EP3720505A1 - Vecteurs de molecules pharmacologiquement actives et non hydrosolubles et leur procede de preparation - Google Patents

Vecteurs de molecules pharmacologiquement actives et non hydrosolubles et leur procede de preparation

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EP3720505A1
EP3720505A1 EP18819547.3A EP18819547A EP3720505A1 EP 3720505 A1 EP3720505 A1 EP 3720505A1 EP 18819547 A EP18819547 A EP 18819547A EP 3720505 A1 EP3720505 A1 EP 3720505A1
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EP
European Patent Office
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nanoplateform
formula
active
linker
npc2
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18819547.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Mireille Blanchard-Desce
Diane BRAGUER
Michel Vaultier
Marie-Anne ESTEVE
Jonathan DANIEL
Florian CORREARD
Maeva MONTALEYTANG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique de Bordeaux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to novel vectors of pharmacologically active and non-water soluble molecules with reduced side effects.
  • nanoparticles is beginning to gain importance and solves at least one of two problems, in particular the problem of solubility.
  • One of the most used antitumour molecules is paclitaxel from the taxane family. This molecule has a solubility of less than 1 mg / l.
  • the pharmaceutical formulation of this compound contains excipients such as castor oil to allow its solubilization. These excipients have by themselves a toxicity.
  • Table 1 Main means of nanovectorization of antitumor active molecules But these new vectors often meet only one of the two criteria.
  • the nanovector from albumin solves the problem of low solubility of the active molecule.
  • the binding between the active molecule and the albumin is weak. It is therefore easy to cleave this bond, which implies a risk of release of the active molecule in all parts of the body and therefore significant side effects.
  • the nanovector from diamond makes it possible to obtain nanovectors covalently bonded to the active molecule.
  • these diamond nanoparticles are not soluble in water. The short- and long-term toxic effects of these hard carbon nanoparticles are unknown.
  • One aspect of the invention relates to a novel nanoplateform capable of covalently binding a pharmacologically active molecule, especially antitumor, and non-water soluble, while remaining soluble in water.
  • Another aspect of the invention relates to a novel nanoplateform comprising a pharmacologically active molecule, in particular antitumor, and which is capable of covalently bonding a fluorophore having an emission wavelength for monitoring the nanoplateform.
  • Another aspect of the invention relates to a novel nanoplateform comprising a pharmacologically active molecule, in particular an antitumor molecule, which is capable of covalently binding an addressing agent which makes it possible to improve the targeted transport of said pharmacologically active molecule, in particular antitumor , and so to limit the side effects.
  • the present invention relates to a pharmacologically active nanoplateform which consists of:
  • NPC2 nanoplateform
  • NPC2 is linked by covalent bonds with M via a linker L,
  • NPC2 nanoplate having the following properties:
  • the solubility of NPC2 in an aqueous medium is 25 to 500 g / L
  • the Young's modulus of NPC2 is from 1 to 4 GPa
  • the density of NPC2 is from 1 to 3
  • the dry size of NPC2 is 10 to 40 nm
  • the hydrodynamic diameter of NPC2 is 10 to 150 nm
  • NPC2 is substantially amorphous said NPC2 nanoplate having, on the surface, carboxylic and hydroxylic acid functions and a number of primary amine graft functions of 0.7 to 7 mmol per gram of nanoplate, said pharmacologically active molecule M having a solubility in an aqueous medium of less than 200 mg / l,
  • said pharmacologically active nanoplateform having an aqueous solubility of 5 to 500 g / l
  • NPC2 is substantially free of lipids, nucleic acids, proteins and peptides.
  • the active nanoplateforms according to the present invention may contain any pharmacologically active molecules as long as they are not soluble in water but made soluble in water following their binding with the nanoplateform.
  • the subject of the present invention is an active nanoplateform which consists of:
  • NPC2 nanoplateform
  • NPC2 is linked by covalent bonds with M via a linker L,
  • NPC2 nanoplate having the following properties:
  • the solubility of NPC2 in an aqueous medium is 25 to 500 g / L
  • the Young's modulus of NPC2 is from 1 to 4 GPa
  • the density of NPC2 is from 1 to 3
  • the dry size of NPC2 is 10 to 40 nm
  • the hydrodynamic diameter of NPC2 is 10 to 150 nm
  • NPC2 is substantially amorphous
  • NPC2 nanoplate having a number of primary amine functions of surface grafting of 0.7 to 7 mmol per gram of nanoplateform
  • said antitumor active molecule M having a solubility in an aqueous medium of less than 200 mg / l
  • said active nanoplateform having an aqueous solubility of 5 to 500 g / l, with the proviso that:
  • NPC2 is substantially free of lipids, nucleic acids, proteins and peptides.
  • the subject of the present invention is an active nanoplateform consisting of:
  • NPC2 nanoplateform
  • NPC2 a nanoplateform comprising or consisting of carbon, hydrogen, oxygen, and nitrogen in the form of primary amino group (s) and primary alkylamino group (s) of 1 to 10 carbons, in particular of primary amino group (s) and of primary ethylamino group (s),
  • NPC2 is linked by covalent bonds with M optionally via a linker L, said nanoplateform NPC2 having the following properties:
  • the solubility of NPC2 in an aqueous medium is 25 to 500 g / L
  • the Young's modulus of NPC2 is from 1 to 4 GPa
  • the density of NPC2 is from 1 to 3
  • the dry size of NPC2 is 10 to 40 nm
  • the hydrodynamic diameter of NPC2 is 10 to 150 nm
  • NPC2 is substantially amorphous
  • said NPC2 nanoplate having a number of primary amine functions of surface grafting of from 1.4 to 7 mmol per gram of nanoplateform, said antitumor active molecule M having a solubility in aqueous medium of less than 200 mg / L,
  • said active nanoplateform having an aqueous solubility of 5 to 500 g / L,
  • NPC2 is substantially free of lipids, nucleic acids, proteins and peptides.
  • the subject of the present invention is an active nanoplateform consisting of:
  • NPC2 nanoplateform
  • NPC2 a nanoplateform comprising or consisting of carbon, hydrogen, oxygen, and nitrogen in the form of primary amino group (s) and primary alkylamino group (s) of 1 to 10 carbons, in particular of primary amino group (s) and of primary ethylamino group (s),
  • NPC2 is linked by covalent bonds with M via a linker L,
  • said NPC2 nanoplate having the following properties: the solubility of NPC2 in an aqueous medium is 25 to 500 g / L
  • the Young's modulus of NPC2 is from 1 to 4 GPa
  • the density of NPC2 is from 1 to 3
  • the dry size of NPC2 is 10 to 40 nm
  • the hydrodynamic diameter of NPC2 is 10 to 150 nm
  • NPC2 is substantially amorphous
  • said NPC2 nanoplate having a number of primary amine functions of surface grafting of from 1.4 to 7 mmol per gram of nanoplateform, said antitumor active molecule M having a solubility in aqueous medium of less than 200 mg / L,
  • said active nanoplateform having an aqueous solubility of 5 to 500 g / L,
  • NPC2 is substantially free of lipids, nucleic acids, proteins and peptides
  • the aqueous solubility of said antitumor active molecule is less than or equal to 200 mg / L relative to the antitumour active molecule in the uns-salified form
  • the optional addressing agent (A) in the active nanoplateform may however be a protein or a peptide.
  • the subject of the present invention is an active nanoplateform as described above in which:
  • NPC2 is linked by covalent bonds with M via a linker L,
  • R 1 and R 2 are independently selected from: -NH-, -COO, -NHCO-, -O-, -OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- and -CO-NH-NH-CO-
  • R 3 is chosen from: -NH-; -O-
  • R 4 is chosen from: -O-, -NHNH-, NH-, in particular via a succinic linker
  • nanoplateform is understood to mean a nanoparticle serving as a support and comprising surface grafting functions allowing the grafting of components on the surface, and including the possible fluorophores and addressing agent as long as the active molecule antitumor is not grafted.
  • active nanoplateform means a nanoplateform on which the active antitumor molecule is grafted, it being understood that the fluorophore and / or the addressing agent may or may not be present.
  • surface grafting functions means functions located on the surface of the nanoplateform capable of covalently binding the molecules of interest to the nanoplateform. These functions are chosen from the primary amine functional groups or the carboxylic acid functions.
  • the term "molecules of interest” means the molecules to be grafted to the nanoplateform, that is to say either the active antitumor molecule, the fluorophore if it is present and / or the agent addressing if present.
  • substantially amorphous nanoplate means a nanoplateform having no characteristic line on the XRD spectrum, but may contain microcrystalline inclusions not detectable by this method of analysis.
  • nanoplateform substantially free of lipids, nucleic acids, proteins and peptides means a nanoplateform containing less than 5% of lipids, less than 5% of nucleic acids, less than % of peptides and less than 5% of proteins by weight, relative to the total weight of the nanoplateform.
  • the active nanoplateforms according to the present invention have the advantage of being nanovectors of antitumor active molecules capable of solubilizing said insoluble molecules thanks to the own solubility of the nanoplateform.
  • the active nanoplateforms according to the present invention have the advantage of having covalent bonds between the nanoplateform and the molecules attached thereto.
  • the interest is to be able to control the release or non-release of the molecules of interest attached to the active nanoplateform.
  • nanoplateforms according to the present invention comprise:
  • an active antitumor molecule an addressing agent and a fluorophore.
  • the active nanoplateforms according to the present invention have the advantage of being flexible. It is thus possible to graft different molecules according to the functions that it is desired to be filled by the active nanoplateforms. Thus, if it is desired that the antitumor activating molecule targets a particular cell type, it is possible to attach an addressant to the active nanoplateform particularly targeting the relevant cells. But if we want the whole body is targeted, the absence of addressing agent removes the discriminating nature of the active nanoplateforme.
  • the active nanoplateforms according to the present invention are soluble in an aqueous medium, which makes it possible to dispense with the addition of toxic solvents, and are capable of efficiently transporting the active antitumour molecule to a destination targeted by the addressing agent ( if it is present), and thus increase the selectivity of the active molecule.
  • the nanoplateforms according to the present invention make it possible to overcome the two main causes of the side effects of antitumor treatments known to date.
  • the functional grafting functions at the surface of the active nanoplateform as described above comprise NH 2 OR groups consisting of NH 2 groups, said surface grafting functions being capable of being bound by covalent bonds to M and / or F and / or A, the level of bonded grafting functions being from about 50% to about 100% of the total surface grafting functions of the NPC 2 nanoplate.
  • bonded grafting function is understood to mean a grafting function on the surface of the nanoplateform onto which is grafted a compound that can be either a linker or a molecule of interest.
  • linker means a compound capable of covalently binding the nanoplateform and the molecules of interest.
  • the linkers are identical or different depending on the molecules of interest.
  • linker is an anglicism corresponding to the term “linker”.
  • non-water-soluble pharmacologically active molecule means all the pharmacologically active molecules whose solubility in aqueous medium is equal to or less than 200 mg per liter. Said solubility is relative to the pharmacologically active molecules in their uns-salified form.
  • pharmacologically active compounds can be used in the form of salts during the grafting process.
  • the term "rate of grafting functions related" the ratio between the number of grafting functions effectively linked and the number of grafting functions present on the surface.
  • the molecules of interest that are linked to the nanoplateform are linked to amine functions. These functions are the most reactive in the case of this invention. These functions bind more easily than carboxylic acid functions.
  • Said amine functions are located on the surface of the nanoparticle as exemplified in formula AAA below.
  • NP C represents here the core of the NPC 2 nanoplate without the grafting functions located on the surface.
  • the nanoplateform of the AAA formula carries "primary amine” (-NH 2 ) functions as well as “ethylamino” functions (-CH 2 -CH 2 -NH 2 ).
  • the active nanoplateform as described above comprises a fluorophore F, and NPC 2 is linked by covalent bonds with F via an I_F linker.
  • the nanoplate is bonded with an antitumor active molecule and with a fluorophore.
  • This fluorophore makes it possible to follow the evolution of the active nanoplate to which it is linked in the body, in particular in wavelengths adapted to the biology.
  • the covalent bonds bind the nanoplate with the fluorophore and prevent the accumulation of fluorophore in the host organism.
  • the active nanoplateform as described above comprises an addressing agent A, and NPC2 is linked by covalent bonds with A, via a linker L A.
  • the nanoplate is bound with an antitumor active molecule and with an addressing agent.
  • This targeting agent makes it possible to target the cells or organs that must be targeted by the treatment.
  • This targeting agent can be an antibody, a peptide or a small molecule that binds receptors highly expressed by the cells of the blood-brain barrier, tumor cells or that target neo-angiogenesis (LDLR, receptor transferrin, EGFR, VEGF ). It may be, for example, peptides RGD, TAT, angiopep-2, or anti-EGFR or anti-VEGF antibodies.
  • the active nanoplateforme as described above comprises a fluorophore F, and an addressing agent A, and NPC2 is bound by covalent bonds via a linker L F F NPC2 and is bound by covalent bonds with A via a linker L A.
  • the nanoplate is bonded with an antitumor active molecule, an addressant and also a fluorophore.
  • This nanoplateform makes it possible to target the place of accumulation and action of the active nanoplate by means of the addressing agent, and to follow the evolution in the body of the active nanoplateform thanks to the fluorophore, by fluorescence imaging.
  • the active nanoplateform as described above comprises a fluorescent NPC2 nanoplate.
  • Example 1.1 not very favorable to biological imaging. It is for this reason that a fluorophore emitting at a favorable wavelength for living imaging, typically the near infrared (700 nm ⁇ max ⁇ 1000 nm), can be attached to the fluorescent active nanoplateform.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula I
  • NP C represents the core of the NPC 2 nanoplate with no surface grafting functions, NPC 2 having the above meaning
  • L f , L and L A represent the linkers linking via covalent bonds the core of the NP C nanoplate with the compounds F, M and A of Formula II, Formula IIa and Formula Mb,
  • T F , T and T A represent the grafting functions of the NPC 2 nanoplate after their integration into the L F , L and LA linkers,
  • Z F , Z and Z A represent the binding functions of the linkers L F , L and L A after their bonding to the grafting functions T F , T and T A ,
  • R F , R and R A represent the functional chains of the linkers L F , L and L a ,
  • Q F , Q and Q A represent the binding functions of the linkers L F , L and L A after their binding on the fluorophore, the antitumour active molecule and the addressing agent,
  • L x linkers can take two types of organization:
  • linker which is not composed solely of the grafting function of NPC2 is to be able to use it for the grafting of the active antitumor molecule by another covalent bond.
  • the active nanoplateforme contains a fluorophore and an antitumor active molecule
  • the active nanoplateform can take 18 configurations:
  • long linker means a linker formed by the addition of a linker precursor and which does not contain only the grafting function derived from the nanoplateform.
  • I, I F and I A are equal to 1.
  • short linker means a linker formed solely by the grafting function derived from the nanoplateform.
  • I, I F and I A are equal to 0.
  • Case 18 there is neither fluorophore nor addressing agent. This means that the linkers corresponding to these two molecules of interest are also absent. The linker of the active antitumor molecule is marked short. Case 18 therefore corresponds to the simplest case where only the active antitumour molecule is present.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula III,
  • NP C , T, Z, R, Q, M and I have the meanings stated above.
  • the active nanoplateform can take two configurations of Table 2, configurations 9 and 18.
  • the active nanoplateform contains only the active antitumor molecule, without fluorophore, and without an addressing agent.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula IV,
  • the active nanoplateform is such that the configuration 9 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises only an active molecule covalently linked to a nanoplateform via a long linker.
  • This type of configuration may be interesting in the case of a very weakly water-soluble active molecule. Indeed, it is possible to add a hydrophilic linker between the nanoplateform and the active molecule. This can help the solubilization of the active nanoplateform, especially in the case where the grafting rate of the active antitumor molecule is high (close to 100%).
  • grafting rate of the active antitumor molecule the ratio between the number of grafting functions related to an antitumor active molecule and the number of grafting functions present on the surface of NPC2.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula
  • the active nanoplateform can take the configurations 3.6 12 and 15 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, and a fluorophore, without an addressing agent.
  • the linkers are either in long configuration or in short configuration.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula
  • the active nanoplateform follows configuration 6 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, and a fluorophore, without an addressing agent.
  • the active molecule is linked via a long linker, while the fluorophore is linked via a short linker to the nanoplate.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula
  • the active nanoplateform can take configurations 7, 8, 16 and 17 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, and an addressant, without a fluorophore.
  • the linkers are either in long configuration or in short configuration.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula
  • the active nanoplateform follows configuration 7 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, and an addressant, without a fluorophore.
  • the active molecule and the addressing agent are respectively linked via two long linkers, which may be different from each other, on the nanoplateform.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula IX,
  • the active nanoplateform can take the configurations 1, 2, 4, 5, 10, 11, 13 and 14 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, an addressing agent, and a fluorophore.
  • the linkers are either in long configuration or in short configuration for each of the molecules of interest.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula
  • NP C , T, T F , T A , Z, Z F , Z a , R, R F , R A , Q, Q F , Q A , F, M and A have the meanings stated above.
  • the active nanoplateform follows configuration 1 of Table 2.
  • the active nanoplateform comprises an antitumor active molecule, an addressing agent, and a fluorophore.
  • the active molecule, the addressing agent and the fluorophore are respectively bound on the nanoplateform via long linkers, which may be different from each other.
  • the subject of the invention is an active nanoplateform in which said antitumor active molecule M is chosen from taxanes or anthracyclines.
  • Taxanes include paclitaxel (known under the trade name Taxol ® ) and docetaxel (known under the trade name Taxotere ® ).
  • Taxol ® paclitaxel
  • Taxotere ® docetaxel
  • the anthracyclines mention may be made of epirubicin, pirarubicin, idarubicin, zorubicin, aclarubicin and especially doxorubicin.
  • the invention relates to an active nanoplateform in which said antitumor active molecule M is chosen from taxanes such as paclitaxel or anthracyclines such as doxorubicin.
  • the invention relates to an active nanoplateform in which said antitumor active molecule M is paclitaxel or doxorubicin.
  • the subject of the invention is an active nanoplateform in which said antitumor active molecule M is paclitaxel.
  • the subject of the invention is an active nanoplateform in which said antitumor active molecule M is doxorubicin.
  • the active molecule being selected from the water-insoluble antitumour active molecules
  • the active nanoplateform makes it possible to render the said antitumor active molecules much more soluble in water, which makes it possible to improve their transport in the blood up to to the action areas.
  • paclitaxel an active molecule of the taxane family
  • the solubility of the corresponding active nanoplateform is at least 6.6 g / L.
  • the active molecule content of the active nanoplateform is from 10 to 150 mg per gram of active nanoplateforms, in particular from 30 to 100 mg / g, and more particularly to 45 mg / g.
  • the active nanoplateform as described above comprises a fluorophore F, chosen from Rhodamine B, Fluorescein isocyanate, Lucifer Yellow cadaverine, the Alexa Fluor family or the NIR cyanine family.
  • the fluorophore may also be fluorescein.
  • the fluorophore is chosen from a set of fluorophores that can be grafted onto the nanoplateform.
  • the choice of the fluorophore is based on the emission spectrum of the chosen fluorophore, or possibly the absorption spectrum.
  • Table 3 Emission spectrum of the various fluorophores that can be used.
  • the active nanoplateform as described above comprises an addressing agent A, chosen from the antibodies or the vector peptides, in particular an antibody targeting the EGF receptors, the RGD peptide or a peptide targeting LDLR.
  • Addressing agent A may also be cetuximab.
  • the addressing agent is selected from a set of proteins that can direct the active nanoplate to its target, and thus allow the release of the active molecule on the preselected target.
  • the active nanoplateform as described above comprises L, L F and L A linkers chosen from the compounds of Formula XI.
  • R 1 and R 2 are independently selected from: -NH-, -COO, -NHCO-, -O-, -OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- and -CO-NH-NH-CO-
  • R 3 is chosen from: -NH-; -O-
  • R 4 is selected from: -O-, -NHNH-, NH-
  • the linkers are selected according to several criteria: The nature of the bonds to be formed with between the molecules of interest and the nanoplate
  • Table 4 describes a set of links that can serve as links
  • NP C , T, T F , T A , Z, Z F , Z A , R, R F , R A , Q, Q F and Q A have the meanings given in formula I.
  • the subject of the invention is a nanoplateform in which the bond between said antitumor active molecule M and said linker L, or said nanoplateform NPC2, is cleavable under pH conditions of 2 to 8, in particular 4 at 8 and preferably from 4 to 7.5.
  • the pH conditions according to the invention in which the bond is cleavable are pH conditions of 2; 2.5; 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5 and / or 8.
  • the bond between the active molecule and the nanoplate is cleavable under the conditions chosen, which makes it possible to release the active molecule.
  • a toxic antitumour active molecule which is nontoxic when it is bound to the nanoplateform and which becomes toxic again, especially for tumor cells, during its release after cleavage.
  • This embodiment makes it possible to limit the side effects of the active antitumor molecule, by limiting the toxicity of the active molecule during its transport.
  • the active nanoplateform as described above is of Formula XII or of Formula XI IA,
  • the nanoplate is bound to a fluorophore (Rhodamine B), which makes it possible to follow the evolution of the nanoplateform by fluorescence in the field of the orange.
  • This fluorophore is directly bound on the nanoplateform via a short linker comprising only a primary amine grafting function.
  • the nanoplate is also bound to the antitumor active molecule, in this case paclitaxel, via a long linker comprising a primary amine grafting function and a compound terminated by a carboxylic acid function which after binding to the antitumor active molecule becomes an ester function.
  • the active nanoplateform obtained has two different bonds, respectively for the fluorophore and for the active antitumor molecule. So the cleavage conditions of these two molecules of interest are different, which allows the release of one (the active antitumor molecule) without necessarily releasing the other (the fluorophore).
  • the present invention also relates to a process for preparing an active nanoplateform as described above comprising a step of grafting an active antitumor molecule:
  • NPC 2 , L and M have the meanings of Formula I
  • an active nanoplateform consisting of a nanoplateform covalently bonded to said antitumor active molecule.
  • the linker can be:
  • the synthesis method preferably provides, in the case where a linker precursor is present, to first bind this precursor to the nanoplate before binding the antitumor active molecule.
  • the method of preparation as described above comprises, before the step of grafting an active antitumor molecule, a step of binding a fluorophore:
  • NPC 2 , L F and F have the meanings of Formula I
  • the method of preparation as described above comprises, before the step of grafting an active antitumor molecule, a step of refonalisation of an initial nanoplateform
  • an initial nanoplateform By bringing an initial nanoplateform into contact with an organic amine of the diamino-alkane type having two amine functional groups. preferably two primary amine and / or secondary functions and even more preferably two primary amine functions to increase the level of grafting functions comprising amine groups on the surface of said nanoplateform and thus obtain a refocused nanoplateform, followed by
  • the organic molecule is an ⁇ - ⁇ -diaminoalkane of 1 to 10 carbon atoms, having two primary amine functional groups, in particular 1,2-ethylenediamine.
  • the term "refunctionalization” means a step of transformation of the grafting functions at the surface of the nanoplateform, which are not usable for the grafting of the molecules of interest, in particular the acidic, amide, or alcohols and convertible by reaction sites carrying various functions usable for the aforesaid grafting and in particular a primary amine function.
  • the initial nanoplateform is refunctionalized to increase the rate of primary amine grafting functions at the surface of the nanoplateform.
  • amine grafting functions already exist. It is therefore possible to use these grafting functions to graft the molecules of interest. It is also possible to use different grafting functions of the amine functions. The refunctionalization step is therefore only an optimization of the possible charge in amine grafting functions of the nanoplateform.
  • the method of preparation as described above comprises, after the step of grafting an active antitumor molecule, a step of binding an addressing agent:
  • NPC 2 , L A , M and A have the meanings of Formula I,
  • an active nanoplateform consisting of a nanoplateform covalently linked to said antitumor active molecule M and linked to said addressant agent A.
  • the method of preparation as described above comprises the following steps:
  • a nanoplateform By contacting a nanoplateform with an organic molecule of the aw diaminoalkane type comprising two amine functions, preferably two primary and / or secondary amine functional groups and even more preferably two primary amine functions, in order to increase the rate of grafting functions comprising amine groups on the surface of said nanoplateform and thus obtaining an optionally reconditioned nanoplateform, b. a possible step of binding a fluorophore,
  • an active nanoplateform consisting of a nanoplateform covalently bonded to said antitumor active molecule M, optionally reconditioned, optionally linked to said fluorophore F and possibly linked to said addressing agent A.
  • the possible agent for addressing agent is a vector peptide.
  • the organic molecule is a diamine-alkane of 1 to 10 carbon atoms, having two primary amine functional groups, in particular 1,2-ethylenediamine.
  • the subject of the present invention comprises a refunctionalization step.
  • the subject of the present invention is a process for preparing an active nanoplateform as described above, comprising the following steps: a. a step of refonalisation of a nanoplateform,
  • nanoplateform By contacting a nanoplateform with an organic molecule of the aw diaminoalkane type with 1 to 10 carbon atoms carbon, comprising two primary amine functions, in particular 1, 2-ethylenediamine, to increase the level of grafting functions comprising amine groups on the surface of said nanoplateform and thus obtain a refunctionalized nanoplateform,
  • NPC2, L F , L, L A , F, M and A have the meanings set forth above to obtain an active nanoplateform consisting of a nanoplateform covalently bound to said reactive antitumor molecule M, refunctionalized, possibly bound to said fluorophore F and linked to said addressing agent A, said addressing agent being an antibody.
  • the synthesis method according to the present invention has the advantage of being flexible. It is possible to modify:
  • the fluorescence of the active nanoplateform in particular the color of this fluorescence,
  • B and d are real numbers between 0 and 1 respectively corresponding to the rate of refunctionalization of the COOFI grafting functions to NH 2 at the rate of refunctionalization of the OH grafting functions in NH 2,
  • the grafting functions T F , T and T A are chosen from the grafting functions of the nanoplateform of Formula b (NH 2 , COOH, OH),
  • Formula B Formula C Formula D c. a step of grafting an antitumour active molecule by the possible contacting of said Formula D nanoplate with a linker precursor L 'of Formula 2
  • step c taking place according to the following diagram
  • Formula D Formula E Formula F d. a possible step of binding an addressing agent by the possible bringing into contact of said active nanoplateform of Formula F with a linker precursor L A 'of Formula 3
  • Formula B and Formula B are two different scripts of the same NPC2 nanoplate.
  • the grafting functions T, T A and T F are chosen from the grafting functions available on the surface of the nanoplateform of Formula b, namely NHI 2 and COOH.
  • step a in the above process is
  • an organic molecule of the type an organic molecule of the aw diaminocane type of 1 to 10 carbon atoms, comprising two primary amine functions, in particular 1,2-ethylenediamine, to obtain an NPC2 nanoplateform of Formula bb or of Formula B,
  • B is a real number from 0 to 1 corresponding to the refoncalization rate of the COOFI grafting functions in NHI 2
  • the grafting functions T F , T and T A are chosen from the grafting functions of the nanoplateform of Formula bb (Alkyl-NH 2 , NHI 2 , COOH),
  • Formula bb and Formula B are two different scripts of the same NPC2 nanoplate.
  • the grafting functions T, T A and T F are chosen from the grafting functions available on the surface of the nanoplateform of Formula b, namely NH 2 and COOH.
  • refoncalization with 1,2-ethylenediamine results in a structure of formula b-b in which the alkyl group is ethyl.
  • an additional step of synthesizing the initial nanoplate can be performed.
  • the linker obtained as a result of the binding of this precursor on the nanoplateform is a long linker.
  • the resulting linker is a short linker.
  • b and d are respectively the rate of refunctionalization of the COOFI grafting functions in NFi 2 and the rate of refoncalization of OFI grafting functions to NFI2, where b and d are real numbers greater than 0,
  • the grafting functions T F , T and T A are chosen from the grafting functions of the nanoplateform of Formula b, in particular NFI2, b. a step of binding a fluorophore by the possible bringing into contact of a linker precursor L F 'of Formula 1,
  • step b taking place according to the following diagram
  • Formula H Formula J Formula K c. a step of grafting an antitumor active molecule by the possible bringing into contact of said nanoplateform of Formula K with a linker precursor L 'of Formula 2
  • step c taking place according to the following diagram
  • Formula K Formula L Formula M d. a possible step of binding an addressing agent by the possible bringing into contact of said active nanoplateform of Formula M with a linker precursor L A 'of Formula 3,
  • the refoncalization step is not total. There may remain OFI and COOFI grafting functions on the surface of the nanoplate.
  • Formula b and Formula H are two different scripts of the same NPC2 nanoplate.
  • the grafting functions T, T A and T F are chosen from the grafting functions available on the surface of the nanoplateform of Formula b, namely NH 2 , OH and COOH.
  • step a in the above process is:
  • B is the refoncalization rate of the COOH grafting functions in NH 2 , b being a real number greater than 0,
  • the grafting functions T F , T and T A are chosen from the grafting functions of the nanoplateform of Formula bb, in particular NH 2 or Alkyl-NH 2 ,
  • the refoncalization step is not total. There may remain OH and COOH grafting functions on the surface of the nanoplate.
  • Formula bb and Formula H are two different scripts of the same NPC 2 nanoplate.
  • the grafting functions T, T A and T F are chosen from the grafting functions available on the surface of the nanoplateform of Formula bb, ie NH 2 , COOH.
  • step b taking place according to the following diagram
  • Formula H Formula O Formula P c. a step of grafting an active antitumor molecule by contacting said nanoplateform of Formula P with a linker precursor L 'of Formula 2
  • step c taking place according to the following diagram
  • Formula P Formula Q Formula R d. a step of binding an addressing agent by bringing said active nanoplateform of Formula R into contact with a linker precursor L a 'of Formula 3
  • the three molecules of interest are respectively linked by long linkers to the nanoplate, the three linkers may be identical or different to each other as required for the active nanoplateforms.
  • step a in the above process is: a step of refoncalization by contacting an NPCi nanoplateform of Formula a-b,
  • an organic molecule of the aw diaminoalkane type having two amine functional groups, preferably two primary and / or secondary amine functional groups and even more preferably two primary amine functional groups, to obtain an NPC 2 nanoplateform of Formula b or of Formula T,
  • step b taking place according to the following diagram
  • Formula T Formula U c. a step of grafting an antitumor active molecule by contacting said nanoplateform of Formula U with a linker precursor L 'of Formula 2
  • step c taking place according to the following diagram
  • step a in the above process is: a refunctionalization step by contacting an NPC1 nanoplate of Formula ab,
  • an organic ⁇ -diaminoalkane-type molecule of 1 to 10 carbon atoms comprising two primary amine functional groups, in particular 1,2-ethylenediamine, to obtain an NPC2 nanoplateform of Formula b-b or of Formula T,
  • Formula a with an organic molecule of the aw diaminoalkane type having two amine functional groups, preferably two primary and / or secondary amine functional groups and even more preferably two primary amine functional groups, to obtain an NPC 2 nanoplateform of Formula b or of Formula Y,
  • step b taking place according to the following diagram
  • step a in the above process is:
  • Formula a-b with an organic ⁇ -diaminoalkane-type molecule of 1 to 10 carbon atoms, comprising two primary amine functional groups, in particular 1,2-ethylenediamine, to obtain an NPC2 nanoplateform of Formula b-b or of Formula Y,
  • an organic molecule of the aw diaminoalkane type comprising two amine functional groups, preferably two primary and / or secondary amine functions and even more preferably two primary amine functional groups, to obtain an NPC 2 nanoplateform of Formula b or of Formula AA,
  • step b taking place according to the following diagram
  • step c taking place according to the following diagram
  • step a in the above process is:
  • the method of preparation as described above comprises before the possible step of reconditioning an NPC1 nanoplate,
  • the initial nanoplateform (NPC1) is synthesized from organic molecules that can be biosourced. This synthesis makes it possible to obtain the nanoplateforms directly. If there is no stage of refonctionnalisation, the nanoplateforms obtained following this synthesis are those used to graft the molecules of interest.
  • the method of preparation as described above comprises before the possible step of refocusing an NPCi nanoplate,
  • the initial nanoplateform (NPCi) is synthesized from organic molecules that can be biosourced. This synthesis makes it possible to obtain the nanoplateforms directly.
  • the method of preparation as described above comprises,
  • the method of preparation as described above comprises,
  • nanoplateform NPC1 of Formula ab by contacting said nanoplateform NPC1 of Formula ab with an excess of 1, 2-ethylenediamine at a temperature of 100 to 180 ° C for 2 to 24 hours, especially 12 hours, to obtain a nanoplateform NPC2 of Formula b.
  • the alkyl group is: ethyl (-CH 2 -CH 2 -).
  • the initial nanoplate (NPCi) after being synthesized is refunctionalized with an amino compound to increase the number of primary amine grafting functions on the surface of the nanoplate.
  • This step can be carried out with a primary diamine.
  • This primary diamine may be 1,2-diaminoethane (1,2-ethylenediamine), 1,3-diaminopropane or 1,4-diaminobutane.
  • the rate of refonalisation is 95%.
  • Formula a b a step of refonalisation of said NPCi nanoplateform of Formula a, by contacting said nanoplateform NPCi with Formula (a) with an excess of 1, 2-ethylenediamine at a temperature of 100 to 150 ° C for 2 to 24 hours, especially 12 hours, to obtain an NPC 2 nanoplateform of Formula b or of Formula AE,
  • Formula a Formula b c a step of binding a fluorophore by bringing into contact a fluorophore F consisting of Rhodamine B, with said nanoplateform NPC 2 of Formula AE,
  • step c taking place according to the following diagram
  • Formula AE Formula AF d. a step of grafting an antitumor active molecule by contacting said nanoplateform of Formula AF with a linker precursor L ', of the succinic anhydride and a base, of Na 2 CO 3 , to obtain the Formula nanoplateform AG
  • Formula ab b a step of refoncalization of said NPCi nanoplateform of Formula ab, by contacting said NPCi nanoplateform of Formula ab with an excess of 1,2-ethylenediamine at a temperature of 100 to 180 ° C for 2 to 24 hours, in particular 12 hours, to obtain a nanoplateform NPC 2 of formula bb or of Formula AE,
  • Formula ab Formula bb c a step of binding a fluorophore by bringing into contact a fluorophore F consisting of Rhodamine B, with said nanoplateform NPC 2 of Formula AE,
  • step c taking place according to the following diagram NH - Rhodamine B Rhodamine B i -NH 2
  • Formula AE Formula AF d. a step of grafting an antitumour active molecule by contacting said nanoplateform of Formula AF with a linker precursor L ', succinic anhydride and a base, in particular sodium carbonate or diisopropylethylamine, to obtain the nanoplateform of Formula AG
  • the invention relates to an active nanoplateform in which the NPC2 nanoplateform
  • the invention relates to an active nanoplateform in which the NPC2 nanoplateform
  • the present invention also relates to the use of the active nanoplateform previously described as a medicament.
  • the present invention also relates to the active nanoplateform previously described for its use as a medicament.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one active nanoplateform described above in combination with a pharmacologically acceptable excipient.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one active nanoplateform described above, wherein said antitumor active molecule M is chosen from taxanes or anthracyclines, and in combination with a pharmacologically acceptable excipient.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one active nanoplateform described above wherein said antitumor active molecule M is paclitaxel or doxorubicin, and in combination with a pharmacologically acceptable excipient.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one active nanoplateform described above wherein said antitumor active molecule M is paclitaxel, and in combination with a pharmacologically acceptable excipient.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one active nanoplateform as described above, wherein said antitumor active molecule M is chosen from taxanes, more particularly paclitaxel and docetaxel or from anthracyclines, more particularly epirubicin, pirarubicin, idarubicin, zorubicin, aclarubicin and doxorubicin and said active nanoplateform being in association with a pharmacologically acceptable excipient.
  • compositions according to the invention advantageously comprise one or more excipients or vehicles, which are pharmaceutically acceptable.
  • excipients or vehicles which are pharmaceutically acceptable.
  • the compositions may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles that can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, acacia, etc.
  • the compositions may be formulated as injectable solutions or suspensions, gels, tablets, powders, capsules, capsules, etc.
  • the invention which contains, for example, 45 mg of paclitaxel per g of NPC2 (NMR data), also encompasses a pharmaceutical composition formulated in unit dose comprising from 1 g to 15 g of active nanoplate, in particular from 3 g to 12.5 g of active nanoplateforms and preferably from 5 g to 10 g of active nanoplateforms .
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated in unit dose of 1; 1, 5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8; 8.5; 9; 9.5; 10; 10.5; 11; 1 1, 5; 12; 12.5; 13; 13.5; 14; 14.5 and / or 15 g of active nanoplateforms.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition formulated at a dose of active nanoplateforms of 20 mg / kg to 200 mg / kg of body weight (or from 0.88 g / m 2 to 8.8 g / kg of body weight). m 2 of body surface area).
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition formulated at a dose of active nanoplateforms of from 20 mg / kg to 200 mg / kg of body weight, in particular from 40 mg / kg to 180 mg / kg, particularly from 60 mg / kg to 160 mg / kg and preferably 80 mg / kg to 140 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated in a unit dose of 20; 25; 30 ; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 100; 105; 110; 115; 120; 125; 130; 135; 140; 145; 150; 155; 160; 165; 170; 175; 180; 185; 190; 195 and / or 200 mg / kg of active nanoplateforms.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition formulated at a dose of active nanoplate of from 0.88 g / m 2 to 8.8 g / m 2 of body surface, in particular from 1 g / m 2 to 8 g / m 2 , particularly from 3 g / m 2 to 6 g / m 2 and preferably from 3 g / m 2 to 6 g / m 2 .
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated in unit dose of 0.88; 1; 1, 5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8; 8.5 and / or
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition formulated to be administrable by any appropriate route of administration, in particular enterally or parenterally.
  • enteral routes include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intrathecal injection or intratumoral injection.
  • parenteral routes include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intrathecal injection or intratumoral injection.
  • the vaginal, nasal, pulmonary, atrial, ophthalmic or transdermal route of administration is also possible. Injections can be performed as a bolus, and / or by continuous infusion.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated to be enterally administrable selected from the oral, sublingual, perlingual, or rectal route.
  • Preparations for parenteral administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters such as ethyloleate.
  • Aqueous vehicles include water, alcohol / water solutions, emulsions or suspensions.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated to be parenterally administrable chosen from intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal or intratumoral injection.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated to be administrable subcutaneously.
  • Another aspect of the invention relates to active nanoplateforms for their use in the treatment of cancers, especially primary brain tumors, and more particularly glioblastoma and / or brain metastases originating from primary tumors of non-cerebral localization.
  • a more specific aspect of the invention relates to active nanoplateforms for their use in the treatment of glioblastoma and brain metastases from various primary tumors of non-cerebral localization.
  • An aspect of the invention that is even more specific concerns active nanoplateforms for their use in the treatment of glioblastoma.
  • An even more specific aspect of the invention relates to active nanoplateforms for their use in the treatment of brain metastases from different primary tumors of non-cerebral localization.
  • a particular aspect of the invention comprises active nanoplateforms in which the bond between paclitaxel or doxorubicin and the linker L of the nanoplateform of Formula 20 is cleavable and allows the release of paclitaxel or doxorubicin, in particular by hydrolytic breaking. the ester bond between the linker L and paclitaxel or doxorubicin,
  • a very specific aspect of the invention comprises active nanoplateforms in which the bond between the paclitaxel and the linker L of the nanoplateform of Formula 20 is cleavable and allows the release of paclitaxel, in particular by hydrolytically breaking the ester bond between the linker. L and paclitaxel.
  • Another very specific aspect of the invention comprises active nanoplateforms in which the link between the doxorubicin and the linker L of the Formula 20 nanoplate is cleavable and allows the release of doxorubicin, in particular by hydrolytically breaking the ester bond between linker L and doxorubicin.
  • FIG. 1A represents an image of the NPCi or NPC2 nanoplateforms obtained by transmission electron microscopy (TEM).
  • TEM transmission electron microscopy
  • Figure 1 B represents the size distribution diagram of the obtained nanoplateforms, and the curve modeling this distribution by a log-normal function. The distribution is centered around a size of 17 nm.
  • Figure 2 shows the diffractogram of the nanoplateforms NPC1 or NPC2 obtained by DRX (measurements made on powder using a Bruker D2 Phaser X-ray powder diffractometer). The curve is representative of an amorphous compound.
  • FIG. 3A represents the Raman spectrum of the NPC1 or NPC2 nanoplateforms (measurements made on powder using an Explora Raman microscope equipped with an air objective (50x) and operating at 785 nm).
  • the presence of an intense band at 1575 cm 1 (G band of graphite), the absence of a band at 2714 cm 1 (2D band of graphite), and the weak band between 1310 and 1350 cm 1 (Band D of the graphite) graphite) do not suggest the presence of graphite in the sample.
  • FIG. 3B represents the infrared spectrum of the NPC1 or NPC2 nanoplateforms (measurements made on a KBr chip using a PerkinElmer Spectrum 100 Optica spectrometer).
  • Figure 4A shows the XPS spectrum of NPC1 or NPC2 nanopatterns (measurements made on powder using a K-alpha spectrometer) for carbon.
  • Figure 4B shows the XPS spectrum of NPC1 or NPC2 nanopatterns (measurements made on powder using a K-alpha spectrometer) for nitrogen. The peak is centered around a binding energy of 399.8 eV.
  • Figure 4C shows the XPS spectrum of the NPC1 or NPC2 nanopatterns (measurements made on powder using a K-alpha spectrometer) for oxygen.
  • the first peak is centered around a binding energy of 531, 0 eV, the second 532.2 eV and the third 533.2 eV.
  • Figure 5 A shows the emission (dotted curve) and absorption (solid curve) spectra of the nanoplateforms (measurements made in solution in water using a Fluoro-Max fluorometer and a Jasco V-570 UV-Visible spectrometer). respectively) NPC1 or NPC2.
  • FIG. 5B shows the intensity of the fluorescence emission of the NPC1 or NPC2 nanoplateforms as a function of the incident wavelength and the emitted wavelength.
  • the optimum corresponds to an incident wavelength of 360 nm for an emission of 455 nm.
  • Figure 6 shows the emission spectrum of NPCi or NPC2 nanoplatforms, at 37 ° C and with a concentration of 25 ⁇ g / ml in a biological medium (culture medium + fetal calf serum), as a function of time, and with an incident wavelength at 360 nm.
  • Figure 7 shows the colorimetric tests measuring cell survival performed after 72 hours of incubation of NPC2 (A, B and C).
  • the real-time impedance test measuring cell survival is performed for at least 72 h incubation of NPC2 (D, E and F). These tests were performed with doses of 1 to 100 ⁇ g / mL on U-87-MG cells (A and D), HMEC-1 (B and E) and on NHDF (C and F).
  • the Alamar Blue test is represented by a line marked with a triangle.
  • Figure 8 shows the colorimetric tests measuring the survival of the cells, performed after 72 hours of NPC2 incubation. These tests were performed with doses of 1 to 100 ⁇ g / mL on HMEC-1, U-87 MG, GL261 DsRed, OLN-93, C8-D1A cells.
  • Figure 9 shows the internalization of NPC2 in U-87-MG, HMEC-1, and NHDF cells after a 4 h incubation (labeled NPC2 1 ⁇ g / mL and NPC2 5 ⁇ g / mL) with orthogonal views showing the distribution of NPC2 in cell thickness.
  • the internalization of NPC2 by HMEC-1 and NHDF is negligible whereas ITinternalisation in U-87-MG cells is visible. This finding is made from two-photon fluorescence images obtained at 740 nm excitation and 480 to 550 nm emissions after autofluorescence correction, as well as images obtained in transmitted light to locate the cells.
  • FIG. 10 shows the internalisation of NPC2 in U-87-MG, HMEC-1, and NHDF cells after a 4 h incubation and a NPC2 concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • the U-87-MG cells and the NHDF cells do not show a major change in the internalization of the NPC2 compared to FIG. 8.
  • the internalisation of the NPC2 at 25 ⁇ g / ml is improved in the HMEC-cells. 1 as seen from two-photon fluorescence images after autofluorescence correction. Transmitted light images are also provided to locate the cells.
  • Figure 11 shows the internalisation of NPC2 in U-251 MG cells after a 4 h incubation and a NPC2 concentration of 1.5 and / or 25 ⁇ g / mL.
  • the control cells were exposed to the culture medium only.
  • An internalisation of NPC2 in these cells is demonstrated, as shown by the two-photon fluorescence images obtained at excitation of 740 nm and emissions of 480 to 550 nm after correction of autofluorescence. Transmitted light images are also provided to locate the cells.
  • Figure 12 represents the internalization of NPC2 in U-87 MG cells with a NPC2 nanoplate concentration of 0 (controls), 1 or 5 ⁇ g / ml under or without blocking conditions of endocytosis (without blocking, inhibition energy-dependent endocytosis, clathrin inhibitor, caveolin inhibitor, lipid raft inhibitor).
  • NPC2 are internalized in U-87-MG cells after treatment with concentrations of 1 and 5 ⁇ g / mL for 4 hours in the absence of inhibition of endocytosis (positive control).
  • these same cells are cultured at 4 ° C to block energy-dependent endocytosis or endocytosis inhibitors using the caveolin pathway or lipid rafts, we do not find NPC2 inside the cells which shows the involvement of these endocytosis pathways in the cellular internalisation of NPC2.
  • those in the presence of an endocytosis inhibitor using the clathrin pathway remain able to internalize NPC2 at concentrations of 1 and 5 ⁇ g / mL.
  • the transmitted light images are provided to locate the cells. All two-photon fluorescence images obtained at 740 nm excitation with 480-550 nm emission are corrected by subtracting autofluorescence from untreated control cells.
  • Figure 13 shows the comparative cell viability tests between paclitaxel alone (PTX) and active nanoplateforms of Example 3.1 (NPC2-PTX) on HMEC-1 (A) cells; SK-N-SH (B) and U-87 MG (C), and measured by the MTT test, after 72 hours of treatment with a concentration range of 0.1 to 100 nM expressed in PTX or PTX equivalent carried by NPC2, or measured by the real-time impedance test after 72 hours of treatment of HMEC-1 (D) for the active nanoplateforms of Example 3.1.
  • Figure 14 shows the MTT tests measuring cell survival, performed after 72 h incubation of NPC2-PTX. These tests were carried out with doses of 0.1 to 10 mM on the U-87-MG and GL261 cells.
  • Figure 15 shows the pharmacological activity of PTX (A and C) and NPC2-PTX (B and D), analyzed by indirect immunofluorescence of tubulin on HMEC-1 (A and B) cells and U-87 MG (C and D) after 6 hours of treatment with PTX or PTX concentrations carried by NPC2 of 10, 50 and / or 100 nM.
  • Figure 16 represents the pharmacological activity of NPC2-PTX and NPC2, analyzed by indirect immunofluorescence of tubulin on U-87 MG cells after 24 h of treatment with NPC2-bearing NPC2-PTX concentrations of 5 and 10 ⁇ M and NPC2 concentrations of 38 and 76 ⁇ g / ml.
  • Figure 17 shows the pharmacological activity of PTX and NPC2-PTX, determined by light microscopy on U-87 MG cells in 3D culture before treatment (D0) and 7 and 14 days after treatment with concentrations corresponding to IC 5 o calculated in 2D (equitoxic doses), at 2.8 times the IC 5 o and at 4 times the ICso.
  • Figure 18 shows the activity of PTX and NPC2-PTX, measured on U-87 MG cells in 3D culture by the Alamar Blue test 7 days (A) and 14 days after treatment (B). The results are expressed as a percentage of the 100% standardized test.
  • Figure 19 shows the pharmacological activity of NPC2 and NPC2-PTX, determined by light microscopy on spheroidized GL261 cells in 3D culture before treatment (D0) and 7 and 14 days after treatment with NPC2-PTX concentration of 20 ⁇ M and an NPC2 concentration of 153 pg / ml
  • Figure 20 shows the pharmacological activity of NPC2 and NPC2-PTX, determined by light microscopy on spheroidized GL261 cells in 3D culture before treatment (D0) up to 14 days after treatment with NPC2-PTX concentrations of 10 and 20 pM and NPC2 concentrations of 76 and 153 pg / ml
  • FIG. 21 represents the pharmacological activity of NPC2 and NPC2-PTX, determined by light microscopy on spheroidized GL261 cells in 3D culture 14 days after treatment with a NPC2-PTX concentration of 20 mM and a NPC2 concentration of 153 ⁇ g / ml
  • Figure 22 represents body weight monitoring in C57BL / 6 mice up to 14 days after treatment with a dose of NPC2-PTX of 11 mg / kg and a dose of NPC2 of 2 mg / kg
  • citric acid monohydrate (5.25 g, 25.0 mmol) is dissolved in distilled water (5 ml) and then diethylenetriamine is added dropwise (3 ml). 0 ml, 2.87 g, 27.6 mmol).
  • the resulting yellow aqueous solution is heated with a microwave oven for 2 minutes at 600 W power.
  • ethanol 25 ml is added and the residue is scraped with a spatula until a light brown powder is formed.
  • the homogeneous suspension is centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes.
  • the brownish powder at the bottom of the centrifuge cylinder is collected and washed with ethanol and then with diethyl ether giving 4.8 g of initial nanopatform NPCi brown powder after complete drying in vacuo or a mass yield of 60%.
  • NPC1 nanoplateforms (200 mg) are dissolved in 1 ml of ethylenediamine. This solution is maintained at a temperature of 115 ° C. with stirring for 12 hours. The brown solution obtained is cooled to ambient temperature and then added dropwise to 20 ml of dichloromethane with stirring. A suspension is then obtained. This is centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes. The pellet is resuspended in 20 ml of dichloromethane using ultrasound for 5 minutes and then centrifuged again under the same conditions as above. This process is repeated 3 rd time. The brown powder obtained is then dried under vacuum (0.1 torr) at 50 ° C. for 2 hours.
  • NPC2 nanoparticles in powder form are mechanically "anchored” in an ultra-pure indium matrix (by pressure), then the whole is analyzed by a K-alpha spectrometer.
  • nanoplate powder as obtained previously is added in 64 mg of water. The solution is stirred for a few minutes. With an addition of 16.7 mg nanoplate, the solution after shaking is strongly colored and clear to the eye. The solubility of the nanoplateforms is therefore greater than 250 g / l.
  • the hardness of the NPC2 nanoplateform was measured by atomic force microscopy (AFM).
  • the atomic force microscope used is a Bruker Dimension Icon model and the tip used is a ScanAsyst-Air tip with a 2 nm radius of curvature.
  • the Young's modulus is measured using the peak force mode of the apparatus.
  • An aqueous solution of nanoplateforms is deposited on a microscope glass slide, then the Young's modulus of the sample is measured and compared to two references: a polystyrene film which has a Young's modulus of 3-3.5 GPa and a PDMS film which has a Young's modulus of 3.5 MPa.
  • Several nanoplateform deposits were made.
  • the measured Young's modulus values for the various samples are between 1 and 4 GPa. It can therefore be concluded that the nanoplateforms have a hardness close to that of polystyrene (organic polymer).
  • the density of the nanoplate is measured on an AccuPyc II 1340 pycnometer from nanoplateforms in powder form and according to the helium gas expansion technique. Ten successive measurements are made, then the value of the density is calculated as the average of these ten measurements, a density of 1.53.
  • the measurement of the "dry" size of the nanoplateforms is made on a transmission electron microscope (HITACHI H7650 at 80 kV).
  • a drop of aqueous solution of nanoplateforms is deposited on a copper grid (covered with a carbon film) previously positively charged according to the "Glow discharge” technique (in order to increase the affinity of the nanoplateforms for the grid).
  • the excess aqueous solution is removed by capillarity using an absorbent paper and then a drop of an aqueous solution of uranyl acetate is added to the grid for one minute. After this time, the excess of the aqueous solution of uranyl acetate is removed by capillarity by means of an absorbent paper.
  • the operation is repeated twice for the contrast agent (uranyl acetate), then the dry grid is ready for observation.
  • the size of the nanoplateforms is measured randomly on several snapshots using the ImageJ software (number of particles measured> 400).
  • the average size obtained by TEM of the nanoplateforms is 17 nm.
  • Nanoplatforms in powder form are analyzed on a Bruker D2 Phaser X-ray powder diffractometer.
  • the graphite has a very fine and intense line corresponding to the plane (002) at small angles (2Q ⁇ 26 °), and as the spectrum of X-ray diffraction of the nanoplateforms in FIG. 2, there is no trace of this characteristic line of graphite.
  • Nanoplatforms in powder form are dispersed on a microscope slide, and Raman spectra are measured on this slide using the Explora Raman microscope using an air lens (50x) and a 785 nm laser.
  • the graphite is characterized by several bands in Raman spectroscopy, the G band which is at 1575 cm 1 , the D band which is between 1310 and 1350 cm 1 , and the 2D band which is at 2714 cm 1 (for a laser at 785 nm)
  • the XRD and Raman measurements suggest the substantially amorphous character of the nanoplate.
  • aqueous nanoplate solution typically a few mg / ml
  • 100 ⁇ l of an aqueous solution of KCN containing pyridine Kaiser aldrich test kit
  • 100 ⁇ l of a solution are mixed together.
  • phenol alcohol 80% in ethanol, Kaiser aldrich test kit
  • 100 ⁇ l of an alcoholic solution of ninhydrin 6% in ethanol, Kaiser aldrich test kit
  • the mixture is heated at 120 ° C for 5 minutes and then allowed to cool to room temperature.
  • 20 ⁇ l of the solution obtained above are diluted in 2 ml of ethanol, and then the absorbance at 580 nm of this new solution is measured.
  • the concentration of primary amine reacted with ninhydrin is deduced from the value of the absorbance and thus reflects the amount of reactive primary amine present on the surface of the nanoplateforms.
  • the value obtained is 0.7 pmol of reactive NH 2 per mg of nanoplateforms.
  • the rate of primary amine grafting functions is 3.3 pmol of reactive NH 2 per mg of refunctionalized nanoplateforms.
  • the absorbance of a freshly prepared aqueous solution of nanoplateforms is measured on a JASCO spectrometer V-570 at room temperature, in a quartz tank with a 1 cm optical path.
  • the maximum absorbance of the nanoplateforms is at the wavelength of 360 nm.
  • the fluorescence emission of the nanoplateforms is measured on the same solution of nanoplateforms after prior dilution thereof until an absorbance of less than 0.15 at 360 nm is reached. Fluorescence is recorded on a Fluoro-Max fluorometer (Horiba) and the maximum emission wavelength is 455 nm.
  • the stability of the nanoplateforms is monitored by the evolution of the fluorescence emission under an incident wavelength of 360 nm.
  • the results of FIG. 5 show a decrease in the intensity of fluorescence emitted over time during the first 24 hours before reaching a plateau after 48 hours.
  • Cetuximab, anti-EGFR antibody or Bevacizumab anti VEGF antibody cetuximab, anti-EGFR antibody or Bevacizumab anti VEGF antibody
  • the active antitumour molecule M Paclitaxel, Docetaxel, Etoposide, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Pirarubicin, Zorubicin, Aclarubicin,
  • a solution of nanoplateforms NPC2 in DMSO (1.0 equivalent, 50 g / l) is prepared and then succinic anhydride is added (0.5 equivalents). The solution is stirred at room temperature overnight, then the DMSO is removed by lyophilization. The traces of DMSO are removed by precipitating the nanoplateforms in dichloromethane. The powder obtained is dried under vacuum. The nanoplateforms obtained now carry the succinic linker.
  • a solution of nanoplates carrying the succinic linker in DMSO (1.0 equivalents, 100 g / l) is prepared, then a solution of EDC.HCl in DMSO (0.5 equivalents, 0.2 mol / l) is added. The solution is stirred at ambient temperature for 5 minutes and then a solution of / V-hydroxysuccinimide (NHS) in DMSO (0.5 equivalents, 0.2 mol / l) is added. The solution is stirred at room temperature overnight then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate. The suspension is stirred vigorously for 5 minutes, then the precipitate is recovered by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and then washed 3 times with dichloromethane. Residual traces of solvent are removed under reduced pressure. The powder obtained corresponds to the nanoplateform comprising the NHS-activated succinic linker.
  • Nanoplatforms with NHS-activated succinic linker are dissolved in a solution of DMSO (1.0 equivalent of activated linker, 50 mg / L) with 1.0 equivalents of A /, / V-diisopropylethylamine and 1.0 equivalent of
  • DMSO 1.0 equivalent of activated linker, 50 mg / L
  • 1.0 equivalents of A /, / V-diisopropylethylamine 1.0 equivalent of
  • This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate.
  • the precipitate obtained is collected by centrifugation and then washed with dichloromethane 3 times.
  • the solid residue obtained is dissolved in a volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed three times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the molecule of antitumor activity M linked by a succinic linker.
  • aqueous antibody solution (6 ⁇ mol / L) containing periodate (10 mM) is stirred for 30 minutes in the dark at room temperature and then the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under compressed air pressure (4 mmol). bar). The solution retained by the filter is washed three times with distilled water and can be used as such or frozen and lyophilized.
  • NPC2-L nanoplate-bearing succinic linker
  • 0.1 equivalents of hydrazine hydrate is added.
  • the solution is heated by microwaves for 90 seconds at 900 W.
  • the solution is frozen and freeze-dried. Nanoparticles now carry hydrazide functions.
  • Nanoparticles carrying hydrazide functions are dissolved (1.0 equivalent of hydrazide) in an aqueous solution of activated antibody (1.0 equivalent, 6 pmol / L). The solution is stirred gently for 4 h in the dark at room temperature, and then a slight excess of NaBH 3 CN (1.1 equivalent) is added. The solution is stirred an additional hour in the dark at room temperature. Once the reduction reaction is complete, the aqueous solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with distilled water and is then frozen and lyophilized. The nanoparticles are now carriers of the antibody binding agent A bound by a linker.
  • the nanoplatforms with NHS-activated succinic linker are dissolved in a solution of DMSO (1.0 equivalent of activated NHS linker, 50 mg / L) with 1.0 equivalents of A /, / V-diisopropylethylamine and 0.1 equivalent of This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the nanoplate to precipitate.
  • the precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times.
  • the solvent residues are evaporated under reduced pressure.
  • the solid residue obtained corresponds to the nanoplateform carrying the peptide A addressing agent.
  • Example 9 Synthesis of the Active Nanoparticles NPC TM (LM) -LA (Antibodies) To a solution of nanoplateforms with the antibody targeting agent (NPC2-L-A (antibody)) in DMSO (1.0 equivalent of free linker, 50 mg / L) is added a catalytic amount of 4-dimethylaminopyridine, 1.0 equivalent of N, N'-diisopropylethylamine and 1.0 equivalent of the antitumour active molecule M. In the case where the antitumour active molecule M is in the hydrochloride form, an additional 1.0 equivalent of diisopropylethylamine is added for each hydrate equivalent.
  • the solution is stirred for 5 minutes and then a slight excess of EDC.HCl in solution in DMSO (1.1 equivalent, 0.2 mol / L) is added.
  • the solution is stirred at room temperature overnight then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate.
  • the suspension is stirred gently for 5 minutes, then the precipitate is recovered by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed 3 times with dichloromethane. Residual traces of solvent are removed under reduced pressure.
  • the solid residue is dissolved in a volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the antibody addressing agent A and the antitumour activity molecule M both linked by a linker.
  • nanoplateforms with the peptide targeting agent (NPC2-L-A (peptide)) in DMSO 1.0 equivalent of free linker, 50 mg / L
  • 1.0 equivalent of / V, / V-diisopropylethylamine 1.0 equivalent of the antitumor active molecule M.
  • the antitumour active molecule M is in the form of hydrochloride
  • 1.0 equivalent of diisopropylethylamine is added for each equivalent of hydrochloride. This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate.
  • the precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times. The solvent residues are evaporated under reduced pressure. The solid residue obtained is dissolved in a volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the peptide A addressing agent and the antitumour activity molecule M.
  • Rhodamine B in DMSO 1.0 equivalent, 100 g / L
  • EDC.HCl in DMSO 1.1 equivalent, 0.2 mol / L
  • the solution is stirred at room temperature for 5 minutes and then a solution of N-hydroxysuccinimide in DMSO (1.0 equivalent, 0.2 mol / l) is added.
  • the solution is filtered on cotton and the filtrate is frozen and freeze-dried.
  • the powder obtained is used as it is, and corresponds to Rhodamine B with the activated ester NFIS.
  • Nanoparticles carrying hydrazide functions are dissolved (1.0 equivalents of hydrazide) in a solution of fluorophore F in DMSO (1.0 equivalent, 1 mol / L). This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate. The precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times. The solvent residues are evaporated under reduced pressure. The solid residue is dissolved in a volume of water and the aqueous solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with distilled water and is then frozen and lyophilized. The nanoparticles are now carriers of fluorophore F linked by a linker and free linker.
  • Nanoparticles carrying the fluorophore F are dissolved in the DMSO (1.0 equivalent of free linker, 50 mg / l), then a catalytic amount of 4-dimethylaminopyridine, 1.0 equivalent of A / V-diisopropylethylamine and 1.0 equivalent of the M antitumor active molecule.
  • M is in the form of hydrochloride
  • 1.0 equivalent of diisopropylethylamine is added for each equivalent of hydrochloride.
  • the solution is stirred for 5 minutes and then a slight excess of EDC.FICI in solution in DMSO (1.1 equivalent, 0.2 mol / L) is added.
  • the solution is stirred at ambient temperature overnight and then dichloromethane is added in order to precipitate the nanoparticles, causing the precipitation of the nanoplate.
  • the suspension is stirred gently for 5 minutes, then the precipitate is recovered by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed 3 times with dichloromethane. Residual traces of solvent are removed under reduced pressure.
  • the solid residue obtained is dissolved in 20 ml of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the fluorophore F and the antitumour activity molecule M.
  • Nanoparticles carrying the succinic linker and hydrazide functions are dissolved (1.0 equivalents of hydrazide) in a solution of fluorophore F in the DMSO (0.5 equivalents, 1 mol / L). This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate. The precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times. The solvent residues are evaporated under reduced pressure.
  • the solid residue obtained is added to an aqueous solution of activated antibody (0.5 equivalents, 6 pmol / L), then the solution is gently stirred for 4 hours in the dark at room temperature. A slight excess of NaBH 3 CN (1.1 equivalent) is added and the solution is stirred an additional hour in the dark at room temperature.
  • the aqueous solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with distilled water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the nanoplateform comprising the fluorophore F and the antibody addressing agent A.
  • the solid residue obtained is dissolved in DMSO (1.0 equivalent of linker-NHS, 50 mg / L) with 1.0 equivalents of A / V-diisopropylethylamine and 1.0 equivalent of the peptide A targeting agent. This solution is stirred. at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the nanoplate to precipitate. The precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times. The solvent residues are evaporated under reduced pressure. The residue is dissolved in one volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed three times with water and is then frozen and lyophilized. The powder obtained corresponds to the nanoplateform comprising the fluorophore F and the peptide A addressing agent.
  • Example 16 Synthesis of Active Nanoparticles NPC2- (LF) - (LM) -LA (Antibodies) Nanoparticles carrying hydrazide functions are dissolved (1.0 equivalents of hydrazide) in a solution of fluorophore F in DMSO (0.5 equivalents, 1 mol / L). This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate. The precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times. The solvent residues are evaporated under reduced pressure.
  • the solid residue obtained is dissolved in an aqueous solution of activated antibody (0.5 equivalents, 6 pmol / L), then the solution is stirred gently for 4 hours in the dark at room temperature. A slight excess of 3N NaBH 3 (1.1 equivalent) is added and the solution is stirred an additional hour in the dark at room temperature. Once the reduction reaction is complete, the aqueous solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with distilled water and is then frozen and lyophilized.
  • the solid residue obtained is dissolved in DMSO (1.0 equivalent of free linker, 50 mg / L) with a catalytic amount of 4-dimethylaminopyridine, 1.0 equivalents of / V, / V-diisopropylethylamine and 1.0 equivalents of the antitumour active molecule M.
  • DMSO 1.0 equivalent of free linker, 50 mg / L
  • 4-dimethylaminopyridine 1.0 equivalents of / V, / V-diisopropylethylamine
  • 1.0 equivalents of the antitumour active molecule M is in the form of hydrochloride
  • 1.0 equivalent of diisopropylethylamine is added for each equivalent of hydrochloride.
  • the solution is stirred for 5 minutes and then a slight excess of EDC.HCl in solution in DMSO (1.1 equivalent, 0.2 mol / L) is added.
  • the solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane is added, causing the nanoplate to precipitate.
  • the suspension is stirred gently for 5 minutes, then the precipitate is recovered by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed 3 times with dichloromethane. Residual traces of solvent are removed under reduced pressure.
  • the solid residue is dissolved in a volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is three times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the fluorophore F, the antibody targeting agent A and the antitumour activity molecule M.
  • the solid residue obtained is dissolved in DMSO (1.0 equivalent of linker-NHS, 50 mg / L) with one equivalent of / V, / V-diisopropylethylamine and 0.1 equivalent of the addressant peptide A and 0.9 equivalent of the antitumour active molecule M.
  • This solution is stirred at room temperature overnight then dichloromethane is added, causing the precipitation of the nanoplate.
  • the precipitate obtained is collected by centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) and washed with dichloromethane 3 times.
  • the solvent residues are evaporated under reduced pressure.
  • the resulting residue is dissolved in one volume of water and the solution is filtered by ultracentrifugation with a 1 kDa filter under air pressure (4 bar). The solution retained by the filter is washed 3 times with water and is then frozen and lyophilized.
  • the powder obtained corresponds to the nanoplateform comprising the fluorophore F, the peptide A addressing agent and the anti
  • the reaction mixture is stirred at room temperature for 60 h, then water is added to destroy the unreacted EDC.
  • the solvent mixture water and DMF
  • the solvent mixture is evaporated under reduced pressure and the powder obtained is washed with acetone and is harvested by centrifugation.
  • the solid obtained is purified on a column of Sephadex LH20 using water as eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and then evaporated under reduced pressure.
  • a solution of nanoparticles carrying the long linker in DMSO (100 g / L, 1 mL) is prepared, as described above, then a solution of EDC.FICI in DMSO (0.178 mol / L, 0.27 mL) is added. The solution is stirred at ambient temperature for 5 minutes and then a solution of N hydroxysuccinimide in DMSO (0.174 mol / L, 0.26 mL) is added. The solution is stirred at ambient temperature for 21 h and then dichloromethane (12 mL) is added in order to saturate the DMSO in dichloromethane and to precipitate the active nanoplateforms.
  • Nanoplatforms with the NFIS-activated long linker can be dissolved in a solution of DMSO containing potassium carbonate and doxorubicin hydrochloride. This solution is stirred at room temperature overnight and then dichloromethane can be added. The precipitate obtained is collected by centrifugation and washed with dichloromethane 3 times.
  • the residue is purified on Sephadex LH20 with water as eluent.
  • the aqueous phases containing the pure product are combined and the solvent is removed by lyophilization.
  • the solid residue obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the active molecule doxorubicin linked by a long linker.
  • a solution of nanoplateforms in DMF (25 g / L, 4 mL) is prepared, and then sodium carbonate is added (424 mg).
  • the solution is heated to 61 ° C. and once this temperature is reached, lissamine rhodamine B is added (1.5 mg).
  • the solution is stirred at 61 ° C overnight and the DMF is evaporated under reduced pressure and the resulting residue is neutralized with hydrochloric acid (pH ⁇ 1).
  • the aqueous solution is concentrated under reduced pressure and the residue is solubilized in ethanol, centrifuged and the supernatant is collected in order to remove the insoluble salts in ethanol. After the ethanol is removed under reduced pressure, the resulting powder (69 mg) is dried under vacuum.
  • the nanoplateforms obtained now carry the fluorophore lissamine rhodamine B with the short linker.
  • the nanoplatforms with fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) are then dissolved in DMSO, and then sodium carbonate is added (424 mg). The suspension is stirred at room temperature for 5 minutes and then succinic anhydride (100 mg) is added. The solution is stirred at room temperature overnight and then water is added followed by hydrochloric acid until the pH of the solution reaches ⁇ 1. The solution is concentrated under reduced pressure and the residual solvents are removed by lyophilization. The resulting residue is dissolved in absolute ethanol and the insoluble salts are removed by centrifugation.
  • the supernatant alcohol phase is harvested and then evaporated under reduced pressure until a powder is obtained. Traces of residual succinic acid are removed by washing the solid residue obtained with chloroform and then with acetone. The residual powder (38 mg) is dried under vacuum.
  • the nanoplatforms carrying the fluorophore lissamine rhodamine B with the short linker obtained are now carriers of the long linker.
  • a solution of the nanoplateforms with fluorophore lissamine rhodamine B and the long linker in DMF (12.5 g / L, 2 mL) is prepared, followed by paclitaxel (3 mg), DMAP (catalytic amount) and EDC.HCI ( 6.18 mg) are added.
  • the solution is stirred at ambient temperature for 60 h and then water is added.
  • the solution is concentrated under reduced pressure and the residual powder obtained is washed with acetone. Once dried, the powder obtained is purified on Sephadex LH20 using water as eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and the water is removed by lyophilization.
  • the powder obtained (22.9 mg) corresponds to the active nanoplateform comprising the fluorophore Lissamine rhodamine B linked by a short linker and the active molecule paclitaxel linked by a long linker. Synthesis of an active nanoplateform with addressing agent with long linker and active molecule with long linker.
  • the reaction mixture is stirred at room temperature for 60 h, then water is added to destroy the unreacted EDC.
  • the solvent mixture water and DMF
  • the solvent mixture is evaporated under reduced pressure and the powder obtained is washed with acetone and is harvested by centrifugation.
  • the solid obtained is purified on a column of Sephadex LH20 using water as eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and then evaporated under reduced pressure.
  • the nanoplatforms with the active succinic linker molecule can then be dissolved in DMF, followed by a diester derivative of the RGD peptide and EDC. HCI are added.
  • the reaction mixture is stirred at room temperature for 60 h, then water is added to destroy the unreacted EDC.
  • the solvent mixture water and DMF
  • the solvent mixture is evaporated under reduced pressure and the powder obtained is washed with acetone and is harvested by centrifugation.
  • the solid obtained is purified on a column of Sephadex LH20 using water as an eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and then evaporated under reduced pressure.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the addressing agent linked by a long linker and the active molecule linked by a long linker.
  • a solution of nanoplateforms in DMF (25 g / L, 4 mL) is prepared, and then sodium carbonate is added (424 mg).
  • the solution is heated to 61 ° C. and once this temperature is reached, lissamine rhodamine B is added (1.5 mg).
  • the solution is stirred at 61 ° C overnight and the DMF is evaporated under reduced pressure.
  • the residue obtained is neutralized with hydrochloric acid (pH ⁇ 1).
  • the aqueous solution is concentrated under reduced pressure and the residue is solubilized in ethanol, centrifuged and the supernatant is collected in order to remove the insoluble salts in ethanol. After the ethanol is removed under reduced pressure, the resulting powder (69 mg) is dried under vacuum.
  • the nanoplateforms obtained now carry the fluorophore lissamine rhodamine B with the short linker.
  • the nanoplatforms with fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) are then dissolved in DMSO, and then sodium carbonate is added (424 mg).
  • the suspension is stirred at room temperature for 5 minutes and then succinic anhydride (100 mg) is added.
  • the solution is stirred at room temperature overnight and then water is added, followed by hydrochloric acid until the pH of the solution reaches ⁇ 1.
  • the solution is concentrated under reduced pressure and the residual solvents are removed by lyophilization.
  • the resulting residue is dissolved in absolute ethanol and the insoluble salts are removed by centrifugation.
  • the supernatant alcoholic phase is collected and then evaporated under reduced pressure until a powder is obtained. Traces of residual succinic acid are removed by washing the solid residue obtained with chloroform and then with acetone. The residual powder (38 mg) is dried under vacuum.
  • the nanoplatforms carrying the fluorophore lissamine rhodamine B with the short linker obtained are now carriers of the long linker.
  • a solution of the nanoplateforms with fluorophore lissamine rhodamine B and the long linker in DMF (12.5 g / L, 2 mL) is prepared, followed by paclitaxel (3 mg), DMAP (catalytic amount) and EDC.HCI ( 6.18 mg) are added.
  • the solution is stirred at ambient temperature for 60 h and then water is added.
  • the solution is concentrated under reduced pressure and the residual powder obtained is washed with acetone, and once dried is purified on Sephadex LH20 using water as eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and the water is removed by lyophilization.
  • the powder obtained (22.9 mg) corresponds to active nanoplateforms bearing fluorophore lissamine rhodamine B (short linker) with paclitaxel (long linker).
  • Nanoplatforms with the active molecule linker long and the short linker fluorophore are then dissolved in DMF, followed by a diester derivative of the RGD peptide and EDC.HCl.
  • the reaction mixture is stirred at room temperature for 60 h, then water is added to destroy the unreacted EDC.
  • the solvent mixture water and DMF
  • the solvent mixture is evaporated under reduced pressure and the powder obtained is washed with acetone and is harvested by centrifugation.
  • the solid obtained is purified on a column of Sephadex LH20 using water as eluent.
  • the aqueous phases containing the good product are combined and then evaporated under reduced pressure.
  • the powder obtained corresponds to the active nanoplateform comprising the addressing agent and the active molecule, each linked by a long linker and the fluorophore linked by a short linker.
  • the goal is to measure the cell survival rate in the presence of a range of NPC2 and determine the impact of these nanoplateforms on cell viability.
  • the adherent cells are treated with a range of concentrations (1, 5, 25, 50, 75 and 100 ⁇ g / ml) of NPC2 dispersed in the culture medium.
  • the total volume is maintained at 200 ⁇ L per well and each condition is performed in quadruplicate (impedance test) and / or quintupled (colorimetric test).
  • a cell viability test is performed either by a colorimetric test after 72 hours of treatment, or by an impedance test over a period of at least 72 hours. All colorimetric tests were repeated 3 times for each line, while the impedance test was repeated 2 times on the U-87-MG and HMEC-1 lines and was done once on the NDHF line.
  • This test uses as reagent 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), which is converted into formazan (crystal violet) by living cells. The latter absorbing at the wavelength of 600 nm is detectable by an absorbance measurement.
  • the cells after undergoing the above treatment with NPC2, are incubated with 200 ⁇ L of 0.5 mg / mL MTT reagent dispersed in the culture medium (Correard, F., et al (2014). Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) for 3 to 4 hours at 37 ° C. Since the formazan crystals are visible in the cells under a light field microscope, the medium is replaced by 200 ⁇ L of dimethylsulfoxide (DMSO). The cells are then lysed, the dissolved formazan crystals and the absorbance is measured with a Multiskan Spectrophotometer (Ascent, Labtec Systems) with a 600 nm filter.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the percentage of viability is obtained by comparing the absorbance value of the treated cells with the absorbance value of the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • the cells after undergoing the above treatment with NPC2, are incubated with 20 ⁇ l of Alamar Blue reagent; that is 10% of the volume of medium (Pasquier, E., et al., 2013) Angiogenesis, 2013 Apr; 16 (2): 373-86) for 4 to 5 h at 37 ° C.
  • the absorbance is then measured with a POLARstar Omega microplate reader (BMG LABTECH) with a 570 nm filter and a 595 nm filter.
  • the percentage of viability is obtained by comparing the level of fluorescence emitted by the reduced Alamar Blue reagent in the treated cells with the level present in the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • This test is based on protein biomass and uses an anionic sulforhodamine B probe, which binds strongly to proteins. Inhibition of cell growth is measured using a sulforhodamine B assay kit (Sigma Aldrich) as previously described in: Berges, R., et al. (2016). Mol Cancer Ther. 2016 Nov; 15 (11): 2740-2749.
  • the cells after having been treated as above with NPC2, are fixed at 4 ° C. with 50 ⁇ l of cold 10% trichloroacetic acid (TCA). The cells are then washed several times with deionized water to remove any trace of medium and / or TCA. The cells are then dried to remove all traces of water and 50 ⁇ l of sulforhodamine B is added to each well. The cells are incubated for 30 min, then rinsed 4-5 times with 10% acetic acid and dried in the open air. A volume of 200 ⁇ l of Tris base at 10 mM is added to each well and the microplate is shaken weakly to homogenize the anionic sulforhodamine B probe.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the absorbance is then measured with a POLARstar Omega microplate reader (BMG LABTECH) with a filter. at 565 nm and a filter at 620 nm to eliminate background noise.
  • BMG LABTECH POLARstar Omega microplate reader
  • the percentage of cell viability is obtained by comparing the absorbance linked to the treated cells with the absorbance linked to the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • the impedance test is based on a real-time measurement of the resistance induced by a cell monolayer grown on a gold electrode, which shows a variation as the cells detach from the surface.
  • the impedance measurement is performed with an impedance meter (Xcelligence, ACEA Biosciences), and provides quantitative information on the state of living cells (adhesion, proliferation, mortality) continuously and in real time.
  • E-plate 96 A 96-well plate coated with gold electrodes (E-plate 96) is seeded in the manner described above (see Table Z) in a volume of 100 ⁇ L.
  • the impedance measurement reaches a plateau, the plate is removed from the meter, the culture medium is removed, and the cells are treated with NPC2 as described above. The plate is then reinserted into the reader and the impedance is measured every 15 minutes for at least 72 hours.
  • the percentage of cell viability is obtained by comparing the impedance measurement of the treated cells with the measurement of impedance of the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from the number of independent experiments conducted for each cell line under consideration.
  • HMEC-1 cells show a slight 20% decrease in cell viability at concentrations greater than 50 ⁇ g / mL with the MTT assay ( Figure 7B), which is also observed at concentrations greater than 25 ⁇ g / mL with impedance test ( Figure 7E).
  • the decrease in maximum cell viability observed is 20% for the maximum concentration of 100 ⁇ g / ml of NPC2 after 72 hours of treatment. This demonstrates very satisfactorily the low toxicity of these nanoplatforms vis-à-vis the human cell lines cancerous and / or non-cancerous tested.
  • U-251 MG cells are also used. They are transfected with dsRed (Alves, I.D., et al., (2014) Biochimica and Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1838 (8): 2087-2098) and grown in:
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the culture medium is replaced with culture medium containing NPC2 (1, 5 and / or 25 ⁇ g / ml in a volume equivalent to that of the seeding).
  • the cells are then incubated for 4 h at 37 ° C before the medium is removed and the cells fixed for 2-photon microscopy. This experiment is repeated 3 times with the U-87-MG cells and 2 times with the U-251 MG, HMEC1 and NHDF cells. Repetitions are performed with different cell passages
  • the cells are washed several times with Phosphate Buffer Saline (PBS), fixed with 4% paraformaldehyde in PBS (15 min at room temperature) and rinsed twice with PBS.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the fixed cells are stored at 4 ° C in PBS.
  • emission wavelength ranging from 480 nm to 550 nm (480 nm ⁇ £ em 550 nm).
  • a 20x dry lens is used.
  • the average fluorescence intensity and standard deviation of control cells not treated with NPC2 are used to determine the autofluorescence contribution threshold in NPC2 treated cells using MATLAB. Only fluorescence intensities greater than at least once the standard deviation of the control mean intensity are displayed using MATLAB.
  • NPC2 are preferentially internalized in cancer cells.
  • the goal is to determine the cellular mechanism implemented.
  • the cells are treated with 1 and / or 5 ⁇ g / ml of NPC2 and incubated for 4 h at 4 ° C. and then rinsed with PBS and fixed in order to carry out the procedure. observation by 2-photon microscopy (see Example [20]). Inhibition of different endocytic pathways
  • the cells are treated with:
  • chlorpromazine clathrin inhibitor
  • the cells are washed with cold PBS and then treated with 1 and / or 5 ⁇ g / ml of NPC2 for 4 h at 37 ° C. while the control cells are incubated with medium alone. .
  • the cells are then rinsed with PBS and fixed in order to carry out 2-photon microscopy (see Example [20]). These experiments are carried out twice with different cell passages.
  • NPC2 uses mainly endocytosis pathways related to caveolin and lipid rafts. It could also indicate an effect of the "protein ring” that is created on the surface of NPC2, which binds either to caveolin or to lipid rafts present on the surface of glioblastoma cells. Indeed, it has been shown that this "protein ring” favors the internalisation of gold nanoparticles with a diameter of less than 20 nm by a caveolin-dependent mechanism, whereas the larger nanoparticles are internalized by a clathrin- dependent (Cheng, X., et al., 2015. ACS Applied Materials & Interfaces 7 (37): 20568-20575). Therefore and in view of these results, it is deduced that the "protein ring” in combination with the size of the NPC2 preferentially favor internalization linked to caveolin by the glioblastoma cells.
  • Example G221 In vitro study of cytotoxicity induced by PTX and NPCs - PTX
  • the goal is to measure the cell survival rate in the presence of a range of PTX or a range of NPC2-PTX and to determine the IC 5 o corresponding to the concentration of PTX or NPC2-PTX inhibiting 50% of cell viability.
  • PTX paclitaxel
  • NPC2 NPC2
  • the U-87 MGs are treated with a range of PTX ranging from 1 to 100 nM and a range of NPC2-PTX ranging from 0.35 to 70 nM (PTX equivalent);
  • the HMEC-1 are treated with a range of PTX ranging from 0.05 to 50 nM and a range of NPC2-PTX ranging from 0.0175 to 17.5 nM (PTX equivalent); and
  • - SK-N-SH are treated with a range of PTX ranging from 5 to 100 nM and a range of NPC2-PTX ranging from 5 to 100 nM (PTX equivalent).
  • the seeding and treatment volume is maintained at 150 ⁇ L per well and each condition is performed with a conventional incubation at 37 ° C.
  • a cell viability test is performed by an MTT test after 72 hours of treatment. This test uses as reagent 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), which is converted into formazan (crystal violet) by living cells. The latter absorbing at the wavelength of 600 nm is detectable by an absorbance measurement.
  • the cells after undergoing the above treatment with PTX and / or with NPC2-PTX, are treated with 150 ⁇ L of 0.5 mg / mL MTT reagent dispersed in the culture medium (Correard, F., et al., (International Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) for 3 to 5 hours at 37 ° C. As soon as the formazan crystals are visible in the cells under a light field microscope, the medium is replaced by 150 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO). The cells are then lysed, the dissolved formazan crystals and the absorbance is measured with a Multiskan spectrophotometer (Ascent, Labtec Systems with a 600 nm filter.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the percentage of viability is obtained by comparing the absorbance value of the treated cells with the absorbance value of the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • This assay performed only with the HMEC-1 cell line, is based on a real-time measurement of the resistance induced by a cell monolayer grown on a gold electrode, which will show a variation as cells detach from the surface.
  • the impedance measurement is performed with the Real Time Cell Analyst (RTCA, ACEA Biosciences), and provides quantitative information on the biological state of the cells (adhesion, proliferation, mortality) continuously and in real time. Inoculation of a 96-well plate coated with gold electrodes (E-plate 96) is carried out as described previously (see Table 5).
  • the plate is removed from the RTCA station, the culture medium is removed and the cells are treated with a range of NPC2-PTX ranging from 0.35 to 17.5 nM (PTX equivalent). ). The plate is then reinserted into the station and the impedance is measured every 15 minutes for at least 72 hours.
  • the percentage of cell viability is obtained by comparing the impedance measurement of the treated cells with the measurement of impedance of the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from two independent experiments.
  • the cell viability tests were performed by two techniques: an MTT test and then an impedance test to confirm the absence of interaction between the NPC2-PTX and the colorimetric reagent used (MTT) for the measurement of cell survival. .
  • Example G231 In vitro study of cytotoxicity induced by PTX and NPCs - PTX The goal is to measure the cell survival rate in the presence of a range of PTX or a range of NPC2-PTX
  • the adherent cells are treated with a concentration range of paclitaxel coupled to NPC2 (NPC2-PTX) of 0.1 to 10 pM (PTX equivalent).
  • NPC2-PTX concentration range of paclitaxel coupled to NPC2
  • the seeding and treatment volume is maintained at 150 ⁇ L per well and each condition is performed with conventional incubation at 37 ° C and 5% CO 2.
  • a cell viability test is performed by an MTT test after 72 hours of treatment.
  • This test uses as reagent 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), which is converted into formazan (crystal violet) by living cells. The latter detectable by an absorbance measurement at 600 nm.
  • the cells after undergoing the above treatment with PTX and / or with NPC2-PTX, are treated with 150 ⁇ L of 0.5 mg / mL MTT reagent dispersed in the culture medium. As soon as the formazan crystals are visible in the cells under a light field microscope, the medium is replaced by 150 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the cells are then lysed, the dissolved formazan crystals and the absorbance is measured with a Multiskan spectrophotometer (Ascent, Labtec Systems with a 600 nm filter)
  • the percentage of viability is obtained by comparing the absorbance value of the cells treated with the absorbance value of the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • NPC2-PTX The activity of NPC2-PTX is dose-dependent and achieves a maximal effect of 40 and 80% inhibition of cell survival at the highest doses, for GL261 and U-87 MG respectively ( Figure 14).
  • Aim to visualize the microtubular network, target of PTX, in order to look for the pharmacological effects induced by NPC2-PTX, in comparison with PTX.
  • the U-87-MG and HMEC-1 cells are inoculated on Lab-Tek® culture chambers (Nunc). After 24 h of incubation, the medium is replaced by different concentrations of NPC2-PTX or PTX (10, 50 and 100 nM). After 6 hours of treatment, the medium is replaced by an ice-cold methanol solution for fixing and permeabilizing the cells. After saturation with a 1% solution of PBS-BSA (bovine serum albumin), the cells are incubated for 1 hour at 37 ° C. with a mouse anti-tubulin antibody (clone DM1A, Sigma) diluted in a PBS-solution.
  • PBS-BSA bovine serum albumin
  • Aim to visualize the microtubule network, target of PTX, in order to look for the pharmacological effects induced by NPC2-PTX, in comparison with NPC2.
  • the U-87-MG line is used.
  • the U-87-MG cells are seeded on Lab-Tek® culture chambers (Nunc). After 24 h of incubation, the medium is replaced by medium alone (control cells) or by different concentrations of NPC2 (38 and 76 ⁇ g / ml) or NPC2-PTX (38 and 76 ⁇ g / ml equivalent NPC2, 5 and 10). mM equivalent PTX). After 24 hours of treatment, the medium is replaced by an ice-cold methanol solution for fixing and permeabilizing the cells. After saturation with a 1% solution of PBS-BSA (bovine serum albumin), the cells are incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • PBS-BSA bovine serum albumin
  • a mouse anti-b-tubulin antibody (clone DM1 A, Sigma) diluted in a solution of PBS. 1% BSA, then 1 hour at 37 ° C. in the dark with a FITC (Cell Signaling Technology) coupled anti-mouse secondary antibody diluted in the 1% PBS-BSA solution.
  • the nucleus is labeled with a solution of DAPI or 4,6-diamidino-2-phenylindole (0.25 ⁇ g / ml Sigma) for 2 min.
  • the slide is finally mounted with Prolong® anti-fluorescence alteration agent (Invitrogen). The observation is carried out under an epifluorescence microscope (Leica DM-IRBE) coupled to a digital camera (Princeton Instruments, CCD camera coolsnap FX).
  • OBJECTIVE To observe PTX or NPC2-PTX induced spheroid size changes, compared to control, and to measure the cell survival rate on cells in 3D culture in the presence of a range of PTX or NPC2-PTX concentrations. .
  • Spheroids cells in 3D culture make it possible to better represent the tumor environment. They are composed of cells in necrosis in their center and proliferating cells at the periphery. The application of NPC2-PTX on these spheroids allows to study them over a longer time compared to the 2D study.
  • the U-87 MG cells are cultured in EMEM medium supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin-streptomycin and 20% (w / v) methylcellulose. The cells are seeded on a round bottom 96-well culture plate, at a concentration of 1000 cells / well, 72 hours before treatment. The cells are maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 and 10 ⁇ l of fresh medium are added every two days to all the wells (controls and treated).
  • the cells are incubated in culture medium (control cells) or containing PTX (9, 25 and 40 nM) or NPC2-PTX (25, 70, 100 nM). These concentrations correspond to the IC 5 o calculated in 2D (equitoxic doses), to 2.8 times the ICso and to 4 times the IC 5 o ⁇
  • the follow-up of the treatment is done on the day of the treatment (jO), 7 days (d7) and / or 14 days (d14) after treatment.
  • This measurement is done in one step and uses a reagent based on resazurin, which is reduced by living cells.
  • the measured signal is proportional to the number of living cells.
  • the percentage of viability is obtained by comparing the level of fluorescence emitted by the reduced Alamar Blue reagent in the treated cells with the level present in the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • OBJECTIVE To observe size changes in NPC2-PTX-mediated spheroids compared to control, and to measure the cell survival rate on cells in 3D culture.
  • Spheroids cells in 3D culture make it possible to better represent the tumor environment. They are composed of necrotic cells in their center and proliferating cells at the periphery. The application of NPC2-PTX on these spheroids allows to study them over a longer time compared to the 2D study.
  • the GL261 cells are cultured in DMEM medium supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin-streptomycin and 20% (w / v) methylcellulose. The cells are seeded on a round bottom 96-well culture plate, at a concentration of 1000 cells / well, 72 hours before treatment. The cells are maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 and 10 ⁇ l of fresh medium are added every two days to all the wells (controls and treated).
  • the cells are incubated in culture medium (control cells) or containing NPC2 (76 and 153 ⁇ g / ml) or NPC2-PTX (76 and 153 ⁇ g / ml equivalent NPC2 either
  • the percentage of viability is obtained by comparing the level of fluorescence emitted by the reduced Alamar Blue reagent in the treated cells with the level present in the untreated control cells, which is considered as reference and equivalent to 100% viability.
  • the standard deviation is calculated from 3 independent experiments.
  • NPC2-PTX After treatment for 13 days with NPC2-PTX at 153 ⁇ g / ml equivalent, ie 20 ⁇ M PTX equivalent, the NPC2-PTX inhibit cell viability very significantly compared with NPC2 (p ⁇ 0.001).
  • the results of the Alamar Blue test thus confirm the inhibition of growth observed by optical microscopy and highlight a dose-dependent cytotoxic effect.
  • NPC2 naked is safe on spheroids whereas NPC2-PTX has anti-cancer dose-time-dependent activity (Figure 21)
  • Example G281 Stability study under storage conditions (4 ° C)
  • the purity of NPC2s dispersed in ultrapure water is determined by HPLC, in order to quantitatively determine the presence of free PTX that could have been released from its binding from NPC2-PTX under storage conditions.
  • the chromatographic separation of PTX is carried out on a Phenomenex Kinetex XD-C18 column (2.1 x 100 mm, 2.6 ⁇ m).
  • the isocratic elution is carried out with a mobile phase composed of 50% acetonitrile, 1 mM ammonium acetate and 0.05% formic acid at a flow rate of 0.3 ml / min.
  • the effluent is detected at 229 nm with a diode array detector.
  • the standard PTX calibration curves (10 to 1000 nM) show a retention time of 3.3 ⁇ 0.2 min. A quantization limit of 10 nM was determined.
  • Example G291 Stability study in a biological medium at 37 ° C.
  • Aim to determine the stability of the NPC 2 -PTX binding under physiological conditions.
  • the amount of free PTX present in a whole blood sample of C57BL / 6 mice containing a concentration of 60 mg / L of NPC2-PTX (equivalent to 6 mg / L of PTX) was determined by liquid-liquid extraction and HPLC assay. after incubation for 48 hours at room temperature. The extraction of the free PTX is carried out in the same way as from the culture medium.
  • the free PTX concentration in the blood was 0.64 mg / L, indicating a release of approximately 11% of the PTX load of the NPCs 2 .
  • Example G311 Determination of the DMT after single intracerebral injection of the N PCs and NPC? -PTX
  • Aim To evaluate the maximum tolerated dose (MTD) of NPC2-PTX and NPC2 during intracerebral injection in healthy C57BU6 mice.
  • the needle of a 25 ⁇ l Hamilton syringe is inserted 3 mm from the brain surface and left in place 3 minutes before the injection begins.
  • the injection of a total volume of 20 ⁇ L is carried out with an electric syringe pump according to the following scheme: 3 ⁇ L in 15 minutes, then 5 ⁇ L in 10 minutes, and finally 12 ⁇ L in 15 minutes.
  • the injection is followed by a pause time of 5 minutes before the rise of the needle, performed at a rate of 0.5 mm per minute.
  • the wound is sutured and the animals are monitored until waking. The Animal behavior is then observed for 14 days and their weight regularly measured.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveau vecteur de molécules pharmacologiquement actives non hydrosolubles. Ces nanovecteurs, sous la forme de nanoplateformes carbonées, sont capables de solubiliser ces molécules actives tout en réduisant les effets secondaires des traitements. La présente invention concerne aussi les procédés de synthèse de ces nanoplateformes, ainsi que leur utilisation comme médicament, en particulier dans le traitement des tumeurs cérébrales

Description

VECTEURS DE MOLECULES PHARMACOLOGIQUEMENT ACTIVES ET NON HYDROSOLUBLES
ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de molécules pharmacologiquement actives et non hydrosolubles à effets secondaires réduits.
La chimiothérapie anticancéreuse conventionnelle a pour principal inconvénient un impact très fort sur les patients via de nombreux effets indésirables. Ces effets secondaires posent de nombreux problèmes dans le quotidien des patients et deviennent le principal facteur limitant du traitement.
Ces problèmes de toxicité proviennent de deux causes :
• un manque de sélectivité de la molécule active, lui conférant un faible index thérapeutique,
• la présence de solvants toxiques servant à la solubilisation des composés non hydrosolubles.
Deux pistes sont disponibles pour diminuer les effets secondaires des traitements :
• un meilleur ciblage des cellules cancéreuses, de façon à augmenter l’efficacité du traitement tout en diminuant sa toxicité,
• une meilleure solubilisation des composés non hydrosolubles grâce à des solvants ou des vecteurs non toxiques.
Le développement des nanoparticules commence à prendre de l’importance et permet de résoudre au moins l’un des deux problèmes, en particulier le problème de solubilité.
L’une des molécules antitumorale les plus utilisées est le paclitaxel de la famille des taxanes. Cette molécule présente une solubilité inférieure à 1 mg/l. La formulation pharmaceutique de ce composé contient des excipients comme l’huile de ricin pour permettre sa solubilisation. Ces excipients présentent par eux-mêmes une toxicité.
Durant les dernières années, de nombreux nanovecteurs permettant le transport efficace du paclitaxel ont été développés via divers vecteurs :
Tableau 1 : Principaux moyens de nanovectorisation des molécules actives antitumorales Mais ces nouveaux vecteurs répondent souvent à un seul des deux critères. Par exemple, le nanovecteur à partir de l’albumine permet de résoudre le problème de faible solubilité de la molécule active. Par contre, la liaison entre la molécule active et l’albumine est faible. Il est donc facile de cliver cette liaison, ce qui implique un risque de relargage de la molécule active dans l’ensemble des parties du corps et donc des effets secondaires non négligeables.
De la même façon, le nanovecteur à partir de diamant permet d’obtenir des nanovecteurs liés par liaison covalente à la molécule active. Par contre, ces nanoparticules de diamant ne sont pas solubles dans l’eau. Les effets toxiques à court et long terme de ces nanoparticules de carbone dures ne sont pas connus.
L’un des aspects de l’invention concerne une nouvelle nanoplateforme capable de lier de façon covalente une molécule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et non hydrosoluble, tout en restant soluble dans l’eau.
Un autre aspect de l’invention concerne une nouvelle nanoplateforme comportant une molécule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et qui est susceptible de lier de façon covalente un fluorophore ayant une longueur d’onde d’émission permettant le suivi de la nanoplateforme.
Un autre aspect de l’invention concerne une nouvelle nanoplateforme comportant une molécule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et qui est susceptible de lier de façon covalente un agent d’adressage qui permet d’améliorer le transport ciblé de ladite molécule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et ainsi de limiter les effets secondaires.
Selon un aspect de l’invention, la présente invention concerne une nanoplateforme pharmacologiquement active qui est constituée :
d’une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituée de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, et d’azote,
d’une molécule pharmacologiquement active (M),
d’un éventuel fluorophore (F), et
d’un éventuel agent d’adressage (A),
et dans laquelle
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker L,
ladite nanoplateforme NPC2 possédant les propriétés suivantes :
la solubilité de NPC2 en milieu aqueux est de 25 à 500 g/L
le module de Young de NPC2 est de 1 à 4 GPa,
la densité de NPC2 est de 1 à 3,
la taille sèche de NPC2 est de 10 à 40 nm,
le diamètre hydrodynamique de NPC2 est de 10 à 150 nm,
NPC2 est substantiellement amorphe ladite nanoplateforme NPC2 possédant en surface des fonctions acides carboxyliques et hydroxyles et un nombre de fonctions amines primaires de greffage de 0.7 à 7 mmol par gramme de nanoplateforme, ladite molécule pharmacologiquement active M ayant une solubilité en milieu aqueux inférieure à 200 mg/l,
ladite nanoplateforme pharmacologiquement active ayant une solubilité en milieu aqueux de 5 à 500 g/l,
avec la réserve que :
NPC2 soit substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides.
Les nanoplateformes actives selon la présente invention peuvent contenir des molécules pharmacologiquement actives quelconques tant qu’elles ne sont pas solubles dans l’eau mais rendues solubles dans l’eau suite à leur liaison avec la nanoplateforme.
Selon un aspect de l’invention, la présente invention a pour objet une nanoplateforme active qui est constituée :
d’une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituée de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, et d’azote,
d’une molécule active antitumorale (M),
d’un éventuel fluorophore (F), et
d’un éventuel agent d’adressage (A),
et dans laquelle
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker L,
ladite nanoplateforme NPC2 possédant les propriétés suivantes :
la solubilité de NPC2 en milieu aqueux est de 25 à 500 g/L
le module de Young de NPC2 est de 1 à 4 GPa,
la densité de NPC2 est de 1 à 3,
la taille sèche de NPC2 est de 10 à 40 nm,
le diamètre hydrodynamique de NPC2 est de 10 à 150 nm,
NPC2 est substantiellement amorphe
ladite nanoplateforme NPC2 possédant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 0.7 à 7 mmol par gramme de nanoplateforme,
ladite molécule active antitumorale M ayant une solubilité en milieu aqueux inférieure à 200 mg/l,
ladite nanoplateforme active ayant une solubilité en milieu aqueux de 5 à 500 g/l, avec la réserve que :
NPC2 soit substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides. Selon un autre aspect de l’invention, la présente invention a pour objet une nanoplateforme active constituée :
d’une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituée de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, et d’azote sous la forme de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) alkylamino primaire(s) de 1 à 10 carbones, en particulier de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) éthylamino primaire(s),
d’une molécule active antitumorale (M),
d’un éventuel fluorophore (F), et
d’un éventuel agent d’adressage (A),
et dans laquelle
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M éventuellement via un linker L, ladite nanoplateforme NPC2 possédant les propriétés suivantes :
la solubilité de NPC2 en milieu aqueux est de 25 à 500 g/L
le module de Young de NPC2 est de 1 à 4 GPa,
la densité de NPC2 est de 1 à 3,
la taille sèche de NPC2 est de 10 à 40 nm,
le diamètre hydrodynamique de NPC2 est de 10 à 150 nm,
NPC2 est substantiellement amorphe
ladite nanoplateforme NPC2 possédant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 1 ,4 à 7 mmol par gramme de nanoplateforme, ladite molécule active antitumorale M ayant une solubilité en milieu aqueux inférieure à 200 mg/L,
ladite nanoplateforme active ayant une solubilité en milieu aqueux de 5 à 500 g/L,
avec la réserve que :
NPC2 soit substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides.
Selon un autre aspect de l’invention, la présente invention a pour objet une nanoplateforme active constituée :
d’une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituée de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, et d’azote sous la forme de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) alkylamino primaire(s) de 1 à 10 carbones, en particulier de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) éthylamino primaire(s),
d’une molécule active antitumorale (M),
d’un éventuel fluorophore (F), et
d’un éventuel agent d’adressage (A),
et dans laquelle
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker L,
ladite nanoplateforme NPC2 possédant les propriétés suivantes : la solubilité de NPC2 en milieu aqueux est de 25 à 500 g/L
le module de Young de NPC2 est de 1 à 4 GPa,
la densité de NPC2 est de 1 à 3,
la taille sèche de NPC2 est de 10 à 40 nm,
le diamètre hydrodynamique de NPC2 est de 10 à 150 nm,
NPC2 est substantiellement amorphe
ladite nanoplateforme NPC2 possédant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 1 ,4 à 7 mmol par gramme de nanoplateforme, ladite molécule active antitumorale M ayant une solubilité en milieu aqueux inférieure à 200 mg/L,
ladite nanoplateforme active ayant une solubilité en milieu aqueux de 5 à 500 g/L,
avec la réserve que :
NPC2 soit substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides
Selon un autre mode de réalisation, la solubilité en milieu aqueux de ladite molécule active antitumorale est inférieure ou égale à 200 mg/L par rapport à la molécule active antitumorale sous la forme non-salifiée,
Selon un autre mode de réalisation, l’éventuel agent d’adressage (A) dans la nanoplateforme active peut toutefois être une protéine ou un peptide.
Selon un autre aspect de l’invention, la présente invention a pour objet une nanoplateforme active telle que décrite ci-dessus dans laquelle :
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker L,
choisi parmi les composés de formule XI,
Formule XI
dans laquelle :
• Ri et R2 sont indépendamment choisis parmi : -NH-, -COO, -NHCO-, -O-, - OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- et -CO-NH-NH-CO- • R3 est choisi parmi : -NH- ; -O-
• R4 est choisi parmi : -O-, -NHNH-, NH- en particulier via un linker succinique
Au sens de la présente invention, on entend par « nanoplateforme » une nanoparticule servant de support et comprenant des fonctions de greffage en surface permettant le greffage de composants à la surface, et incluant les éventuels fluorophore et agent d’adressage tant que la molécule active antitumorale n’est pas greffée.
Au sens de la présente invention, on entend par « nanoplateforme active » une nanoplateforme sur laquelle la molécule active antitumorale est greffée, étant entendu que le fluorophore et/ou l’agent d’adressage peuvent être présents ou non.
Au sens de la présente invention, on entend par « fonctions de greffage en surface » des fonctions situées en surface de la nanoplateforme capables de lier de façon covalente les molécules d’intérêt à la nanoplateforme. Ces fonctions sont choisies parmi les fonctions amines de préférence primaires ou les fonctions acides carboxyliques.
Au sens de la présente invention, on entend par « molécules d’intérêt », les molécules devant être greffées à la nanoplateforme, c’est à dire soit la molécule active antitumorale, le fluorophore s’il est présent et/ou l’agent d’adressage s’il est présent.
Au sens de la présente invention, on entend par « nanoplateforme substantiellement amorphe » une nanoplateforme ne comportant pas de raie caractéristique sur le spectre DRX, mais susceptible de contenir des inclusions microcristallines non détectables par cette méthode d’analyse.
Au sens de la présente invention, on entend par « nanoplateforme substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides» une nanoplateforme contenant moins de 5% de lipides, moins de 5% d’acides nucléiques, moins de 5% de peptides et moins de 5% de protéines en poids, par rapport au poids total de la nanoplateforme.
Les nanoplateformes actives selon la présente invention présentent l’avantage d’être des nanovecteurs de molécules actives antitumorales capables de solubiliser lesdites molécules insolubles grâce à la solubilité propre de la nanoplateforme.
Les nanoplateformes actives selon la présente invention présentent l’avantage d’avoir des liaisons covalentes entre la nanoplateforme et les molécules attachées à celle-ci. L’intérêt est de pouvoir contrôler le relargage ou le non-relargage des molécules d’intérêt attachées à la nanoplateforme active. Ainsi, il est possible en choisissant les liaisons covalentes de façon appropriée, de permettre le relargage de la molécule active antitumorale uniquement à proximité ou à l’intérieur d’une tumeur, tout en ne relargant pas, dans le même temps, le fluorophore.
Les nanoplateformes selon la présente invention comportent :
• soit uniquement une molécule active antitumorale,
• soit une molécule active antitumorale, ainsi qu’un fluorophore,
• soit une molécule active antitumorale ainsi qu’un agent d’adressage,
• soit une molécule active antitumorale, un agent d’adressage et un fluorophore.
Les nanoplateformes actives selon la présente invention présentent l’avantage d’être modulables. Il est ainsi possible de greffer des molécules différentes selon les fonctions que l’on souhaite voir remplir par les nanoplateforme actives. Ainsi, si l’on souhaite que la molécule active antitumorale cible un type de cellules en particulier, il est possible de fixer un agent d’adressage sur la nanoplateforme active ciblant particulièrement les cellules concernées. Mais si l’on souhaite que l’ensemble du corps soit ciblé, l’absence d’agent d’adressage permet de retirer le caractère discriminant de la nanoplateforme active.
Les nanoplateformes actives selon la présente invention sont solubles en milieu aqueux, ce qui permet de s’affranchir de l’ajout de solvants toxiques, et sont capables de transporter efficacement la molécule active antitumorale vers une destination ciblée par l’agent d’adressage (s’il est présent), et ainsi d’augmenter la sélectivité de la molécule active. Les nanoplateformes selon la présente invention permettent de surmonter les deux causes principales des effets secondaires des traitements antitumoraux connus à ce jour.
Dans un mode de réalisation particulier, les fonctions de greffage en surface de la nanoplateforme active telle que décrite ci-dessus, comprennent des groupements NH2 OU sont constituées de groupements NH2, lesdites fonctions de greffage en surface étant susceptibles d’être liées par des liaisons covalentes à M et/ou F et/ou A, le taux de fonctions de greffage liées étant compris d’environ 50 % à environ 100 % du total des fonctions de greffage en surface de la nanoplateforme NPC2.
Au sens de la présente invention, on entend par « fonction de greffage liée » une fonction de greffage en surface de la nanoplateforme sur laquelle est greffé un composé pouvant être soit un linker, soit une molécule d’intérêt.
Au sens de la présente invention, on entend par « linker » un composé capable de lier de façon covalente la nanoplateforme et les molécules d’intérêt. Les linkers sont identiques ou différents selon les molécules d’intérêt. Le terme « linker » est un anglicisme correspondant au terme « lieur ».
Au sens de la présente invention, on entend par « molécule pharmacologiquement active non hydrosoluble » l’ensemble des molécules pharmacologiquement actives dont la solubilité en milieu aqueux est égale ou inférieure à 200 mg par litre. Ladite solubilité est par rapport aux molécules pharmacologiquement actives sous leur forme non-salifiée. Dans le cadre de la présente invention, les molécules pharmacologiquement actives peuvent toutefois être utilisées sous forme de sels lors du processus de greffage.
Au sens de la présente invention, on entend par « taux de fonctions de greffage liées » le rapport entre le nombre de fonctions de greffage effectivement liées et le nombre de fonctions de greffage présentes en surface.
Dans ce mode de réalisation, les molécules d’intérêt qui sont liées à la nanoplateforme, sont liées sur des fonctions amines. Ces fonctions sont les plus réactives dans le cas de cette invention. Ces fonctions se lient plus facilement que les fonctions acides carboxyliques.
Lesdites fonctions amines sont situées à la surface de la nanoparticule comme exemplifié dans la formule AAA ci-dessous.
Formule AAA
NPC représente ici le cœur de la nanoplateforme NPC2 sans les fonctions de greffage situées en surface. La nanoplateforme de la formule AAA porte des fonctions « amine primaire » (-NH2), ainsi que des fonctions « éthylamino » (-CH2-CH2-NH2).
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend un fluorophore F, et NPC2 est liée par liaisons covalentes avec F, via un linker I_F.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme est liée avec une molécule active antitumorale et avec un fluorophore. Ce fluorophore permet de suivre l’évolution de la nanoplateforme active à laquelle il est lié dans l’organisme, en particulier dans des longueurs d’onde adaptées à la biologie.
Dans ce mode de réalisation, les liaisons covalentes permettent de lier la nanoplateforme avec le fluorophore et de prévenir l’accumulation de fluorophore dans l’organisme hôte. Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend un agent d’adressage A, et NPC2 est liée par liaisons covalentes avec A, via un linker LA.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme est liée avec une molécule active antitumorale et avec un agent d’adressage. Cet agent d’adressage permet de cibler les cellules ou les organes qui doivent être visés par le traitement. Cet agent d’adressage peut être un anticorps, un peptide ou une petite molécule qui lient des récepteurs fortement exprimés par les cellules de la barrière hémato-encéphalique, les cellules tumorales ou qui ciblent la néo angiogenèse (LDLR, transferrine récepteur, EGFR, VEGF). Il peut s’agit par exemple des peptides RGD, TAT, angiopep-2, ou d’anticorps anti EGFR ou anti VEGF.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend un fluorophore F, et un agent d’adressage A, et NPC2 est liée par liaisons covalentes avec F via un linker LF et NPC2 est liée par liaisons covalentes avec A via un linker LA.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme est liée avec une molécule active antitumorale, avec un agent d’adressage et aussi avec un fluorophore. Cette nanoplateforme permet de cibler le lieu d’accumulation et d’action de la nanoplateforme active grâce à l’agent d’adressage, et de suivre l’évolution dans l’organisme de la nanoplateforme active grâce au fluorophore, par imagerie de fluorescence.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend une nanoplateforme NPC2 fluorescente.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme avant sa liaison avec la molécule active antitumorale ou même avant l’éventuelle liaison avec le fluorophore est déjà fluorescente avec une longueur d’onde d’émission (par exemple, rnax = 460nm pour la nanoplateforme de l’exemple 1.1 ) peu favorable à l’imagerie en milieu biologique. C’est pour cette raison qu’un fluorophore émettant à une longueur d’onde favorable à l’imagerie du vivant, typiquement le proche infrarouge (700nm< max<1000nm), peut être attaché à la nanoplateforme active fluorescente.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule I
Formule I
dans laquelle :
• NPC représente le cœur de la nanoplateforme NPC2 sans les fonctions de greffage situées en surface, NPC2 ayant la signification ci-dessus,
• M, F et A ayant les significations ci-dessus,
• f et a sont des nombres entiers valant indépendamment 0 ou 1 ,
• Lf, L et LA représentent les linkers liant par l’intermédiaire de liaisons covalentes le cœur de la nanoplateforme NPC avec les composés F, M et A de Formule II, Formule lia et Formule Mb,
Formule llb
dans lesquelles :
o TF, T et TA représentent les fonctions de greffage de la nanoplateforme NPC2 après leur intégration dans les linkers LF, L et LA,
o ZF, Z et ZA représentent les fonctions de liaison des linkers LF, L et LA après leur liaison sur les fonctions de greffage TF, T et TA,
o RF, R et RA représentent les chaînes fonctionnelles des linkers LF, L et La,
o QF, Q et QA représentent les fonctions de liaison des linkers LF, L et LA après leur liaison sur le fluorophore, la molécule active antitumorale et l’agent d’adressage,
o I, IF et lA sont des nombres entiers égaux ou différents entre eux et valant 0 ou 1. Dans ce mode de réalisation, les linkers Lx peuvent prendre deux types d’organisation :
a. soit contenir uniquement la fonction de greffage de la nanoplateforme NPC2, ce qui implique que la molécule d’intérêt est liée directement sur la nanoplateforme, (Ic = 0)
b. soit contenir en plus de la fonction de greffage de la nanoplateforme NPC2 un composé qui est lié de façon covalente sur la précédente fonction de greffage. C’est sur ce composé que la molécule d’intérêt vient se lier (lx = 1 )·
L’intérêt d’avoir un linker qui n’est pas composé uniquement de la fonction de greffage de NPC2 est de pouvoir l’utiliser pour le greffage de la molécule active antitumorale par une autre liaison covalente. Par exemple, dans le cas où :
■ la nanoplateforme active contient un fluorophore et une molécule active antitumorale,
■ ces deux molécules d’intérêt sont liées sur les mêmes types de fonctions de greffage,
il y a un risque que le fluorophore soit relargué dans les mêmes conditions que la molécule active antitumorale. En ajoutant/modifiant le linker pour l’une des deux molécules d’intérêt, il est possible d’avoir des fonctions de greffage différentes et des conditions de relargage différentes.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active peut prendre 18 configurations :
Tableau 2 : Table des configurations possibles de la Formule I
Au sens de la présente invention, on entend par « linker long », un linker formé par l’ajout d’un précurseur de linker et qui ne contient pas uniquement la fonction de greffage issue de la nanoplateforme. Dans ce cas de figure, I, IF et lA sont égaux à 1.
Au sens de la présente invention, on entend par « linker court », un linker formé uniquement par la fonction de greffage issue de la nanoplateforme. Dans ce cas de figure, I, IF et lA sont égaux à 0.
Par exemple, si l’on prend le cas 18 du Tableau 2, Il n’y a ni fluorophore, ni agent d’adressage. Cela signifie que les linkers correspondant à ces deux molécules d’intérêt sont aussi absents. Le linker de la molécule active antitumorale est marqué court. Le cas 18 correspond donc au cas le plus simple où seule la molécule active antitumorale est présente.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule III,
Formule III
dans laquelle :
NPC, T, Z, R, Q, M et I ont les significations énoncées ci-dessus.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active peut prendre deux configurations du Tableau 2, les configurations 9 et 18.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active ne contient que la molécule active antitumorale, sans fluorophore, et sans agent d’adressage.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule IV,
Formule IV
dans laquelle :
• NPC, T, Z, R, M et Q ont les significations énoncées ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active est telle que la configuration 9 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend uniquement une molécule active liée de façon covalente à une nanoplateforme via un linker long. Ce type de configuration peut être intéressant dans le cas d’une molécule active très faiblement hydrosoluble. En effet, il est possible d’ajouter un linker hydrophile entre la nanoplateforme et la molécule active. Cela peut aider à la solubilisation de la nanoplateforme active, en particulier dans le cas où le taux de greffage de la molécule active antitumorale est élevé (proche de 100%).
Au sens de la présente invention, on entend par « taux de greffage de la molécule active antitumorale », le rapport entre le nombre de fonctions de greffage liées à une molécule active antitumorale et le nombre de fonctions de greffage présentes en surface de NPC2.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule
Formule V
dans laquelle :
• NPC, TF, T, ZF, Z, Rf, R, Qf, Q, If, I, F et M ont les significations énoncées ci-dessus.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active peut prendre les configurations 3,6 12 et 15 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, et un fluorophore, sans agent d’adressage. Les linkers sont soit en configuration longue, soit en configuration courte.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule
dans laquelle :
• NPC, TF, T, Z, R, M, F et Q ont les significations énoncées ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active suit la configuration 6 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, et un fluorophore, sans agent d’adressage. La molécule active est liée via un linker long, tandis que le fluorophore est lié via un linker court à la nanoplateforme.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule
Formule IVII
dans laquelle :
• NPC, T, TA, Z, ZA, R, RA, Q, QA, L IA, A et M ont les significations énoncées ci-dessus
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active peut prendre les configurations 7, 8, 16 et 17 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, et un agent d’adressage, sans fluorophore. Les linkers sont soit en configuration longue, soit en configuration courte.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule
dans laquelle :
• NPC, T, TA, Z, ZA, R, RA, Q, QA, A et M ont les significations énoncées ci- dessus.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active suit la configuration 7 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, et un agent d’adressage, sans fluorophore. La molécule active et l’agent d’adressage sont respectivement liés via deux linkers longs, qui peuvent être différents entre eux, sur la nanoplateforme. Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule IX,
Formule IX dans laquelle :
NPC, T, TF, Ta, Z, ZF, ZA> R, RF, RA, Q, QF, QA, I, IF, U, F, A et M ont les significations énoncées ci-dessus.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active peut prendre les configurations 1 , 2, 4, 5, 10, 11 , 13 et 14 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, un agent d’adressage, et un fluorophore. Les linkers sont soit en configuration longue, soit en configuration courte, pour chacune des molécules d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule
dans laquelle :
NPC, T, TF, TA, Z, ZF, Za, R, RF, RA, Q, QF, QA, F, M et A ont les significations énoncées ci-dessus.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active suit la configuration 1 du Tableau 2.
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme active comprend une molécule active antitumorale, un agent d’adressage, et un fluorophore. La molécule active, l’agent d’adressage ainsi que le fluorophore sont respectivement liés sur la nanoplateforme via des linkers longs, qui peuvent être différents entre eux. De façon générale, l’Invention a pour objet une nanoplateforme active dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes ou les anthracyclines. Parmi les taxanes, on peut citer le paclitaxel (connu sous le nom commercial de Taxol®) et le docétaxel (connu sous le nom commercial de Taxotère®). Parmi les anthracyclines, on peut citer l'épirubicine, la pirarubicine, l'idarubicine, la zorubicine, l'aclarubicine et notamment la doxorubicine.
De façon particulière, l’Invention a pour objet une nanoplateforme active dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes comme le paclitaxel ou les anthracyclines comme la doxorubicine.
De façon plus particulière, l’Invention a pour objet une nanoplateforme active dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est du paclitaxel ou de la doxorubicine.
De façon encore plus particulière, l’Invention a pour objet une nanoplateforme active dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est du paclitaxel.
De façon encore plus particulière, l’Invention a pour objet une nanoplateforme active dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est de la doxorubicine.
Dans ce mode de réalisation, la molécule active étant choisie parmi les molécules actives antitumorales non hydrosolubles, la nanoplateforme active permet de rendre beaucoup plus solubles dans l’eau lesdites molécules actives antitumorales, ce qui permet d’améliorer leur transport dans le sang jusqu’aux zones d’action. Pour rappel de ce qui est connu, le paclitaxel, une molécule active de la famille des taxanes, présente une solubilité dans l’eau de l’ordre de 0.5 mg/l. Lorsque le paclitaxel est lié à la nanoplateforme (exemple 3.1 ci-dessous), la solubilité de la nanoplateforme active correspondante est au minimum de 6.6 g/L.
Dans un mode de réalisation particulier, la teneur en molécule active de la nanoplateforme active est de 10 à150 mg par gramme de nanoplateformes actives, en particulier de 30 à 100 mg/g, et plus particulièrement 45 mg/g.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend un fluorophore F, choisi parmi la Rhodamine B, la Fluorescéine isocyanate, la Lucifer Yellow cadaverine, la famille des Alexa Fluor ou la famille des cyanines NIR. Le fluorophore peut également être la fluorescéine.
Dans ce mode de réalisation, le fluorophore est choisi parmi un ensemble de fluorophores qui peuvent être greffés sur la nanoplateforme. Le choix du fluorophore se fait en fonction du spectre d’émission du fluorophore choisi, voir éventuellement du spectre d’absorption.
Tableau 3 : Spectre d’émission des différents fluorophores pouvant être utilisés.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend un agent d’adressage A, choisi parmi les anticorps ou les peptides vecteurs, en particulier un anticorps ciblant les récepteurs de l’EGF, le peptide RGD ou un peptide ciblant le LDLR. L’agent d’adressage A peut également être le cetuximab.
Dans ce mode de réalisation, l’agent d’adressage est choisi parmi un ensemble de protéines pouvant diriger la nanoplateforme active en direction de sa cible, et ainsi permettre le relargage de la molécule active sur la cible présélectionnée.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus comprend des linkers L, LF et LA choisis parmi les composés de Formule XI.
Formule XI
dans laquelle :
• Ri et R2 sont indépendamment choisis parmi : -NH-, -COO, -NHCO-, -O-, - OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- et -CO-NH-NH-CO-
• R3 est choisi parmi : -NH- ; -O-
• R4 est choisi parmi : -O-, -NHNH-, NH-
En particulier un linker succinique
Dans ce mode de réalisation, les linkers sont choisis en fonction de plusieurs critères : • la nature des liaisons à former avec entre les molécules d’intérêt et la nanoplateforme
• leur affinité avec l’eau et les lipides,
• l’encombrement spatial de la molécule active, pour éviter l’encombrement stérique autour de la nanoplateforme.
Tableau 4 : Tableau des liaisons possibles
Le tableau 4 décrit un ensemble de liaisons pouvant servir de liaison
Trois configurations sont possibles :
■ soit Gau représente NPc, Gi représente TF, G2 représente ZF et Dro représente RF-QF-F.
■ soit Gau représente NPc, G1 représente T, G2 représente Z et Dro représente R-Q-M.
■ soit Gau représente NPc, G1 représente TA, G2 représente ZA et Dro représente RA-QA-A.
dans lesquelles NPC, T, TF, TA, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF et QA ont les significations énoncées à la formule I.
Le choix des liaisons pouvant lier de façon covalente la molécule d’intérêt à son linker propre se fait selon le choix des liaisons du tableau 4.
Selon un autre aspect, l’Invention a pour objet une nanoplateforme dans laquelle la liaison entre ladite molécule active antitumorale M et soit ledit linker L, soit ladite nanoplateforme NPC2, est clivable dans des conditions de pH de 2 à 8, en particulier de 4 à 8 et de préférence de 4 à 7,5. Autrement dit, les conditions de pH selon l’Invention dans lesquelles la liaison est clivable sont des conditions de pH de 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 et/ou 8. Dans ce mode de réalisation particulier, la liaison entre la molécule active et la nanoplateforme est clivable dans les conditions choisies, ce qui permet de libérer la molécule active.
Dans ce mode de réalisation particulier, il est possible d’utiliser une molécule active antitumorale toxique, qui est non toxique lorsqu’elle est liée à la nanoplateforme et qui redevient toxique, notamment pour les cellules tumorales, lors de son relargage après clivage. Ce mode de réalisation permet de limiter les effets secondaires de la molécule active antitumorale, en limitant la toxicité de la molécule active lors de son transport.
Dans un mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus est de Formule XII ou de Formule XI IA,
Formule XIIA
dans laquelle :
• NPC a la signification décrite ci-dessus.
Dans ce mode de réalisation particulier, la nanoplateforme est liée à un fluorophore (Rhodamine B), ce qui permet de suivre l’évolution de la nanoplateforme par fluorescence dans le domaine de l’orange. Ce fluorophore est directement lié sur la nanoplateforme via un linker court ne comprenant qu’une fonction de greffage amine primaire. La nanoplateforme est aussi liée à la molécule active antitumorale, dans ce cas le paclitaxel, via un linker long comprenant une fonction de greffage amine primaire et un composé terminé par une fonction acide carboxylique qui après liaison avec la molécule active antitumorale devient une fonction ester.
Dans ce mode de réalisation particulier, la nanoplateforme active obtenue présente deux liaisons différentes, respectivement pour le fluorophore et pour la molécule active antitumorale. Ainsi les conditions de clivage de ces deux molécules d’intérêt sont différentes, ce qui permet le relargage de l’une (la molécule active antitumorale) sans nécessairement relarguer l’autre (le fluorophore).
La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d’une nanoplateforme active telle que décrite ci-dessus comprenant une étape de greffage d’une molécule active antitumorale :
• par une éventuelle mise en contact d’une nanoplateforme NPC2 avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme liée par liaison covalente audit linker L, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M,
dans lequel NPC2, L et M ont les significations de la Formule I,
pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale.
Le procédé de synthèse décrit ci-dessus est le minimum requis pour obtenir une nanoplateforme active telle que décrite ci-dessus. Dans ce procédé, le linker peut être :
• soit un linker court ne contenant que la fonction de greffage de la nanoplateforme. Ce cas est obtenu en n’ajoutant pas de précurseur de linker.
• soit un linker long ; ce cas est obtenu en ajoutant un précurseur de linker L’.
Le procédé de synthèse prévoit de préférence, dans le cas où un précurseur de linker est présent, de lier d’abord ce précurseur sur la nanoplateforme avant de lier la molécule active antitumorale.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus, comprend, avant l’étape de greffage d’une molécule active antitumorale, une étape de liaison d’un fluorophore :
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme NPC2 avec un précurseur LF’ dudit linker LF, pour obtenir une nanoplateforme liée audit linker LF, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme liée audit linker LF avec un fluorophore F,
dans lequel NPC2, LF et F ont les significations de la Formule I,
pour obtenir une nanoplateforme liée audit fluorophore.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus, comprend, avant l’étape de greffage d’une molécule active antitumorale, une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme initiale
• par la mise en contact d’une nanoplateforme initiale avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amine de préférence deux fonctions amine primaire et/ou secondaire et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amine primaire pour accroître le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée, suivie
d’une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée avec un précurseur LF’ dudit linker LF, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée liée audit linker LF, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée liée audit linker LF avec un fluorophore F, dans lequel NPC2, LF et F ont les significations de la Formule I,
pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée éventuellement liée audit fluorophore F.
Dans un mode de réalisation particulier, la molécule organique est un a-w diamino- alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine.
Au sens de la présente invention, on entend par « refonctionnalisation », une étape de transformation des fonctions de greffage en surface de la nanoplateforme, lesquelles sont non utilisables pour le greffage des molécules d’intérêt, en particulier les fonctions acides, amides, ou alcools et transformables par réaction en sites portant diverses fonctions utilisables pour le susdit greffage et en particulier une fonction amine primaire.
Dans ce mode de réalisation particulier, avant l’étape de greffage qui permet de greffer la molécule active antitumorale, la nanoplateforme initiale est refonctionnalisée pour augmenter le taux de fonctions de greffage amine primaire à la surface de la nanoplateforme.
En surface de la nanoplateforme initiale, il existe déjà des fonctions de greffage amine. Il est donc possible d’utiliser ces fonctions de greffage pour greffer les molécules d’intérêt. Il est aussi possible d’utiliser des fonctions de greffage différentes des fonctions amine. L’étape de refonctionnalisation n’est donc qu’une optimisation de la charge possible en fonctions de greffage amine de la nanoplateforme.
Dans ce mode de réalisation particulier, à la suite de la refonctionnalisation et avant de greffer la molécule active, il est possible de lier un fluorophore sur la nanoplateforme refonctionnalisée. Cet éventuel fluorophore peut être lié soit à un linker court, soit à un linker long. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus, comprend, après l’étape de greffage d’une molécule active antitumorale, une étape de liaison d’un agent d’adressage :
• par une éventuelle mise en contact d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, avec un précurseur LA’ dudit linker LA, pour obtenir une nanoplateforme liée à ladite molécule active antitumorale M et liée audit linker LA, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M et liée audit linker LA, avec un agent d’adressage A,
dans lequel NPC2, LA, M et A ont les significations de la Formule I,
pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M et liée audit agent d’adressage A.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus, comprend les étapes suivantes :
a. une éventuelle étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme,
• par la mise en contact d’une nanoplateforme avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amine de préférence deux fonctions amine primaire et/ou secondaire et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amine primaire, pour accroître le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée, b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée avec précurseur LF’ dudit linker LF, pour obtenir une nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit linker LF, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit linker l_F avec un fluorophore F, pour obtenir une nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F,
c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F, avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée par liaison covalente audit linker L, suivie • par la mise en contact de ladite nanoplateforme éventuellement refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F,
d. une éventuelle étape de liaison d’un agent d’adressage,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, éventuellement refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F avec un précurseur LA’ dudit linker LA, pour obtenir une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, éventuellement refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement lié audit linker LA, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, éventuellement refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement lié audit linker LA avec un d’agent d’adressage A,
dans lequel NPC2, LF, L, LA, F, M et A ont les significations énoncées ci-dessus, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, éventuellement refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement liée audit agent d’adressage A.
Selon un mode de réalisation particulier, l’éventuel agent agent d’adressage est un peptide vecteur.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule organique est un a-w diamino- alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine.
Selon encore un mode de réalisation particulier, l’objet de la présente l’invention comprend une étape de refonctionalisation.
Selon un autre aspect de l’invention, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’une nanoplateforme active telle que décrite ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : a. une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme,
• par la mise en contact d’une nanoplateforme avec une molécule organique du type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour accroître le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée,
b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore,
• par une mise contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée avec de l’anhydride succinique pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique, suivie
• par la mise en contact de la nanoplateforme refonctionnalisée par ledit linker succinique avec de l’hydrazine pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié avec un fluorophore F, la quantité de fluorophore F étant sub- stoichiométrique par rapport au nombre de linkers succiniques activés, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique activé et éventuellement liée audit fluorophore F, c. une étape de liaison d’un agent d’adressage,
• par une mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié et éventuellement liée audit fluorophore F avec un agent d’adressage A pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A,
d. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A, avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F, liée audit agent d’adressage et éventuellement liée par liaison covalente audit linker L, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F, liée audit agent d’adressage et éventuellement liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F et liée à un agent d’adressage,
dans lequel NPC2, LF, L, LA, F, M et A ont les significations énoncées ci-dessus pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A, ledit agent d’adressage étant un anticorps.
Le procédé de synthèse selon la présente invention présente l’avantage d’être modulable. Il est possible de modifier :
• la nature des fonctions de greffage, ainsi que leur proportion respective,
• la fluorescence de la nanoplateforme active, en particulier la couleur de cette fluorescence,
• l’encombrement stérique autour de la nanoplateforme,
• la nature des liaisons covalentes liant les molécules d’intérêt à la nanoplateforme,
• le taux de greffage des molécules d’intérêt sur la nanoplateforme,
• la zone de ciblage du traitement.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite de nanoplateforme active de Formule I,
Formule I
dans laquelle :
• NPC, F, M, A, L, Lf, La, a et f ont les significations énoncées ci-dessus, comprend les étapes suivantes :
a. une éventuelle étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a Formule a
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amine de préférence deux fonctions amine primaire et/ou secondaire et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amine primaire, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule B,
dans lesquelles :
• b et d sont des nombres réels compris entre 0 et 1 correspondant respectivement au taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOFI en NH2 au taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage OH en NH2,
• les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b (NH2, COOH, OH),
• a et f sont des nombres entiers valant 0 ou 1 , égaux ou différents. b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore par l’éventuelle mise en contact d’un précurseur de linker LF’ de Formule 1
ZF RF QF
Formule 1
avec une nanoplateforme NPC2 de Formule B
pour obtenir une nanoplateforme de Formule C
Formule C
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule C avec ledit fluorophore F pour obtenir une nanoplateforme de Formule D,
Formule D ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule B Formule C Formule D c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule D avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
Z— R - Q
Formule 2
pour obtenir une nanoplateforme de Formule E,
Formule E
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule E avec ladite molécule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule F,
Formule F
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
Formule D Formule E Formule F d. une éventuelle étape de liaison d’un agent d’adressage par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule F avec un précurseur de linker LA’ de Formule 3
ZA RA QA Formule 3
pour obtenir une nanoplateforme active de Formule G
Formule G
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule G avec ledit agent d’adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule I,
ladite étape d ayant lieu selon le schéma suivant
Formule F Formule G Formule I
Dans ce mode de réalisation particulier, l’éventuelle étape de refonctionnalisation n’est pas totale. Si b=d=0 sur la Formule b, il n’y a pas de refonctionnalisation et les fonctions de greffage de la nanoplateforme NPC2 sont les mêmes que celles de la nanoplateforme initiale NPC1. Si b>0 ou d>0, la refonctionnalisation est effective et des fonctions de greffage non désirées comme les fonctions OFI et COOFI réagissent pour obtenir des fonctions amines primaires.
Dans ce mode de réalisation, les Formule b et Formule B sont deux écritures différentes d’une même nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffages disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b, soit NHI2 et COOH.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a-b
NH2 COOH Formule a-b
avec une molécule organique de type une molécule organique du type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule B,
dans lesquelles :
• b est un nombre réel compris de 0 à 1 correspondant au taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOFI en NHI2
• les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b-b (Al kyle-NH2, NHI2, COOH),
• a et f sont des nombres entiers valant 0 ou 1 , égaux ou différents,
• avec la réserve que le nombre b est supérieur à 0.
Dans ce mode de réalisation particulier, l’étape de refonctionnalisation n’est pas totale. Si b =0 sur la Formule b, il n’y a pas de refonctionnalisation et les fonctions de greffage de la nanoplateforme NPC2 sont les mêmes que celles de la nanoplateforme initiale NPC1. Si b>0, la refonctionnalisation est effective et des fonctions de greffage non désirées comme les fonctions OH et COOH réagissent pour obtenir des fonctions amines primaires.
Dans ce mode de réalisation, les Formule b-b et Formule B sont deux écritures différentes d’une même nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffages disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b, soit NH2 et COOH.
Dans ce mode de réalisation, une refonctionnalisation par du 1 ,2-éthylènediamine conduit à une structure de formule b-b dans laquelle le groupement alkyle est un éthyle.
Dans ce mode de réalisation, une étape supplémentaire de synthèse de la nanoplateforme initiale peut être effectuée.
Dans ce mode de réalisation, si un précurseur de linker est mis en contact avec une nanoplateforme active ou non, le linker obtenu à la suite de la liaison de ce précurseur sur la nanoplateforme est un linker long. Par contre si une molécule d’intérêt est liée sans qu’un précurseur de linker ne soit lié, le linker obtenu est un linker court.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule IX,
Formule IX
dans laquelle :
• NPC, T, TF, TA, M, F, A, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF, QA, I, IF et ont les significations de la Formule I,
comprend :
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a,
NH2
Î COOH Formule a
1
OH
dans laquelle :
• NPc ayant la signification indiquée dans la Formule I,
avec une molécule organique de type a,w-diamino-alcane comportant deux fonctions amines de préférence deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule H,
dans lesquelles :
• b et d sont respectivement le taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOFI en NFi2 et le taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage OFI en NFI2, b et d étant des nombres réels supérieurs strictement à 0,
• les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b, en particulier NFI2, b. une étape de liaison d’un fluorophore par l’éventuelle mise en contact d’un précurseur de linker LF’ de Formule 1 ,
ZF RF QF
Formule 1
avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule H,
pour obtenir une nanoplateforme de Formule J,
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule J avec ledit fluorophore F, pour obtenir une nanoplateforme de Formule K,
ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule H Formule J Formule K c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule K avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
Z— R - Q
Formule 2
pour obtenir une nanoplateforme de Formule L
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule L avec ladite molécule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule M,
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
Formule K Formule L Formule M d. une éventuelle étape de liaison d’un agent d’adressage par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule M avec un précurseur de linker LA’ de Formule 3,
ZA RA QA
Formule 3
pour obtenir une nanoplateforme active de Formule N,
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule N avec ledit agent d’adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule IX
ladite étape d ayant lieu selon le schéma suivant
Formule M Formule N Formule IX
Dans ce mode de réalisation particulier, l’étape de refonctionnalisation n’est pas totale. Il peut rester des fonctions de greffage OFI et COOFI sur la surface de la nanoplateforme.
Dans ce mode de réalisation, les Formule b et Formule H sont deux écritures différentes d’une même nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffage disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b, soit NH2, OH et COOH.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est :
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b,
Formule a-b
dans laquelle :
• NPc a la signification indiquée dans la Formule I,
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule H, Formule H
dans lesquelles :
• b est le taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOH en NH2, b étant un nombre réel supérieur strictement à 0,
• les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b-b, en particulier NH2 ou Alkyle-NH2,
Dans ce mode de réalisation particulier, l’étape de refonctionnalisation n’est pas totale. Il peut rester des fonctions de greffage OH et COOH sur la surface de la nanoplateforme.
Dans ce mode de réalisation, les Formule b-b et Formule H sont deux écritures différentes d’une même nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffage disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b-b, soit NH2, COOH.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule X,
Formule X
dans laquelle :
• NPC, T, TF, Ta, M, F, A, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF et QA ont les significations de la Formule I,
comprend
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a, Formule a
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amines de préférence deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule H,
(NH2)(i+b+d) |F l COOH( -b) Formule b . l T Formule H
OH( -d) TA
dans lesquelles :
• b, d, TF, TA et T ayant les significations énoncées ci-dessus, b. une étape de liaison d’un fluorophore par la mise en contact d’un précurseur de linker LF’ de Formule 1 ,
ZF RF QF
Formule 1
avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule H
pour obtenir une nanoplateforme de Formule O
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule O avec ledit fluorophore F pour obtenir une nanoplateforme de Formule P,
ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule H Formule O Formule P c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule P avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
Z— R— Q
Formule 2
pour obtenir une nanoplateforme de Formule Q,
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Q avec ladite molécule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule R,
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
Formule P Formule Q Formule R d. une étape de liaison d’un agent d’adressage par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule R avec un précurseur de linker La’ de Formule 3
ZA RA QA Formule 3
pour obtenir une nanoplateforme active de Formule S,
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule S avec ledit agent d’adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule X
ladite étape d ayant lieu selon le schéma suivant
Formule R Formule S Formule X
Dans ce mode de réalisation, les trois molécules d’intérêt sont respectivement liées par des linkers longs à la nanoplateforme, les trois linkers pouvant être identiques ou différents entre eux selon les besoins pour la nanoplateformes actives
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est : une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b,
NH2
Î COOH Formule a-b
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2de Formule b-b ou de Formule H,
dans lesquelles :
• b, TF, TA et T ont les significations énoncées ci-dessus,
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule VI,
Formule VI
dans laquelle :
• NPC, T, M, F, TF, Z, R, et Q ont les significations de la Formule I, comprend
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a, Formule a
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amines de préférence deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule T,
dans laquelle :
• b, d, T et TF ayant les significations énoncées ci-dessus, b. une étape de liaison d’un fluorophore par la mise en contact dudit fluorophore F, avec une nanoplateforme NPC2 de Formule T,
pour obtenir une nanoplateforme de Formule U
Formule U
ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule T Formule U c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule U avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
1— R— Q
Formule 2
pour obtenir la nanoplateforme de Formule W
|F F i T - Z— R— Q Formule W
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule W avec ladite molécule active antitumorale M, pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule VI,
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
Formule U Formule W Formule VI
Dans ce mode de réalisation, le fluorophore est lié directement à la nanoplateforme via un linker court, tandis que la molécule active antitumorale est liée à la nanoplateforme via un linker long. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est : une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a-b,
NH2
Î COOH Formule a-b
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule T,
dans laquelle :
• b, T et TFont les significations énoncées ci-dessus,
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule IV,
Formule IV
dans laquelle :
• NPC, T, M, Z, R et Q ont les significations de la Formule I,
comprend :
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a,
Formule a avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane comportant deux fonctions amines de préférence deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule Y,
dans laquelle :
• b, d et T ayant les significations énoncées ci-dessus,
b. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Y avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
1— R— Q
Formule 2
pour obtenir une nanoplateforme de Formule Z Formule Z
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Z avec ladite molécule active antitumorale M, pour obtenir la nanoplateforme active de Formule IV,
ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule Y Formule Z Formule IV
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est :
une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a-b,
Formule a-b avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule Y,
dans laquelle :
• b, d et T ont les significations énoncées ci-dessus,
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule VIII,
Formule VIII
dans laquelle :
• NPC, T, TA, M, A, Z, ZA, R, RA, Q, et QA ont les significations de la Formule
I,
comprend :
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH?
±
l COOH Formule a
T
OH
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane, comportant deux fonctions amines de préférence deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de façon encore plus préférentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule AA,
Formule b i T Formule AA
TA
dans laquelle :
• b, d, T et TA ayant les significations énoncées ci-dessus, b. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AA avec un précurseur de linker L’ de Formule 2
1— R— Q
Formule 2
pour obtenir une nanoplateforme de Formule AB
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AB avec ladite molécule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active de Formule AC,
ladite étape b ayant lieu selon le schéma suivant
Formule AA Formule AB Formule AC c. une étape de liaison d’un agent d’adressage par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule AC avec un précurseur de linker La’ de Formule 3,
ZA RA QA
Formule 3
pour obtenir une nanoplateforme active de Formule AD
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule AD avec ledit agent d’adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule VIII
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
Formule AC Formule AD Formule VIII
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape a dans le procédé ci-dessus est :
une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b,
Formule a-b
avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule AA,
dans laquelle :
• b, d, T et TA ont les significations énoncées ci-dessus,
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus comprend avant l’éventuelle étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme NPC1,
une étape de synthèse de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a
Formule a
par la mise en contact d’acide citrique avec du diéthylènetriamine dans l’eau sous micro-ondes pendant un temps suffisant pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a,
selon le schéma
OH
Formule a dans lequel :
• NPC a la signification de la Formule I,
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme initiale (NPC1) est synthétisée à partir de molécules organiques pouvant être biosourcées. Cette synthèse permet d’obtenir directement les nanoplateformes. S’il n’y a pas d’étape de refonctionnalisation, les nanoplateformes obtenues suite à cette synthèse sont celles utilisées pour greffer les molécules d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus comprend avant l’éventuelle étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme NPCi,
une étape de synthèse de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a-b
Formule a-b
par la mise en contact d’acide citrique avec du diéthylènetriamine dans l’eau sous micro-ondes pendant un temps suffisant pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a-b,
selon le schéma
Formule a-b dans lequel :
• NPC a la signification de la Formule I,
Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme initiale (NPCi) est synthétisée à partir de molécules organiques pouvant être biosourcées. Cette synthèse permet d’obtenir directement les nanoplateformes.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus comprend,
une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme NPCi de Formule a,
Formule a par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a avec un excès de 1 ,2-éthylènediamine à une température comprise de 100 à 150°C pendant 2 à 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b, selon le schéma,
Formule a Formule b dans lequel
• b, d et NPC ont les significations énoncées ci-dessus,
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus comprend,
une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme NPC1 de Formule a-b,
NH2
'
i COOH Formule a-b
par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a-b avec un excès de 1 ,2-éthylènediamine à une température comprise de 100 à 180°C pendant 2 à 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b- b,
selon le schéma,
Formule a-b Formule b-b dans lequel
• b, d et NPC ont les significations énoncées ci-desssus,
Dans ce mode de réalisation, le groupement alkyle est : un éthyle (-CH2-CH2-). Dans ce mode de réalisation, la nanoplateforme initiale (NPCi) après avoir été synthétisée est refonctionnalisée avec un composé aminé pour accroître le nombre de fonctions de greffage amine primaire à la surface de la nanoplateforme. Cette étape peut être effectuée avec une diamine primaire. Cette diamine primaire peut être du 1 ,2-diaminoéthane (1 ,2-éthylènediamine), du 1 ,3-diaminopropane ou du 1 ,4 diaminobutane.
Dans ce mode de réalisation, le taux de refonctionnalisation est de 95%.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule XII,
HN Rhodamine B
Formule XII
dans laquelle :
• NPC a la signification de la Formule I,
comprend
a. une étape de synthèse d’une nanoplateforme NPCi de Formule a,
Formule a
par la mise en contact d’acide citrique avec de la diéthylènetriamine dans l’eau sous micro-ondes avec une puissance de 500 à 1000 W, notamment 600 W, pendant un temps de 1 à 5 minutes, notamment 2 minutes, pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a,
selon le schéma
Formule a b. une étape de refonctionnalisation de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a, par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a avec un excès de 1 ,2-éthylènediamine à une température comprise de 100 à 150°C pendant 2 à 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule AE,
dans laquelle :
• b et d ont la signification de la Formule I,
selon le schéma,
Formule a Formule b c. une étape de liaison d’un fluorophore par la mise en contact d’un fluorophore F constitué par de la Rhodamine B, avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule AE,
pour obtenir une nanoplateforme de Formule AF
HN - Rhodamine B
Formule AF
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant
odamine B
Formule AE Formule AF d. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AF avec un précurseur de linker L’, de l’anhydre succinique et une base, du Na2C03, pour obtenir la nanoplateforme de Formule AG
H N Rhodamine B suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AG avec ladite molécule active antitumorale M, du paclitaxel, pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule XII,
ladite étape d ayant lieu selon le schéma suivant
Formule AF Formule AG Formule XII
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation tel que décrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule XII,
HN - Rhodamine B
Formule XII
dans laquelle :
• NPC a la signification de la Formule I,
comprend
a. une étape de synthèse d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b,
Formule a-b
par la mise en contact d’acide citrique avec du diéthylènetriamine dans l’eau sous micro-ondes avec une puissance de 500 à 1000 W, notamment 600 W, pendant un temps de 1 à 5 minutes, notamment 2 minutes, pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a-b,
selon le schéma
Formule a-b b. une étape de refonctionnalisation de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a-b, par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPCi de Formule a-b avec un excès de 1 ,2-éthylènediamine à une température comprise de 100 à 180°C pendant 2 à 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule AE,
(NH2-Alkyle)^
Formule b-b
Formule AE
• b a la signification énoncée ci-dessus
selon le schéma,
Formule a-b Formule b-b c. une étape de liaison d’un fluorophore par la mise en contact d’un fluorophore F constitué par de la Rhodamine B, avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule AE,
pour obtenir une nanoplateforme de Formule AF
HN - Rhodamine B
Formule AF
- NH2
ladite étape c ayant lieu selon le schéma suivant NH - Rhodamine B Rhodamine B i -NH2
Formule AE Formule AF d. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AF avec un précurseur de linker L’, de l’anhydre succinique et une base, notamment du carbonate de sodium ou de la diisopropyléthylamine, pour obtenir la nanoplateforme de Formule AG
HN - Rhodamine B
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AG avec ladite molécule active antitumorale M, du paclitaxel, pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule XII,
ladite étape d ayant lieu selon le schéma suivant
Formule AF Formule AG Formule XII
Selon un autre aspect, l’Invention concerne une nanoplateforme active dans laquelle la nanoplateforme NPC2
• ne présente pas de toxicité cellulaire in vitro ; et
• est susceptible d’être internalisée par des cellules en culture in vitro, à une concentration comprise de 1 pg/mL à 25 pg/mL.
Selon un aspect plus particulier, l’Invention concerne une nanoplateforme active dans laquelle la nanoplateforme NPC2
• ne présente pas de toxicité cellulaire in vitro, notamment sur la lignée cellulaire cancéreuse U-87-MG et sur les lignées non-cancéreuses FIMEC- 1 et NHDF ; et
• est susceptible d’être internalisée par des cellules en culture in vitro, notamment par la lignée cellulaire cancéreuse U-87-MG,
à une concentration comprise de 1 pg/mL à 25 pg/mL. La présente Invention concerne également l’utilisation de la nanoplateforme active précédemment décrite comme médicament.
La présente Invention concerne également la nanoplateforme active précédemment décrite pour son utilisation comme médicament.
À ce titre, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active décrite ci-dessus en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
Selon un aspect particulier, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active décrite ci-dessus où ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes ou les anthracyclines, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
Selon un aspect plus particulier, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active décrite ci-dessus où ladite molécule active antitumorale M est du paclitaxel ou de la doxorubicine, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
Selon un aspect particulier, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active décrite ci-dessus où ladite molécule active antitumorale M est du paclitaxel, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
Selon un aspect encore plus particulier, l’invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active telle que décrite ci- dessus, où ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes, plus particulièrement le paclitaxel et le docétaxel ou parmi les anthracyclines, plus particulièrement l’épirubicine, la pirarubicine, l’idarubicine, la zorubicine, l’aclarubicine et la doxorubicine et ladite nanoplateforme active étant en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
Les compositions pharmaceutiques selon l’Invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l’Homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l’hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, l’acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de solutions ou de suspensions injectables, gels, comprimés, poudres, gélules, capsules, etc.
Par ailleurs, l’Invention, laquelle contient par exemple 45 mg de paclitaxel par g de NPC2 (données RMN), englobe également une composition pharmaceutique formulée en dose unitaire comprenant de 1 g à 15 g de nanoplateformes actives, notamment de 3 g à 12,5 g de nanoplateformes actives et de préférence de 5 g à 10 g de nanoplateformes actives. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée en dose unitaire de 1 ; 1 ,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ; 8 ; 8,5 ; 9 ; 9,5 ; 10 ; 10,5 ; 11 ; 1 1 ,5 ; 12 ; 12,5 ; 13 ; 13,5 ; 14 ; 14,5 et/ou 15 g de nanoplateformes actives.
Selon un autre aspect, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique formulée à une dose de nanoplateformes actives de 20 mg/kg à 200 mg/kg de poids corporel (ou de 0,88 g/m2 à 8,8 g/m2 de surface corporelle).
Selon un autre aspect particulier, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique formulée à une dose de nanoplateformes actives de 20 mg/kg à 200 mg/kg de poids corporel, notamment de 40 mg/kg à 180 mg/kg, particulièrement de 60 mg/kg à 160 mg/kg et de préférence de 80 mg/kg à 140 mg/kg. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée en dose unitaire de 20 ; 25 ; 30 ; 35 ; 40 ; 45 ; 50 ; 55 ; 60 ; 65 ; 70 ; 75 ; 80 ; 85 ; 90 ; 95 ; 100 ; 105 ; 110 ; 115 ; 120 ; 125 ; 130 ; 135 ; 140 ; 145 ; 150 ; 155 ; 160 ; 165 ; 170 ; 175 ; 180 ; 185 ; 190 ; 195 et/ou 200 mg/kg de nanoplateformes actives.
Selon un aspect particulier, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique formulée à une dose de nanoplateformes actives de 0,88 g/m2 à 8,8 g/m2 de surface corporelle, notamment de 1 g/m2 à 8 g/m2, particulièrement de 3 g/m2 à 6 g/m2 et de préférence de 3g/m2 à 6 g/m2. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée en dose unitaire de 0,88 ; 1 ; 1 ,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ; 8 ; 8,5 et/ou
8,8 g/m2 de nanoplateformes actives.
Afin d’être administrée à un mammifère, notamment à l’Homme, l’Invention a pour objet une composition pharmaceutique formulée pour être administrable par toute voie d’administration appropriée en particulier par voie entérale ou parentérale.
Parmi les voies entérales, on peut notamment citer la voie buccale, sublinguale, perlinguale, ou rectale. Parmi les voies parentérales, on peut notamment citer l’injection intraveineuse, l’injection sous-cutanée, l’injection intradermique, l’injection intramusculaire, l’injection intrapéritonéale, l’injection intrathécale ou l’injection intratumorale. La voie d’administration vaginale, nasale, pulmonaire, auriculaire, ophtalmique ou transdermique est aussi possible. Les injections peuvent être réalisées sous forme de bolus, et/ou par perfusion continue.
Selon un mode d’administration préférentielle, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée pour être administrable par voie entérale choisie parmi la voie buccale, sublinguale, perlinguale, ou rectale. Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyloléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.
Selon un autre mode d’administration préférentielle, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée pour être administrable par voie parentérale choisie parmi l’injection intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intrathécale ou intratumorale.
Selon un autre mode d’administration préférentielle, la composition pharmaceutique selon l’Invention est formulée pour être administrable par voie sous-cutanée.
Un autre aspect de l’Invention concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement de cancers notamment des tumeurs cérébrales primitives et plus particulièrement le glioblastome et/ou les métastases cérébrales issues de tumeurs primaires de localisation non cérébrale.
Un aspect de l’Invention plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement du glioblastome et des métastases cérébrales issues de différentes tumeurs primaires de localisation non cérébrale.
Un aspect de l’Invention encore plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement du glioblastome.
Un aspect de l’Invention encore plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement des métastases cérébrales issues de différentes tumeurs primaires de localisation non cérébrale.
Un aspect particulier de l’Invention comprend des nanoplateformes actives dans laquelle la liaison entre le paclitaxel ou la doxorubicine et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage du paclitaxel ou de la doxorubicine, en particulier en rompant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et le paclitaxel ou la doxorubicine,
Un aspect très précis de l’Invention comprend des nanoplateformes actives dans laquelle la liaison entre le paclitaxel et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage du paclitaxel, en particulier en rompant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et le paclitaxel.
Un autre aspect très précis de l’Invention comprend des nanoplateformes actives dans laquelle la liaison entre la doxorubicine et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage de la doxorubicine, en particulier en rompant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et la doxorubicine. Figures :
La Figure 1 A représente une image des nanoplateformes NPCi ou NPC2 obtenue par microscopie électronique à transmission (TEM). L’échelle est de 50 nm, et la distribution visuelle de la taille des nanoplateformes est nettement inférieure à cette échelle.
La Figure 1 B représente, le diagramme de distribution de la taille des nanoplateformes obtenues, et la courbe modélisant cette distribution par une fonction log-normale. La distribution est centrée autour d’une taille de 17 nm.
La Figure 2 représente le diffractogramme des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 obtenu par DRX (mesures effectuées sur poudre en utilisant un diffractomètre de poudre rayon-X Bruker D2 Phaser). La courbe est représentative d’un composé amorphe.
La Figure 3 A représente le spectre Raman des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuées sur poudre en utilisant un microscope Raman Explora équipé d’un objectif à air (50x) et opérant à 785 nm). La présence d’une bande intense à 1575 cm 1 (Bande G du graphite), l’absence d’une bande à 2714 cm 1 (Bande 2D du graphite), et la faible bande entre 1310 et 1350 cm 1 (Bande D du graphite) ne suggèrent pas la présence de graphite dans l’échantillon.
La Figure 3 B représente le spectre Infrarouge des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuées sur pastille de KBr en utilisant un spectromètre PerkinElmer Spectrum 100 Optica).
La Figure 4 A représente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuées sur poudre en utilisant un spectromètre K-alpha) pour le carbone.
La Figure 4 B représente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuées sur poudre en utilisant un spectromètre K-alpha) pour l’azote. Le pic est centré autour d’une énergie de liaison de 399.8 eV.
La Figure 4 C représente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuées sur poudre en utilisant un spectromètre K-alpha) pour l’oxygène. Le premier pic est centré autour d’une énergie de liaison de 531 ,0 eV, le second 532.2 eV et le troisième 533.2 eV.
La Figure 5 A représente les spectres d’émission (courbe pointillée) et d’absorption (courbe pleine) des nanoplateformes (mesures effectuées en solution dans l’eau en utilisant un fluorimètre Fluoro-Max et un spectromètre UV-Visible Jasco V-570 respectivement) NPC1 ou NPC2.
La Figure 5 B représente l’intensité de l’émission de fluorescence des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 en fonction de la longueur d’onde incidente et de la longueur d’onde émise. L’optimale correspond à une longueur d’onde incidente de 360 nm pour une émission de 455 nm.
La Figure 6 représente le spectre d’émission des nanoplateformes NPCi ou NPC2, à 37°C et avec une concentration de 25 pg/ml dans un milieu biologique (milieu de culture + sérum de veau fœtal), en fonction du temps, et avec une longueur d’onde incidente à 360 nm.
La Figure 7 représente les tests colorimétriques mesurant la survie des cellules, effectués après 72 h d'incubation des NPC2 (A, B et C). Le test d'impédance en temps réel mesurant la survie des cellules est effectué au moins pendant 72 h d'incubation des NPC2 (D, E et F). Ces tests ont été réalisés avec des doses de 1 à 100 pg/mL sur les cellules U-87-MG (A et D), HMEC-1 (B et E) et sur NHDF (C et F).
Panel A, B et C : axe des abscisses = Concentration en pg/mL et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %. Pour l’ensemble de ce panel,
• le test MTT est représenté par des tirets marqués d’un losange,
• le test Sulforhodamine B est représenté par des pointillés marqués d’un carré, et
• le test Alamar Blue est représenté par un trait marqué d’un triangle.
Panel D, E et F : axe des abscisses = temps en h et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %. Pour l’ensemble de ce panel,
• la dose de 5 pg/mL est représentée par un trait gris foncé
• la dose de 25 pg/mL est représentée par un trait gris très clair
• la dose de 50 pg/mL est représentée par un trait gris clair
• la dose de 100 pg/mL est représentée par un trait noir profond.
La Figure 8 représente les tests colorimétriques mesurant la survie des cellules, effectués après 72 h d'incubation des NPC2. Ces tests ont été réalisés avec des doses de 1 à 100 pg/mL sur les cellules HMEC-1 , U-87 MG, GL261 DsRed, OLN-93, C8-D1A
axe des abscisses = Concentration en pg/mL et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %.
La Figure 9 représente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-87-MG, HMEC- 1 , et NHDF après une incubation de 4 h (marqué NPC2 1 pg/mL et NPC2 5 pg/mL) avec des vues orthogonales montrant la distribution des NPC2 dans l'épaisseur des cellules. L'internalisation des NPC2 par les HMEC- 1 et les NHDF est négligeable alors que ITinternalisation dans les cellules U-87-MG est visible. Ce constat est fait à partir d'images de fluorescence à deux photons obtenues à une excitation de 740 nm et des émissions de 480 à 550 nm après correction de l'autofluorescence, ainsi que des images obtenues en lumière transmise pour localiser les cellules.
Barre d'échelle: 35 pm La Figure 10 représente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-87-MG, HMEC- 1 , et NHDF après une incubation de 4 h et une concentration en NPC2 de 25 pg/ml. Les cellules U-87-MG et les cellules NHDF ne présentent pas de modification majeure de l’internalisation des NPC2 par rapport à la Figure 8. Par contre, l’internalisation des NPC2 à 25 pg/mL est améliorée dans les cellules HMEC-1 telles qu'observées à partir d'images de fluorescence à deux photons après correction de l’autofluorescence. Des images en lumière transmise sont également fournies pour localiser les cellules.
Barre d'échelle: 35 pm
La Figure 11 représente l’internalisation des NPC2 dans les cellules U-251 MG après une incubation de 4 h et une concentration en NPC2 de 1 , 5 et/ou 25 pg/mL. Les cellules contrôles ont été exposées au milieu de culture seulement. Il est mis en évidence une internalisation des NPC2 dans ces cellules comme le montrent les images de fluorescence à deux photons obtenues à une excitation de 740 nm et des émissions de 480 à 550 nm après correction de l'autofluorescence. Des images en lumière transmise sont également fournies pour localiser les cellules.
Barre d'échelle: 35 pm
La Figure 12 représente l’internalisation des NPC2 dans les cellules U-87 MG avec une concentration en nanoplateformes NPC2 de 0 (contrôles), 1 ou 5 pg/ml dans des conditions de blocage ou non de l’endocytose (sans blocage, inhibition de l'endocytose énergie-dépendante, inhibiteur de clathrine, inhibiteur de cavéoline, inhibiteur de rafts lipidiques).
Les NPC2 sont internalisés dans les cellules U-87-MG après traitement par des concentrations de 1 et 5 pg/mL pendant 4 heures en l’absence d’inhibition de l’endocytose (contrôle positif). Lorsque ces mêmes cellules sont cultivées à 4° C afin de bloquer l'endocytose énergie-dépendante ou à des inhibiteurs de l'endocytose utilisant la voie de la cavéoline ou des radeaux lipidiques, nous ne retrouvons pas de NPC2 à l’intérieur des cellules ce qui témoigne de l’implication de ces voies d’endocytose dans l’internalisation cellulaire de NPC2. Par contre, celles en présence d’un inhibiteur de l’endocytose utilisant la voie de la clathrine restent capables d’internaliser les NPC2 à des concentrations de 1 et 5 pg/mL. Les images en lumière transmise sont fournies pour localiser les cellules. Toutes les images de fluorescence à deux photons obtenues à une excitation de 740 nm avec une émission de 480 à 550 nm sont corrigées en soustrayant l’autofluorescence des cellules témoins non traitées.
Barre d'échelle: 35 pm
La Figure 13 représente les tests de viabilité cellulaire comparatifs entre le paclitaxel seul (PTX) et les nanoplateformes actives de l’exemple 3.1 (NPC2-PTX) sur les cellules HMEC-1 (A) ; SK-N-SH (B) et U-87 MG (C), et mesurés par le test MTT, après 72 heures de traitement avec une gamme de concentration allant de 0, 1 à 100 nM exprimée en PTX ou équivalent PTX porté par NPC2, ou mesuré par le test d’impédance en temps réel après 72 h de traitement des HMEC-1 (D) pour les nanoplateformes actives de l’exemple 3.1. Ces données ont permis de déterminer les IC50 du paclitaxel et des nanoplateformes actives de l’exemple 3.1 selon la lignée considérée.
Axe des abscisses = Concentration de PTX ou équivalent PTX porté par NPC2 en nM et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %
La Figure 14 représente le tests MTT mesurant la survie des cellules, effectués après 72 h d'incubation des NPC2-PTX. Ces tests ont été réalisés avec des doses de 0.1 à 10 mM sur les cellules U-87-MG et GL261.
Axe des abscisses = Concentration en mM et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %.
La Figure 15 représente l’activité pharmacologique du PTX (A et C) et des NPC2- PTX (B et D), analysée par immunofluorescence indirecte de la tubuline sur cellules HMEC-1 (A et B) et U-87 MG (C et D) après 6 h de traitement avec des concentrations de PTX ou équivalent PTX porté par NPC2 de 10, 50 et/ou 100 nM.
Barre d'échelle : 0,5 cm = 10 pm
La Figure 16 représente l’activité pharmacologique du NPC2-PTX et des NPC2, analysée par immunofluorescence indirecte de la tubuline sur cellules U-87 MG après 24 h de traitement avec des concentrations NPC2-PTX d’équivalent PTX porté par NPC2 de 5 et 10 pM et des concentrations NPC2 de 38 et 76 pg/ml.
Barre d'échelle : 0,5 cm = 10 pm
La Figure 17 représente l’activité pharmacologique du PTX et des NPC2-PTX, déterminée par microscopie optique sur les cellules U-87 MG en culture 3D avant traitement (J0) et 7 et 14 jours après traitement avec des concentrations qui correspondent à l’IC5o calculée en 2D (doses équitoxiques), à 2,8 fois l’IC5o et à 4 fois l’ICso.
Barre d’échelle : 500 pm
La Figure 18 représente l’activité du PTX et des NPC2-PTX, mesurée sur les cellules U-87 MG en culture 3D par le test d’Alamar Blue 7 jours (A) et 14 jours après traitement (B). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au contrôle normalisé à 100 %.
Axe des abscisses = Concentration en multiple de l’IC5o et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %
Axe des abscisses = Concentration en multiple de l’IC5o et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en % La Figure 19 représente l’activité pharmacologique des NPC2 et des NPC2-PTX, déterminée par microscopie optique sur les cellules GL261 sphéroïdes en culture 3D avant traitement (J0) et 7 et 14 jours après traitement avec une concentration NPC2- PTX de 20 pM et une concentration NPC2 de 153 pg/ml
La Figure 20 représente l’activité pharmacologique des NPC2 et des NPC2-PTX, déterminée par microscopie optique sur les cellules GL261 sphéroïdes en culture 3D avant traitement (J0) jusqu’à 14 jours après traitement avec des concentrations NPC2-PTX de 10 et 20 pM et des concentrations NPC2 de 76 et 153 pg/ml
Axe des abscisses = temps après traitement en jours = surface normalisée des cellules
La Figure 21 représente l’activité pharmacologique des NPC2 et des NPC2-PTX, déterminée par microscopie optique sur les cellules GL261 sphéroïdes en culture 3D 14 jours après traitement avec une concentration NPC2-PTX de 20 mM et une concentration NPC2 de 153 pg/ml
Axe des abscisses = Concentration des nanoparticules et l’axe des ordonnées = viabilité cellulaire en %
La Figure 22 représente le suivi du poids corporel chez la souris C57BL/6 jusqu’à 14 jours après traitement avec une dose de NPC2-PTX de 11 mg/kg et une dose de NPC2 de 2 mg/kg
Axe des abscisses = temps après traitement en jours et l’axe des ordonnées = poids moyen par groupe (g)
Exemples
Exemple 1 : Synthèse de la nanoplateforme initiale NPCi et de la nanoplateforme NPC?
1. Synthèse de la nanoplateforme initiale NPCi
Dans un Bêcher de 50 ml, de l'acide citrique monohydraté (5,25 g, 25,0 mmol) est dissous dans de l'eau distillée (5 ml), puis de la diéthylène triamine est ajoutée au goutte à goutte (3,0 ml, 2.87g, 27,6 mmol). La solution aqueuse jaune résultante est chauffée à l'aide d'un four à micro-ondes pendant 2 minutes à 600 W de puissance. Après refroidissement du résidu, de l'éthanol (25 ml) est ajouté et le résidu est gratté avec une spatule jusqu'à formation d'une poudre légèrement brune. Après sonication aux ultrasons pendant 2 minutes, la suspension homogène est centrifugée à 6000 tr / min pendant 10 minutes. La poudre brunâtre au fond du cylindre de centrifugation est recueillie et lavée avec de l'éthanol puis avec de l'éther diéthylique donnant 4,8 g de nanoplateformes initiale NPCi en poudre brune après séchage complet sous vide soit un rendement massique de 60%.
2. Synthèse de la nanoplateforme NPC2
Des nanoplateformes NPC1 (200mg) sont mis en solution dans 1 ml d’éthylène- diamine. Cette solution est maintenue à une température de 115 °C sous agitation pendant 12 heures. La solution brune obtenue est refroidie à la température ambiante puis additionnée goutte à goutte à 20 ml de dichlorométhane sous agitation. Une suspension est alors obtenue. Celle-ci est centrifugée à 6000 tours/minute pendant 10 minutes. Le culot est remis en suspension dans 20 ml de dichlorométhane à l’aide d’ultrasons pendant 5 minutes puis de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions que précédemment. Ce processus est répété une 3eme fois. La poudre marron obtenue est alors séchée sous vide (0.1 torr) à 50°C pendant 2 h. On obtient 190 mg de poudre sèche soit un rendement massique de 95% par rapport à NPC2. Le test de Kaiser permet le dosage du nombre de fonctions amines primaires à la surface des nanoparticules soit 2.7 méquivaients de NH2 /g. La même réaction réalisée avec le 1 ,3 diaminopropane à 135°C pendant 12 h conduit à 185 mg de poudre sèche (Rendement massique = 92.5% / NPC2) portant 3 méquivaients de NH2/g de nanoparticules.
Exemple 2 : Caractéristique de la nanoplateforme NPC?
1. Composition de la nanoplateforme NPC2
En raison de la taille de la nanoplateforme obtenue, l’utilisation de la technique XPS permet de connaître les liaisons internes et de surface de la nanoplateforme et donc les atomes composant la nanoplateforme. Les nanoplateformes NPC2 sous forme de poudre sont « ancrées » mécaniquement dans une matrice en indium ultra-pur (par pression), puis l’ensemble est analysé par un spectromètre K-alpha. Les résultats, présentés sur la figure 3, montre la présence des liaisons suivantes dans les nanoplateformes : C=C, C- C, C-CO, C-CN, C-O, C-N, N-C=0, C-NHR et COO.
2. Mesure de la solubilité de la nanoplateforme NPC2
En raison de la très forte solubilité des nanoplateformes dans l’eau, combinée à une très forte absorptivité, une technique d’absorption est impossible à utiliser. La solubilité a été mesurée par un contrôle uniquement visuel. Pour cette mesure, de la poudre de nanoplateforme telle qu’obtenue précédemment est ajoutée dans 64 mg d’eau. La solution est agitée pendant quelques minutes. Avec un ajout de 16.7 mg de nanoplateforme, la solution après agitation est fortement colorée et limpide à l’œil. La solubilité des nanoplateformes est donc supérieure à 250 g/l.
3. Dureté de la nanoplateforme NPC2 La dureté des nanoplateformes a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM). Le microscope à force atomique utilisé est un modèle Bruker Dimension Icon et la pointe utilisée est une pointe ScanAsyst-Air avec un rayon de courbure de 2 nm. Le module de Young est mesuré en utilisant le mode peak force de l’appareil. Une solution aqueuse de nanoplateformes est déposée sur une lame en verre de microscope, puis le module de Young de l’échantillon est mesuré et est comparé à deux références : un film de polystyrène qui possède un module de Young de 3-3.5 GPa et un film de PDMS qui possède un module de Young de 3.5 MPa. Plusieurs dépôts de nanoplateformes ont été effectués. Les valeurs des modules de Young mesurés pour les divers échantillons se situent entre 1 et 4 GPa. On peut donc en conclure que les nanoplateformes ont une dureté proche de celle du polystyrène (polymère organique).
Densité de la nanoplateforme NPC2
La densité de la nanoplateforme est mesurée sur un pycnomètre AccuPyc II 1340 à partir de nanoplateformes sous forme de poudre et selon la technique d’expansion de gaz d’hélium. Dix mesures successives sont réalisées, puis la valeur de la densité est calculée comme étant la moyenne de ces dix mesures, soit une densité de 1.53.
Taille sèche de la nanoplateforme NPC2
La mesure de la taille « sèche » des nanoplateformes est faite sur un microscope électronique à transmission (HITACHI H7650 à 80 kV). Une goutte de solution aqueuse de nanoplateformes est déposée sur une grille de cuivre (recouverte d’un film de carbone) préalablement chargée positivement selon la technique « Glow discharge » (afin d’augmenter l’affinité des nanoplateformes pour la grille). Après une minute, l’excès de solution aqueuse est éliminé par capillarité au moyen d’un papier absorbant puis une goutte d’une solution aqueuse d’acétate d’uranyle est ajoutée sur la grille pendant une minute. Après ce temps, l’excès de la solution aqueuse d’acétate d’uranyle est éliminé par capillarité au moyen d’un papier absorbant. L’opération est répétée deux fois pour le contrastant (acétate d’uranyle), puis la grille une fois sèche est prête pour l’observation. La taille des nanoplateformes est mesurée aléatoirement sur plusieurs clichés à l’aide du logiciel ImageJ (nombre de particules mesurées > 400). La taille moyenne obtenue par TEM des nanoplateformes est de 17 nm.
Cristallinité de la nanoplateforme NPC2
a. Par DRX
Des nanoplateformes sous forme de poudre sont analysées sur un diffractomètre de poudre rayon-X Bruker D2 Phaser. A titre d’information, le graphite présente une raie très fine et intense correspondant au plan (002) aux petits angles (2Q ~ 26°), et comme le montre le spectre de diffraction X sur poudre des nanoplateformes sur la figure 2, il n’y a aucune trace de cette raie caractéristique du graphite.
b. Par spectroscopie Raman
Des nanoplateformes sous forme de poudre sont dispersées sur une lame de microscope, puis les spectres Raman sont mesurés sur cette lame au moyen du microscope Raman Explora en utilisant un objectif à air (50x) et un laser à 785 nm.
Le graphite est caractérisé par plusieurs bandes en spectroscopie Raman, la bande G qui se situe à 1575 cm 1, la bande D qui se situe entre 1310 et 1350 cm 1, et la bande 2D qui se situe à 2714 cm 1(pour un laser à 785 nm)
De fait, sur le spectre Raman des nanoplateformes (figure 3), on peut observer une bande à 1583 cm 1 qui pourrait être la bande G, cependant, il n’y a pas de certitude sur la présence de la bande D. Enfin la bande 2D est absente du spectre. Il faut toutefois noter que dans certains cas, décrits dans la littérature, la bande 2D peut être absente pour des nanoplateformes de carbone.
La mesure par DRX et par Raman suggère le caractère substantiellement amorphe de la nanoplateforme.
Taux de fonctions de greffage amine primaire en surface de la nanoplateforme NPC2
Dans un tube à hémolyse, sont mélangés 20pL d’une solution aqueuse de nanoplateformes (typiquement quelques mg/mL), 100 pL d’une solution aqueuse de KCN contenant de la pyridine (Kit test Kaiser aldrich), 100 pL d’une solution alcoolique de phénol (80% dans l’éthanol, Kit test Kaiser aldrich) et 100 pL d’une solution alcoolique de ninhydrine (6% dans l’éthanol, Kit test Kaiser aldrich). Le mélange est chauffé à 120°C pendant 5 minutes, puis laissé à refroidir à température ambiante. 20 pL de la solution précédemment obtenue sont dilués dans 2 mL d’éthanol, puis l’absorbance à 580 nm de cette nouvelle solution est mesurée. La concentration en amine primaire ayant réagi avec la ninhydrine est déduite de la valeur de l’absorbance et reflète donc la quantité d’amine primaire réactive présente à la surface des nanoplateformes. Pour les nanoplateformes, la valeur obtenue est de 0.7 pmol de NH2 réactive par mg de nanoplateformes. Pour les nanoplateformes refonctionnalisées, le taux de fonctions de greffage amine primaire est de 3.3 pmol de NH2 réactive par mg de nanoplateformes refonctionnalisées.
Fluorescence de la nanoplateforme NPC2
L’absorbance d’une solution aqueuse de nanoplateformes (aérée et équilibrée thermiquement) fraîchement préparée est mesurée sur un spectromètre JASCO V-570 à température ambiante, dans une cuve en quartz avec un trajet optique de 1 cm. L’absorbance maximale des nanoplateformes a lieu à la longueur d’onde de 360 nm. L’émission de fluorescence des nanoplateformes est mesurée sur la même solution de nanoplateformes après dilution préalable de celle-ci jusqu’à atteindre une absorbance inférieure à 0.15 à 360 nm. La fluorescence est enregistrée sur un fluorimètre Fluoro-Max (Horiba) et la longueur d’onde d’émission maximale est de 455 nm.
9. Stabilité de la nanoplateforme NPC2
La stabilité des nanoplateformes NPC2 a été testée :
• dans différents milieux (eau, PBS, milieu de culture avec sérum de veau fœtal),
• à différentes concentrations (25 pg/ml et 100 pg/ml)
• à différents pH (de 4 à 11 )
• à différentes températures (4° et 37°C)
La stabilité des nanoplateformes est suivi grâce à l’évolution de l’émission de fluorescence sous une longueur d’onde incidente de 360 nm.
Les résultats de la figure 5 montrent une diminution de l’intensité de la fluorescence émise dans le temps pendant les premières 24 h avant d’atteindre un palier au bout de 48 h.
Les exemples ci-dessous (exemples 3 à 17) sont réalisés avec :
- le fluorophore F
5/6-carboxyfluorescein succinimidyl ester (mixed isomers), Texas Red-X succinimidyl ester (mixed isomers), Indocyanine green NHS active ester, Alexa Fluor 532/633/700/750/790 succinimidyl ester, Rhodamine B NHS active ester
- l’agent d’adressage anticorps A
Cétuximab, anticorps anti EGFR ou Bevacizumab anticorps anti VEGF
- l’agent d’adressage peptide A
RGD, TAT, angiopep-2
- la molécule active antitumorale M Paclitaxel, Docétaxel, Etoposide, Doxorubicine, Epirubicine, Idarubicine, Pirarubicine, Zorubicine, Aclarubicine,
Exemple 3 : Synthèse d’une nanoplateforme NPC2 avec un linker succinique (NPC2-L)
Une solution de nanoplateformes NPC2 dans le DMSO (1.0 équivalent, 50 g/L) est préparée, puis de l’anhydride succinique est ajouté (0.5 équivalent). La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit, puis le DMSO est éliminé par lyophilisation. Les traces de DMSO sont éliminées en faisant précipiter les nanoplateformes dans du dichlorométhane. La poudre obtenue est séchée sous vide. Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du linker succinique.
Exemple 4 : Activation du linker succinique des NPC2-L par de l’N- hydroxysuccinimide (NPC2-L-NHS)
Une solution de nanoplateformes porteuses du linker succinique dans le DMSO (1.0 équivalent, 100 g/L) est préparée, puis une solution d’EDC.HCI dans le DMSO (0.5 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante 5 minutes puis une solution de /V-hydroxysuccinimide (NHS) dans le DMSO (0.5 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée fortement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) puis lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme comportant le linker succinique activé NHS.
Exemple 5 : Synthèse des nanoparticules actives NPC2-L-M
Les nanoplateformes avec le linker succinique activé NHS (NPC2-L-NHS) sont dissoutes dans une solution de DMSO (1.0 équivalent de linker activé, 50 mg/L) avec 1.0 équivalent de A/,/V-diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de la molécule active antitumorale M. Dans le cas où, la molécule active antitumorale M est sous forme de chlorhydrate, 1.0 équivalent de A/,/V-diisopropyléthylamine est ajouté pour chaque équivalent de sel. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation puis lavé au dichlorométhane 3 fois. Une fois le solvant résiduel éliminé sous pression réduite, le résidu solide obtenu est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée trois fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant la molécule d’activité antitumorale M liée par un linker succinique.
Exemple 6 : Activation de l’agent d’adressage anticorps :
Une solution aqueuse d’anticorps (6 prnol/L) contenant du periodate (10 mM) est agitée pendant 30 minutes dans le noir à température ambiante puis la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air comprimé (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée trois fois avec de l’eau distillée et peut être utilisée telle quelle ou bien congelée et lyophilisée.
Exemple 7 : Synthèse des nanoparticules NPC?-L-A (anticorps)
Une solution de nanoplateformes porteuses du linker succinique (NPC2-L) dans l’eau est préparée (1.0 équivalent de linker, 50 mg/L), puis 0.1 équivalent d’hydrate d’hydrazine est ajouté. La solution est chauffée par micro-ondes pendant 90 secondes à 900 W. La solution est congelée puis lyophilisée. Les nanoparticules sont maintenant porteuses de fonctions hydrazides.
Des nanoparticules porteuses de fonctions hydrazides sont dissoutes (1.0 équivalent d’hydrazide) dans une solution aqueuse d’anticorps activé (1.0 équivalent, 6 pmol/L). La solution est agitée doucement pendant 4 h dans le noir à température ambiante, puis un léger excès de NaBH3CN (1.1 équivalent) est ajouté. La solution est agitée une heure supplémentaire dans le noir à température ambiante. Une fois la réaction de réduction terminée, la solution aqueuse est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau distillée puis est congelée et lyophilisée. Les nanoparticules sont maintenant porteuses de l’agent d’adressage anticorps A lié par un linker.
Exemple 8 : Synthèse des nanoparticules NPC?-L-A (peptide)
Les nanoplateformes avec le linker succinique activé NHS (NPC2-L-NHS) sont dissoutes dans une solution de DMSO (1.0 équivalent de linker activé NHS, 50 mg/L) avec 1.0 équivalent de A/,/V-diisopropyléthylamine et 0.1 équivalent d’agent d’adressage peptide A. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu solide obtenu correspond à la nanoplateforme portant l’agent d’adressage peptide A.
Exemple 9 : Synthèse des nanoparticules actives NPC?-(L-M)-L-A (anticorps) A une solution de nanoplateformes avec l’agent d’adressage anticorps (NPC2-L- A(anticorps)) dans le DMSO (1.0 équivalent de linker libre, 50 mg/L) est ajouté une quantité catalytique de 4-diméthylaminopyridine, 1.0 équivalent de N,N’~ diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de la molécule active antitumorale M. Dans le cas où, la molécule active antitumorale M est sous forme de chlorhydrate, 1.0 équivalent supplémentaire de diisopropyléthylamine est ajouté pour chaque équivalent d’hydrate. La solution est agitée 5 minutes puis un léger excès d’EDC.HCI en solution dans le DMSO (1.1 équivalent, 0.2 mol/L) est ajouté. La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée doucement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite. Le résidu solide est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant l’agent d’adressage anticorps A et la molécule d’activité antitumorale M tous deux liés par un linker.
Exemple 10 : Synthèse des nanoparticules actives NPC?-(L-M)-L-A (peptide)
A une solution de nanoplateformes avec l’agent d’adressage peptidique (NPC2-L- A(peptide)) dans le DMSO (1.0 équivalent de linker libre, 50 mg/L) est ajouté 1.0 équivalent de /V,/V-diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de la molécule active antitumorale M. Dans le cas où, la molécule active antitumorale M est sous forme de chlorhydrate, 1.0 équivalent de diisopropyléthylamine est ajouté pour chaque équivalent de chlorhydrate. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu solide obtenu est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant l’agent d’adressage peptide A et la molécule d’activité antitumorale M.
Exemple 11 : Activation de la Rhodamine B par de l’N-hydroxysuccinimide
Une solution de Rhodamine B dans le DMSO (1.0 équivalent, 100 g/L) est préparée, puis une solution d’EDC.HCI dans le DMSO (1.1 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante 5 minutes puis une solution de N- hydroxysuccinimide dans le DMSO (1.0 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est filtrée sur coton et le filtrat est congelé puis lyophilisé. La poudre obtenue est utilisée telle quelle, et correspond à la Rhodamine B avec l’ester activé NFIS.
Exemple 12 : Synthèse des nanoparticules NPC2-L-F
Des nanoparticules porteuses de fonctions hydrazides sont dissoutes (1.0 équivalent d’hydrazide) dans une solution de fluorophore F dans le DMSO (1.0 équivalent, 1 mol/L). Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu solide est dissous dans un volume d’eau et la solution aqueuse est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau distillée puis est congelée et lyophilisée. Les nanoparticules sont maintenant porteuses du fluorophore F lié par un linker et de linker libre.
Exemple 13 : Synthèse des nanoparticules actives NPC2-(L-F)-L-M
Des nanoparticules porteuses du fluorophore F sont dissoutes dans le DMSO (1.0 équivalent de linker libre, 50 mg/L), puis sont ajouté une quantité catalytique de 4- diméthylaminopyridine, 1.0 équivalent de A/,/V-diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de la molécule active antitumorale M. Dans le cas où la molécule active antitumorale M est sous forme de chlorhydrate, 1.0 équivalent de diisopropyléthylamine est ajouté pour chaque équivalent de chlorhydrate. La solution est agitée 5 minutes puis un léger excès d’EDC.FICI en solution dans le DMSO (1.1 équivalent, 0.2 mol/L) est ajouté. La solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté afin de faire précipiter les nanoparticules, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée doucement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite. Le résidu solide obtenu est dissous dans 20ml d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant le fluorophore F et la molécule d’activité antitumorale M.
Exemple 14 : Synthèse des nanoparticules NPC?-(L-F)-L-A (anticorps)
Des nanoparticules porteuses du linker succinique et de fonctions hydrazides sont dissoutes (1.0 équivalent d’hydrazide) dans une solution de fluorophore F dans le DMSO (0.5 équivalent, 1 mol/L). Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite.
Le résidu solide obtenu est ajouté à une solution aqueuse d’anticorps activé (0.5 équivalent, 6 pmol/L), puis la solution est agitée doucement pendant 4 h dans le noir à température ambiante Un léger excès de NaBH3CN (1.1 équivalent) est ajouté et la solution est agitée une heure supplémentaire dans le noir à température ambiante. Une fois la réaction de réduction terminée, la solution aqueuse est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau distillée puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme comportant le fluorophore F et l’agent d’adressage anticorps A.
Exemple 15 : Synthèse des nanoparticules NPC?-(L-F)-L-A (peptide)
A une solution de nanoparticules porteuses du fluorophore F dans le DMSO (1.0 équivalent en linker succinique libre, 100 g/L) est ajouté une solution d’EDC.HCI dans le DMSO (0.2 équivalent, 0.2 mol/L). La solution est agitée à température ambiante 5 minutes puis une solution de /V-hydroxysuccinimide dans le DMSO (0.1 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée fortement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite.
Le résidu solide obtenu est dissous dans du DMSO (1.0 équivalent de linker-NHS, 50 mg/L) avec 1.0 équivalent de A/,/V-diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de l’agent d’adressage peptide A. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée trois fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme comportant le fluorophore F et l’agent d’adressage peptide A.
Exemple 16 : Synthèse des nanoparticules actives NPC2-(L-F)-(L-M)-L-A (anticorps) Des nanoparticules porteuses de fonctions hydrazides sont dissoutes (1.0 équivalent d’hydrazide) dans une solution de fluorophore F dans le DMSO (0.5 équivalent, 1 mol/L). Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite.
Le résidu solide obtenu est dissous dans une solution aqueuse d’anticorps activé (0.5 équivalent, 6 pmol/L), puis la solution est agitée doucement pendant 4 h dans le noir à température ambiante. Un léger excès de NaBH3CN (1.1 équivalent) est ajouté et la solution est agitée une heure supplémentaire dans le noir à température ambiante. Une fois la réaction de réduction terminée, la solution aqueuse est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau distillée puis est congelée et lyophilisée.
Le résidu solide obtenu est dissous dans du DMSO (1.0 équivalent de linker libre, 50 mg/L) avec une quantité catalytique de 4-diméthylaminopyridine, 1.0 équivalent de /V,/V-diisopropyléthylamine et 1.0 équivalent de la molécule active antitumorale M. Dans le cas où, la molécule active antitumorale M est sous forme de chlorhydrate, 1.0 équivalent de diisopropyléthylamine est ajouté pour chaque équivalent de chlorhydrate. La solution est agitée 5 minutes puis un léger excès d’EDC.HCI en solution dans le DMSO (1.1 équivalent, 0.2 mol/L) est ajouté. La solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée doucement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite. Le résidu solide est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est 3 trois fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant le fluorophore F, l’agent d’adressage anticorps A et la molécule d’activité antitumorale M.
Exemple 17 : Synthèse des nanoparticules actives NPC2-(L-F)-(L-M)-L-A (peptide)
A une solution de nanoparticules porteuses du fluorophore F dans le DMSO (1.0 équivalent en linker succinique libre, 100 g/L) est ajouté une solution d’EDC.HCI dans le DMSO (1.1 équivalent, 0.2 mol/L). La solution est agitée à température ambiante 5 minutes puis une solution de /V-hydroxysuccinimide dans le DMSO (1.0 équivalent, 0.2 mol/L) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. La suspension est agitée fortement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 rpm, 4 minutes) et lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite.
Le résidu solide obtenu est dissous dans du DMSO (1.0 équivalent de linker-NHS, 50 mg/L) avec un équivalent de /V,/V-diisopropyléthylamine et 0.1 équivalent de l’agent d’adressage peptide A et 0.9 équivalent de la molécule active antitumorale M. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane est ajouté, provoquant la précipitation de la nanoplateforme. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) et lavé au dichlorométhane 3 fois. Les résidus de solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu obtenu est dissous dans un volume d’eau et la solution est filtrée par ultracentrifugation avec un filtre 1 kDa sous pression d’air (4 bars). La solution retenue par le filtre est lavée 3 fois avec de l’eau puis est congelée et lyophilisée. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme comportant le fluorophore F, l’agent d’adressage peptide A et la molécule active antitumorale M.
Exemple 18 : Synthèses des nanoplateformes actives
1. Synthèse d’une nanoplateforme active avec linker long et paclitaxel
Une solution de nanoplateformes dans le DMSO (50 g/L, 2 ml_) est préparée, puis de l’anhydride succinique est ajouté (9.4 mg). La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit, puis le DMSO est éliminé par lyophilisation. Les traces de DMSO sont éliminées en faisant précipiter les nanoplateformes dans du dichlorométhane. La poudre obtenue est séchée sous vide (m = 66 mg). Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du linker. Les nanoplateformes avec le linker succinique sont ensuite dissoute dans du DMF (67 g/L, 0.6 mL) est ajouté du paclitaxel (6.0 mg), du DMAP en quantité catalytique puis de l’EDC.HCI (6.2 mg). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 60 h, puis de l’eau est ajouté pour détruire l’EDC qui n’a pas réagi. Le mélange de solvant (eau et DMF) est évaporé sous pression réduite, puis la poudre obtenue est lavée par de l’acétone et est récoltée par centrifugation. Le solide obtenu est purifié sur une colonne de Sephadex LH20 en utilisant l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis évaporées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active (m = 31.7 mg) comportant la molécule active paclitaxel liée par un linker long.
2. Synthèse d’une nanoplateforme active avec linker long et doxorubicine
Une solution de nanoplateformes porteuses du linker long dans le DMSO (100 g/L, 1 mL) est préparée, tel que décrite ci-dessus, puis une solution d’EDC.FICI dans le DMSO (0.178 mol/L, 0.27 mL) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante 5 minutes puis une solution de N- hydroxysuccinimide dans le DMSO (0.174 mol/L, 0.26 mL) est ajoutée. La solution est agitée à température ambiante pendant 21 h puis du dichlorométhane (12 mL) est ajouté afin de saturer le DMSO en dichlorométhane et de faire précipiter les nanoplateformes actives. La suspension est agitée fortement pendant 5 minutes, puis le précipité est récupéré par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) puis lavé 3 fois par du dichlorométhane. Les traces résiduelles de solvant sont éliminées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active (m = 80.8 mg) comportant le linker long activé NFIS. Les nanoplateformes avec le linker long activé NFIS peuvent être dissous dans une solution de DMSO contenant du carbonate de potassium et du chlorhydrate de doxorubicine. Cette solution est agitée à température ambiante pendant une nuit puis du dichlorométhane peut être rajouté. Le précipité obtenu est récolté par centrifugation et lavé au dichlorométhane 3 fois. Une fois le solvant résiduel éliminé sous pression réduite, si le produit obtenu n’est pas pur, le résidu est purifié sur Sephadex LH20 avec l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le produit pur sont rassemblées et le solvant est éliminé par lyophilisation. Le résidu solide obtenu correspond à la nanoplateforme active comportant la molécule active doxorubicine liée par un linker long.
Synthèse d’une nanoplateforme active avec fluorophore et linker court et molécule active avec linker long.
Une solution de nanoplateformes dans le DMF (25 g/L, 4 ml_) est préparée, puis du carbonate de sodium est ajouté (424 mg). La solution est chauffée à 61 °C et une fois cette température atteinte, de la lissamine rhodamine B est ajoutée (1.5 mg). La solution est agitée à 61 °C pendant la nuit et le DMF est évaporé sous pression réduite puis le résidu obtenu est neutralisé par de l’acide chlorhydrique (pH~1 ). La solution aqueuse est concentrée sous pression réduite puis le résidu est solubilisé dans de l’éthanol, centrifugé et le surnageant est collecté afin d’éliminer les sels non solubles dans l’éthanol. Une fois l’éthanol éliminé sous pression réduite, la poudre obtenue (69 mg) est séchée sous vide. Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court. Les nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) sont ensuite dissoute dans du DMSO, puis du carbonate de sodium est ajouté (424 mg). La suspension est agitée à température ambiante pendant 5 minutes, puis de l’anhydride succinique (100 mg) est ajouté. La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit puis de l’eau est ajoutée, suivi d’acide chlorhydrique jusqu’à ce que le pH de la solution atteigne ~1. La solution est concentrée sous pression réduite puis les solvants résiduels sont éliminés par lyophilisation. Le résidu obtenu est dissout dans de l’éthanol absolu et les sels non soluble sont éliminés par centrifugation. La phase alcoolique surnageante est récoltée puis évaporée sous pression réduite jusqu’à l’obtention d’une poudre. Les traces d’acide succinique résiduelles sont éliminées en lavant le résidu solide obtenu par du chloroforme puis par de l’acétone. La poudre résiduelle (38 mg) est séchée sous vide. Les nanoplateformes porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Une solution des nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B et le linker long dans le DMF (12.5 g/L, 2 mL) est préparée puis du paclitaxel (3 mg), du DMAP (quantité catalytique) et de l’EDC.HCI (6.18 mg) sont ajoutés. La solution est agitée à température ambiante pendant 60h puis de l’eau est ajoutée. La solution est concentrée sous pression réduite et la poudre résiduelle obtenue est lavée par de l’acétone. Une fois séchée, la poudre obtenue est purifiée sur Sephadex LH20 en utilisant de l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis l’eau est éliminée par lyophilisation. La poudre obtenue (22.9 mg) correspond à la nanoplateforme active comportant le fluorophore lissamine rhodamine B lié par un linker court et la molécule active paclitaxel liée par un linker long. Synthèse d’une nanoplateforme active avec agent d’adressage avec linker long et molécule active avec linker long.
Une solution de nanoplateformes dans le DMSO (50 g/L, 2 mL) est préparée, puis de l’anhydride succinique est ajouté (9.4 mg). La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit, puis le DMSO est éliminé par lyophilisation. Les traces de DMSO sont éliminées en faisant précipiter les nanoplateformes dans du dichlorométhane. La poudre obtenue est séchée sous vide (m = 66 mg). Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Les nanoplateformes avec le linker succinique sont ensuite dissoute dans du DMF (67 g/L, 0.6 mL). Dans la solution obtenue est ajouté du paclitaxel (6.0 mg), du DMAP en quantité catalytique puis de l’EDC.HCI (6.2 mg). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 60 h, puis de l’eau est ajoutée pour détruire l’EDC qui n’a pas réagi. Le mélange de solvant (eau et DMF) est évaporé sous pression réduite, puis la poudre obtenue est lavée par de l’acétone et est récoltée par centrifugation. Le solide obtenu est purifié sur une colonne de Sephadex LH20 en utilisant l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis évaporées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active (m = 31.7 mg) comportant la molécule active linker long. Les nanoplateformes avec la molécule active linker succinique peuvent ensuite être dissoutes dans du DMF, puis un dérivé diester du peptide RGD et de l’EDC. HCI sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 60 h, puis de l’eau est ajoutée pour détruire l’EDC qui n’a pas réagi. Le mélange de solvant (eau et DMF) est évaporé sous pression réduite, puis la poudre obtenue est lavée par de l’acétone et est récoltée par centrifugation. Le solide obtenu est purifié sur une colonne de Sephadex LH20 en utilisant l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis évaporées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant l’agent d’adressage lié par un linker long et la molécule active liée par un linker long.
Synthèse d’une nanoplateforme active avec agent d’adressage / molécule active avec linker long et fluorophore avec linker court.
Une solution de nanoplateformes dans le DMF (25 g/L, 4 mL) est préparée, puis du carbonate de sodium est ajouté (424 mg). La solution est chauffée à 61 °C et une fois cette température atteinte, de la lissamine rhodamine B est ajoutée (1.5 mg). La solution est agitée à 61 °C pendant la nuit et le DMF est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est neutralisé par de l’acide chlorhydrique (pH~1 ). La solution aqueuse est concentrée sous pression réduite puis le résidu est solubilisé dans de l’éthanol, centrifugé et le surnageant est collecté afin d’éliminer les sels non solubles dans l’éthanol. Une fois l’éthanol éliminé sous pression réduite, la poudre obtenue (69 mg) est séchée sous vide. Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court. Les nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) sont ensuite dissoutes dans du DMSO, puis du carbonate de sodium est ajouté (424 mg). La suspension est agitée à température ambiante pendant 5 minutes, puis de l’anhydride succinique (100 mg) est ajouté. La solution est agitée à température ambiante pendant la nuit puis de l’eau est ajoutée, suivie d’acide chlorhydrique jusqu’à ce que le pH de la solution atteigne ~1. La solution est concentrée sous pression réduite puis les solvants résiduels sont éliminés par lyophilisation. Le résidu obtenu est dissout dans de l’éthanol absolu et les sels non solubles sont éliminés par centrifugation. La phase alcoolique surnageante est récoltée puis évaporée sous pression réduite jusqu’à l’obtention d’une poudre. Les traces d’acide succinique résiduelles sont éliminées en lavant le résidu solide obtenu par du chloroforme puis par de l’acétone. La poudre résiduelle (38 mg) est séchée sous vide. Les nanoplateformes porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Une solution des nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B et le linker long dans le DMF (12.5 g/L, 2 mL) est préparée puis du paclitaxel (3 mg), du DMAP (quantité catalytique) et de l’EDC.HCI (6.18 mg) sont ajoutés. La solution est agitée à température ambiante pendant 60h puis de l’eau est ajoutée. La solution est concentrée sous pression réduite et la poudre résiduelle obtenue est lavée par de l’acétone, puis une fois séchée est purifiée sur Sephadex LH20 en utilisant de l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis l’eau est éliminée par lyophilisation. La poudre obtenue (22.9 mg) correspond aux nanoplateformes actives porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B (linker court) avec le paclitaxel (linker long). Les nanoplateformes avec la molécule active linker long et le fluorophore linker court sont ensuite dissoute dans du DMF, puis un dérivé diester du peptide RGD et de l’EDC.HCI sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 60 h, puis de l’eau est ajoutée pour détruire l’EDC qui n’a pas réagi. Le mélange de solvant (eau et DMF) est évaporé sous pression réduite, puis la poudre obtenue est lavée par de l’acétone et est récoltée par centrifugation. Le solide obtenu est purifié sur une colonne de Sephadex LH20 en utilisant l’eau comme éluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblées puis évaporées sous pression réduite. La poudre obtenue correspond à la nanoplateforme active comportant l’agent d’adressage et la molécule active liés chacun par un linker long et le fluorophore lié par un linker court.
Exemple 19 : Etude in vitro de l’innocuité des NPC?
Le but est de mesurer le taux de survie cellulaire en présence d’une gamme de NPC2 et déterminer l’impact de ces nanoplateformes sur la viabilité cellulaire.
Culture cellulaire
L’ensemble des tests in vitro est réalisé sur cinq lignées cellulaires :
Tableau G41. Lignées cellulaires et conditions d’expérimentation in vitro
Test de survie - Traitement
Suite à l’ensemencement des cellules comme décrit ci-dessus, les cellules adhérentes sont traitées avec une gamme de concentrations (1 , 5, 25, 50, 75 et 100 pg/mL) de NPC2 dispersés dans le milieu de culture. Le volume total est maintenu à 200 pL par puits et chaque condition est réalisée en quadruplé (test d’impédance) et/ou quintuplé (test colorimétrique). Un test de viabilité cellulaire est réalisé soit par un test colorimétrique après 72 h de traitement, soit par un test d’impédance sur une période d’au moins 72 h. Tous les tests colorimétriques ont été répétés 3 fois pour chaque lignée, tandis que le test d’impédance a été répété 2 fois sur les lignées U- 87-MG et HMEC-1 et a été fait une fois sur la lignée NDHF.
(1) Test colorimétrique - Test MTT
Ce test utilise comme réactif le 3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT), lequel est converti en formazan (cristal violet) par les cellules vivantes. Ce dernier absorbant à la longueur d’onde de 600 nm est détectable par une mesure d’absorbance.
Les cellules, après avoir subi le traitement ci-dessus avec des NPC2, sont incubées avec 200 pL de réactif MTT à 0,5 mg/mL dispersé dans le milieu de culture (Correard, F., et al. (2014). International Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) pendant 3 à 4 h à 37°C. Dès lors que les cristaux de formazan sont visibles dans les cellules au microscope à champ lumineux, le milieu est remplacé par 200pL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors lysées, les cristaux de formazan dissous et l’absorbance est mesurée avec un Spectrophotomètre Multiskan (Ascent, Labtec Systems) avec un filtre à 600 nm.
Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant la valeur d’absorbance des cellules traitées avec la valeur d’absorbance des cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
(2) Test colorimétrique - Test Alamar Blue Ce test se fait en une étape et utilise un réactif à base de résazurine, lequel est réduit par les cellules vivantes. Ceci entraîne un décalage de l’absorbance du réactif dont le pic d’absorbance passe de 570 nm (forme oxydée) à 595 nm (forme réduite) détectable par une mesure d’absorbance.
Les cellules, après avoir subi le traitement ci-dessus avec des NPC2, sont incubées avec 20 pL de réactif Alamar Blue ; soit 10 % du volume de milieu (Pasquier, E., et al. (2013). Angiogenesis. 2013 Apr;16(2):373-86) pendant 4 à 5 h à 37°C. L’absorbance est ensuite mesurée avec un lecteur de microplaque POLARstar Oméga (BMG LABTECH) avec un filtre à 570 nm et un filtre à 595 nm.
Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant le taux de fluorescence émise par le réactif Alamar Blue réduit dans les cellules traitées avec le taux présent dans les cellules contrôles non traitées, lequel est considéré comme référence et équivalent à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
(3) Test colorimétrique - Test Sulforhodamine B
Ce test est basé sur la biomasse protéique et utilise une sonde anionique sulforhodamine B, laquelle se fixe fortement aux protéines. L’inhibition de la croissance cellulaire est mesurée en utilisant un kit de dosage sulforhodamine B (Sigma Aldrich) comme décrit précédemment dans : Berges, R., et al. (2016). Mol Cancer Ther. 2016 Nov;15(11 ):2740-2749.
Les cellules, après avoir été traitées comme ci-dessus avec des NPC2, sont fixées à 4°C avec 50 pL d’acide trichloroacétique (TCA) 10 % froid. Les cellules sont ensuite lavées plusieurs fois avec de l’eau déionisée pour enlever toute trace de milieu et/ou de TCA. Les cellules sont alors séchées pour enlever toute trace d’eau et 50 pL de sulforhodamine B sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées 30 min, puis rincées 4-5 fois avec de l’acide acétique 10 % et séchées à l’air libre. Un volume de 200 pL de Tris base à 10 mM est ajouté dans chaque puits et la microplaque est agitée faiblement pour homogénéiser la sonde anionique sulforhodamine B. L’absorbance est ensuite mesurée avec un lecteur de microplaque POLARstar Oméga (BMG LABTECH) avec un filtre à 565 nm et un filtre à 620 nm pour éliminer le bruit de fond. Afin de s’affranchir des interactions parasites entre la sonde et le plastique, des « blancs » sont réalisés à partir de puits qui n’ont subi aucun traitement. Ceci peut également être utilisé pour s’assurer du lavage correct de cellules.
Le pourcentage de viabilité cellulaire est obtenu en comparant l’absorbance liée aux cellules traitées avec l’absorbance liée aux cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
(4) Test d’impédance en temps réel Le test d’impédance est basé sur une mesure en temps réel de la résistance induite par une monocouche cellulaire cultivée sur une électrode d’or, qui montre une variation lorsque les cellules se détachent de la surface. La mesure d’impédance est réalisée avec un impédancemètre (Xcelligence, ACEA Biosciences), et permet d’obtenir des informations quantitatives sur l’état des cellules vivantes (adhésion, prolifération, mortalité) en continu et en temps réel.
Une plaque 96 puits, recouverte d’électrodes d’or (E-plate 96) est ensemencée de la manière décrite précédemment (cf. tableau Z) dans un volume de 100 pL. Lorsque la mesure d’impédance atteint un plateau, la plaque est retirée du compteur, le milieu de culture est retiré et les cellules sont traitées avec des NPC2 comme décrit ci- dessus. La plaque est ensuite réinsérée dans le lecteur et l’impédance est mesurée toutes les 15 minutes pendant au moins 72 h.
Le pourcentage de viabilité cellulaire est obtenu en comparant la mesure d’impédance des cellules traitées par rapport à la mesure d’impédance des cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart-type est calculé à partir du nombre d’expériences indépendantes menées pour chaque lignée cellulaire considérée.
Résultats - Figures [7-8]
La viabilité cellulaire a été mesurée après l’incubation des cellules avec des concentrations croissantes de NPC2 de 1 à 100 pg/mL pendant au moins 72 h. Les cellules U-87 MG ne montrent aucune réduction de la viabilité cellulaire même à la concentration maximum de 100 pg/mL (Figure 7A, D), et ce quel que soit le test considéré, les mêmes résultats sont observés sur les lignées OLN 93 et C8-D1A (Figure 8). Les cellules HMEC-1 montrent une légère diminution de 20 % de la viabilité cellulaire à des concentrations supérieures à 50 pg/mL avec le test MTT (Figure 7B), laquelle s’observe également à des concentrations supérieures à 25 pg/mL avec le test d’impédance (Figure 7E). Pour les cellules NHDF, une diminution de 20 % de la viabilité cellulaire à des concentrations supérieures à 25 pg/mL est observée avec le test MTT et à 100 pg/mL avec le test d’impédance (Figure 7C, F), alors qu’aucune inhibition significative de la viabilité cellulaire n’est mesurée avec le test Alamar Blue (Figure 7C). Concernant le test sulforhodamine B, aucune diminution de la viabilité cellulaire n’est mesurée quelle que soit la lignée cellulaire considérée (Figure 7 A, B et C).
De manière générale, la diminution de viabilité cellulaire maximum observée est de 20 % pour la concentration maximale de 100 pg/mL de NPC2 après 72 h de traitement. Ceci démontre de façon très satisfaisante la faible toxicité de ces nanoplateformes vis-à-vis des lignées cellulaires humaines cancéreuses et/ou non cancéreuses testées.
Exemple G201 : Etude in vitro d’internalisation cellulaire
Le but est de démontrer qu’il existe une internalisation cellulaire des NPC2. Culture cellulaire
Cf. Exemple [19], tableau [4]
Les cellules U-251 MG sont également utilisées. Elles sont transfectées avec du dsRed (Alves, I. D., et al. (2014). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1838(8): 2087-2098) et cultivées dans du :
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) avec du rouge phénol,
- 2 mM de glutamine,
- 10 % de SVF, et
- 1 % (100 U/mL) de pénicilline-streptomycine.
Elles sont ensemencées 24 h avant traitement, à la densité de 20 000 cellules/cm2.
Test d’internalisation cellulaire
(1) Traitement
Après avoir ensemencé les cellules U-87-MG, U251 -MG, HMEC-1 et NHDF comme décrit précédemment, le milieu de culture est remplacé par du milieu de culture contenant des NPC2 (1 , 5 et/ou 25 pg/mL dans un volume équivalent à celui de l’ensemencement). Les cellules sont ensuite incubées 4 h à 37°C avant que le milieu soit retiré et les cellules fixées en vue de réaliser de la microscopie à 2-photons. Cette expérience est répétée 3 fois avec les cellules U-87-MG et 2 fois avec les cellules U-251 MG, HMEC1 et NHDF. Les répétitions sont réalisées avec des passages cellulaires différents
(2) Fixation
Les cellules sont lavées plusieurs fois avec du Phosphate Buffer Saline (PBS), fixées avec du paraformaldéhyde 4 % en PBS (15 min à température ambiante) et rincées 2 fois avec du PBS. Les cellules fixées sont conservées à 4°C dans du PBS.
(3) Microscopie à 2-photons
Les cellules sont imagées avec un microscope à 2-photons Zeiss couplé à un laser pulsé MAI-TAI, dont la longueur d’onde d’excitation est de 740 nm (Aex = 740 nm), et un photomultiplicateur capable de détecter des longueurs d’onde d’émission allant de 480 nm à 550 nm (480 nm < Aém £ 550 nm). Un objectif sec 20 x est utilisé. L’intensité moyenne de fluorescence et l’écart type des cellules contrôles non traitées avec les NPC2 sont utilisés pour déterminer le seuil de contribution d’autofluorescence dans les cellules traitées avec les NPC2 en utilisant MATLAB. Seules les intensités de fluorescence supérieures à au moins une fois l’écart type de l’intensité moyenne contrôle sont affichées en utilisant MATLAB.
Résultats - Figures [9 ; 10 ; 11]
L’innocuité des NPC2 étant démontrée, il est nécessaire de s’assurer qu’ils sont bien internalisés par des cellules de glioblastome en vue de leurs applications thérapeutiques futures. Pour cela, le protocole d’expérimentation décrit ci-dessus a été mis en place et une fois la correction de fluorescence appliquée sur les cellules traitées il ressort que :
- Après 4 h d’incubation avec les NPC2, il existe une importante internalisation de ces derniers par les cellules U-87-MG aux concentrations de 1 et 5 pg/mL, alors qu’elle est négligeable avec les cellules HMEC-1 et NHDF (Figure 9).
- A la concentration de 25 pg/mL, les cellules U-87-MG présentent toujours une excellente internalisation des NPC2 et ce de manière homogène. A cette même concentration, les cellules NFIDF n’internalisent pas les NPC2 alors que les cellules FIMEC-1 montrent une légère augmentation de l’internalisation des NPC2 mais pas de manière uniforme (Figure 10).
- La localisation cellulaire des NPC2 au sein des cellules U-87-MG a également été observée en réalisant un Z-scanning des cellules. Les images de fluorescence selon l’axe XY et les coupes orthogonales correspondantes XZ et YZ montrent une distribution homogène des NPC2 le long de l’axe Z (Figure 9, vues orthogonales des cellules U-87-MG).
- Les résultats obtenus avec la lignée additionnelle de glioblastome humain U- 251 MG montrent également une internalisation massive des NPC2 après 4 h d’incubation à toutes les concentrations (1 , 5 et 25 pg/mL de NPC2) (Figure 11 ) contrairement aux lignées cellulaires FIMEC-1 et NFIDF.
Par ailleurs, il a été observé que 4 h d’incubation des NPC2 est la durée optimale d’internalisation par les cellules U-87-MG par rapport à une incubation courte de 2 h et une incubation prolongée de 24 h. Ici, il est également démontré que les NPC2 sont préférentiellement internalisés dans les cellules cancéreuses.
Exemple G211 : Détermination de la voie utilisée pour l’internalisation cellulaire des N PC?
Le but est de déterminer le mécanisme cellulaire mis en œuvre.
Culture cellulaire
Seules les cellules U-87-MG sont utilisées : cf. Exemple [19], tableau [4], colonne U- 87-MG.
Test d’internalisation cellulaire
Cf. exemple [20].
Inhibition de l’internalisation énergie-dépendante
Après avoir ensemencé les cellules U-87-MG comme décrit précédemment, les cellules sont traitées avec 1 et/ou 5 pg/mL de NPC2 et incubées 4 h à 4°C puis rincées avec du PBS et fixées en vue de réaliser l’observation par microscopie à 2- photons (cf. Exemple [20]). Inhibition des différentes voies d’endocytose
Après avoir ensemencé les cellules U-87-MG comme décrit précédemment, les cellules sont traitées avec :
- 5 pg/mL de chlorpromazine (inhibiteur de clathrine), ou
- 200 mM de génistéine (inhibiteur de cavéoline), ou
- 1 mM de méthyl- -cyclodextrine (inhibiteur des radeaux lipidiques).
Après 30 min d’incubation à 37°C, les cellules sont lavées avec du PBS froid puis traitées avec 1 et/ou 5 pg/mL de NPC2 pendant 4 h à 37°C tandis que les cellules contrôles sont incubées avec du milieu seul. Les cellules sont ensuite rincées avec du PBS et fixées en vue de réaliser de la microscopie à 2-photons (cf. Exemple [20]). Ces expériences sont réalisées 2 fois avec des passages cellulaires différents.
Résultats - Figure [12]
Afin de définir le mécanisme mis en œuvre par les cellules pour l’internalisation les NPC2, les cellules U-87-MG ont été incubées avec les NPC2 à 4°C. A cette température, l’internalisation des NPC2 est négligeable ce qui suggère un mécanisme d’internalisation énergie-dépendant (Figure 12, ligne 2). Les cellules U- 87-MG ont été également traitées avec de la chlorpromazine (inhibiteur de clathrine), ou de la génistéine (inhibiteur de cavéoline), ou de la méthyl- -cyclodextrine (inhibiteur du radeau lipidique). Il a alors été observé qu’inhiber la clathrine n’a pas d’effet prononcé sur l’internalisation des NPC2, alors qu’inhiber la cavéoline ou la voie des radeaux lipidiques réduit drastiquement celle-ci (Figure 12, lignes 3-5).
Ces observations suggèrent par conséquent que le mécanisme d’internalisation des NPC2 utilise principalement les voies d’endocytose liées à la cavéoline et aux radeaux lipidiques. Cela pourrait également indiquer un effet de la « couronne protéique » qui se crée à la surface des NPC2, laquelle se lierait soit à la cavéoline soit aux radeaux lipidiques présents à la surface des cellules de glioblastome. En effet, il a été démontré que cette « couronne protéique » favorise l’internalisation de nanoparticules d’or d’un diamètre inférieur à 20 nm par un mécanisme cavéoline- dépendant, tandis que les nanoparticules plus grosses sont internalisées par un mécanisme clathrine-dépendant (Cheng, X., et al. (2015). ACS Applied Materials & Interfaces 7(37): 20568-20575). Par conséquent et au vu de ces résultats, il en est déduit que la « couronne protéique » en combinaison avec la taille des NPC2 favorisent préférentiellement une internalisation liée à la cavéoline par les cellules de glioblastome.
Exemple G221 : Etude in vitro de la cytotoxicité induite par le PTX et les NPC?- PTX
Le but est de mesurer le taux de survie cellulaire en présence d’une gamme de PTX ou d’une gamme de NPC2-PTX et de déterminer l’IC5o correspondant à la concentration de PTX ou de NPC2-PTX inhibant 50 % de la viabilité cellulaire.
Culture cellulaire L’ensemble des tests in vitro est réalisé sur trois lignées cellulaires : cf. tableau ci- après.
Tableau G51. Lignées cellulaires et conditions d’expérimentation in vitro Test de survie
(1) Traitement & test MTT
Suite à l’ensemencement des cellules comme décrit ci-dessus, les cellules adhérentes sont traitées avec une gamme de concentration soit de paclitaxel (PTX), soit de paclitaxel couplé aux NPC2 (NPC2-PTX) comme suit :
- les U-87 MG sont traitées par une gamme de PTX allant de 1 à 100 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de à 0,35 à 70 nM (équivalent PTX) ;
- les HMEC-1 sont traitées par une gamme de PTX allant de 0,05 à 50 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de 0,0175 à 17,5 nM (équivalent PTX) ; et
- les SK-N-SH sont traitées par une gamme de PTX allant de 5 à 100 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de 5 à 100 nM (équivalent PTX).
Le volume d’ensemencement et de traitement est maintenu à 150 pL par puits et chaque condition est réalisée avec une incubation classique à 37°C. Un test de viabilité cellulaire est réalisé par un test MTT après 72 h de traitement. Ce test utilise comme réactif le 3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT), lequel est converti en formazan (cristal violet) par les cellules vivantes. Ce dernier absorbant à la longueur d’onde de 600 nm est détectable par une mesure d’absorbance.
Les cellules, après avoir subi le traitement ci-dessus avec du PTX et/ou avec des NPC2-PTX, sont traitées avec 150 pL de réactif MTT à 0,5 mg/mL dispersé dans le milieu de culture (Correard, F., et al. (2014). International Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) pendant 3 à 5 h à 37°C. Dès lors que les cristaux de formazan sont visibles dans les cellules au microscope à champ lumineux, le milieu est remplacé par 150 pL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors lysées, les cristaux de formazan dissous et l’absorbance est mesurée avec un spectrophotomètre Multiskan (Ascent, Labtec Systems avec un filtre à 600 nm.
Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant la valeur d’absorbance des cellules traitées avec la valeur d’absorbance des cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
(2) Traitement & Test d’impédance en temps réel
Ce test, réalisé uniquement avec la lignée cellulaire HMEC-1 , est basé sur une mesure en temps réel de la résistance induite par une monocouche cellulaire cultivée sur une électrode d’or, qui montrera une variation lorsque les cellules se détachent de la surface. La mesure d’impédance est réalisée avec le système Real Time Cell laAnalyser (RTCA, ACEA Biosciences), et permet d’obtenir des informations quantitatives de l’état biologique des cellules (adhésion, prolifération, mortalité) en continu et en temps réel. L’ensemencement d’une plaque 96 puits, recouverte d’électrodes d’or (E-plate 96) est réalisé comme décrit précédemment (cf. tableau 5). Lorsque la mesure d’impédance atteint un plateau, la plaque est retirée de la station RTCA, le milieu de culture est retiré et les cellules sont traitées par une gamme de NPC2-PTX allant de 0,35 à 17,5 nM (équivalent PTX). La plaque est ensuite réinsérée dans la station et l’impédance est mesurée toutes les 15 minutes pendant au moins 72 h.
Le pourcentage de viabilité cellulaire est obtenu en comparant la mesure d’impédance des cellules traitées par rapport à la mesure d’impédance des cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart-type est calculé à partir de deux expériences indépendantes.
Résultats - Figure [13]
Les tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par deux techniques : un test au MTT puis un test d’impédance afin de confirmer l’absence d’interaction entre les NPC2- PTX et le réactif colorimétrique utilisé (MTT) pour la mesure de survie cellulaire.
Les résultats obtenus avec les tests au MTT sont résumés dans le tableau ci- dessous :
Tableau G61. Résultats du test au MTT
En résumé, il est montré une activité similaire du PTX et des NPC2-PTX sur les lignées HMEC-1 et SK-N-SH, alors que pour la lignée U-87 MG le PTX est significativement plus actif que les NPC2-PTX. Cette différence d’activité entre PTX et NPC2-PTX sur les U-87 MG pourrait être due à une différence de mécanisme de pénétration intracellulaire entre le PTX et le NPC2-PTX. Pour les SK-N-SH, il est à noter que des concentrations plus élevées en PTX et NPC2-PTX sont nécessaires pour atteindre l’IC5o, par rapport aux deux autres lignées cellulaires.
Le test d’impédance est réalisé sur les cellules HMEC-1 (Figure 12D). Les résultats obtenus pour les NPC2-PTX avec cette méthode (IC50 = 6,5 ± 1 ,3 nM) sont comparables aux résultats obtenus avec le test MTT (IC50 = 6,0 ± 1 ,4 nM, p = 0,56). Ceci confirme l’absence d’interaction avec le réactif colorimétrique et valide les résultats obtenus par les tests utilisant le MTT.
Exemple G231 : Etude in vitro de la cytotoxicité induite par le PTX et les NPC?- PTX Le but est de mesurer le taux de survie cellulaire en présence d’une gamme de PTX ou d’une gamme de NPC2-PTX
Culture cellulaire
L’ensemble des tests in vitro est réalisé sur deux lignées cellulaires : Voir tableau ci- après.
Tableau 171. Lignées cellulaires et conditions d’expérimentation in vitro Test de survie - Traitement
Suite à l’ensemencement des cellules (glioblastome humain, U-87 MG et glioblastome murin, GL261 ), les cellules adhérentes sont traitées avec une gamme de concentration de paclitaxel couplé aux NPC2 (NPC2-PTX) de 0.1 à 10 pM (équivalent PTX). Le volume d’ensemencement et de traitement est maintenu à 150 pL par puits et chaque condition est réalisée avec une incubation classique à 37°C et 5% de C02. Un test de viabilité cellulaire est réalisé par un test MTT après 72 h de traitement.
Test MTT
Ce test utilise comme réactif le 3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT), lequel est converti en formazan (cristal violet) par les cellules vivantes. Ce dernier détectable par une mesure d’absorbance à 600 nm.
Les cellules, après avoir subi le traitement ci-dessus avec du PTX et/ou avec des NPC2-PTX, sont traitées avec 150 pL de réactif MTT à 0,5 mg/mL dispersé dans le milieu de culture. Dès lors que les cristaux de formazan sont visibles dans les cellules au microscope à champ lumineux, le milieu est remplacé par 150 pL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors lysées, les cristaux de formazan dissous et l’absorbance est mesurée avec un spectrophotomètre Multiskan (Ascent, Labtec Systems avec un filtre à 600 nm. Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant la valeur d’absorbance des cellules traitées avec la valeur d’absorbance des cellules contrôles non traitées, laquelle est considérée comme référence et équivalente à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
Résultats - Figure 14
L’activité des NPC2-PTX est dose dépendante et atteint un effet maximal de 40 et 80 % d’inhibition de la survie cellulaire aux doses les plus fortes, pour les GL261 et U-87 MG respectivement (figure 14).
Exemple G241 : Etude cellulaire par immunofluorescence en comparaison au
PTX
But : visualiser le réseau microtubulaire, cible du PTX, afin de rechercher les effets pharmacologiques induits parles NPC2-PTX, en comparaison au PTX.
Culture cellulaire
Seules les lignées U-87-MG et HMEC-1 sont utilisées (voir tableau 5).
Immunofluorescence Les cellules U-87-MG et HMEC-1 sont ensemencées sur des chambres de culture Lab-Tek® (Nunc). Après 24 h d’incubation, le milieu est remplacé par différentes concentrations de NPC2-PTX ou de PTX (10, 50 et 100 nM). Après 6 h de traitement, le milieu est remplacé par une solution de méthanol glacé permettant de fixer et de perméabiliser les cellules. Après saturation avec une solution de PBS-BSA ( sérum- albumine bovine) 1 %, les cellules sont incubées 1 h à 37°C avec un anticorps anti a- tubuline de souris (clone DM1A, Sigma) dilué dans une solution de PBS-BSA 1 %, puis 1 h à 37°C à l’obscurité avec un anticorps secondaire anti-souris couplé au FITC (Cell Signaling Technology) dilué dans la solution de PBS-BSA 1 %. Le marquage du noyau est réalisé par une solution de DAPI ou 4,6-diamidino-2-phénylindole (0,25 pg/mL ; Sigma) pendant 2 min. La lame est finalement montée avec de l’« antifading » Prolong® (Invitrogen). L’observation est effectuée au microscope à épifluorescence (Leica DM-IRBE) couplé à une caméra digitale (Princeton Instruments ; CCD caméra coolsnap FX).
Résultats - Figure [15]
Par immunofluorescence indirecte à l’aide d’un anticorps anti a-tubuline et marquage des noyaux au DAPI (Figure 15), il est observé au niveau des cellules contrôles, à la fois U-87-MG et HMEC, un réseau microtubulaire bien étalé, des cellules allongées, un noyau interphasique standard et quelques cellules en mitose. Après traitement par du PTX (Figure 15-A et 15-C), aux 3 concentrations testées, les cellules s’arrondissent, le réseau microtubulaire est perturbé. Il y a formation de bundles (association des microtubules) dans les cellules interphasiques et de fuseaux mitotiques anormaux sous la forme de pseudo-asters dans les cellules mitotiques. Il est également observé une augmentation du nombre de mitoses. Ces effets sont caractéristiques d’un traitement par taxane.
Après traitement par des NPC2-PTX (figure 15-B, 15-D), il existe des effets comparables à ceux obtenus après traitement par PTX à toutes les concentrations testées. Il est observé des cellules arrondies, des bundles ainsi que des pseudo asters. Le nombre de mitoses est également augmenté par rapport au contrôle.
Ainsi, l’ensemble des effets cytotoxiques spécifiques du PTX sont retrouvés après traitement de cellules en culture 2D par NPC2-PTX, ce qui confirme que le PTX est libéré de sa liaison à NPC2 pour être pharmacologiquement actif.
Exemple G251 : Etude cellulaire par immunofluorescence en comparaison au
NPC?
But : visualiser le réseau microtubulaire, cible du PTX, afin de rechercher les effets pharmacologiques induits parles NPC2-PTX, en comparaison au NPC2.
Culture cellulaire Seules la lignée U-87-MG a été utilisée (voir tableau 5).
Immunofluorescence
La lignée U-87-MG est utilisée. Les cellules U-87-MG sont ensemencées sur des chambres de culture Lab-Tek® (Nunc). Après 24 h d’incubation, le milieu est remplacé par du milieu seul (cellules contrôle) ou par différentes concentrations de NPC2 (38 et 76 pg/ml) ou NPC2-PTX (38 et 76 pg/ml équivalent NPC2, 5 et 10 mM équivalent PTX). Après 24 h de traitement, le milieu est remplacé par une solution de méthanol glacé permettant de fixer et de perméabiliser les cellules. Après saturation avec une solution de PBS-BSA ( sérum-albumine bovine) 1 %, les cellules sont incubées 1 h à 37°C avec un anticorps anti b-tubuline de souris (clone DM1 A, Sigma) dilué dans une solution de PBS-BSA 1 %, puis 1 h à 37°C à l’obscurité avec un anticorps secondaire anti-souris couplé au FITC (Cell Signaling Technology) dilué dans la solution de PBS-BSA 1 %. Le marquage du noyau est réalisé par une solution de DAPI ou 4,6-diamidino-2-phénylindole (0,25 pg/rnL ; Sigma) pendant 2 min. La lame est finalement montée avec un agent anti-altération de fluorescence Prolong® (Invitrogen). L’observation est effectuée au microscope à épifluorescence (Leica DM-IRBE) couplé à une caméra digitale (Princeton Instruments ; CCD caméra coolsnap FX).
Résultats - Figure [16]
Par immunofluorescence indirecte à l’aide d’un anticorps anti b-tubuline et marquage des noyaux au DAPI, il est observé au niveau des cellules contrôles et les cellules traitées par NPC2, un réseau microtubulaire bien étalé, des cellules allongées, un noyau interphasique standard et quelques cellules en mitose. Après traitement par des NPC2-PTX, il existe des effets comparables à ceux obtenus après traitement par PTX seul à toutes les concentrations testées. Il est observé des cellules arrondies, des fagots de microtubules ainsi que des anomalies de formation des pôles mitotiques. Le nombre de mitoses est également augmenté par rapport au contrôle.
Exemple G261 : Etude de cytotoxicité en culture 3D
But : observer des modifications de taille des sphéroïdes induites par PTX ou NPC2- PTX, par rapport au contrôle, et mesurer le taux de survie cellulaire sur des cellules en culture 3D en présence d’une gamme de concentrations de PTX ou de NPC2- PTX.
Culture cellulaire 3D
Les sphéroïdes (cellules en culture 3D) permettent de mieux représenter l’environnement tumoral. Elles sont composées de cellules en nécrose en leur centre et de cellules proliférantes en périphérie. L’application des NPC2-PTX sur ces sphéroïdes permet de les étudier sur un temps plus long par rapport à l’étude en 2D. Les cellules U-87 MG sont cultivées en milieu EMEM supplémenté par 10 % de SVF, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline-streptomycine et 20 % (m/v) de méthylcellulose. Les cellules sont ensemencées sur une plaque de culture 96 puits à fond rond, à la concentration de 1000 cellules/puits, 72 h avant traitement. Les cellules sont maintenues à 37°C et 5 % de CO2 et 10 pi de milieu frais sont ajoutés tous les deux jours à l’ensemble des puits (contrôles et traités).
Traitement
Les cellules sont incubées dans du milieu de culture (cellules contrôles) ou contenant du PTX (9, 25 et 40 nM) ou des NPC2-PTX (25, 70, 100 nM). Ces concentrations correspondent à l’IC5o calculée en 2D (doses équitoxiques), à 2,8 fois l’ICso et à 4 fois l’IC5o· Le suivi du traitement se fait le jour du traitement (jO), 7 jours (j7) et/ou 14 jours (j14) après traitement.
(1) Microscopie optique
Avant traitement puis tous les deux jours, les sphéroïdes sont observés au microscope optique couplé à une caméra (Nikon ECLIPSE TS100), au grossissement *4.
(2) Test colorimétrique - Test Alamar Blue
Cette mesure se fait en une étape et utilise un réactif à base de résazurine, lequel est réduit par les cellules vivantes. Le composé réduit (= résofurine) est détectable par fluorescence (Aex = 584 nm et Aém = 620 nm) et le signal mesuré est proportionnel au nombre de cellules vivantes.
Une fois le traitement ci-dessus mis en place, 10 pL d’Alamar Blue sont ajoutés à chaque puits 7 jours ou 14 jours après traitement puis les cellules sont incubées 12 h avant la mesure de fluorescence. Les données sont obtenues par lecture de la fluorescence au POLARstar Oméga (BMG LABETCH) après excitation à 584 nm et lecture de l’émission à 620 nm.
Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant le taux de fluorescence émise par le réactif Alamar Blue réduit dans les cellules traitées avec le taux présent dans les cellules contrôles non traitées, lequel est considéré comme référence et équivalent à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
Résultats - Figure [17 ; 18]
(1 ) Les concentrations de PTX et NPC2-PTX utilisées sur les sphéroïdes sont exprimées en multiple de l’IC5o obtenue en culture 2D, afin de comparer des doses équitoxiques. Comme attendu, il a été observé une croissance des sphéroïdes non traités (contrôle). En effet, en culture 3D, ces sphéroïdes présentent une augmentation très significative de leur taille au cours du temps avec un diamètre (d) de 313 +/- 0 miti à jO contre 785 +/- 6 mhh à j14 (p < 0,001 ). Après traitement par PTX et NPC2-PTX, la croissance des sphéroïdes apparaît ralentie dans certaines conditions par rapport au contrôle (Figure 14). A l’IC5o, aucune différence de taille par rapport au contrôle n’est retrouvée à j7 et à j14 à la fois pour le PTX et les NPC2-PTX. En effet, les diamètres mesurés à j14 sont respectivement de 800 +/- 11 pm (p = 0,10) pour le PTX et 799 +/- 16 pm (p = 0,23) pour les NPC2-PTX.
A 2,8 fois riC5o, aucune différence n’est retrouvée à j7 et j14 pour le PTX comparé au contrôle. Ainsi à j14, le diamètre mesuré après traitement par PTX est de 757 +/- 22 pm (p = 0,10). En revanche, une moindre croissance est observée avec les NPC2- PTX, à j7 et est confirmée à j14 où le diamètre mesuré du sphéroïde est de 368 +/-
22 pm (p < 0,001 ).
A 4 fois l’IC5o, une différence très significative de croissance en comparaison au contrôle est retrouvée à j7 et est confirmée à j14 à la fois pour le PTX dont le diamètre mesuré à j14 est de 389 +/- 33 pm (p < 0,001 ) et pour les NPC2-PTX dont le diamètre à j14 est égal à 316 +/- 12 pm (p < 0,001 ).
Ainsi, après traitement par NPC2-PTX, dès une concentration égale à 2,8 fois G IC50 calculée en culture 2D, il est observé une inhibition majeure de la croissance du sphéroïde par rapport au contrôle, à partir de j7 (p < 0,001 ), laquelle est confirmée à 4 fois l’IC5o. Il est mis en évidence en culture 3D, sur les cellules U-87-MG, une inhibition de la croissance des sphéroïdes après traitement par NPC2-PTX supérieure à celle observée avec le PTX seul (à doses équitoxiques en 2D). A l’IC5o cependant, il n’est pas observé d’effet sur les sphéroïdes à la fois pour le PTX et les NPC2-PTX. Cette absence d’activité en 3D peut être due à une plus grande difficulté de pénétration des molécules actives dans les sphéroïdes que dans les cellules en culture 2D.
(2) Par la suite, il a été effectué un test de viabilité cellulaire à l’Alamar Blue sur les sphéroïdes. A 2,8 fois G IC50, les NPC2-PTX présentent une activité significativement supérieure au PTX à 7 jours de traitement (p = 0,0079) (Figure 18A), ainsi qu’à 14 jours (p = 0,011 ) (Figure 18B). A 4 fois l’IC5o, l’inhibition de croissance des sphéroïdes induite par les NPC2-PTX est similaire à celle induite par le PTX à 7 jours (p = 0,98) (Figure 15A) et à 14 jours (p = 0,30) (Figure 18B).
Les résultats du test à l’Alamar Blue confirment donc l’inhibition de croissance observée par microscopie optique et mettent en avant un effet cytotoxique dose- dépendant. Ainsi, à doses équitoxiques mesurées en culture 2D, les NPC2-PTX présentent une activité supérieure au PTX en culture 3D. En effet, à 2,8 fois l’IC5o, les PTX et NPC2-PTX ont une activité similaire (70 % d’inhibition de viabilité cellulaire) en 2D. Par contre, en 3D, le PTX n’induit qu’une diminution de la viabilité cellulaire de 10 %, tandis que les NPC2-PTX entraînent une inhibition de viabilité de 60 %. Exemple G271 : Etude de cytotoxicité en culture 3D
But : observer des modifications de taille des sphéroïdes induites parles NPC2-PTX, par rapport au contrôle, et mesurer le taux de survie cellulaire sur des cellules en culture 3D.
Culture cellulaire 3D
Les sphéroïdes (cellules en culture 3D) permettent de mieux représenter l’environnement tumoral. Elles sont composées de cellules en nécrose en leur centre et de cellules proliférantes en périphérie. L’application des NPC2-PTX sur ces sphéroïdes permet de les étudier sur un temps plus long par rapport à l’étude en 2D. Les cellules GL261 sont cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10 % de SVF, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline-streptomycine et 20 % (m/v) de méthylcellulose. Les cellules sont ensemencées sur une plaque de culture 96 puits à fond rond, à la concentration de 1000 cellules/puits, 72 h avant traitement. Les cellules sont maintenues à 37°C et 5 % de C02 et 10 pl de milieu frais sont ajoutés tous les deux jours à l’ensemble des puits (contrôles et traités).
Traitement
Les cellules sont incubées dans du milieu de culture (cellules contrôles) ou contenant des NPC2 (76 et 153 pg/ml) ou des NPC2-PTX (76 et 153 pg/ml équivalent NPC2 soit
10 et 20 mM équivalent PTX). Avant traitement puis tous les jours, les sphéroïdes sont observés au microscope optique couplé à une caméra (Nikon ECLIPSE TS100), au grossissement *4. L’aire est calculée à partir du logiciel ImageJ à chaque temps, à chaque concentration, et elle est rapporté au contrôle = aire normalisée. La viabilité des sphéroïdes après 13 jours de traitement est calculée avec un test à l’Alamar Blue. Vingt microlitres d’Alamar Blue sont ajoutés à chaque puits 13 jours après traitement puis les cellules sont incubées 24 h avant la mesure de fluorescence. Les données sont obtenues par lecture de la fluorescence au POLARstar Oméga (BMG LABETCH) après excitation à 584 nm et lecture de l’émission à 620 nm. Le pourcentage de viabilité est obtenu en comparant le taux de fluorescence émise par le réactif Alamar Blue réduit dans les cellules traitées avec le taux présent dans les cellules contrôles non traitées, lequel est considéré comme référence et équivalent à 100 % de viabilité. L’écart type est calculé à partir de 3 expériences indépendantes.
Résultats - Figures 19-21
11 a été observé une croissance des sphéroïdes non traités (contrôle) (figure 19). Après traitement par NPC2, la taille des sphéroïdes n’est pas significativement modifiée par rapport au contrôle. La taille des sphéroïdes traités par NPC2-PTX, est significativement diminuée par rapport au contrôle, de manière temps dépendante (figure 19). Également, cet effet est dose-dépendant avec un effet significativement supérieur à 20 mM par rapport à 10 pM (j10, différence <0.05). Par la suite, il a été effectué un test de viabilité cellulaire à l’Alamar Blue sur les sphéroïdes. Les viabilités sont rapportées à celles obtenues par les sphéroïdes contrôle (= 100%). Après traitement 13 jours par NPC2 à 153 pg/ml, aucune différence de viabilité n’est retrouvée par rapport au contrôle. Après traitement 13 jours par NPC2-PTX à 153 pg/ml équivalent soit 20 pM équivalent PTX, les NPC2-PTX inhibent la viabilité cellulaire de manière très significative par rapport aux NPC2 (p<0.001 ). Les résultats du test à l’Alamar Blue confirment donc l’inhibition de croissance observée par microscopie optique et mettent en avant un effet cytotoxique dose-dépendant. Les NPC2 nues présentent une innocuité sur les sphéroïdes tandis que les NPC2-PTX présentent une activité anticancéreuse dose- et temps-dépendante (Figure 21 )
Exemple G281 : Etude de stabilité en conditions de stockage (4 °C)
But : déterminer la stabilité de la liaison NPC2-PTX en solution mère.
La pureté des NPC2 dispersées dans l’eau ultrapure est déterminée par HPLC, afin de déterminer quantitativement la présence de PTX libre qui aurait pu être libéré de sa liaison à partir des NPC2-PTX dans les conditions de stockage. La séparation chromatographique du PTX est réalisée sur une colonne Phenomenex Kinetex XD- C18 (2.1 x 100 mm, 2.6 pm). L’élution isocratique est réalisée avec une phase mobile composée d’acétonitrile 50 %,1 mM d’acétate d’ammonium et 0.05 % d’acide formique, à un débit de 0.3 ml/min. L’effluent est détecté à 229 nm avec un détecteur à barrette de diode. Les courbes de calibration standard du PTX (10 à 1000 nM) montrent un temps de rétention de 3.3 ± 0.2 min. Une limite de quantification de 10 nM a été déterminée.
Résultats
Jusqu’à 8 semaines après solubilisation des NPC2-PTX, aucun pic spécifique du PTX n’est retrouvé en HPLC, signifiant que la liaison chimique ester entre le PTX et les NPC2 est stable dans la solution mère pour des un temps prolongé.
Exemple G291 : Etude de stabilité en milieu biologique à 37 °C
But : déterminer la stabilité de la liaison NPC2-PTX en conditions physiologiques.
Les NPC2-PTX ont été dilués en milieu EMEM complet à une concentration finale de 10 pM équivalent PTX et stockés à 37°C. A différents temps, de 15 minutes jusqu’à 2 semaines, 100 pi de cette solution ont été collectés. Un microlitre d’étalon interne (docétaxel) à 1 mg/ml ont été ajoutés et mixés avec 200 pi de SDS 5%, puis 200 pi de dichlorométhane. Après centrifugation, la phase organique est conservée et l’extraction liquide est répétée deux fois sur la phase aqueuse. Après évaporation de la phase organique, le résidu solide est solubilisé dans 300 pi de phase mobile avant dosage HPLC. Le rendement d’extraction du PTX est convenable, correspondant à 88.5 ± 2.8% (n = 4). Résultats
Aucun pic spécifique du PTX n’a été détecté au-dessus de la limite de quantification (10 nM) à 15 min, 4 h, 24 h, 48 h, 1 semaine et 2 semaines, indiquant l’absence de libération prématurée du PTX de sa liaison et indiquant la stabilité des NPC2-PTX.
Exemple G301 : Etude de stabilité dans le sang de souris
But : déterminer la stabilité de la liaison NPC2-PTX dans le sang de souris
La quantité de PTX libre présente dans un échantillon de sang total de souris C57BL/6 contenant une concentration de 60 mg/L de NPC2-PTX (équivalent à 6 mg/L de PTX) a été déterminée par extraction liquide-liquide et dosage HPLC après incubation pendant 48 heures à température ambiante. L’extraction du PTX libre s’effectue de la même manière qu’à partir du milieu de culture.
Résultats
Après 48 h d’incubation à température ambiante, la concentration de PTX libre dans le sang était de 0.64 mg/L, indiquant une libération d’environ 11 % de la charge en PTX des NPC2.
Exemple G311 : Détermination de la DMT après injection unique intra-cérébrale des N PC? et NPC?-PTX
But : évaluer la dose maximum tolérée (DMT) de NPC2-PTX et de NPC2 lors d’une injection intracérébrale chez la souris saine C57BU6.
Méthode
Deux groupes d’animaux sains ont reçu une injection dans le striatum droit de particules dispersées dans du PBS, aux doses de 11 mg/kg pour les NPC2-PTX (n = 4) et de 20 mg/kg pour les NPC2 (n = 3). Après anesthésie par un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg), les animaux sont installés sur un cadre de stéréotaxie et l’hydratation des yeux est maintenue par l’application d’un gel oculaire. La peau du crâne est rasée, badigeonnée de bétadine et incisée, puis le crâne est percé avec une fraise aux coordonnées suivantes à partir du bregma : +2 mm vers la droite et +1 mm antérieurement. L’aiguille d’une seringue Hamilton de 25 pL est insérée de 3 mm depuis la surface du cerveau et laissée en place 3 minutes avant le début de l’injection. L’injection d’un volume total de 20 pL s’effectue avec un pousse seringue électrique selon le schéma suivant : 3 pL en 15 minutes, puis 5 pL en 10 minutes, et enfin 12 pL en 15 minutes. L’injection est suivie d’un temps de pause de 5 minutes avant la remontée de l’aiguille, effectuée au rythme de 0.5 mm par minute. La plaie est suturée et les animaux sont surveillés jusqu’au réveil. Le comportement des animaux est ensuite observé pendant 14 jours et leur poids régulièrement mesuré.
Résultats - Figure 22
Aucun des animaux traités par NPC2-PTX ou NPC2 n’est décédé ni n’a présenté de signes cliniques anormaux à la suite du traitement. De plus, l’évolution du poids corporel est restée normale dans les deux groupes durant les 14 jours suivant l’injection intracérébral. Ces résultats démontrent une tolérance satisfaisante des NPC2 et des NPC2-PTX chez la souris C57BL/6 aux doses respectives de 20 mg/kg et 11 mg/kg lors d’une administration intracérébrale.

Claims

Revendications
1. Nanoplateforme active constituée :
d’une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituée de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, et d’azote sous la forme de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) alkylamino primaire(s) de 1 à 10 carbones, en particulier de groupement(s) amino primaire(s) et de groupement(s) éthylamino primaire(s),
d’une molécule active antitumorale (M),
d’un éventuel fluorophore (F), et
- d’un éventuel agent d’adressage (A),
et dans laquelle
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker L,
ladite nanoplateforme NPC2 possédant les propriétés suivantes :
la solubilité de NPC2 en milieu aqueux est de 25 à 500 g/L
- le module de Young de NPC2 est de 1 à 4 GPa,
la densité de NPC2 est de 1 à 3,
la taille sèche de NPC2 est de 10 à 40 nm,
le diamètre hydrodynamique de NPC2 est de 10 à 150 nm,
NPC2 est substantiellement amorphe
ladite nanoplateforme NPC2 possédant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 1 ,4 à 7 mmol par gramme de nanoplateforme, ladite molécule active antitumorale M ayant une solubilité en milieu aqueux inférieure à 200 mg/L,
ladite nanoplateforme active ayant une solubilité en milieu aqueux de 5 à 500 g/L,
avec la réserve que :
NPC2 soit substantiellement dépourvue de lipides, d’acides nucléiques, de protéines et de peptides.
2. Nanoplateforme active selon la revendication 1 dans laquelle la nanoplateforme
NPC2 est liée par liaisons covalentes avec M via un linker choisi parmi les composés de formule XI,
Formule XI
dans laquelle :
· Ri et R2 sont indépendamment choisis parmi : -NH-, -COO, -NHCO-, -O-, -
OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- et -CO-NH-NH-CO-
• R3 est choisi parmi : -NH- ; -O-
• R4 est choisi parmi : -O-, -NHNH-, NH- en particulier via un linker succinique.
3. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle :
o ladite nanoplateforme active comprend un fluorophore F et dans laquelle NPC2 est liée par liaisons covalentes avec F, via un linker LF, ou o ladite nanoplateforme active comprend un agent d’adressage A et dans laquelle NPC2 est liée par liaisons covalentes avec A, via un linker LA, ou o dans laquelle ladite nanoplateforme active comprend un fluorophore F et un agent d’adressage A et dans laquelle NPC2 est liée par liaisons covalentes avec F via un linker LF et NPC2 est liée par liaisons covalentes avec A via un linker LA.
4. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule I
Formule I
dans laquelle : • NPC représente le cœur de la nanoplateforme NPC2 sans les fonctions de greffage situées en surface, NPC2 ayant la signification de la revendication 1 ,
• M, F et A ayant les significations de la revendication 1 ,
• f et a sont des nombres entiers valant indépendamment 0 ou 1 ,
• Lf, L et LA représentent les linkers liant par l’intermédiaire de liaisons covalentes le cœur de la nanoplateforme NPC avec les composés F, M et A de Formule II, Formule lia et Formule Mb,
Formule llb
dans lesquelles :
o TF, T et TA représentent les fonctions de greffage de la nanoplateforme NPC2 après leur intégration dans les linkers LF, L et LA,
o ZF, Z et ZA représentent les fonctions de liaison des linkers LF, L et LA après leur liaison sur les fonctions de greffage TF, T et TA,
o RF, R et RA représentent les chaînes fonctionnelles des linkers LF, L et La,
o QF, Q et QA représentent les fonctions de liaison des linkers LF, L et LA après leur liaison sur le fluorophore, la molécule active antitumorale et l’agent d’adressage,
o I, IF et lA sont des nombres entiers égaux ou différents entre eux et valant 0 ou 1.
5. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle :
■ ladite nanoplateforme active est de Formule III,
Formule III dans laquelle :
■ NPC, T, Z, R, Q, I et M ont les significations des revendications 1 et 4,
■ ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule IV,
Formule IV
■ ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule V,
Formule V
dans laquelle :
■ NPc, TF, T, ZF, Z, Rf, R, Qf, Q, If, I, F et M ont les significations des revendications 1 et 4,
ou, dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VI,
Formule VI
ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VII,
Formule VII
dans laquelle :
■ NPc, T, TA, Z, ZA, R, RA, Q, QA, I, IA, A et M ont les significations des revendications 1 et 4,
ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VIII
Formule VIII
ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule IX,
Formule IX
dans laquelle :
■ NPc, TF, T, TA, ZF, Z, ZA, RF, R, RA, QF, Q, QA, IF, I, IA, F, A et M ont les significations des revendications 1 et 4,
■ ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule X,
Formule X
6. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes comme le paclitaxel ou les anthracyclines comme la doxorubicine.
7. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit fluorophore F est choisi parmi la Rhodamine B, la Fluorescéine, la Lucifer Yellow cadavérine, la famille des Alexa Fluor ou la famille des cyanines NIR.
8. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ledit agent d’adressage est choisi parmi les anticorps ou les peptides vecteurs en particulier un anticorps ciblant les récepteurs de l’EGF, le peptide RGD ou un peptide ciblant le LDLR.
9. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 et 3 à 8, dans laquelle lesdits linkers L, LF et LA sont choisis parmi les composés de
Formule XI,
Formule XI
dans laquelle :
• Ri et R2 sont indépendamment choisis parmi : -NH-, -COO, -NFICO-, -O-, - OCO-, -NHCSNH-, -NHCONH- et -CO-NH-NH-CO-
• R3 est choisi parmi : -NH- ; -O-
• R4 est choisi parmi : -O-, -NHNH-, NH- En particulier un linker succinique.
10. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications à 9 répondant à la Formule XII ou à la Formule XI IA,
HN - Rhodamine B
Formule XII HN Rhodamine B
Formule XIIA
dans laquelle :
■ NPC a la signification de la revendication 4,
11. Procédé de préparation d’une nanoplateforme active telle que définie dans les revendications 1 à 10, comprenant une étape de greffage d’une molécule active antitumorale,
■ par une éventuelle mise en contact d’une nanoplateforme NPC2 avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme liée par liaison covalente audit linker L, suivie
■ par la mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M,
dans lequel NPC2, L et M ont les significations des revendications 1 et 4, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale.
12. Procédé de préparation d’une nanoplateforme active, selon la revendication 11 , comprenant les étapes suivantes :
a. une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme,
• par la mise en contact d’une nanoplateforme avec une molécule organique de type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour accroître le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée,
b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée avec précurseur LF’ dudit linker LF, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée et éventuellement liée audit linker l_F, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée et éventuellement liée audit linker LF avec un fluorophore F, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F,
c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F, avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée par liaison covalente audit linker L, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F, d. une éventuelle étape de liaison d’un agent d’adressage,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F avec un précurseur LA’ dudit linker LA, pour obtenir une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement lié audit linker LA, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement lié audit linker LA avec un d’agent d’adressage A, dans lequel NPC2, LF, L, LA, F, M et A ont les significations des revendications 1 et 4,
pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et éventuellement liée audit agent d’adressage A,
ledit éventuel agent d’adressage étant un peptide vecteur.
13. Procédé de préparation d’une nanoplateforme active selon la revendication 11 , comprenant les étapes suivantes :
a. une étape de refonctionnalisation d’une nanoplateforme,
• par la mise en contact d’une nanoplateforme avec une molécule organique du type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour accroître le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée,
b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore,
• par une mise contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée avec de l’anhydride succinique pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique, suivie
• par la mise en contact de la nanoplateforme refonctionnalisée par ledit linker succinique avec de l’hydrazine pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié, suivie
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié avec un fluorophore F, la quantité de fluorophore F étant sub- stoichiométrique par rapport au nombre de linkers succiniques activés, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique activé et éventuellement liée audit fluorophore F, c. une étape de liaison d’un agent d’adressage,
• par une mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée par un linker succinique modifié et éventuellement liée audit fluorophore F avec un agent d’adressage A pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A,
d. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale,
• par une éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A, avec un précurseur L’ dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F, liée audit agent d’adressage et éventuellement liée par liaison covalente audit linker L, suivie
• par la mise en contact de ladite nanoplateforme refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F, liée audit agent d’adressage et éventuellement liée par liaison covalente audit linker L avec une molécule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée et éventuellement liée audit fluorophore F et liée à un agent d’adressage, dans lequel NPC2, LF, L, LA, F, M et A ont les significations des revendications 1 et 4, pour obtenir une nanoplateforme active constituée d’une nanoplateforme liée par liaison covalente à ladite molécule active antitumorale M, refonctionnalisée, éventuellement liée audit fluorophore F et liée audit agent d’adressage A, ledit agent d’adressage étant un anticorps.
14. Procédé de préparation d’une nanoplateforme active, selon l’une quelconque des revendications 1 1 à 13, ladite nanoplateforme active étant de Formule I,
Formule I
dans laquelle :
• NPC, F, M, A, L, La, Lf, a et f ont les significations des revendications 1 et 4,
ledit procédé comprenant :
a. une étape de refonctionnalisation par mise en contact d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b
Formule a-b
avec une molécule organique de type une molécule organique du type a-w diamino-alcane de 1 à 10 atomes de carbone, comportant deux fonctions amine primaire, en particulier du 1 ,2-éthylènediamine, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule B,
NH2
Formule B
(NFI2-Alkyle) ) COOH(1 -b)
Formule b-b dans lesquelles :
■ b est un nombre réel compris de 0 à 1 correspondant au taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOFI en NHI2 ■ les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b-b (Alkyle-NH2, NH2, COOH),
■ a et f sont des nombres entiers valant 0 ou 1 , égaux ou différents,
■ avec la réserve que le nombre b est supérieur à 0,
b. une éventuelle étape de liaison d’un fluorophore par l’éventuelle mise en contact d’un précurseur de linker LF’ avec une nanoplateforme NPC2 de Formule B
pour obtenir une nanoplateforme de Formule C
Formule C
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule C avec ledit fluorophore F pour obtenir une nanoplateforme de Formule D,
Formule D c. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule D avec un précurseur de linker L’
pour obtenir une nanoplateforme de Formule E
Formule E
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule E avec ladite molécule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule F, Formule F
d. une éventuelle étape de liaison d’un agent d’adressage par l’éventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule F avec un précurseur de linker LA’
pour obtenir une nanoplateforme active de Formule G,
Formule G
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule G avec ledit agent d’adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule I.
15. Procédé de préparation d’une nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 1 à 14, ladite nanoplateforme active étant de Formule XII,
HN - Rhodamine B
Formule XII
dans laquelle :
■ NPC a la signification de la revendication 4,
ledit procédé comprenant :
a. une étape de synthèse d’une nanoplateforme NPCi de Formule a-b,
Formule a-b par la mise en contact d’acide citrique avec du diéthylènetriamine dans l’eau sous micro-ondes avec une puissance de 500 à 1000 W, notamment 600 W, pendant un temps de 1 à 5 minutes, notamment 2 minutes, pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a-b,
b. une étape de refonctionnalisation de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a, par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a avec un excès de 1 ,2-éthylènediamine à une température comprise de 100 à 180°C pendant 2 à 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b-b ou de Formule AE,
Formule b-b
NH2 NH2 Formule AE
dans laquelle :
• b a la signification de la revendication 14,
selon le schéma,
c. une étape de liaison d’un fluorophore par la mise en contact d’un fluorophore F constitué par de la Rhodamine B, avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule AE,
pour obtenir une nanoplateforme de Formule AF
HN - Rhodamine B
Formule AF d. une étape de greffage d’une molécule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AF avec un précurseur de linker L’, de l’anhydre succinique et une base, notamment du carbonate de sodium ou de la diisopropyléthylamine, pour obtenir la nanoplateforme de Formule AG
HN - Rhodamine B
suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AG avec ladite molécule active antitumorale M, du paclitaxel, pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule XII,
16. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, pour son utilisation comme médicament.
17. Composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, où ladite molécule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes, plus particulièrement le paclitaxel et le docétaxel ou parmi les anthracyclines, plus particulièrement l’épirubicine, la pirarubicine, l’idarubicine, la zorubicine, l’aclarubicine et la doxorubicine et ladite nanoplateforme active étant en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable.
18. Nanoplateforme active selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, pour son utilisation dans le traitement de cancers et des tumeurs cérébrales plus particulièrement le glioblastome et les métastases cérébrales issues de différentes tumeurs primaires.
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