CN111372609A - 声动力学疗法 - Google Patents

声动力学疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN111372609A
CN111372609A CN201880050562.3A CN201880050562A CN111372609A CN 111372609 A CN111372609 A CN 111372609A CN 201880050562 A CN201880050562 A CN 201880050562A CN 111372609 A CN111372609 A CN 111372609A
Authority
CN
China
Prior art keywords
complex
biotin
cancer
microbubble
sonosensitizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880050562.3A
Other languages
English (en)
Inventor
约翰·卡兰
安东尼·麦克海尔
苏坎塔·卡米拉
凯兰·洛根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ulster University
Original Assignee
Ulster University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ulster University filed Critical Ulster University
Publication of CN111372609A publication Critical patent/CN111372609A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A61K41/0033—Sonodynamic cancer therapy with sonochemically active agents or sonosensitizers, having their cytotoxic effects enhanced through application of ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0042—Photocleavage of drugs in vivo, e.g. cleavage of photolabile linkers in vivo by UV radiation for releasing the pharmacologically-active agent from the administered agent; photothrombosis or photoocclusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/558—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a chemiluminescent acceptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/244—Anthraquinone radicals, e.g. sennosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及用于声动力学治疗方法中的微泡复合物，其包含附着到一个或多个连接基团或以另外的方式与一个或多个连接基团相关联的微泡，每个连接基团与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂结合。本发明还涉及所述微泡复合物本身和含有它们的药物组合物。本发明特别适用于治疗深部肿瘤，特别是胰腺癌。

Description

声动力学疗法
技术领域
本发明总体上涉及声动力学疗法的改进并与其相关，并且更具体地，涉及用于治疗特征在于过度增殖和/或异常细胞的疾病的此类方法。
更具体地，本发明涉及使用组合的声动力学和抗癌疗法靶向治疗深部肿瘤，诸如胰腺癌。
背景技术
深部肿瘤的常规治疗通常包括大手术、化疗、放疗或所有这些的组合。所有三种干预措施都可能导致各种并发症，包括败血症。因此，迫切需要开发具有更高疗效的更具针对性且侵入性更小的治疗方法来治疗此类患者。胰腺癌是深部肿瘤的一个实例。它仍然是已知的最致命的癌症类型之一，其中不到20％被诊断有资格接受外科治疗。它占所有癌症的大约2％，其中手术切除后全身化疗的患者的五年生存率为15％-21％。
已知用于癌症治疗的方法包括光动力学疗法(PDT)。PDT包括将光敏剂应用于受影响的区域，随后暴露于光活化光，以将这些转化为细胞毒性形式。这导致目标组织中细胞和周围脉管系统的破坏。目前被批准用于PDT的光敏剂吸收可见光区(低于700nm)中的光。然而，这种波长的光穿透皮肤的能力有限；这仅能穿透到几毫米的表面深度。虽然PDT可以用于治疗较深部位的靶细胞，但这通常涉及使用装置，诸如导管导向的光纤，以用于激活光敏剂。这不仅是一个复杂的程序，而且它阻止进入身体的某些位点。这也破坏了治疗的非侵入性。因此，尽管适用于治疗浅表肿瘤，但在治疗深层细胞(诸如肿瘤块)和解剖学上不易触及的病变中使用PDT是受限的。
声动力学疗法(SDT)是一个较新的概念，并且涉及超声和声敏药物(本文中也称为“声敏剂(sonosensitiser)”或“声敏剂(sonosensitising agent)”)的组合。在与PDT类似的方式中，声敏剂被声能激活导致在感兴趣的目标位点处产生活性氧物种(ROS)，诸如单线态氧。此类物种具有细胞毒性，从而杀死靶细胞或至少降低其增殖潜力。许多已知的光敏剂可以被声能激活，并且因此适用于SDT。由于超声波很容易通过几厘米的组织传播，因此SDT提供了一种可以治疗位于组织深处的肿瘤的手段。与使用光一样，超声能量也可以聚焦在肿瘤块上，以便激活声敏剂，从而将其作用限制在目标位点。
与PDT相比，SDT提供了一些显著的优势：超声被广泛认为是一种经济有效且安全的临床成像方式，并且与光不同，根据所使用的超声频率，超声可以紧密聚焦，并穿透软组织达几十厘米。
在WO 2012/143739中，声敏剂与充气微泡(MB)缀合，以提供用于SDT的微泡-声敏剂“复合物”。这些复合物允许通过使用超声波对气泡的受控破坏，以位点特异性方式有效递送活性声敏剂。目标声敏剂的后续或同时声激活导致目标位点处的细胞破坏和肿瘤组织的退化。
最近，发明人已经证明了在临床前模型中使用微泡-声敏剂复合物治疗胰腺癌的SDT的有效性(McEwan等人,J Control Release.2015；203,51-6)。这些研究显示，当与用包含SF6作为核心气体的类似MB缀合物治疗的肿瘤相比时，注射填充有气态氧并携带孟加拉玫瑰红敏化剂的超声响应微泡(MB)在携带人异种移植BxPC-3肿瘤的小鼠中提供了统计学上显著的SDT介导的肿瘤生长减少。将氧掺入MB核心的基本原理是为了在声动力学事件中增加肿瘤微环境中产生的ROS的量，因为氧是SDT中ROS生产的底物。特别是胰腺肿瘤，已知是高度缺氧的，并且这进一步对依赖于氧气产生细胞毒性ROS的方法诸如PDT/SDT的功效产生负面影响。
还已经证明了，将基准胰腺癌抗代谢治疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨与补充化疗诸如伊立替康和奥沙利铂相结合可以提高胰腺癌患者的平均生存率(Lee等人,Chemotherapy.2013；59,273-9)。然而，这种被称为FOLFIRINOX的组合导致显著的副作用，并且仅适用于在其他方面适合且健壮的患者。
因此，需要用于治疗深部的不可触及的肿瘤诸如胰腺癌的替代方法，特别是非侵入性或微侵入性且无副作用的方法。此类方法将具有明显的社会经济效益，例如在减少患者创伤、减少治疗费用和减少与任何住院相关的费用方面。本发明满足了这一需求。
发明内容
发明人现在提出，由于抗代谢疗法和SDT通过不同的机制(前者通过胸苷酸合酶抑制，并且后者通过细胞底物氧化)发挥其细胞毒性作用，因此它们在单一治疗方案中的组合可以为患者提供显著的益处。
具体地，本发明人现在已经发现，当用于声动力学治疗方法时，使用微泡同时递送声敏剂和抗代谢物两者具有许多优点。具体地，他们发现的是，递送呈具有微泡的复合物形式(“微泡复合物”)的声敏剂和抗代谢剂两者允许通过使用超声对气泡进行受控破坏，以位点特异性方式(例如，向内部肿瘤)有效递送两种药物。目标声敏剂的声激活导致ROS的产生，ROS的产生破坏目标位点处的肿瘤细胞。这种作用得到抗代谢物作用的补充，该抗代谢物直接在预期的目标位点处发挥其细胞毒性作用。通过使用微泡作为两种药物的载体，减少了非靶组织对这些药物的非特异性摄取，从而提供了优于全身递送的显著优势。因此，预期这种疗法将减少副作用，并且进而为患者提供显著益处。
如本文所述，发明人提出使用配体(在本文中称为“连接基团”)，其能够将声敏剂和抗代谢剂两者附着到单个微泡的表面(例如通过“生物素-亲和素”相互作用)。这使得能够使用单个微泡进行组合的抗代谢物/SDT治疗。通过将两种药物附着到同一微泡而不是分离微泡，可以实现药物负载的增加。配体也可以被修饰以携带两种或更多种抗代谢物和/或两种或更多种声敏剂，以进一步增强药物负载。
本文所述的微泡复合物特别适用于胰腺癌的治疗。然而，它们的用途延伸到特征在于过度增殖和/或异常细胞的其他疾病和病状的治疗，特别是其他深部肿瘤的治疗。如本文将描述的，因此这些具有更广泛的应用，该应用延伸到使用各种化疗药物治疗其他此类疾病和病状。
通过进一步修饰微泡复合物以在其壳结构中掺入化疗药物，发明人还提出可以实现具有增强治疗效果的高度靶向抗癌疗法。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了一种微泡复合物，其包含附着到一个或多个连接基团或以另外的方式与一个或多个连接基团相关联的微泡，每个连接基团与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂结合。
在另一方面，本发明提供了一种微泡复合物，其包含附着到一个或多个连接基团或以另外的方式与一个或多个连接基团相关联的微泡，每个连接基团与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂(“第一化疗剂”)结合，其中所述微泡包含其中掺入了一种或多种附加化疗剂(“第二化疗剂”)的壳。在本发明的这一方面，第一和第二化疗剂可以是不同的或者它们可以是相同的。优选地，它们将是不同的。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的微泡复合物，其用于声动力学治疗方法。
在又一方面，本发明提供了一种声动力学治疗方法，其中将如本文所述的微泡复合物施用至患者的受影响细胞或组织，并对所述细胞或组织进行超声波辐射。
就根据本发明的微泡复合物旨在用于SDT方法而言，应当理解它们将是超声响应的。具体地，旨在可以通过施加超声波使复合物的微泡组分破裂，从而在所期望的目标位点处释放一种或多种声敏剂和一种或多种化疗剂。
如本文所用，术语“微泡”旨在指微球体，其包括具有近似球形形状并包围内部空隙的壳，该内部空隙包括气体或气体混合物。“壳”是指包围微泡内部空隙的膜。
术语“声敏剂(sonosensitiser)”、“声敏剂(sonosensitising agent)”和“声敏药物”在本文中可互换使用，并且旨在指能够将声能(例如超声波)转化为活性氧物种(ROS)(诸如导致细胞毒性的单线态氧)的任何化合物。
如本文所用，术语“化疗剂”旨在广泛地涵盖可用于治疗癌症的任何化学或生物化合物。其包括生长抑制剂和其他细胞毒性剂。术语“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞、特别是癌细胞生长的化合物。
如本文所用，术语“声动力学疗法”旨在指一种涉及超声和声敏剂组合的方法，其中声敏剂通过声能的激活导致活性氧物种诸如单线态氧的产生。
根据本发明的微泡复合物包括附着到至少一种声敏剂和至少一种化疗剂或以另外的方式与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂相关联的微泡。这些试剂通过一个或多个连接基团附着到微泡或以另外的方式与微泡相关联，每个连接基团携带至少一种声敏剂和至少一种化疗剂。应当理解，由任何给定连接基团携带的声敏剂和化疗剂将不是相同的化学实体，即它们将是不同的化学实体。
在一个实施方案中，根据本发明的微泡复合物包括附着到多种声敏剂和/或多种化疗剂或以另外的方式与多种声敏剂和/或多种化疗剂相关联的微泡。
当微泡与多于一种声敏剂结合时，这些声敏剂可以是相同或不同的，并且可以由单个连接基团或者两个或更多个连接基团携带。通常，结合到特定微泡的声敏剂是相同的。
当微泡与多于一种化疗剂结合时，这些化疗剂可以是相同或不同的，并且可以由单个连接基团或者两个或更多个连接基团携带。通常，通过如本文所述的一个或多个连接基团附着到特定微泡的化疗剂将是相同的。
一种或多种化疗剂和一种或多种声敏剂通过一个或多个连接基团连接到微泡。每个连接基团可以通过共价或非共价方式，例如通过静电相互作用、疏水相互作用、范德华力、氢键或其任何组合，结合到微泡以及一种或多种化疗剂和一种或多种声敏剂或以另外的方式与微泡以及一种或多种化疗剂和一种或多种声敏剂相关联。
在一个实施方案中，一个或多个连接基团与微泡之间的相互作用可以包括强的非共价键，诸如生物素-亲和素相互作用。在这个实施方案中，结合对的一个组分(例如连接基团)用生物素官能化并且另一个组分(例如微泡)用亲和素官能化。由于亲和素含有用于生物素的多个结合位点，因此其通常也通过生物素-亲和素相互作用结合到微泡。例如，微泡可以用生物素官能化以形成生物素化的微泡，然后将其用亲和素孵育。一旦亲和素结合到微泡，这允许任何进一步生物素化部分(诸如并入生物素(或生物素残基)的连接基团)的结合。微泡与连接基团之间产生的连接因此可以采取“生物素-亲和素-生物素”相互作用的形式。
在一个实施方案中，一种或多种化疗剂和/或一种或多种声敏剂共价结合到一个或多个连接基团，即一种或多种化疗剂和/或一种或多种声敏剂通过一个或多个共价键附着到一个或多个连接基团。
应当理解，用于本发明的一个或多个连接基团的精确性质并非关键，只要这些基团能够将至少一种化疗剂和至少一种声敏剂连接到微泡(或本文所述的适当地“官能化”的微泡，例如携带一种或多种生物素-亲和素官能性的微泡)。应当理解，任何连接基团都将是生物相容的。
本文所述的任何微泡都可以与多个连接基团结合或以另外的方式与多个连接基团相关联，以便进一步增加声敏剂和化疗剂的负载。在这个实施方案中，连接基团不需要彼此相同，尽管它们通常将是相同的。
本领域技术人员可以容易地选择合适的连接基团。通常，每个连接基团将包含有机基团，该有机基团在其与微泡(或“官能化”微泡)以及与化疗剂和声敏剂的附着点之间包含至多约200个原子，例如至多约100个原子的链。有机链可以包括脂族、脂环族或芳族基团，或其任何组合。在一个实施方案中，它可以包含脂族、脂环族和芳族基团。在另一个实施方案中，它可以包含脂族和脂环族基团。
合适的连接基团可以具有高达约3,000Da，例如高达约1,500Da的分子量。
用于本发明的连接基团可以是直链或支链的。在一个实施方案中，连接基团可以是支链的。可以提供不同程度的分支，并且可以根据由连接基团携带的试剂的数量进行选择。例如，连接基团可以包括至多六个分支，例如一个、两个、三个或四个分支，这使得其能够附着到微泡(或“官能化”微泡)以及一种或多种化疗剂和一种或多种声敏剂。连接基团与微泡以及化疗剂和声敏剂的附着通常将通过分支结构的末端基团进行。
在一个实施方案中，连接基团可以包括三个分支，即它是“三足的”。在这个实施方案中，连接基团的第一分支将能够结合微泡(例如通过非共价相互作用诸如“亲和素-生物素”)，第二分支将能够连接化疗剂(例如共价地)，并且第三分支将能够连接声敏剂(例如共价地)。
合适的连接基团可以包括直链或支链(优选支链)C30-50亚烷基链(优选C30-40亚烷基链)，其任选地被一个或多个选自C1-3烷基、-O(C1-3)烷基和-OR'(其中R'是H或C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基)的基团取代；并且其中亚烷基链的一个或多个(优选至多10个，例如4-9个，或6-8个)-CH2-基团可以被独立地选自-O-、-CO-、-C(O)O-、-NR”-和-NR”CO-(其中每个R”独立地是H或C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基)的基团替换。在一个实施方案中，连接基团也可以被如本文所述的生物素或生物素残基取代(例如末端取代)。
在一个实施方案中，连接基团可以包含一个或多个氨基酸。例如，其可以包含肽、肽残基或片段。
适用于本发明的三足连接基团包括其中支链与中心N或C原子连接的那些基团。具有中心氮原子的那些基团优选用于本发明中。此类连接基团包括具有以下结构的那些：
Figure BDA0002379596590000061
其中：
L1、L2和L3各自独立地是-(CH2)q-，其中q是1至4的整数，优选2；
每个R独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
n是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
p是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
X是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
应当理解，形成根据本发明的微泡复合物的各种组分的连接在一些情况下可能需要一种或多种组分被适当地“官能化”，例如通过引入一种或多种能够使它们彼此连接或缔合(例如通过形成共价键，或本文所述的任何其他类型的结合)的反应性基团。本文中对复合物的“官能化”组分的任何提及都应相应地进行解释。例如，“官能化”微泡可以携带“生物素-亲和素”官能团，以便它可以结合生物素化的连接基团。“官能化”声敏剂和“官能化”化疗剂可以例如携带一个或多个反应性基团(诸如胺，例如伯胺、羧基、羟基、酸、酰卤、硫醇、羰基等)使得它们能够连接到所选的连接基团。可以使用任何合适的官能团，并且这些官能团可以由本领域技术人员根据待相互连接的组分的性质容易地选择。
任何组分(例如声敏剂或化疗剂)的“官能化”通常将涉及与一种或多种能够提供所期望“官能化”组分的化合物的反应。合适的化合物可以容易地由任何熟练的化学工作者确定，并且可以包括例如含有胺或羧酸基团的部分。与试剂反应后，这些可以例如提供能够与所选连接基团反应的末端胺或羧酸官能团。可以用于声敏剂或化疗剂官能化的化合物的实例在本文方案2和4中示出。在方案2中，使用Br-CH2-CH2-NH2来官能化声敏剂孟加拉玫瑰红以产生“孟加拉玫瑰红-胺”。在方案4中，使孟加拉玫瑰红与8-溴辛酸反应以产生“孟加拉玫瑰红-辛酸”，并且使化疗剂吉西他滨与HO-(CH2)11-CO2H和氯甲酸4-硝基苯基酯反应以产生羧酸官能化的吉西他滨。
类似地，应当理解，在各种组分连接(例如通过化学反应)以形成根据本发明的微泡复合物之后，一些或所有组分可能不再保持它们的原始结构，而是可能由于它们彼此连接或缔合(例如通过共价键的形成，或本文所述的任何其他类型的结合)中涉及的反应而“失去”一个或多个末端基团或原子(例如H原子)。这些组分可以被认为是原始组分的“残基”，并且对复合物组分的“残基”的任何提及都应相应地解释。方案2和4作为可以用于制备掺入生物素的三足连接基团的方法的实例在本文中提供。在这些实例中，生物素的末端羧基用于通常通过胺或酯键将其连接到三足连接基团。在最终结构中，生物素作为生物素的“残基”存在。
在式(I)中，L1、L2和L3可以是相同的。在一个实施方案中，L1、L2和L3各自是-(CH2)2-。
在式(I)中，每个R可以是相同的。在一个实施方案中，每个R是H。
在式(I)中，n和p可以是相同的。在一个实施方案中，n和p两者都是4至8的整数，例如6。
在式(I)的一个实施方案中，X是生物素或生物素残基，其能够结合亲和素官能化微泡。
用于本发明的通式(I)中的三足连接基团的实例如下：
Figure BDA0002379596590000071
其中：
X是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
在式(II)的一个实施方案中，X是生物素或生物素残基，其能够结合亲和素官能化微泡。
可以用于本发明的其他三足连接基团是具有以下通式结构的那些基团：
Figure BDA0002379596590000081
其中：
L4、L5和L6各自独立地是-(CH2)t-，其中t是1至4的整数，优选2；
每个R'独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
r是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
s是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6或7；
X'是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
在式(III)的可替代实施方案中：
*表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点。
在式(III)中，L4、L5和L6可以是相同的。在一个实施方案中，L4、L5和L6各自是-(CH2)2-。
在式(III)中，每个R'可以是相同的。在一个实施方案中，每个R'是H。
在式(III)中，r和s可以是相同或不同的。在一个实施方案中，r和s两者都是4至8的整数，例如6或7。在一个实施方案中，r是6并且s是7。
在式(III)的一个实施方案中，X'是生物素或生物素残基，其能够结合亲和素官能化微泡。
可以用于本发明的根据式(III)的三足连接基团的实例如下：
Figure BDA0002379596590000091
其中：
X'是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
在式(IV)的一个实施方案中，X'是生物素或生物素残基，其能够结合亲和素官能化微泡。可以用于本发明的其他三足连接基团是具有以下通式结构的那些基团：
Figure BDA0002379596590000092
其中：
L7、L8和L9各自独立地是-(CH2)u-，其中u是1至4的整数，优选2；
每个R”独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
X”是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
在式(V)中，L7、L8和L9可以是相同的。在一个实施方案中，L7、L8和L9各自是-(CH2)2-。
在式(V)中，每个R”可以是相同的。在一个实施方案中，每个R”是H。
在式(V)的一个实施方案中，X”是生物素或生物素残基，其能够结合亲和素官能化微泡。
可以用于本发明的根据式(V)的三足连接基团的实例如下：
Figure BDA0002379596590000101
其中：
X”是能够结合到如本文所述的微泡或“官能化”微泡的官能团；
*表示连接基团与如本文所述声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示连接基团与如本文所述化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
为了用于本发明，合适类别的化疗剂和这些类别中的实例包括以下：抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤)；5-氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶或5-FU)；胞苷类似物(例如吉西他滨)；嘌呤抗代谢物(例如巯基嘌呤)；烷化剂(例如环磷酰胺)；非经典烷化剂(例如达卡巴嗪)；铂类似物(例如顺铂)；抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、博莱霉素、丝裂霉素C)；生物还原药物(例如丝裂霉素C、巴诺蒽醌(Banoxantrone，AQ4N))；蒽环类药物(例如阿霉素、米托蒽醌)；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷)；抗微管剂，诸如长春花生物碱(例如长春新碱)、紫杉醇类(taxols)(例如紫杉醇)和埃博霉素(例如伊沙匹隆(ixabepiline))；抗雌激素(例如他莫昔芬)；抗雄激素(例如比卡鲁胺(biclutamide)、醋酸环丙孕酮)；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、福美斯坦)；抗血管生成或缺氧靶向药物(天然存在的，如内皮抑素，或合成的，如吉非替尼、来那度胺)；抗血管剂(例如康普立停(cambretastatin))；酪氨酸激酶抑制剂(例如吉非替尼、埃罗替尼、凡德他尼(vandetanim)、舒尼替尼)；癌基因或信号通路靶向剂(例如替吡法尼(tipfarnib)、洛那法尼、纳曲吲哚、雷帕霉素)；靶向应激蛋白的试剂(例如格尔德霉素及其类似物)；自噬靶向剂(例如氯喹)；蛋白酶体靶向剂(例如硼替佐米)；端粒酶抑制剂(靶向寡核苷酸或核苷酸)；组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如曲古抑菌素A、丙戊酸)；DNA甲基转移酶抑制剂(例如地西他滨)；烷基磺酸盐(例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan))；氮丙啶(例如苯并多巴、卡波醌、甲多巴(meturedopa)和尿多巴(uredopa))；乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)(例如六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine))；氮芥(例如苯丁酸氮芥、氯萘醌、氯膦酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、诺维比辛(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶氮芥)；亚硝基脲(nitrosureas)(例如卡莫司汀、氯唑霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀)；嘌呤类似物(例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷)；雄激素类(例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯)；抗肾上腺素类(例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦)；和免疫检查点抑制剂(例如BMS-1001和BMS-1166)。也可以使用任何这些化合物的药学上可接受的盐、衍生物或类似物。
用于本发明的生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(在不同于S期的地方)的试剂，诸如诱导Gl阻滞和M期阻滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)；紫杉烷家族成员，包括紫杉醇、多西紫杉醇及其类似物；和拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、片螺素D、阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。阻滞G1的那些试剂包括，例如，DNA烷化剂，诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-FU和阿糖胞苷(ara-C)。
化疗剂的选择将取决于各种因素，包括肿瘤的性质、待治疗的患者等，但本领域技术人员可以容易地选择。
在一个特定实施方案中，化疗剂是抗代谢物。特别适用于本发明的抗代谢物包括5-氟嘧啶和胞苷类似物。可以用于治疗胰腺癌的抗代谢物的实例是5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨。此类试剂在本发明中有特定用途，并且在一个实施方案中，它们可以由本文所述的任何连接基团携带。
在一个实施方案中，化疗剂是生长抑制剂。特别适用于本发明的那些包括蒽环类拓扑异构酶抑制剂，例如阿霉素。
为了掺入微泡的壳结构中，可以选择本文所述的任何化疗剂。化疗剂应当能够自发地嵌入微泡脂质的疏水脂质链中。在化疗药物是疏水的情况下，这可能涉及直接疏水相互作用。在一个实施方案中，用于掺入微泡壳中的化疗剂因此可以是疏水的。疏水剂可以被认为是LogP值大于约2的那些。可替代地，非极性化疗剂可以通过引入或一个或多个非极性官能团进行适当的修饰(例如官能化)，所述非极性官能团使它们能够自发地嵌入微泡的壳(例如脂质壳)中。
在一个实施方案中，待掺入微泡壳中的化疗剂可以是抗微管剂。此类试剂的实例尤其包括紫杉醇类诸如紫杉醇。紫杉醇(或“PTX”)是疏水性的。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂(例如BMS-1001或BMS-1166)可以包含在微泡的壳内，以便在治疗期间刺激免疫系统。
微泡在本领域是熟知的，例如作为超声造影剂。因此，它们的组成及其制备方法是本领域技术人员熟知的。制备微泡的程序的实例描述于例如Christiansen等人,Ultrasound Med.Biol.,29:1759-1767,2003；Farook等人,J.R.Soc.Interface,6:271-277,2009；以及Stride和Edirisinghe,Med.Biol.Eng.Comput.,47:883-892,2009中，其内容通过引用特此并入。
微泡包括包围包含气体的内部空隙的壳。通常，这些微泡的形状近似球形，尽管微泡的形状在实施本发明方面不是必需的，并且因此不被认为是限制性的。微泡的大小应当例如允许其在例如通过静脉注射施用后通过体循环(例如肺部系统)。微泡通常具有小于约200μm的直径，优选地在约0.1至约100μm，例如约0.5至约100μm的范围内。特别适用于本发明的是直径小于约10μm，更优选1至8μm，特别优选至多5μm，例如约2μm的微泡。微泡的壳的厚度将变化，并且通常将在约5至约200nm，例如约10至约200nm的范围内。精确的厚度不是必需的，只要壳执行保持气体核心的期望功能。
可以用于形成微泡的材料应当是生物相容的，并且合适的材料是本领域熟知的。通常，微泡的壳将包含表面活性剂或聚合物。可以使用的表面活性剂包括能够通过在核心内气体与外部介质(例如含有微泡的水性溶液)之间的界面处形成层来形成和维持微泡的任何材料。可以使用表面活性剂或表面活性剂的组合。合适的那些包括脂质，特别是磷脂。可以使用的脂质包括卵磷脂(即磷脂酰胆碱)，例如天然卵磷脂诸如蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂，以及合成卵磷脂诸如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；及其混合物。在一个实施方案中，脂质诸如1,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DBPC)和/或1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)可以用于形成微泡的壳。DBPC和DSPE的组合特别适用于本发明。
合适的脂质和脂质组合可以基于它们增强微泡在氧保留方面的稳定性的能力来选择。在这方面适用的是1,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)。在一个实施方案中，可以使用脂质的组合，其中DBPC的存在量为至少70mol.％，优选至少80mol.％，更优选至少80mol.％(基于脂质总量)。
适用于形成微泡壳的聚合物材料包括蛋白质，特别是白蛋白，特别是人血清白蛋白。可以使用的其他生物相容性聚合物包括聚(乙烯醇)(PVA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、氰基丙烯酸酯、泊洛沙姆(普朗尼克)、壳聚糖和壳聚糖衍生物或其组合。
微泡壳可以包括相同或不同材料的单层或多层。例如，在碱性壳材料(例如脂质)带有一种或多种聚合物或多糖的情况下，可以形成多层。此类聚合物的实例包括聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮。微泡壳也可以涂覆有聚合物，诸如聚-L-赖氨酸和PLGA，和/或多糖，诸如藻酸盐、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖盐酸盐(DEAE)或壳聚糖。用于附着这些涂覆材料的方法可能涉及静电或共价相互作用。可以使用不同的涂覆材料(聚合物、多糖、蛋白质等)以例如通过增加基于微泡的试剂的刚性、流通稳定性和/或组织渗透能力，通过操纵微泡的净表面电荷，并且可能最重要的是，通过增加其有效负载能力，改善微泡的特性。
形成单层、双层或多层结构的脂质可以用于形成用于本发明的微泡。这些的实例包括单层或多层脂质体和胶束。
本文所述的任何微泡壳可以包含有助于微泡在目标位点处聚集的其他组分。例如，这些可以被官能化，使得这些掺入或结合了能够结合靶细胞或组织的配体或靶向剂。合适的靶向剂的实例包括抗体和抗体片段、细胞粘附分子及其受体、细胞因子、生长因子和受体配体。可以使用本领域已知的方法，例如通过共价偶联、使用分子间隔物(例如PEG)和/或亲和素-生物素复合物方法，将此类试剂附着到微泡。例如，将脂质-PEG-生物素缀合物掺入基于脂质的微泡中，随后加入亲和素，使得微泡表面能够用生物素化的靶向配体官能化。赫赛汀是抗体的一个实例，该抗体可以缀合到微泡壳以用于靶向目的。
微泡壳可以进一步包含有助于其附着到一个或多个如本文所述的连接基团的组分。在一个实施方案中，微泡壳可以通过分子间隔物诸如PEG(例如PEG-2000)共价偶联到生物素或生物素残基。这使得微泡表面能够用亲和素进行官能化，然后亲和素可以与生物素化的连接基团缀合。在微泡的壳中掺入脂质-间隔物-生物素缀合物(例如脂质-PEG-生物素缀合物)可以通过在微泡形成之前一种或多种脂质的适当官能化来实现。
在化疗剂(例如紫杉醇、PTX)掺入微泡的壳内的情况下，这可以例如溶解在有机溶剂中，并在微泡形成之前加入到含有脂质的溶液中。溶剂的蒸发提供了掺入化疗剂(例如PTX)的干燥脂质膜，该膜可以被重构和超声处理以提供负载的微泡。脂质-化疗剂膜(例如脂质-PTX膜)可以在合适的溶剂中重构、加热到脂质转变温度以上，并温和超声以确保化疗剂完全掺入脂质链中。然后，在超声处理以制备最终微泡悬浮液的同时，可以用合适的气体(例如全氟丁烷，PFB)喷洒溶液。
当壳包含聚合物材料，诸如白蛋白时，可以使用双重乳液(例如水包油包水)方法将化疗剂(例如紫杉醇)掺入(例如嵌入)在微泡的壳内。使用这种方法，化疗剂可以与聚合物一起溶解在乳液的油相中。从乳液中除去溶剂后，油相变成其中嵌入化疗剂的聚合物壳。
微泡核心内的气体应当是生物相容的。术语“气体”不仅涵盖在环境温度和压力下为气态的物质，还涵盖在这些条件下为液态的那些物质。当“气体”在环境温度下是液体时，它通常在38℃或更高的温度下将经历相变成气体或蒸汽。对于在环境温度下为液体的任何气体，通常优选其在约38℃与45℃之间，优选稍微高于体温的温度下经历相变成气体。例如，当经受刺激(诸如超声波)时，它可能经历相变，这导致局部温度升高。因此，本文中对“气体”的任何提及应被认为不仅涵盖气体和液体，还涵盖液体蒸汽及其任何组合，例如气体中液体蒸汽的混合物。
适用于掺入根据本发明使用的微泡中的气体包括空气、氮气、氧气、二氧化碳、氢气；惰性气体，诸如氦、氩、氙或氪；氟化硫，诸如六氟化硫、五氟化硫；低分子量烃，诸如烷烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷)、环烷烃(例如环丙烷、环丁烷、环戊烷)、烯烃(例如乙烯、丙烯)；和炔烃(例如乙炔或丙炔)；醚类；酯类；卤化低分子量烃；及其混合物。
合适的卤代烃的实例是含有一个或多个氟原子的卤代烃，并且包括例如溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷、氯三氟乙烯、氟乙烯、乙基氟、1,1-二氟乙烷和全氟化碳。
合适的碳氟化合物的实例包括全氟化碳。全氟化碳包括全氟烷烃，诸如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷和全氟庚烷；全氟烯烃，诸如全氟丙烯、全氟丁烯；和全氟环烷烃，诸如全氟环丁烷。
含有全氟化气体，特别是全氟化碳，诸如全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷和全氟己烷的微泡由于它们在血流中的稳定性而适用于本发明。
含有全氟化碳(特别是全氟烷烃)和包含磷脂的壳的微泡可以用于本发明，并且描述于例如Nomikou和McHale,Cancer Lett.,296:133-143,2010中。这种微泡的一个实例是Sonidel SDM202(可从Sonidel公司获得)。全氟化碳可以作为气体或液体的形式存在。含有液体核心的那些可以由纳米乳液制备，这些纳米乳液随后可以在暴露于超声波时转化成气体微泡，例如Rapoport等人,Bubble Sci.Eng.Technol.1:31-39,2009中所述。
在一个实施方案中，用于本发明的微泡可以携带氧。由于氧是SDT的关键底物，并且许多癌症都是缺氧的，因此用氧气填充气泡的核心增强了声动力学效应和产生的单线态氧量。
可以用于本发明的声敏剂包括使靶细胞或组织对超声波高度敏感的化合物。在一些情况下，声敏剂可能能够将声能(例如超声波)转化为ROS，从而导致细胞毒性。其他可能通过破坏细胞膜的完整性使目标细胞或组织对超声波过敏。熟知的是，许多已知的声敏剂可以促进光动力激活，并且也可以用于使细胞或组织对光过敏。
在本发明的一个实施方案中，声敏剂可以同时作为成像剂，例如作为NIR剂。此类敏化剂在能够在体内跟踪缀合物的成像潜力方面提供益处。
适合在本发明中用作声敏剂的化合物的实例包括吩噻嗪染料(例如亚甲蓝、甲苯胺蓝)、孟加拉玫瑰红、卟啉(例如
Figure BDA0002379596590000152
)、氯、苯并氯、酞菁、萘酞菁、类卟吩(porphycenes)、花青(例如部花青540和吲哚菁绿)、偶氮二焦酚次甲基(azodipyromethines)(例如BODIPY及其卤代衍生物)、吖啶染料、红紫素、脱镁叶绿酸(pheophorbides)、verdins、补骨脂素、血卟啉、原卟啉和姜黄素。也可以使用这些试剂的任何已知类似物或衍生物。合适的衍生物包括药学上可接受的盐。
在本发明中优选用作声敏剂的是亚甲蓝、孟加拉玫瑰红、吲哚青绿(ICG，也称为Cardio Green)及其任何类似物和衍生物。特别优选用于本发明的是孟加拉玫瑰红。ICG具有以下结构：
Figure BDA0002379596590000151
本文描述的任何声敏剂的已知类似物也可以用于本发明。特别合适的是基于花青的染料的结构类似物，例如ICG的结构类似物及其药学上可接受的盐。这些染料的实例包括花青染料IR820和IR783，这两种染料都是可商购获得的：
Figure BDA0002379596590000161
吸收近红外(NIR)的荧光染料ICG被FDA批准用于医学成像。它在NIR区(750-900nm)吸收很强，并且其优点是可以被人体组织中更深处的光激活(800nm处的光穿透力比600nm处大四倍)。然而，当与其他已知的敏化剂诸如孟加拉玫瑰红相比时，花青染料诸如ICG、IR820和IR783的单线态氧生成(SOG)效率相对较差。这可以通过将更多花青分子聚集到微泡上来克服。
通过在花青染料的结构中掺入卤原子(例如碘和溴)，已经进行了其他尝试来提高花青染料的ROS生成能力。例如，在US 2013/0231604(其全部内容通过引用并入本文)中，提出基于花青的染料和此类染料的类似物可以通过在每个苯并唑环或萘唑环的苯或萘部分上掺入三个碘原子来修饰。本文件中公开的任何聚次甲基染料(特别是花青)都可以用作本发明的声敏剂。
在US 2013/0231604中记载的工作的发展中，本发明人已经制备了某些花青染料(例如IR783)的结构类似物，这些花青染料在每个苯并唑环上携带一个或两个卤原子(例如碘或溴，优选碘)，并且发现这些花青染料具有增强的ROS生成能力，并因此与ICG相比，在超声激活时对癌细胞(例如胰腺癌细胞)更具细胞毒性。尽管不希望受理论的束缚，但据信卤原子的存在由于所谓的“重原子效应”，增加了从激发单线态到激发三线态的系统间交叉(ISC)。然后三重激发态能够与分子氧或其他底物结合以产生ROS。根据US 2013/0231604的教导，不能预测通过用卤原子(例如碘)替换IR783中更少(即总共2个或4个)的氢原子可以实现这种增强的ROS生成能力的水平。
此外，如下文将更详细讨论的，发明人惊奇地发现，当IR783被总共两个卤原子(即，在每个苯并唑环上仅有一个卤原子，例如碘)取代时，该化合物保持高荧光性，并且因此也可以用作NIR成像剂。由于ISC的任何增加通常都会降低化合物发射荧光的能力，因此这一发现是出乎意料的。综合起来，这些特定的IR783类似物的NIR成像潜力和敏化潜力意味着这些化合物具有“治疗”潜力，即作为治疗剂和诊断剂两者的能力。
IR783的卤化(例如碘化)类似物可以用于本发明，并且这些类似物可以由式VII或式VIII的化合物或其药学上可接受的盐表示：
Figure BDA0002379596590000171
(其中在式VII和式VIII中，每个X独立地选自溴和碘原子，优选地其中每个X是碘)。
本领域技术人员可以容易地选择此类化合物的合适盐及其制备方法。这些化合物可以例如用无机或有机碱转化成合适的其药学上可接受的盐。可能适用于此目的的碱包括碱金属和碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯，氨和有机胺，诸如二乙胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、环己胺和二环己胺。盐形成的程序在本领域是常规的。
式VII和VIII的优选化合物包括以下化合物及其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002379596590000181
用于形成微泡的方法是本领域中已知的。此类方法包括在所选壳材料存在的情况下，在水性介质中形成气体悬浮液。用于形成微泡的技术包括超声波处理、高速混合(机械搅拌)、同轴电流体动力雾化和使用T-接头的微流体处理(参见例如，Stride和Edirisinghe,Med.Biol.Eng.Comput,47:883-892,2009)。超声波处理被广泛使用，并且通常是优选的。这种技术可以使用超声波发射探头来实现。更具体地，将微泡壳组分的水性悬浮液在相关微泡组分气体例如氧气存在下进行超声处理。
可以用于形成微泡的其他方法包括在纳米乳液中蒸发纳米液滴核心(参见例如Rapoport等人，上文)。此类纳米液滴的核心通常将由有机全氟化合物形成，该化合物被脂质壳或可生物降解的两亲性嵌段共聚物诸如聚(环氧乙烷)-共-聚(L-丙交酯)或聚(环氧乙烷)-共-己内酯包裹。可替代地，纳米乳液可以通过挤压通过上浆膜来制备，例如使用白蛋白作为壳材料。液滴到气泡的转变可以由物理和/或机械手段引起，包括加热、超声波和通过细规格针注射。此类微泡可以在对患者施用时(例如，在使用细规格针施用的步骤中)或在体内期望的靶细胞或组织处(例如，通过使纳米乳液经受超声波)形成。
在对患者施用的步骤期间或施用后(即在体内)，施用能够形成如本文所定义的所希望微泡复合物的纳米液滴在本发明的范围内。当期望所得微泡含有氧气时，这可以以溶解形式提供在相移纳米乳液的液体全氟化碳核心中。
本文所述的微泡复合物可以使用本领域已知的方法和程序来制备。可以用于将化疗剂和/或声敏剂共价附着到连接基团的方法包括已知的化学偶联技术。所使用的确切方法将取决于连接基团、化疗剂和声敏剂的确切性质，特别是任何侧基官能团的性质。如果需要，待连接的一种或两种组分可以被官能化，例如包括可以用于偶联分子的反应性官能团。合适的反应性基团包括酸、羟基、羰基、酰卤、硫醇和/或伯胺。引入此类官能团的方法是本领域熟知的。
可以用于将连接基团共价结合到一种或多种化疗剂和/或声敏剂的方法的实例包括但不限于以下：
a)基于碳化二亚胺的偶联方法。这些可以用于将含有胺或羧酸官能团的连接基团偶联到具有羧酸或胺官能团的部分。此类方法导致酯键或酰胺键的形成；
b)“CLICK”反应(即1,3-偶极环加成反应)。这可以用于使叠氮化物或乙炔官能化的接头与具有乙炔或叠氮化物官能团的部分反应；
c)席夫碱形成(即亚胺键形成)。此反应可以用于将醛或胺官能化的接头结合到含有胺或醛官能团的部分；和
d)迈克尔加成反应。
微泡通过生物素-亲和素键与一个或多个连接基团的连接可以通过本领域技术人员已知的方法进行。在此类方法中，这两个部分通常将被生物素化，并且然后将亲和素用于形成两者之间的连接。在实施例1的方案2中提供了一种产生根据本发明的微泡复合物的方法的实例，其中微泡通过生物素-亲和素-生物素相互作用结合到连接基团。
作为将连接基团偶联到预先形成的微泡的替代方案，这可以替代地连接到脂质(例如，使用上述任何方法)，并且脂质在其制备过程中可以随后掺入微泡的脂质壳中。
本文所述的用于制备微泡复合物的任何方法形成了本发明的其他方面。
在本文所述的任何方法中形成的任何中间体也被认为形成了本发明的一部分，例如在本文实施例中方案1-5中概述的程序中产生的任何中间体。此类中间体的实例包括方案1中的吉西他滨-生物素缀合物(4)、方案2中的生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红缀合物(9)、方案3中的生物素-阿霉素缀合物(3)、方案4中的生物素-阿霉素-孟加拉玫瑰红缀合物(9)和方案5中的生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红缀合物(9)。本文所述的微泡复合物具有使其在声动力学治疗方法中有用的特性。
这些复合物适用于治疗响应于声动力学疗法的体内细胞或组织的紊乱或异常。这些包括恶性和恶性前癌症病状，诸如癌性生长或肿瘤及其转移；肿瘤，诸如肉瘤和癌，特别是实体瘤。本发明特别适用于治疗肿瘤，尤其是位于皮肤表面以下的那些肿瘤。
可以使用本发明治疗的肿瘤的实例是肉瘤，包括成骨肉瘤和软组织肉瘤；癌，例如乳腺癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、子宫癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；神经母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肾母细胞瘤(Wilm's tumour)；白血病，包括急性淋巴细胞白血病和急性成髓细胞白血病；星形细胞瘤、胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤。胰腺癌的治疗形成了本发明的优选方面。
在一个方面，本文所述的复合物可以用于声动力学治疗方法，并且同时也可用于体内成像方法(例如诊断成像方法)。在此类方法中，成像可以用于监控有效负载沉积和/或复合物(或多种复合物)在感兴趣的目标位点处的累积。如上所述，本发明的这一方面可以通过选择具有成像潜力的声敏剂(例如同时用作NIR成像剂的声敏剂)来实现。可替代地，已知的成像剂，诸如NIR成像剂，也可以与提议用于本发明的微泡缀合。NIR成像剂可以与微泡缀合(例如通过非共价键，诸如生物素-亲和素相互作用)。除了提供将化疗剂和声敏剂靶向体内特定位点的手段之外，本文所述的方法还可以离体进一步开发。例如，在治疗白血病的自体骨髓移植中，可以通过将微泡复合物分子靶向癌细胞来离体治疗来自患者的骨髓。然后可以用超声波处理这些混合物来破坏癌细胞，并且然后可以在放射治疗后用处理过的骨髓重建患者中的造血。可替代地，本发明的方法可以离体进行，以从为常规移植采集的器官中去除不需要的组织。在自体或异源再移植处理过的组织之前，可以靶向手术切除的组织并破坏病灶。
为了用于本文所述的任何方法，微泡复合物通常将与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂一起提供在药物组合物中。此类组合物形成本发明的另一方面。
根据本发明使用的药物组合物可以使用本领域熟知的技术来配制。施用途径将取决于预期用途。通常，这些将被全身施用，并且因此可以以适于肠胃外施用的形式提供，例如通过皮内、皮下、腹膜内或静脉注射。合适的药物形式包括含有活性微泡复合物以及一种或多种惰性载体或赋形剂的悬浮液和溶液。合适的载体包括盐水、无菌水、磷酸盐缓冲盐水及其混合物。
这些组合物还可以包括其他试剂，诸如乳化剂、悬浮剂、分散剂、增溶剂、稳定剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂等。这些组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌。
含有复合物的溶液可以稳定化，例如通过添加诸如粘度调节剂、乳化剂、增溶剂等试剂。
优选地，用于本发明的组合物将以微泡复合物在水或盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的水性悬浮液的形式使用。复合物可以冻干粉末的形式提供，用于在使用时重构，例如用于在水、盐水或PBS中重构。
本文所述的方法包括施用治疗有效量的含有微泡复合物的组合物。然后微泡复合物可以在激活之前被允许分布到身体的期望部分或目标区域。一旦施用到身体，则使目标区域暴露于一定频率和强度的超声波，以实现期望的治疗效果。典型的激活程序可以包括两步过程，其中微泡首先通过聚焦超声破裂，从而释放声敏剂和化疗剂，然后所述声敏剂和化疗剂能够渗透期望的目标组织(例如肿瘤)。目标细胞内声敏剂随后的声激活导致单线态氧的产生，该单线态氧可以氧化各种细胞组分，诸如蛋白质、脂质、氨基酸和核苷酸，从而破坏目标细胞。虽然设想声敏剂的激活通常将发生在其递送之后(即，在微泡破裂以释放声敏剂之后)，但复合物的递送和声敏剂的激活可以同时进行。
可替代地，本文所述的任何方法可以包括在施用含有微泡复合物的组合物期间将身体中的目标区域暴露于超声波，即微泡复合物的施用和超声波的递送可以同时进行。当微泡复合物的半衰期较低时，这可以避免在目标区域接收超声波之前可能大部分被去除的情况。
本文所述组合物的有效剂量将取决于复合物的性质、施用方式、待治疗的病状、患者等并且可以相应地调整。
可以使用的超声波的频率和强度可以基于在目标位点处实现微泡的选择性破坏的需要来选择，并且可以例如与微泡的共振频率相匹配。超声频率通常将在20kHz至10MHz，优选0.1至2kHz的范围内。超声波可以作为单一频率或不同频率的组合来递送。超声波的强度(即功率密度)可以在约0.1W/cm2至约1kW/cm2，优选约1至约50W/cm2的范围内。治疗时间通常将在1毫秒至20分钟的范围内，并且这将取决于所选择的强度，即对于低超声波强度，治疗时间将延长，并且对于较高超声波强度，治疗时间将降低。超声波可以以连续或脉冲模式应用，并且可以聚焦或作为柱状波束递送。
能够产生声能的任何辐射源(例如超声波)都可以用于本文所述的方法中。该源应当能够将能量导向目标位点，并且可以包括例如能够将能量从身体表面导向目标组织的探针或装置。
在实现空化(或微泡破坏)所需的超声频率和/或强度与引起声敏剂激活所需的超声频率和/或强度不同的情况下，这些不同的超声波参数(频率/强度)组可以同时应用或以两步(或多步)程序应用。
本发明的另一方面涉及患者的细胞或组织的声动力学治疗方法，该方法包括：
(a)向受影响的细胞或组织施用有效量的本文所述的组合物；和
(b)使所述细胞或组织经受超声波。
在所使用的声敏剂是也响应于光的一种声敏剂的情况下，超声波激活可能伴随着光激活。光热激活也可以另外采用，例如当使用NIR染料作为声敏剂时。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：(i)如本文所述的微泡复合物；和(ii)在声动力学治疗和/或诊断成像方法中使用(i)的说明。在试剂盒的一个实施方案中，组分(i)可以以干燥形式(例如作为冻干粉末)提供。在这种情况下，试剂盒还可以包括含有无菌的生理上可接受的液体和任选的气体的容器，分别用于活性物质的粉末形式(例如盐水或PBS)和氧气或全氟化碳的重构。
虽然根据本发明的各种方法和用途在本文中主要是在施用“即用型”微泡复合物的背景下描述的，但在可替代实施方案中，可以施用复合物的前体。如本文所用的术语“前体”旨在指微泡复合物的前体，该前体在体内转化为微泡复合物，并且因此基本上等同于微泡复合物。因此，例如，术语“前体”涵盖能够在体内或施用期间转化成所期望微泡复合物的纳米乳液或纳米液滴制剂。在一个实施方案中，此类前体能够在积聚在目标组织(例如肿瘤组织)中时转化成所期望的复合物。在分配到目标组织或细胞之后，液滴到气泡的转变可以通过包括超声波在内的方法触发。可替代地，施用复合物前体的步骤本身可以诱导根据本发明的微泡复合物的形成。例如，当前体采用纳米乳液的形式时，液滴到气泡的转变可以通过经由细规格针注射或通过使制剂经受适当的相变刺激(例如加热)来诱导。将合适的纳米乳液直接注射到目标细胞或组织中、例如肿瘤中并且原位相变形成了本发明的另一个方面。
应当理解，在本文所述的任何组合物、方法或用途中，对根据本发明的微泡复合物的任何提及可以由本文所定义的合适的“前体”代替。
根据本发明用作微泡复合物前体的纳米乳液或纳米液滴制剂可以通过适当修改本领域已知的方法和程序来生产，例如由Rapoport等人(见上文)公开的那些方法和程序。在此类制剂中，纳米乳液液滴的核心可以由液体全氟化碳(例如全氟烷烃)形成，其被合适的聚合物、蛋白质或脂质壳材料(例如本文中关于微泡复合物描述的任何聚合物)的壁包裹。纳米液滴的壳与携带声敏剂和化疗剂的连接基团的连接可以使用常规方法实现，并且包括上述用于将连接基团附着到预先形成的微泡的任何方法。所使用的确切方法将取决于壳材料和连接基团的确切性质，特别是任何侧基官能团的性质。如果需要，壳和/或连接基团可以被官能化，例如包括可以用于偶联部分的反应性官能团。合适的反应性基团包括酸、羟基、羰基、酰卤、硫醇和/或伯胺。在一个实施方案中，壳可以用生物素官能化，并且然后结合亲和素，以随后促进生物素化连接基团的结合。当期望形成的微泡将含有氧气时，全氟化碳可以作为液态形式氧的载体。在复合物形成后，全氟化碳液体被氧饱和，氧随后蒸发以形成氧气。本文主要在结合到连接基团的微泡复合物的背景下描述了在微泡的壳内掺入一种化疗剂(或多种化疗剂)，该连接基团携带至少一种附加化疗剂和至少一种声敏剂。然而，发明人已经认识到本发明的这一方面具有更广泛的适用性，并且可以与其他微泡复合物组合使用，包括WO2012/143739(其全部内容通过引用并入本文)中已知和描述的微泡-声敏剂复合物。它也可以在微泡-化疗剂复合物的背景中找到用途，该复合物包括附着到至少一种化疗剂或以另外的方式与至少一种化疗剂相关联的微泡。这种复合物可以在本文所述的任何方法中单独使用，或者可替代地，它可以与微泡-声敏剂复合物(诸如WO 2012/143739中所述的复合物)组合(例如同时)使用。在本发明的这些方面，微泡、声敏剂和化疗剂可以选自如本文所定义的任一种。
本文所述的具有嵌入微泡壳内的化疗剂的任何微泡复合物(例如微泡-声敏剂复合物或微泡-化疗剂复合物)本身是新颖的，并且形成了本发明的其他方面。在一个实施方案中，本发明提供了一种微泡-声敏剂复合物，该复合物具有嵌入在微泡壳内的紫杉醇类(例如紫杉醇)，优选地其中声敏剂为孟加拉玫瑰红。在另一个实施方案中，本发明提供了一种微泡-化疗剂复合物，该复合物具有嵌入在微泡壳内的他克唑(例如紫杉醇)，优选地其中化疗剂为抗代谢物(例如吉西他滨)或拓扑异构酶抑制剂(例如阿霉素)。
在本发明的这些更广泛的方面，声敏剂可以使用本领域已知的方法连接到微泡，诸如WO 2012/143739(其全部内容通过引用并入本文)中描述的那些方法。WO 2012/143739中公开的任何方法可以类似地应用于微泡-化疗剂复合物的制备。在此类方法中，待连接的组分通常将被生物素化，并且然后在它们之间用亲和素形成连接。将化疗剂掺入微泡壳的方法包括本文所述的任何方法。
制备具有嵌入微泡壳内的化疗剂的微泡-声敏剂复合物或微泡-化疗剂复合物的方法形成了本发明的另一个方面，这些方法包括例如使用本文所述的任何技术将化疗剂掺入微泡壳中的步骤。
与微泡、声敏剂或化疗剂的性质相关的本公开的任何实施方案同样适用于本发明的这些更广泛的方面。类似地，本文所述的任何治疗或使用方法同样适用于本发明的这些更广泛的方面。
现在将参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明，其中：
图1示出了使用0、2.5mg或5mg紫杉醇(PTX)制备的MB表面上负载的生物素-RB的量。
图2示出了使用0mg(黑条)、2.5mg(暗条)或5mg紫杉醇(PTX)(浅灰色)制备的三批MB-RB的MB数量对时间的图示。
图3示出了用吉西他滨(黑色)或生物素-Gem(灰色)处理的BxPC-3细胞的细胞活力图。在孵育48小时后通过MTT测定确定细胞活力。
图4示出了用吉西他滨或生物素-Gem-RB处理的BxPC-3细胞的细胞活力图。在孵育48小时后通过MTT测定确定细胞活力。
图5示出了用(i)无治疗(CTRL)(ii)PTX-MB-Gem(iii)PTX-MB-RB和(iv)PTX-MB-Gem-RB治疗的患有异位Mia-Paca-2肿瘤的小鼠的肿瘤生长对时间的图示。在施用MB缀合物的过程中，使肿瘤暴露于超声波，而PTX-MB-RB和PTX-MB-Gem-RB在注射后30分钟接受第二次超声波暴露。在第0、1和2天施用治疗。
图6示出了PTX/GEM/RB-MB的示意图。
图7示出了由明视场和荧光显微镜图像构建的PTX/GEM/RB-MB的尺寸分布。
图8示出了比较生物素-GEM-RB(正方形)和盐酸吉西他滨(圆形)在Panc-1(a)BxPc-3(b)和Mia-PaCa-2(c)细胞系中的效力的MTT测定结果。
图9示出了MTT测定的结果，其比较了在有(灰色)和没有(黑色)超声波暴露的情况下，在Panc-1球状体中与GEM/RB MB(GEM/RB-5μΜ)、PTX MB(PTX-6.6μΜ)和PTX/GEM/RB MB(PTX-6.6μΜ，GEM/RB-5μΜ)孵育48小时后Panc-1球状体的细胞活力。
图10示出了碘化丙啶(PI)测定的结果，其比较了在有(灰色)和没有(黑色)超声波暴露的情况下，与GEM/RB MB(GEM/RB-6.8μΜ)、PTX MB(PTX-5μΜ)和PTX/GEM/RB MB(PTX-5μΜ，GEM/RB-6.8μΜ)孵育48小时后Panc-1球状体的细胞活力。
图11示出了用(i)无治疗(圆圈)(ii)O2MB-PTX/GEM/RB(正方形)(iii)吉西他滨(三角形)治疗的患有Mia-PaCa-2肿瘤的小鼠的(a)肿瘤体积变化％和(b)平均体重的图示。微泡悬浮液(6.86x 107±1.99x 106MB)作为100uL I.V注射液(PTX-2.44±0.37mg/Kg，GEM-0.5±0.04mg/Kg，RB-1.85±0.14mg/Kg)递送。将盐酸吉西他滨溶解在无菌PBS中，并作为100uL I.P注射液(120mg/Kg)施用。在注射后立即和30分钟后，以1MHz的频率、3.5W/cm2的超声功率密度和30％的占空比进行3.5分钟的超声波治疗。误差条表示±标准误差。
图12示出了用(i)无治疗(圆圈)(ii)O2MB-PTX/GEM/RB(正方形)(iii)O2MB-PTX(↑三角形)(v)蓖麻油聚氧乙烯醚(cremophorEL)中的吉西他滨+PTX(菱形)治疗的小鼠肿瘤体积的百分比变化图。微泡悬浮液(O2MB-PTX/GEM/RB-6.47x 107±1.86x 106MB，O2MB-PTX-7.01x 107±1.5x 106MB)作为100uL I.V.注射液(O2MB-PTX/GEM/RB-PTX-3.38±0.21mg/KgGEM-0.82±0.06mg/Kg RB-3.02±0.24mg/Kg，O2MB-PTX-PTX-4.69±0.75mg/Kg)进行递送。将盐酸吉西他滨溶解在无菌PBS中，并作为100uL I.P注射液(120mg/Kg)施用。将紫杉醇溶解在1mL乙醇、1mL氢化蓖麻油(cremophor)和8mL无菌PBS中，并作为100uL I.V.注射液施用。在注射后立即和30分钟后，以1MHz的频率、3.5W/cm2的超声功率密度和30％的占空比进行3.5分钟的超声波治疗。误差条表示±平均值的标准误差。
图13是示出当紫杉醇浓度从0增加到5mg时生物素-RB的相对负载的图。
图14是示出在3小时内负载有0μΜPTX(黑条)、250μΜPTX(深灰色条)或700μΜPTX(浅灰色条)的MB制剂的相对稳定性的图。
图15是a)O2MB-PTX/DOX和b)O2MB-PTX/RB的示意图。
图16是示出来自MCF-7菌落形成测定的存活百分比的图示。仅用PTX/Dox/RB治疗(药物组合)或用超声波治疗(药物组合+US)后的细胞。在处理后，将细胞孵育8天，随后固定并染色。结晶紫染色通过图像J定量。
图17是示出在存在或不存在US(30s，频率1MHz，3.0W/cm2，50％占空比)的情况下，用(i)无治疗(ii)仅MB(无药物)(iii)仅PTX/Dox(即无MB)或iv)PTX-MB-Dox/PTX-MB-Dox处理后，MCF-7球状体的细胞活力的图。用US处理的样品与未经处理的样品的统计显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。iv与iii的统计显著性：&&p<0.01。用US处理的iv与未用US处理的iv的统计显著性：$$$p<0.001。误差条表示±标准误差，n＝3。
图18是示出来自仅用MB(即无MB)；仅PTX/Dox(即无MB)；PTX-MB-Dox/PTX-MB-RB+/-US(30s，1MHz，3.0W/cm2，50％占空比)处理并且然后用PI染色的MCF-7球状体的荧光显微镜图像的相对PI荧光的图。用US处理的样品与未经处理的样品的统计学显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。iv与iii的统计显著性：&&&p<0.001。用US处理的iv与未用US处理的iv的统计显著性：p<0.01。误差条表示±标准误差，n＝3。
图19示出了：(a)在MCF-7移植瘤模型中的肿瘤生长延迟图，其遵循(1)无治疗(2)在注射过程中通过IV与US递送的施用到肿瘤的O2MB-PTX/RB和O2MB-PTX/Dox的混合悬浮液(50μL)(3)与(2)相同但没有US处理(4)在注射过程中通过IV与US递送的施用到肿瘤的O2MB-PTX/Dox，和(5)含有游离PTX和DOX的Cremophor制剂。对于MB治疗：[MB]＝1.2x 109MB/mL[PTX]＝2.29mg/kg；[DOX]＝1.96mg/kg且[RB]＝5.34mg/kg。对于Cremophor中无PTX/DOX治疗：[PTX]＝4.96mg/kg且[Dox]＝2.50mg/kg。误差条表示±SEM，其中n＝5；和(b)在每组实验过程中记录的动物体重图。
实施例1-生物素-吉西他滨(生物素-Gem)和生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红(生物素-Gem-RB)缀合物的合成
1.1生物素化的吉西他滨(生物素-GEM)的合成：
根据方案1合成生物素化的吉西他滨。该方案在以下提供。
Figure BDA0002379596590000261
方案1：制备生物素-Gem的合成方案
(2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3羟基四氢呋喃-2-基)甲基(2-(5-(2-氧代六氢-lH-噻吩并[3,4-d)咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)碳酸酯(4)的合成：
按照文献程序制备化合物2(参见McEwan等人Biomaterials.2016:80,20-32)。在0℃下向2(0.28g，0.9mmol)的DCM(10mL)溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(0.59g，2.9mmol)、DIPEA(0.50g，3.9mmol)和催化量的吡啶，并在室温下搅拌24小时。然后在真空中将反应混合物浓缩至干燥。将含有3的粗残余物溶解在20mL DMF中。向此溶液中加入在DMF(5mL)和TEA(1mL)中的吉西他滨(0.88g，2.9mmol)，并且将混合物再搅拌24小时。在反应完成后(通过TLC监测)，向反应混合物中加入过量的二乙醚(200mL)，并搅拌45分钟。分离如此获得的微黄色油并用冷二乙醚(50mL x 3)洗涤三次。使用DCM/MeOH(9:1)作为洗脱剂通过PTLC纯化粗化合物，以得到目标化合物4(0.12g，22％产率)。
1H NM(DMSO-d6)：δ7.99-7.91(m,3H,CH,NH2),6.41-6.33(m,1H,CH),6.12-6.01(m,3H,CH,NH X 2),4.30-4.16(m,1H,CH),4.19-4.12(m,3H,CH,CH2),3.90-3.75(m,2H,CH2),3.69-3.58(m,2H,CH2),3.12-3.09(m,1H,CH),2.93-2.88(m,2H,CH2),2.83(brs,1H,OH),2.82-2.77(m,2H,CH X2),2.72(brs,1H,NH),2.49-2.04(m,2H,CH2),1.49-1.28(m,6H,CH2X3)。
13C NMR(DMSO-d6)：175.0(C＝O),166.3(C),165.5(C＝O),156.3(C＝O),156.1(C＝O),141.3(CH),125.3(C),95.2(CH),79.2(CH),67.2(CH),61.9(CH),60.2(OCH2),55.5(OCH2),39.6(CH),37.8(CH2),35.2(CH),28.3(CH2),28.0(CH2),25.3(CH2)。ESI-MS：针对C22H30F2N6O8S计算，576.18；实测值577.2(M+H)。
1.2生物素-Gem-RB的合成：
根据方案2合成生物素-Gem-RB。每个中间体的方案在以下提供。
Figure BDA0002379596590000271
方案2：制备生物素-Gem-RB的合成方案
N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d)咪唑-4-基)戊酰胺(3)的合成：
向生物素-NHS(0.5g，1.5mmol)和TEA(催化量)在无水DMF(10mL)中的搅拌溶液中，加入三(2-氨基乙基)胺(0.22g，1.5mmol)在5mL DMF中的溶液。在氩气气氛下在0℃下搅拌反应混合物。在搅拌2小时后，加入另一体积的TEA(催化量)，并且使反应混合物在室温下搅拌过夜。在反应完成后(通过TLC)，在减压下除去过量的DMF，保持温度低于45℃，并且将如此获得的白色胶状液体倒入过量的二乙醚(200mL)中并过滤。通过碱性(TEA)硅胶上的柱色谱法(MeOH:DCM 1:9至3:7)纯化粗产物，以得到为白色半固体的3(0.33g，61％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.94(brs,1H,NH),6.42(brs,1H,NH),6.35(brs,1H,NH),4.49(brs,4H,NH2X 2),4.29(s,1H,CH),4.12(s,1H,CH),3.07-3.02(m,6H,CH2X 3),2.88-2.82(m,1H,CH),2.44-2.06(m,10H,CH2X 5),1.59-1.48(m,4H,CH2X 2),1.47-1.29(m,2H,CH2)。
ESI-MS：针对C16H32N6O2S计算，372.23；实测值373.31(M+H)。
双(2,5-二氧吡咯烷-l-基)8,8'-((((2-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)氮杂二基)双(乙烷-2,l-二基))双(氮杂二基))双(8-氧代辛酸酯)(5)的合成：
在TEA(催化量)存在下，将化合物3(0.5g，1.3mmol)溶解在10mL无水DMF中，并加入双(2,5-二氧吡咯烷-l-基)辛二酸酯(4.1g，2.7mmol)。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物24小时。在反应完成后(通过TLC)，向反应混合物中加入过量的二乙醚(200mL)。过滤如此获得的白色沉淀并用冷二乙醚(50mL x 3)洗涤三次。通过碱性(TEA)硅胶上的柱色谱法(MeOH:CHCl3 2:8至5:5v/v)纯化粗产物，以得到为低熔点白色固体的5(0.83g，71％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.94(brs,2H,NH X 2),7.67(brs,1H,NH),6.41(brs,1H,NH),6.34(brs,1H,NH),4.29(s,1H,CH),4.12(s,1H,CH),3.06-3.04(m,3H,CH和CH2),2.88-2.72(m,6H,CH2X 3),2.71-2.63(m,8H,CH2X 4),2.45-2.34(m,6H,CH2X 3),2.20-2.06(m,10H,CH2X 5),1.60-1.21(m,22H,CH2X 11)。
13C NMR(DMSO-d6)：172.5(C＝O),170.7(C＝O),163.1(C＝O),162.7(C＝O),61.4(CH),59.6(CH),55.8(CH2),53.9(NCH2),39.9(CH2),39.8(CH2),39.6(CH2),37.3(CH2),36.2(CH2),35.6(CH2),31.2(CH2),28.7(CH2),28.5(CH2),25.8(CH2),25.7(CH2),25.6(CH2)。
ESI-MS：针对C40H62N8O12S计算，878.4；实测值901.3(M+Na盐)。
((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基4,11,19-三氧代-15-(2-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)-1-((2,3,4,5-四氯-6-(6-羟基-2,4,5,7-四碘-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酰基)氧基)-3,12,15,18-四氮杂二十六烷基-26-酸酯(9)的合成：
在0℃下向DMF(无水，10mL)溶液中加入5(0.4g，0.45mmol)GMC-盐酸盐(8，0.136g，0.45mmol)和TEA(0.5mL)，并在氩气气氛下在室温下搅拌24小时。在反应完成后(通过GC-MS监测)，将孟加拉玫瑰红胺7(根据McEwan等人J.Control Release.2015；203,51-56制备)(0.43g、0.45mmol，在DMF(5mL)中)和TEA(0.5mL)加入到反应混合物中，并继续搅拌24小时。通过粗反应混合物的质谱分析来监测反应的进展。在反应完成后，向溶液中加入过量的二乙醚(200mL)，并搅拌30分钟。过滤如此获得的粉红色沉淀，并分别用冷二乙醚(100mL)、乙酸乙酯(100mL)、丙酮-水混合物(10％，v/v，100mL)洗涤几次，并且最后用乙酸乙酯-己烷混合物(50％，v/v，100ml)洗涤，以得到化合物9的粉红色粉末(0.26g，30％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.95(brs,2H,NH2),7.69(s,1H,CH,芳香质子),7.68(s,1H,CH,芳香质子),7.37(s,1H,CH),7.32(brs,4H,NH X 4),6.89(s,1H,CH),6.42(brs,1H,NH),6.35(brs,1H,NH),6.22(d,J＝5.5Hz,1H,CH),6.13(brs,1H,NH),5.78-5.77(m,1H,CH),5.19(s,1H,CH X 2),4.9(brs,1H,OH),4.30(s,2H,-OCH2),4.13(s,2H,-OCH2),3.79-3.60(m,3H,CH,CH2),3.39-3.32(m,2H,CH2),3.07(brs,6H,N-NHCH2 X 3),2.94-2.84(m,6H,NCH2X 3),2.81(brs,1H,OH),2.45-2.46(m,3H,CH,CH2),2.17-2.06(m,10H,CH2 X 5),1.60-1.10(m,22H,CH2X 11)。
13C NMR(DMSO-d6)：171.8(C＝O,C),165.98(C＝O),163.2(C＝O),162.7(C＝O),159.3(CH),155.0(C＝O),150.5(C),145.8(C),141.2(CH),131.0(C),128.7(C),123.5(C),116.2(C),95.0(CH),80.9(C),69.3(CH),61.5(C),59.6(CH2),59.4(CH),55.8(CH),51.7(CH2),45.8(CH2),40.2(CH2),37.3(CH2),37.05(CH2),36.2(CH2),35.5(CH2),31.0(CH2),28.7(CH2),28.5(CH2),28.2(CH2),25.6(CH2)。ESI-MS：针对C63H72针对Cl4F2I4 N10O15S计算，1925.98；实测值1925.90(M-H)。
实施例2-亲和素官能化紫杉醇(PTX)负载微泡(MB)的制备、稳定性和负载效率
2.1壳内掺入PTX的脂质稳定化MB(PTX-MB)的制备：
通过首先将脂质1,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)(4.0mg，4.43umol)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG(2000))(1.35mg，0.481μmo1)和DSPE-PEG(2000)-生物素(1.45mg，0.481μmol)溶解在氯仿中以实现82:9:9的摩尔比来制备壳中疏水掺入PTX的亲和素官能化脂质稳定化微泡。向此溶液中加入溶解在氯仿中的紫杉醇(5mg，5.86μmo1)。将该溶液在40℃下加热30分钟直到氯仿蒸发。将干燥的脂质膜在3mL林格氏溶液(PBS、甘油、丙二醇(8:1:1体积比))中重构，并在75℃水浴上加热30分钟。然后，使用显微镜超声细胞破裂仪将悬浮液以22％的振幅超声1分钟，以使脂质与紫杉醇完全结合。然后用PFB气体鼓吹悬浮液，同时以89％的振幅超声处理悬浮液1分钟，以形成微泡悬浮液。然后使MB在冰上冷却10分钟，随后以700rpm离心5分钟，以除去气泡饼下面液体中存在的过量脂质/紫杉醇。然后用2mL Ungers溶液洗涤滤饼，随后加入亲和素水性溶液(500μL，2.5mg/mL)。然后将悬浮液搅拌5分钟，随后离心(700rpm)以除去过量的亲和素。然后用2mL Ungers溶液再次洗涤MB滤饼，离心(700rpm)并分离MB。
2.2将生物素-RB、生物素-Gem和生物素-Gem-RB加载到亲和素官能化的PTX-MB表面上：
将在DMSO:Ungers溶液(10:90v/v)中制备的含有生物素-RB、生物素-Gem或生物素-Gem-RB(500μL，5mg/mL)的溶液加入到2mL PTX-MB(2.0x 108MB/mL)中。然后使用旋转摇动器将悬浮液混合5分钟，随后离心(700rpm)5分钟以除去过量的配体。将此偶联过程再重复一次。将最终的微泡滤饼悬浮在2mL Ungers溶液中。直接使用微泡，或者在使用前立即通过用氧气鼓吹悬浮液2分钟来充氧。
2.3亲和素官能化PTX-MB的负载能力：
为了确定亲和素官能化MB的负载能力是否受到MB壳中掺入PTX的影响，在第2.1节中描述的NB制造过程中，使用0mg、2.5mg或5mg PTX制备了三批PTX-MB。然后，如第2.2节所述，使每批MB负载生物素-RB。然后，通过有意冲刷固定量的MB并使用参考校准曲线，使用UV-Vis光谱对负载在MB表面上的孟加拉玫瑰红的量进行定量。将各种反应重复进行三次。选择生物素-RB用于这项研究的原因是由于其固有的发色团使得定量过程更加简单。
这项研究的结果显示在图1中，并且显示对于任何制备的批次生物素-RB的负载没有统计学上显著的差异。这些结果表明PTX在MB壳中的存在并不影响附着到表面的生物素化配体的量。
2.4PTX-MB的稳定性测定：
为了测定表面附着有生物素化有效负载的PTX-MB的稳定性，如第2.3节所述制备了三批在壳中含有0、2.5或5.0mg PTX的PTX-MB-RB MB。将来自每批的微泡样品(2mL)在37℃下孵育3小时，并且然后使用血细胞计数器以不同的时间间隔(0分钟、10分钟、60分钟、120分钟和180分钟)计数MB数量。
这项研究的结果显示在图2中，并且显示对于任何制备的PTX-MB-RB批次的MB数量没有统计学上显著的差异。这些结果表明，PTX-MB-RB缀合物的稳定性不受MB壳中PTX存在的影响。
实施例3-PTX-MB-RB、PTX-MB-Gem和PTX-MB-Gem-RB的生物测试
3.1生物素-Gem和生物素-Gem-RB在BxPC-3细胞中的功效：
为了确保生物素-Gem和生物素-Gem-RB的抗代谢功效不受化学修饰的影响，在人胰腺癌细胞系BxPc-3中测定了缀合物的细胞毒性。在37℃下，在湿润的5％CO2气氛中，将细胞保存在补充有10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640中。将这些细胞以每孔5000个细胞的密度接种到96孔板中。然后将板孵育24小时，随后加入100uL掺有Gem、生物素-Gem或生物素-Gem-RB的培养基。用于生物素-Gem的浓度为0、0.1、5、10、25、50、100和100μΜ，而对于生物素-Gem-RB，研究了0.01μΜ、0.05μΜ、0.1μΜ、0.5μΜ、1μΜ、5μΜ和10μΜ的浓度。在每种情况下都使用相应浓度的Gem。然后，在使用MTT测定确定细胞活力之前，将细胞进一步孵育48小时。这项研究的结果如图3和图4所示，并且显示在测试的浓度范围内，吉西他滨与生物素-Gem或生物素-Gem-RB相比，其疗效没有统计学上显著的差异。这些结果表明吉西他滨在每种这些配体中的化学修饰不会对其功效产生负面影响。
3.2使用PTX-MB-Gem-RB递送的紫杉醇/吉西他滨/SDT组合治疗的体内功效：
在37℃下，在湿润的5％CO2气氛中，将MIA-Paca-2细胞保存在补充有10％胎牛血清和1％链霉素(penstrep)的DMEM培养基中。将细胞(5x106)重新悬浮在
Figure BDA0002379596590000311
中，并皮下植入BALB/c SCID小鼠的后背部中。根据1986年英国动物(科学程序)法，所有动物都受到人道的对待，并符合许可程序。一旦肿瘤达到平均体积150mm3，则动物被随机分成4个治疗组(每组中n＝4)。将动物通过腹腔注射Hypnorm:hypnovel:冰冷无菌水(1:2:1)进行麻醉。通过静脉注射到尾静脉中，用100μL含有PTX-MB-RB([PTX]＝878μΜ；[RB]＝1179μΜ)、PTX-MB-Gem([PTX]＝846μΜ；[Gem]＝850μΜ)或PTX-MB-Gem-RB([PTX]＝742μΜ；[Gem]＝489μΜ；[RB]＝489μΜ)的悬浮液处理动物。使用超声凝胶将超声直接应用于肿瘤区域，以在注射过程中和注射后3分钟内以1MHz的超声频率，3.5Wcm-1的超声功率密度和30％的占空比调节接触3.5分钟。对于PTX-MB-RB和PTX-MB-Gem-RB组，在注射30分钟后将使用相同参数的第二次超声治疗也直接应用于肿瘤。在第0、1和2天施用治疗。在整个治疗过程中，每天使用卡尺监测肿瘤生长，并使用以下等式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(W*H*L/2)。
结果如图5所示，并且显示所有治疗组的肿瘤生长相对于对照组有统计学上显著的减少(p<0.001)。与紫杉醇-吉西他滨(PTX-MB-Gem)组合治疗相比，组合的紫杉醇-SDT(PTX-MB-RB)组的肿瘤生长没有显著差异。然而，当与组合紫杉醇-SDT(PTX-MB-RB)或组合紫杉醇-吉西他滨(PTX-MB-Gem)治疗相比时，对于组合紫杉醇-吉西他滨-SDT(PTX-MB-Gem-RB)治疗的肿瘤生长有统计学上显著的差异(p<0.01)。
实施例4-携带生物素-RB、生物素-Gem和生物素-Gem-RB的亲和素官能化PTX-MB的制备、表征和生物测试
4.1将生物素-RB、生物素-Gem和生物素-Gem-RB加载到亲和素官能化的PTX-MB表面上：
将含有生物素-RB、生物素-Gem或生物素-Gem-RB(1mL，5mg/mL)的饱和水性溶液加入到2mL PTX-MB或不含PTX的MB(6.72x 108MB/mL)中。将悬浮液混合5分钟(0℃)，随后离心(700rpm)3分钟以除去过量的配体。然后用PBS溶液将MB滤饼再洗涤3次。将最终的微泡滤饼悬浮在2mL PBS溶液中。直接使用微泡，或者在使用前立即通过用氧气鼓吹悬浮液2分钟来充氧。使用光学显微镜在血细胞计数器上测定最终微泡数量。PTX/GEM/RB-MB的示意图在图6中示出。
4.2MB制剂的粒度分布分析：
使用imageJ软件进行粒度分布分析。在应用自动阈值策略消除失焦MB之前，将明视场图像转换为8位灰度。然后相对于明视场图像中存在的比例尺计算粒径。图7示出了从该图像构建的粒度分布直方图。平均微泡直径为1.52μm。
4.3体外功效：
在37℃下，在湿润的5％CO2气氛中，将人原发性胰腺癌细胞系BxPc-3、Panc-1和Mia-PaCa-2分别保存在补充有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基以及含有1g/L葡萄糖并补充有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。将这些细胞以每孔5000个细胞的密度接种到96孔板中。然后将板孵育24小时，随后加入100μL掺有范围从0.001-1000μΜ浓度的Gem或生物素-Gem-RB的培养基。然后，在通过MTT测定确定细胞活力之前，将细胞进一步孵育48小时。
图8示出了生物素-GEM-RB与可商购获得的盐酸吉西他滨在三种胰腺癌细胞系中的比较功效：Panc-1(a)BxPc-3(b)和Mia-PaCa-2(c)宽的浓度范围内(0-1000μΜ)。这些结果显示，吉西他滨修饰后的功效没有降低，并且对10μΜ以上的Panc-1细胞的功效也有显著提高。
4.4Panc-1球状体的培养：
将人原发性胰腺癌细胞系PANC-1保存在含有1g/L葡萄糖并补充有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。将细胞在37℃下在5％CO2湿润的气氛中孵育。通过将2000个细胞(200uL)接种到预包被的96孔板(每孔60uL 1.5％琼脂糖)中制备球状体。每天检查球状体，并花3天达到可治疗的大小。
4.5Panc-1球状体的体外细胞毒性：
如上所述培养Panc-1球状体。用新鲜的无药物介质PTX-MB(5uM)、GEM/RB-MB(6.8μΜ)或PTX/GEM/RB-MB(PTX-5μΜ，GEM/RB-6.8μΜ)代替每个孔中的介质。然后用超声波(Sonidel SP100声孔器，30秒，频率-1MHz，超声功率密度-3.0W/cm2，占空比-40％)单独处理孔。在与新鲜培养基GEM/RB MB、PTX MB和PTX/GEM/RB MB孵育48小时后，在有和没有超声暴露的情况下，对Panc-1球状体的检查显示，在超声暴露30秒后，用负载药物的MB治疗的所有组中，球状体形态均退化。
4.6球状体的总细胞活力测定
在初始处理后两天，如上所述洗涤球状体。在Eppendorf管中收集每种条件的总共5个球状体/复制体，用PBS洗涤，并且然后在37℃下用胰蛋白酶孵育15分钟。然后将所得细胞悬浮液用MTT(10μl在100μl培养基中)孵育3小时。然后使用FLUOstar Omega(BMG实验室)板阅读器在570-690nm处测量吸光度。
在图9中，数据表示为相对于未处理样品的细胞活力百分比。这表明用MB制剂处理的所有组的细胞活力都下降了，并且当这些组用超声波处理30秒时，细胞活力进一步下降。用PTX/GEM/RB MB+US处理的球状体表现最好，其中与未处理的对照组相比，细胞活力降低了67％。
4.7球状体的碘化丙啶染色：
在初始处理后两天，用PBS洗涤Panc-1球状体四次以除去过量的药物，并且然后用最终浓度为100μg/mL的PBS和碘化丙啶(Invitrogen)的溶液孵育。然后将球状体在RT下孵育40分钟。在孵育后，将球状体用PBS洗涤然后放置到玻璃显微镜载玻片上，此时使用NIKONEclipse E400相衬显微镜在明视场(BF)和荧光中采集实时图像，以分别使用540nm带通激发和590nm长通发射滤光片可视化碘化丙啶信号。用所有MB制剂处理的球状体在617nm处显示出增强的荧光强度，并且因此碘化丙啶(PI)的摄取增加。用GEM/RB MB或PTX/GEM/RB MB处理的球状体显示荧光强度进一步增加，其中后者表现最好。在治疗后暴露于超声波30秒的组中，荧光强度的进一步增加是明显的。图10示出了用MB制剂处理的所有组的PI摄取都增加了，并且当这些组用超声波处理30秒时，PI摄取进一步增加。用PTX/GEM/RB MB+US处理的球状体表现最好。
4.8体内细胞毒性实验：
在37℃下，在湿润的5％CO2气氛中，将Mia-Paca-2细胞保存在DMEM培养基中，并且将BxPc-3细胞保存在RPMI 1640中，两者均补充有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS)。将细胞(5x106)重新悬浮在
Figure BDA0002379596590000331
中，并皮下植入SCID(
Figure BDA0002379596590000332
Hsd-Prkdcscid)小鼠的后背部内。肿瘤在3周内达到可治疗的大小。每天使用卡尺进行肿瘤测量。一旦肿瘤达到平均体积150mm3，则动物被随机分配到治疗组。将动物通过腹腔注射hypnorm:hypnovel:注射用冰冷无菌水(1:2:1)进行麻醉。用100μLO2MB-GEM-RB、O2MB-PTX-GEM-RB治疗动物，通过I.V.注射将聚氧乙烯蓖麻油中的紫杉醇注射到尾静脉中并且通过I.P.注射注射盐酸吉西他滨。在注射后立即以1MHz的超声频率，3.5Wcm-1的超声功率密度和30％的占空比将超声直接应用于肿瘤持续3.5分钟。在30分钟后，将第二次超声处理直接应用于肿瘤。在整个治疗过程中每天监测肿瘤生长。
将盐酸吉西他滨溶解在无菌PBS中，并作为100uL I.P注射液(120mg/Kg)施用。在注射后立即和30分钟后，以1MHz的频率、3.5W/cm2的超声功率密度和30％的占空比进行3.5分钟的超声波治疗。
图11(a)中的曲线显示，用PTX/GEM/RB MB治疗随后进行超声暴露的小鼠肿瘤生长有统计学上显著的降低。在整个10天的实验中，此组内的肿瘤生长得到持续控制。由此组显示的响应也优于用当前胰腺癌治疗标准(吉西他滨)的临床剂量治疗的小鼠。图11(b)显示，当与未治疗的对照组相比时，用PTX/GEM/RB MB治疗的小鼠体重没有明显减轻，这表明该治疗不仅有效，而且耐受性良好。相比之下，用临床剂量的吉西他滨治疗的小鼠在第6天体重显著下降12％。
图12中的曲线显示，用PTX/GEM/RB MB治疗随后进行超声暴露的小鼠肿瘤生长速率有统计学上显著的降低。在整个10天的实验中，此组内的肿瘤生长得到持续控制。由此组显示的响应也优于用当前胰腺癌治疗标准组合疗法(吉西他滨+紫杉醇)的临床剂量治疗的小鼠。
4.9PTX和生物素-Gem-RB浓度以及RB负载能力的测定：
如前所述制备三批PTX/RB MB，其中向脂质膜中加入0、2.5或5mg PTX，并加入相同量的生物素孟加拉玫瑰红。在随后的洗涤之后，使用在550nm处测量的标准UV分光光度法获得孟加拉玫瑰红的浓度。将此实验进行三次。使用Phenomenex C18柱(250x 4.6mm，5μm)，流动相由乙腈:水(1:1v/v)组成，并且检测波长为227nm，通过反相HPLC测定PTX浓度。分析物的保留时间为9分钟。使用UV分光光度法测定Biotin-Gem-RB的负载，其中分析物吸收波长为560nm。图13示出随着紫杉醇浓度从0增加到5mg时生物素-RB的相对负载。这显示，随着磷脂壳的酰基链中紫杉醇负载浓度的增加，生物素-RB的相对负载能力不会显著降低。
4.10PTX-MB的稳定性：
如前所述制备PTX-MB，其中向脂质膜中加入0、2.5或5mg PTX。在随后的洗涤之后，使用光学显微镜上的血细胞计数器来测定MB数量。在MB合成后立即进行初始读数，并且然后在10、60、120和180分钟后进行读数。如前所述，使用反相HPLC测定PTX浓度。
图14中的结果显示，随着磷脂MB的酰基链中PTX浓度的增加，制剂的相对稳定性没有显著降低。
实施例5-携带生物素-阿霉素(生物素-Dox)或生物素-孟加拉玫瑰红(生物素-RB)缀合物的紫杉醇(PTX)负载微泡(MB)的制备和生物测试
5.1试剂和材料：
1,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG(2000))和DSPE-PEG(2000)-生物素购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)。氧气购自BOC Industrial Gases UK，并且全氟丁烷(PFB)购自Apollo Scientific Ltd。磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Gibco,LifeTechnologies,UK。甘油和丙二醇(1kg，水解)购自Sigma Aldrich(UK)。使用Leica DM500光学显微镜获得光学显微镜图像。孟加拉玫瑰红钠盐、NHS-生物素、吉西他滨、MTT测定试剂盒、亲和素、氯乙酸、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、羟基苯并三唑(HOBt)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、无水二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇尽可能以最高等级购自Sigma Aldrich(UK)。生物素、二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯和2-氨基乙醇购自Tokyo Chemical Industry UK Ltd。
5.2生物素-Dox的合成：
根据方案3合成生物素化阿霉素(生物素-Dox)(3)。该方案在以下提供。
Figure BDA0002379596590000351
方案3：合成生物素-Dox的合成方案
在氮气气氛下，向生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(1，0.14g，0.41mmmol)在DMF(10ml)中的冰冷溶液中加入阿霉素(2，0.3g，0.41mmol)。在搅拌30分钟后，向此反应混合物中加入三乙胺(0.5ml，2mmol)，并使其在室温下再搅拌12小时。通过TLC(Merck二氧化硅60，HF 254，20:80甲醇-二氯甲烷v/v)监测反应。在反应完成后，向反应混合物中加入过量的二乙醚(100ml)。过滤如此获得的红色固体并用二乙醚(50ml X 3)洗涤三次。然后使用甲醇-二氯甲烷(20:80，v/v)作为洗脱剂使此红色固体经受PTLC纯化，以获得0.25g(产率＝78％)的3。从乙醇中重结晶此产物获得分析样品。
1H NMR(DMSO-d6)5：7.84(d,J＝7.5Hz,2H,芳香族),7.58(d,J＝7.5Hz,1H,芳香族),6.36(s,1H,NH),6.29(s,1H,NH),5.37(brs,1H,OH),5.22(brs,1H,OH),4.87(s,2H,-CH2-OH),4.51(brs,2H,OH X 2),4.36-4.33(m,1H,CH),4.25-4.22(m,1H,CH),4.16-4.13(m,1H,CH),3.99(s,3H,OCH3),3.60-3.58(m,1H,CH),3.55(brs,2H,OH X2),3.10-3.00(m,4H,CH2X1,CH X 2),2.88-2.54(m,3H,CH2X 1,CH),2.20-2.00(m,1H,CH),1.63-1.50(m,4H,CH2X 2),1.42-1.22(m,11H,CH3X 1,CH2X 4)。13CNMR(DMSO-d6)：177.6,176.9,174.8,166.4,163.0,161.2,153.7,152.7,137.4,132.4,120.4,1 19.4,99.5,97.8,80.15,75.1,72.7,66.4,61.4,59.5,55.7,47.8,33.8,31.9,28.9,28.8,28.5,28.4,24.9,19.8,17.6,17.1。ESMS(M-H]：针对C37H43I2N3O13S计算＝769.25，实测值＝767.9。
5.3在壳内负载有PTX且在MB表面附着生物素-Dox或生物素-RB的携带氧的微泡的制备：
通过将l,2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)(4.0mg，4.44umol)、l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG(2000))(1.35mg，0.481μmo1)和DSPE-PEG(2000)-生物素(1.45mg，0.481umol)溶解在氯仿中以实现82:9:9的摩尔比来制备壳中疏水掺入PTX的亲和素官能化脂质稳定化微泡。向此溶液中加入溶解在氯仿(100uL)中的紫杉醇(5mg，5.86μmo1)。在室温下在真空下除去溶剂，得到半透明膜。将干燥的脂质膜在2mL含有PBS、甘油、丙二醇(8:1:1体积比)的溶液中重构，并在80℃水浴中加热30分钟。然后，使用显微镜超声细胞破裂仪将悬浮液以22％的振幅超声30秒，以使紫杉醇完全悬浮。然后用PFB气体鼓吹悬浮液，同时以89％的振幅超声处理悬浮液1分钟，以形成微泡。然后将MB在冰上冷却10分钟，随后以700rpm离心3分钟，并移除下层清液以除去过量的脂质/紫杉醇。然后在加入亲和素水性溶液(10mg/mL)之前，将滤饼再洗涤2次。然后将悬浮液搅拌5分钟(0℃)，随后离心(700rpm)以除去未结合的亲和素。然后再次洗涤MB滤饼并将其悬浮在PBS溶液中。将含有生物素-Dox、生物素-RB(1mL，5mg/mL)的饱和水性溶液加入到2mL PTX-MB(7.52x 108MB/mL)中。将悬浮液混合5分钟(0℃)，随后离心(700rpm)3分钟以除去过量的配体。然后用PBS溶液将MB滤饼再洗涤3次。将最终的微泡滤饼悬浮在2mL PBS溶液中。微泡在使用前立即通过用氧气鼓吹悬浮液2分钟来充氧。使用光学显微镜在血细胞计数器上测定最终微泡数量。图15是a)O2MB-PTX/DOX b)O2MB-PTX/RB的示意图。
5.4测定Dox、PTX、SDT及其组合在MCF-7细胞中的细胞毒性的菌落形成测定：
在这项研究中，使用的每种药物的浓度都是有意亚致死的，使得通过组合治疗获得的任何益处都可以很容易地识别出来。此外，由于超声的作用可能由于声孔效应而影响细胞对药物的摄取，因此还将用Dox或PTX处理的细胞暴露于超声，以控制由于声孔效应对细胞活力的任何潜在的超声介导作用。在处理后，使用菌落形成测定确定细胞活力。
将MCF-7细胞接种(5x103)在96孔板中，24小时后用游离药物处理细胞，作为PTX(1nM)、Dox(10nM)、RB(10nM)的单一处理或组合处理3小时，随后更换培养基。使用SonidelSP100声孔器(1MHz，30秒，3Wcm-2，占空比＝50％，且PRF＝100Hz)对选择的孔进行超声处理。第二天，从2个孔中合并细胞，并接种在6孔板中。将板放置在孵育箱中7天。从孔中取出培养基，在室温下加入定影/染色溶液20分钟。定影/染色溶液包含：0.5g结晶紫(0.05％)、27ml37％甲醛、100ml 10X PBS(X1)、10mL甲醇(1％)和863mL蒸馏水。取出溶液，并在流水下洗涤。使用高分辨率照相机拍摄照片并通过Image J分析菌落形成。
结果如图16所示，并且显示与未处理的细胞相比，在没有超声波的情况下，用PTX、Dox和孟加拉玫瑰红(药物组合)的组合处理的细胞的菌落形成没有减少。与未处理的细胞相比，用PTX+US、RB+US(即SDT)或Dox+US处理的细胞的菌落数分别减少了7.3％、18.8％和29.3％，而用PTX、Dox和RB+US组合处理的细胞的菌落数减少了44.0％。由于使用了亚致死剂量的药物，因此在没有US的情况下，组合药物组合给药(cocktail)缺乏疗效并不奇怪。然而，暴露于US后疗效的显著改善表明声孔效应改善了这些药物的摄取，从而能够观察到细胞毒性效应。事实上，观察到组合PTX、Dox和SDT治疗组的细胞活力下降最大，表明这三种治疗相互补充，并改善了观察到的细胞毒性效应。
5.5MCF-7球状体的制备：
人类乳腺癌MCF-7细胞系购自American Type Culture Collection(ATCC,Rockville,MD,USA)。将MCF-7细胞在补充有10％FBS(Gibco)、100μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养基中培养，并保存在37℃下，湿润的5％CO2气氛中。通过在来自PerkinElmer的载体板(ULA)中生长MCF-7细胞来产生3D球状体。简而言之，在每个孔中将8000个MCF-7接种在100μl培养基中。在接种后24小时，向每个孔中加入100μl培养基，并将板在37℃下用5％CO2孵育3天，以允许细胞组装。通过取出100μl旧培养基并用100μl新鲜培养基替换，每3-4天更换一次培养基。
5.6使用MB-PTX-Dox/MB-PTX-RB±超声对MCF-7球状体进行化学-声动力学疗法治疗：
在孵育3天后，将球状体分成组，并根据以下条件进行处理：未处理的球状体、仅用MB(无药物)处理的球状体、仅用PTX/Dox(即无MB)([PTX]＝0.34μΜ，[DOX]＝1μΜ)处理的球状体、用PTX-MB-Dox/PTX-MB-RB([DOX]＝1μΜ，[RB]＝10μΜ)处理的球状体。在需要时，然后将单个孔放置成与发射表面直接接触，将使用超声凝胶的Sonidel SP100声孔器用于介导接触。使用1MHz的频率、3.0W/cm2的US功率密度和50％的占空比(脉冲频率＝100Hz)，用超声波(US)处理每个孔30秒。在每次处理结束时，将板放置在孵育箱中，在37℃下湿润的5％CO2气氛中3小时，并且然后将孔洗涤3次，并加入新鲜培养基。在处理后48小时，用MTT测定(APPLICHEM LIFESCIENCE)来测定细胞活力。简而言之，在Eppendorf管中收集每种条件的5个球状体/复制体，用PBS洗涤，并且然后在37℃下用胰蛋白酶孵育15分钟。然后将所得细胞悬浮液用MTT(10μl在100μl培养基中)孵育3小时。然后使用FLUOstar Omega(BMG实验室)板阅读器在570-690nm处测量吸光度。数据表示为细胞活力相对于未处理样品的百分比。
此外，在每次处理结束时，进行碘化丙啶(PI)染色，以便研究球形冠上的细胞损伤。简而言之，用PBS洗涤球状体四次以除去过量的培养基，并且然后用PBS和PI(Invitrogen)的溶液孵育，其中最终浓度为100μg/ml。然后将球状体在RT下在黑暗中孵育40分钟。在孵育结束时，将球状体用PBS洗涤三次以除去过量的PI，并且然后使用NIKONEclipse E400相衬显微镜在明视场和荧光中收集实时图像，以分别使用540nm带通激发和590nm长通发射滤光片观察PI。此外，用NIS-Elements BR 3.2成像软件评估荧光信号，考虑每种条件总共3个不同的球状体。将Image J软件用于定量PI荧光，表示为PI荧光％/μm2。此外，为了研究每种处理对球状体形态的影响，通过使用以下公式计算每个球状体的体积：体积＝4/3πr3。
如图17所示，当3D MCF-7球状体仅暴露于US处理，或先前仅暴露于MB或PTX/Dox，并且然后暴露于US时，观察到细胞活力的统计学上显著的降低(p<0.05)。然而，与仅用PTX-MB-Dox/PTX-MB-Dox处理的球状体(p<0.001)相比和用游离药物即PTX/Dox处理，并且然后暴露于US的球状体(p<0.01)相比，当MCF-7 3D球状体用PTX-MB-Dox/PTX-MB-Dox的组合处理并且然后暴露于US时，观察到细胞活力的降低增加(p<0.001)。
P.I.染色实验的结果显示出与MTT测定中观察到的趋势略有不同。P.I.是一种DNA选择性渗透染料，其自由穿过死亡细胞的受损质膜，但不渗透活细胞的膜。与处理后分析球状体的单细胞悬液的MTT测定实验相反，在P.I染色后检查完整的球状体。记录每个治疗组的明视场和荧光图像，其中荧光强度量化并绘制在图18中。对于用O2MB-PTX-Dox/O2MB-PTX-RB+US组处理的球状体观察到亮红色P.I.荧光，其强度明显高于任何其他组。令人惊讶地并且与MTT测定的结果相反，在没有US的情况下，O2MB-PTX-Dox/O2MB-PTX-RB组的P.I.荧光强度明显高于PTX/Dox+US组。同样值得注意的是，用O2MB-PTX-Dox/O2MB-PTX-RB+US处理的球状体的平均体积明显小于任何其他组，包括在没有US的情况下用O2MB-PTX-Dox/O2MB-PTX-RB处理的那些球状体。综合起来，对于用MB介导的化学-声动力学疗法治疗的球状体观察到的强烈的P.I.荧光和尺寸减小，以及从MTT分析测定观察到的细胞活力的降低，突出了这种方法在这种特定乳腺癌模型中的有效性。
5.7使用O2MB-PTX-D0X/02MB-PTX-RB±超声进行体内化学-声动力学治疗的细胞毒性：
在受体小鼠中建立皮下MCF-7肿瘤，并通过IV注射施用O2MB-PTX-Dox/O2MB-PTX-RB制剂的混合悬浮液。在注射过程中，超声被定位在肿瘤处以破坏MB，在适当的情况下释放有效负载并激活SDT。为了充分评估MB递送治疗的有效性，还用游离PTX/Dox的组合(即没有MB附着)处理动物组。
根据1986年英国动物(科学程序)法，本研究中采用的所有动物都根据许可程序进行处理。将在100μL基质胶中的Mia PaCa-2细胞(5x106)皮下植入SCID(CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)小鼠的后背部中。肿瘤在细胞植入后大约1-2周开始形成。一旦肿瘤变得可察觉的，则使用游标卡尺测量尺寸。使用等式肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2计算肿瘤体积。一旦肿瘤达到大约65mm3±4.20，则将动物分组并开始治疗。第1组无治疗，第2组通过IV递送的O2MB-PTX/PvB和O2MB-PTX/Dox的混合悬浮液(50μL)，同时在注射过程中将US应用于肿瘤。第3组接受了与第2组相同的MB治疗，但没有US。第4组接受通过IV递送的O2MB-PTX/Dox，同时在注射过程中将US应用于肿瘤，并且第5组接受含有游离PTX和Dox的cremaphor溶液。在注射过程中和之后使用Sonidel SP100声孔器(3.5Wcm-2，1MHz，30％占空比，和PRF＝100Hz；PNP＝0.48MPa；MI＝0.48)递送超声波(总共3.5分钟)，同时在注射后30分钟进行第二次3.5分钟超声暴露。每周进行一次治疗、肿瘤测量和体重记录。
肿瘤生长延迟图如图19所示，并且显示用PTX-MB-Dox/PTX-MB-RB+US治疗的动物的肿瘤体积显著减少，其中初始治疗后25天，当与治疗前大小相比时，肿瘤小6.96％。相比之下，在没有超声波的情况下，用相同PTX-MB-Dox/PTX-MB-RB制剂治疗的动物的肿瘤在同一时期内增长了43.15％。这些结果表明，超声靶向微泡破坏(UTMD)能够使更大比例的药物定位在肿瘤中，从而产生显著改善的治疗效果。事实上，PTX-MB-Dox/PTX-MB-RB+US的效果也明显好于使用游离PTX/Dox组合治疗后观察到的效果(其在第25天增加了24.77％)，尽管接受的PTX和Dox的剂量分别增加了16.8％和98.4％。
综合起来，这些结果证实了体外疗效结果，并强调了MB递送的化学-声动力学疗法作为乳腺癌靶向治疗的有效性。除了通过这种方法提供的改进的功效之外，这种治疗对MB治疗组动物的体重也具有良好的耐受性，其中MB治疗组动物的体重与未治疗动物的体重非常接近。相比之下，在实验过程中，用游离PTX/Dox治疗的动物体重下降了12.1％。体重的这种减轻很可能是由于递送PTX所需的游离药物或聚氧乙烯蓖麻油媒介物所表现出的毒性。已知聚氧乙烯蓖麻油会产生不期望的副作用，并且虽然耐受性差，但对于疏水PTX在水性溶液中的分散是必需的。因此，通过在MB壳内掺入PTX来避免这种有毒媒介物的必要性的能力是一个额外优势。
实施例7-生物素-阿霉素-孟加拉玫瑰红缀合物的制备
根据方案4合成了三足生物素-阿霉素-孟加拉玫瑰红缀合物(生物素-Dox-RB)：
Figure BDA0002379596590000411
方案4：制备生物素-Dox-RB的合成方案
7.1N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(3)的合成：
向生物素-NHS(0.5g，1.5mmol)和TEA(催化量)在无水DMF(10mL)中的搅拌溶液中，加入三(2-氨基乙基)胺(0.22g，1.5mmol)在5mL DMF中的溶液。在氩气气氛下在0℃下搅拌反应混合物。在搅拌2小时后，加入另一体积的TEA(催化量)，并且使反应混合物在室温下搅拌过夜。在反应完成后(通过TLC)，在减压下除去过量的DMF，保持温度低于45℃，并且将如此获得的白色胶状液体倒入过量的二乙醚(200mL)中并过滤。通过碱性(TEA)硅胶上的柱色谱法(MeOH:DCM 1:9至3:7)纯化粗产物，以得到为白色半固体的3(0.33g，61％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.94(brs,1H,NH),6.42(brs,1H,NH),6.35(brs,1H,NH),4.49(brs,4H,NH2X 2),4.29(s,1H,CH),4.12(s,1H,CH),3.07-3.02(m,6H,CH2X 3),2.88-2.82(m,1H,CH),2.44-2.06(m,10H,CH2X 5),1.59-1.48(m,4H,CH2X 2),1.47-1.29(m,2H,CH2)。ESI-MS：针对C16H32N6O2S计算，372.23；实测值373.31(M+H)。
7.2双(2,5-二氧吡咯烷-l-基)8,8'-((((2-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)氮杂二基)双(乙烷-2,l-二基))双(氮杂二基))双(8-氧代辛酸酯)(5)的合成：
在TEA(催化量)存在下，将化合物3(0.5g，1.3mmol)溶解在10mL无水DMF中，并向其中加入双(2,5-二氧吡咯烷-l-基)辛二酸酯(4，1g，2.7mmol)。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物24小时。在反应完成后(通过TLC)，向反应混合物中加入过量的二乙醚(200mL)。过滤如此获得的白色沉淀并用冷二乙醚(50mL X 3)洗涤三次。通过碱性(TEA)硅胶上的柱色谱法(MeOH:CHCl3 2:8至5:5v/v)纯化粗产物，以得到为低熔点白色固体的5(0.83g，71％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.94(brs,2H,NH X 2),7.67(brs,1H,NH),6.41(brs,1H,NH),6.34(brs,1H,NH),4.29(s,1H,CH),4.12(s,1H,CH),3.06-3.04(m,3H,CH和CH2),2.88-2.72(m,6H,CH2X 3),2.71-2.63(m,8H,CH2X 4),2.45-2.34(m,6H,CH2X 3),2.20-2.06(m,10H,CH2X 5),1.60-1.21(m,22H,CH2X 11)。13C NMR(DMSO-d6)：172.5(C＝O),170.7(C＝O),163.1(C＝O),162.7(C＝O),61.4(CH),59.6(CH),55.8(CH2),53.9(NCH2),39.9(CH2),39.8(CH2),39.6(CH2),37.3(CH2),36.2(CH2),35.6(CH2),31.2(CH2),28.7(CH2),28.5(CH2),25.8(CH2),25.7(CH2),25.6(CH2)。ESI-MS：针对C40H62N8O12S计算，878.4；实测值901.3(M+Na盐)。
7.3 26-(((2S,3S,4S,6R)-3-羟基-2-甲基--6-(((1S,3S)-3,5,12-三羟基-3-(2-羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,1l-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢四烯-1-基)氧基)四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4,11,19,26-四氧代-15-(2-(5-(2-四氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)-3,12,15,18-四氮杂二十六烷基2,3,4,5-四氯-6-(6-羟基-2,4,5,7-四碘-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(9)的合成：
在0℃下向DMF(无水，10mL)溶液中加入5(0.4g，0.45mmol)阿霉素-盐酸盐(8，0.26g，0.45mmol)和TEA(0.5mL)，并在氩气气氛下在室温下搅拌24小时。在反应完成后(通过GC-MS监测)，将孟加拉玫瑰红胺7(根据文献程序单独制备)，0.46g、0.45mmol，在DMF(5mL)中)和TEA(0.5mL)加入到反应混合物中，并继续搅拌24小时。通过粗反应混合物的GC-MS分析来监测反应的进展。在反应完成后，向溶液中加入过量的二乙醚(200mL)，并搅拌30分钟。过滤如此获得的暗红色沉淀，并分别用冷二乙醚(100mL)、乙酸乙酯(100mL)、丙酮-水混合物(10％，v/v，100mL)洗涤几次，并且最后用乙酸乙酯-己烷混合物(50％，v/v，100ml)洗涤，以得到化合物9的红色粉末(0.28g，28％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：7.93(s,2H,Ar-CH),7.90-7.85(m,2H,Ar-CH),7.66(brs,5H,NH),7.45(s,1H,6.39(brs,1H,NH),6.33(brs,1H,NH),5.41-5.39(m,1H,CH),5.19-5.18(m,4H,-CH2X 2),4.93-4.71(m,3H,CH X 3),4.55(s,3H,-OCH3),4.27-3.90(m,4H,CH X 4),3.04-2.97(m,8H,CH2X 4),2.80-2.77(m,2H,CH2),2.48-2.43(m,8H,CH2X 4),2.03(brs,12H,CH2X 6),1.43(brs,12H,CH2X 6),1.14-1.11(m,13H,CH2X 5,CH3X 1)。
13C NMR(DMSO-d6)：220.1,177.3,172.5,172.2,171.5,168.9,163.2,162.7,157.3,156.6,154.6,153.7,150.3,138.5,136.5,135.6,133.0,110.7,101.9,97.6,96.3,89.2,79.3,76.7,66.8,63.5,61.4,60.5,59.6,57.5,55.8,53.9,51.9,40.4,40.2,37.4,36.5,36.2,35.6,31.2,28.7,28.4,28.3,25.7。
ESI-MS：针对C81H90针对Cl4I4N8O22S计算，2209.12；实测值2208.02(M-H)。
实施例8-生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红缀合物的可替代合成方法
根据方案5合成了生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红(生物素-Gem-RB)缀合物：
Figure BDA0002379596590000441
方案5：制备生物素-Gem-RB的合成方案
8.1N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(3)的合成：
根据实施例1所述的程序合成化合物3。
8.2 7-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)羰基)氧基)庚酸(6)的合成：
在0℃下向DCM(10mL)溶液中加入4(1g，4.6mmol)、4-硝基苯氯甲酸酯(2.79g，13.8mmol)、DIPEA(2.38g，18.4mmol)和催化量的吡啶，并在室温下搅拌5小时。然后在真空下浓缩反应混合物。将粗残余物溶解在DMF(10mL)中。向此溶液中加入在DMF(5mL)和TEA(2mL)中的GMC盐酸盐(4.1g，13.8mmol)，并继续搅拌24小时。通过粗反应混合物的GC-MS分析来监测反应的进展。在反应完成后，向反应混合物中加入过量的二乙醚(200mL)。使用MeOH/CHCl3(5％，v/v)作为洗脱剂，通过快速色谱法分离和纯化如此获得的黄色油。化合物6被分离为粘稠的黄色液体。(1.5g，产率＝64.3％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ10.5(brs,1H,-COOH),7.63(d,J＝7.5Hz,1H,-CH),7.41(brs,2H,-NH2),6.20(d,J＝7.5Hz,1H,-CH),5.18(brs,1H,-CH),3.71-3.55(m,5H,-CH2X2,-CHX1),2.36(brs,2H,-CH2),1.23-1.17(m,18H,-CH2X 9)。
13C NMR(DMSO-d6)：172.1,166.0,155.1,154.9,153.6,123.5,95.2,95.0,80.8,69.1,68.8,33.6,29.4,29.3,29.2,28.9,28.8,25.5,25.4。
ESI-MS：针对C22H33F2N3O8计算，504.2；实测值527.0(M+Na盐)。
8.3 1-((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3,16,24-三氧代-20-(2-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙基)-2,4-二氧杂-17,20,23-三氮杂三十一碳烷-31-基-2,3,4,5-四氯-6-(6-羟基-2,4,5,7-四碘-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(9)的合成：
向酸6(0.34g，0.6mmol)、化合物3(0.25g，0.6mmol)和HOBt(0.27g，2.0mmol)在无水DMF(50mL)中的溶液中加入EDCl、HCl(0.4g，2.0mmol)和DIPEA(0.45g，3.5mmol)，并在室温在氮气下搅拌24小时。通过粗反应混合物的GC-MS分析来监测反应的进展。在反应完成后，向反应混合物中加入在5mL DMF中的RB-辛酸8(根据文献程序制备，0.8g，0.7mmol)，随后加入催化量的DIPEA，并在室温下继续搅拌24小时。在反应完成后，向反应混合物中加入过量的二乙醚(200mL)，并搅拌30分钟。过滤如此获得的粉红色沉淀，并分别用冷二乙醚(100mL)、乙酸乙酯(100mL)、丙酮-水混合物(10％，v/v，100mL)洗涤几次，并且最后用乙酸乙酯-己烷混合物(50％，v/v，100ml)洗涤，以得到化合物9的粉红色粉末(0.63g，45％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.86(s,2H,Ar-CH),7.73(d,J＝7.0Hz,1H,CH),7.39(brs,3H,NH X 3),6.40-6.34(m,2H,NH X2),6.03(s,1H,CH),5.72(d,J＝7.0Hz,1H,CH),4.22(s,1H,CH),4.05(brs,3H,CH2,CH X2),3.86(brs,1H,OH),3.81-3.50(m,6H,CH X 2,CH2X 2),3.02-2.86(m,8H,CH2X 4),2.80-2.00(m,12H,CH2X 6),1.52-0.81(m,32H,CH2X 16)。
13C NMR(DMSO-d6)：172.6,171.6,169.9,168.9,166.0,163.2,162.7,155.1,141.5,141.1,123.5,98.9,96.4,95.0,83.9,80.8,70.2,69.1,68.9,68.7,61.4,59.6,59.2,54.2,54.0,48.9,46.0,38.0,37.3,36.1,35.5,31.1,28.9,28.6,28.3,25.7。
ESI-MS：针对C66H79针对Cl4F2I4N9O15S计算，1955.03；实测值1956.5(M+H)。

Claims (42)

1.一种微泡复合物，其包含附着到一个或多个连接基团或以另外的方式与一个或多个连接基团相关联的微泡，每个连接基团与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂结合。
2.如权利要求1所述的复合物，其中结合到任何给定连接基团的所述声敏剂和化疗剂不是相同的化学实体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的复合物，其中每个连接基团通过非共价键、例如通过生物素-亲和素相互作用结合到所述微泡或以另外的方式与所述微泡相关联。
4.如权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中每个连接基团通过共价键与所述声敏剂以及与所述化疗剂结合。
5.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中每个连接基团包含有机基团，所述有机基团包含至多约200个原子、例如至多约100个原子的链。
6.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中每个连接基团包含直链或支链(优选支链)C30-50亚烷基链(优选C30-40亚烷基链)，所述亚烷基链任选地被一个或多个选自C1-3烷基、-O(C1-3)烷基和-OR'(其中R'是H或C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基)的基团取代；并且其中所述亚烷基链的一个或多个(优选至多10个，例如4-9个，或6-8个)-CH2-基团可以被独立地选自-O-、-CO-、-C(O)O-、-NR”-和-NR”CO-(其中每个R”独立地是H或C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基)的基团替换。
7.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中每个连接基团包含生物素或生物素残基(例如，被其末端取代)。
8.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中每个连接基团是分支的。
9.如权利要求8所述的复合物，其中每个连接基团具有三个分支。
10.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000011
其中：
L1、L2和L3各自独立地是-(CH2)q-，其中q是1至4的整数，优选2；
每个R独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
n是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
p是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
X是能够结合到微泡或“官能化”微泡的官能团；优选地其中X是能够结合亲和素官能化微泡的生物素或生物素残基；
*表示所述连接基团与声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示所述连接基团与化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
11.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000021
其中：X、*和**如权利要求10中所定义。
12.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000022
其中：
L4、L5和L6各自独立地是-(CH2)t-，其中t是1至4的整数，优选2；
每个R'独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
r是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6；
s是2至10的整数，优选4至8，更优选5至7，例如6或7；
X'是能够结合到微泡或“官能化”微泡的官能团；优选地其中X'是能够结合亲和素官能化微泡的生物素或生物素残基；
*表示所述连接基团与声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示所述连接基团与化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
13.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000031
其中：
X'、*和**如权利要求12中所定义。
14.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000041
其中：
L7、L8和L9各自独立地是-(CH2)u-，其中u是1至4的整数，优选2；
每个R”独立地是H或C1-6烷基(优选C1-3烷基，例如CH3)，优选H；
X”是能够结合到微泡或“官能化”微泡的官能团；优选地其中X”是能够结合亲和素官能化微泡的生物素或生物素残基；
*表示所述连接基团与声敏剂、“官能化”声敏剂或声敏剂残基的附着点；并且
**表示所述连接基团与化疗剂、“官能化”化疗剂或化疗剂残基的附着点。
15.如权利要求9所述的复合物，其中每个连接基团具有以下结构：
Figure FDA0002379596580000042
其中：
X”、*和**如权利要求14中所定义。
16.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述化疗剂选自以下：抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤)；5-氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶或5-FU)；胞苷类似物(例如吉西他滨)；嘌呤抗代谢物(例如巯基嘌呤)；烷化剂(例如环磷酰胺)；非经典烷化剂(例如达卡巴嗪)；铂类似物(例如顺铂)；抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、博莱霉素、丝裂霉素C)；生物还原药物(例如丝裂霉素C、巴诺蒽醌(AQ4N))；蒽环类药物(例如阿霉素、米托蒽醌)；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷)；抗微管剂，诸如长春花生物碱(例如长春新碱)、紫杉醇类(例如紫杉醇)和埃博霉素(例如伊沙匹隆)；抗雌激素(例如他莫昔芬)；抗雄激素(例如比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮)；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、福美斯坦)；抗血管生成或缺氧靶向药物(天然存在的，如内皮抑素，或合成的，如吉非替尼、来那度胺)；抗血管剂(例如康普立停)；酪氨酸激酶抑制剂(例如吉非替尼、埃罗替尼、凡德他尼、舒尼替尼)；癌基因或信号通路靶向剂(例如替吡法尼、洛那法尼、纳曲吲哚、雷帕霉素)；靶向应激蛋白的试剂(例如格尔德霉素及其类似物)；自噬靶向剂(例如氯喹)；蛋白酶体靶向剂(例如硼替佐米)；端粒酶抑制剂(靶向寡核苷酸或核苷酸)；组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如曲古抑菌素A、丙戊酸)；DNA甲基转移酶抑制剂(例如地西他滨)；烷基磺酸盐(例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡)；氮丙啶(例如苯并多巴、卡波醌、甲多巴和尿多巴)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(例如六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺)；氮芥(例如苯丁酸氮芥、氯萘醌、氯膦酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、诺维比辛、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶氮芥)；亚硝基脲(例如卡莫司汀、氯唑霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀)；嘌呤类似物(例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷)；雄激素类(例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯)；抗肾上腺素类(例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦)；和免疫检查点抑制剂；以及任何这些化合物的药学上可接受的盐、衍生物或类似物。
17.如权利要求16所述的复合物，其中所述化疗剂是抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶或吉西他滨。
18.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述微泡包含其中掺入了一种或多种附加化疗剂的壳。
19.如权利要求18所述的复合物，其中所述一种或多种附加化疗剂如权利要求16或权利要求17所定义，优选地其中所述附加化疗剂是疏水性的。
20.如权利要求18所述的复合物，其中所述附加化疗剂是抗微管剂，例如紫杉醇类，诸如紫杉醇。
21.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述微泡包括保持气体、优选全氟化碳或氧气的壳。
22.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其包括直径在0.1至100μm范围内的微泡。
23.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述微泡具有包含一种或多种磷脂的壳，每种磷脂任选地连接到一种或多种聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。
24.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述微泡被生物素化，并且任选地被进一步亲和素官能化。
25.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述声敏剂选自吩噻嗪染料(例如亚甲蓝、甲苯胺蓝)、孟加拉玫瑰红、卟啉(例如
Figure FDA0002379596580000061
)、氯、苯并氯、酞菁、萘酞菁、类卟吩、花青和花青类似物(例如部花青540和吲哚菁绿)、偶氮二焦酚次甲基(例如BODIPY及其卤代衍生物)、吖啶染料、红紫素、脱镁叶绿酸、verdins、补骨脂素、血卟啉、原卟啉和姜黄素。
26.如权利要求25所述的复合物，其中所述声敏剂是孟加拉玫瑰红、亚甲蓝、吲哚菁绿或其类似物，优选孟加拉玫瑰红。
27.如前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述微泡连接到一个或多个选自以下的结构：如方案2中所示的式(9)(生物素-Gem-RB)、如方案4中所示的式(9)(生物素-Dox-RB)、和如方案5中所示的式(9)(生物素-Gem-RB)。
28.一种药物组合物，其包含如权利要求1至27中任一项所述的复合物，以及至少一种药物载体或赋形剂。
29.如权利要求1至27中任一项所述的复合物或如权利要求28所述的组合物，其用于疗法中或用作药剂。
30.如权利要求1至27中任一项所述的复合物或如权利要求28所述的组合物，其用于声动力治疗方法中。
31.用于如权利要求30所要求的用途的复合物或组合物，其中所述复合物或组合物同时或顺序地与患者的细胞或组织接触，所述细胞或组织经受超声波和/或光的辐射。
32.如权利要求30或权利要求31所述的复合物或组合物，其使用于癌症的治疗和/或诊断，优选地使用于深部肿瘤的治疗和/或诊断。
33.如权利要求32所述使用的复合物或组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组中：肉瘤，包括成骨肉瘤和软组织肉瘤；癌，例如头颈癌、乳腺癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝脏癌、子宫癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；神经母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肾母细胞瘤；白血病，包括急性淋巴细胞白血病和急性成髓细胞白血病；星形细胞瘤、胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
34.如权利要求33所述使用的复合物或组合物，其中所述癌症是胰腺癌。
35.一种试剂盒，其包括：(i)如权利要求1至27中任一项所述的微泡复合物或如权利要求28所述的组合物；和(ii)在声动力学治疗和/或诊断成像方法中使用(i)的说明。
36.如权利要求1至27中任一项所述的微泡复合物在制造用于声动力学治疗和/或诊断成像方法中的药剂中的用途。
37.一种声动力学治疗方法，其中将如权利要求1至27中任一项所述的微泡复合物或如权利要求28所述的组合物施用到患者的受影响细胞或组织，并且使所述细胞或组织经受超声波辐射和/或光。
38.制备如权利要求1至27中任一项所述的微泡复合物的方法，所述方法包括将微泡或适当官能化的微泡连接到一个或多个连接基团的步骤，每个连接基团与至少一种声敏剂和至少一种化疗剂结合。
39.一种吉西他滨-生物素缀合物，例如具有方案1中结构(4)的缀合物。
40.一种生物素-吉西他滨-孟加拉玫瑰红缀合物，例如具有方案2中结构(9)或方案5中结构(9)的缀合物。
41.一种生物素-阿霉素缀合物，例如具有方案3中结构(3)的缀合物。
42.一种生物素-阿霉素-孟加拉玫瑰红缀合物，例如具有方案4中结构(9)的缀合物。
CN201880050562.3A 2017-05-31 2018-05-31 声动力学疗法 Pending CN111372609A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1708663.8A GB201708663D0 (en) 2017-05-31 2017-05-31 Therapy
GB1708663.8 2017-05-31
PCT/GB2018/051481 WO2018220376A1 (en) 2017-05-31 2018-05-31 Sonodynamic therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111372609A true CN111372609A (zh) 2020-07-03

Family

ID=59271054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880050562.3A Pending CN111372609A (zh) 2017-05-31 2018-05-31 声动力学疗法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11878059B2 (zh)
EP (1) EP3630186A1 (zh)
CN (1) CN111372609A (zh)
GB (1) GB201708663D0 (zh)
WO (1) WO2018220376A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114588268A (zh) * 2022-03-25 2022-06-07 清华大学 提高激活sting通路和抗肿瘤t细胞应答的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019217413A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 Mtm Research, Llc Photodynamic compositions and methods of use
GB201819853D0 (en) * 2018-12-05 2019-01-23 Innovation Ulster Ltd Therapy
GB201908352D0 (en) 2019-06-11 2019-07-24 Innovation Ulster Ltd Sonodynamic therapy
CN110183504B (zh) * 2019-06-13 2023-07-07 湖南大学 一种具有肿瘤靶向性的吉西他滨前体药物及其制备方法和用途
CN110522992B (zh) * 2019-07-22 2021-02-19 西安交通大学 基于空间非均匀聚焦涡旋声场的相变纳米液滴调控方法
CN111346226A (zh) * 2020-03-12 2020-06-30 徐州医科大学附属医院 一种自产氧纳米粒及其介导肿瘤光动力治疗的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012143739A1 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 University Of Ulster Sonodynamic therapy
CN106267225A (zh) * 2015-05-29 2017-01-04 上海新理念生物医药科技有限公司 三马来酰亚胺型连接子及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9710049D0 (en) * 1997-05-19 1997-07-09 Nycomed Imaging As Method
WO2007038172A2 (en) * 2005-09-23 2007-04-05 Nitto Denko Corporation Guanidinium carriers
CN102294035B (zh) 2011-08-25 2013-03-27 南京大学 一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法
WO2013109907A1 (en) 2012-01-18 2013-07-25 University Of Kansas Drug and imaging agent delivery compositions and methods
WO2015089154A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 The Regents Of The University Of California Regionally activated drug delivery nanoparticles
KR101595795B1 (ko) * 2014-03-19 2016-02-22 (주)아이엠지티 약물을 함유한 나노입자가 결합된 이중-목적 paｔ／초음파 조영제 및 이의 제조방법
WO2017019520A1 (en) * 2015-07-24 2017-02-02 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods of cerenkov targeted and activated imaging and therapeutics
GB201520649D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Univ Ulster Sonodynamic therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012143739A1 (en) * 2011-04-21 2012-10-26 University Of Ulster Sonodynamic therapy
CN106267225A (zh) * 2015-05-29 2017-01-04 上海新理念生物医药科技有限公司 三马来酰亚胺型连接子及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRIGITTE ALLART等: "A Stable Bis-Allyloxycarbonyl Biotin Aldehyde Derivative for Biotinylation via Reductive Alkylation: Application to the Synthesis of a Biotinylated Doxorubicin Derivative", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
CONOR MCEWAN等: "Combined sonodynamic and antimetabolite therapy for the improved treatment of pancreatic cancer using oxygen loaded microbubbles as a delivery vehicle", 《BIOMATERIALS》 *
CONOR MCEWAN等: "Oxygen carrying microbubbles for enhanced sonodynamic therapy of hypoxic tumours", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
SRINAVYA VUTUKURU等: "An Affinity-Based Strategy for the Design of Selective Displacers for the Chromatographic Separation of Proteins", 《LANGMUIR》 *
SUKHENDU MAITI等: "Gemcitabine–coumarin–biotin conjugates_ a target specific theranostic anticancer prodrug", 《J. AM. CHEM. SOC.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114588268A (zh) * 2022-03-25 2022-06-07 清华大学 提高激活sting通路和抗肿瘤t细胞应答的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11878059B2 (en) 2024-01-23
US20200114003A1 (en) 2020-04-16
GB201708663D0 (en) 2017-07-12
EP3630186A1 (en) 2020-04-08
WO2018220376A1 (en) 2018-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108601835B (zh) 用于声动力疗法的微泡-化学治疗剂复合物
US11878059B2 (en) Sonodynamic therapy
Locatelli et al. Surface modifications of gold nanorods for applications in nanomedicine
WO2012143739A1 (en) Sonodynamic therapy
US20220062417A1 (en) Therapy
KR101188979B1 (ko) 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법
US20220233713A1 (en) Sonodynamic therapy
WO2001026704A2 (en) Targeted drug activation
WO2021005337A1 (en) Sonodynamic therapy
WO2017062875A1 (en) Compositions and methods for on-demand high-efficiency triggerable anesthesia
WO2013144369A1 (fr) Materiau, son procede de preparation et ses utilisations
KR20130127232A (ko) 광역학치료용 광민감제로서 플러렌과 글리콜키토산의 접합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 광역학치료방법
US20210346518A1 (en) Cyanine-based telodendrimers and uses for treating cancer
JP5808107B2 (ja) 細胞特異的能動集積性を有する光線力学療法剤
KR102358116B1 (ko) 기체 발포형 마이셀 및 이의 제조방법
RU2791572C1 (ru) Сонодинамическая терапия
US20230165972A1 (en) Cancer therapy with microbubbles
Luan A Cancer-targeting Liposomal Delivery System for Photodynamic Diagnosis and Therapy of Cancers in Peritoneal Cavity
JP2024534479A (ja) 非晶質光増感性粒子、その調製方法、及びその使用方法
CN118555971A (zh) 无定形光敏粒子、其制备方法及其使用方法
Khan Alternative therapeutic options for cutaneous melanoma using nanoparticles for enhanced delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200703