DE102018204426A1

DE102018204426A1 - Mikroskopiesystem

Info

Publication number: DE102018204426A1
Application number: DE102018204426.0A
Authority: DE
Inventors: Marco Wilzbach; Christoph Hauger
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2018-11-15
Anticipated expiration: 2038-03-23
Also published as: CN108931508B; US11036039B2; CN108931508A; US20180348495A1; DE102018204426B4

Abstract

Mikroskopiesystem mit einem Detektionssystem, welches dazu konfiguriert ist, Licht eines ersten Kanals in einem Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln, Licht eines zweiten Kanals in einem zweiten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln und Licht eines dritten Kanals in einem dritten Detektionsbereich zu detektierten und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln, und mit einer Steuerung, welche dazu konfiguriert ist, einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in einem Objektbereich unter Verwendung des ersten Fluoreszenzlichtsignals, des ersten Korrektursignals und des zweiten Korrektursignals zu bestimmen, wobei ein erster Teil des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs (im Wesentlichen ausschließlich) im ersten Detektionsbereich (erster Kanal) detektiert wird, wobei ein Wellenlängenbereich, der in der Nähe des ersten Teils des Fluoreszenzspektrums liegt (im Wesentlichen ausschließlich) im zweiten Detektionsbereich (zweiter Kanal) detektiert wird und wobei ein Teil des Anregungsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs (im Wesentlichen ausschließlich) im dritten Detektionsbereich (dritter Kanal) detektiert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und zur Bestimmung eines Näherungswertes für eine räumliche Verteilung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs.
Fluoreszenzfarbstoffe werden im Bereich der Tumorresektion verwendet, um krankes Gewebe von gesundem Gewebe zu unterscheiden. Hierzu wird in dem Bereich des kranken Gewebes ein Fluoreszenzfarbstoff angereichert, welcher, wenn er mit Licht seines Anregungsspektrums belichtet wird, Fluoreszenzlicht seines Emissionsspektrums emittiert. Da das Fluoreszenzlicht lediglich von dem Gewebe ausgeht, in welchem sich der Fluoreszenzfarbstoff angereichert hat, ist zusätzlich ein Übersichtsbild hilfreich, um das kranke Gewebe im Umfeld des gesunden Gewebes betrachten zu können.
Allerdings ist das vom Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht kein Maß für die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs und damit kein Maß für die Menge/Konzentration des kranken Gewebes, da die Stärke der Fluoreszenz noch von weiteren Eigenschaften des Gewebes abhängt. Gewebebereiche, in denen die gleiche Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs vorliegen, erscheinen daher in Fluoreszenzbildern unterschiedlich intensiv, obwohl die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in den Bereichen gleich ist. Die folgenden Eigenschaften des Gewebes bedingen den Unterschied zwischen der vom Fluoreszenzfarbstoff emittierten Intensität und der davon an einem Detektor ankommenden Intensität. Zum einen absorbiert das Gewebe im Bereich des Anregungsspektrums Licht, so dass nicht das gesamte zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs vorgesehene Licht den Fluoreszenzfarbstoff tatsächlich erreicht. Im Wellenlängenbereich der Emission führt Lichtstreuung des Fluoreszenzlichts dazu, dass nicht das gesamte vom Fluoreszenzfarbstoff emittierte Licht den Detektor erreicht, sondern vom umliegenden Gewebe gestreut wird.
Es wurde gezeigt, dass eine semi-empirische Näherung für die tatsächlich von einem Fluoreszenzfarbstoff emittierte Lichtintensität existiert, die von der gemessenen Fluoreszenzlichtintensität und von der Intensität von reflektiertem Licht in den Wellenlängenbereichen des Absorptionsspektrums und des Emissionsspektrums abhängt (P. A. Valdes et al., „A spectrally constrained dual-band normalization technique for protoporphyrin IX quantification in fluorescence-guided surgery", Optical Society of America, Optics Letter, Vol. 37, No. 11, June 1, 2012, 1817-1819).
Eine verallgemeinerte Näherung kann wie folgt ausgedrückt werden: $I_{F L}^{t o t} = A \frac{I_{F L}^{det}}{{(I_{K o 1})}^{α} \cdot {(I_{K o 2})}^{β}}$
wobei

: die räumliche Verteilung der Intensität von Fluoreszenzlicht, welches ohne den störenden Einfluss des umliegenden Gewebes im Objektbereich vom Fluoreszenzfarbstoff emittiert wird, bezeichnet,
: die räumliche Verteilung der Intensität von Fluoreszenzlicht, welches mittels eines Mikroskops detektiert werden kann, bezeichnet und damit die durch das umliegende Gewebe bedingten Verfälschungen enthält,
I_Ko1: die räumliche Verteilung der Intensität von an dem Gewebe reflektiertem Licht eines in der Nähe des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs befindlichen Wellenlängenbereichs bezeichnet,
I_Ko2: die räumliche Verteilung der Intensität von an dem Gewebe reflektiertem Licht eines in der Nähe des Anregungsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs befindlichen Wellenlängenbereichs bezeichnet,
A: einen empirischen Parameter bezeichnet,
α: einen weiteren empirischen Parameter bezeichnet, und

β: noch einen weiteren empirischen Parameter bezeichnet.

Die Parameter A, α und β können beispielsweise mittels vergleichender Verfahren empirisch bestimmt werden. Die räumlichen Verteilungen von Lichtintensitäten $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 sind daher mittels eines Mikroskops detektierte Intensitäten von Licht von im Allgemeinen unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Im Gegensatz dazu bezeichnet $I_{F L}^{t o t}$
die Intensitätsverteilung von Licht, welches vom Fluoreszenzfarbstoff im Objektbereich tatsächlich erzeugt wird. D. h., der störende Einfluss des den Fluoreszenzfarbstoff umgebenden Gewebes schlägt sich nicht in $I_{F L}^{t o t},$
jedoch in $I_{F L}^{det}$
nieder. Da $I_{F L}^{t o t}$
die Intensitätsverteilung von Fluoreszenzlicht ohne den störenden Einfluss des Gewebes repräsentiert, ist $I_{F L}^{t o t}$
ein Maß für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich und damit auch für die räumliche Verteilung der Menge/Konzentration kranken Gewebes im Objektbereich.
Herkömmliche Mikroskopiesysteme, die dazu konfiguriert sind, $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 zu detektierten, weisen den Nachteil auf, dass diese Intensitätsverteilungen sequenziell nacheinander detektiert werden, so dass die Aufnahme der Intensitätsverteilungen $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 ein langwieriger Prozess ist. Gerade im Bereich der Chirurgie ist dies ein wesentlicher Nachteil, da sich das Gewebe im Objektbereich während der Aufnahme dieser Intensitätsverteilungen verändern kann, was die Genauigkeit der resultierenden Intensitätsverteilung $I_{F L}^{t o t}$
negativ beeinflusst.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskopiesystem bereitzustellen, welches diesen Nachteil überwindet. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskopiesystem bereitzustellen, welches die räumliche Verteilung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs wiederholt und schnell detektieren kann.
Gelöst wird die obige Aufgabe durch ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem, welches dazu konfiguriert ist, die Intensitätsverteilungen $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 gleichzeitig aufzunehmen.
Ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und Bestimmung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs in einem Gewebe in einem Objektbereich umfasst: ein Detektionssystem, welches dazu konfiguriert ist, Licht eines ersten Kanals in einem ersten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln, Licht eines zweiten Kanals in einem zweiten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln und Licht eines dritten Kanals in einem dritten Detektionsbereich zu detektierten und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln, wobei ein erster Teil des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs, d. h. ein erster Emissionswellenlängenbereich, (im Wesentlichen ausschließlich) im ersten Detektionsbereich (erster Kanal) detektiert wird, wobei ein Wellenlängenbereich, der in der Nähe des ersten Teils des Fluoreszenzspektrums liegt, d. h. ein erster Korrekturwellenlängenbereich, (im Wesentlichen ausschließlich) im zweiten Detektionsbereich (zweiter Kanal) detektiert wird und wobei ein Teil des Anregungsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs, d. h. ein zweiter Korrekturwellenlängenbereich, (im Wesentlichen ausschließlich) im dritten Detektionsbereich (dritter Kanal) detektiert wird.
„Im Wesentlichen ausschließlich“ bedeutet, dass eine Optik des Mikroskopiesystems, welche einen Objektbereich, in dem sich ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff angereichertes Gewebe befinden kann, auf die Detektionsbereiche abbildet, so konfiguriert ist, dass von dem Objektbereich ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs zu wenigstens 75%, bevorzugt wenigstens 90%, weiter bevorzugt wenigstens 99% auf den ersten Detektionsbereich gerichtet wird, von dem Objektbereich ausgehendes Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs zu wenigstens 75%, bevorzugt wenigstens 90%, weiter bevorzugt wenigstens 99% auf den zweiten Detektionsbereich gerichtet wird und von dem Objektbereich ausgehendes Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs zu wenigstens 75%, bevorzugt wenigstens 90%, weiter bevorzugt wenigstens 99% auf den dritten Detektionsbereich gerichtet wird.
Alternativ kann „im Wesentlichen ausschließlich“ so definiert sein, dass das Verhältnis der Intensität von Licht einer bestimmten Wellenlänge an einem Detektionsbereich zu der Intensität von Licht der selben Wellenlänge an einem anderen Detektionsbereich einen Wert von wenigstens 10:1, bevorzugt wenigstens 100:1, weiterbevorzugt wenigstens 1.000:1 beträgt.
Hierdurch stellt das Detektionssystem drei (Bild)-Signale bereit, welche die räumlichen Intensitätsverteilungen $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 repräsentieren. Das Mikroskopiesystem umfasst ferner eine Steuerung, welche die räumliche Verteilung der Intensität von im Objektbereich emittiertem Fluoreszenzlicht bestimmen kann und daraus einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich bestimmen kann. Beispielsweise ist der Näherungswert ein zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich proportionaler Wert.
Somit ist die Steuerung dazu konfiguriert, den Einfluss des um den Fluoreszenzfarbstoff angeordneten Gewebes aus dem Signal $I_{F L}^{det}$
zu eliminieren. Das resultierende Signal $I_{F L}^{t o t}$
kann von der Steuerung dazu verwendet werden, die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich zu bestimmen.
Um die den Intensitätsverteilungen $I_{F L}^{det},$
I_Kol und I_Ko2 zu Grunde liegenden Wellenlängenbereiche separat detektierten zu können, kann die Optik und/oder das Detektionssystem verschiedene wellenlängenabhängige optische Elemente umfassen.
Diese optischen Elemente können beispielsweise (dichroitische) Strahlteiler, optische Filter oder Filtermatrizen nach Art eines Bayer-Patterns umfassen.
Bei dem vorangehend beschriebenen Mikroskopiesystem wird der Umstand ausgenutzt, dass sich zwischen dem (Peak im) Absorptionsspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs und einem (Haupt)-Peak des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs ein verhältnismäßig großer Wellenlängenbereich befindet, so dass sich der erste Korrekturwellenlängenbereich und der zweite Korrekturwellenlängenbereich nicht oder im Wesentlichen nicht überlappen. Der erste Korrekturwellenlängenbereich und der zweite Korrekturwellenlängenbereich werden daher von unterschiedlichen Detektionsbereichen in unterschiedlichen Kanälen detektiert.
Jedoch kann ein Fluoreszenzfarbstoff mehrere lokale Absorptionsmaxima und mehrere lokale Emissionsmaxima aufweisen oder der Wellenlängenbereich zwischen dem Hauptabsorptionspeak und dem Hauptemissionspeak kann gering sein. In solchen Fällen kann es vorteilhaft sein, denselben Detektionsbereich sowohl für den ersten Korrekturwellenlängenbereich als auch für den zweiten Korrekturwellenlängenbereich zu verwenden. In diesem Fall liegen der erste Korrekturwellenlängenbereich und der zweite Korrekturwellenlängenbereich spektral gesehen nahe beieinander oder überlappen sich wenigstens teilweise oder wesentlich. Somit kann ein einziger Detektionsbereich zur Detektion von sowohl dem ersten Korrekturwellenlängenbereich als auch dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich verwendet werden. Somit steht auch lediglich ein (einziges) Korrektursignal für die Bestimmung des Näherungswertes für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs zur Verfügung. Die anderen Kanäle eines Mehrkanalbilddetektors, welcher auch den Detektionsbereich umfasst, in welchem der erste und zweite Korrekturwellenlängenbereich detektiert werden, können daher zur Aufnahme eines Übersichtsbildes verwendet werden. Das eben beschriebene Mikroskopiesystem bedient sich daher einem Spezialfall des oben beschriebenen Ausdrucks für die Näherung, für den gilt, dass I_Kol als Näherung für I_Ko2 angesehen werden kann.
Damit ergibt sich für diesen Spezialfall eine andere Funktion zur Bestimmung des Näherungswertes für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich, wobei diese Funktion als Argumente das erste Fluoreszenzlichtsignal und das erste Korrektursignal, welches Licht sowohl des ersten Korrekturwellenlängenbereichs als auch des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs repräsentiert, umfasst. Insbesondere kann diese Funktion als Term umfassen: $I_{F L}^{t o t} = B \frac{I_{F L}^{det}}{{(I_{K o})}^{γ}}$
wobei

: die räumliche Verteilung der Intensität von im Objektbereich emittiertem Fluoreszenzlicht bezeichnet,
: das erste Fluoreszenzlichtsignal bezeichnet,
I_Ko: das erste Korrektursignal bezeichnet,
B: einen Parameter bezeichnet, und
γ: einen weiteren Parameter bezeichnet.

Nachfolgend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang mit den Zeichnungen beschrieben.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines Stereomikroskops gemäß einer Ausführungsform.
2 zeigt eine beispielhafte spektrale Konfiguration von Elementen des Stereomikroskops der 1.
3A bis 3D zeigen eine beispielhafte spektrale Konfiguration für Beleuchtungslicht und für ein erstes optisches Filter des Stereomikroskops der 1.
4 zeigt eine beispielhafte spektrale Konfiguration für Beleuchtungslicht und weitere Elemente des Stereomikroskops der 1.
5 zeigt eine schematische Darstellung eines Stereomikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform.
6 zeigt eine räumliche Konfiguration von Detektionsbereichen eines Mehrkanalbilddetektors.
7 zeigt eine beispielhafte spektrale Konfiguration von Detektionsbereichen des Stereomikroskops der 5.
8 zeigt eine weitere beispielhafte spektrale Konfiguration für Beleuchtungslicht und Elemente des Stereomikroskops der 1.
9 zeigt eine weitere beispielhafte spektrale Konfiguration eines optischen Filters des Stereomikroskops der 1.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines Mikroskopiesystems 1 gemäß einer ersten Ausführungsform.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst eine Beleuchtungsvorrichtung 3, welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht 5 zu erzeugen und auf einen Objektbereich 7 zu richten. Die Beleuchtungsvorrichtung 5 kann eine oder mehrere schmalbandige und/oder breitbandige Lichtquellen sowie einen oder mehrere Beleuchtungsfilter umfassen, um das Beleuchtungslicht 5 zu erzeugen.
In dem Objektbereich 7 kann beispielsweise ein Gewebe mit einem Fluoreszenzfarbstoff angeordnet werden. Der Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise Protoporphyrin IX (PPIX) sein, dessen Absorptionsspektrum (33) zwischen ca. 350 nm und 650 nm liegt, wobei der dominante Absorptionspeak bei 405 nm liegt, und dessen Emissionsspektrum (35) zwischen 600 nm und 750 nm liegt, wobei die dominanten Absorptionspeaks bei 635 nm und 705 nm liegen (vgl. Diagramm 31 in 2).
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner ein erstes Detektionssystem 9 und eine erste Optik 11.
Das erste Detektionssystem 9 umfasst einen ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 und einen ersten Mehrkanalbilddetektor 19. Der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 ist ein Bilddetektor, d. h. der Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 gibt ein Signal aus, welches ein Bild repräsentiert, wobei das Bild die innerhalb eines bestimmten Zeitraums auf einen Detektionsbereich des Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 treffende Intensität von Licht repräsentiert. Der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 kann je nach Anwendung als monochromatischer Sensor oder als Mehrkanalbilddetektor konfiguriert sein, wobei ein Mehrkanalbilddetektor zur Detektion mehrerer verschiedener Kanäle geeignet ist.
Der erste Mehrkanalbilddetektor 19 ist ebenfalls ein Bilddetektor. Ein Mehrkanalbilddetektor weist mehrere verschiedene Detektionsbereich auf, welche jeweils Licht eines Kanals detektieren können und für jeden Kanal ein Signal ausgeben. Hierin bezeichnet „Kanal“ einen Wellenlängenbereich. Die Kanäle überlappen sich spektral höchstens teilweise. Beispielsweise überlappen sich die Kanäle des ersten Mehrkanalbilddetektors paarweise höchstens zu 100 nm, bevorzugt höchstens zu 50 nm. Ein Beispiel eines Mehrkanalbilddetektors ist eine herkömmliche RGB-Farbkamera.
Eine herkömmliche RGB-Farbkamera hat die Kanäle Rot (R), Grün (G) und Blau (B). Hierbei kann der Blau-Kanal den Wellenlängenbereich von 400 nm bis 530 nm umfassen, der Grün-Kanal kann den Wellenlängenbereich von 460 nm bis 600 nm umfassen und der Rot-Kanal kann den Wellenlängenbereich von 570 nm bis 750 nm umfassen.
Die erste Optik 11 umfasst ein Objektiv 21 und einen ersten Strahlteiler 23. Die erste Optik 11 kann weitere optische Elemente umfassen, beispielsweise die erste bildformende Linse 25 oder ein in 1 nicht dargestelltes erstes Zoom-Element, welches zwischen der ersten bildformenden Linse 25 und dem Objektiv 21 angeordnet sein kann.
Die erste Optik 11 ist dazu konfiguriert, den Objektbereich 7 auf Detektionsbereiche des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 und des Mehrkanalbilddetektors 19 abzubilden, so wie dies durch einen ersten Strahlengang 27 dargestellt ist. Die erste Optik 11 kann Filter und Filtermatrizen nach Art eines Bayer-Patterns umfassen, die unmittelbar vor den Detektionsbereichen angeordnet sind. D. h. hierin umfasst die Optik auch Filter, die fest mit den Detektoren verbunden sind.
Die Optik ist dazu konfiguriert, Licht bestimmter Wellenlängen im Wesentlichen ausschließlich auf einen einzigen der Detektionsbereich der Detektionsbereiche (je Stereo-Strahlengang) zu richten.
2 zeigt eine spektrale Konfiguration des Beleuchtungslichts 5, des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17, des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 und des ersten Strahlteilers 23 für einen in dem Objektbereich 7 angeordneten beispielhaften Fluoreszenzfarbstoff.
Das Diagramm 31 zeigt ein (auf seinen Maximalwert) normiertes Absorptionsspektrum 33 und ein (auf seinen Maximalwert) normiertes Emissionsspektrum 35. Das Absorptionsspektrum 33 und das Emissionsspektrum 35 entsprechen denen des Fluoreszenzfarbstoffs PPIX.
Das Diagramm 41 zeigt die Intensität des Beleuchtungslichts 5 in Abhängigkeit der Wellenlänge. In einem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1, welches sich von λEm1L bis λEm1H erstreckt, weist das Beleuchtungslicht 5 höchstens eine erste Intensität W1 auf. D. h. im gesamten Wellenlängenbereich von λEm1L bis λEm1H weist das Beleuchtungslicht 5 an keiner Wellenlänge eine Intensität auf, die größer als die erste Intensität W1 ist. Der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 umfasst wenigstens einen ersten Teil des Emissionsspektrums 35. In dem ersten Teil des Emissionsspektrums weist die (auf den Maximalwert des Emissionsspektrums 35) normierte Emission beispielsweise einen Wert von wenigstens 1%, bevorzugt, wenigstens 5%, weiter bevorzugt wenigstens 10% auf.
Ein erster Korrekturwellenlängenbereich Ko1 liegt spektral in der Nähe des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1. Beispielsweise liegt der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 im Bereich zwischen λEm1L - 150 nm und λEm1H+150 nm. Der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 überlappt den ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 nicht. Im ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 weist das Beleuchtungslicht 5 wenigstens eine zweite Intensität W2 auf. D. h. im gesamten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 weist das Beleuchtungslicht 5 an keiner Wellenlänge eine Intensität auf, die kleiner als die zweite Intensität ist. Die erste Intensität W1 ist beispielsweise um wenigstens einen Faktor 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1.000 oder 10.000 kleiner als die zweite Intensität W2, wodurch der Objektbereich 7 mit Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1 belichtet wird, während der erste Emissionswellenlängenbereiche Em1 im Wesentlichen nicht belichtet wird.
Ein zweiter Korrekturwellenlängenbereich Ko2 umfasst einen ersten Teil des Anregungsspektrums 33 des Fluoreszenzfarbstoffs. Der erste Teil des Anregungsspektrums 33 weist beispielsweise eine (auf den Maximalwert des Absorptionsspektrums 33) normierte Absorption von wenigstens 1%, bevorzugt wenigstens 5%, weiter bevorzugt wenigstens 10% auf. Im zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 weist das Beleuchtungslicht 5 wenigstens die zweite Intensität W2 auf. D. h. im gesamten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 weist das Beleuchtungslicht 5 an keiner Wellenlänge eine Intensität auf, die kleiner als die zweite Intensität ist. Hierdurch wird der Fluoreszenzfarbstoff angeregt, wodurch der Fluoreszenzfarbstoff Licht im Emissionsspektrum 35 emittiert.
In dem in 2 gezeigten Beispiel erstreckt sich der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 von 610 nm bis 655 nm; der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 erstreckt sich von 560 nm bis 595 nm; und der zweite Korrekturwellenlängenbereich Ko2 erstreckt sich von 390 nm bis 420 nm. Alternativ kann sich der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 von 640 nm bis 710 nm erstrecken; der zweite Korrekturwellenlängenbereich Ko2 kann sich von 430 nm bis 450 nm erstrecken.
Der erste Strahlteiler 23 der ersten Optik 11 kann beispielsweise ein dichroitischer Strahlteiler sein. D. h. der erste Strahlteiler 23 kann dazu konfiguriert sein, Licht mit einer Wellenlänge, die größer als eine erste Grenzwellenlänge λ1 ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 auszugeben und Licht mit einer Wellenlänge, die kleiner als die erste Grenzwellenlänge λ1 ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Mehrkanalbilddetektor 19 auszugeben. „Im Wesentlichen ausschließlich“ bedeutet beispielsweise, dass das Verhältnis des mittleren Transmissionsgrads in einen ersten Ausgang (zum ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17) im Wellenlängenbereich oberhalb der ersten Grenzwellenlänge λ1 zu dem mittleren Transmissionsgrad in einen zweiten Ausgang (zum ersten Mehrkanalbilddetektor 19) in demselben Wellenlängenbereich wenigstens 100, bevorzugt wenigstens 1.000 oder weiter bevorzugt wenigstens 10.000 beträgt.
Wie in dem in 2 gezeigten Beispiel kann die erste Grenzwellenlänge λ1 zwischen dem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 und dem ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 liegen. In dem in 2 gezeigten Beispiel beträgt die erste Grenzwellenlänge 600 nm. Hierdurch wird vom Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 (im Wesentlichen ausschließlich) zu dem ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 ausgegeben. Von dem Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1 wird (im Wesentlichen ausschließlich) zu dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 ausgegeben; und von dem Objektbereich 7 ausgehendes Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs Ko2 wird (im Wesentlichen ausschließlich) zu dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 ausgegeben.
Anstelle eines dichroitischen Strahlteilers kann auch ein konventioneller Strahlteiler zusammen mit entsprechenden Filtern verwendet werden, um dieselbe Wirkung zu erzielen. Ein zwischen dem konventionellen Strahlteiler und dem ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 angeordnetes Filter weist hierzu beispielsweise ausschließlich im ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 einen hohen Transmissionsgrad auf. Ein zwischen dem konventionellen Strahlteiler und dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 angeordnetes Filter weist hierzu beispielsweise in dem ersten und zweiten Korrekturwellenlängenbereich jeweils einen hohen Transmissionsgrad und in dem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 einen geringen Transmissionsgrad auf. Ein Verhältnis zwischen einem hohen und einem geringen Transmissionsgrad kann beispielsweise wenigstens 100, bevorzugt wenigstens 1.000 oder weiter bevorzugt wenigstens 10.000 betragen.
Durch den Strahlteiler 23 und weitere Filter, die den zweiten und dritten Kanal voneinander spektral trennen, ist die erste Optik 11 dazu konfiguriert, gleichzeitig von dem Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 auf einen ersten Detektionsbereich des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 abzubilden, vom Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1 auf einen zweiten Detektionsbereich des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 abzubilden und vom Objektbereich 7 ausgehendes Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs Ko2 auf einen dritten Detektionsbereich des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 abzubilden. Die weiteren Filter sind beispielsweise solche, die eine konventionelle RGB-Farbkamera aufweist.
Der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 ist dazu konfiguriert, in dem ersten Detektionsbereich Licht eines ersten Kanals zu detektierten. Licht des ersten Kanals wird in dem ersten Detektionsbereich detektiert und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umgewandelt. Mit anderen Worten bezeichnet „Kanal“ denjenigen Wellenlängenbereich, für den der erste Detektionsbereich des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 eine nicht vernachlässigbare Sensitivität für Licht aufweist. Das von dem ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 ausgegebene Fluoreszenzlichtsignal repräsentiert daher die innerhalb eines vorbestimmten Zeitraums auf den ersten Detektionsbereich treffende Intensität von Licht des ersten Kanals.
Das Diagramm 51 stellt den ersten Kanal Ch1 dar. Der erste Kanal Ch1 umfasst den ersten Emissionswellenlängenbereich Em1. Mit dem ersten Detektionsbereich wird daher Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 detektiert und ein entsprechendes Signal, das Fluoreszenzlichtsignal, ausgegeben. Im vorliegenden Beispiel erstreckt sich der erste Kanal Ch1 von etwa 600 nm bis 670 nm.
Der erste Mehrkanalbilddetektor 19 ist dazu konfiguriert, Licht eines zweiten Kanals Ch2 in einem zweiten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln. Das Diagramm 52 stellt den zweiten Kanal Ch2 des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 dar. Der zweite Kanal Ch2 umfasst den ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko 1. Im vorliegenden Beispiel erstreckt sich der zweite Kanal Ch2 von etwa 550 nm bis über 700 nm. Dies entspricht näherungsweise dem Rot-Kanal einer konventionellen RGB-Farbkamera.
Ferner ist der erste Mehrkanalbilddetektor 19 dazu konfiguriert, Licht eines dritten Kanals Ch3 in einem dritten Detektionsbereich zu detektierten und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln. Das Diagramm 53 stellt den dritten Kanal Ch3 des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 dar. Der dritte Kanal Ch3 umfasst den zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2. Im vorliegenden Beispiel erstreckt sich der dritte Kanal Ch3 von etwa 350 nm bis 540 nm. Dies entspricht näherungsweise dem Blau-Kanal einer konventionellen RGB-Farbkamera.
Wieder bezugnehmend auf 1 umfasst das Mikroskopiesystem 1 ferner eine Steuerung 29, welche das erste Fluoreszenzlichtsignal, das erste Korrektursignal und das zweite Korrektursignal von dem ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 bzw. von dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 empfängt. Die Steuerung ist dazu konfiguriert, das erste Fluoreszenzlichtsignal, das erste Korrektursignal und das zweite Korrektursignal zu verarbeiten und daraus einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich 7 zu bestimmen.
Durch das gleichzeitige und im Wesentlichen exklusive Abbilden des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 auf den ersten Detektionsbereich, des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1 auf den zweiten Detektionsbereich und des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs Ko2 auf den dritten Detektionsbereich ist es möglich, gleichzeitig Signale für diese drei Wellenlängenbereiche zu erhalten. Hierdurch kann der Näherungswert für die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich 7 wiederholt schnell berechnet werden.
Nachfolgend werden weitere Ausführungsformen beschrieben, welche auf der im Zusammenhang mit den 1 und 2 beschriebenen Ausführungsform basieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Optik 11 ferner ein erstes optisches Filter 61 (vgl. 1), welches zwischen dem ersten Strahlteiler 23 und dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 angeordnet ist. Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 kann wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% betragen. Ferner kann ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% betragen. Ferner kann ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 höchstens 30%, bevorzugt höchstens 10%, weiter bevorzugt höchstens 1% betragen.
In den 3A bis 3D sind verschiedene Ausführungsformen für die Beleuchtung und das erste optische Filter 61 dargestellt.
In der Ausführungsform gemäß 3A weist das Beleuchtungslicht 5 im Wellenlängenbereich von etwa 400 nm bis etwa 600 nm wenigstens die zweite Intensität W2 auf, wobei die erste Grenzwellenlänge λ1 des dichroitischen Strahlteilers 23 bei etwa 600 nm liegt. Außerhalb dieses Wellenlängenbereichs weist das Beleuchtungslicht 5 höchstens die erste Intensität W1 auf, d. h. von 600 nm bis mindestens 720 nm. Der Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm umfasst dabei den ersten und zweiten Korrekturwellenlängenbereich.
Das erste optische Filter 61 weist in einem Wellenlängenbereich von etwa 400 nm bis etwa 600 nm einen hohen mittleren Transmissionsgrad T auf und weist außerhalb dieses Wellenlängenbereichs einen geringen Transmissionsgrad auf. Beispielsweise beträgt ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen 400 nm und 600 nm wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90%. Hierdurch wird der Objektbereich 7 im ersten und zweiten Korrekturwellenlängenbereich belichtet und das am Objektbereich 7 reflektierte Licht des ersten und zweiten Korrekturwellenlängenbereichs wird durch das erste Filter 61 auf den ersten Mehrkanalbilddetektor 19 abgebildet. Dort wird das reflektierte Licht von dem zweiten Detektionsbereich und dem dritten Detektionsbereich in verschiedenen Kanälen detektiert, nämlich im zweiten bzw. im dritten Kanal.
Der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 kann in dieser Ausführungsform beispielsweise einen Bereich um 635 nm, einen Bereich um 705 nm oder einen Bereich von 635 nm bis 705 nm umfassen. Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) kann im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens einen Wert (W3) aufweisen, welcher wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt 100, weiter bevorzugt 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist.
Hierdurch kann, wenn der erste Mehrkanalbilddetektor 19 beispielsweise eine konventionelle RGB-Farbkamera ist, ein farbtreues Übersichtsbild mit der BGB-Kamera aufgenommen werden und zudem kann das Signal des Rot-Kanals, welcher den ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 umfasst, und das Signal des Blau-Kanals, welcher den zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 umfasst, zur Bestimmung der räumlichen Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs verwendet werden. Während hierdurch ein besonders farbtreues Übersichtsbild erzeugt werden kann, repräsentiert das Signal des Rot-Kanals nicht nur die Intensität von Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1, sondern auch Licht anderer Wellenlängen innerhalb des Rot-Kanals. Dasselbe gilt entsprechend für den Blau-Kanal. Dies kann sich negativ auf die Genauigkeit der Bestimmung der räumlichen Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs auswirken.
Wie in 3B dargestellt, entspricht das Beleuchtungslicht 5 gemäß einer weiteren Ausführungsform dem Beleuchtungslicht 5, wie es in der in 3A gezeigten Ausführungsform verwendet wird. Das erste Filter 61 gemäß 3B weist lediglich im ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 einen hohen Transmissionsgrad und im Übrigen einen geringen Transmissionsgrad auf. Beispielsweise beträgt ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) höchstens einen Wert (W3), welcher wenigstens um einen Faktor 10, 100 oder 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist. Die Bereiche mit hohen Transmissionsgraden im ersten Filter 61 gemäß 3B können auch etwa 5 nm bis 25 nm in jede Richtung breiter sein als der erste bzw. zweite Korrekturwellenlängenbereich.
Das Übersichtsbild, welches in dieser Ausführungsform mit einer konventionellen RGB-Kamera (für den ersten Mehrkanalbilddetektor 19) erhalten wird, ist wegen der Unterdrückung eines Abschnitts des sichtbaren Spektrums nicht farbtreu. Jedoch ist die Genauigkeit für die Bestimmung der räumlichen Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs verbessert, da dem zweiten Detektionsbereich (Rot-Kanal) lediglich Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs Ko1 zugeführt wird und weil dem dritten Detektionsbereich (Blau-Kanal) lediglich Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs Ko2 zugeführt wird.
Dieselbe Wirkung wird auch mit der in 3C dargestellten Ausführungsform erreicht. Hierbei weist das Beleuchtungslicht 5 ausschließlich im ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 wenigstens die zweite Intensität W2 auf und im Übrigen lediglich höchstens die erste Intensität W1. Das erste Filter 61 gemäß 2C entspricht dem ersten Filter 61 gemäß 3A.
Eine verbesserte Farbtreue und gleichzeitig eine hohe Genauigkeit bei der Bestimmung der räumlichen Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs lässt sich mit der Konfiguration gemäß 3D erreichen. Hierzu weist der erste Mehrkanalbilddetektor 19 ferner einen vierten Detektionsbereich auf, mit welchem Licht eines vierten Kanals Ch4 detektiert und in ein Signal des vierten Kanals umgewandelt werden kann. Der vierte Kanal Ch4 überlappt den zweiten und den dritten Kanal jeweils höchstens teilweise. Bei einer konventionellen RGB-Farbkamera entspricht der vierte Kanal beispielsweise dem Grün-Kanal, welcher beispielhaft in 2 in Diagramm 54 dargestellt ist.
Das Beleuchtungslicht 5 weist in einem Ergänzungswellenlängenbereich G1, der im vierten Kanals Ch4 (Grün-Kanal) enthalten ist, eine mittlere vierte Intensität W4 auf. Die mittlere vierte Intensität kann 0,01% bis 50% der zweiten Intensität (W2), bevorzugt 0,05% bis 10% der zweiten Intensität (W2), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% der zweiten Intensität (W2) betragen. Dabei kann die erste Intensität (W1) wenigstens um den Faktor 10, bevorzugt wenigstens um den Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um den Faktor 1.000 kleiner als die mittlere vierte Intensität (W4) sein.
Zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 und dem Ergänzungswellenlängenbereich G1 und zwischen dem Ergänzungswellenlängenbereich G1 und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 kann das Beleuchtungslicht 5 beispielsweise höchstens die erste Intensität W1 aufweisen. Der Ergänzungswellenlängenbereich G1 kann beispielsweise einen Wellenlängenbereich von 520 nm bis 570 nm umfassen.
Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) beträgt im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) beispielsweise jeweils 0,01% bis 50% eines mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1), bevorzugt 0,05% bis 10% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1).
Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und zwischen dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) kann jeweils wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt 100, weiter bevorzugt 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Mikroskopiesystem 1 ein Stereomikroskopiesystem, wie in 1 dargestellt. Hierzu umfasst das in 1 dargestellte Mikroskopiesystem 1 ferner eins zweites Detektionssystem 109 und eine zweite Optik 111. Das zweite Detektionssystem 109 kann ähnlich oder identisch konfiguriert sein wie das erste Detektionssystem 9. Die zweite Optik 111 kann ähnlich oder identisch konfiguriert sein wie die erste Optik 11.
Das zweite Detektionssystem 109 umfasst einen zweiten Fluoreszenzlichtbilddetektor 117 und einen zweiten Mehrkanalbilddetektor 119. Der zweite Fluoreszenzlichtbilddetektor 117 kann ähnlich oder identisch konfiguriert sein wie der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor 17. Der zweite Mehrkanalbilddetektor 119 kann ähnlich oder identisch konfiguriert sein wie der erste Mehrkanalbilddetektor 19.
Sind das zweite Detektionssystem 109 und das erste Detektionssystem 9 identisch konfiguriert, haben sie jeweils dieselbe spektrale Konfiguration.
Alternativ hierzu können der zweite Fluoreszenzlichtbilddetektor 117 und der zweite Mehrkanalbilddetektor 119 eine andere spektrale Konfiguration aufweisen, sodass ein weiterer Emissionswellenlängenbereich detektiert werden kann.
Hierzu ist der zweite Fluoreszenzlichtbilddetektor 117 dazu konfiguriert, einen zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2 zu detektierten, welcher von dem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 verschieden ist. Der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 erstreckt sich von λEm2L bis λEm2H und ist ein zweiter Teil des Emissionsspektrums 35 des Fluoreszenzfarbstoffs. Der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 und der zweite Emissionswellenbereich Em2 können sich beispielsweise teilweise überlappen oder sich nicht überlappen. Beispielsweise könne sich der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 und der zweite Emissionswellenbereich Em2 höchstens 50 nm, insbesondere höchstens 20 nm oder höchstens 10 nm überlappen.
Der zweite Fluoreszenzlichtbilddetektor 117 ist dazu konfiguriert, Licht eines fünften Kanals in einem fünften Detektionsbereich zu detektierten und in ein zweites Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln. Ferner ist der zweite Mehrkanalbilddetektor 119 dazu konfiguriert, Licht eines sechsten Kanals in einem sechsten Detektionsbereich zu detektierten und in ein drittes Korrektursignal umzuwandeln. Ferner ist der Mehrkanalbilddetektor 119 dazu konfiguriert, Licht eines siebten Kanals in einem siebten Detektionsbereich zu detektierten und in ein viertes Korrektursignal umzuwandeln.
Ein Beispiel für eine beispielhafte spektrale Konfiguration ist in 4 dargestellt.
Das Diagramm 31 zeigt das normierte Absorptionsspektrum 33 und das normierte Emissionsspektrum 35. Das Diagramm 41 zeigt die Intensität des Beleuchtungslichts 5 in Abhängigkeit der Wellenlänge.
Das Diagramm 151 stellt den fünften Kanal Ch5 dar. Der fünfte Kanal Ch5 umfasst den zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2. Mit dem fünften Detektionsbereich wird daher Licht des zweiten Emissionswellenlängenbereichs Em2 detektiert und ein entsprechendes Signal ausgegeben. Im vorliegenden Beispiel umfasst der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 eine Wellenlänge von 680 nm bis 720 nm. Insbesondere umfasst der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 die Wellenlänge 705 nm.
Das Diagramm 152 stellt den sechsten Kanal Ch6 des zweiten Mehrkanalbilddetektors 119 dar. Der sechste Kanal Ch6 umfasst einen dritten Korrekturwellenlängenbereich Ko3. Der dritte Korrekturwellenlängenbereich Ko3 liegt zwischen λEm2L - 150 nm und λEm2H + 150 nm und überlappt den zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2 nicht. Im vorliegenden Beispiel erstreckt sich der sechste Kanal Ch6 von etwa 550 nm bis über 700 nm. Dies entspricht näherungsweise dem Rot-Kanal einer konventionellen RGB-Farbkamera.
Das Diagramm 153 stellt den siebten Kanal Ch3 des zweiten Mehrkanalbilddetektors 119 dar. Der siebte Kanal Ch7 umfasst einen vierten Korrekturwellenlängenbereich Ko4. Der vierte Korrekturwellenlängenbereich Ko4 umfasst einen zweiten Teil des Anregungsspektrums 33 des Fluoreszenzfarbstoffs. Im vorliegenden Beispiel erstreckt sich der siebte Kanal Ch7 von etwa 350 nm bis 540 nm. Dies entspricht näherungsweise dem Blau-Kanal einer konventionellen RGB-Farbkamera.
Somit können verschiedene Teile des Emissionsspektrums durch unterschiedliche Detektoren, nämlich den ersten und zweiten Fluoreszenzlichtbilddetektor separat voneinander detektiert werden.
Das Beleuchtungslicht 5 weist im zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2 höchstens die erste Intensität W1 auf. Ferner weist das Beleuchtungslicht 5 im dritten Korrekturwellenlängenbereich Ko3 und im vierten Korrekturwellenlängenbereich Ko4 wenigstens die zweite Intensität auf.
Die zweite Optik 111, welche das Objektiv 21 und einen zweiten Strahlteiler 123 umfasst, ist dazu konfiguriert, vom Objektbereich ausgehendes Licht des zweiten Emissionswellenlängenbereichs Em2 (im Wesentlichen ausschließlich) auf den fünften Detektionsbereich abzubilden, vom Objektbereich ausgehendes Licht des dritten Korrekturwellenlängenbereichs Ko3 (im Wesentlichen ausschließlich) auf den sechsten Detektionsbereich abzubilden und vom Objektbereich ausgehendes Licht des vierten Korrekturwellenlängenbereichs Ko4 (im Wesentlichen ausschließlich) auf den siebten Detektionsbereich abzubilden. Insbesondere kann der zweite Strahlteiler 123 ein dichroitischer Strahlteiler mit einer zweiten Grenzwellenlänge λ2 sein oder wie der erste Strahlteiler 23 konfiguriert sein.
Die Steuerung 29 ist ferner dazu konfiguriert, den Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich 7 ferner unter Verwendung des zweiten Fluoreszenzlichtsignals, des dritten Korrektursignals und des vierten Korrektursignals zu bestimmen.
5 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Mikroskopiesystems 200 zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und Bestimmung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs in einem Gewebe in einem Objektbereich.
Komponenten des Mikroskopiesystems 200, die denen des in 1 gezeigten Mikroskopiesystems 1 gleich sind, werden mit denselben Bezugszeichen bezeichnet und auf deren Beschreibung wird verwiesen.
Das Mikroskopiesystem 200 umfasst die Beleuchtungsvorrichtung 3, welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht 5 zu erzeugen und auf den Objektbereich 7 zu richten.
Das Mikroskopiesystem 200 umfasst eine erste Optik 211, welche ein Objektiv 21 umfasst und dazu konfiguriert ist, vom Objektbereich 7 ausgehendes Licht auf einen ersten Mehrkanalbilddetektor 203 abzubilden. Die erste Optik 211 kann eine bildformende Linse 25 umfassen, so wie dies in 5 gezeigt ist. Ferner kann die erste Optik 211 ein Zoom-System (nicht dargestellt) umfassen.
Der erste Mehrkanalbilddetektor 203 ist dazu konfiguriert, Licht eines ersten Kanals Ch1 in einem ersten Detektionsbereich D1 zu detektierten und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln, Licht eines zweiten Kanals Ch2 in einem zweiten Detektionsbereich D2 zu detektierten und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln und Licht eines dritten Kanals Ch3 in einem dritten Detektionsbereich D3 zu detektierten und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln. Die Kanäle des ersten Mehrkanalbilddetektors 203 überlappen sich spektral im Wesentlichen nicht, so dass jeder der Detektionsbereiche den ihm zugeordneten Kanal im Wesentlichen exklusiv detektiert. Auf diese Weise können verschiedene Spektralbereiche gleichzeitig detektiert werden.
Für zwei aneinander grenzende oder sich teilweise überlappende Kanäle M und N kann beispielsweise die folgende Bedingung gelten: $\int_{M \cup N} S_{M} (λ) \cdot S_{N} (λ) d λ \leq W$
wobei

S_M: die auf die maximale Sensitivität normierte Sensitivität des Detektionsbereichs für den Kanal M repräsentiert,
S_N: die auf die maximale Sensitivität normierte Sensitivität des Detektionsbereichs für den Kanal N repräsentiert,
λ: die Wellenlänge repräsentiert, und
W: 20%, bevorzugt 10%, weiter bevorzugt 1% beträgt.

Ein Beispiel der Konfiguration des ersten Mehrkanalbilddetektors 203 ist in den 6 und 7 dargestellt. 6 zeigt eine beispielhafte räumliche Anordnung der Detektionsbereiche D1, D2, D3 und D4 des ersten Mehrkanalbilddetektors 203. In diesem Beispiel weist der erste Mehrkanalbilddetektors 203 einen weiteren vierten Detektionsbereich D4 auf, mit welchem der erste Mehrkanalbilddetektor 203 dazu konfiguriert ist, Licht eines vierten Kanals Ch4 zu detektierten und ein entsprechendes Signal auszugeben. Der erste Detektionsbereich D1 besteht aus einer Vielzahl regelmäßig angeordneter Pixel. Ebenso besteht der zweite Detektionsbereich D2, der dritte Detektionsbereich D3 und der vierte Detektionsbereich D4 jeweils aus regelmäßig angeordneten Pixeln, wobei sich die verschiedenen Detektionsbereiche räumlich nicht überlagern.
7 zeigt die Kanäle des ersten Mehrkanalbilddetektors 203. Mit anderen Worten zeigt 7 als Kanäle diejenigen Wellenlängenbereiche, in denen die jeweiligen Detektionsbereiche eine signifikante Sensitivität für Licht aufweisen. Eine Sensitivität kann beispielsweise für eine bestimmte Wellenlänge als signifikant betrachtet werden, wenn die Sensitivität an dieser Wellenlänge wenigstens 10%, bevorzugt wenigstens 30% der maximalen Sensitivität des Detektionsbereichs beträgt.
Im vorliegenden Beispiel ist der erste Detektionsbereich D1 dazu konfiguriert, Licht in einem Wellenlängenbereich um 635 nm (erster Kanal Ch1) zu detektierten. Insbesondere umfasst der erste Kanal Ch1 einen Wellenlängenbereich von 610 nm bis 650 nm.
Der vierte Detektionsbereich D4 ist dazu konfiguriert, Licht eines Wellenlängenbereichs um 705 nm (vierter Kanals Ch4) zu detektierten. Insbesondere umfasst der vierte Kanal einen Wellenlängenbereich von 650 nm bis 720 nm.
Der zweite Detektionsbereich D2 ist dazu konfiguriert, Licht eines Wellenlängenbereichs um 600 nm (zweiter Kanal Ch2) zu detektierten. Insbesondere umfasst der zweite Kanal Ch2 einen Wellenlängenbereich von 560 nm bis 610 nm.
Der dritte Detektionsbereich D3 ist dazu konfiguriert, Licht eines Wellenlängenbereichs um 405 nm (dritter Kanal Ch3) zu detektierten. Insbesondere umfasst der dritte Kanal Ch3 einen Wellenlängenbereich von 390 nm bis 450 nm.
Die spektrale Konfiguration der einzelnen Detektionsbereiche kann beispielsweise durch Bandfilter erzielt werden, deren Fertigung dem Fachmann geläufig ist.
Wieder bezugnehmend auf 5 ist die Beleuchtungsvorrichtung 3 dazu konfiguriert, das Beleuchtungslicht 5 so zu erzeugen, dass es in einem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1, welcher ein Teil des Emissionsspektrums 35 des Fluoreszenzfarbstoffs (vgl. 2) ist und in dem ersten Kanal Ch1 enthalten ist, höchstens eine erste Intensität W1 aufweist. Der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 erstreckt sich von λEm1L bis λEm1H.
Ferner weist das Beleuchtungslicht 5 in einem ersten Korrekturwellenlängenbereich Ko1 und in einem zweiten Korrekturwellenlängenbereich Ko2 jeweils wenigstens eine zweite Intensität W2 auf. Der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 ist in dem zweiten Kanal Ch2 enthalten; und der zweite Korrekturwellenlängenbereich Ko2 ist in dem dritten Kanal Ch3 enthalten. Der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 liegt in der Nähe des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1, beispielsweise zwischen λEm1L-150nm und λEm1+150 nm und überlappt den ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 nicht. Der zweite Korrekturwellenlängenbereich Ko2 umfasst einen Teil des Anregungsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs. Die erste Intensität W1 ist wenigstens um einen Faktor 2 kleiner als die zweite Intensität W2. Dies ist beispielhaft im Diagramm 41 der 2 dargestellt.
Das Mikroskopiesystem 200 umfasst ferner eine Steuerung 29, welche dazu konfiguriert ist, einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich 7 unter Verwendung des ersten Fluoreszenzlichtsignals, des ersten Korrektursignals und des zweiten Korrektursignals zu bestimmen.
Wie in den 6 und 7 dargestellt, weist der erste Mehrkanalbilddetektor 203 den vierten Detektionsbereich D4 auf, welcher dazu konfiguriert ist, Licht des vierten Kanals Ch4 zu detektierten. Der vierte Kanal kann beispielsweise so gewählt werden, dass er einen zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2 umfasst, welcher ein zweiter Teil des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs ist und sich mit dem ersten Emissionswellenlängenbereich nicht überlappt. Auf diese Weise kann das Emissionsspektrum in mehreren verschiedenen Wellenlängenbereichen abgetastet werden und mehrere Fluoreszenzlichtsignale stehen dann zur Bestimmung des Näherungswertes für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs zur Verfügung. Beispielsweise kann der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 einen Wellenlängenbereich von 670 nm bis 710 nm umfassen und insbesondere die Wellenlänge 705 nm umfassen.
Alternativ kann der vierte Kanal Ch4 dazu konfiguriert sein, einen im sichtbaren Spektralbereich außerhalb des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs, außerhalb des zweiten Kanals Ch2 und außerhalb des dritten Kanals Ch3 liegenden Wellenlängenbereich zu detektierten, um hierdurch die Farbtreue des Übersichtsbildes zu verbessern. Beispielsweise kann der vierte Kanal Ch4 einen Wellenlängenbereich um 500 nm umfassen, um einen Wellenlängenbereich grünen Lichts zu detektierten.
Weiter alternativ kann der Mehrkanalbilddetektor 203 so konfiguriert sein, dass der erste Kanal Ch1 und der vierte Kanal Ch4 sich spektral teilweise überlappen. So können sich auch der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 und der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 spektral teilweise überlappen. Der Überlapp zwischen dem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 und dem zweiten Emissionswellenlängenbereich Em2 kann beispielweise höchstens 50 nm, insbesondere höchsten 20 nm oder höchstens 10 nm sein. Der Überlapp zwischen dem ersten Kanal Ch1 und dem vierten Kanal kann beispielsweise höchstens 100 nm, insbesondere höchstens 50 nm oder höchstens 20 nm sein.
Wie in 5 dargestellt, kann das Mikroskopiesystem 200 als Stereomikroskopiesystem ausgebildet sein. Hierzu umfasst das Mikroskopiesystem 200 ferner eine zweite Optik 311, welche dazu konfiguriert ist, den Objektbereich 7 auf einen zweiten Mehrkanalbilddetektor 303 abzubilden. Der zweite Mehrkanalbilddetektor 303 kann ähnlich oder identisch wie der erste Mehrkanalbilddetektor 203 konfiguriert sein.
Eine weitere Ausführungsform wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die 1, 8 und 9 beschrieben. Das Mikroskopiesystem gemäß dieser Ausführungsform entspricht im Wesentlichen dem in 1 gezeigten Mikroskopiesystem 1, wobei das Beleuchtungslicht 5, die erste Optik 11, die zweite Optik 111, sowie das erste Detektionssystem 9 und das zweite Detektionssystem 109 eine andere spektrale Konfiguration aufweisen, die in den 8 und 9 dargestellt ist.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ein erstes Detektionssystem 9, welches einen ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 und einen ersten Mehrkanalbilddetektor 19 umfasst. Der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 ist dazu konfiguriert, Licht eines ersten Kanals Ch1 in einem ersten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln. Der erste Mehrkanalbilddetektor 19 ist dazu konfiguriert, Licht eines zweiten Kanals Ch2 in einem zweiten Detektionsbereich zu detektierten und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln.
Die Beleuchtungsvorrichtung 3 ist dazu konfiguriert, Beleuchtungslicht 5 zu erzeugen und auf den Objektbereich 7 zu richten.
8 zeigt eine beispielhafte spektrale Konfiguration des Mikroskopiesystems. Das Diagramm 31 zeigt die spektrale Konfiguration des Fluoreszenzfarbstoffs. Das Diagramm 41 zeigt die spektrale Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts 5.
Das Diagramm 51 zeigt die spektrale Konfiguration des ersten Detektionsbereichs des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17. Das Diagramm 52 zeigt die spektrale Konfiguration des zweiten Detektionsbereichs des ersten Mehrkanalbilddetektors 19. Das Diagramm 53 zeigt die spektrale Konfiguration eines dritten Detektionsbereichs des ersten Mehrkanalbilddetektors 19.
Wie im Diagramm 41 dargestellt, weist das Beleuchtungslicht 5 in einem Korrekturwellenlängenbereich Ko wenigstens eine zweite Intensität W2 auf und weist in einem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 höchstens eine erste Intensität W1 auf. Durch diese Konfiguration des Beleuchtungslichts 5 wird der Fluoreszenzfarbstoff im Wesentlichen im Wellenlängenbereich Ko angeregt. D. h., der Korrekturwellenlängenbereich Ko umfasst wenigstens einen Teil des Anregungsspektrums 33 des Fluoreszenzfarbstoffs. Zudem liegt der Korrekturwellenlängenbereich Ko zwischen λEm1L - 15 nm und λEm1H + 150 nm, wobei sich der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 von λEm1L bis λEm1H erstreckt und ein erster Teil des Emissionsspektrums 35 des Fluoreszenzfarbstoffs ist. Der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 und der Korrekturwellenlängenbereich Ko überlappen sich spektral nicht.
Wieder bezugnehmend auf 1 ist die erste Optik 11 dazu konfiguriert, gleichzeitig von dem Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 auf den ersten Detektionsbereich des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 abzubilden und von dem Objektbereich 7 ausgehendes Licht des Korrekturwellenlängenbereichs Ko auf den zweiten Detektionsbereich des Mehrkanalbilddetektors 19 abzubilden.
Wie in 8 dargestellt, umfasst der erste Kanal Ch1 des ersten Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 den ersten Emissionswellenlängenbereich Em1. Ferner umfasst der zweite Kanal Ch2 des ersten Mehrkanalbilddetektors 19 den Korrekturwellenlängenbereich Ko.
Gemäß dieser Konfiguration wird der Fluoreszenzfarbstoff im Wellenlängenbereich Ko angeregt. Beispielsweise umfasst der Korrekturwellenlängenbereich Ko die Wellenlänge 630 nm, an welcher der Fluoreszenzfarbstoffs PPIX ein lokales Absorptionsmaximum aufweist. Bevorzugt umfasst der Korrekturwellenlängenbereich Ko einen Wellenlängenbereich von 620 nm bis 650 nm, weiter bevorzugt einen Wellenlängenbereich von 610 nm bis 660 nm.
Der auf diese Weise angeregte Fluoreszenzfarbstoff emittiert Fluoreszenzlicht in einem Nebenmaximum um 705 nm. Daher umfasst der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 die Wellenlänge 705 nm. Bevorzugt umfasst der erste Emissionswellenlängenbereich einen Wellenlängenbereich von 680 nm bis 710 nm, weiter bevorzugt von 670 nm bis 720 nm.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner den Strahlteiler 23, welcher beispielsweise als dichroitischer Strahlteiler mit einer Grenzwellenlänge λ1 von beispielsweise 660 nm konfiguriert sein kann. Alternativ kann der erste Strahlteiler 23 ein konventioneller Strahlteiler sein und das Mikroskopiesystem 1 kann ferner Filter umfassen, so dass der Strahlteiler 23 in Verbindung mit den Filtern Licht des Emissionswellenlängenbereichs Em1 im Wesentlichen ausschließlich auf den ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor 17 abbildet und Licht des Korrekturwellenlängenbereichs Ko im Wesentlichen ausschließlich auf den Mehrkanalbilddetektor 19 abbildet. Die Grenzwellenlänge des ersten Strahlteilers 23 liegt dementsprechend zwischen dem ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 und dem Korrekturwellenlängenbereich Ko, bevorzugt zwischen 600 nm und 700 nm, weiter bevorzugt zwischen 655 nm und 675 nm, noch weiter bevorzugt bei 660 nm.
Durch diese spektrale Konfiguration wird vom Objektbereich 7 ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs Em1 im Wesentlichen ausschließlich auf den ersten Detektionsbereich abgebildet und damit im ersten Kanal Ch1 detektiert. Das vom Objektbereich 7 ausgehende Licht des Korrekturwellenlängenbereichs Ko wird dementsprechend im Wesentlichen ausschließlich auf den zweiten Detektionsbereich abgebildet und im zweiten Kanal Ch2 detektiert.
Zur Erzeugung eines farbtreuen Übersichtsbildes weist das Beleuchtungslicht 5 in einem Ergänzungswellenlängenbereich G2 eine mittlere fünfte Intensität W5 auf, die kleiner als die zweite Intensität W2, jedoch größer als die erste Intensität W1 ist. Beispielsweise beträgt die mittlere fünfte Intensität 0,01% bis 50% der zweiten Intensität W2, bevorzugt 0,05% bis 10% der zweiten Intensität W2, weiter bevorzugt 0,1 % bis 1% der zweiten Intensität W2.
Die erste Optik 11 umfasst ferner ein erstes optisches Filter 61, welches zwischen dem ersten Strahlteiler 23 und dem ersten Mehrkanalbilddetektor 19 angeordnet ist. 9 zeigt die spektrale Konfiguration des ersten optischen Filters 61. Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im Korrekturwellenlängenbereich Ko beträgt 0,01% bis 50% eines mittleren Transmissionsgrades des ersten optischen Filters 61 im Ergänzungswellenlängenbereich G2. Ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters im ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 kann wenigstens um einen Faktor von wenigstens 10 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im Korrekturwellenlängenbereich Ko sein. Bevorzugt weist ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im Korrekturwellenlängenbereich 0,05% bis 10% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters 61 im Ergänzungswellenlängenbereich G2 auf, weiter bevorzugt 0,1% bis 1% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters 61 im Ergänzungswellenlängenbereich G2. Bevorzugt ist ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im ersten Emissionswellenlängenbereich Em1 um wenigstens einen Faktor 100 oder weiter bevorzugt 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters 61 im Korrekturwellenlängenbereich Ko.
Der erste Mehrkanalbilddetektor 19 kann ferner dazu konfiguriert sein, Licht wenigstens eines dritten Kanals Ch3 in wenigstens einem dritten Detektionsbereich zu detektierten und in wenigstens ein Farbsignal umzuwandeln, wobei der wenigstens eine dritte Kanal Ch3 den zweiten Kanal Ch2 höchstens teilweise überlappt und wobei der wenigstens eine dritte Kanal Ch3 den Ergänzungswellenlängenbereich G2 wenigstens teilweise umfasst. In dem in 8 dargestellten Beispiel zeigt das Diagramm 53 die spektrale Konfiguration des dritten Detektionsbereichs des ersten Mehrkanalbilddetektors 19. Der dritte Kanal Ch3 umfasst den Ergänzungswellenlängenbereich G2 wenigstens teilweise. Wie in den vorangehenden Beispielen, kann der erste Mehrkanalbilddetektor 19 eine konventionelle RGB-Farbkamera sein.
In einer Weiterbildung des in 1 dargestellten Mikroskopiesystems 1 ist anstelle des Fluoreszenzlichtbilddetektors 17 bzw. 117 ein weiterer Mehrkanalbilddetektor vorgesehen, welcher dazu konfiguriert ist, wenigstens zwei verschiedene Emissionswellenlängenbereiche in wenigstens zwei verschiedenen Kanälen zu detektierten und für jeden Kanal ein separates Fluoreszenzlichtsignal auszugeben. Beispielsweise ist dieser Mehrkanalbilddetektor dazu konfiguriert, in einem Kanal einen Wellenlängenbereich um die Wellenlänge 635 nm zu detektierten und in einem weiteren Kanal die Wellenlänge um 705 nm zu detektierten. Die so bereitgestellten Fluoreszenzlichtsignale könnten dann wie vorangehend beschrieben zur Bestimmung des Näherungswertes für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich verwendet werden.
In den vorangehend erläuterten Ausführungsformen kann der erste Emissionswellenlängenbereich Em1 wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein. Der erste Korrekturwellenlängenbereich Ko1 kann wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein. Der zweite Korrekturwellenlängenbereich Ko2 kann wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein.
Ferner kann der zweite Emissionswellenlängenbereich Em2 wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein. Der dritte Korrekturwellenlängenbereich Ko3 kann wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein. Der vierte Korrekturwellenlängenbereich Ko4 kann wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 50 nm oder wenigstens 100 nm breit sein.
Gemäß einer weiten Ausführungsform kann die erste Grenzwellenlänge λ1 des ersten Strahlteilers 23 und/oder die zweite Grenzwellenlänge λ2 des zweiten Strahlteilers 123 in einem Wellenlängenbereich von 600 nm bis 700 nm liegen, insbesondere bei 660 nm.
Gemäß einer weiten Ausführungsform ist zwischen dem ersten Strahlteiler (23) und dem ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) ein zweites optisches Filter angeordnet, dessen Transmissionsverhalten dem ersten Strahlteiler (23) nachgebildet ist. Alternativ das zweite optische Filter dazu konfiguriert sein, im Wesentlichen ausschließlich Licht der Emissionswellenlängenbereiche zu transmittieren und Licht außerhalb der Emissionswellenlängenbereiche zu unterdrücken. Ein weiteres zweites optisches Filter kann zwischen dem zweiten Strahlteiler (123) und dem zweiten Fluoreszenzlichtbilddetektor (117) angeordnet sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

P. A. Valdes et al., „A spectrally constrained dual-band normalization technique for protoporphyrin IX quantification in fluorescence-guided surgery“, Optical Society of America, Optics Letter, Vol. 37, No. 11, June 1, 2012, 1817-1819 [0004]

Claims

Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und Bestimmung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs in einem Gewebe in einem Objektbereich, wobei das Mikroskopiesystem umfasst: ein erstes Detektionssystem (9), welches einen ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) und einen ersten Mehrkanalbilddetektor (19) umfasst; wobei der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) dazu konfiguriert ist, • Licht eines ersten Kanals (Ch1) in einem ersten Detektionsbereich zu detektieren und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln; wobei der erste Kanal (Ch1) einen ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) umfasst; wobei der erste Mehrkanalbilddetektor (19) dazu konfiguriert ist, • Licht eines zweiten Kanals (Ch2) in einem zweiten Detektionsbereich zu detektieren und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln, wobei der zweite Kanal (Ch2) einen ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) umfasst; • Licht eines dritten Kanals (Ch3) in einem dritten Detektionsbereich zu detektieren und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln, wobei der dritte Kanal (Ch3) einen zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) umfasst; eine Beleuchtungsvorrichtung (3), welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht (5) zu erzeugen und auf den Objektbereich (7) zu richten, wobei das Beleuchtungslicht • im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens eine erste Intensität (W1) aufweist und • im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens eine zweite Intensität (W2) aufweist, • wobei die erste Intensität (W1) wenigstens um einen Faktor 2 kleiner als die zweite Intensität (W2) ist; eine erste Optik (11), welche ein Objektiv (21) und einen ersten Strahlteiler (23) umfasst; wobei die erste Optik dazu konfiguriert ist, gleichzeitig • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs (Em1) auf den ersten Detektionsbereich abzubilden; • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko1) auf den zweiten Detektionsbereich abzubilden; • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko2) auf den dritten Detektionsbereich abzubilden; und eine Steuerung, welche dazu konfiguriert ist, einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich unter Verwendung des ersten Fluoreszenzlichtsignals, des ersten Korrektursignals und des zweiten Korrektursignals zu bestimmen; wobei: • sich der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) von λEm1L bis λEm1H erstreckt und ein erster Teil des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs ist, • der erste Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) zwischen λEm1L-150 nm und λEm1H+150 nm liegt und den ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) nicht überlappt, • der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) einen ersten Teil des Anregungsspektrums (33) des Fluoreszenzfarbstoffs umfasst.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1, wobei der erste Strahlteiler (23) dazu konfiguriert ist, • Licht mit einer Wellenlänge, die größer als eine erste Grenzwellenlänge (λ1) ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) auszugeben und • Licht mit einer Wellenlänge, die kleiner als die erste Grenzwellenlänge ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Mehrkanalbilddetektor (19) auszugeben, • wobei die erste Grenzwellenlänge (λ1) zwischen dem ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) und dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) liegt, bevorzugt zwischen 570 nm und 620 nm oder zwischen 655 nm und 675 nm.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 2, wobei die erste Optik (11) ferner umfasst: ein erstes optisches Filter (61), welches zwischen dem ersten Strahlteiler (23) und dem ersten Mehrkanalbilddetektor (19) angeordnet ist, wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% beträgt; wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% beträgt; wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens einen Wert (W3) aufweist, welcher wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 3, wobei das Beleuchtungslicht (5) von 450 nm bis 550 nm, bevorzugt von 400 nm bis zur ersten Grenzwellenlänge (λ1) wenigstens die zweite Intensität (W2) aufweist; und wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% beträgt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 3, wobei das Beleuchtungslicht (5) von 450 nm bis 550 nm, bevorzugt von 400 nm bis zur ersten Grenzwellenlänge (λ1) wenigstens die zweite Intensität (W2) aufweist; und wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) höchstens einen Wert (W3) aufweist, welcher wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 3, wobei das Beleuchtungslicht (5) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) höchstens den ersten Intensitätswert (W1) aufweist; und wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 80%, weiter bevorzugt wenigstens 90% beträgt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 2, wobei der erste Mehrkanalbilddetektor (19) ferner dazu konfiguriert ist, Licht eines vierten Kanals (Ch4), welcher den zweiten Kanal (Ch2) und den dritten Kanal (Ch3) jeweils höchstens teilweise überlappt, in einem vierten Detektionsbereich zu detektieren und in ein Signal des vierten Kanals umzuwandeln; und wobei das Beleuchtungslicht (5) in einem Ergänzungswellenlängenbereich (G1), der im vierten Kanal (Ch4) enthalten ist, eine mittlere vierte Intensität (W4) aufweist, wobei die mittlere vierte Intensität 0,01% bis 50% der zweiten Intensität (W2), bevorzugt 0,05% bis 10% der zweiten Intensität (W2), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% der zweiten Intensität (W2) beträgt, wobei die erste Intensität (W1) wenigstens um den Faktor 10, bevorzugt wenigstens um den Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um den Faktor 1.000 kleiner als die mittlere vierte Intensität (W4) ist; und wobei die erste Optik (11) ferner umfasst: ein erstes optisches Filter (61), welches zwischen dem ersten Strahlteiler (23) und dem ersten Mehrkanalbilddetektor (19) angeordnet ist, wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) jeweils 0,01% bis 50% eines mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1), bevorzugt 0,05% bis 10% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G1) beträgt; und wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens einen Wert aufweist, welcher wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 7, wobei das Beleuchtungslicht (5) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und zwischen dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) höchstens die erste Intensität aufweist; und/oder wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) zwischen dem ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und zwischen dem Ergänzungswellenlängenbereich (G1) und dem zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) jeweils wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und/oder zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) ist.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Emissionsspektrum (35) des Fluoreszenzfarbstoffs den Wellenlängenbereich von 610 nm bis 720 nm umfasst; und/oder wobei der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) einen Wellenlängenbereich von 620 nm bis 660 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 635 nm umfasst; und/oder wobei der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) einen Wellenlängenbereich von 670 nm bis 710 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 705 nm umfasst; und/oder wobei der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) einen Wellenlängenbereich von 380 nm bis 450 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 405 nm umfasst; und/oder wobei der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) einen Wellenlängenbereich von 600 nm bis 650 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 630 nm umfasst; und/oder wobei sich der zweite und dritte Kanal höchstens teilweise überlappen.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, ferner umfassend: ein zweites Detektionssystem (109), welches einen zweiten Fluoreszenzlichtbilddetektor (117) und einen zweiten Mehrkanalbilddetektor (119) umfasst; wobei der zweite Fluoreszenzlichtbilddetektor (117) dazu konfiguriert ist, • Licht eines fünften Kanals (Ch5) in einem fünften Detektionsbereich zu detektieren und in ein zweites Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln; wobei der fünfte Kanal (Ch5) einen zweiten Emissionswellenlängenbereich (Em2) umfasst; wobei der zweite Mehrkanalbilddetektor (119) dazu konfiguriert ist, • Licht eines sechsten Kanals (Ch6) in einem sechsten Detektionsbereich zu detektieren und in ein drittes Korrektursignal umzuwandeln; wobei der sechste Kanal (Ch6) einen dritten Korrekturwellenlängenbereich (Ko3) umfasst; • Licht eines siebten Kanals (Ch7) in einem siebten Detektionsbereich zu detektieren und in ein viertes Korrektursignal umzuwandeln; wobei der siebte Kanal (Ch7) einen vierten Korrekturwellenlängenbereich (Ko4) umfasst; wobei das Beleuchtungslicht (5) • im zweiten Emissionswellenlängenbereich (Em2) höchstens die erste Intensität (W1) aufweist und • im dritten Korrekturwellenlängenbereich (Ko3) und im vierten Korrekturwellenlängenbereich (Ko4) wenigstens die zweite Intensität aufweist, eine zweite Optik (111), welche das Objektiv (21) und einen zweiten Strahlteiler (123) umfasst; wobei die zweite Optik dazu konfiguriert ist, • vom Objektbereich ausgehendes Licht des zweiten Emissionswellenlängenbereichs (Em2) auf den fünften Detektionsbereich abzubilden; • vom Objektbereich ausgehendes Licht des dritten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko3) auf den sechsten Detektionsbereich abzubilden; • vom Objektbereich ausgehendes Licht des vierten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko4) auf den siebten Detektionsbereich abzubilden; und wobei die Steuerung (29) ferner dazu konfiguriert ist, den Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich ferner unter Verwendung des zweiten Fluoreszenzlichtsignals, des dritten Korrektursignals und des vierten Korrektursignals zu bestimmen; wobei: • sich der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) und zweite Emissionswellenlängenbereich (Em2) teilweise oder nicht überlappen; • sich der zweite Emissionswellenlängenbereich (Em2) von λEm2L bis λEm2H erstreckt und ein zweiter Teil des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs ist, • der dritte Korrekturwellenlängenbereich (Ko3) zwischen λEm2L-150 nm und λEm2H+150 nm liegt und den zweiten Emissionswellenlängenbereich (Em2) nicht überlappt, • der vierte Korrekturwellenlängenbereich (Ko4) einen zweiten Teil des Anregungsspektrums (33) des Fluoreszenzfarbstoffs umfasst.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 10, wobei der zweite Strahlteiler (123) dazu konfiguriert ist, • Licht mit einer Wellenlänge, die größer als eine zweite Grenzwellenlänge ist, im Wesentlichen ausschließlich zum zweiten Fluoreszenzlichtbilddetektor (117) auszugeben und • Licht mit einer Wellenlänge, die kleiner als die zweite Grenzwellenlänge ist, im Wesentlichen ausschließlich zum zweiten Mehrkanalbilddetektor (119) auszugeben, • wobei die zweite Grenzwellenlänge zwischen dem zweiten (Em2) Emissionswellenlängenbereich und dem dritten Korrekturwellenlängenbereich (Ko3) liegt.
Mikroskopiesystem (200) zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und Bestimmung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs in einem Gewebe in einem Objektbereich, wobei das Mikroskopiesystem (200) umfasst: einen ersten Mehrkanalbilddetektor (203), welcher dazu konfiguriert ist, • Licht eines ersten Kanals (Ch1) in einem ersten Detektionsbereich (D1) zu detektieren und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln; wobei der erste Kanal (Ch1) einen ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) umfasst; • Licht eines zweiten Kanals (Ch2) in einem zweiten Detektionsbereich (D2) zu detektieren und in ein erstes Korrektursignal umzuwandeln, wobei der zweite Kanal (Ch2) einen ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) umfasst; • Licht eines dritten Kanals (Ch3) in einem dritten Detektionsbereich (D3) zu detektieren und in ein zweites Korrektursignal umzuwandeln, wobei der dritte Kanal (Ch3) einen zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) umfasst; • wobei sich der erste, zweite und dritte Kanal im Wesentlichen spektral nicht überlappen; eine Beleuchtungsvorrichtung (3), welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht (5) zu erzeugen und auf den Objektbereich (7) zu richten, wobei das Beleuchtungslicht • im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens eine erste Intensität (W1) aufweist und • im ersten Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) und im zweiten Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens eine zweite Intensität (W2) aufweist, • wobei die erste Intensität (W1) wenigstens um einen Faktor 2 kleiner als die zweite Intensität (W2) ist; eine erste Optik (211), welche ein Objektiv umfasst und dazu konfiguriert ist, gleichzeitig • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des ersten (Em1) Emissionswellenlängenbereichs auf den ersten Detektionsbereich (D1) abzubilden; • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des ersten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko1) auf den zweiten Detektionsbereich (D2) abzubilden; • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des zweiten Korrekturwellenlängenbereichs (Ko2) auf den dritten Detektionsbereich (D3) abzubilden; und eine Steuerung (29), welche dazu konfiguriert ist, einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich (7) unter Verwendung des ersten Fluoreszenzlichtsignals, des ersten Korrektursignals und des zweiten Korrektursignals zu bestimmen; wobei: • sich der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) von λEm1L bis λEm1H erstreckt und ein erster Teil des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs ist, • der erste Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) zwischen λEm1L-150 nm und λEm1H+150 nm liegt und den ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) nicht überlappt, • der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) einen ersten Teil des Anregungsspektrums (33) des Fluoreszenzfarbstoffs umfasst.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 12, wobei der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) einen Wellenlängenbereich von 610 nm bis 650 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 635 nm umfasst; und/oder wobei der erste Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) einen Wellenlängenbereich von 560 nm bis 610 nm wenigstens teilweise umfasst; und/oder wobei der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) einen Wellenlängenbereich von 390 nm bis 450 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 405 nm umfasst.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 12, wobei der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) einen Wellenlängenbereich von 670 nm bis 710 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 705 nm umfasst; und/oder wobei der erste Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) einen Wellenlängenbereich von 600 nm bis 660 nm wenigstens teilweise umfasst; und/oder wobei der zweite Korrekturwellenlängenbereich einen Wellenlängenbereich von 390 nm bis 450 nm wenigstens teilweise umfasst, insbesondere die Wellenlänge 405 nm umfasst.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 12 bis 14, • wobei der Mehrkanalbilddetektor (203) ferner dazu konfiguriert ist, Licht eines vierten Kanals (Ch4) in einem vierten Detektionsbereich (D4) zu detektieren und in ein zweites Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln; wobei der vierte Kanal (Ch4) einen zweiten Emissionswellenlängenbereich (Em2) umfasst; • wobei sich der erste, zweite, dritte und vierte Kanal im Wesentlichen spektral nicht überlappen; wobei das Beleuchtungslicht (5) im zweiten Emissionswellenlängenbereich (Em2) höchstens die erste Intensität (W1) aufweist; wobei die erste Optik (211) ferner dazu konfiguriert ist, gleichzeitig vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des zweiten Emissionswellenlängenbereichs (Em2) auf den vierten Detektionsbereich (D4) abzubilden; wobei die Steuerung (29) ferner dazu konfiguriert ist, den Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich (7) ferner unter Verwendung des zweiten Fluoreszenzlichtsignals zu bestimmen; wobei: der zweite Emissionswellenlängenbereich (Em2) ein zweiter Teil des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs ist und sich der erste und zweite Emissionswellenlängenbereich nicht überlappen.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Näherungswert unter Anwendung einer ersten Funktion bestimmt wird, wobei die erste Funktion das erste Fluoreszenzlichtsignal, das erste Korrektursignal und das zweite Korrektursignal als Argumente hat, wobei die erste Funktion insbesondere als Term umfasst: $I_{F L}^{t o t} = A \frac{I_{F L}^{det}}{{(I_{K o 1})}^{α} \cdot {(I_{K o 2})}^{β}}$
wobei
die räumliche Verteilung der Intensität von im Objektbereich emittiertem Fluoreszenzlicht bezeichnet,
das erste Fluoreszenzlichtsignal bezeichnet, I_Ko1 das erste Korrektursignal bezeichnet, I_Ko2 das zweite Korrektursignal bezeichnet, A einen Parameter bezeichnet, α einen weiteren Parameter bezeichnet, und β noch einen weiteren Parameter bezeichnet.
Mikroskopiesystem einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, bevorzugt wenigstens 50 nm, weiter bevorzugt wenigstens 100 nm breit ist; und/oder wobei der erste Korrekturwellenlängenbereich (Ko1) wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, bevorzugt wenigstens 50 nm, weiter bevorzugt wenigstens 100 nm breit ist; und/oder wobei der zweite Korrekturwellenlängenbereich (Ko2) wenigstens 10 nm, wenigstens 20 nm, bevorzugt wenigstens 50 nm, weiter bevorzugt wenigstens 100 nm breit ist.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Aufnahme eines Übersichtsbildes und Bestimmung der Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs in einem Gewebe in einem Objektbereich, wobei das Mikroskopiesystem umfasst: ein erstes Detektionssystem (9), welches einen ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) und einen ersten Mehrkanalbilddetektor (19) umfasst; wobei der erste Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) dazu konfiguriert ist, • Licht eines ersten Kanals (Ch1) in einem ersten Detektionsbereich zu detektieren und in ein erstes Fluoreszenzlichtsignal umzuwandeln; wobei der erste Kanal (Ch1) einen ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) umfasst; wobei der erste Mehrkanalbilddetektor (19) dazu konfiguriert ist, • Licht eines zweiten Kanals (Ch2) in einem zweiten Detektionsbereich zu detektieren und in ein Korrektursignal umzuwandeln, wobei der zweite Kanal (Ch2) einen Korrekturwellenlängenbereich (Ko) umfasst; eine Beleuchtungsvorrichtung (3), welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht (5) zu erzeugen und auf den Objektbereich (7) zu richten, wobei das Beleuchtungslicht • im ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) höchstens eine erste Intensität (W1) aufweist und • im Korrekturwellenlängenbereich (Ko) wenigstens eine zweite Intensität (W2) aufweist, • wobei die erste Intensität (W1) wenigstens um einen Faktor 2 kleiner als die zweite Intensität (W2) ist; eine erste Optik (11), welche ein Objektiv (21) und einen ersten Strahlteiler (23) umfasst; wobei die erste Optik dazu konfiguriert ist, gleichzeitig • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des ersten Emissionswellenlängenbereichs (Em1) auf den ersten Detektionsbereich abzubilden; • vom Objektbereich (7) ausgehendes Licht des Korrekturwellenlängenbereichs (Ko) auf den zweiten Detektionsbereich abzubilden; und eine Steuerung, welche dazu konfiguriert ist, einen Näherungswert für die räumliche Verteilung der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Objektbereich unter Verwendung des ersten Fluoreszenzlichtsignals und des Korrektursignals zu bestimmen; wobei: • sich der erste Emissionswellenlängenbereich (Em1) von λEm1L bis λEm1H erstreckt und ein erster Teil des Emissionsspektrums (35) des Fluoreszenzfarbstoffs ist, • der Korrekturwellenlängenbereich (Ko) zwischen λEm1L-150 nm und λEm1H+150 nm liegt, den ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) nicht überlappt und einen ersten Teil des Anregungsspektrums (33) des Fluoreszenzfarbstoffs umfasst.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 18, wobei der erste Strahlteiler (23) dazu konfiguriert ist, • Licht mit einer Wellenlänge, die größer als eine erste Grenzwellenlänge (λ1) ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Fluoreszenzlichtbilddetektor (17) auszugeben und • Licht mit einer Wellenlänge, die kleiner als die erste Grenzwellenlänge ist, im Wesentlichen ausschließlich zum ersten Mehrkanalbilddetektor (19) auszugeben, • wobei die erste Grenzwellenlänge (λ1) zwischen dem ersten Emissionswellenlängenbereich (Em1) und dem Korrekturwellenlängenbereich (Ko) liegt, bevorzugt zwischen 600 nm und 700 nm, weiter bevorzugt zwischen 655 nm und 675 nm, noch weiter bevorzugt bei 660 nm.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 19, wobei das Beleuchtungslicht (5) in einem Ergänzungswellenlängenbereich (G2) eine mittlere fünfte Intensität (W5) aufweist, wobei die mittlere fünfte Intensität (W5) 0,01% bis 50% der zweiten Intensität (W2), bevorzugt 0,05% bis 10% der zweiten Intensität (W2), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% beträgt der zweiten Intensität (W2), wobei die erste Intensität (W1) wenigstens um den Faktor 10, bevorzugt wenigstens um den Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um den Faktor 1.000 kleiner als die mittlere fünfte Intensität (W5) ist; und wobei die erste Optik (11) ferner umfasst: ein erstes optisches Filter (61), welches zwischen dem ersten Strahlteiler (23) und dem ersten Mehrkanalbilddetektor (19) angeordnet ist, • wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im Korrekturwellenlängenbereich (Ko) 0,01% bis 50% eines mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G2), bevorzugt 0,05% bis 10% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G2), weiter bevorzugt 0,1% bis 1% des mittleren Transmissionsgrads des ersten optischen Filters (61) im Ergänzungswellenlängenbereich (G2) aufweist, • wobei ein mittlerer Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im ersten Emissionswellenlängenbereichs (Em1) wenigstens um einen Faktor 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1.000 kleiner als der mittlere Transmissionsgrad des ersten optischen Filters (61) im Korrekturwellenlängenbereich (Ko) ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 20, wobei der Ergänzungswellenlängenbereich (G2) wenigstens 50 nm, bevorzugt wenigstens 100 nm, weiter bevorzugt wenigstens 150 nm, noch weiter bevorzugt wenigstens 200 nm breit ist; und/oder wobei der Ergänzungswellenlängenbereich (G2) ausschließlich Wellenlängen umfasst, die kleiner als die erste Grenzwellenlänge (λ1) sind; und/oder wobei der Ergänzungswellenlängenbereich (G2) den Wellenlängenbereich von 500 nm bis 600 nm wenigstens teilweise umfasst, bevorzugt den Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm wenigstens teilweise umfasst; und/oder wobei der Ergänzungswellenlängenbereich (G2) und der Korrekturwellenlängenbereich (Ko) nicht überlappen, bevorzugt aneinander angrenzen.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 20 oder 21, wobei der erste Mehrkanalbilddetektor (19) ferner dazu konfiguriert ist, Licht wenigstens eines dritten Kanals (Ch3) in wenigstens einem dritten Detektionsbereich zu detektieren und in wenigstens ein Farbsignal umzuwandeln, wobei der wenigstens eine dritte Kanal (Ch3) den zweiten Kanal (Ch2) höchstens weilweise überlappt und wobei der wenigstens eine dritte Kanal (Ch3) den Ergänzungswellenlängenbereich (G2) wenigstens teilweise umfasst.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei der Näherungswert unter Anwendung einer zweiten Funktion bestimmt wird, wobei die zweite Funktion das erste Fluoreszenzlichtsignal und das Korrektursignal als Argumente hat, wobei die zweite Funktion insbesondere als Term umfasst: $I_{F L}^{t o t} = B \frac{I_{F L}^{det}}{{(I_{K o})}^{γ}}$
wobei
die räumliche Verteilung der Intensität von im Objektbereich emittiertem Fluoreszenzlicht bezeichnet,
das erste Fluoreszenzlichtsignal bezeichnet, I_Ko das Korrektursignal bezeichnet, B einen Parameter bezeichnet und γ einen weiteren Parameter bezeichnet.