CA3078717A1 - Particules pseudo-virales utiles pour traiter des maladies auto-immunes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une particule pseudovirale comprenant un auto-antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à sa surface. L'invention concerne également l'utilisation de la dite particule dans le traitement d'une maladie auto-immune.

Description

Particules pseudo-virales utiles pour traiter des maladies auto-immunes DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne des compositions comprenant des particules pseudovirales utiles pour modifier, réguler ou réprimer une réponse immunitaire, plus particulièrement pour traiter un dysfonctionnement immunitaire tel qu'une maladie auto-immune. Des méthodes pour produire lesdites compositions sont décrites. Cette invention peut être utilisée chez les mammifères, en particulier chez les hommes mais également chez les autres vertébrés.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La prévalence des maladies auto-immunes a considérablement augmenté dans les pays industrialisés au cours des dernières décennies. Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui s'attaque aux constituants .. normaux de l'organisme (auto-antigène).
Aujourd'hui, les traitements proposés contre les maladies auto-immunes reposent sur l'utilisation de médicaments immunosuppresseurs et agissent de façon non-spécifique sur le système immunitaire, avec des conséquences sur sa fonctionnalité et l'efficacité
des réponses anti-infectieuses. Le développement de nouveaux traitements efficaces, durables et spécifiques pour les dysfonctionnements immunitaires reste donc nécessaire.
L'administration d'antigènes qui sont la cible des mécanismes pathologiques, dans une formulation favorable à l'instauration d'une tolérance immunitaire constitue une stratégie d'intérêt.
Des particules pseudovirales, également appelées VLP (virus-like particle), sont utilisées pour la vaccination anti-infectieuse ou anti-tumorale. Les particules pseudovirales offrent l'avantage de pouvoir être facilement modulables et peuvent être utilisées comme plateforme antigénique. Les antigènes ciblés peuvent être ainsi véhiculés à l'intérieur ou à la surface des particules pseudo-virales, favorisant le

2 PCT/FR2018/052676 déclenchement des réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques, mais aussi de masquer les antigènes des facteurs neutralisants ou réagissants (anticorps) lorsqu'ils sont à l'intérieur. De plus, la grande flexibilité de cette plateforme antigénique permet la vectorisation de molécules immunorégulatrices, à l'origine de l'induction de tolérance.
RESUME DE L'INVENTION :
De façon intéressante, les inventeurs ont montré que les particules pseudovirales permettent de bloquer l'activation des cellules présentatrices d'antigènes et l'activation des cellules T et peuvent donc être utilisées pour moduler les réponses immunitaires, .. voire induire une tolérance immunitaire spécifique. En d'autres termes les particules pseudovirales permettent de rendre l'organisme tolérant aux antigènes vectorisés par ces particules pseudovirales dites tolérogènes.
Un premier objet de l'invention est une particule pseudovirale comprenant un ou des antigène(s) et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule. La particule pseudovirale selon l'invention est particulièrement utilisée dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire, de préférence une maladie auto-immune telle que la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
La particule pseudovirale est de préférence sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant en outre un excipient pharmaceutique.
Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un plasmide ou ensemble de plasmide(s) capables de produire in situ une particule pseudovirale telle que définie ici, en particulier pour leur utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire.
LEGENDE DES FIGURES
La Figure 1 illustre la structure des particules pseudovirales VLP sans antigène et sans CTLA-4 (VLP), VLP avec un antigène OVA seul (VLP vA) ou associée au CTLA-4 (tVLP'), VLP sans antigène et exprimant le CTLA-4 à sa surface (tVLP-), et des

3 PCT/FR2018/052676 VLP avec un antigène OVA (VLP vA) co-injecté avec du CTLA-4 soluble (CTLA-4-Ig).
La Figure 2 illustre les constructions utilisées pour former les particules selon l'invention (A) et la structure de la particule pseudovirale tolérogène tVLP
vA (B) où
OVA est l'antigène cible.
La Figure 3 illustre la caractérisation et l'expression des protéines thérapeutiques dans les tVLP vA. A. Validation par Western Blot de l'expression de Gag et d'OVA
dans les particules pseudovirales VLP vA. VLP- sont des particules contrôle sans l'antigène OVA. B. Validation par immunoprécipitation de l'expression de CTLA-4 dans les particules pseudovirales tVLP. C. Comparaison de l'expression de formes chimériques de CTLA-4 (WT, TM-VSV-G, ou domaine d'ancrage GPI) dans les cellules transfectées (haut) ou à la surface des particules pseudovirales (bas) par cytométrie en flux. Les cellules non transfectées ou les VLP- sont utilisés comme contrôle négatif (noire). D. Quantification du domaine CTLA-4 dans les préparations tVLP, tVLP
vA ou VLP - par test ELISA (gauche) et quantification relative de CTLA-4 par rapport aux protéines totales mesurées en utilisant la méthode BCA (droite). Les résultats correspondent aux moyennes SEM (n=4) and représentent 3 expériences indépendantes.
La Figure 4 illustre la captation et les effets des tVLP sur les cellules dendritiques purifiées. A. Schéma expérimental. Les cellules dendritiques purifiées CD11 chi CMH-IIhigh de la rate de souris BALB/c ou les cellules dendritiques issues de la moelle osseuse sont cultivées en présence de VLP -, VLPGFP ou tVLPGFP et stimulées ou non avec du LPS. 24 heures après culture, l'expression des molécules de costimulations et les marqueurs d'activation est analysée par cytométrie en flux. B. La captation des VLPGFP par les cellules dendritiques purifiées est confirmée par la présence de cellules GFP+ après 24h de culture. Les VLP- sont utilisés comme contrôle négatif (noire). (C-E). L'expression des molécules de costimulation et des marqueurs d'activation est analysée par cytométrie en flux sur les cellules dendritiques purifiées après co-culture avec du milieu en présence ou non de 1 ug/mL de LPS et 5, 10 ou 15 iLtg/mL de tVLPGFP. L'expression de CD80, CD86, CD40 et CMH-II est analysée dans les cellules

4 PCT/FR2018/052676 vivantes exprimant CD1 1 c et CMH-II. C. représente les profils de cytométrie de CD80, CD86 dans les cellules dendritiques cultivées dans du milieu de culture seul, en présence de LPS et en présence de LPS et de tVLPGFP (15 iLtg/mL). D.
L'expression des molécules de costimulation est mesurée en utilisant la moyenne géométrique de fluorescence (MFI). E. La modulation d'expression est représentée par le ratio MFI
comparé au milieu de contrôle.
La Figure 5 illustre les effets des tVLP sur les cellules dendritiques issues des précurseurs de la moelle osseuse. A. illustre l'expression CD80, CD86, CD40 et CMH-II analysée par cytométrie en flux sur les cellules dendritiques issues de la moelle osseuse vivantes après co-culture avec du milieu en présence ou non de litg/mL
de LPS
et 5, 10 ou 15 iLtg/mL de tVLPGFP. La modulation d'expression de CD80, CD86, et CMH-II est représentée par le ratio gMFI comparé au milieu de contrôle. B.
Quantification par ELISA de l'IL-10 dans le surnageant de culture des cellules dendritiques après 24 heures de culture dans du milieu seul, en présence de LPS ou en présence de LPS et tVLP.
La Figure 6 illustre le blocage de la prolifération des cellules T antigène spécifiques par les tVLP. A. Schéma expérimental. Les cellules T CD4+ CD25- issues des souris OT-II
sont cultivés deux ou trois jours avec des rates irradiées de souris OT-II
chargées avec un peptide 0VA323-339 ou une protéine OVA. Pour analyser la prolifération, les cellules T CD4+ OT-II sont marquées avec du CellTrace0 Violet. Les cellules T vivantes OT-II CTV+CD4+ co-cultivées pendant 2 jours avec des splénocytes irradiés chargés avec un peptide 0VA323-339 en présence ou non de 10 itg/mL de VLP-, tVLP-, ou une dose équivalente de hCTLA-4 sont analysées par cytométrie en flux. B. Profil de cytométrie des dilutions CTV des cellules T CD4+ CTV + OT-II après deux jours dans différentes conditions de culture. (C-D). Indices de suppression des dilutions CTV des cellules OT-II co-cultivées pendant deux ou trois jours avec les splénocytes mis en contact avec le peptide 0VA323-339 (C) ou la protéine OVA (D). Les résultats correspondent à
la moyenne SEM (n=4) et représentent 3 expériences indépendantes.
La Figure 7 illustre la validation de l'expression de MOG dans les tVLPImG et son effet suppresseur sur les cellules effectrices de la sclérose en plaque. A.
Validation par

5 PCT/FR2018/052676 Western Blot de l'expression de MOG et de Gag dans les particules pseudovirales VLPm G. Les VLP- sont utilisés comme contrôle. B. Validation par cytométrie en flux de l'expression de CTLA-4 dans les particules pseudovirales tVLPm G. Les VLP-sont utilisées comme contrôle négatif C. Blocage de la prolifération des cellules T

spécifiques de MOG par tVLPm G. Profil de cytométrie des dilutions CTV des cellules T CD4+ CTV + 2D2 après sept jours en présence de tVLPImG et VLP- (contrôle).
D.
Cinétique de division des cellules T dans les différentes conditions de culture. E. Indices de suppression et moyennes géométriques des dilutions CTV des cellules 2D2 à 7 jours de culture. Les résultats correspondent à la moyenne SEM.
La Figure 8 illustre la caractérisation et l'expression des protéines thérapeutiques dans les tVLP exprimant IL-2 comme molécule immunorégulatrice. A. Validation par Western Blot de l'expression d'IL-2 et de Gag dans les particules pseudovirales. B.
Quantification de l'IL-2 dans les préparations VLP IL-2+ et IL-2- par test ELISA. C.
Comparaison de l'expression de formes chimériques de l'IL-2 (TM-VSV-G ou domaine d'ancrage GPI) dans les cellules transfectées (haut) ou à la surface des particules pseudovirales (bas) par cytométrie en flux. Les cellules non transfectées ou les VLP
sont utilisés comme contrôle négatif (noire).
La Figure 9 illustre la validation fonctionnelle de l'IL-2 présent à la surface des tVLP.
Les VLP IL-2+ ont été mis en culture (50 ,g/mL) avec les cellules CTLL-2 dépendante de l'IL-2. La prolifération (A) et la survie (B) des cellules ont été évaluées sur une période de 8 jours. En contrôle, de l'IL-2 à 25 ou 50 UI/mL, ou du milieu seul ont été
utilisés.
La Figure 10 montre l'effet thérapeutique des tVLPs sur un modèle murin de sclérose en plaques (souris développant une encéphalite autoimmune expérimentale (EAE)). Les scores cliniques d'EAE chez les souris traitées par une dose quotidienne de vaccin spécifique de l'antigène MOG (tVLP+), Abatacept ou un placebo entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de l'EAE. Les résultats sont présentés en moyennes écart-type (n=5 souris / groupe). *, p<0.005; Mann-Whitney entre tVLP+ et placebo.
La Figure 11 montre qu'une induction de la tolérance par les tVLPs réduit l'infiltration immunitaire du système nerveux central et augmente les Tregs spléniques. Des souris

6 PCT/FR2018/052676 C57B1/6 ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de tVLPs ou PBS
(placebo) entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de l'EAE. A J29, les rates et moelles épinères/cerveaux ont été prélevées et les cellules immunitaires infiltrantes ont été
isolées puis analysées par cytométrie de flux (Figure 11A, monocytes inflammatoires, Figure 11B, lymphocytes Tregs). Des souris naïves ont été incluses comme contrôle.
Les résultats sont présentés en moyennes écart-type (n=2 souris / groupe).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point une méthode pour traiter les dysfonctionnements immunitaires d'un sujet, tels que des maladies auto-immunes, comprenant l'administration de particules pseudovirales contenant un antigène et une molécule immunorégulatrice.
Cette particule pseudovirale contient avantageusement une molécule immunorégulatrice, exposée à sa surface.
La présente invention concerne donc une particule pseudovirale comprenant un antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule, qui permet de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène. La molécule immunorégulatrice est de préférence une molécule qui exerce des fonctions régulatrices et/ou suppressives sur les cellules présentatrices d'antigène, favorisant un recrutement des cellules T
régulatrices.
En particulier, la molécule immunorégulatrice peut être un récepteur de point de contrôle immunitaire (appelé en anglais immune-checkpoint receptor ), plus particulièrement une séquence peptidique comprenant le domaine extracellulaire, plus particulièrement le domaine de type immunoglobine (appelé également en anglais Ig-like domain ) d'un récepteur de point de contrôle immunitaire, de préférence choisi parmi le groupe consistant en: CTLA-4 (pour Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 ), 0X40 (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4)), PD1 (Programmed cell Death 1), Tim3 (aussi connu sous le nom de HAVCR2), LAG-3 et TIGIT (aussi connu sous le nom de IVSTM3). La molécule immunorégulatrice peut être également une cytokine, de préférence choisie parmi le groupe consistant en: IL-2 (Interleukine 2) , IL-10 (Interleukine 10) et TGF-béta. La molécule immunorégulatrice est de préférence fusionnée au domaine transmembranaire

7 PCT/FR2018/052676 et/ou d'ancrage d'une protéine, de préférence d'une glycoprotéine. En particulier la molécule immunorégulatrice est liée au domaine transmembranaire d'une protéine d'enveloppe ou un système d'ancrage glycosylphosphatidylinositol (GPI) pour être exposée à la surface de la particule. La cytokine, qui est de préférence l'interleukine 2, peut être humaine ou d'une autre espèce animale, elle peut être sauvage ou mutante. En particulier il peut s'agir d'une IL-2 humaine modifiée des-alanyl-1, serine-125.
Peuvent être associées des molécules adjuvantes ayant la capacité d'orienter les réponses immunitaires vers un profil cytokinique souhaité. Une molécule capable d'activer les TLR (Toll Like Receptor) telle que de l'ARN viral, de préférence de l'ARN non codant, peut être associée pour renforcer les réponses Thl (Pitoiset F.et al. J.
Virol. 2017 Oct 13 ;91(21)) et ainsi lutter contre les réponses Th2 qui peuvent être parfois associées à des mécanismes pathologiques auto-immuns, tels que dans la pancréatite autoimmun (Pakala et al, J Exp Med. 1997, 186(2): 299-306). Les particules selon l'invention peuvent être également associées à des molécules ou des adjuvants (de type alun) capables d'initier des mécanismes à l'origine des réponses de type Th2.
La particule pseudovirale est de préférence une particule rétrovirale synthétique. En d'autres termes, la particule pseudovirale comprend une protéine rétrovirale de capside et/ou une protéine rétrovirale d'enveloppe.
La présente invention concerne plus particulièrement les particules pseudovirales définies ici, pour une utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire.
Les particules pseudovirales selon l'invention sont utilisées pour le traitement des maladies auto-immunes.
La particule pseudovirale de ladite invention comprend un antigène qui est un antigène du soi également appelé auto-antigène pour une utilisation dans le traitement d'une maladie auto-immune, de préférence la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).

8 PCT/FR2018/052676 Ainsi l'administration de particules pseudovirales comprenant l'auto-antigène permet d'induire une tolérance spécifique à cet antigène en induisant les cellules régulatrices et en supprimant la réponse spécifique et les cellules effectrices.
La présente invention concerne également un ou des plasmide(s) capables de produire in vitro mais aussi in situ des particules pseudovirales. En particulier, on utilise un ou des plasmides codant pour une protéine de capside et/ou une protéine d'enveloppe constituant la particule pseudovirale. La présente invention concerne plus particulièrement les dits plasmides pour une utilisation dans le traitement d'un dysfonctionnement immunitaire.
La particule pseudovirale ou le ou les plasmide(s) capable(s) de produire in situ une particule pseudovirale peuvent être administrés au sujet de préférence par voie mucosale, par exemple par voie orale, sublinguale, intranasale, ou par voie sous-cutanée ou intra-veineuse.
La présente invention utilise une composition pharmaceutique comprenant la particule pseudovirale ou un ou des plasmide(s) capable(s) de produire in situ des particules pseudovirales. Cette composition peut également comprendre un excipient pharmaceutique.
La composition pharmaceutique peut comprendre plusieurs particules pseudovirales ou plusieurs plasmide(s) capables de produire in situ des particules pseudovirales comprenant des antigènes différents et/ou des molécules immunorégulatrices différentes.
Est également décrite ici une méthode de préparation de particules pseudovirales ou de plasmides capables de produire in situ les particules pseudovirales.
Définitions - Le terme antigène désigne une molécule telle qu'une protéine, un polypeptide, un peptide, un lipide, un acide nucléique, un polysaccharide, un épitope capable d'être reconnu par un anticorps ou des cellules du système immunitaire. En particulier l'antigène est capable de déclencher une réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut conduire à une production d'anticorps et/ou à une activation de cellules du système

9 PCT/FR2018/052676 immunitaire. En particulier, l'antigène est une protéine, un polypeptide, un peptide hétérologue de la particule pseudovirale, plus particulièrement une protéine, un polypeptide ou un peptide non-viral. Dans le cadre de la présente invention, l'antigène est une molécule hétérologue vis-à-vis du virus formant la particule. Il s'agit de .. préférence d'une molécule non-virale. Dans l'invention, l'antigène est un antigène du soi également appelé auto-antigène. Par auto-antigène on entend ici un antigène du patient, ciblé par une réponse auto-immune lors d'une rupture de la tolérance.
Le terme comprend aussi les fragments épitopiques des protéines complètes.
- Une maladie auto-immune est causée par une réponse inappropriée du système immunitaire à l'encontre de molécules ou d'une combinaison de molécules qui sont normalement présentes dans l'organisme. Ces molécules sont alors appelées auto-antigènes. Des exemples de maladies auto-immunes sont la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, les thyroïdes auto-immunes, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
De préférence, les réactions allergiques ou les symptômes allergiques (tels que la rhinite, l'asthme allergique, la dermatite, l'urticaire, l'inflammation des sinus ou un choc anaphylactique suite à l'exposition à l'allergène) ne sont pas inclus dans la définition des maladies auto-immunes visées ici.
- Le terme traiter signifie supprimer les symptômes, éliminer les causes des symptômes de manière transitoire ou permanente mais également prévenir ou ralentir l'apparition de symptômes du dysfonctionnement immunitaire.
- Le terme sujet signifie toutes personnes humaines ou animaux non-humains qui sont susceptibles d'être traités par la composition de la présente invention.
En particulier les sujets susceptibles de subir un dysfonctionnement immunitaire, ceux qui ont déjà été sujets à un dysfonctionnement immunitaire, qui ont des prédispositions à un dysfonctionnement immunitaire ou qui présentent des signes de dysfonctionnement immunitaire.

10 PCT/FR2018/052676 - Au sens de la présente invention, l'expression "quantité efficace" (ou "quantité
thérapeutiquement efficace") se réfère à une quantité de particules pseudovirales selon l'invention nécessaire ou suffisante pour, sans causer d'effets secondaires significatifs et défavorables pour le sujet, retarder ou stopper l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, apporter des améliorations, réduire la sévérité ou l'incidence d'un dysfonctionnement immunitaire, ou stopper ou soigner un dysfonctionnement immunitaire. Une quantité efficace peut être administrée avant l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, pour une action prophylactique ou préventive.
De façon alternative ou additionnelle, une quantité efficace peut être administrée après l'apparition d'un dysfonctionnement immunitaire, pour une action thérapeutique.
- Un "excipient" désigne, dans la présente invention, toute substance autre que le principe actif présente dans une composition lui conférant des propriétés de stabilité, de forme (liquide, solide, gélule, etc... suivant le mode 'administration), de goût, de dissolution (par exemple dissolution ciblée dans l'estomac ou le tube digestif), de couleur, etc... Un "excipient pharmaceutiquement acceptable" désigne plus spécifiquement un excipient qui n'induit pas de réaction non-souhaitée lors de son administration à un sujet, de préférence à un humain. Cette définition inclut tous les solvants, milieux de dispersion, enrobages, agents antibactériens ou antifongiques, agents isotoniques et agents permettant de retarder l'absorption du principe actif, etc.
Pour une administration à l'homme, les préparations doivent remplir les conditions de stérilité, de pyrogénicité, de sécurité générale et les standards de pureté
définis par les agences réglementaires, comme le bureau des normes biologiques de la FDA.
- On entend ici, par "ARN ", toute molécule d'acide ribonucléique. Les molécules d'acide ribonucléique peuvent être des ribonucléotides naturels ou modifiés, notamment pour présenter une meilleure résistance aux RNases. La séquence de l'ARN peut comprendre des séquences de stabilisation qui permettent d'augmenter la demi-vie de l'ARN dans le cytosol. Par exemple, les séquences de stabilisation sont des séquences transcrites et non-traduites du gène de la 13-globine.
La présente invention a pour objet une particule pseudovirale comprenant un antigène.
La particule pseudovirale de la présente invention est destinée à réguler de manière

11 PCT/FR2018/052676 durable et spécifique le système immunitaire, en particulier elle permet de dévier le profil immunitaire ou d'induire un mécanisme actif de régulation des réponses auto-immunes. Afin de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène, la particule pseudovirale de l'invention comprend en outre une molécule immunorégulatrice exprimée à la surface de la particule.
Particules pseudovirales utiles dans l'invention :
Les particules pseudovirales sont formées par auto-assemblage d'au moins une protéine de structure d'origine virale telle que la protéine de capside ou la protéine d'enveloppe.
Ces particules imitent la structure et les propriétés antigéniques du virion natif, mais sont incapables de se répliquer. En particulier, les particules pseudovirales sont produites par auto-assemblage de protéines de structure, en particulier des sous-unités constitutives de la capside virale et/ou de l'enveloppe virale (demande de brevet internationale W02002/34893).
Selon l'invention, les particules pseudovirales peuvent être obtenues à partir de virus à
ADN double brin tel que le virus de l'herpès, l'adenovirus, le parvovirus, de virus à
ADN à simple brin, de virus à ARN à double brin tel que les réovirus, de virus à ARN
simple brin à polarité positive, de virus à ARN simple brin à polarité
négative, de rétrovirus. En particulier les particules pseudovirales sont obtenues à partir de l'assemblage de protéines de structure de AAV, d'adénovirus, de VSV, de virus d'herpès.
Dans un cas particulier, les particules pseudovirales peuvent être préparées à
partir de rétrovirus. Il peut s'agir notamment de rétrovirus appartenant à la famille des oncovirus, des lentivirus ou des spumavirus. Dans la famille des oncovirus, on peut citer notamment les oncovirus lents, non porteur d'oncogène, tels que par exemple MoMLV, ALV, BLV, ou MMTV et les oncovirus rapides, tels que RSV par exemple. Dans la famille des lentivirus, on peut citer par exemple HIV, SIV, FIV ou CAEV.
Dans un autre cas particulier, la particule virale selon l'invention comprend une protéine de structure, de préférence une enveloppe dérivée du VSV (vesicular stomatitis virus), plus particulièrement du VSV-G.

12 PCT/FR2018/052676 Les protéines de structure de la dite particule pseudovirale sont des capsides et/ou des enveloppes virales. La capside virale est une structure multiprotéique qui englobe et protège le matériel génétique dans un virus. La capside est formée à partir de copies d'une unique ou de différentes sous-unités protéiques. Certains virus sont entourés d'une enveloppe à double couche lipidique contenant des glycoprotéines. Cette enveloppe permet de moduler le tropisme et l'immunogénicité.
Dans un mode préféré de l'invention, la particule pseudovirale est une particule rétrovirale synthétique. Une particule rétrovirale comprend une protéine d'enveloppe synthétisées à partir d'un gène env, des protéines de capside synthétisées à
partir du gène gag, et des enzymes telles que la reverse transcriptase, des protéases ou une intégrase synthétisée à partir du gène pol, associées à un génome viral constitué de deux copies d'ARN contenant les séquences gag/pol/env. La particule rétrovirale synthétique comprend une protéine d'enveloppe et/ou une protéine de capside. En particulier des enveloppes qui peuvent être utilisées dans la présente invention sont des enveloppes des virus suivants : 4070A, RD114, 10A1, VSV, LCMV, VIH, virus de la rage, ou le GALV. Dans une approche préférée de l'invention, l'enveloppe a un tropisme pour les cellules de mammifères, plus particulièrement, pour les cellules humaines.
Dans un aspect particulier de l'invention, la particule pseudovirale ne comprend pas de protéine d'enveloppe.
En particulier, la particule pseudovirale comprend la protéine de capside gag du MoMLV capables de s'auto-assembler en particules pseudovirales.
Les particules pseudovirales peuvent comprendre des protéines virales modifiées. Ces protéines peuvent être modifiées entre autres par criblage de banque, par modification chimique ou par modification génétique de la séquence de la protéine virale naturelle.
Par exemple, la protéine virale peut être modifiée par substitution, addition ou délétion d'acides aminés. Les protéines virales peuvent également être liées de manière covalente ou non à l'antigène et/ou la molécule immunorégulatrice par modification génique de la séquence de la protéine virale ou par liaison chimique. Par exemple, la protéine virale modifiée peut comprendre au moins une partie de la protéine virale fusionnée à l'antigène ou à la molécule immunorégulatrice.

13 PCT/FR2018/052676 Dans la présente invention, la particule pseudovirale comprend un antigène. En particulier, l'antigène est un auto-antigène. L'antigène peut être exposé à la surface de la particule pseudovirale ou contenu dans la particule pseudovirale.
L'antigène peut être associé à la particule pseudovirale par exemple par l'intermédiaire de l'enveloppe, un fragment de l'enveloppe, la protéine de capside, un fragment de la protéine de capside.
En particulier, l'antigène peut être fusionné par le domaine N-terminal ou C-terminal de de la protéine de capside ou du fragment de la protéine de capside pour être contenu dans la particule pseudovirale. L'antigène peut également être fusionné au domaine transmembranaire ou du domaine d'ancrage de l'enveloppe ou du fragment d'enveloppe ou au domaine GPI pour être exposé à la surface de la particule pseudovirale.
Dans un autre mode particulier, l'antigène peut être contenu dans la particule pseudovirale par exemple en fusionnant l'antigène à la capside, en particulier au domaine N ou C-terminal de la capside, de préférence au domaine C-terminal de la protéine de capside. L'antigène peut être lié à la protéine de structure directement ou par l'intermédiaire d'un linker , de préférence une séquence peptidique.
Par séquence peptidique, on entend une séquence d'acides aminés qui permet de lier des sous-unités protéiques de telle sorte que la protéine adopte une bonne conformation pour l'activité
des sous-unités protéiques. En particulier, la séquence peptidique linker est une séquence de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés.
Dans un mode préféré, l'antigène peut être contenu à l'intérieur de la particule pseudovirale. Par exemple, pour que l'antigène soit contenu à l'intérieur de la particule, l'antigène peut être fusionné directement ou via une liaison peptidique à la protéine de capside, de préférence au domaine C-terminal de la protéine de capside gag.
L'antigène peut être également exposé à la surface de la particule ou contenu dans la particule grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Afin de favoriser la tolérance spécifique de l'antigène, la particule pseudovirale utilisée dans l'invention comprend, une molécule immunorégulatrice.
Les molécules immunorégulatrices sont capables de moduler la réponse immunitaire, en particulier en modulant les fonctions des cellules présentatrices d'antigènes et/ou les cellules T régulatrices. Dans un mode particulier de l'invention, les molécules

14 PCT/FR2018/052676 immunorégulatrices sont des molécules capables d'augmenter l'activité des cellules T
régulatrices (Tregs).
Dans un mode particulier, la molécule immunorégulatrice peut être un récepteur capable de moduler la réponse immunitaire, en particulier, capable d'induire la fonction .. suppressive des Tregs. A titre d'exemple, ces molécules immunorégulatrices peuvent être dérivées des récepteurs de point de contrôle immunitaire (appelé en anglais immune-check-point receptors ) tels que PD1 (Programmed Cell Death 1, aussi connu sous le nom de PDCD1 ou CD279), CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, aussi connu sous le nom de CD152), Tim3 (aussi connu sous le nom de HAVCR2), .. TIGIT (aussi connu sous le nom de IVSTM3) ou 0X40. En particulier, les molécules immunorégulatrices correspondent au domaine extracellulaire des récepteurs, plus particulièrement au domaine du type immunoglobine (appelé en anglais immunoglobuline-like domain ) des récepteurs de point de contrôle immunitaire tels que par exemple les domaines extracellulaires ou les domaine du type immunoglobine de PD1, CTLA-4, Tim3, TIGIT ou 0X40.
La molécule immunorégulatrice peut être également un ligand de récepteur tel que PD1-Ll (Programmed Cell Death ligand 1, aussi connu sous le nom de CD274).
Les molécules immunorégulatrices peuvent être également des cytokines comme par exemple IL-2 qui est requis pour la génération et le maintien des Tregs.
Aussi, sur les cellules dendritiques, la neutralisation des molécules de costimulation telles que CD80, CD86 notamment après fixation de CTLA4 peut bloquer l'activation lymphocytaire.
Les molécules immunorégulatrices peuvent exercer leur fonction en modifiant l'orientation des réponses immunitaires notamment vers un profil Thl, Th2, Th3 et ce .. par exemple pour le traitement des réponses auto-immunes. Dans un mode particulier de l'invention, les molécules immunorégulatrices sont des molécules capables d'activer les TLR (Toll-like receptors). Les molécules capables d'activer les TLR sont par exemple des molécules comprenant des structures conservées dans les pathogènes telles que les flagellines, l'ADN non méthylé CpG ou de l'ARN. Par exemple, l'ARN viral peut

15 PCT/FR2018/052676 stimuler les TLR7 / TLR8 et la flagelline peut stimuler le TLR5 et ainsi favoriser l'orientation des réponses vers un profil Thl.
L'ARN capable d'activer les TLR, utile dans la présente invention, peut être stabilisé
contre la dégradation par l'ARNase. En particulier l'ARN viral peut être chimiquement modifié par rapport à de l'ARN naturel. La modification peut consister au remplacement, l'insertion ou la suppression d'un ou plusieurs atomes ou groupe d'atomes. En particulier, l'ARN comprend au moins un nucléotide modifié. L'ARN

peut également comprendre une coiffe de un ou plusieurs nucléotides guanosines modifiés ou une queue de plusieurs adénosines. Les molécules d'ARN de la présente invention sont préférentiellement des ARN comprenant entre 2 et 1000 nucléotides, plus préférentiellement entre 8 et 200 nucléotides encore plus préférentiellement entre 15 et 31 nucléotides.
L'ARN peut être de l'ARN à simple ou à double brin. L'ARN utile dans la présente invention est préférentiellement de l'ARN viral. L'ARN viral peut être codant ou non-codant, préférentiellement l'ARN viral est non-codant. En particulier, l'ARN
viral non-codant peut être dérivé du cytomégalovirus.
La molécule immunorégulatrice peut être exposée à la surface de la particule pseudovirale ou être contenue dans la particule pseudovirale.
La molécule immunorégulatrice peut être exposée à la surface de la particule pseudovirale par exemple par l'intermédiaire de l'enveloppe, un fragment de l'enveloppe, la protéine de capside, un fragment de la protéine de capside ou du domaine transmembranaire ou d'ancrage d'une protéine. En particulier, la molécule immunorégulatrice peut être fusionnée par le domaine N-terminal ou C-terminal de la protéine de capside ou du fragment de capside de la particule pseudovirale.
Dans un mode particulier, pour être exposée à la surface de la particule, la molécule immunorégulatrice est de préférence fusionnée à un domaine transmembranaire ou un domaine d'ancrage d'une protéine, de préférence une protéine d'enveloppe, de préférence une glycoprotéine. La molécule immunorégulatrice peut être liée à
la protéine de structure ou au domaine transmembranaire directement ou par l'intermédiaire d'un linker , de préférence une séquence peptidique. Par séquence

16 PCT/FR2018/052676 peptidique, on entend une séquence d'acides aminés qui permet de lier des sous-unités protéiques de telle sorte que la protéine adopte une bonne conformation pour l'activité
des sous-unités protéiques. En particulier, la séquence peptidique linker est une séquence de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés. De préférence, la séquence peptidique linker est G-G-G-G-S (SEQ ID NO : 5). La molécule immunorégulatrice peut être également exposée à la surface de la particule pseudovirale ou contenue dans la particule grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Dans un mode particulier de l'invention, la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice est exposée à la surface de la particule en liant la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice au domaine transmembranaire de la glycoprotéine du VSV-G
(vesicular stomatitis virus) ou en liant la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59. De préférence, afin d'améliorer l'exposition de la molécule immunorégulatrice à la surface de la particule pseudovirale, la molécule immunorégulatrice ou le domaine extracellulaire de la molécule immunorégulatrice est liée au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59.
La molécule immunorégulatrice peut être liée de manière covalente ou non, elle peut être liée directement ou par l'intermédiaire d'un linker à une protéine virale, de préférence par l'intermédiaire d'une séquence peptique. La molécule immunorégulatrice peut être également liée à la particule pseudovirale grâce à une réaction chimique ou enzymatique.
Dans un exemple de réalisation particulier, il est fourni une particule pseudorétrovirale formée par l'expression d'une protéine Gag fusionnée en C-terminale à un antigène de type auto-antigène, comprenant en outre une glycoprotéine composée du domaine transmembranaire de VSV-G ou d'un domaine d'ancrage de la glycoprotéine CD59 fusionné en N-terminal à une molécule immunorégulatrice telle qu'IL-2, PD-L1 ou au domaine extracellulaire de PD1, ou CTLA-4. Un linker, préférentiellement une séquence peptidique peut être inclus entre les deux parties pour limiter les contraintes stoechiométriques. La particule peut éventuellement contenir à l'intérieur des molécules

17 PCT/FR2018/052676 d'ARN non codant, jouant le rôle de ligand de TLR. Les particules pseudovirales peuvent être préparées à partir des méthodes connues de l'art. En particulier, elles peuvent être produites en utilisant des lignées cellulaires d'encapsidation.
Ces lignées sont construites in vitro, et expriment l'ensemble des protéines nécessaires à
la constitution et à l'encapsidation d'une particule virale. Des lignées cellulaires peuvent être également transfectées de manière transitoire avec les éléments génétiques nécessaires à la constitution de la particule virale. En résumé, la méthode de préparation des particules pseudovirales comprend une étape de culture de lignées cellulaires exprimant les protéines gag et/ou pol et/ou env comme décrit précédemment, et une étape de récupération des particules produites par les cellules. Les particules virales peuvent être purifiées par exemple par centrifugation, gradients, chromatographie. Le surnageant de la cellule peut être également utilisé directement sans étape de purification.
La présente invention concerne également un ou des plasmide(s) capable(s) de produire in situ la particule pseudovirale comme décrite précédemment. Le plasmide comprend une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine virale modifiée de la particule pseudovirale, par exemple une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe et/ou une protéine gag. En particulier, le plasmide comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de structure virale fusionnée avec un antigène. En particulier, le plasmide code pour une capside fusionnée à un antigène. Le plasmide peut également coder pour une protéine de structure virale fusionnée à une molécule immunorégulatrice. En particulier, le plasmide code pour un domaine transmembranaire de l'enveloppe VSV-G ou pour un domaine glycophosphatidylino sitol d'ancrage de CD 5 9 fusionnée à une molécule immunorégulatrice telle qu'IL-2, PD-L1 ou au domaine extracellulaire de PD1 ou CTLA-4. Les protéines de structures virales composant la particule pseudovirale peuvent être codées par différents plasmides. Les molécules immunorégulatrices peuvent être également codées par un plasmide différent de celui des protéines de structures. Les plasmides peuvent comprendre également d'autres éléments tels que des marqueurs géniques et/ou l'origine de réplication qui permettent les manipulations in vitro.

18 PCT/FR2018/052676 Traitement des dysfonctionnements du système immunitaire .=
La présente invention concerne également la particule pseudovirale comme décrite précédemment ou un ou des plasmide(s) capables de produire in situ la dite particule pseudovirale pour son utilisation dans le traitement de dysfonctionnement immunitaire.
Par dysfonctionnement immunitaire, on entend les maladies dues à une réponse inappropriée du système immunitaire.
La maladie auto-immune quant à elle est causée par une réponse inappropriée du système immunitaire à l'encontre de molécules ou d'une combinaison de molécules qui sont normalement présentes dans l'organisme. Ces molécules sont alors appelée auto-antigènes. Des exemples de maladies auto-immunes sont la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, les thyroïdes auto-immunes, la maladie de Crohn, l'arthrite rhumatique, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis ou la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).
Compositions pharmaceutiques et modes d'administration.
La présente invention utilise de manière avantageuse une composition pharmaceutique comprenant une particule pseudovirale comme décrite précédemment ou un ou plusieurs plasmide(s) capable(s) de produire in situ la dite particule pseudovirale. La composition pharmaceutique peut comprendre également un excipient pharmaceutique tel que des solutions salines, des tampons, des solutés isotoniques. La composition peut également comprendre des adjuvants ou des agents immunogènes.
En général, la composition comprend une quantité suffisante de particules pseudovirales, entre 103 et r12 u particules, plus particulièrement entre 109 et 1011 particules.
La composition peut être administrée pour prévenir tout dysfonctionnement immunitaire. La dite composition de la présente invention peut être également administrée après l'apparition des symptômes du dysfonctionnement immunitaire.
L'administration de la composition peut se faire suivant les différentes voies connues de l'art qui peut être ajustée en fonction des antigènes, de la pathologie, des effets biologiques, du plasmide ou de la particule. Par exemple, la composition peut être

19 PCT/FR2018/052676 administrée par une injection parentérale, par exemple par une injection sous-cutanée, intradermique, intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale. La composition peut être également administrée par voie orale, par voie sublinguale, par inhalation, par infusion.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition pharmaceutique ou le médicament est sous une forme solide. Des exemples de formulations solides adaptées à
une administration orale incluent, mais ne sont pas limités à, des granules, une poudre, une gélule, un comprimé, une pommade, un gel, une poudre à dissoudre, une pâte, une gomme à mâcher, une capsule souple ou une capsule molle.
La présente invention concerne également une méthode pour prévenir, pour traiter ou réduire un dysfonctionnement immunitaire comprenant l'administration à un sujet d'une quantité suffisante d'une particule pseudovirale comme décrite précédemment.
Le sujet est de préférence un mammifère, de préférence un humain. En particulier cette méthode comprend l'administration de la composition comprenant la particule pseudovirale à un sujet.
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Matériel et méthodes Plasmides Le plasmide pGag-pol codant pour la capside du MuLV (Murine Leukemia Virus) est obtenu à partir du plasmide pHIT60 (Soneoka Y et al. Nucleic Acids Research.
1995;23(4):628-633). Le promoteur CMV est remplacé par un promoteur minimal CMV comprenant un site de restriction unique (SacII/Xbal) permettant le clonage dans le plasmide d'expression phCMV.
pGagGFP code pour une protéine de fusion Gag-GFP sous le contrôle d'un promoteur hCMV. Ce plasmide est obtenu à partir du plasmide EPX145-68 (Garrone, P. et al. Sci.
Transl. Med. 3, 94ra71-94ra71 (2011)) en insérant un fragment PCR comprenant un site de restriction MluI entre les sites NruI et NheI. Le fragment d'ADN synthétisé
par PCR

20 PCT/FR2018/052676 et codant pour la GFP comprenant un site MluI dans le domaine 5' est inséré
dans le site MluI pour donner le plasmide CMV-Gag-GFP.
Le plasmide lentiviral pcppT.CMV-Gag/OVA code pour une protéine de fusion Gag-OVA exprimée sous le contrôle du promoteur cytomégalovirus humain (hCMV) et un gène de résistance à l'ampicilline. La séquence OVA est insérée dans le domaine C-terminal de Gag via le site de restriction unique MluI (position 8689; réalisé
par Genscript0).
pGag-OVA est obtenu à partir de vecteur pcDNA3.1 et code pour la même protéine de fusion que celle exprimée par pcppT. CMV-Gag/OVA sous le contrôle du promoteur hCMV.
pGAG-MOG est obtenu par insertion de la séquence codante pour MOG (Myelin oligodendrocyte glycoprotein) dans le vecteur phCMV. La séquence codante pour MOG
est obtenue par amplification PCR en utilisant les amorces 5' TGACACGCGTGCCTGTTTGTGGAGCTTCTC 3' (SEQ ID NO: 1) et 5' GCTAGCTCAAAGGGGGTTTCTTAGCT 3 (SEQ ID NO :2). Le produit PCR est ensuite inséré dans le vecteur par clonage aux sites de restrictions d'enzyme M/u/ et NheI.
Différents plasmides codant pour différentes formes de CTLA-4 murines recombinantes avec des séquences d'ancrage spécifiques ont été préparés.
Le plasmide pCTLA-4WT comprend une séquence codante pour la protéine CTLA-4 sauvage (NCBI Reference Sequence: NM 009843.4) insérée dans le plasmide pIRES
(Clontech0) en utilisant le site de restriction EcoRI (position 1102).
Le plasmide pCTLA-4TM code pour le domaine extracellulaire de la protéine murine CTLA-4 (SEQ ID NO : 3) (MACLGLRRYK AQLQLPSRTW PFVALLTLLF IPVFS
EAIQV TQPSVVLASS HGVASFPCEY SPSHNTDEVR VTVLRQTNDQ
MTEVCATTFT EKNTVGFLDY PFCSGTFNES RVNLTIQGLR AVDTGLYLCK
VELMYPPPYF VGMGN GTQIY VIDPEPCPDS D F LLWILVAV SLGLFFYSFL
VTAV) liées aux domaines transmembranaires et intracytoplasmiques de la protéine VSV-G (vesicular stomatitis virus-derived G) (SEQ ID NO: 4:

21 PCT/FR2018/052676 SSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK) et séparés du domaine extracellulaire mCTLA-4 par une séquence flexible G-G-G-G-S (SEQ ID
NO:
5).
Le plasmide pCTLA-4GPI code pour le domaine extracellulaire de la protéine murine CTLA-4 comprenant le domaine transmembranaire de CD59 (SEQ ID NO: 6:
MRAQRGLILLLLLLAVFCSTAVSLTCYHCF) Le plasmide pIL-2TM code pour la protéine murine IL-2 (GenBank : AAI16874) liée au domaine transmembranaire et intracytoplasmique de la protéine VSV-G (SEQ ID
NO:
3) par une séquence flexible G-G-G-G-S (SEQ ID NO : 5).
Le plasmide pIL2Gpi code pour la protéine murine IL-2 lié au domaine transmembranaire de CD59 (SEQ ID NO : 6).
Tous les plasmides sont préparés par culture bactérienne en milieu TB et purifiés avec le kit NucleoBond PC 2000 Endotoxine Free (Macherey-Nagel).
Lignées cellulaires.
Les cellules HEK 293T (CRL-1573, ATCC) sont cultivées à 37 C à 5% CO2 dans du milieu DMEM supplémenté avec 2mM de L-glutamine, 100U/mL de pénicilline et streptomycine et 10% de sérum de veau foetal inactivé (Thermo Fischer Scientific).
Les cellules 293T-GagOVA sont obtenues par infection des cellules HEK 293T
avec des particules lentivirales recombinantes GagOVA. Les particules lentivirales sont produites en transfectant les cellules HEK 293T avec un vecteur lentiviral recombinant GagOVA ((psi)pcppT.CMV-Gag/OVA), un plasmide HIV GagPol (pCMV9) et un plasmide codant pour la protéine VSV-g (phCMV-VSVg).
Les lignées cellulaires clonales sont obtenues par sélection à l'ampicilline et par dilution limite. Les clones exprimant l'eGFP ou GagOVA sont triées sur la fluorescence de la GFP ou en utilisant un anticorps anti-OVA (Agro-Bio0) et anti-MuLV Gag (clone R187, CRL-1912 ; ATCC) en cytométrie en flux après perméabilisation des cellules.
Production des particules pseudovirales (VLP)

22 PCT/FR2018/052676 Les VLP non recombinants (VLP-) ou les VLP vA (VLP vA) sont produites dans les cellules 293T ou 293T-GagOVA, respectivement. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175-cm3 à 15.106 cellules par flasque et co-transfectées au phosphate de calcium 24 h plus tard avec 50 itg de plasmides comprenant pGag-pol.
Les VLP ou VLP vA non recombinants tolérogènes (tVLP, tVLP vA) sont produites dans les cellules 293T ou 293T-GagOVA, respectivement. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175-cm3 à 15.106 cellules par flasque et co-transfectées au phosphate de calcium 24 h plus tard avec 50 itg de plasmides comprenant pGag-pol avec pCTLA-4Tm ou pCTLA-4Gp1 à un ratio de 3:1 pGag-pol/pCTLA-4 pour les VLP tolérogéniques (tVLP) et un ratio de 1:3 pGag-pol/pCTLA-4 pour les tVLP OVA.
Les VLPImG et tVLPImG sont produites en utilisant le même protocole avec 50 itg de plasmide pGAG-MOG ou un ratio de 2:1 pGAG-MOG/ pCTLA-4Gp1 respectivement.
Les VLP recombinantes GFP sont produites dans les cellules DD7 exprimant constitutivement GagGFP suivant le protocole décrit ci-dessus.
Les VLPIL2 sont produites dans les cellules 293T. Les cellules sont ensemencées dans des flasques de culture 175-cm3 à 15.106 cellules par flasque et co-transfectées au phosphate de calcium 24 heures plus tard avec 50 itg de plasmides pGag-pol avec ou non pIL2TM ou pIL2Gpi à un ratio de 2 :1 pGag-Pol/pIL2.
Après 16 ou 18 heures, le milieu est remplacé avec du milieu DMEM-sans sérum de veau foetal.
Après 48 heures, le surnageant des cellules est prélevé, filtré à travers des membranes de pore de 0,45itm et concentré afin d'obtenir une solution purifiée de particules pseudorétrovirales (rétro VLP). La purification du surnageant filtré
s'effectue par centrifugation sur centricons (centricon Plus-70, Millipore), puis par ultracentrifugation à 107 170 g pendant 2 heures à 4 C sur un gradient de sucrose (Beckman rotor SW41).
Les VLP sont reprises en PBS 1X et leur concentration est déterminée par la méthode BCA (Pierce BCA Protein, Assay Kit, Thermo scientific).
Immunoprécipitation et Western Blot.

23 PCT/FR2018/052676 Pour les expériences d'immunoprécipitation, les échantillons (30 tg des protéines totales) sont incubées avec 1 tg d'anticorps murin anti-CTLA-4 (clone 14D3, eBiosciences) ou 1 tg d'anticorps anti-mIL2 (ebiosciences) à 4 C pendant 30 minutes, puis mélangés avec 10 L de billes prélavées Dynabeads0 couplées à des protéines G
(Thermo Fischer Scientific) pendant une heure. Les complexes billes-VLP sont lavés et les billes sont enlevées en utilisant un tampon glycine (pH = 2,6; Sigma Aldrich) avant l'analyse par Western Blot.
Pour réaliser le Western Blot, les échantillons (10 tg de protéines totales de VLP ou moins pour les protéines recombinantes) sont mélangés avec du tampon d'échantillon .. LDS et son tampon réducteur puis analysé par électrophorèse dans 4-12% Bis Tris Gel selon les instructions du fournisseur (Thermo Fischer Scientific). Les protéines sont ensuite transférées sur des membranes PDVF. L'immunomarquage est réalisé dans du tampon PBS Tween 0,05% avec un anticorps rat anti-souris (clone R187, CRL-1912 cells; ATCC) reconnaissant la capside MuLV p30 Gag, un anticorps polyclonal de lapin anti-OVA (Agro-Bio), et un anticorps polyclonal de lapin anti-MOG (Thermo Fischer Scientific).
Des anticorps secondaires biotinylés et la streptavidine-Qdot (Thermo Fischer Scientific) sont utilisés pour la marquege secondaire. Le signal est détecté
en utilisant le Quantum 5T4-3 026 (Vilber Lourmat).
Souris Des souris femelles BALB/C (AnNR/j) âgées de 7 semaines (Laboratoires Janvier) sont maintenues dans l'animalerie sous des conditions spécifiques sans pathogène en accord avec la directive de l'Union Européenne relative à la protection des animaux utilisés à
des fins scientifiques. Tous les protocoles ont été validés par le comité
régional d'éthique en matière d'expérimentation animale.
Tests sur les cellules dendritiques spléniques.
Les rates de souris BALB/c sont prélevées et digérées pendant 30 minutes dans du milieu RPMI 10% SVF (Life technologies) avec 0,1 mg/mL de DNAse et Collagenase IV (Sigma Aldrich). Les cellules CD3+, CD19+ et Ter119+ sont éliminées par

24 PCT/FR2018/052676 séparation magnétique avec des anticorps biotinylés spécifiques (eBiosciences) et des billes anti-biotine (30 lut/ 100.10*6 cellules; Miltenyi). Les cellules restantes sont marquées avec des anticorps anti-CD1 1 c et I-Ail-E puis les cellules CD11c+
MHC-II
high sont triées par cytométrie en flux (FACS-Aria, BD). Les cellules triées sont incubées pendant 24 heures avec du milieu RPMI + SVF 10% + GM-CSF (20 ng/mL ;
Miltenyi) +/- 10 iag/mL LPS (Sigma Aldrich) +/- VLPs à différentes concentrations.
L'expression de marqueurs d'activation (CD80, CD86, CD40, MHC-II) est analysée par cytométrie en flux et le taux de cytokines sécrétées dans le surnageant de culture est testé par test ELISA.
Test d'activation des cellules dendritiques de la moelle osseuse :
Les cellules de moelle osseuse prélevées à partir du tibia et du fémur de souris BALB/c sont cultivées pendant 8 jours dans du milieu RPMI supplémenté avec 2mM L-Glutamine, 100 U/mL penicilline, 100 iag/mL streptomycine, 10% serum de veau foetal inactivé et 20 ng/mL GM-CSF. Tous les 3 jours, le milieu est remplacé. A J8, les cellules dendritiques différenciées de la moelle osseuse sont cultivées pendant 24 heures en présence de VLP, LPS, ou milieu seul comme contrôle négatif. L'expression des marqueurs d'activation (CD80, CD86, CD40, MHC-II) est analysée par cytométrie en flux et le taux de cytokines sécrétées dans le surnageant de culture est testé
par test ELISA.
Prolifération in vitro des cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène Les cellules spléniques et les cellules ganglionnaires lymphatiques mésentériques sont prélevées à partir de souris OT-II FOXP3-GFP exprimant la GFP spécifiquement dans les Treg Foxp3+ et un TCR spécifique d'un peptide dérivé de l'OVA présenté par le CMH-II ou dans les souris TCR 2D2 exprimant un TCR spécifique d'un peptide dérivé
de MOG présenté par le CMH-II. Les cellules non Treg (Tconv ; TCR+ GFP-) sont enrichies par sélection négative en utilisant les anticorps biotinylés anti-Ter119, CD19 et CD8 (BD Biosciences) et des microbilles anti-biotine (3041100.106 cellules ;
Miltenyi), puis triées par cytométrie en flux (FACS ARIA, BD). Les cellules sont ensuite marquées avec le marqueur CellTrace Violet (cellules OT-II CTV+) (CTV, Thermo Fischer Scientific).

25 PCT/FR2018/052676 Les cellules spléniques contenant les cellules dendritiques sont irradiées (25Gy) puis incubées avec le peptide OVA-II323-329 (5 ,g/mL, Genscript) ou une protéine OVA (200 iLtg/mL, Sigma Aldrich) pendant 1 ou 4 heures respectivement. Alternativement, les cellules spléniques sont incubées avec un peptide M0G33_55 (90 ,g/mL
Biotechne) pendant 1 heure.
Dans une plaque 96 puits, 105 cellules OT-II CTV+ ou de cellules 2D2 CTV+ sont cultivées dans du milieu RPMI complémenté avec 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL
penicilline, 100 iLtg/mL streptomycine, 20 ng/mL de GM-CSF (Miltenyi) et 10 %
de sérum de veau foetal inactivé avec 5.105 de splénocytes pré-incubés avec l'antigène en présence de 1, 5 ou 10 iLtg/mL de VLP ou tVLP. Après deux et trois jours, la prolifération et l'activation des cellules Tconv CTV+ sont analysées par cytométrie en flux.
Modèle murin de sclérose en plaque Des souris C57BL / 6 âgées de 6 semaines (Laboratoires Janvier) ont été
immunisées par voie sous-cutanée au jour 0 des deux côtés du flanc avec une solution 1: 1 de 200 i_tg de MOG 35-55 (Tocris) émulsionnée dans du CFA (Sigma Aldrich) complété avec des mycobactéries (HKMT BD Difco) à une concentration finale de 5 mg / mL. Le même jour et 48 heures après, 200 ng de toxine Pertusis (Enzo Life Sciences) sont injectés aux souris par voie intraveineuse. Le développement de l'EAE a été surveillé
pendant 30 jours et les symptômes ont été notés tous les deux ou trois jours. Les scores cliniques sont évalués sur une échelle de 0 à 5 comme suit: 0 = aucune anomalie; 1 =
faiblesse de la queue ou des membres postérieurs; 2 = faiblesse de la queue et des membres postérieurs; 3 = paralysie des membres postérieurs; 4 = paralysie des membres postérieurs et faiblesse des membres antérieurs; et 5 = moribond. Les données sont rapportées sous forme de score clinique quotidien moyen.
Vaccination toléro gène.
Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 30 iLtg de tVLP, une fois par jour pendant 10 jours, entre le quinzième et le vingt-cinquième jour. Les souris ont également reçu une injection de PBS (Placebo) ou d'Abatacept (CTLA-4-Ig) avec la même quantité de CTLA-4 incluse dans les vaccins tVLP.

26 Test fonctionnel des VLP1L-2 La fonctionnalité des VLPIL2 a été testée sur les cellules CTLL-2 (ATCC TIB-214TM).
Les cellules sont cultivées dans du milieu RPMI complémenté avec 2mM de L-glutamine, 100U/mL de penicilline et streptomycine, 10% de sérum de veau foetal thermiquement inactivé, 1% de tampon HEPES et 0,1% de 2-mercaptoéthanol (tous provenant de Thermo Fischer Scientific). Des VLPIL_2 (50 ,g/mL) ou d'IL-2 humain (ProleukinO, Novartis) aux concentrations voulues sont ajoutées au milieu. Le nombre de cellules et le taux de mortalité sont évalués chaque jour par comptage des cellules au bleu Trypan dans des cellules de Malassez.
Cytométrie en flux Les anticorps utilisés dans les expériences sont listés dans le tableau 1.
Cible Clone Dilution Conjugué
Fournisseur CD4 RM4-5 1:400 Horizon V500 eBiosciences CD8 53-6.7 1:400 Alexa Fluor 700 BD
IA/IE M5/114.15.2 1:400 Horizon V500 BD
CD80 16-10A1 1:400 PE-Cy7 eBiosciences CD86 GL1 1:1000 eFluor 450 eBiosciences CD 11c N418 1:200 APC
eBiosciences CD25 PC61.5 1:200 PE-Cy7 eBiosciences FOXP3 FJK-16s 1:100 FITC
eBiosciences Fixable Viability Dye 1:2000 eFluor 780 eBiosciences CD40 HM40-3 1:200 APC
eBiosciences CD11c N418 1:200 PE
eBiosciences mIL-2 (IL-2 murin) JES6-5H4 1 :100 APC BD
CD152 (CTLA-4) UC10-4B9 1:200 APC
eBiosciences CD3 145-2C11 1:400 Biotin eBiosciences CD19 MB19-1 1:400 Biotin eBiosciences Ter-119 TER-119 1:400 Biotin eBiosciences Tableau 1: liste des anticorps utilisés en cytométrie en flux.
Pour les études in vitro, le Live Dead eFluor0780 est ajouté pour exclure les cellules mortes de l'analyse. Toutes les expériences de cytométrie en flux sont réalisées sur le

27 PCT/FR2018/052676 cytomètre BC LSRII et les données sont analysées en utilisant le logiciel FlowJo (Treestar Inc.).
Pour l'analyse en cytométrie en flux des VLP, 20 itg de VLPs sont incubés avec 5 iLt,L
de billes de latex aldéhyde/sulfate de 4itm de diamètre (Thermo Fischer Scientific) pendant 15 min à température ambiante. Du PBS est ajouté à un volume final de lmL
puis incubé pendant une heure. Les billes sont bloquées dans 20 iLt,L de sérum de veau foetal pendant 30 minutes et lavées trois fois, puis incubées avec l'anticorps de surface anti-CD152 ou anti-mIL-2 (eBiosciences) dans du PBS, 2% BSA pendant une heure.

Pour les marquages intra-VLP, les billes sont traitées avec du PBS 1% Triton pendant une heure. L'incubation avec l'anticorps primaire (anti-MulV p30, anti-OVA et anti-MOG) et un anticorps secondaire est réalisée dans du PBS 0.1% Triton. Les billes sont ensuite lavées et suspendues dans 200 iLt,L de PBS avant d'être analysées par cytométrie en flux LSRII (Beckton Dickinson).
Test ELISA
Le mCTLA-4 est détecté à la surface des VLP en utilisant la méthode ELISA. Les plaques 96 puits à fond plat (Medisorp, Nunc) sont recouvertes d'anticorps murins anti-CD152 (0,2 iLtg/mL, clone 14D3, eBioscience) à 4 C toute la nuit. Après lavage des puits, les sites de liaison non spécifiques sont bloqués avec du PBS 1% BSA
pendant une heure à température ambiante. 90itL d'échantillon sont ajoutés dans chaque puit avec 10 itL de tampon de lyse et incubés pendant 2 heures à température ambiante.
Des anticorps mAb anti-CD152 (UC10-4B9, eBioscience), de la streptavidine conjuguées à la peroxydase (Sigma-Aldrich) et du tetramethylbenzidine (TMB, eBioscience) sont ajoutés à température ambiante pendant 10 min pour détecter mCTLA-4. La réaction est arrêtée en ajoutant 100itL de HC1 (1M) et la densité
optique est mesurée à 450 nm avec une plaque de lecture ELISA automatique (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter). Le tag mCTLA-4-His (Thermo Fischer Scientific) est utilisé comme standard.
Le mIL-2 est détecté à la surface des VLP en en utilisant les kits Ready-Set-Go mIL-2 (eBiosciences) selon les instructions du fabricant. Les VLP- sont utilisés comme contrôle négatif

28 PCT/FR2018/052676 Analyse statistique L'analyse statistique est réalisée avec GraphPad Prism (logiciel GraphPad) avec le test U de Mann-Whitney avec *p<0,05 représentant une différence statistiquement significative (**p<0,01; ***p<0,001).
RESULTATS
1. Validation de l'expression d'OVA et CTLA-4 par les tVLP vA
L'expression de Gag et d'OVA par les VLP recombinant (VLP vA) ont été validées par Western Blot. Les VLP- obtenus à partir de WT Gag sont utilisés comme contrôle. Les analyses en Western Blot des surnageants de cellules transfectées témoignent de la formation des rétroVLP vectorisant l'antigène d'intérêt, ici l'ovalbumine (OVA) (Figure 3A).
L'immunoprécipitation par un anticorps anti-CTLA-4 témoigne de l'assemblage des molécules immunorégulatrices (CTLA-4) sur les tVLP vA (révélées avec un anti-Gag ;
Figure 3B).
L'expression des différentes formes chimériques de CTLA-4 (WT, TM-VSVG ou avec le domaine d'ancrage GPI) a été comparées dans les cellules transfectées ou sur les VLP
par cytométrie en flux. Des cellules non transfectées ou les VLP- ont été
utilisés comme contrôle négatif. Après comparaison du niveau d'expression des différentes formes chimériques de CTLA-4 (Figure 3C), il ressort que le système GPI(CD59b) est optimal et sera retenu dans la suite des résultats. Nous avons pu quantifier la présence du domaine CTLA-4 dans nos préparations en utilisant le test ELISA et la molécule représente entre 8 et 15% des protéines totales mesurées en utilisant la méthode utilisant l'acide Bicinchoninic (BCA) (Figure 3D).
2. Evaluation in vitro de l'effet des tVLPGFP sur l'activation des cellules dendritiques.
Les tVLPGFP ou VLPGFP (sans CTLA4) et les VLP- contrôle ont été mises en contact avec les cellules dendritiques (DC) purifiées sur la base de l'expression du CD 11c et du CMH-II111 à partir des splénocytes de souris BALB/c (Figure 4A). La captation des tVLPGFP par les cellules dendritiques purifiées est confirmée par la présence de cellules

29 PCT/FR2018/052676 GFP+ après 24h de culture. Les VLP- sont utilisés comme contrôle négatif (Figure 4B).
Le phénotype des DC est ensuite analysé 24h après une stimulation par le LPS
(ligand du TLR4). Il en ressort que seules les tVLPGFP bloquent de façon significative et dose dépendante l'augmentation d'expression des molécules de costimulation (CD80, CD86) .. induite par le LPS (Figure 4C-E). De façon intéressante, le niveau d'expression des molécules du CMH-II n'est pas affecté, ne perturbant pas la capacité des DC à
présenter l'antigène (Figure 4E). Des résultats similaires ont été observés lorsque les DC sont issues de cellules pro-génitrices de la moelle osseuse (Figure 5A). Une augmentation du niveau d'IL-10 a pu également être détectée dans le milieu en présence des tVLPGFP, témoignant d'une immuno-régulation exercée directement sur les cellules dendritiques (Figure 5B).
3. Evaluation in vitro de l'effet des tVLP- sur l'activation des cellules T
spécifiques de l'antigène.
Nous avons évalué si les tVLP- étaient capables de bloquer l'activation des lymphocytes T CD4+CD25- issues de souris OT-II spécifiques de l'antigène (OVA) après mise en contact avec les DC, présentes parmi les splénocytes irradiés et chargés avec la protéine OVA ou le peptide 0VA323-339 (Figure 6A). L'analyse de la prolifération des lymphocytes T en celltrace violet (CTVO) témoigne d'une bonne activation des lymphocytes T OT-II en présence du peptide 0VA323-339 seul ou du peptide plus les VLP- (Figure 6B). En revanche, l'ajout des tVLP- conduit à une suppression importante de l'activation des lymphocytes T avec un effet dose, pouvant atteindre au jour 3 près de 80% de suppression avec une stimulation peptidique (Figure 6C) et 40% de suppression avec la protéine. De façon intéressante, l'action immunorégulatrice des tVLP- est plus efficace comparativement à un traitement Abatacept (hCTLA-4-Ig), mis .. en quantité équivalente.
4. Effet suppresseur des tVLPm G sur les cellules effectrices de la sclérose en plaque Nous avons généré des rétroVLPt vectorisant l'antigène MOG (Figure 7A).
L'expression du CTLA4 chimérique (comportant le domaine GPI de CD59b) à la surface des particules et de l'antigène MOG à l'intérieur des particules ont pu être

30 PCT/FR2018/052676 observées par cytométrie de flux (Figure 7B). L'effet régulateur des tVLP1mG-recombinantes a pu être testé par un test de prolifération in vitro avec les cellules T
CD4+ 2D2 qui expriment un récepteur TCR spécifique du peptide MOG. Nous avons pu observer que les tVLPImG bloquent significativement la division des cellules T
spécifiques de l'antigène MOG (Figure 7C), y compris après un temps prolongé
de culture (Jour 7, Figure 7D). Cette suppression est forte, avec un index de plus de 60 (Figure 7E), et est dose dépendante comme en témoigne la diminution croissante d'expression du marqueur d'activation (CD25) en fonction de la quantité de tVLPImG
mis dans la culture.
Ces résultats constituent une première preuve de principe de l'utilisation des VLP
tolérogènes pour le contrôle des réponses auto-immunes et de leur potentiel thérapeutique dans la sclérose en plaque.
5. Validation de l'expression d'IL-2 par les VLPIL2 L'expression de Gag et d'IL-2 par les VLP recombinant (VLPIL2) a été validée par Western Blot. Les VLP- obtenus à partir de WT Gag et de l'IL-2 murin sont utilisés comme contrôles. Les analyses en Western Blot des surnageants de cellules transfectées témoignent de la formation des VLP exprimant l'IL-2 (Figure 8A).
La présence d'IL-2 a été quantifiée en utilisant le test ELISA sur les VLPIL2 et les VLP
(Figure 8B). L'expression des différentes formes chimériques de IL-2 (TM-VSVG
ou avec le domaine d'ancrage GPI) a été comparée dans les cellules transfectées ou sur les VLP par cytométrie en flux (Figure 8C). Des cellules non transfectées ou les VLP- ont été utilisées comme contrôle négatif. Après comparaison du niveau d'expression des différentes formes chimériques de VLPIL2 (Figure 8C), il ressort que le système GPI(CD59b) est optimal.
6. Effet fonctionnel des VLPIL2 La prolifération cellulaire et le pourcentage de mortalité des cellules CTLL-2 ont été
mesurés par bleu Trypan dans des cellules de Malassez en présence d'IL-2 à
25UI/mL, 50UI/mL, deVLPIL2ou en absence d'IL2 (SS IL-2).

31 PCT/FR2018/052676 La prolifération cellulaire et le pourcentage de mortalité des cellules CTLL-2 en présence de VLPIL2 sont similaires aux résultats obtenus en présence de cytokine IL-2 indiquant que les VLPIL2 permettent la prolifération des cellules CTLL-2 et sont donc fonctionnelles (Figure 9).
7. Effet thérapeutique des tVLPm G dans un modèle d'EAE
La Figure 10 illustre l'effet thérapeutique des tVLPImG dans un modèle d'EAE.
Les souris ont été traitées à partir de J15, date à laquelle les souris immunisées avec l'antigène MOG développent les symptômes et présentent un début de paralysie des membres. Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 30 itg de tVLP, une fois par jour pendant 10 jours, entre le quinzième et le vingt-cinquième jour.
En contrôle, des souris ont reçu une injection de PBS (Placebo) ou d'Abatacept (CTLA-4-Ig) avec une dose identique de CTLA-4. Les souris traitées avec les particules tVLPImG
ont une évolution de la maladie bloquée contrairement aux groupes contrôles.
L'effet thérapeutique est durable et maintenu au delà de la période de vaccination, démontrant une induction de tolérance.
Les Figures 11A et 11B montrent qu'une induction de la tolérance par les tVLPs réduit l'infiltration immunitaire du système nerveux central et augmente les Tregs spléniques.
Des souris C57B1/6 ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de tVLPs ou PBS (placebo) entre les jours 15 à 25 (en gras) après induction de l'EAE. A
J29, les rates et moelles épinères/cerveaux ont été prélevées et les cellules immunitaires infiltrantes ont été isolées puis analysées par cytométrie de flux (Figure 11A, monocytes inflammatoires, Figure 11B, lymphocytes Tregs). Des souris naïves ont été
incluses comme contrôle. Les résultats sont présentés en moyennes écart-type (n=2 souris / groupe). Nous observons une diminution des monocytes inflammatoires dans le système nerveux central et une augmentation des lymphocytes T régulateurs dans la rate des souris traitées par les tVLP+ comparativement aux souris contrôles. Les différences observées témoignent d'un contrôle de l'inflammation au niveau du cerveau et de la moelle épinière associé à un recrutement des cellules immunorégulatrices (lymphocytes T régulateurs).

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Particule pseudovirale comprenant un antigène et une molécule immunorégulatrice exposée à la surface de la particule, l'antigène étant un auto-antigène.

2. Particule pseudovirale selon la revendication 1, ladite particule pseudovirale étant une particule rétrovirale synthétique.

3. Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle la molécule immunorégulatrice est un récepteur de point de contrôle immunitaire, de préférence sélectionné parmi le groupe constitué de CTLA4, PD-1, Tim-3, LAG-3, TIGIT et OX40.

4. Particule pseudovirale selon la revendication 3, dans laquelle la molécule immunorégulatrice comprend le domaine extracellulaire dudit récepteur.

5. Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle la molécule immunorégulatrice est sélectionnée parmi le groupe constitué de IL-2, IL-10 et TGF-béta.

6. Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle la molécule immunorégulatrice est liée au domaine transmembranaire de la glycoprotéine du vesicular stomatitis virus (VSV-G) ou au domaine glycophosphatidylinositol (GPI) d'ancrage de la glycoprotéine CD59.

7. Particule pseudovirale selon l'une des revendications 1 à 6 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie-autoimmune.

8. Particule pseudovirale pour une utilisation selon la revendication 7, la maladie auto-immune étant choisie parmi la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis, la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).

9. Particule pseudovirale pour une utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8, ladite particule étant sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant en outre un excipient pharmaceutique.

10. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) comprenant une ou des séquence(s) d'acide nucléique codant pour une ou des protéine(s) virales modifiées de la particule pseudovirale telle que définie à l'une des revendications 1 à 6.

11. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) selon la revendication 10 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie auto-immune.

12. Plasmide ou ensemble de plasmide(s) pour une utilisation selon la revendication 11, la maladie auto-immune étant choisie parmi la sclérose en plaque, le diabète de type 1, le lupus, une thyroïde auto-immune, la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie coeliaque, la myasthénie gravis, la maladie de Biermer (Gastrite atrophique auto-immune) ou l'hépatite autoimmune (HAI).