EP3740307A1 - Verfahren zur behandlung von mindestens einer zelle mit einem chemischen syntheseprodukt in einem microarray - Google Patents

Verfahren zur behandlung von mindestens einer zelle mit einem chemischen syntheseprodukt in einem microarray

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Publication number
EP3740307A1
EP3740307A1 EP19712967.9A EP19712967A EP3740307A1 EP 3740307 A1 EP3740307 A1 EP 3740307A1 EP 19712967 A EP19712967 A EP 19712967A EP 3740307 A1 EP3740307 A1 EP 3740307A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microarray
cell
chemical synthesis
reactants
hydrophilic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19712967.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Maximilian BENZ
Pavel A. Levkin
Mijanur R. MOLLA
Alisa ROSENFELD
Marius BREHM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut fuer Technologie KIT filed Critical Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Publication of EP3740307A1 publication Critical patent/EP3740307A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray, a stacked microarray, a kit comprising at least one microarray and the use of a microarray for the chemical synthesis of a chemical synthesis product and for the treatment of at least one Cell with the chemical synthesis product in a microarray.
  • the development of biologically active substances requires mastering multidisciplinary challenges in the field of chemical biology.
  • the first step here is to find a chemical structure that interacts in the biological framework. If such a lead structure can be identified, it usually has to be optimized for further drug development, since in many cases it does not yet have a selective effect on the biological target.
  • DOS diversity-oriented synthesis
  • the combinatorial synthesis of molecules allows both a high degree of flexibility in the chemical framework and the possibility of parallel synthesis of very large libraries.
  • bulk synthesis usually involves a great deal of reagent, material and labor time requirements.
  • miniaturized form - such as in microarray format - a synthesis in the liquid phase.
  • chemical synthesis is always separate from the biological application, which makes the screening of large libraries even more time-consuming and thus more costly.
  • solid-phase bound systems have been used to synthesize molecules in microarrays.
  • solid-state microarrays chemistry is limited to simple surface synthesis, while in classical liquid-phase chemistry the full range of complex reaction mechanisms is available.
  • immobilization on the surface requires additional reaction steps which would not be necessary in the liquid phase, and additional functional groups are required on the target compounds in order to be able to bind them to the solid phase in the first place.
  • MTP microtiter plates
  • wells wells
  • large amounts of expensive reagents and cells are still needed (per well in 96-well MTP ⁇ 100pL solution / suspension), and the process is also very time consuming.
  • automation is possible, expensive robots and consumables are needed (for example, starting with synthesis to transfecting cells into 96-well MTP, approximately 800 pipette tips are needed).
  • miniaturization in MTP format (standardized) is also limited due to physical limitations.
  • the present invention provides a method of treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray comprising the steps of:
  • a first microarray having a surface with at least one hydrophilic region enclosed by a hydrophobic region, and carrying on at least one hydrophilic region a stopper of a first solution comprising a first reactant;
  • hydrophilic region comprises a reaction product of the first and second reactants as a chemical synthesis product.
  • a microarray in the sense of the present invention is understood as meaning a solid substrate having a patterned surface layer which comprises hydrophilic areas, so-called spots, which are each enclosed by hydrophobic areas (hydrophobic boundaries) on at least one surface of the microarray.
  • the surface layer may in this case be in the form of a film, a film or a coating, for example.
  • the substrate is not particularly limited and may be any substrate which is preferably solid in a temperature range of -30 ° C to 130 ° C, more preferably in a temperature range of 0 ° C to 40 ° C, and most preferably at room temperature.
  • the solid substrate may for example be selected from glass, metal, for example stainless steel or aluminum foil, plastic, concrete or wood.
  • the solid substrate is transparent, with a glass substrate being preferred.
  • the solid substrate has preferably a flat surface.
  • the hydrophilic areas of a microarray are not particularly limited in shape and may be circular, star-shaped or polygonal (triangular, rectangular, pentagonal, hexagonal, ). Hydrophilic areas with a triangular or rectangular shape allow close placement of the hydrophilic areas on the substrate. Nevertheless, for the purposes of the present invention, a microarray is not limited to a particular arrangement of the hydrophilic regions, and represents a comprehensive approach for creating defined arrays of individual drops of equal volume on the surface of a substrate.
  • the hydrophilic regions may be, for example, triangular or rectangular with a side length of 5 mm or less, 3 mm or less, 1 mm or less or 500 ⁇ m or less. In a preferred embodiment of the present invention, the hydrophilic regions are round with a diameter of 5 mm or less, more preferably 3 mm or less, even more preferably 1 mm or less.
  • the hydrophobic regions enclosing the hydrophilic regions are preferably 1 mm or less in width, more preferably 0.5 mm or less, and most preferably 0.1 mm or less.
  • the thickness of the patterned surface layer is not limited. From the viewpoint of saving properties and reduction in manufacturing cost, the patterned surface is preferably thin. In particular, a thickness of 45 ⁇ m or less is preferred, more preferably 30 ⁇ m or less, and most preferably 15 ⁇ m or less.
  • surfaces can be classified as hydrophilic or hydrophobic depending on their contact angle with water.
  • a surface with a static contact angle of at least 90 is referred to as hydrophobic, while a surface with a static contact angle of less than 90 ° is referred to as hydrophilic.
  • Static contact angles (0 s tat) are determined by placing a drop on a surface and measuring the contact angle of the resting rapping with the surface with a goniometer or a camera using special software (sessile drop measurement).
  • Dynamic contact angles represent contact angles outside an equilibrium state and are measured during the progression (0adv) or retraction (Orec) of a drop. The difference between 0a v and 0 re c is called the contact angle hysteresis.
  • hydrophobic regions have a static water contact angle of at least 90 °, preferably more than 95 °, more preferably more than 100 °, and most preferably more than 110 °.
  • the hydrophobic regions of a chip are superhydrophobic and / or the hydrophilic regions are superhydrophilic.
  • superhydrophobic regions have a static water contact angle of greater than 130 °, preferably greater than 140 °, and more preferably greater than 150 °.
  • superhydrophilic regions preferably have a water contact angle of less than 30 °, more preferably less than 20 °, and most preferably less than 10 °.
  • a microarray of the present invention is capable of supporting at least one drop of a solution on this patterned surface.
  • a microarray is capable of carrying at least 1 drop per cm 2 of the patterned surface, more preferably at least 4 drops per cm 2 of the patterned surface, even more preferably at least 8 dots per cm 2 of the patterned surface, and most preferably at least 16 drops per cm 2 of the patterned surface.
  • the upper limit of the number of drops per cm 2 of the patterned surface is not particularly limited and can be determined as required.
  • a microarray carry at most 100 drops per cm 2 of the patterned surface, more preferably at most 50 Drop per cm 2 of the patterned surface, more preferably at most 20 drops per cm 2 of the patterned surface.
  • the droplets disposed on the patterned surface of a microarray have a volume of from 100 pL to 1 mL, more preferably from 1 nL to 100 pL, even more preferably from 100 nL to 50 pL, and most preferably from 500 nL to 25 pL.
  • the drops on the patterned surface of the microarray can be applied by known methods.
  • the orders can be made, for example, manually or automatically. Preferably, the orders are made manually.
  • the orders can be made, for example, by means of discontinuous wetting. Particular emphasis should be placed here methods by rolling droplet, standing droplet, or immersion and removal of the microarray from a solution.
  • the method of applying the present invention is not particularly limited, and a person skilled in the art may select, as appropriate, the method best suited thereto.
  • a stopper of the solution to be applied is rolled over the patterned surface of the microarray, spontaneously forming microdroplets of defined geometry and volume in the hydrophilic regions.
  • individual areas of the microarray can be specifically provided with droplets and it is possible to apply drops of different solutions to different hydrophilic areas of the microarray.
  • the patterned surface of the microarray is covered with the solution to be applied and the excess solution tilted laterally, with micro-droplets spontaneously forming in the hydrophilic regions with defined geometry and volume.
  • the comparatively simple implementation of the standing droplet method requires a larger solution volume compared to the rolling droplet method, since the entire patterned surface of the microarray must be overcoated, and all the droplets produced contain the same solution.
  • High surface tension liquids (HSTL) microarrays are generally used for aqueous solvents with a high surface tension (more than 72.2 mN nr 1 ), whereas for organic solvents with a lower surface tension (less than 72.2 mN irr 1 ) low surface tension liquids (LSTL) Microarrays are used.
  • an HSTL microarray can be made by a process comprising the following steps:
  • HEMA 2-hydroxyethyl methacrylate
  • EDMA ethylene dimethacrylate
  • PFDT perfluorodecanethiol
  • the additional polymerization on the substrate surface can be dispensed with.
  • the production of an LSTL microarray involves the following steps:
  • a glass surface is modified with chlorodimethylvinylsilane and patterned with a photochemical thiol-ene reaction.
  • PFDT photochemical thiol-ene reaction.
  • cysteamine hydrochloride is used.
  • a first microarray which has a surface with at least one hydrophilic region enclosed by a hydrophobic region and which carries at least one hydrophilic region with a rupture of a first solution, which comprises a first reactant.
  • Microarrays can be prepared by the methods described above.
  • the number and arrangement of the hydrophilic spots is not particularly limited. In a preferred embodiment, the number of hydrophilic spots is at least 1 per cm 2 of the patterned surface of the microarray, more preferably at least 4 per cm 2 of the patterned surface of the microarray, even more preferably at least 8 per cm 2 of the patterned surface of the microarray and most preferably at least 16 per cm 2 of the patterned surface of the microarray.
  • the hydrophilic spots are preferably arranged in a regular pattern, for example in rows and columns.
  • the application of a solution to at least one stop of a solution on at least one hydrophilic area can be carried out as described above.
  • the solution is applied to more than one hydrophilic area of the patterned surface, preferably to more than 5, 10, 20, 50, 100 or 500 hydrophilic areas, more preferably all hydrophilic areas.
  • the solution is applied to at least 5, 10, 15, 20, 30, 50 or 75% of the hydrophilic areas, more preferably to 100% of the hydrophilic areas.
  • the solutions are applied manually to the patterned surfaces to produce drops of the solutions.
  • a solution can be applied, which already contains the corresponding reactant.
  • the appropriate reactant may be in dry form, which solubilizes the microarray by applying a suitable solvent to form the droplets of a solution containing a reactant.
  • a microarray it is possible to carry out chemical synthesis in a microarray according to steps (1) and (2) of the method of the present invention and drying the resulting microarray comprising reaction products of the first and second reactants on the hydrophilic regions to form dry residues of the resulting reaction products on the hydrophilic regions of the microarray.
  • Drops of a suitable solvent can be applied to such a dried microarray as described above in order to obtain again a microarray carrying on at least one hydrophilic area a drop of a solution comprising a reactant.
  • the method for treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray of the present invention further comprises a step (2) of adding a second reactant to at least one hydrophilic region of the first microarray containing a first reactant under conditions including Allow reacting the first and second reactants.
  • the manner of adding the second reactants is not further limited here.
  • the drops of the solution of the first reactant may be dried to form a dried residue of the first reactant, and a solution containing a second reactant may be applied to the spots with the dried residues as described above.
  • the addition of a second reactant to at least one hydrophilic region of the first microarray, which contains a first reactant takes place by means of sandwiching the first microarray with a second microarray.
  • the step (2) of the method of the present invention comprises the following steps:
  • the first and second microarrays have the same number of hydrophilic areas on the surface. More preferably, in each case the same number of T ropfen arranged on the surface of the first and the second microarray. More preferably, the one or more droplets are disposed on the surfaces of the first and second microarrays in a complementary arrangement.
  • a complementary arrangement in the sense of the present invention means that when the first and the second microarray are arranged one above the other, so that the droplets are arranged on the surfaces of the first and second microarrays between the substrates of the first and second microarrays, one drop at a time on the surface of the first microarray faces a drop on the surface of the second microarray.
  • step (2ii) of contacting the droplets of the first microarray with a respective stopper of the second microarray the corresponding two droplets can join and the solutions of the droplets of the first and second reactants can mix.
  • the first and second reactants are no longer separated, but together in a mixed solution.
  • the contacting of the drops on the surface of the first and second microarrays is not particularly limited.
  • the droplets of the first and second microarrays are brought into contact by a microarray is arranged pass match with respect to the other microarray, so that each drop on the surface of the first microarray each face a T ropfen on the surface of the second microarray and the microarray each other to be moved until the respective drops touch and connect with each other (sandwiched).
  • the connected drops are hereby arranged between the patterned surfaces of the first and the second microarray.
  • Such an arrangement is also called a stacked microarray or as Called microarray sandwich.
  • a second reactant to at least one hydrophilic region of the first microarray containing a first reactant occurs under conditions that allow reacting the first and second reactants.
  • These conditions are not particularly limited and may be adjusted by a person skilled in the art according to the reaction to be carried out. For example, the temperature or illumination may be adjusted to allow for the reaction of the first and second reactants.
  • a microarray By adding a second reactant to at least one hydrophilic region of the first microarray containing a first reactant under conditions permitting reaction of the first and second reactants, a microarray is obtained having on at least one hydrophilic region a reaction product of the first and second reactants comprising second reactants. In this case, preferably only one type of reaction product is present on each hydrophilic area.
  • the first and second reactants of the process of the present invention are not particularly limited and can be appropriately selected by one skilled in the art based on the chemical synthesis product to be obtained, as long as the first and second reactants either spontaneously or by activation, for example by a temperature change or illumination, for example ultraviolet light or in the presence of a catalyst.
  • the first reactant and / or the second reactant may comprise a mixture of two or more mutually inert reactants.
  • Reactants which are inert to one another in the context of the present invention are reactants which are under normal conditions and do not react with each other under conditions that allow reacting the first and second reactants.
  • the first solution contains a mixture of two reactants that do not react with each other, so are inert to each other.
  • a reaction product can be obtained which in turn can react with the other reactant of the first solution.
  • the first and / or the second reactants are precursors of biologically active substances. This means that after successful implementation of the first and second reactants, biologically active compounds are obtained. More preferably, the first and second reactants are precursor compounds of cell-permeable substances.
  • the first or the second reactants are covalently bound to the hydrophilic regions of the microarrays.
  • the first reactants include thiolactones and pyridyl disulfides and the second reactants include amines.
  • Other suitable reactants are, for example, amino acids and nucleotides.
  • the first microarray carries a drop on more than one hydrophilic area. If the first microarray comprises more than one drop, it is preferred that at least two droplets each have a different first reactant.
  • the drops are arranged on the hydrophilic areas of the surface of the first and second microarrays in a regular pattern, for example in rows and columns. When the droplets are arranged in rows and columns, it is preferred that within a row or within a column, the droplets contain the same solution with the same reactants. Furthermore, it is preferred that if the droplets on the surface of the first microarray contain the same solution within a row, the droplets within a column on the surface of the second microarray contain the same solution.
  • a matrix of reactant mixtures can be obtained in which only the first or the second reactant changes within a row and within a column.
  • a library of structurally related compounds can thus be obtained.
  • the solutions of the first and / or second reactants comprise organic solvents.
  • Suitable organic solvents are, for example, ethylene glycol, N, N-dimethylformamide, cyclohexanol, N-hexadecane, dichloromethane, acetone, 1-butanol, ethyl acetate, ethanol, n-hexane, toluene, methanol, tetrahydrofuran and dimethyl sulfoxide.
  • the method according to the invention for treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray further comprises a step (2iii) of separating the two microarrays until the droplets on the surface of the first and the second microarray no longer contact each other Step (2ii) and before the step (3) is executed.
  • the separation of the two microarrays takes place in a direction which is opposite to the direction of the contacting. More preferably, the separation of the two microarrays takes place in a direction which is perpendicular to the surface of at least one of the two microarrays.
  • the reaction of the first and second reactants allow, were in contact, in the corresponding separate drops on the hydrophilic areas of the surface of the first and the second microarray, a reaction product of the first and second reactants before.
  • the method for treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray further comprises the step (3) of contacting at least one cell with a hydrophilic region of the microarray, the hydrophilic region being a reaction product of the first and second reactants as chemical Synthesis product includes.
  • the contact of at least one cell with a hydrophilic region of the microarray comprising a reaction product of the first and second reactants is not particularly limited.
  • contacting at least one cell with a hydrophilic region of the microarray comprises a reaction product of the first and second reactants as chemical
  • Synthesis product includes the following steps:
  • Synthesis product includes.
  • the microarray in step (3i) has the same number and the same arrangement of droplets of a cell suspension, such as drops on the surfaces of the first and / or the second microarray.
  • each plug may comprise a suspension of the same type of cells, or different tubes may comprise different cell suspensions.
  • the provision of a microarray of a cell suspension is analogous to the method described above for the provision of microarrays, for example by applying a cell suspension by rolling droplet or standing droplet on a HSTL microarray.
  • the hydrophilic region comprising a reaction product of the first and second reactants as chemical synthesis product, as described above for the first and second microarray.
  • contacting at least one cell with a hydrophilic region of the microarray comprising a reaction product of the first and second reactants as a chemical synthesis product comprises the steps of:
  • the microarray carrying on at least one hydrophilic area a rupture of a solution comprising a reaction product of the first and second reactants as a chemical synthesis product, can be dried to obtain a microarray on whose hydrophilic spots dried residues of the reaction products of the first and second reactants are arranged.
  • each spot comprises only one type of reaction product.
  • This dried microarray is then overlaid with a cell suspension and excess suspension removed, for example by tilting the suspension. As a result, drops of the cell suspension form on the spots of the dried microarray.
  • the dried residues of the reaction products can dissolve in the suspension drops and thus are in contact with the cells of the cell suspension.
  • the reaction products are fixed on the spots of the dried microarray before the cell suspension is applied.
  • This fixing can be done, for example, by applying a coating, for example a polymer or viscous compound, to the individual spots.
  • the coating is preferably soluble in the cell suspension. More preferably, the coating is not biologically active. In a further preferred embodiment, the coating is gelatin.
  • the method according to the invention is not restricted to specific cell types. Suitable cell types include prokaryotic cells such as bacteria and archaea, as well as eukaryotic cells such as yeast cells (such as Saccharomyces, eg, Saccharomyces cerevisiae), insect cells (eg, Drosophila melanogaster), plant cells, and mammalian cells (eg, HEK 293, HeLa, CHO, hematopoietic stem and progenitor cells ), wherein the mammalian cells also include human primary cells and cell lines.
  • yeast cells such as Saccharomyces, eg, Saccharomyces cerevisiae
  • insect cells eg, Drosophila melanogaster
  • plant cells eg, HEK 293, HeLa, CHO, hematopoietic stem and progenitor cells
  • mammalian cells eg, HEK 293, HeLa, CHO, hematopoietic stem and progenitor cells
  • the reaction product of the first and second reactants is biologically active.
  • biologically active one describes generally materials, which are able to influence a biological system.
  • biologically active substances are, for example, pharmaceutically active Compounds, hormones or antibiotics.
  • DNA or RNA strands may be said to be biologically active if they are capable of affecting a biological system.
  • plasmids, siRNAs or microRNAs are biologically active DNA and RNA strands.
  • the reaction product of the first and second reactants is cell permeable.
  • Cell permeable means that the reaction products of the first and second reactants can diffuse through a cell membrane or can be actively transported by a cell through the membrane.
  • the first reactant and / or the second reactant comprise a nucleotide strand or the reaction product of the first and second reactants is bound to a nucleotide strand or complexed with a nucleotide strand.
  • This embodiment comprises, on the one hand, the possibility that the first and / or the second reactant is a nucleotide strand which can react with the other reactant to form a modified nucleotide strand.
  • the original nucleotide strand may in this case be a naturally occurring nucleotide strand, for example a DNA strand, an RNA strand or a plasmid, or it may be an artificial nucleotide strand.
  • An artificial nucleotide strand in the context of the present invention describes both a nucleotide strand which has been synthesized and naturally occurring nucleotide strands which have been chemically or biologically modified.
  • the reaction product of the first and second reactants is chemically bound in a further step to a nucleotide strand or complexed with a nucleotide strand.
  • Complexing here includes both noncovalent binding, for example, by electrostatic interactions, as well as the physical entrapment of a nucleotide strand within a structure formed by the reaction product of the first and second reactants.
  • the at least one cell is transformed or transfected with the reaction product of the first and second reactants.
  • T ransformation or transfection generally means the introduction of free DNA or RNA into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • cells can be influenced in their metabolic activity or cells can be modified so that they can produce certain compounds, such as dyes themselves.
  • the method for treating at least one cell with a chemical synthesis product in a microarray of the present invention comprises the following step (4):
  • the step of examining the biological activity of the reaction products of the first and second reactants is preferably carried out using the microarray.
  • cells contacted with the reaction products in step (3) may be stained for health and analyzed photometrically or, if the cells have been transformed or transfected, the cells may be based on the engrafted DNA or RNA are examined.
  • cells transformed with a plasmid that mediates the expression of a particular dye or antibiotic resistance gene may be screened for their antibiotic resistance or their dye expressivity.
  • the present invention further relates to a stacked microarray in which two microarrays are arranged so as to face the surfaces which have hydrophilic regions enclosed by hydrophobic regions and at least one droplet on a hydrophilic region of the first microarray with one droplet be in contact on a hydrophilic area of the second microarray.
  • the present invention relates to a kit comprising at least one microarray comprising dried residues of a reactant or nucleotide strand.
  • standardized reactant or nucleotide libraries can be prepared and preserved, which are dissolved prior to their use by applying a suitable solvent to the hydrophilic regions of the microarray to form a microarray.
  • the kit of the present invention serves to easily provide a standardized test scenario.
  • the present invention also relates to the use of a microarray for the chemical synthesis of a chemical synthesis product and for the treatment of at least one cell with the chemical synthesis product in a microarray.
  • FIG. 1 Exemplary Production of an HSTL Microarray
  • A The photoinitiated copolymerization of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA, (1)) and ethylene dimethacrylate (EDMA, (2)) results in the formation of a highly hydrophilic porous polymer layer.
  • B After the esterification of the polymer with 4-pentynoic acid, the site-selective, photochemical functionalization with perfluorodecanethiol (PFDT, hydrophobic component) and mercaptoethanol (hydrophilic component) can form superhydrophilic spots (hatched) are delimited by superhydrophobic barriers (dotted).
  • PFDT perfluorodecanethiol
  • mercaptoethanol hydrophilic component
  • FIG. 2 Exemplary production of an LSTL microarray. By silanizing a glass substrate, this is modified with vinyl groups. In a photochemical thiol-ene reaction, the surface can be patterned with perfluorodecanethiol (PFDT, hydrophobic component) and cysteamine hydrochloride (hydrophilic component). This results in superhydrophilic spots (hatched) separated by superhydrophobic boundaries (dotted).
  • PFDT perfluorodecanethiol
  • cysteamine hydrochloride hydrochloride
  • Figure 3 Reactants used for lipidide synthesis
  • A Precursor compounds used to synthesize the lipidoid library on a microarray.
  • B Synthesis conditions in the microarray: the reaction is carried out at room temperature in DMSO as solvent and is complete after 2 hours.
  • FIG. 4 Arrangement of the first and second reactants in a stacked microarray.
  • the largest possible product structural framework can be generated (here 80 different lipidides (L )).
  • FIG. 5 Formation of lipoplexes as transfection reagent. After completion of lipidoid synthesis, liposomes spontaneously form in aqueous solutions due to hydrophobic interaction. Electrostatic interactions cause the positively (+) charged head groups of the lipidides to complex negative (-) charged DNA. The resulting lipoplexes can be used as potential transfection reagents.
  • FIG. 6 Results of the reverse transfection. From the individual spots at 10x magnification each one shot was created from the ImageJ using the average gray value was determined. At the same time, this value represents the relative transfection efficiency of the respective lipidide the same parameters, they can be compared with each other. After standardization of the values, a heat map could be generated in which both values (lipoplex and gelatin microarray) were taken into account.
  • Example 1 Preparation of HSTL and LSTL microarrays
  • HSTL microarray slides (Schröder special glass, Ellerau, Germany) of size 76x26 mm were used as substrates.
  • the substrates were first activated for 1 hour in 1 M NaOH and then for 30 minutes in 1 M HCl, washed with distilled water and dried with compressed air.
  • a solution of 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate in ethanol (20 vol%) was applied to a substrate and the substrate was covered with another substrate. After 30 minutes, the substrates were separated, another 30 pL of 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate applied, and the substrates paired for a further 30 minutes.
  • the modified substrate was washed with ethanol and dried with compressed air.
  • a fluorinated substrate On a fluorinated substrate, 30 pL of the polymerization solution was applied and the substrate was paired with a modified substrate. The superimposed substrates (fluorinated substrate below) were irradiated for 15 minutes with UV light of wavelength 260 nm (intensity: 5.0 mW cm -2 ). Subsequently, the substrates were separated, the polymerized substrate washed with ethanol and dried with compressed air. For surface enlargement, the polymer surface was roughened. For this purpose, adhesive tape (Tesa, Norderstedt, Germany) was glued over the entire polymer and this jerky removed again. The substrate was ethanol washed, dried with compressed air and stored for several hours in ethanol.
  • adhesive tape Tesa, Norderstedt, Germany
  • the substrate was irradiated for 2 minutes with UV light of wavelength 260 nm (intensity: 5.0 mW cm -2 ).
  • the substrate was washed with ethanol, dried with compressed air and stored in ethanol until use as HSTL microarray.
  • LSTL microarrays slides (Schröder special glass, Ellerau, Germany) of size 76x26 mm were used as substrates.
  • two glass substrates were immersed in a solution of 50 mL dichloromethane (DOM), 0.8 mL triethylamine (1.6% by volume) and 50 mg 4- (dimethylamino) pyridine (DMAP; 1 mg mL 1 ). Then, 0. 2 mL of chloro (dimethyl) vinylsilane (0.4 vol%) was added and the solution was stirred for 2 minutes at room temperature. The substrates were washed with ethanol and dried with compressed air.
  • DOM dichloromethane
  • DMAP 4- (dimethylamino) pyridine
  • a solution of ethanol / HbO (1: 1) and cysteamine hydrochloride (10% by weight) were applied and the substrate was covered with a quartz glass (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, USA). Subsequently, the substrate was irradiated for 2 minutes with UV light of wavelength 260 nm (intensity: 5.0 mW cm 2 ). The substrate was washed with ethanol, dried with compressed air and stored in ethanol until use as LSTL microarray.
  • a primary or secondary amine 5 induces the reaction by the nucleophilic ring opening of a thiolactone derivative 4, which in turn can undergo a disulfide exchange with a pyridyl disulfide derivative 3.
  • the main product is the lipidoid 6 obtained as a by-product, the yellow 2-thiopyridone (7).
  • the reaction success can be followed by the liberated thiopyridone 7.
  • various lipidides can be obtained. For example, the reactants shown in FIG. 3 were used for lipidoid synthesis in microarrays.
  • pyridyl disulfide derivatives 3 and the thiolactone derivatives 4 can be present unreactively side by side in solution (mutually inert reactants)
  • mixtures of one pyridyl disulfide derivative 3 and one thiolactone derivative 4 are applied to a first microarray and solutions of amines are applied to a second microarray 5th
  • the solutions were applied by means of the "rolling droplet” method.
  • a drop of a solution containing the desired reactant (s) over certain areas of the patterned surface of the microarrays was moved by means of a pipette.
  • different mixtures of the pyridyl disulfide derivatives 3 and thiolactone derivatives 4 or amines 5 can be applied in rows or columns.
  • Solution 1 1, 67 mg rnL -1 thiolactone derivative 4 and 1, 75 mg mL _1 pyridyl disulfide derivative 3 in DMSO
  • FIG. 4 shows a stacked microarray in which the amines 5 used vary in columns and different mixtures of pyridyl disulfide derivatives 3 and the thiolactone derivatives 4 were applied line by line. For each combination of the first and second reactants, a get different lipidoid. Subsequently, the two microarrays were separated and confirmed the formation of lipidides by matrix-assisted laser desorption / ionization with time-of-flight analysis (MALDI-TOF).
  • MALDI-TOF time-of-flight analysis
  • the lipidides obtained were transferred to a MALDI plate by stamping one of the separated microarrays and dried under reduced pressure.
  • the matrix used was a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (a-CHCA).
  • a-CHCA (10 mg mL 1 ) was dissolved in an acetonitrile-water mixture (1: 1, v / v) and mixed with 0.1% trifluoroacetic acid.
  • acetonitrile-water mixture (1: 1, v / v
  • trifluoroacetic acid 0.1% trifluoroacetic acid
  • the analysis was carried out by means of a MALDI TOF / TOF 4800 mass spectrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in the positive ion reflector mode in a mass range of 600-1000 Da.
  • the laser intensity was initially set to 3000 and then readjusted to obtain optimal signals.
  • the data was evaluated by the software Data Explorer Software 4.0 (Applied Biosystems). Samples were spotted on a Sciex Opti-TOF 384 well MALDI plate (123x81 mm).
  • the formed lipidides could be detected in this way on both separate microarrays.
  • Example 2 For the formation of liposomes from the lipidides of Example 2, a microarray of Example 2 containing the reaction products of the first and second reactants was dried under reduced pressure to obtain a dried lipidoid library, each hydrophilic spot of the microarray being one contains dried lipidoid.
  • This dried lipid library was overlaid and contacted with a microarray carrying on its surface drops of sodium acetate buffer solution (200 mM, pH 5).
  • This microarray was prepared by overlaying an HSTL microarray with the sodium acetate buffer solution and dumping excess solution sideways from the microarray ("standing droplet" method).
  • the stacked microarray was incubated for 2 hours at 50 ° C on a heating block. In this way liposomes of the respective lipidides could be formed in the individual drops.
  • the HSTL microarray which has drops of the solutions of the formed liposomes in sodium acetate buffer on its surface, was used for the further steps.
  • the successful formation of the liposomes was demonstrated by nanotracking analysis (NanoSight LM10-HS system, Malvern Instruments), dynamic light scattering (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments) and zeta potential analysis (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments).
  • lipoplexes For the formation of lipoplexes, another HSTL microarray was prepared, on the surface of which was plunged a solution of the plasmid pCS2-GFP (7.50 ng pL 1 ) in sodium phosphate buffer (33 mM, pH 5).
  • the plasmid pCS2-GFP encodes the green fluorescent protein GFP.
  • the droplets on the surface of the microarray containing the liposomes formed were contacted with the droplets on the surface of the microarray containing the plasmid solution. Due to the positive charges on the surface of the liposomes, the negatively charged plasmid DNA attaches to the liposomes to form lipoplexes.
  • the formation of lipoplexes starting from the lipidides of Example 2 is shown in FIG.
  • Example 4 Study of the transfection efficiency of different
  • a cell microarray comprising HEK293T cells was provided.
  • HEK293T cells were seeded on a gelatin-coated HSTL microarray and incubated for 3 hours at 38 ° C and 5% CO 2 content until the onset of adhesion.
  • the sowing of the cells was carried out by means of standing droplet method.
  • a large cell suspension T ropfen was formed on the microarray, which extends over all spots of the microarray. This drop was allowed to stand for 30 seconds to allow some cells to settle out of the cell suspension on the surface of the microarray.
  • the microarray was then tilted sideways to roll the large drop off the microarray, forming small microdroplets on the microarray.
  • the cells can be transfected by superimposing the cell microarray with the lipoplex microarray obtained in Example 3 for 15 minutes at 38 ° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the expression of GFP could be evaluated by fluorescence microscopy.
  • micrographs were taken at a wavelength of 505 nm with a Keyence BZ-9000E fluorescence microscope (Keyence, Osaka, Japan) (objectives: PlanApo 2x 0.10 / 8.5 mm and PlanApo 10x 0.45 / 4.00 mm, resolution: 8 bit; Format: 1360x1024 pixels).
  • the images were analyzed using the accompanying software BZ II Analyzer and ImageJ (National Institute of Health, USA, 1.51 n). The individual images were examined for their mean fluorescence intensity.
  • Example 1 As an alternative transfection method, reverse transfection of HEK293T cells was investigated by means of microarrays. In contrast to that in Example 3 and 4 described T rans Stammionsmethode can be dispensed with in the reverse T ransfetation on the intermediate step of the formation of liposomes. Rather, the lipidides synthesized in Example 1 are converted directly into lipoplexes.
  • a solution of 0.1 M sucrose, 0.04% (w / v) gelatin, 0.002% (w / v) fibronectin and 7.5 ng / pL pCS2-GFP in sodium acetate buffer (on an HSTL microarray) was used ( 50 mM, pH 5).
  • Sandwiching with the LSTL-lipidoid microarray from Example 1 on the one hand transferred the lipidides to an HSTL microarray and, on the other hand, also reacted directly to lipoplexes.
  • the formation of liposomes and subsequent complexing with plasmid DNA to lipoplexes takes place in a single step.
  • the combined microarrays were heated on a heating block for 1.5 hours at 50.degree.
  • the obtained lipoplexes were dried for three days under reduced pressure on the microarray.
  • the cells were seeded directly onto the microarray of the dried lipoplexes by the standing droplet method as described above.
  • the suspension droplet of the cell suspension 60 c 10 4 cells / ml was left on the microarray for 5 seconds before it was tilted.
  • FIG. 6 shows a heat map which correlates the fluorescence intensity of the individual spots with the transfection efficiency.
  • Microarrays can be used as a platform for combinatorial solid phase synthesis.
  • a microarray was used whose hydrophilic areas (round, 3 mm diameter) are functionalized with cysteamine. The hydrophilic areas were treated with hydroxyethyl photolinker Functionalized (HEPL).
  • HEPL hydroxyethyl photolinker Functionalized
  • 1350 pL of a 0.06 M HERL solution in DMF were mixed with 135 pL of diisopropylcarbodiimide (DIC), 120 mg of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) and 1215 pL of DMF.
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the microarray was washed with acetone and dried in a stream of nitrogen.
  • the amino groups of the cysteamide which did not react with the HERL were protected with a 10% solution of pyridine in acetic anhydride. For this purpose, 10 pL of the solution were applied to each spot, washed off with acetone after 30 minutes and dried in a stream of nitrogen.
  • doxorubicin was bound to the HERL.
  • 4-formylbenzoic acid was first bound to the HERL as a spacer by applying a solution of 20 mg of 4-formylbenzoic acid and 10 mg of 4- (dimethylamino) pyridine (DMAP) in 1 mL DMF and 100 ⁇ L DIC to the individual spots ( 10 pL per spot) and incubated for 48 hours.
  • DMAP dimethylamino) pyridine
  • 10 pL each of a solution of 10 mg doxorubicin in 1 L DMSO and 1 pL triethylamine were applied to the individual spots, incubated in the dark for 72 hours, washed with acetone and dried in a stream of nitrogen.
  • the individual spots were covered with gelatin and then cells were seeded.
  • a solution of 0.066 g of bovine hide gelatin in 3 mL of sterile DMEM medium (10% FCS and 1% Pen / Strep) was applied to the microarray by rolling droplet method, incubated for 1 hour at 37 ° C and then dried in air. Thereafter, a suspension of HeLa cells (0.25 c 10 6 cells per mL) was applied to the individual spots by rolling droplet method.
  • the gelatin solution and the cell suspension were also applied to control spots that were not modified with doxorubicin.
  • microarray Individual spots of the microarray were irradiated with UV light (365 nm, 4 mW / cm 2 , 15 min). irradiated to cleave the HEPL and release the doxorubicin, the microarray was then incubated for 48 hours at 37 ° C and stained with CalceinAM / propidium iodide.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray, ein gestapeltes Microarray, ein Kit, umfassend mindestens ein Microarray und die Verwendung eines Microarrays für die chemische Synthese eines chemischen Syntheseproduktes und für die Behandlung von mindestens einer Zelle mit dem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray.

Description

Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray, ein gestapeltes Microarray, ein Kit, umfassend mindestens ein Microarray und die Verwendung eines Microarrays für die chemische Synthese eines chemischen Syntheseproduktes und für die Behandlung von mindestens einer Zelle mit dem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray.
Bei der Entwicklung biologisch aktiver Wirkstoffe müssen multidisziplinäre Herausforderungen im Umfeld der chemischen Biologie gemeistert werden. Der erste Schritt ist hierbei das Auffinden einer chemischen Struktur, die im biologischen Rahmen wechselwirkt. Gelingt es, eine solche Leitstruktur zu identifizieren, muss diese für die weitere Wirkstoffentwicklung meist noch optimiert werden, da sie in vielen Fällen noch nicht selektiv auf das biologische Ziel wirkt.
Eine Möglichkeit eine solche Optimierung durchzuführen ist mittels Diversitäts- orientierter Synthese (DOS) kombinatorisch zahlreiche unterschiedlich funktionalisierte Moleküle herzustellen und diese dann in Hochdurchsatz- Screenings auf ihre biologische Aktivität zu analysieren. Die kombinatorische Synthese von Molekülen ermöglicht sowohl eine große Flexibilität im chemischen Strukturrahmen als auch die Möglichkeit zur parallelen Synthese von sehr großen Bibliotheken. Allerdings ist die Bulk-Synthese meist mit großem Reagenzien-, Material- und Arbeitszeit-Bedarf verbunden. Bisweilen existieren noch keine effizienten Systeme, die in miniaturisierter Form - wie zum Beispiel im Microarray- Format - eine Synthese in flüssiger Phase ermöglichen. Des Weiteren ist im Falle von biologisch aktiven Verbindungen die chemische Synthese immer von der biologischen Anwendung getrennt, was das Screening großer Bibliotheken nochmals deutlich zeitaufwendiger und dadurch auch kostenintensiver macht. Dem stetig steigenden Bedarf an neuen Wirkstoffen kann die pharmazeutische und biotechnologische Forschung und Entwicklung nicht mehr gerecht werden: Für die Entwicklung und das Marketing eines einzelnen Medikaments muss mit hohen Investitionen gerechnet werden, wodurch das gesamte Unterfangen häufig finanziell schlicht nicht lohnenswert ist. Daher wird es zunehmend wichtiger neue, effizientere und günstigere Verfahren zur Erforschung neuer biologisch aktiver Verbindungen zu entwickeln.
Herkömmlicherweise werden Festphasen-gebundene Systeme zur Synthese von Molekülen in Microarrays verwendet. Obwohl die Technik der Festphasen- Microarrays bereits etabliert ist, weißt sie doch deutliche Einschränkungen auf. So beschränkt sich die Chemie in Festphasen-Microarrays auf simple Oberflächensynthesen, während in klassischer Flüssigphasen-Chemie die gesamte Bandbreite komplexer Reaktionsmechanismen zur Verfügung steht. Viele Reaktionen können aus technischen, physikalischen und chemischen Gründen in Festphasen-Microarrays schlicht nicht durchgeführt werden. Durch die Immobilisierung an der Oberfläche werden zusätzliche Reaktionsschritte benötigt, die in Flüssigphase nicht notwendig wären, außerdem werden zusätzliche funktionelle Gruppen an den Zielverbindungen benötigt, um diese überhaupt erst an die feste Phase binden zu können.
Diese Bindung an die feste Phase beeinflusst wiederum die chemische Umgebung und dadurch auch die chemischen Eigenschaften der Zielverbindung, wodurch Reaktionen anders, schlimmstenfalls sogar überhaupt nicht ablaufen. Auch die Analysemethoden sind in der Festphasen-gebundenen Chemie stark eingeschränkt: Häufig müssen Verbindungen auf dem Weg zum Zielmolekül erst von der festen Phase abgespalten werden, um sie dann anschließend mit klassischen Methoden überhaupt analysieren zu können; auch hierfür werden wieder zusätzliche (Reaktions)-Schritte, Reagenzien und Arbeitszeit benötigt. Zu beachten ist, dass bei jeder zusätzlichen Reaktion mit einem Ausbeuteverlust zu rechnen ist, da kaum eine Reaktion vollständig effizient abläuft. Die absolute Produktausbeute in Festphasen-gebundenen Synthesen fällt immer geringer aus als in flüssiger Phase. Die vermutlich entscheidendste Einschränkung von Festphasen-Microarrays ist allerdings die Wahl der Lösungsmittel. Aufgrund der geringen Oberflächenspannung der meisten organischen Lösungsmittel, können diese nicht auf herkömmlichen Glas-basierten Microarrays durchgeführt werden, da die Spots bereits bei geringen Volumina ineinander verlaufen und somit zu Kreuzkontaminationen führen würden. Vor allem bei biologischen Anwendungen führen diese Kreuzkontaminationen zu Komplikationen. Bei klassischen Microarrays müssen die Spots daher einen Abstand von mindesten 1 mm aufweisen, wodurch die Systeme in ihrer Fähigkeit zur Miniaturisierung stark eingeschränkt sind.
Die Verbindung der chemischen Synthese mit biologischen Anwendungen in einem System wurde bisher nur in einer Art Array in Mikrotiterplatten (MTP) durchgeführt. Hier befinden sich auf einer Platte viele Vertiefungen (wells), die klar definiert und räumlich jeweils von den anderen abgegrenzt sind. Allerdings werden hier noch immer große Mengen teurer Reagenzien und Zellen benötigt (pro well in 96-well MTP ~ 100pL Lösung / Suspension), und das Verfahren ist zusätzlich sehr zeitaufwendig. Eine Automatisierung ist zwar möglich, allerdings wird hierfür teure Robotik und extrem viel Verbrauchsmaterial benötigt (z.B. beginnend von der Synthese bis zur Transfektion von Zellen in 96-well MTP werden ca. 800 Pipettenspitzen benötigt). Zusätzlich ist die Miniaturisierung im MTP-Format (standardisiert) aufgrund der physikalischen Grenzen ebenfalls eingeschränkt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray bereitzustellen, das die vorstehend aufgeführten Nachteile bekannter Array-basierter Methoden überkommt und insbesondere die folgenden Vorteile aufweist:
- Verwendung geringer Proben- bzw. Reaktionsvolumina;
- Durchführung chemischer Synthese in Lösungen;
- Möglichkeit durch kombinatorische Synthese Molekülbibliotheken zu erstellen; - Verzicht auf teure Robotik und Drucktechniken; und
- Direkte Integration der biologischen Anwendung.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray bereit, das die folgenden Schritte umfasst:
(1 ) Bereitstellen eines ersten Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist, und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer ersten Lösung trägt, die einen ersten Reaktanden umfasst;
(2) Zugeben eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält, unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen; und
(3) In Kontakt bringen von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt des ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst.
Unter einem Microarray im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man ein festes Substrat mit einer gemusterten Oberflächenschicht, die hydrophile Bereiche, so genannte Spots, umfasst, die jeweils von hydrophoben Bereichen (hydrophobe Grenzen) umschlossen sind, auf mindestens einer Oberfläche des Microarrays. Die Oberflächenschicht kann hierbei beispielsweise in Form einer Folie, eines Films oder einer Beschichtung vorliegen. Das Substrat ist hierbei nicht sonderlich eingeschränkt und kann jedes Substrat sein, das vorzugsweise in einem Temperaturbereich von -30°C bis 130°C, weiter bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C und am meisten bevorzugt bei Raumtemperatur fest ist. Das feste Substrat kann beispielsweise ausgewählt werden aus Glas, Metall, beispielsweise Edelstahl oder Aluminiumfolie, Kunststoff, Beton oder Holz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das feste Substrat transparent, wobei ein Glas Substrat bevorzugt ist. Das feste Substrat hat vorzugsweise eine flache Oberfläche.
Die hydrophilen Bereiche eines Microarrays sind in ihrer Form nicht sonderlich eingeschränkt und können kreisförmig, sternförmig oder polygonal (dreieckig, rechteckig, fünfeckig, sechseckig, ...) sein. Hydrophile Bereiche mit einer dreieckigen oder rechteckigen Form erlauben eine enge Anordnung der hydrophilen Bereiche auf dem Substrat. Nichtsdestotrotz ist ein Microarray im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht auf eine bestimmte Anordnung der hydrophilen Bereiche beschränkt und stellt einen umfassenden Ansatz zur Erzeugung von definierten Anordnungen von einzelnen Tropfen mit gleichem Volumen auf der Oberfläche eines Substrates dar.
Die hydrophilen Bereiche können beispielsweise dreieckig oder rechteckig sein mit einer Seitenlänge von 5 mm oder weniger, 3 mm oder weniger, 1 mm oder weniger oder 500 pm oder weniger. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die hydrophilen Bereiche rund mit einem Durchmesser von 5 mm oder weniger, mehr bevorzugt 3 mm oder weniger, noch mehr bevorzugt 1 mm oder weniger. Die hydrophoben Bereiche, welche die hydrophilen Bereiche umschließen, haben vorzugsweise eine Breite von 1 mm oder weniger, mehr bevorzugt 0,5 mm oder weniger und am meisten bevorzugt 0,1 mm oder weniger.
Des Weiteren ist die Dicke der gemusterten Oberflächenschicht nicht beschränkt. Im Hinblick auf T ransparenzeigenschaften und Reduzierung der Herstellungskosten ist die gemusterte Oberfläche vorzugsweise dünn. Insbesondere ist eine Dicke von 45 pm oder weniger bevorzugt, weiter bevorzugt 30 pm oder weniger und am meisten bevorzugt 15 pm oder weniger.
Im Allgemeinen können Oberflächen in Abhängigkeit ihres Kontaktwinkels mit Wasser als hydrophil oder hydrophob eingestuft werden. Eine Oberfläche mit einem statischen Kontaktwinkel von mindestens 90 wird hierbei als hydrophob bezeichnet, während eine Oberfläche mit einem statischen Kontaktwinkel von weniger als 90° als hydrophil bezeichnet wird. Es wird regelmäßig zwischen zwei verschiedenen Kontaktwinkeln unterschieden: einem statischen und einem dynamischen Kontaktwinkel. Statische Kontaktwinkel (0stat) werden bestimmt, indem ein Tropfen auf eine Oberfläche gegeben wird und der Kontaktwinkel des in Ruhe aufliegenden T ropfens mit der Oberfläche mit einem Goniometer oder einer Kamera mit spezieller Software gemessen wird (sessile drop Messung). Dynamische Kontaktwinkel hingegen stellen Kontaktwinkel außerhalb eines Gleichgewichtszustandes dar und werden während des Fortschreitens (0adv) oder Rückzugs (Orec) eines Tropfens gemessen. Der Unterschied zwischen 0a v und 0rec wird als Kontaktwinkelhysterese bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben hydrophobe Bereiche einen statischen Wasser-Kontaktwinkel von mindestens 90°, bevorzugt mehr als 95°, weiter bevorzugt mehr als 100° und am meisten bevorzugt mehr als 110°.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die hydrophoben Bereiche eines Chips superhydrophob und/oder sind die hydrophilen Bereiche superhydrophil. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben superhydrophobe Bereiche einen statischen Wasser-Kontaktwinkel von mehr als 130°, bevorzugt mehr als 140° und noch mehr bevorzugt mehr als 150°. Weiter haben superhydrophile Bereiche bevorzugt einen Wasser-Kontaktwinkel von weniger als 30°, mehr bevorzugt weniger als 20° und am meisten bevorzugt weniger als 10°.
Auf Grund seiner speziellen Oberflächenmusterung ist ein Microarray der vorliegenden Erfindung in der Lage auf dieser gemusterten Oberfläche mindestens einen Tropfen einer Lösung zu tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Microarray dazu geeignet mindestens 1 Tropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche zu tragen, mehr bevorzugt mindestens 4 Tropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche, noch mehr bevorzugt mindestens 8 T ropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche und am meisten bevorzugt mindestens 16 Tropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche. Die obere Grenze der Anzahl der T ropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche ist nicht sonderlich beschränkt und kann je nach Anforderung bestimmt werden. Im Hinblick auf eine Vereinfachung der Schritte (2) und (3) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung und zur Vermeidung einer Kreuzkontamination benachbarter Tropfen, ist es jedoch bevorzugt, dass ein Microarray höchstens 100 Tropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche trägt, mehr bevorzugt höchstens 50 T ropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche, noch mehr bevorzugt höchstens 20 Tropfen pro cm2 der gemusterten Oberfläche.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die T ropfen, die auf der gemusterten Oberfläche eines Microarrays angeordnet sind, ein Volumen von 100 pL bis 1 mL, weiter bevorzugt von 1 nL bis 100 pL, noch mehr bevorzugt von 100 nL bis 50 pL und am meisten bevorzugt von 500 nL bis 25 pL.
Die Tropfen auf der gemusterten Oberfläche des Microarrays können mit bekannten Methoden aufgetragen werden. Das Aufträgen kann beispielsweise manuell oder automatisiert erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Aufträgen manuell. Das Aufträgen kann beispielsweise mittels diskontinuierlicher Benetzung erfolgen. Besonders hervorgehoben seien hier Methoden mittels rolling droplet, Standing droplet, oder Eintauchen und Herausnehmen des Microarrays aus einer Lösung. Die Methode des Auftragens der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht sonderlich eingeschränkt und ein Fachmann kann, je nach entsprechender Zielsetzung, die am besten hierfür geeignete Methode auswählen.
Bei der rolling droplet Methode wird ein T ropfen der aufzutragenden Lösung über die gemusterte Oberfläche des Microarrays gerollt, wobei sich in den hydrophilen Bereichen spontan Mikrotropfen mit definierter Geometrie und Volumen bilden. Auf diese Weise können gezielt einzelne Bereiche des Microarrays mit T ropfen versehen werden und es ist möglich auf verschiedene hydrophile Bereiche des Microarrays Tropfen unterschiedlicher Lösungen aufzutragen.
Bei der Standing droplet Methode wird die gemusterte Oberfläche des Microarrays mit der aufzutragenden Lösung überschichtet und die überschüssige Lösung seitlich abgekippt, wobei sich in den hydrophilen Bereichen spontan Mikrotropfen mit definierter Geometrie und Volumen bilden. Die vergleichsweise einfache Durchführung der standing droplet Methode benötigt jedoch ein größeres Lösungsvolumen im Vergleich zu der rolling droplet Methode, da die gesamte gemusterte Oberfläche des Microarrays überschichtet werden muss, und alle erzeugten T ropfen enthalten die gleiche Lösung.
Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Arten von Microarrays, die sich in der Art der gemusterten Oberflächen unterscheiden und die von einem Fachmann anhand des zu verwendenden Lösungsmittels entsprechend gewählt werden können. Für wässrige Lösungsmittel mit einer hohen Oberflächenspannung (mehr als 72.2 mN nr1) werden allgemein high surface tension liquids (HSTL) Microarrays verwendet, wohingegen für organische Lösungsmittel mit einer niedrigeren Oberflächenspannung (weniger als 72.2 mN irr1) low surface tension liquids (LSTL) Microarrays verwendet werden.
Ein HSTL Microarray kann beispielsweise durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen eines Polymerisationsgemisches zwischen zwei festen Trägem;
(b) Polymerisieren des Polymerisationsgemisches, um eine poröse Polymerschicht zu bilden;
(c) Entfernen einer der beiden festen T räger; und
(d) Modifizieren der Oberfläche der porösen Polymerschicht, wodurch die gemusterte Oberfläche, die hydrophile Bereiche umfasst, die jeweils von hydrophoben Grenzen beschränkt sind, gebildet wird.
Beispielsweise kann durch photoinitiierte Copolymerisation von 2- Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) und Ethylendimethacrylat (EDMA) auf einem Glas-Substrat eine poröse Polymerschicht, die zum einen die Oberfläche stark vergrößert und zum anderen die Hydrophilie des Substrats durch die Präsentation zahlreicher Hydroxy-Gruppen stark erhöht, ausgebildet werden. Diese Hydroxy- Gruppen können im weiteren Verlauf mit 4-Pentinsäure verestert, und somit unter Verwendung einer Fotomaske mittels Thiol-Yne-Reaktion gezielt funktionalisiert werden: In einem ersten Schritt werden mit Perfluordecanthiol (PFDT) hydrophobe Grenzen und im zweiten Schritt mittels Mercaptoethanol hydrophile Spots erzeugt. Die hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften werden dabei durch die Oberflächenvergrößerung des Polymers ermöglicht.
Für die Herstellung eines LSTL Microarrays kann auf die zusätzliche Polymerisierung auf der S ubstratoberfläche verzichtet werden. Allgemein umfasst die Herstellung eines LSTL Microarrays die folgenden Schritte:
(A) Bereitstellen eines Substrats, das eine Oberfläche umfasst, die Hydroxylgruppen aufweist;
(B) In Kontakt bringen der Oberfläche, die Hydroxylgruppen aufweist, mit einem Halogen-Dialkyl-Alkenyl-Silan , um Dialkyl-Alkenyl-Silyl-Gruppen auf der Oberfläche zu bilden;
(C) Gezieltes Umsetzen der Alkenyl-Gruppen eines Teiles der Dialkyl- Alkenyl-Silyl-Gruppen mit einem hydrophoben Thiol, um hydrophobe Thioether-Gruppen zu erhalten; und
(D) Umsetzen der Alkenyl-Gruppen der übrigen Dialkyl-Alkenyl-Silyl- Gruppen mit einem hydrophilen Thiol, um hydrophile Thioether-Gruppen zu erhalten.
Beispielsweise wird eine Glasoberfläche mit Chlordimethylvinylsilan modifiziert und mit einer photochemischen Thiol-Ene-Reaktion gemustert. Zur Ausbildung der hydrophoben Grenzen wird PFDT verwendet, für die hydrophilen Bereiche kommt Cysteamin-Hydrochlorid zum Einsatz.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (1 ) ein erstes Microarray bereitgestellt, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist, und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer ersten Lösung trägt, die einen ersten Reaktanden umfasst. Microarrays können nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Anzahl und Anordnung der hydrophilen Spots ist hierbei nicht sonderlich beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl der hydrophilen Spots mindestens 1 pro cm2 der gemusterten Oberfläche des Microarrays, weiter bevorzugt mindestens 4 pro cm2 der gemusterten Oberfläche des Microarrays, noch mehr bevorzugt mindestens 8 pro cm2 der gemusterten Oberfläche des Microarrays und am meisten bevorzugt mindestens 16 pro cm2 der gemusterten Oberfläche des Microarrays. Die hydrophilen Spots sind vorzugsweise in einem regulären Muster, beispielsweise in Zeilen und Spalten, angeordnet.
Weiter kann das Aufträgen einer Lösung um mindestens einen T ropfen einer Lösung auf mindestens einem hydrophilen Bereich wie vorstehend beschrieben erfolgen. Bevorzugt wird die Lösung auf mehr als einen hydrophilen Bereich der gemusterten Oberfläche aufgetragen, bevorzugt auf mehr als 5, 10, 20, 50, 100 oder 500 hydrophile Bereiche, mehr bevorzugt auf alle hydrophilen Bereiche. Alternativ wird die Lösung auf mindestens 5, 10, 15, 20, 30, 50 oder 75% der hydrophilen Bereiche aufgetragen, mehr bevorzugt auf 100% der hydrophilen Bereiche.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Lösungen manuell auf die gemusterten Oberflächen aufgetragen, um Tropfen der Lösungen zu erzeugen.
Um einen Microarray zu erhalten, der auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen Tropfen einer Lösung eines Reaktanden trägt, kann eine Lösung aufgetragen werden, die den entsprechenden Reaktanden bereits enthält. Alternativ kann auf den hydrophilen Bereichen des Microarrays der entsprechende Reaktand in trockener Form vorliegen, der durch Aufträgen eines geeigneten Lösungsmittels auf das Microarray in Lösung geht und so die Tropfen einer Lösung, die einen Reaktanden enthält, bildet.
Es ist beispielsweise möglich eine chemische Synthese in einem Microarray gemäß den Schritten (1 ) und (2) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung durchzuführen und das so erhaltene Microarray, das Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden auf den hydrophilen Bereichen umfasst, zu trocknen, um trockene Rückstände der entstandenen Umsetzungsprodukte auf den hydrophilen Bereichen des Microarrays zu bilden. Auf ein solches getrocknetes Microarray können wie vorstehend beschrieben Tropfen eines geeigneten Lösungsmittels aufgebracht werden, um wieder ein Microarray zu erhalten, das auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen Tropfen einer Lösung trägt, die einen Reaktanden umfasst.
Das Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray der vorliegenden Erfindung umfasst weiter einen Schritt (2) des Zugebens eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält, unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen. Die Art und Weise des Zugebens der zweiten Reaktanden ist hierbei nicht weiter beschränkt. Beispielsweise können die Tropfen der Lösung des ersten Reaktanden getrocknet werden, um einen getrockneten Rückstand des ersten Reaktanden zu bilden und eine Lösung, die einen zweiten Reaktanden enthält, kann wie vorstehend beschrieben auf die Spots mit den getrockneten Rückständen aufgetragen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Zugeben eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält mittels sandwichen des ersten Microarrays mit einem zweiten Microarray. Hierbei umfasst der Schritt (2) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte:
(2i) Bereitstellen eines zweiten Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer zweiten Lösung trägt, die einen zweiten Reaktanden umfasst; und
(2ii) In Kontakt bringen der T ropfen des ersten Microarrays mit je einem T ropfen des zweiten Microarrays. Das Bereitstellen eines zweiten Microarrays erfolgt hierbei analog zu der vorstehend beschriebenen Bereitstellung des ersten Microarrays. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen das erste und das zweite Microarray die gleiche Anzahl an hydrophilen Bereichen auf der Oberfläche auf. Weiter bevorzugt ist auf der Oberfläche des ersten und des zweiten Microarrays jeweils die gleiche Anzahl von T ropfen angeordnet. Weiter bevorzugt sind die ein oder mehrere T ropfen auf den Oberflächen des ersten und des zweiten Microarrays in einer komplementären Anordnung angeordnet. Eine komplementäre Anordnung im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass, wenn das erste und das zweite Microarray übereinander angeordnet werden, so dass die T ropfen auf den Oberflächen des ersten und zweiten Microarrays zwischen den Substraten des ersten und zweiten Microarrays angeordnet sind, jeweils ein Tropfen auf der Oberfläche des ersten Microarrays einem Tropfen auf der Oberfläche des zweiten Microarrays gegenübersteht.
Durch den Schritt (2ii) des in Kontakt Bringens der Tropfen des ersten Microarrays mit je einem T ropfen des zweiten Microarrays können sich die entsprechenden zwei Tropfen verbinden und die Lösungen der T ropfen der ersten und zweiten Reaktanden können sich vermischen. Dadurch liegen die ersten und zweiten Reaktanden jetzt nicht mehr getrennt, sondern gemeinsam in einer gemischten Lösung vor.
Das in Kontakt bringen der Tropfen auf der Oberfläche des ersten und zweiten Microarrays ist nicht sonderlich beschränkt. Bevorzugt werden die T ropfen des ersten und zweiten Microarrays in Kontakt gebracht, indem ein Microarray passgleich gegenüber dem anderen Microarray angeordnet wird, so dass jeder Tropfen auf der Oberfläche des ersten Microarrays jeweils einem T ropfen auf der Oberfläche des zweiten Microarrays gegenübersteht und die Microarrays aufeinander zu bewegt werden, bis die jeweiligen Tropfen sich berühren und sich miteinander verbinden (sandwichen). Die verbundenen Tropfen sind hierbei zwischen den gemusterten Oberflächen des ersten und des zweiten Microarrays angeordnet. Eine solche Anordnung wird auch als gestapeltes Microarray oder als Microarray-Sandwich bezeichnet.
Das Zugeben eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält, erfolgt unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen. Dies beinhaltet sowohl die Möglichkeit, dass der Vorgang des in Kontakt Bringens unter Bedingungen stattfindet, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen, oder das gestapelte Microarray aus erstem und zweiten Microarray wird nach dem in Kontakt bringen der Tropfen auf der Oberfläche des ersten und zweiten Microarrays Bedingungen ausgesetzt, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen. Diese Bedingungen sind nicht sonderlich beschränkt und können von einem Fachmann gemäß der zu erfolgenden Reaktion angepasst werden. Beispielsweise kann die Temperatur oder die Beleuchtung angepasst werden, um ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden zu ermöglichen. Durch das Zugeben eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält, unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen, wird ein Microarray erhalten, das auf mindestens einem hydrophilen Bereich ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden umfasst. Hierbei liegt bevorzugt auf jedem hydrophilen Bereich nur eine Art von Umsetzungsprodukt vor.
Die ersten und zweiten Reaktanden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind nicht sonderlich eingeschränkt und können von einem Fachmann anhand des zu erhaltenden chemischen Syntheseproduktes entsprechend ausgewählt werden, solange die ersten und zweiten Reaktanden entweder spontan oder durch Aktivierung, beispielsweise durch eine Temperaturänderung oder Beleuchtung, beispielsweise mit ultraviolettem Licht, oder unter Anwesenheit eines Katalysator miteinander reagieren können. Des Weiteren kann der erste Reaktand und/oder der zweite Reaktand eine Mischung von zwei oder mehreren zueinander inerten Reaktanden umfassen. Unter zueinander inerten Reaktanden im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Reaktanden die unter Normalbedingungen und unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen, nicht miteinander reagieren.
Auf diese Weise ist es zum Beispiel möglich zwei Reaktionsschritte direkt hintereinander durchzuführen. Hierfür enthält beispielsweise die erste Lösung eine Mischung aus zwei Reaktanden, die nicht miteinander reagieren, also zueinander inert sind. Durch in Kontakt bringen dieses Reaktandengemisches mit einem zweiten Reaktanden, mit dem einer der Reaktanden der ersten Lösung reagieren kann, kann ein Umsetzungsprodukt erhalten werden, das wiederrum mit dem anderen Reaktanden der ersten Lösung reagieren kann. Auf diese Weise ist es möglich durch geschickte Syntheseplanung mehrstufige Reaktionen in einem einzigen Gemisch nacheinander ablaufen zu lassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ersten und/oder die zweiten Reaktanden Vorläuferverbindungen biologisch aktiver Stoffe. Das bedeutet, dass nach erfolgreicher Umsetzung der ersten und zweiten Reaktanden biologisch aktive Verbindungen erhalten werden. Weiter bevorzugt sind die ersten und zweiten Reaktanden Vorläuferverbindungen Zell-permeabler Stoffe.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die ersten oder die zweiten Reaktanden kovalent an die hydrophilen Bereiche der Microarrays gebunden.
Beispielsweise umfassen die ersten Reaktanden Thiolactone und Pyridyldisulfide und die zweiten Reaktanden umfassen Amine. Weitere geeignete Reaktanden sind beispielsweise Aminosäuren und Nukleotide.
In einer bevorzugten Ausführungsform trägt das erste Microarray auf mehr als einem hydrophilen Bereich einen Tropfen. Wenn das erste Microarray mehr als einen Tropfen umfasst, ist es bevorzugt, dass in mindestens zwei T ropfen jeweils ein anderer erster Reaktand vorliegt. ln einer bevorzugten Ausführungsform sind die Tropfen auf den hydrophilen Bereichen der Oberfläche des ersten und des zweiten Microarrays in einem regelmäßigen Muster, beispielsweise in Zeilen und Spalten angeordnet. Wenn die T ropfen in Zeilen und Spalten angeordnet sind, ist es bevorzugt, dass innerhalb einer Zeile oder innerhalb einer Spalte die T ropfen die gleiche Lösung mit den gleichen Reaktanden enthalten. Weiter ist es bevorzugt dass, wenn auf der Oberfläche des ersten Microarrays die T ropfen innerhalb einer Zeile die gleiche Lösung enthalten, die Tropfen innerhalb einer Spalte auf der Oberfläche des zweiten Microarrays die gleiche Lösung enthalten. Auf diese Weise kann durch Überlagern und in Kontakt bringen des ersten und des zweiten Microarrays eine Matrix an Reaktandengemischen erhalten werden, bei der sich innerhalb einer Zeile und innerhalb einer Spalte jeweils nur der erste oder der zweite Reaktand ändern. Durch Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden kann somit eine Bibliothek strukturell verwandter Verbindungen erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Lösungen der ersten und/oder zweiten Reaktanden organische Lösungsmittel. Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise Ethylenglykol, N,N-Dimethylformamid, Cyclohexanol, N-Hexadekan, Dichlormethan, Aceton, 1 -Butanol, Ethylacetat, Ethanol, n-Hexan, Toluol, Methanol, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray weiter einen Schritt (2iii) des Trennens der beiden Microarrays bis die Tropfen auf der Oberfläche des ersten und des zweiten Microarrays nicht mehr in Kontakt stehen, der nach dem Schritt (2ii) und vor dem Schritt (3) ausgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Trennen der beiden Microarrays in einer Richtung, die der Richtung des in Kontakt Bringens entgegengesetzt ist. Weiter bevorzugt erfolgt das Trennen der beiden Microarrays in einer Richtung, die senkrecht zu der Oberfläche mindestens eines der beiden Microarrays ist. Durch das Trennen der beiden Microarrays nachdem die ersten und zweiten Reaktanden unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen, in Kontakt standen, liegt in den entsprechenden getrennten Tropfen auf den hydrophilen Bereichen der Oberfläche des ersten und des zweiten Microarrays ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden vor.
Das Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray umfasst weiter den Schritt (3) des in Kontakt Bringens von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt des ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst. Das in Kontakt von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, der ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden umfasst ist nicht sonderlich beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das in Kontakt bringen von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, der ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches
Syntheseprodukt umfasst, die folgenden Schritte:
(3i) Bereitstellen eines Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen Tropfen einer Zellsuspension trägt; und
(3ii) In Kontakt bringen mindestens eines Tropfens der Zellsuspension mit je einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches
Syntheseprodukt umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Microarray in Schritt (3i) die gleiche Anzahl und die gleiche Anordnung von T ropfen einer Zellsuspension auf, wie Tropfen auf den Oberflächen des ersten und/oder des zweiten Microarrays. Hierbei kann jeder T ropfen eine Suspension der gleichen Art von Zellen umfassen, oder verschiedene T ropfen können unterschiedliche Zellsuspensionen umfassen. Das Bereitstellen eines Microarrays einer Zellsuspension erfolgt analog zu den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Bereitstellung von Microarrays, beispielsweise durch auftragen einer Zellsuspension mittels rolling droplet oder standing droplet auf ein HSTL Microarray. Ebenso kann das in Kontakt bringen mindestens eines Tropfens der Zellsuspension mit je einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, wie vorstehend für das erste und zweite Microarray beschrieben, durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das in Kontakt bringen von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, der ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, die folgenden Schritte:
(3iii) Trocknen eines Microarrays, das auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer Lösung, die ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, trägt;
(3iv) Überschichten des getrockneten Microarrays mit einer Zellsuspension; und
(3v) Entfernen der überschüssigen Zellsuspension, um Tropfen der Zellsuspension auf den hydrophilen Bereichen des getrockneten Microarrays zu erhalten.
Das Microarray, das auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer Lösung, die ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, trägt, kann getrocknet werden, so dass ein Microarray erhalten wird, auf dessen hydrophilen Spots getrocknete Rückstände der Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden angeordnet sind. Bevorzugt umfasst jeder Spot nur eine Art von Umsetzungsprodukt. Dieses getrocknete Microarray wird anschließend mit einer Zellsuspension überschichtet und überschüssige Suspension entfernt, beispielsweise durch Abkippen der Suspension. Hierdurch bilden sich Tropfen der Zellsuspension auf den Spots des getrockneten Microarrays. Die getrockneten Rückstände der Umsetzungsprodukte können sich in den Suspensionstropfen lösen und sind somit in Kontakt mit den Zellen der Zellsuspension.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Umsetzungsprodukte auf den Spots des getrockneten Microarrays fixiert bevor die Zellsuspension aufgetragen wird. Dieses Fixieren kann beispielsweise durch Aufträgen einer Beschichtung, beispielsweise eines Polymers oder viskosen Verbindung, auf die einzelnen Spots erfolgen. Die Beschichtung ist bevorzugt löslich in der Zellsuspension. Weiter bevorzugt ist die Beschichtung nicht biologisch aktiv. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Beschichtung Gelatine. Durch das Fixieren der Umsetzungsprodukte mittels einer Beschichtung wird ein Übertragen von Umsetzungsprodukten eines Spots zu einem anderen Spot während des Überschichtens mit der Zellsuspension verhindert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf bestimmte Zelltypen beschränkt. Geeignete Zelltypen schließen prokaryotische Zellen, wie Bakterien und Archaeen, sowie eukaryotische Zellen, wie Hefezellen (wie Saccharomyces, z.B. Saccharomyces cerevisiae), Insektenzellen (z.B. Drosophila melanogaster), Pflanzenzellen und Säugerzellen (z.B. HEK 293, HeLa, CHO, hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen) ein, wobei die Säugerzellen auch humane primäre Zellen und Zelllinien einschließen. Wenn es sich bei der Zellsuspension um eine Suspension von Stammzellen handelt, sind diese Stammzellen vorzugsweise nicht embryonale Stammzellen. Exemplarisch sind hier als Zellen für das erfindungsgemäße Verfahren Säugerzellen, insbesondere HEK 293 genannt. Das Suspensionsmittel der Zellsuspension unterliegt keinen besonderen Beschränkungen und kann von einem Fachmann anhand der zu suspendierenden Zellen entsprechend gewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden biologisch aktiv. Mit biologisch aktiv beschreibt man allgemein Stoffe, die in der Lage sind ein biologisches System zu beeinflussen. Beispiele für solche biologisch aktiven Stoffe sind beispielsweise pharmazeutisch aktive Verbindungen, Hormone oder Antibiotika. Des Weiteren können auch bestimmte DNA- oder RNA-Stränge als biologisch aktiv bezeichnet werden, wenn sie in der Lage sind ein biologisches System zu beeinflussen. Beispielsweise stellen Plasmide, siRNAs oder microRNAs biologisch aktive DNA- und RNA-Stränge dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden Zell-permeabel. Zell-permeabel bedeutet, dass die Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden durch eine Zellmembran diffundieren können bzw. aktiv von einer Zelle durch die Membran transportiert werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen der erste Reaktand und/oder der zweite Reaktand einen Nukleotid sträng oder das Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden ist an einen Nukleotidstrang gebunden oder mit einem Nukleotidstrang komplexiert. Diese Ausführungsform umfasst zum einen die Möglichkeit, dass der erste und/oder der zweite Reaktand ein Nukleotidstrang ist, der mit dem anderen Reaktanden reagieren kann, um einen modifizierten Nukleotidstrang zu bilden. Der ursprüngliche Nukleotidstrang kann hierbei ein natürlich vorkommender Nukleotidstrang sein, beispielsweise ein DNA-Strang, ein RNA-Strang oder ein Plasmid, oder er kann ein künstlicher Nukleotidstrang sein. Ein künstlicher Nukleotidstrang im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschreibt sowohl einen Nukleotidstrang, der synthetisch hergestellt wurde, als auch natürlich vorkommende Nukleotidstränge, die chemisch oder biologisch modifiziert wurden. Zum anderen ist in dieser Ausführungsform auch die Möglichkeit eingeschlossen, dass das Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden in einem weiteren Schritt chemisch an einen Nukleotidstrang gebunden wird oder mit einem Nukleotidstrang komplexiert. Das Komplexieren schließt hierbei sowohl ein nichtkovalentes Binden, beispielsweise durch elektrostatische Wechselwirkungen, ein, als auch das physische Einschließen eines Nukleotidstranges im Inneren einer Struktur, die von dem Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden ausgebildet wird. ln einerweiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Zelle mit dem Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden transformiert bzw. transfiziert. Unter T ransformation bzw. Transfektion versteht man im Allgemeinen das Einbringen von freier DNA oder RNA in prokaryotische bzw. eukaryotische Zellen. Auf diese Weise können Zellen beispielsweise in ihrer Stoffwechselaktivität beeinflusst werden oder Zellen können so verändert werden, dass sie bestimmte Verbindungen, beispielsweise Farbstoffe, selbst produzieren können.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray der vorliegenden Erfindung den folgenden Schritt (4):
(4) Untersuchen der biologischen Aktivität der Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden.
Der Schritt des Untersuchens der biologischen Aktivität der Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden erfolgt hierbei bevorzugt anhand des Microarrays. Beispielsweise können Zellen, die in Schritt (3) mit den Umsetzungsprodukten in Kontakt gebracht worden sind, durch Färbung auf ihre Gesundheit hin untersucht und photometrisch analysiert werden, oder, falls die Zellen transformiert bzw. transfiziert wurden, können die Zellen auf Basis der eingebachten DNA bzw. RNA untersucht werden. So können beispielsweise Zellen, die mit einem Plasmid, das die Expression eines bestimmten Farbstoffes oder Antibiotikaresistenzgens vermittelt, transformiert bzw. transfiziert wurden, auf ihre Antibiotikaresistenz oder ihr Farbstoffexpressionsvermögen hin untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein gestapeltes Microarray, bei dem zwei Microarrays so angeordnet sind, dass sich die Oberflächen, die hydrophile Bereiche, die von hydrophoben Bereichen umschlossen sind, aufweisen, gegenüberiiegen und mindestens ein Tropfen auf einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays mit einem Tropfen auf einem hydrophilen Bereich des zweiten Microarrays in Kontakt stehen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, das mindestens ein Microarray umfasst, das getrocknete Überreste eines Reaktanden oder eines Nukleotidstranges umfasst. Auf diese Weise können beispielsweise standardisierte Reaktanden- oder Nukleotid-Bibliotheken vorbereitet und konserviert werden, die vor Ihrem Einsatz durch Aufbringen eines geeigneten Lösungsmittels auf die hydrophilen Bereiche des Microarrays gelöst werden, um ein Microarray zu bilden. Somit dient das Kit der vorliegenden Erfindung der einfachen Bereitstellung eines standardisierten Test Szenarios.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines Microarrays für die chemische Synthese eines chemischen Syntheseproduktes und für die Behandlung von mindestens einer Zelle mit dem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray.
Die vorliegende Erfindung weist daher im Vergleich mit dem Stand der Technik folgende Vorteile auf:
- Kombinatorische Synthese mit geringen Probenvolumina;
- Chemische Synthese in Lösung;
- Durch Verzicht auf teure Robotik kosteneffizient durchzuführen; und
- Direkte Integration der biologischen Anwendung.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Beispielhafte Herstellung eines HSTL-Microarrays (A) Die photoinitiierte Copolymerisation von 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA, (1 )) und Ethylendimethacrylat (EDMA, (2)) führt zur Ausbildung einer stark hydrophilen porösen Polymerschicht. (B) Nach der Veresterung des Polymers mit 4-Pentinsäure können durch die ortsselektive, photochemische Funktionalisierung mit Perfluordecanthiol (PFDT; hydrophobe Komponente) und Mercaptoethanol (hydrophile Komponente) superhydrophile Spots (schraffiert) gebildet werden, die durch superhydrophobe Barrieren (gepunktet) voneinander abgegrenzt sind.
Figur 2: Beispielhafte Herstellung eines LSTL-Microarrays. Durch die Silanisierung eines Glas-Substrates wird dieses mit Vinyl-Gruppen modifiziert. In einer photochemischen Thiol-Ene-Reaktion kann die Oberfläche mit Perfluordecanthiol (PFDT; hydrophobe Komponente) und Cysteamin-Hydrochlorid (hydrophile Komponente) gemustert werden. Dadurch entstehen superhydrophile Spots (schraffiert), die durch superhydrophobe Grenzen (gepunktet) voneinander separiert sind.
Figur 3: Für die Lipidoidsynthese verwendete Reaktanden (A) Verwendete Vorläufer-Verbindungen zur Synthese der Lipidoid-Bibliothek auf einem Microarray. (B) Synthesebedingungen im Microarray: die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur in DMSO als Lösungsmittel und ist nach 2 Stunden abgeschlossen.
Figur 4: Anordnung der ersten und zweiten Reaktanden in einem gestapelten Microarray. Durch vertikales Aufträgen verschiedener Amine (hier A1-16) und horizontales Aufträgen verschiedener Thiolacton-Pyridyldisulfid- Mischungen (hier T1-5_PY1-5) auf dem ersten bzw. zweiten Microarray kann der größtmögliche Produkt-Strukturrahmen erzeugt werden (hier 80 verschiedene Lipidoide (L)).
Figur 5: Bildung von Lipoplexen als T ransfektions-Reagenz. Nach vollendeter Lipidoid-Synthese formen sich in wässrigen Lösungen, aufgrund hydrophober Wechselwirkung, spontan Liposomen. Durch elektrostatische Wechselwirkungen komplexieren die positiv (+) geladenen Kopfgruppen der Lipidoide negativ (-) geladene DNA. Die so entstandenen Lipoplexe können als potentielle T ransfektions-Reagenzien eingesetzt werden.
Figur 6: Ergebnisse der reversen Transfektion. Von den einzelnen Spots wurde bei 10x Vergrößerung je eine Aufnahme erstellt, aus der mittels ImageJ der durchschnittliche Grau-Wert bestimmt wurde. Dieser Wert stellt gleichzeitig die relative T ransfektionseffizienz des jeweiligen Lipidoids dar. Da sämtliche Spots mit den gleichen Parametern aufgenommen wurden, können, sie untereinander verglichen werden. Nach Standardisierung der Werte konnte eine Heatmap erzeugt werden, in der jeweils beide Werte (Lipoplex- und Gelatine-Microarray) berücksichtigt wurden.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung weiter anhand von Beispielen erläutert, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung von HSTL- und LSTL-Microarrays
Die Herstellung eines HSTL-Microarrays ist schematisch in Figur 1 dargestellt.
Für die Oberflächenmodifizierung eines HSTL-Microarrays wurden Objektträger (Schröder Spezialglas, Ellerau, Deutschland) der Größe 76x26 mm als Substrate verwendet. Die Substrate wurden zunächst für 1 Stunde in 1 M NaOH und anschließend für 30 Minuten in 1 M HCl aktiviert, mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Zur Modifizierung wurde auf einem Substrat eine Lösung aus 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in Ethanol (20 vol%) aufgetragen und das Substrat mit einem weiteren Substrat bedeckt. Nach 30 Minuten wurden die Substrate getrennt, nochmals 30 pL 3- (Trimethoxysilyl)propylmethacrylat aufgetragen, und die Substrate für weitere 30 Minuten gepaart. Das modifizierte Substrat wurde mit Ethanol gewaschen und mit Druckluft getrocknet. In einem Exsikkator wurden ein offenes Eppendorf Safe-Lock Tube (Eppendorf, Wesseling, Deutschland) mit 30 pL Trichlor(1 H, 1 H, 2H, 2H- perfluoroctyl) silan und aktivierten Substraten zur Fluorierung über Nacht unter vermindertem Druck gelagert. Zur Polymerisierung der Substrate wurde eine Polymerisierungs-Lösung aus 2- Hyd roxyethyl methacrylat (HEMA; 24 wt%), Ethylendimethacrylat (EDMA; 16 wt%), 1-Decanol (12 wt%) Cyclohexanol (48 wt%) und 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (0,4 wt%) hergestellt und durch Filtration über eine Aluminiumoxid-Filtersäule aufgereinigt. Auf einem fluorierten Substrat wurden 30 pL der Polymerisierungs-Lösung aufgetragen und das Substrat mit einem modifizierten Substrat gepaart. Die übereinandergelegten Substrate (fluoriertes Substrat unten) wurden für 15 Minuten mit UV-Licht der Wellenlänge 260 nm (Intensität: 5,0 mW cm-2) bestrahlt. Anschließend wurden die Substrate getrennt, das polymerisierte Substrat mit Ethanol gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Zur Oberflächenvergrößerung wurde die Polymeroberfläche aufgeraut. Hierfür wurde Klebeband (Tesa, Norderstedt, Deutschland) über das gesamte Polymer geklebt und dieses ruckartig wieder entfernt. Das Substrat wurde mit Ethanol gewaschen, mit Druckluft getrocknet und für mehrere Stunden in Ethanol gelagert. Zur Veresterung der Oberfläche wurden zwei Substrate mit der nicht- polymerisierten Oberfläche aneinander in eine Lösung aus 45 mL Aceton, 0,056 g DMAP (1 ,24 mg mL 1) und 0,112 g 4-Pentinsäure (2,49 mg mL 1) eingetaucht und die Reaktionslösung auf -20°C gekühlt. Nach Zugabe von 180 pL N,N'- Diisopropylcarbodiimid (DIC; 0.4 vol%) wurde die Reaktionslösung im geschlossenen System für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die Substrate mit Ethanol gewaschen, mit Druckluft getrocknet und für mindestens 2 Stunden in Ethanol gelagert. Auf einem veresterten Substrat wurden unter Lichtausschluss 200 pL einer Lösung aus PFDT (10 vol%) in Aceton aufgetragen und das Substrat mit einer Fotomaske bedeckt. Anschließend wurde das Substrat für 2 Minuten mit UV-Licht der Wellenlänge 260 nm (Intensität: 5.0 mW cm-2) bestrahlt. Das Substrat wurde mit Aceton gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Auf der modifizierten Seite des Substrats wurden 200 pL einer Lösung aus Ethanol/FLO (1 :1) und 2-Mercaptoethanol (10 vol%) aufgetragen und das Substrat mit einem Quarzglas (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, USA) bedeckt. Anschließend wurde das Substrat für 2 Minuten mit UV-Licht der Wellenlänge 260 nm (Intensität: 5,0 mW cm-2) bestrahlt. Das Substrat wurde mit Ethanol gewaschen, mit Druckluft getrocknet und bis zur Verwendung als HSTL- Microarray in Ethanol gelagert.
Die Herstellung eines LSTL-Microarrays ist schematisch in Figur 2 dargestellt.
Für die Oberflächenmodifizierung von LSTL-Microarrays wurden Objektträger (Schröder Spezialglas, Ellerau, Deutschland) der Größe 76x26 mm als Substrate verwendet. Zur Modifizierung wurden zwei Glassubstrate in eine Lösung aus 50 mL Dichlormethan (DOM), 0,8 mL Triethylamin (1 ,6 vol%) und 50 mg 4- (Dimethyiamino)-pyridin (DMAP; 1 mg mL 1) getaucht. Anschließend wurden 0.,2 mL Chlor(dimethyl)vinylsilan (0,4 vol%) hinzugefügt und die Lösung für 2 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Substrate wurden mit Ethanol gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Unter Lichtausschluss wurden 200 pL einer Lösung aus Aceton und 1 H,1 H,2H,2H-perfluordecanthiol (PFDT; 20 vol%) auf die modifizierte Seite eines Substrates aufgetragen und das Substrat mit einer Fotomaske bedeckt. Anschließend wurde das Substrat für 2 Minuten mit UV-Licht der Wellenlänge 260 nm (Intensität: 5,0 mW cm 2) bestrahlt. Das Substrat wurde mit Aceton gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Auf der modifizierten Seite des Substrates wurden 200 pL einer Lösung aus Ethanol/HbO (1 :1 ) und Cysteamin-Hydrochlorid (10 wt%) aufgetragen und das Substrat mit einem Quarzglas (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, USA) bedeckt. Anschließend wurde das Substrat für 2 Minuten mit UV- Licht der Wellenlänge 260 nm (Intensität: 5,0 mW cm 2) bestrahlt. Das Substrat wurde mit Ethanol gewaschen, mit Druckluft getrocknet und bis zur Verwendung als LSTL-Microarray in Ethanol gelagert.
Beispiel 2: Lipidoid-Synthese in Microarrays
Der allgemeine Ablauf einer Lipidoid-Synthese ist in dem folgenden Schema (A) dargestellt:
(A)
“
Derivat Derivat
Ein primäres oder sekundäres Amin 5 induziert die Reaktion durch die nukleophile Ringöffnung eines Thiolacton-Derivates 4, das wiederum einen Disulfid-Austausch mit einem Pyridyldisulfid-Derivat 3 eingehen kann. Als Hauptprodukt wird das Lipidoid 6 erhalten und als Nebenprodukt das gelbe 2-Thiopyridon (7). Der Reaktionserfolg kann durch das freiwerdende Thiopyridon 7 verfolgt werden. Durch Variation der eingesetzten Pyridyid isulfid-Derivate 3, Thiolacton-Derivate 4 und Amine 5 können verschiedene Lipidoide erhalten werden. Beispielsweise wurden für die Lipidoid-Synthese in Microarrays die in Figur 3 dargestellten Reaktanden eingesetzt. Da die Pyridyldisulfid-Derivate 3 und die Thiolacton-Derivate 4 unreaktiv nebeneinander in Lösung vorliegen können (zueinander inerte Reaktanden) werden auf ein erstes Microarray Mischungen je eines Pyridyldisulfid-Derivates 3 und eines Thiolacton-Derivates 4 aufgebracht und auf ein zweites Microarray Lösungen von Aminen 5.
Das Aufbringen der Lösungen erfolgte mittels der "rolling droplet" Methode. Hierfür wurde mittels einer Pipette ein Tropfen einer Lösung, die den oder die gewünschte(n) Reaktande(n) enthält über bestimmte Bereiche der gemusterten Oberfläche der Microarrays bewegt. Auf diese Weise können zeilen- bzw. spaltenweise unterschiedliche Mischungen der Pyridyldisulfid-Derivate 3 und Thiolacton-Derivate 4 bzw. Amine 5 aufgetragen werden.
Für das Aufträgen der Vorläufer-Verbindungen wurden Lösungen mit folgenden Konzentrationen verwendet:
Lösung 1 : 1 ,67 mg rnL-1 Thiolacton-Derivat 4 und 1 ,75 mg mL_1 Pyridyldisulfid- Derivat 3 in DMSO
Lösung 2: Amin 5 1 :24 (v/v) verdünnt in DMSO
Da das verwendete Lösemittel DMSO eine geringe Oberflächenspannung aufweist wurden LSTL-Microarrays verwendet. Der Durchmesser der hydrophilen Bereiche der gemusterten Oberfläche der Microarrays betrug 3 mm. Das Tropfenvolumen der in DMSO gelösten Reaktanden auf der Oberfläche der Microarrays betrug 2,50 pL.
Durch Überlagern der beiden Microarrays und in Kontakt bringen je eines T ropfens auf der Oberfläche des ersten Microarrays mit je einem Tropfen auf der Oberfläche des zweiten Microarrays, wurde die Umsetzung gestartet und die entsprechenden Lipidoide erhalten. Figur 4 zeigt ein gestapeltes Microarray, bei dem spaltenweise die verwendeten Amine 5 variieren und zeilenweise unterschiedliche Mischungen von Pyridyldisulfid-Derivaten 3 und die Thiolacton-Derivaten 4 aufgetragen wurden. Für jede Kombination der ersten und zweiten Reaktanden wurde ein unterschiedliches Lipidoid erhalten. Anschließend wurden die beiden Microarrays getrennt und die Bildung der Lipidoide mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption / Ionisation mit Flugzeitanalyse (MALDI-TOF) bestätigt.
Für die MALDI-TOF Analyse wurden die erhaltenen Lipidoide durch Stempeln eines der getrennten Microarrays auf eine MALDI-Platte übertragen und unter vermindertem Druck getrocknet. Als Matrix wurde a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (a- CHCA) verwendet. a-CHCA (10 mg mL 1) wurde in einer Acetonitril-Wasser- Mischung (1 :1 , v/v) gelöst und mit 0,1 % Trifluoressigsäure vermischt. Zu jedem Proben-Spot auf der MALDI-Platte wurden 0,5 pL dieser Matrix-Lösung pipettiert. Die Matrix-Platte wurde unter vermindertem Druck im Exsikkator getrocknet und direkt im Anschluss analysiert. Die Analyse erfolgte mittels eines MALDI TOF/TOF 4800 Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) im Positiv- Ionen Reflektormodus in einem Massenbereich von 600-1000 Da. Die Laser- Intensität wurde anfangs auf 3000 eingestellt und anschließend nachjustiert, um optimale Signale zu erhalten. Die Auswertung der Daten erfolgte durch die Software Data Explorer Software 4.0 (Applied Biosystems). Die Proben wurden auf eine Sciex Opti-TOF 384 well MALDI-Platte (123x81 mm) gespottet. Als Matrix wurden 0,5 pL einer Lösung aus a-CHCA (10 mg mL 1) in Acetonitril/ddH20 (1 :1 , v/v) mit 0,1 % TFA aufgetragen und die Platte unter vermindertem Druck getrocknet.
Die gebildeten Lipidoide konnten auf diese Weise auf beiden getrennten Microarrays nachgewiesen werden.
Beispiel 3: Herstellung von Liposomen und Lipoplexen und T ransfektion von Zellen in Microarrays
Für die Bildung von Liposomen aus den Lipidoiden aus Beispiel 2, wurde ein Microarray des Beispiels 2, das die Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden enthält, unter vermindertem Druck getrocknet und so eine getrocknete Lipidoid-Bibliothek erhalten, wobei jeder hydrophile Spot des Microarrays je ein getrocknetes Lipidoid enthält. Diese getrocknete Lipid-Bibliothek wurde mit einem Microarray überlagert und in Kontakt gebracht, das auf seiner Oberfläche Tropfen einer Natriumacetat- Pufferlösung (200 mM, pH 5) trägt. Dieses Microarray wurde hergestellt, indem ein HSTL-Microarray mit der Natriumacetat-Pufferlösung überschichtet wurde und überschüssige Lösung seitlich von dem Microarray abgekippt wurde ("standing droplet” Methode).
Für eine optimale Lösung und Durchmischung der getrockneten Lipidoide in den einzelnen Tropfen auf der Oberfläche des Natriumacetat-Microarrays wurde das gestapelte Microarray für 2 Stunden bei 50°C auf einem Heizblock inkubiert. Auf diese Weise konnten in den einzelnen Tropfen Liposome der jeweiligen Lipidoide gebildet werden.
Nach dem Trennen der beiden Microarrays wurde das HSTL-Microarray, das Tropfen der Lösungen der gebildeten Liposomen in Natriumacetat-Puffer auf seiner Oberfläche aufweist, für die weiteren Schritte verwendet. Die erfolgreiche Bildung der Liposomen konnte durch Nanotracking Analyse (NanoSight LM10-HS System, Malvern Instruments), dynamische Lichstreuung (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments) und Zeta-Potential-Analyse (Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments) nachgewiesen werden.
Für die Bildung von Lipoplexen wurde ein weiteres HSTL-Microarray vorbereitet, auf dessen Oberfläche T ropfen einer Lösung des Plasmids pCS2-GFP (7,50 ng pL 1) in Natriumphosphatpuffer (33 mM, pH 5) aufgebracht wurden. Das Plasmid pCS2- GFP kodiert das grün-fluoreszierende Protein GFP. Die Tropfen auf der Oberfläche des Microarrays, das die gebildeten Liposomen enthält, wurden mit den T ropfen auf der Oberfläche des Microarrays, das die Plasmidlösung enthält, in Kontakt gebracht. Auf Grund der positiven Ladungen auf der Oberfläche der Liposomen lagert sich die negativ geladene Plasmid-DNA an die Liposomen an, um Lipoplexe zu bilden. Die Bildung von Lipoplexen ausgehend von den Lipidoiden aus Beispiel 2 ist in Figur 5 dargestellt. Beispiel 4: Untersuchung der T ransfektionseffizienz von unterschiedlichen
Lipoplexen in Microarrays
Für die Untersuchung der T ransfektionseffizienz der unterschiedlichen Lipoplexe wurde ein Zell-Microarray bereitgestellt, das HEK293T Zellen umfasst. Hierfür wurden HEK293T Zellen auf einem mit Gelatine beschichteten HSTL-Microarray ausgesät und für 3 Stunden bei 38°C und 5% C02-Gehalt bis zum Einsetzen der Adhäsion inkubiert. Das Aussäen der Zellen erfolgte dabei mittels standing droplet Methode. Hierfür wurde auf dem Microarray ein großer Zell-Suspensions-T ropfen gebildet, der über sämtliche Spots des Microarrays reicht. Dieser Tropfen wurde für 30 Sekunden stehen gelassen, damit sich einige Zellen aus der Zellsuspension auf der Oberfläche des Microarrays absetzen konnten. Anschließend wurde das Microarray zur Seite gekippt, damit der große Tropfen vom Microarray herunterrollt und dabei kleine Mikrotropfen auf dem Microarray gebildet werden. Nach dem Aussäen der Zellen können durch Überlagern des Zell-Microarrays mit dem in Beispiel 3 erhaltenen Lipoplex-Microarray für 15 Minuten bei 38°C und 5% CO2- Konzentration die Zellen transfiziert werden.
Nach 24 h konnte die Expression von GFP mittels Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet werden. Hierfür wurden Mikroskopie-Aufnahmen bei einer Wellenlänge von 505 nm mit einem Keyence BZ-9000E Fluoreszenz-Mikroskop (Keyence, Osaka, Japan) aufgenommen (Objektive: PlanApo 2x 0.10/8.5 mm und PlanApo 10x 0.45/4.00 mm; Auflösung: 8 bit; Format: 1360x1024 pixels). Die Aufnahmen wurden mit Hilfe der zugehörigen Software BZ II Analyzer und mittels ImageJ (National Institute of Health, USA, 1.51 n) analysiert. Die einzelnen Aufnahmen wurden auf ihre mittlere Fluoreszenzintensität untersucht.
Beispiel 5: Reverse Transfektion in Microarrays
Als alternatives T ransfektionsverfahren wurde eine reverse Transfektion von HEK293T Zellen mittels Microarrays untersucht. Im Gegensatz zu der in Beispiel 3 und 4 beschriebenen T ransfektionsmethode kann bei der reversen T ransfektion auf den Zwischenschritt der Bildung von Liposomen verzichtet werden. Vielmehr werden die in Beispiel 1 synthetisierten Lipidoide direkt zu Lipoplexen umgesetzt.
Hierfür wurde auf einem HSTL-Microarray eine Lösung aus 0,1 M Saccharose, 0,04% (w/v) Gelatine, 0,002% (w/v) Fibronektin und 7,5 ng/pL pCS2-GFP in Natriumacetat-Puffer (50 mM, pH 5) aufgetragen. Durch das Sandwichen mit dem LSTL-Lipidoid-Microarray aus Beispiel 1 wurden zum einen die Lipidoide auf ein HSTL-Microarray übertragen, und zum anderen auch direkt zu Lipoplexen umgesetzt. Die Bildung von Liposomen und das anschließende Komplexieren mit Plasmid-DNA zu Lipoplexen finden in einem einzigen Schritt statt. Hierfür wurden die zusammengeführten Microarrays auf einem Heizblock für 1 ,5 Stunden bei 50 °C erhitzt.
Anschließend wurden die erhaltenen Lipoplexe für drei Tage unter vermindertem Druck auf dem Microarray getrocknet. Die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben direkt auf das Microarray der getrockneten Lipoplexe mittels des Standing droplet Verfahrens ausgesät. Hierbei wurde der Standing droplet der Zellsuspension (60c104 Zellen/mL) für 5 Sekunden auf dem Microarray belassen, bevor er abgekippt wurde.
Die Zellen wurden nach einer Inkubation für 24 Stunden wie vorstehend beschrieben auf Ihre Fluoreszenzintensität untersucht. Figur 6 zeigt eine Heatmap, die die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots mit der T ransfektionseffizienz korreliert.
Beispiel 6: Festphasensynthese in Microarrays
Microarrays können als Plattform für kombinatorische Festphasensynthese verwendet werden. Für das folgende Experiment wurde ein Microarray verwendet, dessen hydrophile Bereiche (rund, 3 mm Durchmesser) mit Cysteamin funktionalisiert sind. Die hydrophilen Bereiche wurden mit Hydroxyethyl-Photolinker (HEPL) funktionalisiert. Hierfür wurden 1350 pL einer 0,06 M HERL Lösung in DMF mit 135 pL Diisopropylcarbodiimid (DIC), 120 mg 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 1215 pL DMF gemischt. Auf jeden hydrophilen Spot des Microarrays wurden 10 pL der Lösung gegeben und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 9 Stunden inkubiert. Anschließend wurde der Microarray mit Aceton gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
Die Aminogruppen des Cysteamids, die nicht mit dem HERL reagiert haben, wurden mit einer 10 %-igen Lösung von Pyridin in Essigsäureanhydrid geschützt. Hierfür wurden 10 pL der Lösung auf jeden Spot aufgetragen, nach 30 Minuten mit Aceton abgewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
Anschließend wurde Doxorubicin an den HERL gebunden. Hierfür wurde erst 4- Formylbenzoesäure als Abstandhalter an den HERL gebunden, indem eine Lösung von 20 mg 4-Formylbenzoesäure und 10 mg 4-(Dimethylamino)-pyridin (DMAP) in 1 mL DMF und 100 pL DIC auf die einzelnen Spots aufgetragen wurde (10 pL pro Spot) und für 48 Stunden inkubiert wurde. Anschließend wurden je 10 pL einer Lösung von 10 mg Doxorubicin in 1 L DMSO und 1 pL Triethylamin auf die einzelnen Spots aufgebracht, im Dunkeln für 72 Stunden inkubiert, mit Aceton gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
Um die biologische Aktivität des erhaltenen Microarrays zu untersuchen, wurden die einzelnen Spots mit Gelatine überschichtet und anschließend wurden Zellen ausgesät. Hierfür wurde eine Lösung aus 0,066 g Gelatine aus Rinderhaut in 3 mL sterilem DMEM Medium (10% FCS und 1 % Pen/Strep) mittels rolling droplet Methode auf das Microarray aufgetragen, für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend an Luft getrocknet. Danach wurde eine Suspension von HeLa Zellen (0,25c106 Zellen pro mL) mittels rolling droplet Methode auf die einzelnen Spots aufgetragen. Hierbei wurden die Gelatinelösung und die Zellsuspension auch auf Kontrollspots aufgetragen, die nicht mit Doxorubicin modifiziert wurden.
Einzelne Spots des Microarrays wurden mit UV-Licht (365 nm, 4 mW/cm2, 15 min) bestrahlt um den HEPL zu spalten und das Doxorubicin freizusetzen, das Microarray anschließend für 48 Stunden bei 37°C inkubiert und mit CalceinAM/Propidiumiodid gefärbt.
Die Zellgesundheit wurde bei den Kontrollspots (unfunktionalisiert bzw. funktionalisiert aber nicht bestrahlt) nicht beeinflusst. Spots, die mit Doxorubicin funktionalisiert sind und mit UV-Licht bestrahlt wurden zeigen eine erhöhte Zellsterberate.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray, umfassend die Schritte:
(1 ) Bereitstellen eines ersten Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist, und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer ersten Lösung trägt, die einen ersten Reaktanden umfasst;
(2) Zugeben eines zweiten Reaktanden zu mindestens einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays, der einen ersten Reaktanden enthält, unter Bedingungen, die ein Umsetzen der ersten und zweiten Reaktanden ermöglichen; und
(3) In Kontakt bringen von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt des ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst.
2. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach Anspruch 1 , wobei der Schritt (2) des Zugebens eines zweiten Reaktanden die folgenden Schritte umfasst:
(2i) Bereitstellen eines zweiten Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer zweiten Lösung trägt, die einen zweiten Reaktanden umfasst; und (2ii) In Kontakt bringen der Tropfen des ersten Microarrays mit je einem Tropfen des zweiten Microarrays.
3. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bereitstellen der Microarrays das manuelle Aufbringen der Tropfen der Lösungen, welche die ersten bzw. zweiten Reaktanden umfassen, auf die hydrophilen Bereiche umfasst.
4. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der erste Reaktand und/oder der zweite Reaktand eine Mischung von zwei oder mehreren zueinander inerten Reaktanden umfasst.
5. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das erste Microarray auf mehr als einem hydrophilen Bereich einen Tropfen trägt und in mindestens zwei Tropfen jeweils ein anderer erster Reaktand vorliegt.
6. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das erste und das zweite Microarray die gleiche Anzahl an hydrophilen Bereichen aufweisen.
7. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Schritt (3) des in Kontakt Bringens von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, der ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, die folgenden Schritte umfasst:
(3i) Bereitstellen eines Microarrays, das eine Oberfläche mit mindestens einem hydrophilen Bereich, der von einem hydrophoben Bereich umschlossen ist, aufweist und auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen Tropfen einer Zellsuspension trägt; und
(3ii) In Kontakt bringen mindestens eines T ropfens der Zellsuspension mit je einem hydrophilen Bereich des Microarrays, wobei der hydrophile Bereich ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst.
8. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Schritt (3) des in Kontakt Bringens von mindestens einer Zelle mit einem hydrophilen Bereich des Microarrays, der ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, die folgenden Schritte umfasst:
(3iii) Trocknen eines Microarrays, das auf mindestens einem hydrophilen Bereich einen T ropfen einer Lösung, die ein Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden als chemisches Syntheseprodukt umfasst, trägt;
(3iv) Überschichten des getrockneten Microarrays mit einer Zellsuspension; und
(3v) Entfernen der überschüssigen Zeilsuspension, um T ropfen der Zellsuspension auf den hydrophilen Bereichen des getrockneten Microarrays zu erhalten.
9. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden biologisch aktiv ist.
10. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der erste Reaktand und/oder der zweite Reaktand einen Nukleotidstrang umfassen oder die Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden an einen Nukleotidstrang gebunden sind oder mit einem Nukleotidstrang komplexiert sind.
11. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die mindestens eine Zelle mit dem Umsetzungsprodukt der ersten und zweiten Reaktanden transformiert bzw. transfiziert wird.
12. Verfahren zur Behandlung von mindestens einer Zelle mit einem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , weiter umfassend den Schritt: (4) Untersuchen der biologischen Aktivität der Umsetzungsprodukte der ersten und zweiten Reaktanden.
13. Gestapeltes Microarray, bei dem zwei Microarrays so angeordnet sind, dass sich die Oberflächen, die hydrophile Bereiche, die von hydrophoben Bereichen umschlossen sind, aufweisen, gegenüberliegen und mindestens ein Tropfen auf einem hydrophilen Bereich des ersten Microarrays mit einem Tropfen auf einem hydrophilen Bereich des zweiten Microarrays in Kontakt stehen.
14. Kit, umfassend mindestens ein Microarray das getrocknete Überreste eines Reaktanden oder eines Nukleotid Stranges umfasst.
15. Verwendung eines Microarrays für die chemische Synthese eines chemischen Syntheseproduktes und für die Behandlung von mindestens einer Zelle mit dem chemischen Syntheseprodukt in einem Microarray.
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