EP3692357A1 - Vorrichtung zur automatischen speziesanalyse und verfahren zu dessen durchführung - Google Patents

Vorrichtung zur automatischen speziesanalyse und verfahren zu dessen durchführung

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EP3692357A1
EP3692357A1 EP17787132.4A EP17787132A EP3692357A1 EP 3692357 A1 EP3692357 A1 EP 3692357A1 EP 17787132 A EP17787132 A EP 17787132A EP 3692357 A1 EP3692357 A1 EP 3692357A1
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EP
European Patent Office
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sample
spectrometer
automatic
evaluation
camera
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17787132.4A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Susanne DUNKER
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Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Original Assignee
Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ filed Critical Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Publication of EP3692357A1 publication Critical patent/EP3692357A1/de
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    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Definitions

  • the present invention relates to an automatic species analysis apparatus and a method of carrying out the same.
  • the present invention relates to a device for automatic species analysis within a large biological group and a method for automatically performing such analyzes.
  • composition especially the appearance and distribution of certain
  • the phytoplankton is examined. These are microscopically small plant organisms, which are the primary producers at the bottom of the food chain. A disruptive change within the phytoplankton community has far-reaching consequences for the rest of the food chain and thus for the entire ecosystem. Due to the rapid growth of the phytoplankton organisms against higher aquatic plants, the phytoplankton is a particularly good indicator of short-term changes, such as nutrient inputs.
  • Cyanobacteria These organisms are extremely adaptable and can be used even under the most difficult conditions, such as light deficiency and nitrogen limitations.A large number of cyanobacteria species are known to be endangered and "overturned” by aquatic life in that they form toxins which have neurotoxic, cytotoxic, dermatological and hepatotoxic effects and therefore constitute a major health hazard in the case of drinking water or recreational use.
  • the cell size allows information about the physiological activity of the species, the cell size distribution is particularly important to estimate the growth potential of phytoplankton species in the water body or to perform, for example, a process control of algae plants.
  • Another example where biological markers can be used to assess environmental quality is air purity studies.
  • an inventive device for automatic species analysis should be able to provide information about the presence of Distribution and the specific properties of biological species in a sample by a metrological evaluation without involvement of a taxonomist win.
  • the study cost and time required for the examinations should be reduced.
  • Laser radiation source directed to the sample area, wherein the fluorescent radiation emitted by the sample within the sample area by excitation by the second laser radiation source and a second collected
  • Spectrometer is supplied for spectral evaluation; and a camera adapted to take a photograph of the sample within the
  • the apparatus further comprising means for automatic species analysis adapted to derive from the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and the second spectrometer (i.e., first and second fluorescence spectra of the sample) and the photographic image of the camera by a multi-stage
  • Threshold comparison for certain stored in an associated database, determination parameters to perform an automatic species analysis.
  • Species analysis within a large biological group means that the species to be automatically identified and examined for their specific properties (ie the biological sample material contained in an environmental sample) belong to a particular biological large group.
  • the large groups may be, for example, certain types of phytoplankton or a pollen group.
  • a device according to the invention can be formed in general for the automatic species analysis of a large number of biological large group.
  • the radiation of a first laser radiation source is directed as excitation radiation onto a sample area, wherein the fluorescence radiation emitted by a sample within the sample area by excitation by the first laser radiation source, e.g. B. by means of a corresponding collection optics, collected and a first spectrometer for spectral evaluation, d. H. for generating a spectrum of the first fluorescence radiation, is supplied.
  • the spectrometer may be a grating spectrometer
  • the spectrometer may be constructed as a filter stack with a plurality of dichroic filters.
  • the spectral measurement is preferably carried out via a corresponding camera (for example a line scan camera or matrix camera), whereby a spectral assignment to individual spectral ranges takes place via the pixel positions.
  • spectral regions are combined into individual channels (eg by numbered channels with a spectral width of 50 nm).
  • the radiation of a second laser radiation source is directed as excitation radiation on the sample area, wherein the of the sample within the sample area by excitation by the second
  • the spectrometer may be
  • a grating spectrometer for example, a grating spectrometer, a prism spectrometer or a
  • Filter spectrometer act.
  • the spectrometer may be constructed as a filter stack with a plurality of dichroic filters.
  • the spectral measurement is preferably carried out via a corresponding camera (eg line scan camera or
  • Matrix camera whereby the pixel positions are spectrally assigned to individual spectral ranges.
  • spectral regions are combined into individual channels (eg by numbered channels with a spectral width of 50 nm).
  • the guidance of the first and second beam path to the sample can be collinear or independent (not collinear).
  • both are Beam paths to a common position or two closely spaced positions, preferably less than 10 ⁇ , more preferably less than 5 ⁇ , more preferably less than 2 ⁇ , more preferably less than 1 ⁇ and even more preferably less than 0.5 ⁇ remote positions, im Test area directed.
  • the fluorescence radiation is preferably supplied to the excitation of a sample via the first beam path exclusively to the first spectrometer for spectral evaluation.
  • the fluorescence radiation is preferably supplied to the excitation of a sample via the second beam path exclusively to the second spectrometer for spectral evaluation.
  • the emission wavelength of the first differs
  • a wavelength difference between the wavelengths of the laser radiation sources may be at least 10 nm, more preferably at least 25 nm, more preferably at least 50 nm, more preferably at least 100 nm, and even more preferably at least 250 nm.
  • the emission wavelength of the first laser radiation source is preferably between 480 nm and 500 nm. It is also preferable for the emission wavelength of the second laser radiation source to be between 550 nm and 570 nm. Particularly preferred is the emission wavelength of the first
  • Laser radiation source at 488 nm. More preferably, the emission wavelength of the second laser radiation source is 561 nm.
  • the sample area may preferably be a photo or video camera for visually detecting the samples within the sample area.
  • the camera may additionally comprise an optical imaging system for enlarging the image (so-called microscopy arrangement).
  • the camera can also be designed as an element of the spectroscopy system.
  • a photo or video camera for visually detecting the samples within the sample area.
  • the camera may additionally comprise an optical imaging system for enlarging the image (so-called microscopy arrangement).
  • the camera can also be designed as an element of the spectroscopy system.
  • a photo or video camera for visually detecting the samples within the sample area.
  • the camera may additionally comprise an optical imaging system for enlarging the image (so-called microscopy arrangement).
  • the camera can also be designed as an element of the spectroscopy system.
  • a photo or video camera for visually detecting the samples within the sample area.
  • the camera may additionally comprise an optical imaging system for enlarging the image (so-called microscopy arrangement).
  • Spectrometer camera also be used for photographic recording of the sample within the sample area. Photographic images of the sample can also take place simultaneously in several spectral ranges, eg. Example by means of a filter spectrometer, in which the spectrometer camera is illuminated simultaneously via different color filters aligned side by side. Preferably, one is
  • a spectrum may consist of a spectrally resolved series of individual fluorescence microscopic images of a sample (ie, simultaneous generation of spectrally and locally resolved fluorescence microscopic images by a spectrometer).
  • a device further comprises a means for automatic species analysis, wherein from the sample-related results of
  • Spectrometer eg, the fluorescence spectra as measured spectral intensity over wavelength
  • the photographic image of the camera takes place an automatic species analysis for a sample.
  • the spectroscopic data of both beam paths are therefore evaluated in combination with at least one photographic image for speciation determination within a biological large group.
  • the means for automatic species analysis accesses an associated database which contains certain parameters for an automatic species analysis.
  • the individual determination parameters are through
  • Thresholds marked and exhibit a multi-level order towards an ever finer taxonomic differentiation ("decision tree").
  • Multi-level means here that the determination parameters in the database preferably have an order of the general group membership, on the family level to the species determination.
  • the automated species analysis database includes additional data
  • Determination key for species analysis e.g. From metadata about the source of the environmental sample, probability assumptions about the presence of certain species, or other limitations and distinctions.
  • the automatic species analysis means may then be multilevel according to the multi-level order of the database
  • Threshold comparison perform an automatic species analysis.
  • taxonomic differentiation of spectral groups evaluation of the sample-related spectroscopy data
  • a biological family level evaluation of the photographic image of the sample
  • species level further evaluation of the photographic image of the sample
  • Threshold comparison here means that for a given
  • a threshold value can be stored, which with a corresponding value from the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and the second
  • the invention is based on the finding that for an automatic
  • Species analysis in particular a combination of spectroscopic methods with means of automatic image recognition (eg., By means of deep learning) is particularly suitable.
  • Wavelengths can be evaluated different excitation paths in the fluorescence of a sample. This allows in particular the specific
  • Excitation wavelengths can be chosen, for example, so that specific molecules or sample components can be excited to fluoresce.
  • the acquired spectroscopic data can then already be used for a first classification into spectral classes.
  • About the evaluation of the photographic recording can then, for. B. based on the geometric dimensions of a sample, a further division at the family level.
  • a further differentiation to speciesites can also be made by evaluating the photographic image and, in particular, by taking into account additional metadata as a further key to the determination, in particular to the expected species distribution on the basis of the sample origin.
  • a device according to the invention further comprises a means for archiving, adapted to the results of the spectroscopic
  • Spectrometer and the photographic image of the camera preferably provided with a time stamp and can be stored as a complete or reduced data set. In particular, this provides the results of automatic species analysis at a later time for review. Such archiving can be used in particular for the optimization of the Stored thresholds for the determination parameters or for an additional random check by a
  • Taxonomists are used.
  • a device further comprises a means for statistical evaluation, designed to perform a statistical evaluation of a variety of automatic species analyzes on different samples.
  • the means for statistical evaluation may be a computer-based statistical evaluation program.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for
  • automatic species analysis comprising the steps of: providing an automatic species analysis device according to the invention; Introducing a sample into the sample area; Producing a sample-related spectroscopic evaluation of the generated fluorescence radiation with the first spectrometer and the second spectrometer and a photograph of the sample with the camera; Evaluation of the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and of the second spectrometer as well as the photographic recording of the camera by the means for the automatic
  • Species analysis wherein automatic species analysis is performed by a multi-level threshold comparison for certain determination parameters stored in an associated database.
  • a value for a determination parameter is first determined from the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and the second spectrometer and the photographic image of the camera, and this is compared to the differentiation decision with the threshold value stored in the database for this determination parameter.
  • a method according to the invention is particularly suitable for carrying out an automatic species analysis by means of a device according to the invention described in this document.
  • the individual steps of the process are based on a procedural application of the in the section on the
  • Image analysis of the photographic image of the camera are performed.
  • further differentiation takes place subsequently at the species level, likewise on the basis of an automatic image analysis of the photographic image of the camera and / or by taking into account additional determination keys for determining species, eg. B. due to metadata for sample origin and / or - distribution, probability assumptions to occur or otherwise
  • the means for automatic species analysis additionally performs a biovolume determination based on the sample related results of
  • the biovolume of the phytoplankton cells per volume of water used can be determined in particular from the number of species per volume and the cell area of the sample, which is preferably determined from a photographic image of the sample by the means for evaluation.
  • a biovolume determination can u. a. on the parameters length, width,
  • Object diameter can be constructed and calculated using a specific (eg a phytoplanktonspezifischen) formulary collection (Hillebrand et al., 1999).
  • the volume of the object can be calculated, for example, using the formula for calculating the spherical volume: (TT / 6) * CP, where c is the diameter the cell (or other spherical examination subject).
  • An ellipsoidal cell can additionally be identified by an aspect ratio (aspect ratio of 1.5) of the elongatedness and whose volume is calculated by the formula (jr / 6) * d 2 * h, where c is the diameter and h is the length of the cell. With an aspect ratio of 0-0.6, a more precise identification of the
  • Particle shape are made. With a length more than 4 times the width ratio, a filamentous structure can be assumed which can be obtained by means of a
  • Cylinder can be calculated ((n / 4) * d 2 * h). Using the calculated volumes, a biovolume determination can be made per volume using the respectively determined number of objects.
  • the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and of the second spectrometer and the photographic image of the camera are archived by the means for archiving.
  • This step serves in particular for a possible documentation of the examination on individual samples. Further advantages of archiving can be found in the corresponding section of the device description.
  • the statistical evaluation means preferably carry out a statistical evaluation of a large number of automatic species analyzes on different samples.
  • a statistical evaluation especially with regard to the distribution frequency of certain species in a given sampling, z. B. in a water sample, done.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for
  • Pollen determination comprises an evaluation of the pollen size, the maximum axial extent and / or the geometrical asymmetry ratio (of the pollen) as a determination parameter.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for
  • automatic phytoplankton determination which is based on a method according to the invention for automatic species analysis, wherein an excitation of the sample at an emission wavelength of the first laser radiation source between 480 nm and 500 nm, wherein the excitation of phycoerythrin excitation of the sample at an emission wavelength of the second laser radiation source between 550 nm and 570 nm.
  • the emission wavelength of the first Laser radiation source at 488 nm. More preferably, the emission wavelength of the second laser radiation source is 561 nm.
  • the method for automatic phytoplankton determination comprises an evaluation of the cell length, the cell width, the maximum axial extent, the geometric asymmetry ratio (of the cell), the cell size, the
  • the method for automated phytoplankton determination allows a
  • Laser configuration with excitation at 488 nm and 561 nm is particularly advantageous.
  • an excitation wavelength of 488 nm (ubiqitäre) carotenoids occurring in all phytoplankton species are excited, while in a phytoplankton species occurring (ubiqitäre) carotenoids excited
  • Excitation wavelength of 561 nm specific individual phytoplankton groups can be excited (mainly Bacillariophyta, cyanobacteria and
  • Species analysis for automatic species analysis is performed by a multi-level threshold comparison with determination parameters, which are stored in an associated database and can be read there.
  • a taxonomic differentiation of Phytoplanktonspezies therefore takes place in a multi-stage process in several steps.
  • a division into spectral groups preferably takes place on the basis of the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and of the second spectrometer.
  • Phytoplankton large groups eg cyanobacteria, green spectral group (Chlorophyta, Euglenophyta), Bacillariophyta, Dinophyta,
  • a division at the family level takes place on the basis of the sample-related photographic image of the camera.
  • a more detailed determination at the family level can be based in particular on specific geometrical or other determination parameters (eg cell size, cell shape, structural arrangements within the cells, etc.) which can be taken in the photographic images by automatic image recognition methods (see Lauterbornia 1997, John, DM 2003). ,
  • phytoplankton samples for example, a characteristic spectral intensity ratio between individual spectral regions in the fluorescent light, by which Phytoplanktongroß phenomenon can be distinguished from each other.
  • Each single cell measured i.e., one sample
  • Heterocontophyta are assigned by a coarsely gridded
  • Emission spectrum is used.
  • an average intensity value in each case can preferably be used for this purpose
  • Spectral range 560-595 nm (referred to as channel 03 without restriction of generality), in the spectral range 595-642 nm (referred to as channel 04), and in the spectral range 642-745 nm (referred to as channel 05).
  • an average intensity value in the spectral range 570-595 nm (referred to as channel 09), in the spectral range 595-642 nm (referred to as channel 10) and in the spectral range 642-745 nm (as channel 1 1).
  • Excitation at a wavelength of 561 nm allows a specific excitation of phycoerythrin um particularly relevant cyanobacteria, as well as cryptophyta from the others
  • Table 1 are exemplary determination parameters as threshold values for a division into spectral Phytoplankton phenomenon given in the above example spectral channelization for fluorescence excitation at wavelengths of 488 nm and 561 nm. This must first be a standardization of the spectroscopic
  • Determination parameters can be improved and optimized with stored measurements of different species. If specific thresholds are reached or undershot for certain channels, a division into a spectral group can be made on the basis of the information given in Tab. Depending on the required requirement for the depth of determination, such can already be determined
  • a differentiation at the family level can according to the invention by the
  • Determination parameters are evaluated. Also here is a
  • filaments the corresponding threshold can be determined by the aspect ratio of the cell, filaments are present at aspect ratios ⁇ 0.3
  • coccale cells coccale cells
  • Determination parameters are used.
  • further information on morphological characteristics may be used as additional keys of identification.
  • Presence of a trained taxonomist is not mandatory) with a statistically better data basis due to a multiple of recorded samples than with a microscopic analysis (minimum requirement Microscope 400 cells, flow cytometers up to 5000 cells / second), thereby also rare species can be detected;
  • Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of a device for automatic species analysis
  • FIG. 2 shows a flow chart for a multi-level threshold comparison in a method according to the invention for automatic species analysis.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of an embodiment of an apparatus for automatic species analysis.
  • the device comprises a first
  • Beam path 10 directed from a first laser radiation source 12 to a sample area 40, wherein the fluorescent radiation emitted by a sample 42 within the sample area 40 by excitation by the first laser radiation source 12 is collected and fed to a first spectrometer 14 for spectral evaluation; a second beam path 20 from a second
  • Laser radiation source 22 directed to the sample area 40, wherein the sample 42 within the sample area 40 by excitation by the second
  • Collected laser radiation source 22 emitted fluorescence radiation and a second spectrometer 24 is supplied for spectral evaluation; and a camera 30 adapted to receive a photograph of the sample 42 within the sample area 40; the apparatus further comprising an automatic species analysis means (50) adapted to be formed from
  • the illustration shows an archiving means 60 connected to the automatic species analysis means 50 adapted to archive the results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer 14 and the second spectrometer 24 as well as the photographic image of the camera 30.
  • the illustration also shows a statistical analysis means 70 connected to the automatic species analysis means 50 adapted to perform a statistical evaluation of a plurality of automatic species analyzes
  • FIG. 2 shows a flow chart for a multi-level threshold comparison in an automatic species analysis method according to the invention.
  • a division into spectral groups takes place on the basis of the sample-related results of the spectroscopic evaluation of the first spectrometer and the second spectrometer (preferably via intensity ratios between the intensity values in different spectral ranges).
  • a family-level division takes place on the basis of an evaluation of the sample-related photographic image of the camera 30.
  • Corresponding threshold values can be extracted from the photographic images of the camera 30 by means of automatic image recognition methods.
  • a classification at species level takes place based on a further evaluation of the sample-related photographic image of the camera 30 with regard to further determination parameters and / or taking into account additional determination keys (eg corresponding probability statements on the species probability based on the sample origin).

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse und ein Verfahren zu dessen Durchführung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe und ein Verfahren zur automatischen Durchführung solcher Analysen. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe umfasst einen ersten Strahlengang (10), von einer ersten Laserstrahlungsquelle (12) auf einen Probebereich (40) gerichtet, wobei die von einer Probe (42) innerhalb des Probenbereiches (40) durch Anregung durch die erste Laserstrahlungsquelle (12) emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem ersten Spektrometer (14) zur spektralen Auswertung zugeführt wird; einen zweiten Strahlengang (20), von einer zweiten Laserstrahlungsquelle (22) auf den Probebereich (40) gerichtet, wobei die von der Probe (42) innerhalb des Probenbereiches (40) durch Anregung durch die zweite Laserstrahlungsquelle (22) emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem zweiten Spektrometer (24) zur spektralen Auswertung zugeführt wird; und eine Kamera (30), dazu ausgebildet, eine fotografische Aufnahme von der Probe (42) innerhalb des Probenbereichs (40) aufzunehmen; wobei die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50) umfasst, dazu ausgebildet, aus den probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durch einen mehrstufigen Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter eine automatische Speziesanalyse vorzunehmen. Ein erfindungsgemäßes Verfahren dient der Durchführung einer automatischen Speziesanalyse mittels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

Titel
Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse und Verfahren zu dessen
Durchführung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse und ein Verfahren zu dessen Durchführung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe und ein Verfahren zur automatischen Durchführung solcher Analysen.
Stand der Technik
Für die Untersuchung von Umweltproben, insbesondere aus Gewässern oder bei Probennahmen aus der Luft, ist neben einer Analyse ihrer chemischen
Zusammensetzung vor allem das Auftreten und die Verteilung bestimmter
biologischer Spezies ein charakteristisches Merkmal zur Beurteilung der Qualität und Reinheit der Proben sowie des momentanen Zustands des beprobten biologischen Systems.
Betrachtet man beispielsweise den ökologischen Zustand europäischer Gewässer, wird deutlich, dass hierbei in vielen Teilen der EU und auch in Deutschland ein großer Teil der Wasserkörper mit weniger als gutem ökologischem Potential bewertet wird. Als biologische Qualitätskomponente wird unter anderem das Phytoplankton begutachtet. Hierbei handelt es sich um mikroskopisch kleine pflanzliche Organismen, welche als Primärproduzenten an unterster Stelle in der Nahrungskette stehen. Eine störende Veränderung innerhalb der Phytoplanktongemeinschaft hat weitreichende Konsequenzen auf den Rest der Nahrungskette und somit das gesamte Ökosystem. Durch das schnelle Wachstum der Phytoplanktonorganismen gegenüber höheren Wasserpflanzen, ist das Phytoplankton ein besonders guter Indikator für kurzzeitige Veränderungen, wie beispielsweise Nährstoffeinträge. Es wird angenommen, dass die größte Belastung für Seen durch den übermäßigen Nährstoffeintrag aus den jeweiligen Einzugsgebieten, beispielsweise in landwirtschaftlich genutzten Bereichen, erfolgt. Vor allem Stickstoff und Phosphor sind hierbei für das Phytoplankton- Wachstum entscheidend, da sie in großen Mengen für das Wachstum benötigt werden. Durch eine hohe externe Nährstoffzufuhr kommt es zu massivem Wachstum von Phytoplanktonorganismen, Veränderungen in der Zusammensetzung des
Phytoplanktons und im schlimmsten Fall zur Verarmung an biologischer Vielfalt und Massenentwicklungen einiger Spezies, welche in engem Zusammenhang mit
Gesundheitsgefährdung und dem„Umkippen" von Gewässern steht. Hierbei steht eine Gruppe von Phytoplanktonorganismen in besonderem Fokus: Cyanobakterien. Diese Organismen sind enorm anpassungsfähig und können auch unter schwierigsten Bedingungen, wie Lichtmangel und Stickstoff-Limitationen auftreten. Von sehr vielen Cyanobakterien-Arten ist bekannt, dass sie Toxine bilden, die neuro-, zyto-, dermato- und hepatotoxisch wirken und demzufolge eine große Gesundheitsgefährdung bei Trinkwasser- oder Freizeitnutzung darstellen.
In den letzten Jahren wurden bereits etliche Anstrengungen unternommen, um der Bildung von Cyanobakterien-Massenentwicklungen entgegenzuwirken. Hierbei wird vor allem versucht, die für das Phytoplanktonwachstum nötigen Nährstoffe zu reduzieren. Etliche Beispiele zeigen, dass allein eine Nährstoffreduktion nicht ausreicht, um das massive Wachstum dieser Phytoplanktongruppe einzuschränken, sondern weitere Effekte eine fördernde Wirkung haben. Hierbei zeigt sich, dass unser Verständnis zur Regulierbarkeit von biologischen Komponenten noch nicht ausreicht, um steuernd einwirken zu können. Im Ökosystem See liegt ein hochkomplexes Zusammenspiel verschiedener Einflussfaktoren vor, die in enger Wechselwirkung miteinander stehen.
Daher ist zur zuverlässigen Bewertung der Gewässerqualität eine kontinuierliche Erfassung der Phytoplanktonzusammensetzung notwendig. Hierbei erfolgt bisher im Allgemeinen eine Probenahme mit anschließender mikroskopischer Begutachtung. Es zeigt sich jedoch, dass diese Probenahme nur einen winzigen Teil der Entwicklung des Phytoplanktons im Jahresverlauf abdecken und es eine sehr hohe Variabilität der Zusammensetzung nur im Verlauf eines Tages oder weniger Tage gibt. Einmalig im Monat getätigte Probenahme spiegeln einen zufälligen Zustand wieder, der innerhalb weniger Tage extrem variieren kann. So kann beispielsweise ein massives Auftreten von Cyanobakterien im Zwischenzeitraum des Beprobungsintervalls auftreten und hat dann eine andere Bewertung zur Folge. Für ein tatsächliches Verständnis von Phytoplankton-Dynamik ist ein wesentlich kürzeres Beprobungsintervall nötig, allerdings gibt es hierbei massive
Einschränkungen durch den immens hohen Zeitaufwand einer mikroskopischen Auswertung. Allein für die Auswertung einer einzigen Probe ergibt sich aus dem Leistungsverzeichnis für Limnologie der Deutschen Gesellschaft für Limnologie ein Zeitaufwand von 60-180 Minuten, je nach Aufwand und Bestimmungstiefe der Organismen (Leistungsverzeichnis für die Limnologie, Deutsche Gesellschaft für Limnologie e.V., 2012). Diese Analyse muss von einem ausgebildeten Taxonomen durchgeführt werden. Weiterhin wird in diesem Zeitrahmen nur erfasst, wie viele Organismen einer Art oder Gattung vorhanden sind, nicht aber, wie beispielsweise die Zellgrößenverteilung aussieht oder wie viel Reservestoffe pro Zelle vorhanden sind. Diese Aussagen haben jedoch vor dem Hintergrund einer wissenschaftlichen
Betrachtung eine große Relevanz. Da die Zellgröße Auskunft über die physiologische Aktivität der Spezies zulässt, ist die Zellgrößenverteilung besonders wichtig, um das Wachstumspotential von Phytoplanktonspezies im Gewässer abzuschätzen oder beispielsweise eine Prozesskontrolle von Algen-Anlagen durchzuführen.
Ein weiteres Beispiel, bei dem biologische Marker zur Beurteilung der Umweltqualität herangezogen werden können, sind Untersuchungen zur Reinheit der Luft.
Insbesondere für Allergiker ist beispielweise eine zuverlässige Bewertung der aktuellen Pollenbelastung in der Luft besonders wichtig. Da die Belastung jedoch je nach Region und Verteilungsvektor starken Schwankungen unterworfen sein kann, ist auch für diese Untersuchungen eine räumlich und zeitlich möglichst engmaschige Beprobung erforderlich. Insbesondere kommt es hierbei jedoch auf möglichst zeitnahe Auswertung der genommen Umweltproben an. Bisher werden diese Auswertungen jedoch ebenfalls überwiegend von entsprechend ausgebildeten Taxonomen vorgenommen, was auch diese Untersuchungen sehr teuer und zeitaufwendig macht.
Offenbarung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse und ein Verfahren zu dessen Durchführung
anzugeben, welche die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik
überwinden. Insbesondere soll eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse dazu in der Lage sein, Aussagen über das Vorhandensein, die Verteilung und die spezifischen Eigenschaften biologischer Spezies in einer Probe durch eine messtechnische Auswertung ohne Beteiligung eines Taxonomen gewinnen zu können. Durch den Einsatz eines vollständig automatisierten Verfahrens zur Speziesanalyse sollen die Untersuchungskosten und der für die Untersuchungen notwendige Zeitaufwand reduziert werden.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche 1 und 7 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen enthalten.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe umfasst einen ersten Strahlengang, von einer ersten Laserstrahlungsquelle auf einen Probebereich gerichtet, wobei die von einer Probe (biologisches Probenmaterial, z. B. Phytoplankton oder ein Pollen) innerhalb des Probenbereiches durch Anregung durch die erste Laserstrahlungsquelle emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem ersten Spektrometer zur spektralen Auswertung zugeführt wird; einen zweiten Strahlengang von einer zweiten
Laserstrahlungsquelle auf den Probebereich gerichtet, wobei die von der Probe innerhalb des Probenbereiches durch Anregung durch die zweite Laserstrahlungsquelle emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem zweiten
Spektrometer zur spektralen Auswertung zugeführt wird; und eine Kamera, dazu ausgebildet, eine fotografische Aufnahme von der Probe innerhalb des
Probenbereichs aufzunehmen; wobei die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur automatischen Speziesanalyse umfasst, dazu ausgebildet, aus den probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers (d. h. erstes und zweites Fluoreszenzspektrum der Probe) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera durch einen mehrstufigen
Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter eine automatische Speziesanalyse vorzunehmen.
Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe bedeutet dabei, dass die automatisch zu identifizierenden und hinsichtlich ihrer spezifischen Eigenschaften zu untersuchenden Spezies (d. h. das in einer Umweltprobe enthaltende biologische Probenmaterial) einer bestimmten biologischen Großgruppe zugehörig sind. Bei den Großgruppen kann es sich beispielsweise um bestimmte Arten von Phytoplankton oder eine Pollengruppe handeln. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann jedoch ganz allgemein zur automatischen Speziesanalyse einer Vielzahl biologischer Großgruppe ausgebildet sein.
Im ersten Strahlengang wird die Strahlung einer ersten Laserstrahlungsquelle als Anregungsstrahlung auf einen Probebereich gerichtet, wobei die von einer Probe innerhalb des Probenbereiches durch Anregung durch die erste Laserstrahlungsquelle emittierte Fluoreszenzstrahlung, z. B. mittels einer entsprechenden Sammeloptik, aufgesammelt und einem ersten Spektrometer zur spektralen Auswertung, d. h. zur Erstellung eines Spektrums der ersten Fluoreszenzstrahlung, zugeführt wird. Bei dem Spektrometer kann es sich beispielsweise um ein Gitterspektrometer, ein
Prismenspektrometer oder ein Filterspektrometer handeln. Insbesondere kann das Spektrometer als Filterstapel mit einer Vielzahl von dichroitischen Filtern aufgebaut sein. Die spektrale Messung erfolgt vorzugsweise über eine entsprechende Kamera (z. B. Zeilenkamera oder Matrixkamera), wobei über die Pixelpositionen eine spektrale Zuordnung zu einzelnen Spektralbereichen erfolgt. Vorzugsweise werden spektrale Bereiche zu einzelnen Kanälen zusammengefasst (z. B. durch durchnummerierte Kanäle mit einer spektralen Breite von 50 nm).
Im zweiten Strahlengang wird die Strahlung einer zweiten Laserstrahlungsquelle als Anregungsstrahlung auf den Probebereich gerichtet, wobei die von der Probe innerhalb des Probenbereiches durch Anregung durch die zweite
Laserstrahlungsquelle emittierte Fluoreszenzstrahlung, z. B. mittels einer
entsprechenden Sammeloptik, aufgesammelt und einem zweiten Spektrometer zur spektralen Auswertung, d. h. zur Erstellung eines Spektrums der zweiten
Fluoreszenzstrahlung, zugeführt wird. Bei dem Spektrometer kann es sich
beispielsweise um ein Gitterspektrometer, ein Prismenspektrometer oder ein
Filterspektrometer handeln. Insbesondere kann das Spektrometer als Filterstapel mit einer Vielzahl von dichroitischen Filtern aufgebaut sein. Die spektrale Messung erfolgt vorzugsweise über eine entsprechende Kamera (z. B. Zeilenkamera oder
Matrixkamera), wobei über die Pixelpositionen eine spektrale Zuordnung zu einzelne Spektralbereichen erfolgt. Vorzugsweise werden spektrale Bereiche zu einzelnen Kanälen zusammengefasst (z. B. durch durchnummerierte Kanäle mit einer spektralen Breite von 50 nm).
Die Führung des ersten und zweiten Strahlenganges auf die Probe kann kollinear oder unabhängig voneinander (nicht kollinear) erfolgen. Vorzugsweise sind beide Strahlengänge auf eine gemeinsame Position oder zwei dicht nebeneinander liegende Positionen, vorzugsweise weniger als 10 μιη, bevorzugter weniger als 5 μιη, bevorzugter weniger als 2 μιη, bevorzugter weniger als 1 μιη und noch bevorzugter weniger als 0,5 μιη entfernt voneinander liegende Positionen, im Probebereich gerichtet. Vorzugsweise wird die Fluoreszenzstrahlung der Anregung einer Probe über den ersten Strahlengang ausschließlich dem ersten Spektrometer zur spektralen Auswertung zugeführt. Vorzugsweise wird die Fluoreszenzstrahlung der Anregung einer Probe über den zweiten Strahlengang ausschließlich dem zweiten Spektrometer zur spektralen Auswertung zugeführt.
Vorzugsweise unterscheiden sich die Emissionswellenlänge der ersten
Laserstrahlungsquelle und die die Emissionswellenlänge der zweiten
Laserstrahlungsquelle voneinander. Insbesondere kann eine Wellenlängendifferenz zwischen den Wellenlängen der Laserstrahlungsquellen mindestens 10 nm, bevorzugter mindestens 25 nm, bevorzugter mindestens 50 nm, bevorzugter mindestens 100 nm, und noch bevorzugter mindestens 250 nm betragen.
Vorzugsweise liegt die Emissionswellenlänge der ersten Laserstrahlungsquelle zwischen 480 nm und 500 nm. Ebenfalls bevorzugt ist, dass die Emissionswellenlänge der zweiten Laserstrahlungsquelle zwischen 550 nm und 570 nm liegt. Besonderes bevorzugt liegt die Emissionswellenlänge der ersten
Laserstrahlungsquelle bei 488 nm. Besonders bevorzugt liegt die Emissionswellenlänge der zweiten Laserstrahlungsquelle bei 561 nm.
Bei der Kamera zur fotografischen Aufnahme von der Probe innerhalb des
Probenbereichs kann es sich vorzugsweise um eine Foto- oder Videokamera zur visuellen Erfassung der Proben innerhalb des Probenbereichs handeln. Die Kamera kann zusätzlich ein optisches Abbildungssystem zur Vergrößerung der Abbildung umfassen (sog. Mikroskopieanordnung). Die Kamera kann alternativ auch als Element des Spektroskopiesystems ausgeführt sein. Insbesondere kann eine
Spektrometerkamera auch zur fotografischen Aufnahme von der Probe innerhalb des Probenbereichs genutzt werden. Dabei können fotografische Aufnahmen von der Probe auch gleichzeitig in mehreren Spektralbereichen erfolgen, z. B. mittels eines Filterspektrometers, bei dem die Spektrometerkamera gleichzeitig über verschiedene nebeneinander ausgerichtete Farbfilter beleuchtet wird. Vorzugsweise ist eine
Spektrometerkamera dazu ausgebildet, gleichzeitig eine Vielzahl
fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen, die jeweils verschiedene Wellenlängenbereiche abdecken, aufzunehmen. Insbesondere kann ein Spektrum aus einer spektral aufgelösten Reihe von einzelnen fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen einer Probe bestehen (d. h. gleichzeitige Erzeugung von spektral und örtlich aufgelösten fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen durch ein Spektrometer).
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst weiterhin ein Mittel zur automatischen Speziesanalyse, wobei aus den probenbezogenen Ergebnissen der
spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten
Spektrometers (z. B. den Fluoreszenzspektren als gemessene spektrale Intensität über Wellenlänge) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera eine automatische Speziesanalyse für eine Probe erfolgt. Die Spektroskopiedaten beider Strahlengänge werden daher in Kombination mit mindestens einer fotografischen Aufnahme zur Speziesbestimmung innerhalb einer biologischen Großgruppe ausgewertet.
Das Mittel zur automatischen Speziesanalyse greift dabei auf eine zugehörige Datenbank zu, welche bestimmte Bestimmungsparameter für eine automatische Speziesanalyse enthält. Die einzelnen Bestimmungsparameter sind durch
Schwellwerte gekennzeichnet und weisen eine mehrstufige Ordnung hin zu einer immer feineren taxonomischen Differenzierung auf („Entscheidungsbaum").
Mehrstufig bedeutet hierbei, dass die Bestimmungsparameter in der Datenbank vorzugsweise eine Ordnung von der allgemeinen Gruppenzugehörigkeit, über die Familienebene bis hin zur Speziesbestimmung aufweisen. Vorzugsweise enthält die Datenbank des Mittels zur automatischen Speziesanalyse zusätzliche
Bestimmungsschlüssel zur Speziesanalyse, z. B. aus Metadaten zur Herkunft der Umweltprobe, Wahrscheinlichkeitsannahmen über das Vorhandensein bestimmter Spezies oder sonstige Einschränkungs- und Unterscheidungsmerkmale.
Das Mittel zur automatischen Speziesanalyse kann anschließend durch einen der mehrstufigen Ordnung der Datenbank entsprechenden mehrstufigen
Schwellwertvergleich eine automatische Speziesanalyse vornehmen. Insbesondere kann eine taxonomische Differenzierung von spektralen Gruppen (Auswertung der probenbezogenen Spektroskopiedaten), über eine biologische Familienebene (Auswertung der fotografischen Aufnahme der Probe) bis hin zur Speziesebene (weitere Auswertung der fotografischen Aufnahme der Probe) erfolgen.
Schwellwertvergleich bedeutet hierbei, dass für einen bestimmten
Bestimmungsparameter in der Datenbank ein Schwellwert hinterlegt sein kann, welcher mit einem entsprechenden Wert aus den probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten
Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera verglichen wird. Eine Differenzierung erfolgt dann aufgrund der Tatsache, ob der Wert aus den
probenbezogenen Ergebnissen ober-, unterhalb oder auf dem Schwellwert liegt.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass für eine automatische
Speziesanalyse insbesondere eine Kombination spektroskopischer Methoden mit Mitteln der automatischen Bilderkennung (z. B. mittels Deep Learning) besonders geeignet ist. Durch eine Anregung der Fluoreszenz bei zwei verschiedenen
Wellenlängen können unterschiedliche Anregungspfade bei der Fluoreszenz einer Probe ausgewertet werden. Diese ermöglicht insbesondere die spezifische
Ausrichtung einer erfindungsgemäßen Anordnung auf eine bestimmte biologische Großgruppe durch Auswahl passender Anregungswellenlängen. Die
Anregungswellenlängen können etwa so gewählt werden, dass ganz spezifisch bestimmte Moleküle bzw. Probenbestandteile zur Fluoreszenz angeregt werden können. Die gewonnenen spektroskopischen Daten können dann bereits für eine erste Einteilung in spektrale Klassen genutzt werden. Über die Auswertung der fotografischen Aufnahme kann anschließend, z. B. anhand der geometrischen Abmessungen einer Probe, eine weitere Einteilung auf Familienebene erfolgen. Eine weitergehende Differenzierung auf Spezieseben kann ebenfalls über die Auswertung der fotografischen Aufnahme und insbesondere auch durch Berücksichtigung zusätzlicher Metadaten als weitere Bestimmungsschlüssel, insbesondere zur erwarteten Speziesverteilung aufgrund der Probenherkunft, erfolgen.
Vorzugsweise weist eine erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur Archivierung auf, dazu ausgebildet, die Ergebnisse der spektroskopischen
Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera zu archivieren. Archivieren bedeutet hierbei, dass für eine Vielzahl untersuchter Probe die probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten
Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera vorzugsweise mit einem Zeitstempel versehen und als vollständiger oder reduzierter Datensatz abgespeichert werden können. Insbesondere stehen dadurch die Ergebnisse einer automatischen Speziesanalyse zu einem späteren Zeitpunkt für eine Überprüfung zur Verfügung. Eine solche Archivierung kann insbesondere zur Optimierung der in der Datenbank abgelegten Schwellwerte für die Bestimmungsparameter herangezogen werden oder für eine zusätzliche stichprobenartige Überprüfung durch einen
Taxonomen genutzt werden.
Vorzugsweise weist eine erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur statistischen Auswertung auf, dazu ausgebildet, eine statistische Auswertung einer Vielzahl automatischer Speziesanalysen an unterschiedlichen Proben vorzunehmen. Bei dem Mittel zur statistischen Auswertung kann es sich um rechnerbasiertes statistisches Auswerteprogramm handeln.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
automatischen Speziesanalyse, folgende Schritte aufweisend: Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse; Einbringen einer Probe in den Probenbereich; Erstellen einer probenbezogenen spektroskopischen Auswertung der erzeugten Fluoreszenzstrahlung mit dem ersten Spektrometer und dem zweiten Spektrometer sowie einer fotografischen Aufnahme der Probe mit der Kamera; Auswertung der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera durch das Mittel zur automatischen
Speziesanalyse, wobei eine automatische Speziesanalyse durch einen mehrstufigen Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter durchgeführt wird. Für den Schwellwertvergleich wird zunächst aus den probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera ein Wert für einen Bestimmungsparameter ermittelt, und dieser zur Differenzierungsentscheidung mit dem zu diesem Bestimmungsparameter in der Datenbank hinterlegten Schwellwert verglichen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist insbesondere dazu geeignet, mittels einer in diesem Dokument beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung eine automatische Speziesanalyse durchzuführen. Die einzelnen Schritte des Verfahrens basieren auf einer verfahrenstechnischen Anwendung von den im Abschnitt zu den
entsprechenden Ausführungsformen der Vorrichtung genannten Merkmalen. Die zu den einzelnen Merkmalen genannten Erläuterungen bzw. deren als bevorzugt oder optional angegebene Ausführungsformen gelten daher sinngemäß auch für einen entsprechenden Verfahrensschritt. Vorzugsweise erfolgt für die Auswertung der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten
Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera durch das Mittel zur automatischen Speziesanalyse über den Schwellwertvergleich zunächst eine
Einteilung nach spektralen Gruppen aufgrund der spektralen Intensitätsverhältnisse für einzelne Wellenlängenbereiche in der Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers jeweils für sich alleine oder in Kombination. Anschließend kann eine Differenzierung auf Familienebene aufgrund einer automatischen
Bildanalyse der fotografischen Aufnahme der Kamera durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt im Anschluss eine weitere Differenzierung auf Speziesebene ebenfalls aufgrund einer automatischen Bildanalyse der fotografischen Aufnahme der Kamera und/oder durch Berücksichtigung zusätzlicher Bestimmungsschlüssel zur Speziesbestimmung, z. B. aufgrund von Metadaten zur Probenherkunft und/oder - Verteilung, Wahrscheinlichkeitsannahmen zum Auftreten oder sonstige
Einschränkungs- und Unterscheidungsmerkmale.
Vorzugsweise führt das Mittel zur automatischen Speziesanalyse zusätzlich eine Biovolumenbestimmung aufgrund der probenbezogenen Ergebnisse der
spektroskopischen Analyse des ersten Spektrometers und/oder des zweiten
Spektrometers und/oder der fotografischen Aufnahme der Kamera durch. Das als gängige Angabe verwendete Biovolumen der Phytoplanktonzellen pro vermessenes Wasservolumen kann insbesondere aus der Speziesanzahl pro Volumen und der vorzugsweise aus einer fotografischen Aufnahme der Probe durch das Mittel zur Auswertung ermittelten Zellfläche der Probe bestimmt werden.
Eine Biovolumenbestimmung kann u. a. auf den Parametern Länge, Breite,
Kreisförmigkeit und Breite-/Längenverhältnis (Aspect Ratio), sowie Zell- bzw.
Objektdurchmesser aufgebaut werden und mithilfe einer spezifischen (z. B. einer phytoplanktonspezifischen) Formelsammlung berechnet werden (Hillebrand et al. 1999). Bei gleichzeitigem Vorliegen von annähernder Kreisförmigkeit und einem Breite-/Längenverhältnis (Aspect Ratio) von 0,6-1 kann das Volumen des Objekts beispielsweise mit der Formel zur Berechnung des Kugelvolumens berechnet werden: (TT/6)*CP, wobei c dem Durchmesser der Zelle (oder eines sonstigen kugelförmigen Untersuchungsobjektes) entspricht. Eine eher ellipsoide Zelle kann zusätzlich durch einen Wert (Aspect Ratio >1 ,5) der Gestrecktheit (Elongatedness) identifiziert werden und deren Volumen mit der Formel (jr/6)*d2*h, wobei c dem Durchmesser und h der Länge der Zelle entspricht, berechnet werden. Bei einem Breite-/Längenverhältnis (Aspect Ratio) von 0-0,6 muss zunächst eine genauere Identifizierung der
Partikelform vorgenommen werden. Bei einer mehr als 4-fachen Länge im Verhältnis der Breite kann eine fädige Struktur angenommen werden, die mit Hilfe eines
Zylinders berechnet werden kann ((n/4)*d2*h). Mithilfe der berechneten Volumina kann unter Verwendung der jeweilig ermittelten Objektanzahl pro Volumen eine Biovolumenbestimmung vorgenommen werden.
Vorzugsweise werden durch das Mittel zur Archivierung die probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera archiviert. Dieser Schritt dient insbesondere einer möglichen Dokumentation der Untersuchung an einzelnen Proben. Weitere Vorteile einer Archivierung können den entsprechenden Abschnitt der Vorrichtungsbeschreibung entnommen werden.
Vorzugsweise wird durch das Mittel zur statistischen Auswertung eine statistische Auswertung einer Vielzahl automatischer Speziesanalysen an unterschiedlichen Proben durchgeführt. Insbesondere kann eine statistische Auswertung vor allem im Hinblick auf die Verteilungshäufigkeit bestimmter Spezies in einer bestimmten Probennahme, z. B. in einer Gewässerprobe, erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
automatischen Pollenbestimmung, welches auf einem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatischen Speziesanalyse basiert. Das Verfahren zur automatischen
Pollenbestimmung umfasst eine Auswertung der Pollengröße, der maximalen axialen Ausdehnung und/oder des geometrischen Asymmetrieverhältnisses (des Pollens) als Bestimmungsparameter.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
automatischen Phytoplanktonbestimmung, welches auf einem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatischen Speziesanalyse basiert, wobei eine Anregung der Probe bei einer Emissionswellenlänge der ersten Laserstrahlungsquelle zwischen 480 nm und 500 nm erfolgt, wobei zur Anregung von Phycoerythrin eine Anregung der Probe bei einer Emissionswellenlänge der zweiten Laserstrahlungsquelle zwischen 550 nm und 570 nm erfolgt. Besonderes bevorzugt liegt die Emissionswellenlänge der ersten Laserstrahlungsquelle bei 488 nm. Besonders bevorzugt liegt die Emissionswellenlänge der zweiten Laserstrahlungsquelle bei 561 nm.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren zur automatischen Phytoplanktonbestimmung eine Auswertung der Zelllänge, der Zellbreite, der maximalen axialen Ausdehnung, des geometrische Asymmetrieverhältnisses (der Zelle), der Zellgröße, der
Koloniegröße, und/oder der Größe lichtbrechender intrazellulärer Strukturen der Zelle (d.h. der Probe) als Bestimmungsparameter.
Das Verfahren zur automatisierten Phytoplanktonbestimmung erlaubt eine
Bestimmung der Phytoplanktonzusammensetzung beispielsweise in natürlichen Wasserproben. Für die Phytoplanktonidentifizierung ist die spezielle
Laserkonfiguration mit einer Anregung bei 488 nm und 561 nm besonders vorteilhaft. Bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm werden bei allen Phytoplanktonspezies vorkommende (ubiqitäre) Carotinoide angeregt, während bei einer
Anregungswellenlänge von 561 nm spezifisch einzelne Phytoplanktongruppen angeregt werden können (vorwiegend Bacillariophyta, Cyanobakterien und
Cryptophyta).
Eine Auswertung der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen
Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera durch das Mittel zur automatischen
Speziesanalyse zur automatischen Speziesanalyse wird durch einen mehrstufigen Schwellwertvergleich mit Bestimmungsparametern, welche in einer zugehörigen Datenbank hinterlegt sind und dort ausgelesen werden könne, durchgeführt. Eine taxonomische Differenzierung der Phytoplanktonspezies erfolgt daher in einem mehrstufigen Verfahren in mehreren Schritten.
In einem ersten Schritt erfolgt vorzugsweise eine Einteilung in spektrale Gruppen anhand der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers. Zunächst kann basierend auf dem Autofluoreszenz-Emissionsmuster, welches sich insbesondere durch ein Anregung bei 488 nm und 561 nm ergibt, eine Zuordnung in
Phytoplanktongroßgruppen vorgenommen werden (z. B. Cyanobakterien, grüne spektrale Gruppe (Chlorophyta, Euglenophyta), Bacillariophyta, Dinophyta,
Cryptophyta, Heterokontophyta). Anschließend erfolgt vorzugsweise in einem zweiten Schritt eine Einteilung auf Familienebene anhand der probenbezogenen fotografischen Aufnahme der Kamera. Eine detailliertere Bestimmung auf Familienebene kann insbesondere auf bestimmten geometrischen oder sonstigen in den fotografischen Aufnahmen durch automatische Bilderkennungsmethoden entnehmbaren Bestimmungsparametern (z. B. Zellgröße, Zellform, Strukturanordnungen innerhalb der Zellen, usw.) basieren (vgl. Lauterbornia 1997; John; D. M. 2003).
In einem dritten Schritt erfolgt schließlich vorzugsweise eine Einteilung auf
Speziesebene anhand einer weiteren Auswertung der probenbezogenen
fotografischen Aufnahme der Kamera hinsichtlich weiterer Bestimmungsparameter und/oder unter Berücksichtigung zusätzliche Bestimmungsschlüssel (z. B.
entsprechender Wahrscheinlichkeitsaussagen zur Spezieswahrscheinlichkeit aufgrund der Probenherkunft). Insbesondere können zur Bestimmung auf
Speziesebene noch Informationen aus externen Quellen und Datenbanken (z. B. AlgaTerra, GBIF, AlgaeBase, planktonforum.eu) einfließen.
Aus der unterschiedlichen Anregung ergibt sich bei erfindungsgemäß spektroskopisch untersuchten Phytoplanktonproben beispielsweise ein charakteristisches spektrales Intensitätsverhältnis zwischen einzelnen spektralen Bereichen im Fluoreszenzlicht, durch welches Phytoplanktongroßgruppen voneinander unterschieden werden können. Jede einzelne vermessene Zelle (d. h. einer Probe) kann hierbei einer bestimmten Phytoplanktongroßgruppe (Cyanobakterien, grüne spektrale Gruppe (Chlorophyta, Euglenophyta), Bacillariophyta, Dinophyta, Cryptophyta,
Heterokontophyta) zugeordnet werden, indem ein grob gerastertes
Emissionsspektrum verwendet wird. Bei einer Anregung bei einer Wellenlänge von 488 nm kann hierzu vorzugsweise jeweils ein gemittelter Intensitätswert im
Spektralbereich 560-595 nm (ohne Beschränkung der Allgemeinheit als Kanal 03 bezeichnet), im Spektralbereich 595-642 nm (als Kanal 04 bezeichnet), und im Spektralbereich 642-745 nm (als Kanal 05 bezeichnet) bestimmt werden. Bei einer Anregung bei einer Wellenlänge von 561 nm kann vorzugsweise jeweils ein gemittelter Intensitätswert im Spektralbereich 570-595 nm (als Kanal 09 bezeichnet), im Spektralbereich 595-642 nm (als Kanal 10 bezeichnet) und im Spektralbereich 642-745 nm (als Kanal1 1 bezeichnet) bestimmt werden. Eine Anregung bei einer Wellenlänge von 561 nm ermöglicht eine spezifische Anregung von Phycoerythrin um besonders relevante Cyanobakterien, sowie Cryptophyta von den anderen
Phytoplanktongroßgruppen unterscheiden zu können.
In Tab. 1 sind exemplarisch Bestimmungsparameter als Schwellwerte für eine Einteilung in spektrale Phytoplanktongruppen bei der im obigen Beispiel angegeben spektralen Kanaleinteilung für eine Fluoreszenzanregung bei Wellenlänge von 488 nm und 561 nm. Hierzu muss zunächst eine Normierung der spektroskopischen
Intensitätswerte von Kanal 03 und Kanal 04 auf Kanal 05 (maximale Intensität auf Kanal 05 = 1 a.u.) erfolgen. Weiterhin müssen Kanal 09 und Kanal 10 auf Kanal 1 1 (maximale Intensität auf Kanal 11 = 1 a.u.) normiert werden. Die
Bestimmungsparameter können mit hinterlegten Messungen unterschiedlichster Spezies verbessert und optimiert werden. Werden bei bestimmten Kanälen bestimmte Schwellwerte erreicht bzw. unterschritten, kann eine Einteilung in eine spektrale Gruppe anhand der Angaben in Tab. 1 erfolgen. Abhängig von der erforderlichen Anforderung an die Bestimmungstiefe, kann bereits eine derart bestimmte
Phytoplanktonzusammensetzung ausreichend für eine Bestimmung sein.
Tab. 1
Eine Differenzierung auf Familienebene kann erfindungsgemäß durch die
Zuhilfenahme gemessener Bildinformationen aus einer fotografischen Aufnahme der Probe, zusätzlich zur Fluoreszenzemission, erfolgen. Mithilfe der Bildinformationen (z. B. aus einer Hellfeld-Aufnahme) kann zunächst, ausgehend von einer bereits getroffenen spektralen Zuordnungen zu einer Phytoplanktongroßgruppe (z. B.
entsprechende der Zuordnung nach Tab. 1 ), eine weitere Identifikation basierend auf verschiedenen Bestimmungsparametern (z. B. nach Lauterbornia 1997, John, D. M. 2003) auf Familienebene erfolgen. Wichtige Bestimmungskriterien, wie beispielsweise die Bildung von Filamenten, die Anzahl, Form und Verteilung von Chloroplasten, sowie eine Begeißelung kann hierbei über morphologische Parameter der
Bildinformation entnommen und entsprechend eines entsprechenden
Bestimmungsparameters ausgewertet werden. Auch hierbei erfolgt eine
Differenzierung vorzugsweise über einen Schwellwertvergleich zwischen in einer Datenbank hinterlegten Schwellwerten und den entsprechend aus den
Bildinformationen gewonnen Werten.
Beispiele für bestimmte Bestimmungsparameter, welche für eine Differenzierung von Phytoplankton auf Familienebene ausgewertet werden können, sind Filamente (der entsprechende Schwellwert kann über das Seitenverhältnis der Zelle festgelegt, Filamente liegen bei Seitenverhältnissen < 0.3 vor), coccale Zellen (bei
Seitenverhältnissen > 0.3), Chloroplastenanzahl, Chloroplastenmorphologie und die Symmetrie der Zellen.
Für Phytoplanktonfamilien mit wenigen Familien (z. B. Cryptophyta) ist es möglich, mit der Differenzierung auf Familienebene bereits einzelne Spezies zu bestimmen. Bei sehr diversen Familien ist eine weitere Differenzierung auf Speziesebene notwendig. Grundsätzlich können auch hier die bereits erwähnten taxonomischen
Bestimmungsparameter verwendet werden. Zusätzlich können weitere Informationen über morphologische Charakteristika als weitere Bestimmungsschlüssel verwendet werden.
Als Bestimmungsparameter auf Speziesebene kann insbesondere die Zelllänge, die Zellbreite, die maximale axiale Ausdehnung der Zelle, deren geometrisches
Asymmetrieverhältnis, die Zellgröße, die Koloniegröße, und/oder die Größe
lichtbrechender intrazellulärer Strukturen ausgewertet werden.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur automatisierten Phytoplanktonbestimmung bringt gegenüber der herkömmlichen mikroskopischen Auswertung den Vorteil:
einer enormen Verringerung des zeitlichen Aufwands für die Probenanalyse (Reduktion der Analysezeit von ca. 60-180 min (nach Leistungsverzeichnis für Limnologie der DGL) auf 5-30 min automatisierte Erfassung, dadurch
Anwesenheit eines ausgebildeten Taxonomen nicht zwingend erforderlich) bei einer statistisch besseren Datengrundlage aufgrund eines Vielfachen an erfassten Proben als bei einer mikroskopischen Analyse (Minimalanforderung Mikroskop 400 Zellen, Durchflusszytometer bis zu 5000 Zellen/Sekunde), hierdurch können auch seltene Spezies erfasst werden;
einer sehr viel höheren Objektivität der Auswertung durch das automatisierte
Bestimmungsverfahren im Vergleich zur subjektiven Erfassung durch einen
Taxonomen;
einer größeren Unverfälschtheit der Messungen, da die Analysen mit so hohem Durchsatz durchgeführt werden können, dass keine Fixierung mit einem Fixierungsreagenz nötig ist;
der Archivierbarkeit der erstellten fotografischen Aufnahmen für jeden einzelnen Organismus und somit die Möglichkeit einer objektiven Auswertung und intensiveren Datenauswertung;
einer deutlichen Unterscheidung von lebenden und toten Zellen, basierend auf der Chi a-Fluoreszenz, dies ermöglicht eine gezielte Erfassung von relevanten lebenden Zellen im Vergleich zu mikroskopischen Verfahren;
einer geringeren Fehlidentifikation durch die zusätzliche taxonomische
Zuordnung basierend auf den Fluoreszenzeigenschaften;
eine Aussage über die Zellgrößenverteilung zur Abschätzung des
Wachstumspotential einer Spezies ist möglich;
eine Aussage über Lokalisation und Menge von Chlorophyll pro Zelle zur Einschätzung des Vitalzustandes der Zellen ist möglich;
gegenüber der herkömmlichen zytometrischen Auswertung besteht die Möglichkeit der Berücksichtigung von zusätzlichen morphologischen
Informationen der gemessenen Zellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnung erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse; und
Fig. 2 ein Ablaufschema für einen mehrstufigen Schwellwertvergleich in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatischen Speziesanalyse. Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse. Die Vorrichtung umfasst einen ersten
Strahlengang 10, von einer ersten Laserstrahlungsquelle 12 auf einen Probebereich 40 gerichtet, wobei die von einer Probe 42 innerhalb des Probenbereiches 40 durch Anregung durch die erste Laserstrahlungsquelle 12 emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem ersten Spektrometer 14 zur spektralen Auswertung zugeführt wird; einen zweiten Strahlengang 20 von einer zweiten
Laserstrahlungsquelle 22 auf den Probebereich 40 gerichtet, wobei die von der Probe 42 innerhalb des Probenbereiches 40 durch Anregung durch die zweite
Laserstrahlungsquelle 22 emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem zweiten Spektrometer 24 zur spektralen Auswertung zugeführt wird; und eine Kamera 30, dazu ausgebildet, eine fotografische Aufnahme von der Probe 42 innerhalb des Probenbereichs 40 aufzunehmen; wobei die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50) umfasst, dazu ausgebildet, aus den
probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durch einen mehrstufigen Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter eine automatische Speziesanalyse vorzunehmen.
Weiterhin zeigt die Darstellung ein mit dem Mittel zur automatischen Speziesanalyse 50 verbundenes Mittel zur Archivierung 60, dazu ausgebildet, die Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers 14 und des zweiten Spektrometers 24 sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera 30 zu archivieren. Die Darstellung zeigt ebenfalls ein mit dem Mittel zur automatischen Speziesanalyse 50 verbundenes Mittel zur statistischen Auswertung 70, dazu ausgebildet, eine statistische Auswertung einer Vielzahl automatischer Speziesanalysen an
unterschiedlichen Proben 42 durchzuführen.
Fig. 2 zeigt ein Ablaufschema für einen mehrstufigen Schwellwertvergleich in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatischen Speziesanalyse. Eine
entsprechende taxonomische Differenzierung erfolgt dabei mehrstufig. Im ersten Schritt S1 erfolgt eine Einteilung in spektrale Gruppen anhand der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers und des zweiten Spektrometers (vorzugsweise über Intensitätsverhältnisse zwischen den Intensitätswerten in unterschiedlichen Spektralbereichen). Anschließend erfolgt in einem zweiten Schritt S2 eine Einteilung auf Familienebene anhand einer Auswertung der probenbezogenen fotografischen Aufnahme der Kamera 30. Entsprechende Schwellwerte können mittels automatischer Bilderkennungsmethoden aus den fotografischen Aufnahmen der Kamera 30 extrahiert werden. In einem dritten Schritt S3 erfolgt schließlich eine Einteilung auf Speziesebene anhand einer weiteren Auswertung der probenbezogenen fotografischen Aufnahme der Kamera 30 hinsichtlich weiterer Bestimmungsparameter und/oder unter Berücksichtigung zusätzlicher Bestimmungsschlüssel (z. B. entsprechender Wahrscheinlichkeitsaussagen zur Spezieswahrscheinlichkeit aufgrund der Probenherkunft).
Bezugszeichenliste
10 erster Strahlengang
12 erste Laserstrahlungsquelle
14 erstes Spektrometer
20 zweiter Strahlengang
22 zweite Laserstrahlungsquelle
24 zweites Spektrometer
30 Kamera
40 Probenbereich
42 Probe
50 Mittel zur automatischen Speziesanalyse 60 Mittel zur Archivierung
70 Mittel zur statistischen Auswertung
51 Schritt 1
52 Schritt 2
53 Schritt 3

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur automatischen Speziesanalyse innerhalb einer biologischen Großgruppe, umfassend:
a) einen ersten Strahlengang (10), von einer ersten Laserstrahlungsquelle (12) auf einen Probebereich (40) gerichtet, wobei die von einer Probe (42) innerhalb des Probenbereichs (40) durch Anregung durch die erste Laserstrahlungsquelle (12) emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem ersten Spektrometer (14) zur spektralen Auswertung zugeführt wird;
b) einen zweiten Strahlengang (20), von einer zweiten
Laserstrahlungsquelle (22) auf den Probebereich (40) gerichtet, wobei die von der Probe (42) innerhalb des Probenbereichs (40) durch Anregung durch die zweite Laserstrahlungsquelle (22) emittierte Fluoreszenzstrahlung aufgesammelt und einem zweiten Spektrometer (24) zur spektralen Auswertung zugeführt wird; und
c) eine Kamera (30), dazu ausgebildet, eine fotografische Aufnahme von der Probe (42) innerhalb des Probenbereichs (40) aufzunehmen;
dadurch gekennzeichnet, dass
d) die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50) umfasst, dazu ausgebildet, aus den probenbezogenen Ergebnissen der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durch einen mehrstufigen Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter eine automatische Speziesanalyse vorzunehmen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , wobei die Emissionswellenlänge der ersten
Laserstrahlungsquelle (14) zwischen 480 nm und 500 nm liegt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Emissionswellenlänge der zweiten Laserstrahlungsquelle (24) zwischen 550 nm und 570 nm liegt.
4. Vornchtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Datenbank des Mittels zur automatischen Speziesanalyse (50) zusätzliche
Bestimmungsschlüssel zur Speziesanalyse enthält.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur Archivierung (60) umfasst, dazu ausgebildet, die
Ergebnisse der spektralen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) zu archivieren.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur statistischen Auswertung (70) umfasst, dazu
ausgebildet, eine statistische Auswertung einer Vielzahl automatischer
Speziesanalysen an unterschiedlichen Proben (42) vorzunehmen.
7. Verfahren zur automatischen Speziesanalyse, folgende Schritte aufweisend: a) Bereitstellen einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche;
b) Einbringen einer Probe (42) in den Probenbereich (40);
c) Erstellen einer probenbezogenen spektroskopischen Auswertung der erzeugten Fluoreszenzstrahlung mit dem ersten Spektrometer (14) und dem zweiten Spektrometer (24) sowie einer fotografischen Aufnahme der Probe (42) mit der Kamera (30);
d) Auswertung der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durch das Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50), wobei eine automatische Speziesanalyse durch einen mehrstufigen
Schwellwertvergleich für bestimmte, in einer zugehörigen Datenbank hinterlegte, Bestimmungsparameter durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei für die Auswertung der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durch das Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50) über den Schwellwertvergleich zunächst eine Einteilung nach spektralen Gruppen aufgrund der spektralen Intensitätsverhältnisse für einzelne
Wellenlängenbereiche in der Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) jeweils für sich alleine oder in Kombination und anschließend eine Differenzierung auf Familienebene aufgrund einer automatischen Bildanalyse der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei im Anschluss eine weitere Differenzierung auf Speziesebene aufgrund einer automatischen Bildanalyse der
fotografischen Aufnahme der Kamera und/oder durch Berücksichtigung zusätzlicher Bestimmungsschlüssel zur Speziesbestimmung durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6 bis 9, wobei durch das Mittel zur automatischen Speziesanalyse (50) zusätzlich eine Biovolumenbestimmung aufgrund der probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Analyse des ersten Spektrometers (14) und/oder des zweiten Spektrometers (24) und/oder der fotografischen Aufnahme der Kamera (30) durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10, wobei durch das Mittel zur Archivierung die probenbezogenen Ergebnisse der spektroskopischen Auswertung des ersten Spektrometers (14) und des zweiten Spektrometers (24) sowie der
fotografische Aufnahme der Kamera (30) archiviert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 6 bis 11 , wobei durch das Mittel zur statistischen Auswertung (70) eine statistische Auswertung einer Vielzahl automatischer Speziesanalysen an unterschiedlichen Proben (42) durchgeführt wird.
13. Verfahren zur automatischen Pollenbestimmung gemäß einem Verfahren nach Anspruch 6 bis 12, wobei als Bestimmungsparameter das Verhältnis zwischen roten und blauen Spektralanteilen, die Pollengröße, die maximale axiale Ausdehnung und/oder das geometrische Asymmetrieverhältnis ausgewertet werden.
14. Verfahren zur automatischen Phytoplanktonbestimmung gemäß einem
Verfahren nach Anspruch 6 bis 12, wobei eine Anregung der Probe (42) bei einer Emissionswellenlänge der ersten Laserstrahlungsquelle (14) zwischen 480 nm und 500 nm erfolgt, wobei zur Anregung von Phycoerythrin eine Anregung der Probe (42) bei einer Emissionswellenlänge der zweiten
Laserstrahlungsquelle (24) zwischen 550 nm und 570 nm erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei als Bestimmungsparameter die Zelllänge, die Zellbreite, die maximale axiale Ausdehnung, das geometrische
Asymmetrieverhältnis, die Zellgröße, die Koloniegröße, und/oder die Größe lichtbrechender intrazellulärer Strukturen ausgewertet werden.
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