EP3700555A1 - Particules pseudo-virales utiles pour traiter des maladies auto-immunes - Google Patents

Particules pseudo-virales utiles pour traiter des maladies auto-immunes

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EP3700555A1
EP3700555A1 EP18804370.7A EP18804370A EP3700555A1 EP 3700555 A1 EP3700555 A1 EP 3700555A1 EP 18804370 A EP18804370 A EP 18804370A EP 3700555 A1 EP3700555 A1 EP 3700555A1
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EP
European Patent Office
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particle
cells
pseudoviral
autoimmune
plasmid
Prior art date
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Pending
Application number
EP18804370.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Bertrand Bellier
David Klatzmann
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
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Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Sorbonne Universite filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to compositions comprising pseudo viral particles useful for modifying, regulating or suppressing an immune response, more particularly for treating an immune dysfunction such as an autoimmune disease. Methods for producing said compositions are described.
  • This invention can be used in mammals, particularly in humans but also in other vertebrates.
  • Autoimmune diseases result from a dysfunction of the immune system that attacks the normal constituents of the body (auto-antigen).
  • Pseudoviral particles also known as virus-like particles (VLPs) are used for anti-infectious or anti-tumor vaccination.
  • VLPs virus-like particles
  • Pseudoviral particles have the advantage of being easily modulated and can be used as an antigenic platform.
  • the targeted antigens can thus be conveyed inside or on the surface of the pseudo-viral particles, favoring the triggering specific humoral and cellular immune responses, but also to mask the antigens of the neutralizing or reactive factors (antibodies) when they are inside.
  • antibodies neutralizing or reactive factors
  • the great flexibility of this antigenic platform allows the vectorization of immunoregulatory molecules, at the origin of the induction of tolerance.
  • the pseudoviral particles block the activation of antigen-presenting cells and the activation of T cells and can therefore be used to modulate immune responses, or even induce a specific immune tolerance.
  • the pseudoviral particles make it possible to render the organism tolerant to antigens vectorized by these so-called tolerogenic pseudoviral particles.
  • a first subject of the invention is a pseudoviral particle comprising one or more antigen (s) and an immunoregulatory molecule exposed on the surface of the particle.
  • the pseudoviral particle according to the invention is particularly used in the treatment of an immune dysfunction, preferably an autoimmune disease such as multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, an autoimmune thyroid, the disease Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease (autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • an immune dysfunction preferably an autoimmune disease such as multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, an autoimmune thyroid, the disease Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease (autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • an immune dysfunction preferably an autoimmune disease such as multiple
  • the pseudoviral particle is preferably in the form of a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutical excipient.
  • plasmid or set of plasmid (s) capable of producing in situ a pseudoviral particle as defined herein, in particular for use in the treatment of immune dysfunction, is used.
  • Figure 1 illustrates the structure of VLP-free VLPs without CTLA-4 (VLP), VLPs with OVA-only antigen (VLP OVA ) or CTLA-4-associated (tVLP OVA ), VLPs without antigen and expressing CTLA- 4 on its surface (tVLP-), and VLPs with OVA antigen (VLP OVA ) co-injected with soluble CTLA-4 (CTLA-4-Ig).
  • Figure 2 illustrates the constructs used to form the particles of the invention (A) and the structure of the tVLP OVA tolerant pseudoviral particle (B) where OVA is the target antigen.
  • Figure 3 illustrates the characterization and expression of therapeutic proteins in OVA tVLPs.
  • A Validation by Western blot expression of Gag and OVA in the virus-like particles VLP OVA.
  • VLP "are particles control without the OVA antigen.
  • B Validation by immunoprecipitation of the expression of CTLA-4 in the virus-like particles TVLPs.
  • C Comparison of the expression of chimeric forms of CTLA-4 (WT, TM- VSV-G, or area of GPI anchor) in the transfected cells (top) or on the surface of virus-like particles (below) by flow cytometry. the untransfected cells or VLPs "are used as a negative control (black).
  • D Validation by Western blot expression of Gag and OVA in the virus-like particles VLP OVA.
  • VLP "are particles control without the OVA antigen.
  • B Validation by immunoprecipitation of the expression of CTLA-4 in the virus-like particles TVLPs.
  • C Comparison of the expression
  • Figure 4 illustrates the uptake and effects of tVLPs on purified dendritic cells.
  • A Experimental scheme. Purified dendritic cells CD1 lc hlgh MHC jjh i gh ⁇ 6 ⁇ ⁇ ⁇ spleen sou ri s BALB / c or dendritic cells derived from bone marrow are cultured in the presence of VLPs VLP TVLPs GFP or GFP and stimulated or not with LPS. 24 hours after culture, the expression of co stimulation molecules and activation markers is analyzed by flow cytometry. B. The uptake of GFP VLPs by the purified dendritic cells is confirmed by the presence of GFP + cells after 24h culture.
  • VLPs "are used as a negative control (black).
  • C-E The expression of costimulatory molecules and activation markers was analyzed by flow cytometry on dendritic cells purified after co-culture with the environment the presence or absence of ⁇ g / ml of LPS and 5, 10 or 15 ⁇ g / ml of tVLP GFP The expression of CD80, CD86, CD40 and MHC-II is analyzed in cells expressing CD1 lc and MHC-II.
  • C. represents the cytometry profiles of CD80, CD86 in dendritic cells cultured in culture medium alone, in the presence of LPS and in the presence of LPS and tVLP GFP (15 ⁇ / ⁇ ⁇ ).
  • D. The expression of costimulatory molecules is measured using the Geometric Mean Fluorescence (MFI).
  • E. The expression modulation is represented by the ratio MFI compared to the control medium.
  • Figure 5 illustrates the effects of tVLPs on dendritic cells derived from bone marrow precursors.
  • A Illustrates the expression CD80, CD86, CD40 and MHC-II analyzed by flow cytometry on living bone marrow dendritic cells after co-culture with medium in the presence or absence of 1 g / ml of LPS and 5 mg / ml of LPS. , 10 or 15 ⁇ g / mL tVLP GFP .
  • Expression modulation of CD80, CD86, CD40 and MHC-II is represented by the gMFI ratio compared to the control medium.
  • B ELIS A quantification of IL-10 in the culture supernatant of the dendritic cells after 24 hours of culture in medium alone, in the presence of LPS or in the presence of LPS and tVLP.
  • Figure 6 illustrates the blocking of proliferation of specific antigen T cells by tVLPs.
  • Live T cells OT-II CTV + CD4 + co-cultured for 2 days with irradiated splenocytes loaded with a peptide OVA323-339 in the presence or absence of 10 ⁇ g / ml of VLP " , tVLP " , or an equivalent dose of hCTLA- 4 are analyzed by flow cytometry.
  • CTV dilution suppression indices of OT-II cells co-cultured for two or three days with splenocytes contacted with peptide OVA323-339 (C) or protein OVA (D). The results correspond to the mean ⁇ SEM (n 4) and represent 3 independent experiments.
  • Figure 7 shows the validation of the expression of MOG in TVLPs MOG and its suppressive effect on the effector cells of multiple sclerosis.
  • A Validation by Western blot of the expression of MOG and in Gag VLPs VLP MOG. VLPs "are used as control.
  • B Validation by flow cytometry of the expression of CTLA-4 in the virus-like particles TVLPs MOG. VLPs" are used as negative control.
  • C Blocking the proliferation of MOG-specific 2D2 T cells by tVLP MOG . Cytometry Profile CTV dilutions of the CD4 + T cells CTV + 2D2 after seven days in the presence of TVLP MOG and VLP "(control).
  • D T cell division kinetics in different growing conditions.
  • E Validation by Western blot of the expression of MOG and in Gag VLPs VLP MOG. VLPs "are used as control.
  • B Validation by flow cytometry of the expression of CTLA-4 in the virus-like particles TVLPs
  • Figure 9 illustrates the functional validation of IL-2 present on the surface of tVLPs.
  • IL-2 + VLPs were cultured (5 ⁇ g / ml) with IL-2-dependent CTLL-2 cells, and cell proliferation (A) and survival (B) were evaluated on After a period of 8 days, IL-2 at 25 or 50 IU / mL, or medium alone, was used in control.
  • FIG 10 shows the therapeutic effect of tVLPs on a mouse model of multiple sclerosis (mice developing experimental autoimmune encephalitis (EAE)).
  • EAE experimental autoimmune encephalitis
  • Figure 11 shows that induction of tolerance by tVLPs reduces immune infiltration of the central nervous system and increases splenic Tregs.
  • Mouses C57B1 / 6 received a daily intraperitoneal injection of tVLPs or PBS (placebo) between days 15 to 25 (in bold) after induction of ⁇ .
  • PBS placebo
  • the inventors have developed a method for treating immune dysfunction of a subject, such as autoimmune diseases, comprising administering pseudoviral particles containing an antigen and an immunoregulatory molecule.
  • This pseudoviral particle advantageously contains an immunoregulatory molecule, exposed on its surface.
  • the present invention thus relates to a pseudoviral particle comprising an antigen and an immunoregulatory molecule exposed on the surface of the particle, which makes it possible to promote the specific tolerance of the antigen.
  • the immunoregulatory molecule is preferably a molecule that exerts regulatory and / or suppressive functions on antigen presenting cells, promoting recruitment of regulatory T cells.
  • the immunoregulatory molecule may be an immune checkpoint receptor ("immune-checkpoint receptor"), more particularly a peptide sequence comprising the extracellular domain, more particularly the immunoglobulin-like domain (also called Ig-like domain ") of an immune control point receptor, preferably selected from the group consisting of: CTLA-4 (for" Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 "), OX40 (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4)), PD1 (Programmed Cell Death 1), Tim3 (also known as HAVCR2), LAG-3 and TIGIT (also known as IVSTM3).
  • Immune-checkpoint receptor for a Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 "
  • OX40 Tuor necrosis factor receptor superfamily, member 4
  • PD1 Programmed Cell Death 1
  • Tim3 also known as HAVCR2
  • LAG-3 and TIGIT also known as IVSTM3
  • the immunoregulatory molecule may also be a cytokine, preferably selected from the group consisting of: IL-2 (Interleukin 2), IL-10 (Interleukin 10) and TGF-beta.
  • the immunoregulatory molecule is preferably fused to the transmembrane domain and / or anchoring a protein, preferably a glycoprotein.
  • the immunoregulatory molecule is linked to the transmembrane domain of an envelope protein or a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring system to be exposed on the surface of the particle.
  • the cytokine which is preferably interleukin-2, may be human or other animal species, it may be wild-type or mutant. In particular, it may be a modified human IL-2 des-alanyl-1, serine-125.
  • Adjuvant molecules can be associated with the ability to direct immune responses to a desired cytokine profile.
  • a molecule capable of activating Toll Like Receptor (TLR) such as viral RNA, preferably non-coding RNA, can be combined to enhance Th1 responses (Pitois et al., J. Virol, 2017). Oct. 13; 91 (21)) and thus fight against Th2 responses that may sometimes be associated with autoimmune pathological mechanisms, such as in autoimmune pancreatitis (Pakala et al., J. Exp Med., 1997, 186 (2): 299-306).
  • the particles according to the invention can also be associated with molecules or adjuvants (of alum type) capable of initiating mechanisms causing Th2-type responses.
  • the pseudoviral particle is preferably a synthetic retroviral particle.
  • the pseudoviral particle comprises a retroviral capsid protein and / or a retroviral envelope protein.
  • the present invention more particularly relates to the pseudoviral particles defined herein for use in the treatment of immune dysfunction.
  • the pseudoviral particles according to the invention are used for the treatment of autoimmune diseases.
  • the pseudoviral particle of said invention comprises an antigen which is a self antigen also called autoantigen for use in the treatment of an autoimmune disease, preferably multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, an autoimmune thyroid, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease (autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • an autoimmune disease preferably multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, an autoimmune thyroid, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease (autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • the present invention also relates to a plasmid (s) capable of producing in vitro but also in situ pseudoviral particles.
  • a plasmid (s) capable of producing in vitro but also in situ pseudoviral particles.
  • one or more plasmids encoding a capsid protein and / or an envelope protein constituting the pseudoviral particle are used.
  • the present invention relates more particularly to said plasmids for use in the treatment of immune dysfunction.
  • the pseudoviral particle or the plasmid (s) capable (s) of producing in situ a pseudo viral particle can be administered to the subject preferably mucosally, for example orally, sublingually, intranasally, or subcutaneously or intravenous.
  • the present invention uses a pharmaceutical composition comprising the pseudoviral particle or plasmid (s) capable (s) of producing in situ pseudoviral particles.
  • This composition may also comprise a pharmaceutical excipient.
  • the pharmaceutical composition may comprise several pseudoviral particles or several plasmid (s) capable of producing in situ pseudoviral particles comprising different antigens and / or different immunoregulatory molecules.
  • Also described here is a method for preparing pseudoviral particles or plasmids capable of producing in situ the pseudo viral particles.
  • antigen refers to a molecule such as a protein, a polypeptide, a peptide, a lipid, a nucleic acid, a polysaccharide, an epitope capable of being recognized by an antibody or cells of the immune system.
  • the antigen is able to trigger an immune response.
  • the immune response can lead to antibody production and / or activation of system cells immune.
  • the antigen is a protein, a polypeptide, a heterologous peptide of the pseudoviral particle, more particularly a protein, a polypeptide or a non-viral peptide.
  • the antigen is a heterologous molecule vis-a-vis the virus forming the particle.
  • the antigen is a self antigen also called autoantigen.
  • autoantigen is meant here an antigen of the patient, targeted by an autoimmune response during a breach of tolerance.
  • the term also includes epitope fragments of complete proteins.
  • autoimmune disease is caused by an inappropriate response of the immune system to molecules or a combination of molecules that are normally present in the body. These molecules are then called autoantigens.
  • autoimmune diseases include multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, autoimmune thyroids, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease ( Autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • allergic reactions or allergic symptoms are not included in the definition of autoimmune diseases referred to here.
  • the term “treat” means to suppress the symptoms, to eliminate the causes of the symptoms transiently or permanently but also to prevent or slow the appearance of symptoms of the immune dysfunction.
  • subject means any human persons or non-human animals that are likely to be treated by the composition of the present invention.
  • subject means any human persons or non-human animals that are likely to be treated by the composition of the present invention.
  • subjects who may experience immune dysfunction those who have already been subject to immune dysfunction, who have predispositions to immune dysfunction, or who have evidence of immune dysfunction.
  • the term “effective amount” refers to an amount of pseudoviral particles according to the invention necessary or sufficient to, without causing significant and adverse side effects for subject, delaying or stopping the onset of immune dysfunction, making improvements, reducing the severity or incidence of immune dysfunction, or stopping or treating immune dysfunction.
  • An effective amount may be administered prior to the occurrence of immune dysfunction, for prophylactic or preventive action. Alternatively or additionally, an effective amount can be administered after the onset of immune dysfunction for therapeutic action.
  • an “excipient” designates, in the present invention, any substance other than the active ingredient present in a composition conferring upon it stability, shape (liquid, solid, capsule, etc., depending on the mode of administration), taste, dissolution (e.g., targeted dissolution in the stomach or digestive tract), color, etc.
  • a “pharmaceutically acceptable excipient” refers more specifically to an excipient which does not induce an undesired reaction when administered to a subject, preferably to a human. This definition includes all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial or antifungal agents, isotonic agents and agents to delay the absorption of the active ingredient, etc.
  • the preparations must meet the requirements of sterility, pyrogenicity, general safety and purity standards defined by regulatory agencies, such as the FDA's Biological Standards Bureau.
  • RNA is meant herein any molecule of ribonucleic acid.
  • the ribonucleic acid molecules may be natural or modified ribonucleotides, in particular to have a better resistance to RNases.
  • the RNA sequence may include stabilization sequences that increase the half-life of the RNA in the cytosol.
  • the stabilization sequences are transcribed and untranslated sequences of the ⁇ -globin gene.
  • the present invention relates to a pseudoviral particle comprising an antigen.
  • the pseudoviral particle of the present invention is intended to regulate the immune system is particularly durable and specific, and in particular it enables the immune profile to be deviated or to induce an active mechanism for regulating autoimmune responses.
  • the pseudoviral particle of the invention further comprises an immunoregulatory molecule expressed on the surface of the particle.
  • Pseudoviral particles useful in the invention are:
  • the pseudoviral particles are formed by self-assembly of at least one structural protein of viral origin such as capsid protein or envelope protein. These particles mimic the structure and antigenic properties of the native virion but are unable to replicate.
  • the pseudoviral particles are produced by self-assembly of structural proteins, in particular subunits constituting the viral capsid and / or the viral envelope (international patent application WO2002 / 34893).
  • the pseudoviral particles can be obtained from double-stranded DNA viruses such as herpes virus, adenovirus, parvovirus, single-stranded DNA virus, double-stranded RNA virus.
  • double-stranded DNA viruses such as herpes virus, adenovirus, parvovirus, single-stranded DNA virus, double-stranded RNA virus.
  • reovirus single-strand positive-strand RNA virus, negative-strand single-strand RNA virus, retrovirus.
  • the pseudoviral particles are obtained from the assembly of structural proteins of AAV, adenovirus, VSV and herpes virus.
  • the pseudoviral particles can be prepared from retroviruses. It may be in particular retrovirus belonging to the family of oncoviruses, lentiviruses or spumaviruses. In the family of oncoviruses, non-oncogenic carriers such as for example MoMLV, ALV, BLV or MMTV and fast oncoviruses, such as RSV for example, may be mentioned in particular. In the family of lentiviruses, there may be mentioned for example HIV, SIV, FIV or CAEV.
  • the viral particle according to the invention comprises a structural protein, preferably an envelope derived from VSV (vesicular stomatitis virus), more particularly VSV-G.
  • the structural proteins of said pseudoviral particle are capsids and / or viral envelopes.
  • the viral capsid is a multiprotein structure that encompasses and protects the genetic material in a virus.
  • the capsid is formed from copies of a single or different protein subunits. Some viruses are surrounded by a lipid bilayer envelope containing glycoproteins. This envelope makes it possible to modulate tropism and immunogenicity.
  • the pseudoviral particle is a synthetic retroviral particle.
  • a retroviral particle comprises an envelope protein synthesized from an env gene, capsid proteins synthesized from the gag gene, and enzymes such as reverse transcriptase, proteases or an integrase synthesized from the pol gene, associated with a viral genome consisting of two copies of AR containing the gag / pol / env sequences.
  • the synthetic retroviral particle comprises an envelope protein and / or a capsid protein.
  • envelopes which can be used in the present invention are envelopes of the following viruses: 4070A, RDI 14, 10A1, VSV, LCMV, HIV, rabies virus, or GALV.
  • the envelope has a tropism for mammalian cells, more particularly for human cells.
  • the pseudoviral particle does not comprise envelope protein.
  • the pseudoviral particle comprises the MoMLV gag capsid protein capable of self-assembly into pseudo viral particles.
  • the pseudoviral particles may comprise modified viral proteins. These proteins can be modified, inter alia, by bank screening, by chemical modification or by genetic modification of the sequence of the natural viral protein.
  • the viral protein can be modified by substitution, addition or deletion of amino acids.
  • the viral proteins may also be covalently or non-covalently bound to the antigen and / or the immunoregulatory molecule by gene modification of the viral protein sequence or by chemical bonding.
  • the modified viral protein may comprise at least a portion of the viral protein fused to the antigen or immunoregulatory molecule.
  • the pseudoviral particle comprises an antigen.
  • the antigen is a self-antigen.
  • the antigen may be exposed on the surface of the pseudoviral particle or contained in the pseudoviral particle.
  • the antigen may be associated with the pseudo viral particle, for example via the envelope, a fragment of the envelope, the capsid protein, a fragment of the capsid protein.
  • the antigen may be fused by the N-terminal or C-terminal domain of the capsid protein or capsid protein fragment to be contained in the pseudoviral particle.
  • the antigen may also be fused to the transmembrane domain or the anchor domain of the envelope or envelope fragment or to the GPI domain to be exposed on the surface of the pseudoviral particle.
  • the antigen may be contained in the pseudoviral particle, for example by fusing the antigen to the capsid, in particular to the N or C-terminal domain of the capsid, preferably to the C-terminal domain of the protein. of capsid.
  • the antigen may be linked to the structural protein directly or via a "linker", preferably a peptide sequence.
  • Peptide sequence is understood to mean an amino acid sequence which makes it possible to bind protein subunits so that the protein adopts a good conformation for the activity of the protein subunits.
  • the peptide sequence "linker” is a sequence of 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 or 50 amino acids.
  • the antigen may be contained within the pseudoviral particle.
  • the antigen can be fused directly or via a peptide bond to the capsid protein, preferably to the C-terminal domain of the gag capsid protein.
  • the antigen can also be exposed on the surface of the particle or contained in the particle through a chemical or enzymatic reaction.
  • the pseudoviral particle used in the invention comprises an immunoregulatory molecule.
  • the immunoregulatory molecules are capable of modulating the immune response, in particular by modulating the functions of the antigen presenting cells and / or the regulatory T cells.
  • the molecules Immune-regulators are molecules that can increase the activity of regulatory T cells (Tregs).
  • the immunoregulatory molecule may be a receptor capable of modulating the immune response, in particular, capable of inducing the suppressive function of Tregs.
  • these immunoregulatory molecules can be derived from immune-check-point receptors, such as PD1 (Programmed Cell Death 1, also known as PDCD1 or CD279 ), CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, also known as CD 152), Tim3 (also known as HAVCR2), TIGIT (also known as IVSTM3) or OX40.
  • the immunoregulatory molecules correspond to the extracellular domain of the receptors, more particularly to the immunoglobulin-like domain (immunoglobulin-like domain) of the immune control point receptors such as, for example, the extracellular domains or the domain of the type immunoglobulin of PD1, CTLA-4, Tim3, TIGIT or OX40.
  • the immunoregulatory molecule may also be a receptor ligand such as PD1-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1, also known as CD274).
  • the immunoregulatory molecules may also be cytokines such as for example IL-2 which is required for the generation and maintenance of Tregs. Also, on dendritic cells, the neutralization of costimulatory molecules such as CD80, CD86 especially after CTLA4 binding may block lymphocyte activation.
  • the immunoregulatory molecules can exert their function by modifying the orientation of the immune responses, in particular to a Th1, Th2, Th3 profile, for example for the treatment of autoimmune responses.
  • the immunoregulatory molecules are molecules capable of activating TLRs (Toll-like receptors).
  • the molecules capable of activating TLRs are, for example, molecules comprising structures conserved in pathogens such as flagellins, unmethylated CpG DNA or RNA.
  • viral RNA can stimulating TLR7 / TLR8 and flagellin can stimulate TLR5 and thus promote the orientation of responses to a Thl profile.
  • RNA capable of activating TLRs can be stabilized against RNase degradation.
  • the viral RNA can be chemically modified with respect to natural RNA. The modification may consist of replacing, inserting or deleting one or more atoms or groups of atoms.
  • the RNA comprises at least one modified nucleotide.
  • the RNA can also comprise a cap of one or more modified guanosine nucleotides or a tail of several adenosines.
  • the RNA molecules of the present invention are preferably RNAs comprising between 2 and 1000 nucleotides, more preferably between 8 and 200 nucleotides, even more preferentially between 15 and 31 nucleotides.
  • the RNA can be single or double-stranded RNA.
  • the RNA useful in the present invention is preferably viral RNA.
  • the viral RNA can be coding or non-coding, preferentially the viral RNA is non-coding.
  • the non-coding viral RNA can be derived from the cytomegalo virus.
  • the immunoregulatory molecule can be exposed on the surface of the pseudoviral particle or be contained in the pseudoviral particle.
  • the immunoregulatory molecule can be exposed on the surface of the pseudoviral particle, for example, via the envelope, a fragment of the envelope, the capsid protein, a fragment of the capsid protein or the transmembrane domain, or anchoring a protein.
  • the immunoregulatory molecule may be fused by the N-terminal or C-terminal domain of the capsid protein or capsid fragment of the pseudoviral particle.
  • the immunoregulatory molecule is preferably fused to a transmembrane domain or an anchor domain of a protein, preferably an envelope protein, preferably a glycoprotein.
  • the immunoregulatory molecule may be linked to the structural protein or the transmembrane domain directly or via a "linker", preferably a peptide sequence.
  • sequence Peptide is an amino acid sequence that binds protein subunits so that the protein adopts a good conformation for the activity of protein subunits.
  • the peptide sequence "linker” is a sequence of 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 or 50 amino acids.
  • the peptide sequence "linker” is GGGGS (SEQ ID NO: 5).
  • the immunoregulatory molecule can also be exposed on the surface of the pseudoviral particle or contained in the particle through a chemical or enzymatic reaction.
  • the immunoregulatory molecule or the extracellular domain of the immunoregulatory molecule is exposed on the surface of the particle by binding the immunoregulatory molecule or the extracellular domain of the immunoregulatory molecule to the transmembrane domain of the VSV-glycoprotein.
  • G vesicular stomatitis virus
  • GI glycophosphatidylinositol
  • the immunoregulatory molecule or the extracellular domain of the immunoregulatory molecule is linked to the glycophosphatidylinositol (GPI) domain for anchoring the CD59 glycoprotein.
  • GPI glycophosphatidylinositol
  • the immunoregulatory molecule may be covalently linked or not, it may be linked directly or via a "linker" to a viral protein, preferably via a peptic sequence.
  • the immunoregulatory molecule can also be bound to the pseudoviral particle through a chemical or enzymatic reaction.
  • a pseudoretroviral particle formed by the expression of a C-terminal fused Gag protein to an antigen-like antigen, further comprising a glycoprotein composed of the transmembrane domain of VSV-G or an anchor domain of the N-terminal fused CD59 glycoprotein to an immunoregulatory molecule such as IL-2, PD-L1 or the extracellular domain of PD1, or CTLA-4.
  • a linker preferably a peptide sequence, can be included between the two parts to limit stoichiometric constraints.
  • the particle may possibly contain molecules inside non-coding AR, playing the role of TLR ligand.
  • the pseudoviral particles may be prepared from methods known in the art. In particular, they can be produced using packaging cell lines.
  • the method for preparing the pseudoviral particles comprises a step of culturing cell lines expressing the gag and / or pol and / or env proteins as described above, and a step of recovering the particles produced by the cells.
  • the viral particles can be purified for example by centrifugation, gradients, chromatography. The supernatant of the cell can also be used directly without a purification step.
  • the present invention also relates to a plasmid (s) capable (s) of producing in situ the pseudoviral particle as described above.
  • the plasmid comprises a nucleic acid sequence encoding the modified viral protein of the pseudoviral particle, for example a nucleic acid sequence encoding an envelope protein and / or a gag protein.
  • the plasmid comprises a nucleic acid sequence coding for a viral structure protein fused with an antigen.
  • the plasmid encodes a capsid fused to an antigen.
  • the plasmid may also encode a viral structure protein fused to an immunoregulatory molecule.
  • the plasmid encodes a transmembrane domain of the VSV-G envelope or for a CD59 anchor glycophosphatidylinositol domain fused to an immunoregulatory molecule such as IL-2, PD-L1 or to the extracellular domain of PD1 or CTLA. -4.
  • the viral structure proteins composing the pseudo viral particle can be encoded by different plasmids.
  • the immunoregulatory molecules may also be encoded by a plasmid different from that of the structural proteins. Plasmids may also include other elements such as gene markers and / or the origin of replication that allow in vitro manipulations. Treatment of dysfunctions of the immune system:
  • the present invention also relates to the pseudoviral particle as described above or plasmid (s) capable of producing in situ said pseudoviral particle for its use in the treatment of immune dysfunction.
  • Immune dysfunction refers to diseases caused by an inappropriate response of the immune system.
  • Autoimmune disease is caused by an inappropriate response of the immune system to molecules or a combination of molecules that are normally present in the body. These molecules are then called autoantigens.
  • autoimmune diseases include multiple sclerosis, type 1 diabetes, lupus, autoimmune thyroid disease, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, celiac disease, myasthenia gravis or Biermer's disease. (Autoimmune atrophic gastritis) or autoimmune hepatitis (HAI).
  • compositions and Modes of Administration advantageously utilizes a pharmaceutical composition comprising a pseudoviral particle as previously described or one or more plasmid (s) capable of producing in situ said pseudoviral particle.
  • the pharmaceutical composition may also comprise a pharmaceutical excipient such as saline solutions, buffers, isotonic solutes.
  • the composition may also comprise adjuvants or immunogens.
  • the composition comprises a sufficient amount of pseudoviral particles, between 10 3 and 10 12 particles, more particularly between 10 9 and 10 11 particles.
  • composition may be administered to prevent immune dysfunction.
  • composition of the present invention may also be administered after the onset of symptoms of immune dysfunction.
  • the administration of the composition can be carried out according to the various routes known in the art which can be adjusted according to the antigens, the pathology, the biological effects, the plasmid or the particle.
  • the composition can be administered by parenteral injection, for example by subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular and intraperitoneal injection.
  • the composition may also be administered orally, sublingually, by inhalation, by infusion.
  • the pharmaceutical composition or the drug is in a solid form.
  • solid formulations suitable for oral administration include, but are not limited to, granules, powder, capsule, tablet, ointment, gel, dissolving powder, paste, chewing gum, a soft capsule or soft capsule.
  • the present invention also relates to a method for preventing, treating or reducing immune dysfunction comprising administering to a subject a sufficient amount of a pseudoviral particle as previously described.
  • the subject is preferably a mammal, preferably a human.
  • this method comprises administering the composition comprising the pseudoviral particle to a subject.
  • the pGag-pol plasmid encoding the MuLV capsid is obtained from plasmid pHIT60 (Soneoka Y et al., Nucleic Acids Research, 1995; 23 (4): 628-633).
  • the CMV promoter is replaced by a minimal CMV promoter comprising a unique restriction site (SacII / XbaI) allowing cloning into the phCMV expression plasmid.
  • pGagGFP encodes a Gag-GFP fusion protein under the control of a hCMV promoter. This plasmid is obtained from the plasmid EPX145-68 (Garrone, P.
  • the lentiviral plasmid pcppT.CMV-Gag / OVA encodes a Gag-OVA fusion protein expressed under the control of the human cytomegalovirus promoter (hCMV) and an ampicillin resistance gene.
  • the OVA sequence is inserted into the C-terminal Gag domain via the unique MluI restriction site (position 8689, made by Genscript®).
  • pGag-OVA is obtained from vector pcDNA3.1 and encodes the same fusion protein as that expressed by pcppT. CMV-Gag / OVA under the control of the hCMV promoter.
  • pGAG-MOG is obtained by insertion of the coding sequence for MOG (Myelin oligodendrocyte glycoprotein) in the phCMV vector.
  • the coding sequence for MOG is obtained by PCR amplification using the primers 5 'TGACACGCGTGCCTGTTTGTGGAGCTTCTC 3' (SEQ ID NO: 1) and 5 'GCTAGCTCAAAGGGGGTTTCTTAGCT 3 (SEQ ID NO: 2).
  • the PCR product is then inserted into the vector by cloning at the MluI and Nhel enzyme restriction sites.
  • Plasmid pCTLA-4WT comprises a coding sequence for the wild-type CTLA-4 protein (NCBI Reference Sequence: NM 009843.4) inserted into the pIRES plasmid (Clontech®) using the Eco RI restriction site (position 1102).
  • the pCTLA-4TM plasmid encodes the extracellular domain of the murine protein CTLA-4 (SEQ ID NO: 3) (MACLGLRRYK AQLQLPSRTW PFVALLTLLF IPVFS EAIQV TQPSVVLASS HGVASFPCEY SPSHNTDEVR VTVLRQTNDQ MTEVCATTFT EKNTVGFLDY PFCSGTFNES RVNLTIQGLR AVDTGLYLCK VELMYPPPYF VGMGN GTQIY VIDPEPCPDS DF LLWILVAV SLGLFFYSFL VTAV) related to transmembrane and intracytoplasmic domains of VSV-G (vesicular stomatitis virus-derived G) protein (SEQ ID NO: 4: SSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKK QIYTDIEMNRLGK) and separated from the extracellular domain mCTLA-4 by a GGGGS flexible sequence (SEQ ID NO: 5).
  • Plasmid pCTLA-4GPI encodes the extracellular domain of murine CTLA-4 protein comprising the transmembrane domain of CD59 (SEQ ID NO: 6: MRAQRGLILLLLLLAVFCSTAVSLTCYHCF)
  • Plasmid PIL-2TM encodes the murine IL-2 protein (GenBank: AAI 16874) linked to the transmembrane and intracytoplasmic domain of the VSV-G protein (SEQ ID NO: 3) by a GGGGS flexible sequence (SEQ ID NO: 5). .
  • the plasmid pIL2opi encodes murine IL-2 protein linked to the transmembrane domain of CD59 (SEQ ID NO: 6).
  • All the plasmids are prepared by bacterial culture in TB medium and purified with the kit "NucleoBond PC 2000 Endotoxin Free” (Macherey-Nagel).
  • HEK 293T cells (CRL-1573, ATCC) are cultured at 37 ° C. at 5% CO 2 in DMEM medium supplemented with 2mM L-glutamine, 100U / ml penicillin and streptomycin and 10% inactivated fetal calf serum ( Thermo Fischer Scientific).
  • 293T-GagOVA cells are obtained by infection of HEK 293T cells with recombinant lentiviral GagOVA particles.
  • the lentiviral particles are produced by transfecting the HEK 293T cells with a recombinant lentiviral vector GagOVA ((psi) pcppT.CMV-Gag / OVA), an HIV GagPol plasmid (pCMV9) and a plasmid encoding the VSV-g protein (phCMV- VSVg).
  • Clones expressing eGFP or GagOVA are sorted on GFP fluorescence or using anti-OVA (Agro-Bio®) and anti-MuLV Gag (clone R187, CRL-1912; ATCC) in flow cytometry after permeabilization of the cells.
  • VLPs Non-recombinant VLPs (VLPs) or VLPs (VLPs) are produced in 293T or 293T-GagOVA cells, respectively.
  • the cells are seeded in 175-cm 3 culture flasks at 15 ⁇ 10 6 cells per flask and co-transfected with calcium phosphate 24 h later with 50 ⁇ g of plasmids comprising pGag-pol.
  • Tolerogenic non-recombinant OVA VLPs or VLPs (tVLP, tVLP OVA ) are produced in 293T or 293T-GagOVA cells, respectively.
  • the cells are seeded in 175-cm 3 culture flasks at 15 ⁇ 10 6 cells per flask and co-transfected with calcium phosphate 24 h later with 50 ⁇ g of plasmids comprising pGag-pol with PCTLA-4TM OR pCTLA-4opi at a ratio of 3: 1 pGag-pol / pCTLA-4 for tolerogenic VLPs (tVLP) and a ratio of 1: 3 pGag-pol / pCTLA-4 for OVA tVLPs.
  • VLPs and MOG MOG TVLPs are produced using the same protocol with 50 mcg pGAG-MOG plasmid or a ratio of 2: 1 pGAG-MOG / pCTLA-4 G pi respectively.
  • the recombinant GFP VLPs are produced in DD7 cells constitutively expressing GagGFP according to the protocol described above.
  • VLP1L2 are produced in 293T cells.
  • the cells are seeded in 175-cm 3 culture flasks at 15 ⁇ 10 6 cells per flask and co-transfected with calcium phosphate 24 hours later with 50 ⁇ g of pGag-pol plasmids with or without PIL2TM OR pIL2opi at a ratio of 2 : 1 pGag-Pol / pIL2. After 16 or 18 hours, the medium is replaced with DMEM-medium without fetal calf serum.
  • the supernatant of the cells is removed, filtered through pore membranes of 0.45 ⁇ m and concentrated in order to obtain a purified solution of pseudoretro viral particles (retro VLP).
  • the filtered supernatant is purified by centrifugation on centricons (centricon Plus-70, Millipore) followed by ultracentrifugation at 107170 g for 2 hours at 4 ° C on a sucrose gradient (Beckman rotor SW41).
  • the VLPs are taken up in PBS IX and their concentration is determined by the BCA method (Pierce BCA Protein, Assay Kit, Thermo Scientific).
  • the samples (30 ⁇ g of the total proteins) are incubated with 1 ⁇ g of murine anti-CTLA-4 antibody (clone 14D3, eBiosciences) or 1 ⁇ g of anti-mIL2 antibody (ebiosciences) at 4 ° C for 30 minutes, then mixed with 10 of the prewashed Dynabeads® beads coupled to G (Thermo Fischer Scientific) proteins for one hour.
  • the samples (10 ⁇ g of total proteins of VLP or less for the recombinant proteins) are mixed with LDS sample buffer and its reducing buffer and then analyzed by electrophoresis in 4-12% Bis Tris Gel according to supplier's instructions (Thermo Fischer Scientific). The proteins are then transferred to PDVF membranes. Immunoblotting is performed in 0.05% PBS Tween buffer with an anti-mouse rat antibody (clone R187, CRL-1912 cells, ATCC) recognizing the MuLV p30 Gag capsid, a polyclonal anti-OVA rabbit antibody (Agro -Bio), and a polyclonal anti-MOG rabbit antibody (Thermo Fischer Scientific).
  • an anti-mouse rat antibody (clone R187, CRL-1912 cells, ATCC) recognizing the MuLV p30 Gag capsid, a polyclonal anti-OVA rabbit antibody (Agro -Bio), and a polyclonal anti-MOG rabbit antibody (Thermo Fischer Scientific
  • Biotinylated secondary antibodies and streptavidin-Qdot are used for secondary labeling.
  • the signal is detected using Quantum ST4-3026 (Vilber Lourmat).
  • mice Female mice (AnNR / j) aged 7 weeks (Laboratoires Janvier) are kept in the animal house under specific conditions without pathogen in accordance with the European Union directive on the protection of animals used for scientific purposes. All the protocols have been validated by the regional committee of ethics in the field of animal experimentation.
  • the spleens of BALB / c mice are removed and digested for 30 minutes in RPMI 10% S VF medium (Life Technologies) with 0.1 mg / ml of DNAse and Collagenase IV (Sigma Aldrich).
  • CD3 +, CD 19+ and Ter 119 + cells are eliminated by magnetic separation with specific biotinylated antibodies (eBiosciences) and anti-biotin beads (30 ⁇ 7 100.10 * 6 cells; Milteny ⁇ ).
  • the remaining cells are labeled with anti-CD1 antibodies lc and IA / IE then CD1 cells lc + MHC-II high are sorted by flow cytometry (FACS-Aria, BD).
  • the sorted cells are incubated for 24 hours with RPMI + 10% VF + GM-CSF medium (20 ng / mL; Milteny) +/- 10 ⁇ g / mL LPS (Sigma Aldrich) +/- VLPs at different concentrations.
  • the expression of activation markers (CD80, CD86, CD40, MHC-II) is analyzed by flow cytometry and the level of cytokines secreted in the culture supernatant is tested by ELISA.
  • Activation test of bone marrow dendritic cells is analyzed by flow cytometry and the level of cytokines secreted in the culture supernatant.
  • the bone marrow cells taken from the tibia and femur of BALB / c mice are cultured for 8 days in RPMI medium supplemented with 2 mM L-Glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 10% serum inactivated fetal calf and 20 ng / mL GM-CSF. Every 3 days, the middle is replaced. On D8, dendritic differentiated bone marrow cells are cultured for 24 hours in the presence of VLP, LPS, or medium alone as a negative control.
  • activation markers CD80, CD86, CD40, MHC-II
  • flow cytometry the level of cytokines secreted in the culture supernatant is tested by ELISA.
  • the spleen cells and the mesenteric lymph node cells are taken from OT-II FOXP3-GFP mice expressing GFP specifically in Foxp3 + Tregs and a TCR specific for an OVA-derived peptide presented by MHC-II or in TCR 2D2 mice expressing a TCR specific for a MOG-derived peptide presented by the MHC-II.
  • Non-Treg cells (Tconv, TCR + GFP-) are enriched by negative selection using biotinylated anti-Terl 19, CD19 and CD8 antibodies (BD Biosciences) and anti-biotin microbeads (30 ⁇ l / 100 ⁇ 10 6 cells; sorted by flow cytometry (FACS ARIA, BD).
  • the cells are then labeled with the CellTrace Violet marker (OT-II CTV + cells) (CTV, Thermo Fischer Scientific).
  • OVA-II CTV + cells CTV, Thermo Fischer Scientific.
  • the spleen cells containing the dendritic cells are irradiated (25 Gy) and then incubated with the OVA-II323-329 peptide (5 ⁇ g / ml, Genscript) or an OVA protein (200 ⁇ g / ml, Sigma Aldrich) for 1 or 4 hours respectively.
  • the spleen cells are incubated with a MOG33-55 peptide (90 ⁇ g / ml Biotechne) for 1 hour.
  • 10 5 OT-II CTV + cells or 2D2 CTV + cells are cultured in RPMI medium supplemented with 2 mM L-Glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 20 ng / ml GM -CSF (Miltenyi) and 10% inactivated fetal calf serum with 5 ⁇ 10 5 splenocytes pre-incubated with the antigen in the presence of 1, 5 or 10 ⁇ g / ml of VLP or tVLP. After two and three days, proliferation and activation of CTV + Tconv cells are analyzed by flow cytometry.
  • mice Six week old C57BL / 6 mice (Laboratoires Janvier) were immunized subcutaneously on day 0 on both sides of the flank with a 1: 1 solution of 200 ⁇ g of MOG 35-55 (Tocris) emulsified in CFA. (Sigma Aldrich) supplemented with mycobacteria (HKMT BD Difco) at a final concentration of 5 mg / mL.
  • MOG 35-55 Tocris
  • HKMT BD Difco mycobacteria
  • 200 ng of Pertusis toxin Enzo Life Sciences
  • the development of ⁇ was monitored for 30 days and symptoms were noted every two or three days.
  • mice received intraperitoneal injections of 30 ⁇ g tVLP once a day for 10 days between the fifteenth and the twenty-fifth day.
  • the mice were also injected with PBS (placebo) or Abatacept (CTLA-4-Ig) with the same amount of CTLA-4 included in the tVLP vaccines.
  • Functional test of VLPIL-2
  • VLPi L2 was tested in the CTLL-2 cells (ATCC TIB-214 TM ®).
  • the cells are cultured in RPMI medium supplemented with 2mM L-glutamine, 100U / ml penicillin and streptomycin, 10% thermally inactivated fetal calf serum, 1% HEPES buffer and 0.1% 2-mercaptoethanol (all from Thermo Fischer Scientific).
  • VLPIL- 2 50 ⁇ / ⁇ ⁇
  • human IL-2 Proleukin®, Novartis
  • Table 1 list of antibodies used in flow cytometry.
  • VLPs For the flow cytometric analysis of the VLPs, 20 ⁇ g of VLPs are incubated with 5 ⁇ l of aldehyde / sulfate latex beads of diameter 4 ⁇ (Thermo Fischer Scientific) for 15 min at room temperature. PBS is added to a final volume of 1mL and then incubated for one hour. The beads are blocked in fetal calf serum for 30 minutes and washed three times, then incubated with anti-CD152 or anti-mIL-2 surface antibody (eBiosciences) in PBS, 2% BSA for one hour. For intra-VLP markings, the beads are treated with 1% Triton PBS for one hour.
  • MCTLA-4 is detected on the surface of VLPs using the ELISA method.
  • the flat-bottom 96-well plates (Medisorp, Nunc) are coated with anti-CD152 murine antibodies (0.2 ⁇ g / mL, clone 14D3, eBioscience) at 4 ° C overnight. After washing the wells, non-specific binding sites are blocked with 1% BSA PBS for one hour at room temperature. 90 ⁇ sample are added in each well with 10 ⁇ ⁇ of lysis buffer and incubated for 2 hours at room temperature.
  • Anti-CD152 mAb antibodies (UC10-4B9, eBioscience), peroxidase-conjugated streptavidin (Sigma-Aldrich) and tetramethylbenzidine (TMB, eBioscience) are added at room temperature for 10 min to detect mCTLA-4.
  • the reaction is stopped by adding ⁇ of HC1 (1M) and the optical density is measured at 450 nm with an automatic ELISA reading plate (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter).
  • the tag mCTLA-4-His (Thermo Fisher Scientific) is used as a standard.
  • MIL-2 is detected on the surface of VLPs using Ready-Set-Go mIL-2 kits (eBiosciences) according to the manufacturer's instructions. VLPs " are used as a negative control.
  • OVA VLPs OVA expression by recombinant VLPs
  • OVA VLPs OVA expression by recombinant VLPs
  • VLPs "obtained from WT Gag are used as control.
  • the Western blot analysis of transfected cell supernatants demonstrate the formation of rodiaVLP vectorizing the antigen of interest, here ovalbumin (OVA) ( Figure 3A).
  • OVA ovalbumin
  • Immunoprecipitation by an anti-CTLA-4 antibody demonstrates the assembly of immunoregulatory molecules (CTLA-4) on OVA tVLPs (revealed with anti-Gag, Figure 3B).
  • CTLA-4 immunoregulatory molecules
  • WT TM-VSVG
  • GPI anchor domain The expression of the different CTLA-4 chimeric forms (WT, TM-VSVG or with the GPI anchor domain) was compared in the transfected cells or on the VLPs by flow cytometry. Untransfected cells or VLPs "have been used as negative control.
  • DC dendritic cells
  • FIG. 7A The expression of chimeric CTLA4 (including the GPI domain of CD59b) on the surface of the particles and MOG antigen within the particles could be observed by flow cytometry ( Figure 7B).
  • the regulatory effect of recombinant tVLPs could be tested by an in vitro proliferation assay with CD4 + 2D2 T cells that express a MOG peptide-specific TCR receptor.
  • MOG tVLPs significantly block the division of MOG antigen-specific T cells (Figure 7C), including after a prolonged culture time (Day 7, Figure 7D). This suppression is strong, with an index of more than 60 (FIG.
  • VLPIL 2 recombinant VLPs
  • CTLL-2 cells were measured by Trypan blue in Malassez cells in the presence of IL-2 at 25 IU / mL, 50 IU / mL, VLPi L2 or in the absence of IL2 (SS). IL-2).
  • the cell proliferation and the percentage mortality of CTLL-2 cells in the presence of VLP1L2 are similar to the results obtained in the presence of cytokine IL-2 indicating that VLP1L2 allow the proliferation of CTLL-2 cells and are therefore functional (FIG. 9).
  • Figure 10 illustrates the therapeutic effect of MOG tVLPs in an EAE model.
  • the mice were treated from day 15, when the mice immunized with the MOG antigen develop the symptoms and exhibit onset of limb paralysis.
  • the mice received intraperitoneal injections of 30 ⁇ g tVLP once a day for 10 days between the fifteenth and the twenty-fifth day.
  • mice were injected with PBS (Placebo) or Abatacept (CTLA-4-Ig) with an identical dose of CTLA-4.
  • Mice treated with MOG tVLP particles have an evolution of the blocked disease unlike the control groups.
  • the therapeutic effect is sustained and maintained beyond the vaccination period, demonstrating an induction of tolerance.
  • FIG. 11A and 11B show that induction of tolerance by tVLPs reduces immune infiltration of the central nervous system and increases splenic Tregs.
  • C57B1 / 6 mice received daily intraperitoneal injection of tVLPs or PBS (placebo) between days 15-25 (in bold) after induction induction.
  • PBS placebo

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Abstract

L'invention concerne une particule pseudovirale comprenant un auto-antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à sa surface. L'invention concerne également l'utilisation de la dite particule dans le traitement d'une maladie auto-immune.

Description

Particules pseudo-virales utiles pour traiter des maladies
auto-immunes
DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne des compositions comprenant des particules pseudo virales utiles pour modifier, réguler ou réprimer une réponse immunitaire, plus particulièrement pour traiter un dysfonctionnement immunitaire tel qu'une maladie auto-immune. Des méthodes pour produire lesdites compositions sont décrites. Cette invention peut être utilisée chez les mammifères, en particulier chez les hommes mais également chez les autres vertébrés.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La prévalence des maladies auto-immunes a considérablement augmenté dans les pays industrialisés au cours des dernières décennies. Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui s'attaque aux constituants normaux de l'organisme (auto-antigène).
Aujourd'hui, les traitements proposés contre les maladies auto-immunes reposent sur l'utilisation de médicaments immunosuppresseurs et agissent de façon non-spécifique sur le système immunitaire, avec des conséquences sur sa fonctionnalité et l'efficacité des réponses anti-infectieuses. Le développement de nouveaux traitements efficaces, durables et spécifiques pour les dysfonctionnements immunitaires reste donc nécessaire.
L'administration d'antigènes qui sont la cible des mécanismes pathologiques, dans une formulation favorable à l'instauration d'une tolérance immunitaire constitue une stratégie d'intérêt.
Des particules pseudovirales, également appelées VLP (virus-like particle), sont utilisées pour la vaccination anti-infectieuse ou anti-tumorale. Les particules pseudovirales offrent l'avantage de pouvoir être facilement modulables et peuvent être utilisées comme plateforme antigénique. Les antigènes ciblés peuvent être ainsi véhiculés à l'intérieur ou à la surface des particules pseudo-virales, favorisant le déclenchement des réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques, mais aussi de masquer les antigènes des facteurs neutralisants ou réagissants (anticorps) lorsqu'ils sont à l'intérieur. De plus, la grande flexibilité de cette plateforme antigénique permet la vectorisation de molécules immunorégulatrices, à l'origine de l'induction de tolérance.
RESUME DE L'INVENTION :
De façon intéressante, les inventeurs ont montré que les particules pseudovirales permettent de bloquer l'activation des cellules présentatrices d'antigènes et l'activation des cellules T et peuvent donc être utilisées pour moduler les réponses immunitaires, voire induire une tolérance immunitaire spécifique. En d'autres termes les particules pseudovirales permettent de rendre l'organisme tolérant aux antigènes vectorisés par ces particules pseudovirales dites tolérogènes.
Un premier objet de l'invention est une particule pseudovirale comprenant un ou des antigène(s) et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule. La particule pseudovirale selon l'invention est particulièrement utilisée dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire, de préférence une maladie auto-immune telle que la sclérose en plaque, le diabète de type 1 , le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
La particule pseudovirale est de préférence sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant en outre un excipient pharmaceutique.
Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un plasmide ou ensemble de plasmide(s) capables de produire in situ une particule pseudovirale telle que définie ici, en particulier pour leur utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire.
LEGENDE DES FIGURES
La Figure 1 illustre la structure des particules pseudovirales VLP sans antigène et sans CTLA-4 (VLP), VLP avec un antigène OVA seul (VLPOVA) ou associée au CTLA-4 (tVLPOVA), VLP sans antigène et exprimant le CTLA-4 à sa surface (tVLP-), et des VLP avec un antigène OVA (VLPOVA) co-injecté avec du CTLA-4 soluble (CTLA-4- Ig).
La Figure 2 illustre les constructions utilisées pour former les particules selon l'invention (A) et la structure de la particule pseudovirale tolérogène tVLPOVA (B) où OVA est l'antigène cible.
La Figure 3 illustre la caractérisation et l'expression des protéines thérapeutiques dans les tVLPOVA. A. Validation par Western Blot de l'expression de Gag et d'OVA dans les particules pseudo virales VLPOVA. VLP" sont des particules contrôle sans l'antigène OVA. B. Validation par immunoprécipitation de l'expression de CTLA-4 dans les particules pseudovirales tVLP. C. Comparaison de l'expression de formes chimériques de CTLA-4 (WT, TM-VSV-G, ou domaine d'ancrage GPI) dans les cellules transfectées (haut) ou à la surface des particules pseudovirales (bas) par cytométrie en flux. Les cellules non transfectées ou les VLP" sont utilisés comme contrôle négatif (noire). D. Quantification du domaine CTLA-4 dans les préparations tVLP, tVLPOVA ou VLP ~ par test ELISA (gauche) et quantification relative de CTLA-4 par rapport aux protéines totales mesurées en utilisant la méthode BCA (droite). Les résultats correspondent aux moyennes ± SEM (n=4) and représentent 3 expériences indépendantes.
La Figure 4 illustre la captation et les effets des tVLP sur les cellules dendritiques purifiées. A. Schéma expérimental. Les cellules dendritiques purifiées CD1 lchlgh CMH- jjhigh ^6 γΆ rate ^ souris BALB/c ou les cellules dendritiques issues de la moelle osseuse sont cultivées en présence de VLP VLPGFP ou tVLPGFP et stimulées ou non avec du LPS. 24 heures après culture, l'expression des molécules de co stimulations et les marqueurs d'activation est analysée par cytométrie en flux. B. La captation des VLPGFP par les cellules dendritiques purifiées est confirmée par la présence de cellules GFP+ après 24h de culture. Les VLP" sont utilisés comme contrôle négatif (noire). (C- E). L'expression des molécules de costimulation et des marqueurs d'activation est analysée par cytométrie en flux sur les cellules dendritiques purifiées après co-culture avec du milieu en présence ou non de ^g/mL de LPS et 5, 10 ou 15 μg/mL de tVLPGFP. L'expression de CD80, CD86, CD40 et CMH-II est analysée dans les cellules vivantes exprimant CDl lc et CMH-II. C. représente les profils de cytométrie de CD80, CD86 dans les cellules dendritiques cultivées dans du milieu de culture seul, en présence de LPS et en présence de LPS et de tVLPGFP (15 μ§/ι ί). D. L'expression des molécules de costimulation est mesurée en utilisant la moyenne géométrique de fluorescence (MFI). E. La modulation d'expression est représentée par le ratio MFI comparé au milieu de contrôle.
La Figure 5 illustre les effets des tVLP sur les cellules dendritiques issues des précurseurs de la moelle osseuse. A. illustre l'expression CD80, CD86, CD40 et CMH- II analysée par cytométrie en flux sur les cellules dendritiques issues de la moelle osseuse vivantes après co-culture avec du milieu en présence ou non de ^g/mL de LPS et 5, 10 ou 15 μg/mL de tVLPGFP. La modulation d'expression de CD80, CD86, CD40 et CMH-II est représentée par le ratio gMFI comparé au milieu de contrôle. B. Quantification par ELIS A de l'IL-10 dans le surnageant de culture des cellules dendritiques après 24 heures de culture dans du milieu seul, en présence de LPS ou en présence de LPS et tVLP.
La Figure 6 illustre le blocage de la prolifération des cellules T antigène spécifiques par les tVLP. A. Schéma expérimental. Les cellules T CD4+ CD25- issues des souris OT-II sont cultivés deux ou trois jours avec des rates irradiées de souris OT-II chargées avec un peptide OVA323-339 ou une protéine OVA. Pour analyser la prolifération, les cellules T CD4+ OT-II sont marquées avec du CellTrace® Violet. Les cellules T vivantes OT- II CTV+CD4+ co-cultivées pendant 2 jours avec des splénocytes irradiés chargés avec un peptide OVA323-339 en présence ou non de 10 μg/mL de VLP", tVLP", ou une dose équivalente de hCTLA-4 sont analysées par cytométrie en flux. B. Profil de cytométrie des dilutions CTV des cellules T CD4+ CTV+ OT-II après deux jours dans différentes conditions de culture. (C-D). Indices de suppression des dilutions CTV des cellules OT- II co-cultivées pendant deux ou trois jours avec les splénocytes mis en contact avec le peptide OVA323-339 (C) ou la protéine OVA (D). Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM (n=4) et représentent 3 expériences indépendantes.
La Figure 7 illustre la validation de l'expression de MOG dans les tVLPMOG et son effet suppresseur sur les cellules effectrices de la sclérose en plaque. A. Validation par Western Blot de l'expression de MOG et de Gag dans les particules pseudovirales VLPMOG. Les VLP" sont utilisés comme contrôle. B. Validation par cytométrie en flux de l'expression de CTLA-4 dans les particules pseudovirales tVLPMOG. Les VLP" sont utilisées comme contrôle négatif. C. Blocage de la prolifération des cellules T 2D2 spécifiques de MOG par tVLPMOG. Profil de cytométrie des dilutions CTV des cellules T CD4+ CTV+ 2D2 après sept jours en présence de tVLPMOG et VLP" (contrôle). D. Cinétique de division des cellules T dans les différentes conditions de culture. E. Indices de suppression et moyennes géométriques des dilutions CTV des cellules 2D2 à 7 jours de culture. Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM. La Figure 8 illustre la caractérisation et l'expression des protéines thérapeutiques dans les tVLP exprimant IL-2 comme molécule immunorégulatrice. A. Validation par Western Blot de l'expression d'IL-2 et de Gag dans les particules pseudovirales. B. Quantification de l'IL-2 dans les préparations VLP IL-2+ et IL-2" par test ELISA. C. Comparaison de l'expression de formes chimériques de l'IL-2 (TM-VSV-G ou domaine d'ancrage GPI) dans les cellules transfectées (haut) ou à la surface des particules pseudovirales (bas) par cytométrie en flux. Les cellules non transfectées ou les VLP" sont utilisés comme contrôle négatif (noire).
La Figure 9 illustre la validation fonctionnelle de l'IL-2 présent à la surface des tVLP. Les VLP IL-2+ ont été mis en culture (5(^g/mL) avec les cellules CTLL-2 dépendante de l'IL-2. La prolifération (A) et la survie (B) des cellules ont été évaluées sur une période de 8 jours. En contrôle, de l'IL-2 à 25 ou 50 UI/mL, ou du milieu seul ont été utilisés.
La Figure 10 montre l'effet thérapeutique des tVLPs sur un modèle murin de sclérose en plaques (souris développant une encéphalite autoimmune expérimentale (EAE)). Les scores cliniques d'EAE chez les souris traitées par une dose quotidienne de vaccin spécifique de l'antigène MOG (tVLP+), Abatacept ou un placebo entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de ΓΕΑΕ. Les résultats sont présentés en moyennes ± écart- type (n=5 souris / groupe). *, p<0.005; Mann-Whitney entre tVLP+ et placebo.
La Figure 11 montre qu'une induction de la tolérance par les tVLPs réduit l'infiltration immunitaire du système nerveux central et augmente les Tregs spléniques. Des souris C57B1/6 ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de tVLPs ou PBS (placebo) entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de ΓΕΑΕ. A J29, les rates et moelles épinères/cerveaux ont été prélevées et les cellules immunitaires infiltrantes ont été isolées puis analysées par cytométrie de flux (Figure 11 A, monocytes inflammatoires, Figure 11B, lymphocytes Tregs). Des souris naïves ont été incluses comme contrôle. Les résultats sont présentés en moyennes ± écart-type (n=2 souris / groupe).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point une méthode pour traiter les dysfonctionnements immunitaires d'un sujet, tels que des maladies auto-immunes, comprenant l'administration de particules pseudovirales contenant un antigène et une molécule immunorégulatrice.
Cette particule pseudovirale contient avantageusement une molécule immunorégulatrice, exposée à sa surface.
La présente invention concerne donc une particule pseudovirale comprenant un antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule, qui permet de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène. La molécule immunorégulatrice est de préférence une molécule qui exerce des fonctions régulatrices et/ou suppressives sur les cellules présentatrices d'antigène, favorisant un recrutement des cellules T régulatrices. En particulier, la molécule immunorégulatrice peut être un récepteur de point de contrôle immunitaire (appelé en anglais « immune-checkpoint receptor »), plus particulièrement une séquence peptidique comprenant le domaine extracellulaire, plus particulièrement le domaine de type immunoglobine (appelé également en anglais « Ig- like domain ») d'un récepteur de point de contrôle immunitaire, de préférence choisi parmi le groupe consistant en : CTLA-4 (pour « Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 »), OX40 (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4)), PD1 (Programmed cell Death 1), Tim3 (aussi connu sous le nom de HAVCR2), LAG-3 et TIGIT (aussi connu sous le nom de IVSTM3). La molécule immunorégulatrice peut être également une cytokine, de préférence choisie parmi le groupe consistant en : IL-2 (Interleukine 2) , IL- 10 (Interleukine 10) et TGF-béta. La molécule immunorégulatrice est de préférence fusionnée au domaine transmembranaire et/ou d'ancrage d'une protéine, de préférence d'une glycoprotéine. En particulier la molécule immunorégulatrice est liée au domaine transmembranaire d'une protéine d'enveloppe ou un système d'ancrage glycosylphosphatidylinositol (GPI) pour être exposée à la surface de la particule. La cytokine, qui est de préférence l'interleukine 2, peut être humaine ou d'une autre espèce animale, elle peut être sauvage ou mutante. En particulier il peut s'agir d'une IL-2 humaine modifiée des-alanyl-1, serine- 125.
Peuvent être associées des molécules «adjuvantes » ayant la capacité d'orienter les réponses immunitaires vers un profil cytokinique souhaité. Une molécule capable d'activer les TLR (Toll Like Receptor) telle que de l'ARN viral, de préférence de l'ARN non codant, peut être associée pour renforcer les réponses Thl (Pitoiset F. et al. J. Virol. 2017 Oct 13 ;91(21)) et ainsi lutter contre les réponses Th2 qui peuvent être parfois associées à des mécanismes pathologiques auto-immuns, tels que dans la pancréatite autoimmun (Pakala et al, J Exp Med. 1997, 186(2): 299-306). Les particules selon l'invention peuvent être également associées à des molécules ou des adjuvants (de type alun) capables d'initier des mécanismes à l'origine des réponses de type Th2.
La particule pseudovirale est de préférence une particule rétrovirale synthétique. En d'autres termes, la particule pseudovirale comprend une protéine rétrovirale de capside et/ou une protéine rétrovirale d'enveloppe.
La présente invention concerne plus particulièrement les particules pseudovirales définies ici, pour une utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire.
Les particules pseudovirales selon l'invention sont utilisées pour le traitement des maladies auto-immunes.
La particule pseudovirale de ladite invention comprend un antigène qui est un antigène du soi également appelé auto-antigène pour une utilisation dans le traitement d'une maladie auto-immune, de préférence la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto- immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI). Ainsi l'administration de particules pseudovirales comprenant Γ auto-antigène permet d'induire une tolérance spécifique à cet antigène en induisant les cellules régulatrices et en supprimant la réponse spécifique et les cellules effectrices.
La présente invention concerne également un ou des plasmide(s) capables de produire in vitro mais aussi in situ des particules pseudovirales. En particulier, on utilise un ou des plasmides codant pour une protéine de capside et/ou une protéine d'enveloppe constituant la particule pseudovirale. La présente invention concerne plus particulièrement les dits plasmides pour une utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire. La particule pseudovirale ou le ou les plasmide(s) capable(s) de produire in situ une particule pseudo virale peuvent être administrés au sujet de préférence par voie mucosale, par exemple par voie orale, sublinguale, intranasale, ou par voie sous-cutanée ou intra- veineuse.
La présente invention utilise une composition pharmaceutique comprenant la particule pseudovirale ou un ou des plasmide(s) capable(s) de produire in situ des particules pseudovirales. Cette composition peut également comprendre un excipient pharmaceutique.
La composition pharmaceutique peut comprendre plusieurs particules pseudovirales ou plusieurs plasmide(s) capables de produire in situ des particules pseudovirales comprenant des antigènes différents et/ou des molécules immunorégulatrices différentes.
Est également décrite ici une méthode de préparation de particules pseudovirales ou de plasmides capables de produire in situ les particules pseudo virales.
Définitions - Le terme « antigène » désigne une molécule telle qu'une protéine, un polypeptide, un peptide, un lipide, un acide nucléique, un polysaccharide, un épitope capable d'être reconnu par un anticorps ou des cellules du système immunitaire. En particulier l'antigène est capable de déclencher une réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut conduire à une production d'anticorps et/ou à une activation de cellules du système immunitaire. En particulier, l'antigène est une protéine, un polypeptide, un peptide hétérologue de la particule pseudovirale, plus particulièrement une protéine, un polypeptide ou un peptide non- viral. Dans le cadre de la présente invention, l'antigène est une molécule hétérologue vis-à-vis du virus formant la particule. Il s'agit de préférence d'une molécule non-virale. Dans l'invention, l'antigène est un antigène du soi également appelé auto-antigène. Par « auto-antigène » on entend ici un antigène du patient, ciblé par une réponse auto-immune lors d'une rupture de la tolérance. Le terme comprend aussi les fragments épitopiques des protéines complètes.
- Une maladie auto-immune est causée par une réponse inappropriée du système immunitaire à l'encontre de molécules ou d'une combinaison de molécules qui sont normalement présentes dans l'organisme. Ces molécules sont alors appelées autoantigènes. Des exemples de maladies auto-immunes sont la sclérose en plaque, le diabète de type 1 , le lupus, les thyroïdes auto-immunes, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
De préférence, les réactions allergiques ou les symptômes allergiques (tels que la rhinite, l'asthme allergique, la dermatite, l'urticaire, l'inflammation des sinus ou un choc anaphylactique suite à l'exposition à l'allergène) ne sont pas inclus dans la définition des maladies auto-immunes visées ici. - Le terme « traiter » signifie supprimer les symptômes, éliminer les causes des symptômes de manière transitoire ou permanente mais également prévenir ou ralentir l'apparition de symptômes du dysfonctionnement immunitaire.
- Le terme « sujet » signifie toutes personnes humaines ou animaux non- humains qui sont susceptibles d'être traités par la composition de la présente invention. En particulier les sujets susceptibles de subir un dysfonctionnement immunitaire, ceux qui ont déjà été sujets à un dysfonctionnement immunitaire, qui ont des prédispositions à un dysfonctionnement immunitaire ou qui présentent des signes de dysfonctionnement immunitaire. - Au sens de la présente invention, l'expression "quantité efficace" (ou "quantité thérapeutiquement efficace") se réfère à une quantité de particules pseudovirales selon l'invention nécessaire ou suffisante pour, sans causer d'effets secondaires significatifs et défavorables pour le sujet, retarder ou stopper l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, apporter des améliorations, réduire la sévérité ou l'incidence d'un dysfonctionnement immunitaire, ou stopper ou soigner un dysfonctionnement immunitaire. Une quantité efficace peut être administrée avant l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, pour une action prophylactique ou préventive. De façon alternative ou additionnelle, une quantité efficace peut être administrée après l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, pour une action thérapeutique.
- Un "excipient" désigne, dans la présente invention, toute substance autre que le principe actif présente dans une composition lui conférant des propriétés de stabilité, de forme (liquide, solide, gélule, etc .. suivant le mode 'administration), de goût, de dissolution (par exemple dissolution ciblée dans l'estomac ou le tube digestif), de couleur, etc .. Un "excipient pharmaceutiquement acceptable" désigne plus spécifiquement un excipient qui n'induit pas de réaction non-souhaitée lors de son administration à un sujet, de préférence à un humain. Cette définition inclut tous les solvants, milieux de dispersion, enrobages, agents antibactériens ou antifongiques, agents isotoniques et agents permettant de retarder l'absorption du principe actif, etc. Pour une administration à l'homme, les préparations doivent remplir les conditions de stérilité, de pyrogénicité, de sécurité générale et les standards de pureté définis par les agences réglementaires, comme le bureau des normes biologiques de la FDA.
- On entend ici, par "ARN ", toute molécule d'acide ribonucléique. Les molécules d'acide ribonucléique peuvent être des ribonucléotides naturels ou modifiés, notamment pour présenter une meilleure résistance aux RNases. La séquence de l'ARN peut comprendre des séquences de stabilisation qui permettent d'augmenter la demi- vie de l'ARN dans le cytosol. Par exemple, les séquences de stabilisation sont des séquences transcrites et non-traduites du gène de la β-globine.
La présente invention a pour objet une particule pseudovirale comprenant un antigène. La particule pseudovirale de la présente invention est destinée à réguler de manière durable et spécifique le système immunitaire, en particulier elle permet de dévier le profil immunitaire ou d'induire un mécanisme actif de régulation des réponses auto- immunes. Afin de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène, la particule pseudovirale de l'invention comprend en outre une molécule immunorégulatrice exprimée à la surface de la particule.
Particules pseudovirales utiles dans l 'invention :
Les particules pseudovirales sont formées par auto-assemblage d'au moins une protéine de structure d'origine virale telle que la protéine de capside ou la protéine d'enveloppe. Ces particules imitent la structure et les propriétés antigéniques du virion natif, mais sont incapables de se répliquer. En particulier, les particules pseudovirales sont produites par auto-assemblage de protéines de structure, en particulier des sous-unités constitutives de la capside virale et/ou de l'enveloppe virale (demande de brevet internationale WO2002/34893).
Selon l'invention, les particules pseudovirales peuvent être obtenues à partir de virus à ADN double brin tel que le virus de l'herpès, l'adenovirus, le parvovirus, de virus à ADN à simple brin, de virus à ARN à double brin tel que les réovirus, de virus à ARN simple brin à polarité positive, de virus à ARN simple brin à polarité négative, de rétrovirus. En particulier les particules pseudovirales sont obtenues à partir de l'assemblage de protéines de structure de AAV, d'adénovirus, de VSV, de virus d'herpès.
Dans un cas particulier, les particules pseudovirales peuvent être préparées à partir de rétrovirus. Il peut s'agir notamment de rétrovirus appartenant à la famille des oncovirus, des lentivirus ou des spumavirus. Dans la famille des oncovirus, on peut citer notamment les oncovirus lents, non porteur d'oncogène, tels que par exemple MoMLV, ALV, BLV, ou MMTV et les oncovirus rapides, tels que RSV par exemple. Dans la famille des lentivirus, on peut citer par exemple HIV, SIV, FIV ou CAEV.
Dans un autre cas particulier, la particule virale selon l'invention comprend une protéine de structure, de préférence une enveloppe dérivée du VSV (vesicular stomatitis virus), plus particulièrement du VSV-G. Les protéines de structure de la dite particule pseudovirale sont des capsides et/ou des enveloppes virales. La capside virale est une structure multiprotéique qui englobe et protège le matériel génétique dans un virus. La capside est formée à partir de copies d'une unique ou de différentes sous-unités protéiques. Certains virus sont entourés d'une enveloppe à double couche lipidique contenant des glycoprotéines. Cette enveloppe permet de moduler le tropisme et l'immunogénicité.
Dans un mode préféré de l'invention, la particule pseudovirale est une particule rétrovirale synthétique. Une particule rétrovirale comprend une protéine d'enveloppe synthétisées à partir d'un gène env, des protéines de capside synthétisées à partir du gène gag, et des enzymes telles que la reverse transcriptase, des protéases ou une intégrase synthétisée à partir du gène pol, associées à un génome viral constitué de deux copies d'AR contenant les séquences gag/pol/env. La particule rétrovirale synthétique comprend une protéine d'enveloppe et/ou une protéine de capside. En particulier des enveloppes qui peuvent être utilisées dans la présente invention sont des enveloppes des virus suivants : 4070A, RDI 14, 10A1, VSV, LCMV, VIH, virus de la rage, ou le GALV. Dans une approche préférée de l'invention, l'enveloppe a un tropisme pour les cellules de mammifères, plus particulièrement, pour les cellules humaines. Dans un aspect particulier de l'invention, la particule pseudovirale ne comprend pas de protéine d'enveloppe. En particulier, la particule pseudovirale comprend la protéine de capside gag du MoMLV capables de s'auto-assembler en particules pseudo virales.
Les particules pseudovirales peuvent comprendre des protéines virales modifiées. Ces protéines peuvent être modifiées entre autres par criblage de banque, par modification chimique ou par modification génétique de la séquence de la protéine virale naturelle. Par exemple, la protéine virale peut être modifiée par substitution, addition ou délétion d'acides aminés. Les protéines virales peuvent également être liées de manière covalente ou non à l'antigène et/ou la molécule immunorégulatrice par modification génique de la séquence de la protéine virale ou par liaison chimique. Par exemple, la protéine virale modifiée peut comprendre au moins une partie de la protéine virale fusionnée à l'antigène ou à la molécule immunorégulatrice. Dans la présente invention, la particule pseudovirale comprend un antigène. En particulier, l'antigène est un auto-antigène. L'antigène peut être exposé à la surface de la particule pseudovirale ou contenu dans la particule pseudovirale. L'antigène peut être associé à la particule pseudo virale par exemple par l'intermédiaire de l'enveloppe, un fragment de l'enveloppe, la protéine de capside, un fragment de la protéine de capside. En particulier, l'antigène peut être fusionné par le domaine N-terminal ou C-terminal de de la protéine de capside ou du fragment de la protéine de capside pour être contenu dans la particule pseudovirale. L'antigène peut également être fusionné au domaine transmembranaire ou du domaine d'ancrage de l'enveloppe ou du fragment d'enveloppe ou au domaine GPI pour être exposé à la surface de la particule pseudovirale.
Dans un autre mode particulier, l'antigène peut être contenu dans la particule pseudovirale par exemple en fusionnant l'antigène à la capside, en particulier au domaine N ou C-terminal de la capside, de préférence au domaine C-terminal de la protéine de capside. L'antigène peut être lié à la protéine de structure directement ou par l'intermédiaire d'un « linker », de préférence une séquence peptidique. Par séquence peptidique, on entend une séquence d'acides aminés qui permet de lier des sous-unités protéiques de telle sorte que la protéine adopte une bonne conformation pour l'activité des sous-unités protéiques. En particulier, la séquence peptidique « linker » est une séquence de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés. Dans un mode préféré, l'antigène peut être contenu à l'intérieur de la particule pseudovirale. Par exemple, pour que l'antigène soit contenu à l'intérieur de la particule, l'antigène peut être fusionné directement ou via une liaison peptidique à la protéine de capside, de préférence au domaine C-terminal de la protéine de capside gag. L'antigène peut être également exposé à la surface de la particule ou contenu dans la particule grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Afin de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène, la particule pseudovirale utilisée dans l'invention comprend, une molécule immunorégulatrice.
Les molécules immunorégulatrices sont capables de moduler la réponse immunitaire, en particulier en modulant les fonctions des cellules présentatrices d'antigènes et/ou les cellules T régulatrices. Dans un mode particulier de l'invention, les molécules immunorégulatrices sont des molécules capables d'augmenter l'activité des cellules T régulatrices (Tregs).
Dans un mode particulier, la molécule immunorégulatrice peut être un récepteur capable de moduler la réponse immunitaire, en particulier, capable d'induire la fonction suppressive des Tregs. A titre d'exemple, ces molécules immunorégulatrices peuvent être dérivées des récepteurs de point de contrôle immunitaire (appelé en anglais « immune-check-point receptors ») tels que PD1 (Programmed Cell Death 1, aussi connu sous le nom de PDCD1 ou CD279), CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, aussi connu sous le nom de CD 152), Tim3 (aussi connu sous le nom de HAVCR2), TIGIT (aussi connu sous le nom de IVSTM3) ou OX40. En particulier, les molécules immunorégulatrices correspondent au domaine extracellulaire des récepteurs, plus particulièrement au domaine du type immunoglobine (appelé en anglais « immunoglobuline-like domain ») des récepteurs de point de contrôle immunitaire tels que par exemple les domaines extracellulaires ou les domaine du type immunoglobine de PD1, CTLA-4, Tim3, TIGIT ou OX40.
La molécule immunorégulatrice peut être également un ligand de récepteur tel que PD1- Ll (Programmed Cell Death ligand 1, aussi connu sous le nom de CD274).
Les molécules immunorégulatrices peuvent être également des cytokines comme par exemple IL-2 qui est requis pour la génération et le maintien des Tregs. Aussi, sur les cellules dendritiques, la neutralisation des molécules de costimulation telles que CD80, CD86 notamment après fixation de CTLA4 peut bloquer l'activation lymphocytaire.
Les molécules immunorégulatrices peuvent exercer leur fonction en modifiant l'orientation des réponses immunitaires notamment vers un profil Thl, Th2, Th3 et ce par exemple pour le traitement des réponses auto-immunes. Dans un mode particulier de l'invention, les molécules immunorégulatrices sont des molécules capables d'activer les TLR (Toll-like receptors). Les molécules capables d'activer les TLR sont par exemple des molécules comprenant des structures conservées dans les pathogènes telles que les flagellines, l'ADN non méthylé CpG ou de l'ARN. Par exemple, l'ARN viral peut stimuler les TLR7 / TLR8 et la flagelline peut stimuler le TLR5 et ainsi favoriser l'orientation des réponses vers un profil Thl .
L'ARN capable d'activer les TLR, utile dans la présente invention, peut être stabilisé contre la dégradation par l'ARNase. En particulier l'ARN viral peut être chimiquement modifié par rapport à de l'ARN naturel. La modification peut consister au remplacement, l'insertion ou la suppression d'un ou plusieurs atomes ou groupe d'atomes. En particulier, l'ARN comprend au moins un nucléotide modifié. L'ARN peut également comprendre une coiffe de un ou plusieurs nucléotides guanosines modifiés ou une queue de plusieurs adénosines. Les molécules d'ARN de la présente invention sont préférentiellement des ARN comprenant entre 2 et 1000 nucléotides, plus préférentiellement entre 8 et 200 nucléotides encore plus préférentiellement entre 15 et 31 nucléotides.
L'ARN peut être de l'ARN à simple ou à double brin. L'ARN utile dans la présente invention est préférentiellement de l'ARN viral. L'ARN viral peut être codant ou non- codant, préférentiellement l'ARN viral est non-codant. En particulier, l'ARN viral non- codant peut être dérivé du cytomégalo virus.
La molécule immunorégulatrice peut être exposée à la surface de la particule pseudovirale ou être contenue dans la particule pseudovirale.
La molécule immunorégulatrice peut être exposée à la surface de la particule pseudovirale par exemple par l'intermédiaire de l'enveloppe, un fragment de l'enveloppe, la protéine de capside, un fragment de la protéine de capside ou du domaine transmembranaire ou d'ancrage d'une protéine. En particulier, la molécule immunorégulatrice peut être fusionnée par le domaine N-terminal ou C-terminal de la protéine de capside ou du fragment de capside de la particule pseudovirale. Dans un mode particulier, pour être exposée à la surface de la particule, la molécule immunorégulatrice est de préférence fusionnée à un domaine transmembranaire ou un domaine d'ancrage d'une protéine, de préférence une protéine d'enveloppe, de préférence une glycoprotéine. La molécule immunorégulatrice peut être liée à la protéine de structure ou au domaine transmembranaire directement ou par l'intermédiaire d'un « linker », de préférence une séquence peptidique. Par séquence peptidique, on entend une séquence d'acides aminés qui permet de lier des sous-unités protéiques de telle sorte que la protéine adopte une bonne conformation pour l'activité des sous-unités protéiques. En particulier, la séquence peptidique « linker » est une séquence de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés. De préférence, la séquence peptidique « linker » est G-G-G-G-S (SEQ ID NO : 5). La molécule immunorégulatrice peut être également exposée à la surface de la particule pseudovirale ou contenue dans la particule grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Dans un mode particulier de l'invention, la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice est exposée à la surface de la particule en liant la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice au domaine transmembranaire de la glycoprotéine du VSV-G (vesicular stomatitis virus) ou en liant la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59. De préférence, afin d'améliorer l'exposition de la molécule immunorégulatrice à la surface de la particule pseudo virale, la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice est liée au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59.
La molécule immunorégulatrice peut être liée de manière covalente ou non, elle peut être liée directement ou par l'intermédiaire d'un « linker » à une protéine virale, de préférence par l'intermédiaire d'une séquence peptique. La molécule immunorégulatrice peut être également liée à la particule pseudovirale grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Dans un exemple de réalisation particulier, il est fourni une particule pseudorétrovirale formée par l'expression d'une protéine Gag fusionnée en C-terminale à un antigène de type auto-antigène, comprenant en outre une glycoprotéine composée du domaine transmembranaire de VSV-G ou d'un domaine d'ancrage de la glycoprotéine CD59 fusionné en N-terminal à une molécule immunorégulatrice telle qu'IL-2, PD-L1 ou au domaine extracellulaire de PD1, ou CTLA-4. Un linker, préférentiellement une séquence peptidique peut être inclus entre les deux parties pour limiter les contraintes stœchio métriques. La particule peut éventuellement contenir à l'intérieur des molécules d'AR non codant, jouant le rôle de ligand de TLR. Les particules pseudovirales peuvent être préparées à partir des méthodes connues de l'art. En particulier, elles peuvent être produites en utilisant des lignées cellulaires d'encapsidation. Ces lignées sont construites in vitro, et expriment l'ensemble des protéines nécessaires à la constitution et à l'encapsidation d'une particule virale. Des lignées cellulaires peuvent être également transfectées de manière transitoire avec les éléments génétiques nécessaires à la constitution de la particule virale. En résumé, la méthode de préparation des particules pseudovirales comprend une étape de culture de lignées cellulaires exprimant les protéines gag et/ou pol et/ou env comme décrit précédemment, et une étape de récupération des particules produites par les cellules. Les particules virales peuvent être purifiées par exemple par centrifugation, gradients, chromatographie. Le surnageant de la cellule peut être également utilisé directement sans étape de purification.
La présente invention concerne également un ou des plasmide(s) capable(s) de produire in situ la particule pseudovirale comme décrite précédemment. Le plasmide comprend une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine virale modifiée de la particule pseudovirale, par exemple une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe et/ou une protéine gag. En particulier, le plasmide comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de structure virale fusionnée avec un antigène. En particulier, le plasmide code pour une capside fusionnée à un antigène. Le plasmide peut également coder pour une protéine de structure virale fusionnée à une molécule immunorégulatrice. En particulier, le plasmide code pour un domaine transmembranaire de l'enveloppe VSV-G ou pour un domaine glycophosphatidylinositol d'ancrage de CD59 fusionnée à une molécule immunorégulatrice telle qu'IL-2, PD-L1 ou au domaine extracellulaire de PD1 ou CTLA-4. Les protéines de structures virales composant la particule pseudo virale peuvent être codées par différents plasmides. Les molécules immunorégulatrices peuvent être également codées par un plasmide différent de celui des protéines de structures. Les plasmides peuvent comprendre également d'autres éléments tels que des marqueurs géniques et/ou l'origine de réplication qui permettent les manipulations in vitro. Traitement des dysfonctionnements du système immunitaire :
La présente invention concerne également la particule pseudovirale comme décrite précédemment ou un ou des plasmide(s) capables de produire in situ la dite particule pseudovirale pour son utilisation dans le traitement de dysfonctionnement immunitaire. Par dysfonctionnement immunitaire, on entend les maladies dues à une réponse inappropriée du système immunitaire.
La maladie auto-immune quant à elle est causée par une réponse inappropriée du système immunitaire à l'encontre de molécules ou d'une combinaison de molécules qui sont normalement présentes dans l'organisme. Ces molécules sont alors appelée auto- antigènes. Des exemples de maladies auto-immunes sont la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, les thyroïdes auto-immunes, la maladie de Crohn, l'arthrite rhumatique, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
Compositions pharmaceutiques et modes d'administration : La présente invention utilise de manière avantageuse une composition pharmaceutique comprenant une particule pseudovirale comme décrite précédemment ou un ou plusieurs plasmide(s) capable(s) de produire in situ la dite particule pseudovirale. La composition pharmaceutique peut comprendre également un excipient pharmaceutique tel que des solutions salines, des tampons, des solutés isotoniques. La composition peut également comprendre des adjuvants ou des agents immunogènes.
En général, la composition comprend une quantité suffisante de particules pseudovirales, entre 103 et 1012 particules, plus particulièrement entre 109 et 1011 particules.
La composition peut être administrée pour prévenir tout dysfonctionnement immunitaire. La dite composition de la présente invention peut être également administrée après l'apparition des symptômes du dysfonctionnement immunitaire.
L'administration de la composition peut se faire suivant les différentes voies connues de l'art qui peut être ajustée en fonction des antigènes, de la pathologie, des effets biologiques, du plasmide ou de la particule. Par exemple, la composition peut être administrée par une injection parentérale, par exemple par une injection sous-cutanée, intradermique, intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale. La composition peut être également administrée par voie orale, par voie sublinguale, par inhalation, par infusion. Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition pharmaceutique ou le médicament est sous une forme solide. Des exemples de formulations solides adaptées à une administration orale incluent, mais ne sont pas limités à, des granules, une poudre, une gélule, un comprimé, une pommade, un gel, une poudre à dissoudre, une pâte, une gomme à mâcher, une capsule souple ou une capsule molle. La présente invention concerne également une méthode pour prévenir, pour traiter ou réduire un dysfonctionnement immunitaire comprenant l'administration à un sujet d'une quantité suffisante d'une particule pseudovirale comme décrite précédemment.
Le sujet est de préférence un mammifère, de préférence un humain. En particulier cette méthode comprend l'administration de la composition comprenant la particule pseudovirale à un sujet.
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Matériel et méthodes
Plasmides
Le plasmide pGag-pol codant pour la capside du MuLV (Murine Leukemia Virus) est obtenu à partir du plasmide pHIT60 (Soneoka Y et al. Nucleic Acids Research. 1995;23(4):628-633). Le promoteur CMV est remplacé par un promoteur minimal CMV comprenant un site de restriction unique (SacII/Xbal) permettant le clonage dans le plasmide d'expression phCMV. pGagGFP code pour une protéine de fusion Gag-GFP sous le contrôle d'un promoteur hCMV. Ce plasmide est obtenu à partir du plasmide EPX145-68 (Garrone, P. et al. Sci. Transi. Med. 3, 94ra71-94ra71 (2011)) en insérant un fragment PCR comprenant un site de restriction MluI entre les sites NruI et Nhel. Le fragment d'ADN synthétisé par PCR et codant pour la GFP comprenant un site MluI dans le domaine 5 ' est inséré dans le site MluI pour donner le plasmide CMV-Gag-GFP.
Le plasmide lentiviral pcppT.CMV-Gag/OVA code pour une protéine de fusion Gag- OVA exprimée sous le contrôle du promoteur cytomégalovirus humain (hCMV) et un gène de résistance à l'ampicilline. La séquence OVA est insérée dans le domaine C- terminal de Gag via le site de restriction unique MluI (position 8689 ; réalisé par Genscript®). pGag-OVA est obtenu à partir de vecteur pcDNA3.1 et code pour la même protéine de fusion que celle exprimée par pcppT. CMV-Gag/OVA sous le contrôle du promoteur hCMV. pGAG-MOG est obtenu par insertion de la séquence codante pour MOG (Myelin oligodendrocyte glycoprotein) dans le vecteur phCMV. La séquence codante pour MOG est obtenue par amplification PCR en utilisant les amorces 5' TGACACGCGTGCCTGTTTGTGGAGCTTCTC 3' (SEQ ID NO : 1) et 5' GCTAGCTCAAAGGGGGTTTCTTAGCT 3 (SEQ ID NO :2). Le produit PCR est ensuite inséré dans le vecteur par clonage aux sites de restrictions d'enzyme MluI et Nhel.
Différents plasmides codant pour différentes formes de CTLA-4 murines recombinantes avec des séquences d'ancrage spécifiques ont été préparés. Le plasmide pCTLA-4WT comprend une séquence codante pour la protéine CTLA-4 sauvage (NCBI Référence Séquence: NM 009843.4) insérée dans le plasmide pIRES (Clontech®) en utilisant le site de restriction Eco RI (position 1102).
Le plasmide pCTLA-4TM code pour le domaine extracellulaire de la protéine murine CTLA-4 (SEQ ID NO : 3) (MACLGLRRYK AQLQLPSRTW PFVALLTLLF IPVFS EAIQV TQPSVVLASS HGVASFPCEY SPSHNTDEVR VTVLRQTNDQ MTEVCATTFT EKNTVGFLDY PFCSGTFNES RVNLTIQGLR AVDTGLYLCK VELMYPPPYF VGMGN GTQIY VIDPEPCPDS D F LLWILVAV SLGLFFYSFL VTAV) liées aux domaines transmembranaires et intracytoplasmiques de la protéine VSV-G (vesicular stomatitis virus-derived G) (SEQ ID NO : 4 : SSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKK QIYTDIEMNRLGK) et séparés du domaine extracellulaire mCTLA-4 par une séquence flexible G-G-G-G-S (SEQ ID NO : 5).
Le plasmide pCTLA-4GPI code pour le domaine extracellulaire de la protéine murine CTLA-4 comprenant le domaine transmembranaire de CD59 (SEQ ID NO : 6 : MRAQRGLILLLLLLAVFCSTAVSLTCYHCF)
Le plasmide PIL-2TM code pour la protéine murine IL-2 (GenBank : AAI 16874) liée au domaine transmembranaire et intracytoplasmique de la protéine VSV-G (SEQ ID NO : 3) par une séquence flexible G-G-G-G-S (SEQ ID NO : 5). Le plasmide pIL2opi code pour la protéine murine IL-2 lié au domaine transmembranaire de CD59 (SEQ ID NO : 6).
Tous les plasmides sont préparés par culture bactérienne en milieu TB et purifiés avec le kit «NucleoBond PC 2000 Endotoxine Free» (Macherey-Nagel).
Lignées cellulaires. Les cellules HEK 293T (CRL-1573, ATCC) sont cultivées à 37°C à 5% C02 dans du milieu DMEM supplémenté avec 2mM de L-glutamine, 100U/mL de pénicilline et streptomycine et 10% de sérum de veau fœtal inactivé (Thermo Fischer Scientific).
Les cellules 293T-GagOVA sont obtenues par infection des cellules HEK 293T avec des particules lentivirales recombinantes GagOVA. Les particules lentivirales sont produites en transfectant les cellules HEK 293T avec un vecteur lentiviral recombinant GagOVA ((psi)pcppT.CMV-Gag/OVA), un plasmide HIV GagPol (pCMV9) et un plasmide codant pour la protéine VSV-g (phCMV-VSVg).
Les lignées cellulaires clonales sont obtenues par sélection à l'ampicilline et par dilution limite. Les clones exprimant l'eGFP ou GagOVA sont triées sur la fluorescence de la GFP ou en utilisant un anticorps anti-OVA (Agro-Bio®) et anti-MuLV Gag (clone R187, CRL-1912 ; ATCC) en cytométrie en flux après perméabilisation des cellules.
Production des particules pseudovirales (VLP) Les VLP non recombinants (VLP ) ou les VLP (VLP ) sont produites dans les cellules 293T ou 293T-GagOVA, respectivement. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175 -cm3 à 15.106 cellules par flasque et co-transfectées au phosphate de calcium 24 h plus tard avec 50 μg de plasmides comprenant pGag-pol. Les VLP ou VLPOVA non recombinants tolérogènes (tVLP, tVLP OVA) sont produites dans les cellules 293T ou 293T-GagOVA, respectivement. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175-cm3 à 15.106 cellules par flasque et co- transfectées au phosphate de calcium 24 h plus tard avec 50 μg de plasmides comprenant pGag-pol avec PCTLA-4TM OU pCTLA-4opi à un ratio de 3: 1 pGag- pol/pCTLA-4 pour les VLP tolérogéniques (tVLP) et un ratio de 1 :3 pGag-pol/pCTLA- 4 pour les tVLP OVA.
Les VLPMOG et tVLPMOG sont produites en utilisant le même protocole avec 50 μg de plasmide pGAG-MOG ou un ratio de 2: 1 pGAG-MOG/ pCTLA-4Gpi respectivement.
Les VLP recombinantes GFP sont produites dans les cellules DD7 exprimant constitutivement GagGFP suivant le protocole décrit ci-dessus.
Les VLP1L2 sont produites dans les cellules 293T. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175-cm3 à 15.106 cellules par flasque et co-transfectées au phosphate de calcium 24 heures plus tard avec 50 μg de plasmides pGag-pol avec ou non PIL2TM OU pIL2opi à un ratio de 2 : 1 pGag-Pol/pIL2. Après 16 ou 18 heures, le milieu est remplacé avec du milieu DMEM-sans sérum de veau fœtal.
Après 48 heures, le surnageant des cellules est prélevé, filtré à travers des membranes de pore de 0,45μιη et concentré afin d'obtenir une solution purifiée de particules pseudorétro virales (rétro VLP). La purification du surnageant filtré s'effectue par centrifugation sur centricons (centricon Plus-70, Millipore), puis par ultracentrifugation à 107 170 g pendant 2 heures à 4°C sur un gradient de sucrose (Beckman rotor SW41). Les VLP sont reprises en PBS IX et leur concentration est déterminée par la méthode BCA (Pierce BCA Protein, Assay Kit, Thermo scientific).
Immunoprécipitation et Western Blot. Pour les expériences d'immunoprécipitation, les échantillons (30 μg des protéines totales) sont incubées avec 1 μg d'anticorps murin anti-CTLA-4 (clone 14D3, eBiosciences) ou 1 μg d'anticorps anti-mIL2 (ebiosciences) à 4°C pendant 30 minutes, puis mélangés avec 10 de billes pré lavées Dynabeads® couplées à des protéines G (Thermo Fischer Scientifîc) pendant une heure. Les complexes billes- VLP sont lavés et les billes sont enlevées en utilisant un tampon glycine (pH = 2,6; Sigma Aldrich) avant l'analyse par Western Blot.
Pour réaliser le Western Blot, les échantillons (10 μg de protéines totales de VLP ou moins pour les protéines recombinantes) sont mélangés avec du tampon d'échantillon LDS et son tampon réducteur puis analysé par électrophorèse dans 4-12% Bis Tris Gel selon les instructions du fournisseur (Thermo Fischer Scientifîc). Les protéines sont ensuite transférées sur des membranes PDVF. L'immuno marquage est réalisé dans du tampon PBS Tween 0,05% avec un anticorps rat anti-souris (clone R187, CRL-1912 cells; ATCC) reconnaissant la capside MuLV p30 Gag, un anticorps polyclonal de lapin anti-OVA (Agro-Bio), et un anticorps polyclonal de lapin anti-MOG (Thermo Fischer Scientifîc).
Des anticorps secondaires biotinylés et la streptavidine-Qdot (Thermo Fischer Scientifîc) sont utilisés pour la marquege secondaire. Le signal est détecté en utilisant le Quantum ST4-3026 (Vilber Lourmat). Souris
Des souris femelles BALB/C (AnNR/j) âgées de 7 semaines (Laboratoires Janvier) sont maintenues dans l'animalerie sous des conditions spécifiques sans pathogène en accord avec la directive de l'Union Européenne relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Tous les protocoles ont été validés par le comité régional d'éthique en matière d'expérimentation animale.
Tests sur les cellules dendritiques spléniques.
Les rates de souris BALB/c sont prélevées et digérées pendant 30 minutes dans du milieu RPMI 10% S VF (Life technologies) avec 0,1 mg/mL de DNAse et Collagenase IV (Sigma Aldrich). Les cellules CD3+, CD 19+ et Ter 119+ sont éliminées par séparation magnétique avec des anticorps biotinylés spécifiques (eBiosciences) et des billes anti-biotine (30 μΙ7 100.10*6 cellules; Miltenyï). Les cellules restantes sont marquées avec des anticorps anti-CDl lc et I-A/I-E puis les cellules CDl lc+ MHC-II high sont triées par cytométrie en flux (FACS-Aria, BD). Les cellules triées sont incubées pendant 24 heures avec du milieu RPMI + S VF 10% + GM-CSF (20 ng/mL ; Miltenyï) +/- 10 μg/mL LPS (Sigma Aldrich) +/- VLPs à différentes concentrations. L'expression de marqueurs d'activation (CD80, CD86, CD40, MHC-II) est analysée par cytométrie en flux et le taux de cytokines sécrétées dans le surnageant de culture est testé par test ELISA. Test d'activation des cellules dendritiques de la moelle osseuse :
Les cellules de moelle osseuse prélevées à partir du tibia et du fémur de souris BALB/c sont cultivées pendant 8 jours dans du milieu RPMI supplémenté avec 2mM L- Glutamine, 100 U/mL pénicilline, 100 μg/mL streptomycine, 10% sérum de veau fœtal inactivé et 20 ng/mL GM-CSF. Tous les 3 jours, le milieu est remplacé. A J8, les cellules dendritiques différenciées de la moelle osseuse sont cultivées pendant 24 heures en présence de VLP, LPS, ou milieu seul comme contrôle négatif. L'expression des marqueurs d'activation (CD80, CD86, CD40, MHC-II) est analysée par cytométrie en flux et le taux de cytokines sécrétées dans le surnageant de culture est testé par test ELISA. Prolifération in vitro des cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène
Les cellules spléniques et les cellules ganglionnaires lymphatiques mésentériques sont prélevées à partir de souris OT-II FOXP3-GFP exprimant la GFP spécifiquement dans les Treg Foxp3+ et un TCR spécifique d'un peptide dérivé de l'OVA présenté par le CMH-II ou dans les souris TCR 2D2 exprimant un TCR spécifique d'un peptide dérivé de MOG présenté par le CMH-II. Les cellules non Treg (Tconv ; TCR+ GFP-) sont enrichies par sélection négative en utilisant les anticorps biotinylés anti-Terl l9, CD19 et CD8 (BD Biosciences) et des microbilles anti-biotine (30μΕ/100.106 cellules ; Miltenyï), puis triées par cytométrie en flux (FACS ARIA, BD). Les cellules sont ensuite marquées avec le marqueur CellTrace Violet (cellules OT-II CTV+) (CTV, Thermo Fischer Scientific). Les cellules spléniques contenant les cellules dendritiques sont irradiées (25 Gy) puis incubées avec le peptide OVA-II323-329 (5μg/mL, Genscript) ou une protéine OVA (200 μg/mL, Sigma Aldrich) pendant 1 ou 4 heures respectivement. Alternativement, les cellules spléniques sont incubées avec un peptide MOG33-55 (90μg/mL Biotechne) pendant 1 heure.
Dans une plaque 96 puits, 105 cellules OT-II CTV+ ou de cellules 2D2 CTV+ sont cultivées dans du milieu RPMI complémenté avec 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL pénicilline, 100 μg/mL streptomycine, 20 ng/mL de GM-CSF (Miltenyi) et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé avec 5.105 de splénocytes pré-incubés avec l'antigène en présence de 1, 5 ou 10 μg/mL de VLP ou tVLP. Après deux et trois jours, la prolifération et l'activation des cellules Tconv CTV+ sont analysées par cytométrie en flux.
Modèle murin de sclérose en plaque
Des souris C57BL / 6 âgées de 6 semaines (Laboratoires Janvier) ont été immunisées par voie sous-cutanée au jour 0 des deux côtés du flanc avec une solution 1 : 1 de 200 μg de MOG 35-55 (Tocris) émulsionnée dans du CFA (Sigma Aldrich) complété avec des mycobactéries (HKMT BD Difco) à une concentration finale de 5 mg / mL. Le même jour et 48 heures après, 200 ng de toxine Pertusis (Enzo Life Sciences) sont injectés aux souris par voie intraveineuse. Le développement de ΓΕΑΕ a été surveillé pendant 30 jours et les symptômes ont été notés tous les deux ou trois jours. Les scores cliniques sont évalués sur une échelle de 0 à 5 comme suit: 0 = aucune anomalie; 1 = faiblesse de la queue ou des membres postérieurs; 2 = faiblesse de la queue et des membres postérieurs; 3 = paralysie des membres postérieurs; 4 = paralysie des membres postérieurs et faiblesse des membres antérieurs; et 5 = moribond. Les données sont rapportées sous forme de score clinique quotidien moyen.
Vaccination tolérogène.
Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 30 μg de tVLP, une fois par jour pendant 10 jours, entre le quinzième et le vingt-cinquième jour. Les souris ont également reçu une injection de PBS (Placebo) ou dAbatacept (CTLA-4-Ig) avec la même quantité de CTLA-4 incluse dans les vaccins tVLP. Test fonctionnel des VLPIL-2
La fonctionnalité des VLPiL2 a été testée sur les cellules CTLL-2 (ATCC® TIB-214™). Les cellules sont cultivées dans du milieu RPMI complémenté avec 2mM de L- glutamine, 100U/mL de pénicilline et streptomycine, 10% de sérum de veau fœtal thermiquement inactivé, 1% de tampon HEPES et 0,1% de 2-mercaptoéthanol (tous provenant de Thermo Fischer Scientific). Des VLPIL-2 (50μ§/ι Ε) ou d'IL-2 humain (Proleukin®, Novartis) aux concentrations voulues sont ajoutées au milieu. Le nombre de cellules et le taux de mortalité sont évalués chaque jour par comptage des cellules au bleu Trypan dans des cellules de Malassez. Cytométrie en flux
Les anticorps utilisés dans les expériences sont listés dans le tableau 1.
Tableau 1 : liste des anticorps utilisés en cytométrie en flux.
Pour les études in vitro, le Live Dead eFluor®780 est ajouté pour exclure les cellules mortes de l'analyse. Toutes les expériences de cytométrie en flux sont réalisées sur le cytomètre BC LSRII et les données sont analysées en utilisant le logiciel FlowJo (Treestar Inc.).
Pour l'analyse en cytométrie en flux des VLP, 20 μg de VLPs sont incubés avec 5 μΐ, de billes de latex aldéhyde/sulfate de 4μηι de diamètre (Thermo Fischer Scientifîc) pendant 15 min à température ambiante. Du PBS est ajouté à un volume final de lmL puis incubé pendant une heure. Les billes sont bloquées dans 20 de sérum de veau fœtal pendant 30 minutes et lavées trois fois, puis incubées avec l'anticorps de surface anti-CD152 ou anti-mIL-2 (eBiosciences) dans du PBS, 2% BSA pendant une heure. Pour les marquages intra-VLP, les billes sont traitées avec du PBS 1% Triton pendant une heure. L'incubation avec l'anticorps primaire (anti-MulV p30, anti-OVA et anti- MOG) et un anticorps secondaire est réalisée dans du PBS 0.1% Triton. Les billes sont ensuite lavées et suspendues dans 200 μΐ, de PBS avant d'être analysées par cytométrie en flux LSRII (Beckton Dickinson).
Test ELISA
Le mCTLA-4 est détecté à la surface des VLP en utilisant la méthode ELISA. Les plaques 96 puits à fond plat (Medisorp, Nunc) sont recouvertes d'anticorps murins anti- CD152 (0,2 μg/mL, clone 14D3, eBioscience) à 4°C toute la nuit. Après lavage des puits, les sites de liaison non spécifiques sont bloqués avec du PBS 1% BSA pendant une heure à température ambiante. 90μί d'échantillon sont ajoutés dans chaque puit avec 10 μΐ^ de tampon de lyse et incubés pendant 2 heures à température ambiante.
Des anticorps mAb anti-CD152 (UC10-4B9, eBioscience), de la streptavidine conjuguées à la peroxydase (Sigma-Aldrich) et du tetramethylbenzidine (TMB, eBioscience) sont ajoutés à température ambiante pendant 10 min pour détecter mCTLA-4. La réaction est arrêtée en ajoutant ΙΟΟμί de HC1 (1M) et la densité optique est mesurée à 450 nm avec une plaque de lecture ELISA automatique (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter). Le tag mCTLA-4-His (Thermo Fischer Scientifîc) est utilisé comme standard.
Le mIL-2 est détecté à la surface des VLP en en utilisant les kits Ready-Set-Go mIL-2 (eBiosciences) selon les instructions du fabricant. Les VLP" sont utilisés comme contrôle négatif. Analyse statistique
L'analyse statistique est réalisée avec GraphPad Prism (logiciel GraphPad) avec le test U de Mann-Whitney avec *p<0,05 représentant une différence statistiquement significative (**p<0,01; ***p<0,001). RESULTATS
1. Validation de l'expression d'OVA et CTLA-4 par les tVLPOVA
L'expression de Gag et d'OVA par les VLP recombinant (VLPOVA) ont été validées par Western Blot. Les VLP" obtenus à partir de WT Gag sont utilisés comme contrôle. Les analyses en Western Blot des surnageants de cellules transfectées témoignent de la formation des rétroVLP vectorisant l'antigène d'intérêt, ici l'ovalbumine (OVA) (Figure 3A).
L'immunoprécipitation par un anticorps anti-CTLA-4 témoigne de l'assemblage des molécules immunorégulatrices (CTLA-4) sur les tVLPOVA (révélées avec un anti-Gag ; Figure 3B). L'expression des différentes formes chimériques de CTLA-4 (WT, TM-VSVG ou avec le domaine d'ancrage GPI) a été comparées dans les cellules transfectées ou sur les VLP par cytométrie en flux. Des cellules non transfectées ou les VLP" ont été utilisés comme contrôle négatif. Après comparaison du niveau d'expression des différentes formes chimériques de CTLA-4 (Figure 3C), il ressort que le système GPI(CD59b) est optimal et sera retenu dans la suite des résultats. Nous avons pu quantifier la présence du domaine CTLA-4 dans nos préparations en utilisant le test ELIS A et la molécule représente entre 8 et 15% des protéines totales mesurées en utilisant la méthode utilisant l'acide Bicinchoninic (BCA) (Figure 3D).
2. Evaluation in vitro de l'effet des tVLPGFP sur l'activation des cellules dendritiques.
Les tVLPGFP ou VLPGFP (sans CTLA4) et les VLP" contrôle ont été mises en contact avec les cellules dendritiques (DC) purifiées sur la base de l'expression du CD1 le et du CMH-IIhl à partir des splénocytes de souris BALB/c (Figure 4A). La captation des tVLPGFP par les cellules dendritiques purifiées est confirmée par la présence de cellules GFP+ après 24h de culture. Les VLP" sont utilisés comme contrôle négatif (Figure 4B). Le phénotype des DC est ensuite analysé 24h après une stimulation par le LPS (ligand du TLR4). Il en ressort que seules les tVLPGFP bloquent de façon significative et dose dépendante l'augmentation d'expression des molécules de costimulation (CD80, CD86) induite par le LPS (Figure 4C-E). De façon intéressante, le niveau d'expression des molécules du CMH-II n'est pas affecté, ne perturbant pas la capacité des DC à présenter l'antigène (Figure 4E). Des résultats similaires ont été observés lorsque les DC sont issues de cellules pro-génitrices de la moelle osseuse (Figure 5A). Une augmentation du niveau d'IL-10 a pu également être détectée dans le milieu en présence des tVLPGFP, témoignant d'une immuno -régulation exercée directement sur les cellules dendritiques (Figure 5B).
3. Evaluation in vitro de l'effet des tVLP" sur l'activation des cellules T spécifiques de l'antigène.
Nous avons évalué si les t VLP" étaient capables de bloquer l'activation des lymphocytes T CD4+CD25" issues de souris OT-II spécifiques de l'antigène (OVA) après mise en contact avec les DC, présentes parmi les splénocytes irradiés et chargés avec la protéine OVA ou le peptide OVA323-339 (Figure 6A). L'analyse de la prolifération des lymphocytes T en « celltrace » violet (CTV®) témoigne d'une bonne activation des lymphocytes T OT-II en présence du peptide OVA323-339 seul ou du peptide plus les VLP" (Figure 6B). En revanche, l'ajout des tVLP" conduit à une suppression importante de l'activation des lymphocytes T avec un effet dose, pouvant atteindre au jour 3 près de 80% de suppression avec une stimulation peptidique (Figure 6C) et 40% de suppression avec la protéine. De façon intéressante, l'action immunorégulatrice des tVLP" est plus efficace comparativement à un traitement Abatacept (hCTLA-4-Ig), mis en quantité équivalente.
4. Effet suppresseur des tVLPMOG sur les cellules effectrices de la sclérose en plaque
Nous avons généré des rétroVLPt vectorisant l'antigène MOG (Figure 7A). L'expression du CTLA4 chimérique (comportant le domaine GPI de CD59b) à la surface des particules et de l'antigène MOG à l'intérieur des particules ont pu être observées par cytométrie de flux (Figure 7B). L'effet régulateur des tVLP - recombinantes a pu être testé par un test de prolifération in vitro avec les cellules T CD4+ 2D2 qui expriment un récepteur TCR spécifique du peptide MOG. Nous avons pu observer que les tVLPMOG bloquent signifîcativement la division des cellules T spécifiques de l'antigène MOG (Figure 7C), y compris après un temps prolongé de culture (Jour 7, Figure 7D). Cette suppression est forte, avec un index de plus de 60 (Figure 7E), et est dose dépendante comme en témoigne la diminution croissante d'expression du marqueur d'activation (CD25) en fonction de la quantité de tVLPMOG mis dans la culture. Ces résultats constituent une première preuve de principe de l'utilisation des VLP tolérogènes pour le contrôle des réponses auto-immunes et de leur potentiel thérapeutique dans la sclérose en plaque.
5. Validation de l'expression d'IL-2 par les VLPIL2
L'expression de Gag et d'IL-2 par les VLP recombinant (VLPIL2) a été validée par Western Blot. Les VLP" obtenus à partir de WT Gag et de l'IL-2 murin sont utilisés comme contrôles. Les analyses en Western Blot des surnageants de cellules transfectées témoignent de la formation des VLP exprimant l'IL-2 (Figure 8A).
La présence d'IL-2 a été quantifiée en utilisant le test ELISA sur les VLP1L2 et les VLP" (Figure 8B). L'expression des différentes formes chimériques de IL-2 (TM-VSVG ou avec le domaine d'ancrage GPI) a été comparée dans les cellules transfectées ou sur les VLP par cytométrie en flux (Figure 8C). Des cellules non transfectées ou les VLP" ont été utilisées comme contrôle négatif. Après comparaison du niveau d'expression des différentes formes chimériques de VLP1L2 (Figure 8C), il ressort que le système GPI(CD59b) est optimal. 6. Effet fonctionnel des VLP1L2
La prolifération cellulaire et le pourcentage de mortalité des cellules CTLL-2 ont été mesurés par bleu Trypan dans des cellules de Malassez en présence d'IL-2 à 25UI/mL, 50UI/mL, deVLPiL2 ou en absence d'IL2 (SS IL-2). La prolifération cellulaire et le pourcentage de mortalité des cellules CTLL-2 en présence de VLP1L2 sont similaires aux résultats obtenus en présence de cytokine IL-2 indiquant que les VLP1L2 permettent la prolifération des cellules CTLL-2 et sont donc fonctionnelles (Figure 9).
7. Effet thérapeutique des tVLPMOG dans un modèle d'EAE
La Figure 10 illustre l'effet thérapeutique des tVLPMOG dans un modèle d'EAE. Les souris ont été traitées à partir de J15, date à laquelle les souris immunisées avec l'antigène MOG développent les symptômes et présentent un début de paralysie des membres. Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 30 μg de tVLP, une fois par jour pendant 10 jours, entre le quinzième et le vingt-cinquième jour. En contrôle, des souris ont reçu une injection de PBS (Placebo) ou d'Abatacept (CTLA-4- Ig) avec une dose identique de CTLA-4. Les souris traitées avec les particules tVLPMOG ont une évolution de la maladie bloquée contrairement aux groupes contrôles. L'effet thérapeutique est durable et maintenu au delà de la période de vaccination, démontrant une induction de tolérance.
Les Figures 11A et 11B montrent qu'une induction de la tolérance par les tVLPs réduit l'infiltration immunitaire du système nerveux central et augmente les Tregs spléniques. Des souris C57B1/6 ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de tVLPs ou PBS (placebo) entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de ΓΕΑΕ. A J29, les rates et moelles épinères/cerveaux ont été prélevées et les cellules immunitaires infiltrantes ont été isolées puis analysées par cytométrie de flux (Figure 11 A, monocytes inflammatoires, Figure 11B, lymphocytes Tregs). Des souris naïves ont été incluses comme contrôle. Les résultats sont présentés en moyennes ± écart-type (n=2 souris / groupe). Nous observons une diminution des monocytes inflammatoires dans le système nerveux central et une augmentation des lymphocytes T régulateurs dans la rate des souris traitées par les tVLP+ comparativement aux souris contrôles. Les différences observées témoignent d'un contrôle de l'inflammation au niveau du cerveau et de la moelle épinière associé à un recrutement des cellules immunorégulatrices (lymphocytes T régulateurs).

Claims

REVENDICATIONS
Particule pseudo virale comprenant un antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule, l'antigène étant un autoantigène.
Particule pseudovirale selon la revendication 1, ladite particule pseudovirale étant une particule rétrovirale synthétique.
Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle la molécule immunorégulatrice est un récepteur de point de contrôle immunitaire, de préférence sélectionné parmi le groupe constitué de CTLA4, PD-1, Tim-3, LAG-3, TIGIT et OX40.
Particule pseudo virale selon la revendication 3, dans laquelle la molécule immunorégulatrice comprend le domaine extracellulaire dudit récepteur.
Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle la molécule immunorégulatrice est sélectionnée parmi le groupe constitué de IL-2, IL- 10 et TGF-béta.
Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle la molécule immunorégulatrice est liée au domaine transmembranaire de la glycoprotéine du vesicular stomatitis virus (VSV-G) ou au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59.
Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 6 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie-autoimmune.
Particule pseudovirale pour une utilisation selon la revendication 7, la maladie auto-immune étant choisie parmi la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis, la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
Particule pseudovirale pour une utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8, ladite particule étant sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant en outre un excipient pharmaceutique.
10. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) comprenant une ou des séquence(s) d'acide nucléique codant pour une ou des protéine(s) virales modifiées de la particule pseudo virale telle que définie à l'une des revendications 1 à 6.
11. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) selon la revendication 10 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie auto-immune. 12. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) pour une utilisation selon la revendication
11, la maladie auto-immune étant choisie parmi la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis, la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
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