exemple de produit pour l’impression de protéines.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE D’EXEMPLE(S) Le produit pour l’impression de protéines de la figure 1 comprend:
- un substrat en verre 1 ,
- une première couche de polymère 3, nanométrique antiadhésive pour les protéines, accrochée ou déposée sur une des faces du substrat 1 , et
- une deuxième couche, ou dépôt solide, de benzophénone 2 déposée sur la couche de polymère antiadhésive 3 et soluble dans un solvant.
La première couche antiadhésive 3 est en contact mécanique avec le substrat 1 et la couche de benzophénone 2, et la première couche antiadhésive 3 est disposée entre la deuxième couche 2 et le substrat en verre 1. Le substrat 1 peut être plan, comme représenté.
Dans un premier mode de réalisation, le substrat 1 est, de façon connue de l’art antérieur, recouvert de la première couche de polymère 3 antiadhésive pour les cellules vivantes, ou couche antiadhésive, ou encore couche anti- salissures («antifouling » en anglais) au sens de la publication Studer mentionnée ci-dessus. Cette première couche est dans ce premier mode de réalisation, une brosse de polymère et le polymère est un PEG (polyéthylène Glycol). Cette première couche 3 est déposée sur le substrat 1 par des moyens connus de l’art antérieur.
Dans un premier mode d’obtention du produit, on réalise une solution liquide d’une benzophénone soluble dans de l’eau, à partir d’une poudre cristallisée de la benzophénone soluble, non-transparente dans le visible sous cette forme poudreuse, et d’eau dés-ionisée. La benzophénone soluble est, par exemple, de formule chimique : (4-benzoylbenzyl)trimethylammonium chloride.
On dépose ensuite une goutte ou plusieurs gouttes de la solution, sur la première couche 3 jusqu’à étaler la solution, liquide, sur le substrat, i.e. sur le substrat recouvert de la première couche, pour obtenir à sa surface, un film de solution, à faces parallèles ou ondulé ou bombé.
On fait ensuite s’évaporer l’eau de la solution. Pour cela, on peut étuver le système obtenu, par exemple à 70°C ou le laisser sécher naturellement à température ambiante, pour assécher la solution par évaporation. La même méthode s’appliquerait pour un solvant qui ne serait pas de l’eau pourvu que le solvant utilisé soit compatible avec la première couche 3. On obtient ainsi, après séchage, une deuxième couche 2 plus ou moins dure de benzophénone transparente, i.e. non cristallisée.
Il est à noter que l’homme du métier s’attendrait à réobtenir la poudre de benzophénone cristallisée et donc non transparente, séparée de la première couche 3 et du substrat. Cependant, pour ce type de benzophénone, de façon surprenante, la benzophénone reste sous forme solide dans une couche homogène adhérente au substrat et transparente optiquement, non cristallisée, vraisemblablement sous forme de solide amorphe. La consistance de cette deuxième couche et son épaisseur permettent notamment de la rayer de façon durable.
D’une façon générale, toute benzophénone présentant, une fois déposée en couche, une transparence dans le visible ou une non-cristallisation, est conforme à l’enseignement du présent exposé et peut donc être utilisée dans le cadre de l'invention. La couche peut être obtenue par évaporation d’une solution de la benzophénone dans un solvant, ou par toute autre méthode de dépôt d’une couche de cette benzophénone sur la première couche 3.
De façon avantageuse, la non-cristallisation de la couche de benzophénone obtenue, permet la photo-impression de motifs par illumination de la première couche 3, sans dégradation de la couche 3 due aux cristaux. La photo-impression est réalisée avec un rayonnement dans le spectre d’absorption de la benzophénone, à travers la deuxième couche 2 ou à travers le substrat 1 , choisi suffisamment transparent au rayonnement d’illumination.
Après illumination, un éclairage, par exemple dans le visible, en incidence rasante, de cette deuxième couche 2, révèle commodément, à la surface externe de la deuxième couche 2, les motifs qui ont été imagés sur la première couche 3, disposée à la surface interne de la deuxième couche 2, sans avoir besoin d’accéder à la première couche 3.
La photo-impression de motifs est ainsi durable et reconnaissable à l’œil nu, à la surface de la deuxième couche 2, ce qui permet de distinguer aisément une couche photo-imprimée d’une couche non photo-imprimée. De façon connue, le rayonnement utilisé pour illuminer les motifs sera d’une longueur d’onde ou d’un spectre situé dans la bande d’absorption de la benzophénone, qui se situe entre 300 nm et 400 nm.
La couche peut être rayée pour mesurer son épaisseur et des couches supérieures à 100 microns peuvent être obtenues aisément. Il est aussi possible de contrôler la quantité initiale de solution de benzophénone pour obtenir une épaisseur de couche contrôlée. L’homme du métier pourra déterminer dans chaque cas la couche la plus fine qu’il est possible d’atteindre par de simples opérations d’exécution.
Il est à noter que réduire l’épaisseur de la couche permet d’éviter ou de minimiser des interférences du rayonnement entre les faces des couches, et des erreurs d’impression des motifs. Il est aussi possible d’utiliser des mélanges de solvants pour homogénéiser l’étalement de la couche, ces solvants étant ensuite évacués.
Le produit, une fois la couche de benzophénone obtenue, peut être stocké et transporté aisément sans précaution particulière. Il peut être insolé sur un système optique sans moyen de micro-fluidique ou de fluidique, pour s’opposer au séchage ou à l’évaporation d’une goutte de solution aqueuse de benzophénone, qui seraient nécessaires dans le procédé de la publication Studer, pour obtenir une concentration constante de benzophénone au- dessus de la première couche pendant l’illumination, afin d’obtenir aussi une adhésion ultérieure contrôlée pour les protéines, dans les zones illuminées. Cet avantage est obtenu grâce à la deuxième couche 2 de benzophénone, qui est solide (e.g. pâteuse ou gélifiée) et dans laquelle la concentration de benzophénone est plus stable, à l’échelle de temps de l’illumination, que dans une goutte de solution liquide de benzophénone.
On remarquera que l’homme du métier n’utiliserait pas dans l’art antérieur et la publication Studer susmentionnée, un solvant plus volatil que l’eau, afin de ne pas accentuer le problème de séchage de la goutte de solution aqueuse de benzophénone pendant l’illumination. Le produit peut aussi être transporté après photo-impression pour être rincé en salle blanche en dissolvant la deuxième couche dans un solvant approprié.
Ce solvant peut être une eau dés-ionisée mais il a été trouvé que l’éthanol ou l’isopropanol qui sont des solvants polaires sont bien adaptés à l’invention. Une benzophénone soluble dans un solvant polaire sera donc particulièrement adaptée à l’invention.
Après rinçage, on pourra mettre en contact la première couche antiadhésive, rendue adhésive pour les protéines, selon les motifs, grâce à l’illumination, avec une solution de protéines pour obtenir un motif de protéines imprimées sur la première couche, selon les motifs illuminés.
Une benzophénone non soluble dans l’eau pourra également être utilisée si l’on trouve un solvant dans lequel on n’observe pas de cristallisation en séchant la couche. La benzoin ethyl ether pourra ainsi être utilisée en utilisant l’acétone comme solvant.
Dans un deuxième mode de réalisation, la deuxième couche est déposée de façon mieux contrôlée en épaisseur, dans un bâti de PVD (dépôt physique en phase vapeur) ou par toute technique (PVD, CVD, ...) permettant de déposer une couche de benzophénone transparente (non-cristallisée) sur un substrat, sans détruire la couche antiadhésive.
Le dépôt physique en phase vapeur pourra permettre de réaliser des couches minces de benzophénone, d’épaisseur très régulière et induisant donc moins d’interférences lors de la photo-impression. Ce mode de dépôt est donc particulièrement intéressant.
Ce mode est préféré pour des couches minces d’épaisseur inférieure à 1000 nm ou submicronique, qui peuvent être difficiles à obtenir par séchage, au moins sans cristallisation, pour une benzophénone particulière.
Une benzophénone adaptée à ce type de dépôt submicronique en phase vapeur, sera, par exemple, une benzophénone soluble de type sulisobenzone ou benzophénone 4 ou encore une benzophénone de type (4- benzoylbenzyl)trimethylammonium chloride. Pour une benzophénone inconnue à déposer en couche mince d’une épaisseur donnée, lorsque l’observation de la couche séchée sera possible optiquement, un homme du métier pourra observer si elle est non-cristallisée et tout spécialement si elle est homogène et transparente, afin de déterminer si la benzophénone inconnue est bien adaptée à l’invention. En cas de cristallisation l’homme du métier pourra réaliser le dépôt en phase vapeur. L’enseignement de la demande s’étend donc aux benzophénones qui ne cristallisent pas en couches minces lors d’un dépôt d’épaisseur donnée. Ce critère pourra être utilisé pour choisir un procédé de dépôt adapté à une benzophénone inconnue ou pour obtenir une épaisseur nouvelle pour une benzophénone connue. L’homme du métier pourra ainsi d’abord utiliser le séchage d’une goutte de solution de benzophénone, puis le dépôt par des techniques de couches minces en phase vapeur pour déterminer quelle gamme d’épaisseur de couche de benzophénone est accessible selon l’invention pour une benzophénone donnée.
Cette combinaison de dépôt de couches minces en phase liquide ou en phase vapeur permet de réaliser potentiellement une gamme importante d’épaisseurs de couches de benzophénone, pour une benzophénone arbitraire compatible avec la photo-impression de protéines sur une couche antiadhésive d’épaisseur nanométrique déposée sur un substrat.
Tout mode de dépôt de couches minces connu de l’art antérieur et compatible avec le dépôt d’une couche de benzophénone soluble, la plus régulière et d’épaisseur contrôlée devant la longueur d’onde d’illumination pourra être utilisé pour réaliser le produit de l’invention.
Le solvant utilisé pour le rinçage, i.e. la dissolution, de la deuxième couche pourra être quelconque pourvu qu’il soit compatible avec le substrat et la couche antiadhésive, notamment la couche antiadhésive sera insoluble dans ce solvant ainsi que le substrat. Pour sa biocompatibilité avec les cellules vivantes, l’eau sera le solvant préféré pour l’opération de rinçage, les couches antiadhésives pour les protéines et le verre généralement utilisé comme substrat étant résistants à l’eau. Il est à noter que l’opération de dépôt d’une couche solide, notamment sous forme de gel, augmente la concentration de la benzophénone par rapport à un liquide et que le temps de photo-impression, toutes choses égales par ailleurs en est raccourci. Ainsi pour un temps d’impression d’un motif de 40 secondes avec une goutte de solution aqueuse en contact avec la première couche, on obtient aisément un temps d’impression de 0,5 seconde avec une deuxième couche obtenue par évaporation de la goutte selon la présente demande.
Par ailleurs, sachant que l’oxygène ou dioxygène intervient dans le mécanisme permettant de rendre les zones éclairées adhésives pour les protéines, le dépôt d’une couche de benzophénone permet d’avoir un meilleur renouvellement en dioxygène au niveau de la première couche 3, qu’avec une goutte de solution aqueuse, plus épaisse et donc moins perméable à l’oxygène que la deuxième couche 2, et d’améliorer l’homogénéité et la reproductibilité instantanée de la photo-impression.
Il est à noter aussi que la couche déposée de benzophénone déposée selon l'invention par séchage ou CVD ou PVD, est de concentration stable, ce qui améliore la reproductibilité à long terme de l’impression de protéines sur la couche antiadhésive du substrat.
L’invention s’étend à tout dépôt solide transparent ou non-cristallisé, de benzophénone, déposé sur une couche antiadhésive pour les protéines. En effet, dans un troisième mode de réalisation, la couche de benzophénone peut être déposée sous forme d’amas transparent, sans chercher à la rendre tout de suite d’épaisseur sensiblement uniforme, par exemple en déposant une goutte de solution de benzophénone avec une pipette, pour obtenir un film d’épaisseur typique de 100 microns et de forme variable, sensiblement circulaire, notamment bombée ou en dôme et en faisant sécher la goutte sans étalement, en conservant ainsi la transparence ou non-cristallisation. Pour utiliser le dépôt ci-dessus, on déposera une goutte de solvant sur le dépôt solide ou amas ci-dessus pour le dissoudre et on ré-étalera la solution reformée sur la première couche 3. Après évaporation du solvant, une couche non-cristallisée, transparente, réapparaît. En cas de vieillissement, au fil du temps, d’une couche de benzophénone, initialement étalée, déposée selon ce troisième mode, on remarque qu’il est possible ultérieurement de déposer une goutte de solvant sur l’amas ou la couche, pour reconstituer une solution et la sécher sous forme de couche mince d’épaisseur uniforme de l’ordre par exemple de quelques microns. On peut ainsi compenser ou réparer avec cette méthode, un défaut d’étalement du gel de benzophénone en couche mince déformant sa surface sur la première couche 3 antiadhésive pour les protéines.
D’une façon générale, cette méthode de compensation ou de réparation par addition d’une goutte de solvant s’applique à tous les modes de l’invention, i.e. à toute couche de benzophénone déposée.
Finalement, l’enseignement de la présente demande apparaît ainsi s’étendre à toute couche de benzophénone non-cristallisée, transparente ou non, déposée à la surface d’une couche antiadhésive pour les protéines, la couche de benzophénone étant soluble dans un solvant dans lequel la couche antiadhésive est insoluble.
L’invention est susceptible d’application industrielle ou utile dans le domaine de l’impression de protéine sur un substrat.

Claims

REVENDICATIONS
1. Produit pour l’impression de protéines, comprenant:
- un substrat (1 ),
- une première couche (3) de polymère, nanométrique, antiadhésive pour les protéines, déposée sur le substrat (1 ),
caractérisé en ce qu'il comprend, en outre,
- une deuxième couche (2) de benzophénone, déposée sur la première couche (3),
dans lequel la deuxième couche (2) est soluble dans un solvant et la première couche (3) est insoluble dans le solvant.
2. Produit selon la revendication 1 , dans lequel la deuxième couche (2) est soluble dans un solvant polaire.
3. Produit selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la première couche (3) est une brosse de polymère.
4. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le substrat (1 ) est en verre.
5. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la deuxième couche (2) est soluble dans l’eau.
6. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la deuxième couche (2) est soluble dans l’éthanol.
7. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la deuxième couche (2) est soluble dans l’isopropanol.
8. Produit selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, dans lequel le polymère est du polyéthylène glycol (PEG).
9. Procédé pour l’obtention du produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 comprenant les étapes suivantes :
déposer la première couche (3) sur le substrat (1 );
déposer la deuxième couche (2) sur la première couche (3).
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la deuxième couche (2) est déposée sur la première couche (3) selon les étapes suivantes:
déposer, sur la première couche (3), la benzophénone en solution dans le solvant;
faire s’évaporer le solvant.
11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la deuxième couche (2) est déposée sur la première couche (3), par un dépôt physique en phase vapeur (PVD) de la benzophénone.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , pour la photo-impression sur la première couche (3) d’un motif adhésif pour des protéines, comprenant les étapes supplémentaires suivantes :
illuminer la première couche (3), dans un spectre d’absorption de la benzophénone, selon le motif;
dissoudre la deuxième couche (2) dans le solvant;
rincer le solvant.
13. Procédé selon la revendication 12, pour l’impression de protéines sur la première couche (3), selon le motif, comprenant les étapes supplémentaires suivantes:
déposer, sur la première couche (3), une solution aqueuse des protéines;
rincer la solution aqueuse des protéines.
EP19716080.7A 2018-03-20 2019-03-19 Substrat pour l'impression de proteines Withdrawn EP3768788A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1852391A FR3079233B1 (fr) 2018-03-20 2018-03-20 Substrat pour l'impression de proteines
PCT/EP2019/056849 WO2019180025A1 (fr) 2018-03-20 2019-03-19 Substrat pour l'impression de proteines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3768788A1 true EP3768788A1 (fr) 2021-01-27

Family

ID=62143395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP19716080.7A Withdrawn EP3768788A1 (fr) 2018-03-20 2019-03-19 Substrat pour l'impression de proteines

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210060515A1 (fr)
EP (1) EP3768788A1 (fr)
JP (1) JP7321181B2 (fr)
CN (1) CN112534012A (fr)
FR (1) FR3079233B1 (fr)
WO (1) WO2019180025A1 (fr)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5071909A (en) * 1989-07-26 1991-12-10 Millipore Corporation Immobilization of proteins and peptides on insoluble supports
JP2008530540A (ja) 2005-02-10 2008-08-07 コミサリア ア レネルジィ アトミーク 支持体への生体分子の光化学的結合のための方法
FR2988093B1 (fr) * 2012-03-14 2014-04-25 Alveole Dispositif de greffage micro-structure de proteines sur un substrat
KR102224521B1 (ko) 2012-10-11 2021-03-08 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 광분해성 재료, 기판 및 그 패터닝 방법
FR3026742B1 (fr) * 2014-10-03 2016-12-23 Alveole Impression d'un motif adhesif sur un support anti-salissures
CN106905158B (zh) * 2017-01-26 2020-01-14 中国科学院长春应用化学研究所 一种直接改性基底的二苯甲酮型分子及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIGA E. ET AL.: "On the limits of benzophenone as cross-linker for surface-attached polymer hydrogels", POLYMERS, vol. 9, no. 12, 686, 7 December 2017 (2017-12-07), pages 1 - 14, XP055490270 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021519225A (ja) 2021-08-10
CN112534012A (zh) 2021-03-19
WO2019180025A1 (fr) 2019-09-26
US20210060515A1 (en) 2021-03-04
FR3079233A1 (fr) 2019-09-27
JP7321181B2 (ja) 2023-08-04
FR3079233B1 (fr) 2022-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2924723A1 (fr) Support solide revetu d'au moins un film de metal et d'au moins une couche d'oxyde transparent et conducteur pour la detection par spr et/ou par une methode electrochimique
US20200264101A1 (en) Nanostructured plasmonic materials and methods of making and use thereof
CN107941787A (zh) 氢气传感器及其制备方法、实现氢气检测的方法
FR2965749A1 (fr) Structure multicouche comprenant un métal précieux accroche sur un substrat diélectrique procédé et utilisation associes
EP3391027B1 (fr) Supports amplificateurs de contraste utilisant un materiau bidimensionnel
CH644454A5 (fr) Produit destine a l'analyse par voie chimique de liquides a ph eleve.
EP3108038A1 (fr) Dispositif et appareil électrochimique et procédés mettant en oeuvre un tel appareil
US10103357B2 (en) Fabrication of multilayer nanograting structures
EP2616235B1 (fr) Procédé de fabrication d'une structure optique segmentée
EP3058345B1 (fr) Supports amplificateurs de contraste pour l'observation d'un echantillon, leur procedes de fabrication et leurs utilisations
EP3768788A1 (fr) Substrat pour l'impression de proteines
EP2591336B1 (fr) Dispositif colorimetrique pour la detection, dans une solution aqueuse d'interet, d'une activite enzymatique hydrolytique a l'egard d'au moins un polymere d'interet
EP3759161B1 (fr) Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique comprenant des zones de rigidités distinctes
EP3058399B1 (fr) Procede de fabrication de supports amplificateurs de contraste
Caligiuri et al. Micro‐and Nano‐Structured Bacteria Growth Media for Planar Bio‐Photonics
WO2019016487A1 (fr) Procede de controle de l'orientation des nano-domaines d'un copolymere a blocs
KR20210093175A (ko) 나노구조체의 제조 방법, 렌즈 및 용액으로부터의 생체 물질의 판독 방법
WO2016162638A1 (fr) Mise en œuvre de chitosane ou d'alginate en tant que masque de transfert dans des procédés de lithographie et de transfert
WO2019016045A1 (fr) Procédé de lithographie interférentielle
EP3325195B1 (fr) Procédé de préparation d'un matériau bichromatique sous la forme d'un film
WO2005109097A1 (fr) Procede de lithographie, produits obtenus et utilisation dudit procede
WO2016087551A1 (fr) Procede de fabrication d'un motif metallique nanostructure et motif metallique
WO2024256675A1 (fr) Procede de marquage 3d
Gerbreders et al. Optical properties of the low-molecular amorphous azochromophores and their application in holography
EP3873851A1 (fr) Compositions a base d'yttrium, de cérium et de composé organique, ainsi que leur utilisation anti-diffusion

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20201015

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20230804

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20231215