EP3649262A1 - Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei - Google Patents

Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei

Info

Publication number
EP3649262A1
EP3649262A1 EP18753447.4A EP18753447A EP3649262A1 EP 3649262 A1 EP3649262 A1 EP 3649262A1 EP 18753447 A EP18753447 A EP 18753447A EP 3649262 A1 EP3649262 A1 EP 3649262A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
trichoderma reesei
strains
reesei
conidia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP18753447.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédérique BIDARD-MICHELOT
Laetitia CHAN HO TONG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP3649262A1 publication Critical patent/EP3649262A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a method of restoring sexual reproduction between two sterile female strains of the fungus Trichoderma reesei.
  • Trichoderma reesei is a species of cellulolytic filamentous fungus, of the genus Trichoderma, which was discovered during the Second World War in the South Pacific. This fungus has the ability to secrete a large amount of cellulosic enzymes (cellulases and hemicellulases), and is now mainly used in the production cycle of second-generation biofuels. Indeed, the enzymes produced by this fungus are particularly useful for the transformation of plant biomass materials into bioproducts useful for industry, such as bioethanol.
  • Second-generation biofuels from non-food sources are of particular interest today, since first-generation (food-source) biofuels can only be produced in limited quantities, as long as they are compete with food production.
  • the second-generation biofuel production process comprises four main stages: pretreatment of lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass, fermentation and distillation.
  • This hydrolysis step involves the cellulase type enzymes produced by the filamentous fungus T. reesei.
  • Trichoderma reesei can be used as a platform strain for the production of homologous or heterologous industrial interest proteins. In order to optimize the performance of Trichoderma reesei, it is essential to improve the Trichoderma reesei strains producing the proteins of interest.
  • T. reesei is thus a solution. It makes it possible to improve the secretory performance of cellulase producing filamentous fungus, the properties of enzymes and to control the stability of strains under industrial conditions.
  • Mutagenesis is a technique commonly used in genetic engineering. It aims to voluntarily introduce mutations into DNA in order to create genetically engineered genes changed. This can make it possible to generate strains with interesting characteristics from an industrial point of view.
  • Random mutagenesis involves inducing non-targeted mutations anywhere in the DNA. These mutations are caused by exposure of the target organism to mutagenic chemicals or radiation. Since mutations are a natural phenomenon, random mutagenesis is therefore considered an accelerator of this natural process and the organisms thus obtained are considered as natural and not as genetically modified organisms (GMOs); they are therefore not subject to the traceability obligation.
  • GMOs genetically modified organisms
  • this method generates, in addition to the mutation responsible for the characteristic of interest, a large number of undesirable mutations called "collateral" which contribute, accumulating, to instability, poor health or even lethality. the organism mutated.
  • Site-directed mutagenesis allows the introduction of mutations identified in a specific gene. To do this, the DNA of interest containing the mutations is synthesized and then introduced into the cell to be mutated where the DNA repair mechanism takes care of integrating it into the genome. The use of a selection marker makes it possible to identify the cells having integrated the mutation of those which did not integrate it. However, organisms that have undergone this mutagenesis are considered as GMOs (due to the introduction of exogenous DNA), and are therefore subject to a traceability obligation.
  • T. reesei for the production of second-generation biofuels
  • the improvement of the hydrolysis step via the introduction of mutations (random or directed) in T. reesei is not not satisfactory, because of the accumulation of undesirable mutations that it entails, or because of the introduction of exogenous DNA. There is therefore a need for a new method of improving the hydrolysis step.
  • the inventors of the present invention have thus developed a novel method of improving the performance of T. reesei using the sexual reproduction of T. reesei.
  • sexual reproduction of T. reesei has never been used as an improvement tool because T. reesei has always been considered as not being able to reproduce sexually.
  • T. reesei's discovery of sexuality (Seidl et al., 2009) has opened up new possibilities for genetic improvement of strains.
  • Sexual reproduction makes it possible, among other things, to create genetic diversity, to preserve beneficial mutations and to eliminate "collateral" mutations from the genome.
  • T. reesei is a so-called heterothallic fungus, that is, sexual reproduction is only possible between compatible sexual-type individuals (MAT1-1 and MAT1-2).
  • T. reesei is hermaphrodite, that is, one strain produces both female and male sex organs ( Figure 1).
  • a QM6a strain MAT1-1 was constructed by genetic engineering (Seidl et al., 2009). Sexual reproduction between compatible QM6a strains does not produce stromata because these strains are sterile females ( Figure 2B) (Seidl et al., 2009).
  • T. reesei All known existing industrial strains of T. reesei were generated from the natural strain QM6a. Since the natural strain QM6a is of sexual type MAT1-2, all industrial strains of T. reesei are now of sexual type MAY 1-2, and are female sterile but fertile males.
  • this strategy has a major disadvantage. Indeed, this requires introducing the functional gene into each of the industrial strains to be reproduced in order to restore the female fertility of industrial strains.
  • this strategy does not take into account the fact that industrial strains are derived from successive mutagenesis and that it is possible that other genes important for female fertility have been modified. Thus, the contribution of the functional idcl gene will not be sufficient to restore female fertility and thus restore sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains. Thus, being able to restore female fertility in strain QM6a, does not mean that it can be restored in industrial strains generated from said strain QM6a.
  • the inventors of the present invention have thus developed a strategy for the restoration of sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains that does not require introducing into the sterile female strains a functional version of the idcl gene, which does not require not to check whether the presence of a functional version of the idcl gene is or is not sufficient to restore sexual reproduction, or even to identify and replace other genes that might be defective.
  • the inventors of the present invention have thus developed a strategy for the recovery of sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains which is simple and effective to put in place.
  • the present invention is based on the results of the inventors according to which the use of an assistant strain ⁇ (that is to say a fertile female strain of T. reesei in which the sexual type locus is MAT 1- 1 or MAY 1-2, was invalidated) in combination with sequential watering of conidia from a sterile T. reesei female strain of a first sexual type, followed by conidia from a sterile female T. reesei strain. a second sexual type was able to restore sexual reproduction between these two sterile female strains.
  • the use of an assistant strain has already been used but not in T. reesei
  • the inventors of the present invention have, however, surprisingly shown that the tricaryon method was able to restore sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains when used in combination with the sequential watering technique (that is to say, watering with conidia of a sterile T. reesei female strain of a first sexual type, then conidia of a T. reesei sterile female strain of a second sexual type).
  • This sequential watering used in combination with a assistant strain ⁇ , used to restore sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains, and allows stromata to be obtained repeatedly (see Example 2i).
  • the invention thus relates to a method for restoring sexual reproduction between two sterile female Trichoderma reesei strains comprising the following steps:
  • the "recovery of sexual reproduction” means obtaining stromata from conidia of a first sterile T. reesei female strain of a first sexual type and a second sterile female strain. T. reesei of a second sexual type, using a ⁇ strain.
  • a "sterile female T. reesei strain” means all T. reesei strains that are sterile female and fertile males. These are T. reesei strains whose female fertility can be restored and which can be used in a sexual reproduction recovery method according to the invention.
  • Such strains are, for example, the strains QM6a, NG14, RUTC30, QM9414, CL847, QM9136, QM9978, QM9979, PC3-7, TU-6, etc. In other words, these are all the strains produced. from the strain QM6a and which are sterile females but it can also be strains of T. reesei resulting from other geographical isolates and which are sterile and fertile female fertile.
  • An "incubation in a suitable medium” means an incubation in a culture medium suitable for the growth of fungi.
  • a culture medium is, for example, PDA medium (Potato Dextrose Agar), SDA medium (Sabouraud Dextrose Agar), SPDA medium (Sweet Potato Dextrose Agar), MEA medium (Malt Extract Agar), Oatmeal Agar medium, medium Cornmeal Agar, and is preferably a complete medium.
  • a complete medium according to the invention is a medium which contains in addition to the components of the minimum medium, the final metabolites which are necessary for the growth, like amino acids, vitamins, bases, ... unlike the minimum medium which is a medium containing the chemical elements strictly necessary for the growth of an organism.
  • An “assistant strain ⁇ " is a strain of T. reesei in which the locus of the sexual type (mating-type) MAT 1-1 or MAT1-2 has been invalidated.
  • Said assistant strain ⁇ can be obtained by any gene / locus invalidation techniques well known to those skilled in the art, or for example by the method described in Example 1.
  • the strain from which the assistant strain ⁇ is obtained must be fertile female. Although belonging to the T. reesei species, this assistant strain does not fall within the definition of a "T. reesei sterile female strain" according to the invention, because of the invalidation of the mating type locus. MAT1-1 or MAT1-2.
  • This assistant strain does not enter into the karyogamy process since it has been invalidated from the sex-type locus that regulates the process.
  • the mechanism of the assistant strain is unknown, but the assumptions about its functioning are as follows:
  • the term "conidia” according to the invention means a spore resulting from the vegetative propagation of a fungus (such as T. reesei).
  • the conidia of a T. reesei strain of the sexual type MAT1-1 or of the sexual type MAT1-2 are obtained under the same conditions.
  • the conidia according to the invention of a first type or a second sexual type can be obtained by culturing and incubation in a suitable medium (such as PDA) or a strain of T. reesei of a first sexual type or a strain of T. reesei of a second sexual type, until the appearance of conidia.
  • the strains are incubated in the light, and at a temperature of about 24-30 ° C until the appearance of conidia.
  • the conidia can then be recovered by rinsing the culture dish with distilled / sterile water.
  • the term "conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type” according to the invention refers to the conidia of one of the two T. reesei strains used in the method of recovery of sexual reproduction according to the invention.
  • the term "conidia of a second strain of T. reesei of a second sexual type" according to the invention means conidia of a strain of T. reesei, compatible with the first strain.
  • the sexual type of the first strain of T. reesei is MAT1-1 or MAT1 -2, in particular MAT1 -1.
  • the sexual type of the second strain of T. reesei is MAT 1-1 or
  • MAT 1-1 or MAT 1-2 refer to the sexual signs of fungi. These are the two compatible sexual types. Since T. reesei is a so-called heterothallic fungus, if the sexual type of the first strain of T. reesei is MAT1-1, then the sexual type of the second strain of T. reesei is necessarily MAT1-2. Conversely, if the sexual type of the first strain of T. reesei is MAT 1-2, then the sexual type of the second strain of T. reesei is necessarily MAT1-1. In a preferred embodiment of the invention, the sexual type of the first strain of T. reesei is MAT 1-1, and the sexual type of the second strain of T. reesei is MAT 1-2.
  • the first strain and the second strain of T. reesei used in a sexual reproduction recovery method according to the invention may be identical or different strains, provided that the sexual types are compatible.
  • the first strain can be a QM6a strain MAT 1-1 and the second strain can be a strain QM6a MAT1-2.
  • the first strain can be a strain NG14 MAT 1-1 and the second strain can be a strain RUTC30 MAT1-2.
  • the T. reesei strain is any sterile female strain, such as the QM6a strain or a strain derived from the QM6a strain.
  • the first strain of T. reesei is QM6a MAT 1-1 or a derived strain
  • the second strain of T. reesei is QM6a MAT 1-2 or a derived strain.
  • the first strain of T. reesei is QM6a MAT 1-2 or a derived strain
  • the second strain of T. reesei is QM6a MAT 1-1 or a derived strain.
  • the strain QM6a MAT 1-2 refers to the strain deposited under the reference ATCC® 13613.
  • a sterile female MAT1-1 strain (such as QM6a MAT1-1) can be obtained by (i) replacing the MAT locus 1 -2 by the MAT1-1 locus, (for example according to the method described in the article Linke, R.
  • strain derived from strain QM6a refers to all the strains obtained from the natural isolate QM6a. These include all industrial strains of T. reesei known to date or all strains of T. reesei female sterile.
  • watering means the pouring of a solution containing the conidia of a first sexual type (for example 10 7 to 10 8 of conidia MAT1-1) or the pouring of a solution containing the conidia of a second sexual type (for example 10 7 to 108 of MAT1-2 conidia).
  • the watering is only performed with conidia of a first and / or a second sexual type (for example without addition of cell extract).
  • the watering is carried out using an appropriate solution containing only the conidia of a first and / or a second sexual type.
  • An appropriate solution is, for example, water such as distilled water or sterile water.
  • the incubation in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ is a dark incubation. Darkness limits the production of conidia and promotes access to the female sex organs by the male sex organs.
  • the incubation in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ lasts at least 2 days, preferably between 2 and 6 days. More particularly, according to a preferred embodiment of the invention, the incubation in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ lasts at least 4 days, preferably between 4 and 5 days. Incubation for 4-5 days optimizes the recovery process (Example 2i).
  • the conidia of the first strain of T. reesei of a first sexual type and / or the conidia of the second strain of T. reesei of a second sexual type are present at a concentration of at least 10 5 conidia / ml.
  • the conidia of the first T. reesei strain of a first sexual type and / or the conidia of the second T. reesei strain of a second sexual type are present at a concentration of at least 10 6 conidia / ml, especially 10 6 to 10 8 conidia / ml, and preferably 10 7 to 10 8 conidia / ml.
  • a concentration of 10 7 to 108 conidia / ml makes it possible to optimize the recovery process (cf Example 2i).
  • the optimal conditions of the sequential watering are an incubation (or pre-incubation) of the assistant strain ⁇ for 4 or 5 days, and a concentration of conidia of 10 7 to 108 conidia / ml (cf Example 2i).
  • the incubation in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ is carried out at room temperature, in particular at 24 ° C.
  • said method for restoring sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains further comprises, between the first and second watering, a step of incubation in a suitable medium. of said assistant strain ⁇ and conidia of a first T. reesei strain of a first sexual type.
  • said first watering, and optionally the incubation step in a suitable medium of said assistant strain ⁇ MAT and conidia of a first T. reesei strain of a first sexual type lasts at least 2 days, preferably between 2 and 7 days, and especially at least 3 or 4 days.
  • said first watering, and optionally the incubation step in a suitable medium of said assistant strain ⁇ and conidia of a first T. reesei strain of a first sexual type is carried out alternating light and darkness, preferably between 3 to 12 hours of light (day) and between 12 to 21 hours of darkness (night).
  • said incubation, in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ and conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type is an incubation alternately day / night.
  • the day / night alternation is an alternation of 12 hours of light and 12 hours of darkness. This is the most favorable condition for sexual reproduction (Seidl, V., et al (2009)).
  • said incubation in an appropriate medium of said assistant strain ⁇ and conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type, lasts 5 to 7 days, preferably 7 days.
  • said incubation, in a suitable medium of said assistant strain ⁇ and conidia of a first T. reesei strain of a first sexual type is carried out at room temperature, in particular at 24 ° C.
  • said method for restoring sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains further comprises a step of obtaining stromata.
  • stromata means macroscopic structures (diameter 3-4mm to 2cm) that result from sexual reproduction. These structures consist of tissues of maternal origin (the tissues that constitute them come from the assistant strain playing the role of female) and are pigmented (brown color) on the surface.
  • said method for restoring sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains further comprises, after the second watering, an incubation step in a suitable medium of the strain. assistant MAT, conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type and conidia of a second strain of T. reesei of a second sexual type, especially until the appearance of stromata, and especially until the pigmented stromata are visible to the naked eye.
  • said second watering, and optionally the step of incubation in a suitable medium of the assistant strain MAT, conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type and conidia of a second strain of T. reesei of a second sexual type lasts at least 5 days, preferably between 5 and 15 days.
  • said second watering, and optionally the incubation step in a suitable medium of the assistant strain MAT conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type and conidia of a second strain of T.
  • said incubation in a suitable medium of said assistant strain MAT, conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type and conidia of a second strain of T. reesei of a second sexual type, is an incubation alternately day / night.
  • the day / night alternation is an alternation of 12 hours of light and 12 hours of darkness.
  • said incubation, in a suitable medium of said assistant strain MAT, conidia of a first strain of T. reesei of a first sexual type and conidia of a second strain of T. reesei of a second sexual type is carried out at room temperature, especially at 24 ° C.
  • said method further comprises, after the appearance of stromata, a step of amplifying said stromata.
  • Said amplification step is carried out by carrying out at least one transfer of the stromata obtained in a new appropriate medium (for example the PDA).
  • the new appropriate medium may be the same as previously used, or a different appropriate medium.
  • the transfer of the stromata into a new suitable medium makes it possible to multiply in a very significant and unexpected manner the final number of stromata obtained (Example 4).
  • said amplification step lasts at least 3 days, for example from 3 to 21 days, preferably from 5 to 15 days, and is preferably carried out at a light / dark alternation, in particular between 3 to 12 hours. of light (day) and between 12 to 21 hours of darkness (night), more particularly 12 hours of light and 12 hours of darkness.
  • the amplification step (the transfer of the stromata into a new appropriate medium) makes it possible (1) to quantitatively increase the number of stromata, by at least 20% and even by at least 50% with respect to a stromata. process without amplification step, but also (2) to increase the maturity of the stromata.
  • said method is a method of restoring sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains, comprising the following steps:
  • a MAT assistant strain said strain being a fertile female T. reesei strain in which the sexual type MAT locus has been invalidated, a first watering of said assistant strain ⁇ with conidia of a first sterile female strain MAI 1-1,
  • stromata amplification step optionally a stromata amplification step.
  • said method is a method of restoring sexual reproduction between two sterile female T. reesei strains, comprising the following steps:
  • said recovery method further comprises obtaining a T. reesei strain.
  • the invention thus relates to the use of a strain of T. reesei obtained by the method mentioned above for the production of cellulases or biofuel.
  • the invention will be better illustrated by the following examples and figures. The following examples are intended to clarify the object of the invention and illustrate advantageous embodiments, but in no case is intended to restrict the scope of the invention.
  • Figure 1 shows the principle of sexual reproduction in the filamentous fungus T. reesei.
  • Figure 2 represents sexual reproduction in T. reesei. Part (A) represents sexual reproduction between two natural isolates (A) and part (B) represents sexual reproduction between two QM6a strains.
  • Figure 3 represents the principle of the assistant strain method.
  • Figure 4 shows the protocol of the implementation of the method of the assistant strain according to the present invention.
  • Figure 5 shows the stromata obtained following the implementation of the method of the assistant strain according to the present invention.
  • Figure 6 shows the final assembly of the invalidation cassette in the plasmid pUC19 (plasmid used to obtain the assistant strain ⁇ according to the present invention).
  • the lines correspond to the primers that are not positioned at the scale.
  • Figure 7 shows the position of the primers chosen for the amplification of the different fragments of the invalidation cassette.
  • the number "(1)” represents the fragment "Flank5 '+ marker", and the number “(2)” represents the fragment "marker + flank3'”.
  • Figure 8 shows the amplification of stromata.
  • the stromata obtained following the implementation of the method of the assistant strain according to the present invention (such as those obtained in FIG. 5) are presented in Petri dishes A1 and B1.
  • the stromata are transferred to a PDA medium (this corresponds to Petri dishes A2 and B2) and the number of stromata can thus be multiplied.
  • This amplification / multiplication step can thus be repeated several times, by transferring the obtained stromata onto a new PDA medium (this corresponds to the Petri dishes A3 and B3).
  • the present invention involves three different strains.
  • the three strains that were used in the examples are as follows:
  • the two sterile strains to cross the strain QM6a MAT 1-1 and the strain QM6a MAT1-2.
  • the locus MAT1-2 was replaced by the locus MAT 1-1 in the strain QM6a MAT 1-2.
  • the strain QM6a MAT 1-2 was obtained from the ATCC (reference ATCC® 13631). It is the natural isolate at the origin of all industrial strains.
  • the AMAT assistant strain which is a strain in which the sexual type MAT locus has been invalidated. This strain can be constructed according to the protocol indicated below:
  • This strain must be constructed from a fertile female strain that can cross with both sterile strains to cross before genetic manipulation.
  • the hygromycin B resistance gene and the 5 'and 3' sequences of the MAT1-2 locus were assembled in a plasmid pUC19 (FIG. 6) using Gibson Assembly Kit (New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations.
  • the hygromycin B resistance gene has been used as a selection marker in the present invention but another selection marker can be used quite well.
  • the recipient plasmid pUC19 was previously digested with XbaI and EcoRI enzymes.
  • the sequences of about 1000 bp upstream and downstream of the MAT1-2 locus were amplified using the 5'matl-2-F and 5'matl-2-R primers for the upstream region and 3'matl-2-F and 3'matl-2-R for the downstream region (Table 1).
  • These primers contain homology regions allowing recombination with pUC19 on one side and the hygromycin resistance gene on the other.
  • the hygromycin B resistance gene was amplified from plasmid pUT1140 using primers matl-2 / Hph-F and matl-2 / Hph-R. These primers contain homology regions allowing recombination with the MAT 1-2 locus on one side and pUC19 on the other.
  • the invalidation cassette was amplified from the bacterial DNA with primers K7-Del-Mat1-2-F and K7-Del-Mat1-2-R.
  • the resulting PCR products were purified using the PCR Purification Kit (Qiagen) and transformed into protoplasts of the wild-type B31 strain using CaCl 2 and polyethylene glycol (PEG).
  • a strain other than strain B31 could have been used, provided that it was a fertile female.
  • the plasmid sequence used to transform the B31 strains is represented by SEQ ID NO: 17.
  • Strain B31 (sexual type MAT1-2) is a descendant of the T. reesei strain
  • CBS999.97 ATCC® 204423 (Sexually Competent, Sucrose- and Nitrate-Assimilating Strains of Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) from South American Soils). This is the equivalent of strain CBS999.97 MAT1-2 of the article by Seidl et al. (2009).
  • Transformants were stabilized and regenerated on PDA medium containing 0.8 M sucrose and 100 ⁇ g / ml hygromycin B. The colonies were then subcultured and purified by conidium isolation on PDA-hygromycin selection medium. . They were then subjected to a phenotypic screening which consists in crossing the transformants B31 with the natural isolate A2 which is of sexual type MAT1-1 and which is compatible with the strain B31: if the locus MAT has been invalidated, then it there will be no sexual reproduction and therefore no stromata.
  • a PCR amplification then makes it possible to verify that the native gene has been replaced by the invalidation cassette.
  • This validation is done in two steps. The first consists in verifying the invalidation of the gene by carrying out a PCR with the primers making it possible to amplify the gene (internal Mat1-2-F and internal Mat1-2-R) (FIG. 7). If the latter is invalidated, no amplification must be obtained. However, to verify that this result is a consequence of the absence of the gene and not a malfunction of the PCR, a pair of control primers (EF1 and EF2) allowing the amplification of an internal fragment of 880 bp of the tefl gene (encoding the translation elongation factor ⁇ 1) present in the genome of all T.
  • EF1 and EF2 a pair of control primers
  • the reesei strains is also used.
  • the amplification of the fragments "flank 5 '+ marker” and "marker + flank 3'” is performed in order to verify the presence of the invalidation cassette at the locus.
  • the position of the primers chosen is shown in FIG. 7.
  • the primers must be chosen downstream of the flank5 fragment and upstream of the flank3 fragment (primers Dmatl-2verif5F associated with verifHygro5). 'and Dmatl-2verif3R associated with verifHygro3').
  • Table 1 Summary of primers used for invalidation and replacement of the MAT locus
  • the assistant strain B31 ⁇ ⁇ -1 ⁇ 1 ⁇ was obtained. It is an assistant strain ⁇ (a strain of T. reesei in which the locus of the sexual type MAT has been invalidated) according to the present invention.
  • Example 2 Comparative Examples with Various Methods to Restore sexual Reproduction Between Two T. reesei Industrial Strains QM6a
  • IDC1 a pezizomycotina- specifies gene that belongs to the MAPP kinase MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus podospora anserina. Fungal genetics and biology: FG & B 44, 1219-1230).
  • the strains were incubated separately for up to two days at 30 ° C to avoid conidia formation and obtain only mycelium.
  • an agar implant 0.5 cm 0.5 cm of each of the strains involved (three for tricaryon) was cut and placed in a 2 ml Eppendorf tube containing 500 ⁇ ⁇ of sterile water.
  • the mycelia were mixed using a FastPrep®-24 (MP Biomedicals) for 20 seconds at a speed of 4 m / s, and 10 ⁇ ⁇ of the ground material were deposited on the Petri dishes.
  • the dishes were incubated in an oven at 24 ° C with an alternation of 12 hours of light and 12 hours of darkness.
  • the experiment was first performed in triplicate. No stromata was obtained. The dishes were kept in an oven until the medium was dry, ie about 1 month.
  • the three strains were inoculated on a petri dish at a distance equal to each other and at maximum distance from the center of the petri dish.
  • the dish was incubated at 24 ° C with alternating day / night (12 hours of light and 12 hours of darkness). No stromata was obtained.
  • d / Method 4 mixture of the three strains in the center of a petri dish
  • the three strains were inoculated alone on a cellophane sheet placed on a petri dish. After 2-3 days of growth in the dark, the mycelia were removed, milled with beads in a Fastprep®, mixed in a ratio of 1: 1: 1 and placed in the center of a Petri dish with different concentrations (1, 1/10, 1 / 100.1 / 1000). No stromata was obtained.
  • Method 5 isolated inoculation of the three strains
  • the three strains were inoculated alone on a cellophane sheet placed on a petri dish. After 2-3 days of growth in the dark, the mycelia were removed, milled with beads in a Fastprep, and mixed in a 1: 1: 1 ratio. This mixture was inoculated into a liquid PD medium. (Potatoes Dextose Broth) supplemented with 1% KH 2 PO 3 and incubated (with or without stirring) for one to two days and then placed in the center of a Petri dish with different concentrations (1, 1/10), with or without addition of 5mM ascorbic acid. No stromata was obtained. Method 6: Inoculation of the three strains
  • the three strains were inoculated together from conidia in a liquid medium PD (Potatoes Dextose Broth) supplemented with 1% KH 2 P0 3i and incubated (with or without stirring) for 1 to 2 days to be subsequently deposited in the center a box of PDA with different concentrations (1, 1/10), with or without addition of 5mM of ascorbic acid. No stromata was obtained.
  • g / Method 7 isolated inoculation of the three strains
  • the three strains were inoculated alone on a cellophane sheet placed on a petri dish. After 2-3 days of growth in the dark, the mycelia were removed, milled with beads in a Fastprep, and mixed with a 1: 1: 1 ratio (QM6a 1-1: QM6a 1-2: MAT), or 1: 1: 2 or 1: 1: 5. The mixture was (i) spread over the whole of the dish, (ii) inoculated at the center of the dish with different dilutions (1, 1/10 and 1/100) on PDA medium, with or without addition of 5mM ascorbic acid.
  • the AMAT assistant strain has the function of a female strain that will provide the maternal tissues necessary for the production of stromata.
  • the assistant strain will be successively watered by conidia MAT1-1 then MATl-2.
  • the AMAT assistant strain is sprinkled uniformly with 1 ml of conidia of the first sexual type, then incubated for 7 days, sprayed with 1 ml of conidia of the second sex type and incubated until stromata are obtained.
  • the AMAT assistant strain is cultured on a PDA medium and incubated at 24 ° C. for 4 days and in the dark. After 4 days of incubation the assistant strain was sprayed with 1 mL of MAT 1-1 sex-type conidia and incubated at 24 ° C for 7 days with alternating 12h of light and 12h of darkness.
  • Table 3 Total number of stromata obtained with the 6 boxes
  • the technique of sequential watering makes it possible to obtain stromata in a repetitive way.
  • the optimal conditions for obtaining stromata are as follows:
  • the assistant strain was watered by:
  • a strain of sexual type MAT 1-1 then the same strain of the sexual type MAY 1-2, or - A strain of sexual type MAT 1-2 then the same strain of the sexual type MAT1-1, or
  • a first watering with a strain of sexual type MAT1-1 thus favors the obtaining of a large number of stromata, in comparison with a first watering with a strain of sexual type MAT1 -2.
  • the amplification was carried out under an alternation of 12h of light and 12h of darkness for a duration of 7 to 21 days: the time elapsed between the first series of photos (Al or Bl) and the second series of photos ( A2 or B2) is 15 days.
  • the stromata of Petri dishes Al / Bl obtained according to the invention (for example such as those obtained in Example 2) were transferred into a new appropriate medium (here the PDA).
  • the stromata obtained at the end of this transfer are represented in the Petri dishes A2 / B2.
  • a second transfer to a suitable new medium was then carried out: the stroamtas of Petri dishes A2 / B2 were transferred to a new appropriate medium.
  • the stromata obtained at the end of this transfer are represented in the Petri dishes A3 / B3.
  • the amplification step also makes it possible to increase the maturity of the stromata.
  • IDC1 a pezizomycotina-specific gene that belongs to the MAPP kinase MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology: FG & B 44, 1219-1230.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei à l'aide d'une souche assistante ∆MAT, ladite souche assistante étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé.

Description

PROCÉDÉ DE RÉTABLISSEMENT DE LA REPRODUCTION SEXUÉE CHEZ LE
CHAMPIGNON TRICHODERMA REESEI
La présente invention concerne un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles du champignon Trichoderma reesei.
Trichoderma reesei (T. reesei) est une espèce de champignon filamenteux cellulolytique, du genre Trichoderma, qui a été découvert pendant la Seconde Guerre mondiale dans le Pacifique Sud. Ce champignon a la capacité de sécréter une grande quantité d'enzymes cellulosiques (cellulases et hémicellulases), et il est aujourd'hui principalement utilisé dans le cycle de production des biocarburants de deuxième génération. En effet, les enzymes produites par ce champignon sont particulièrement utiles pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol.
Les biocarburants de deuxième génération (issus de ressources non alimentaires) sont particulièrement d'intérêt de nos jours, étant donné que les biocarburants de première génération (issus de ressources alimentaires) ne peuvent être produits qu'en quantité limitée, dans la mesure où ils rentrent en concurrence avec la production alimentaire.
Le procédé de production des biocarburants de deuxième génération comprend quatre étapes principales : le prétraitement de la biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique, la fermentation et la distillation.
Même si toutes les étapes de la production des biocarburants de deuxième génération peuvent et doivent être optimisées -afin d'augmenter la production-, un effort particulier est porté sur l'étape d'hydrolyse enzymatique. Cette étape d'hydrolyse met en jeu les enzymes de type cellulase produites par le champignon filamenteux T. reesei.
De manière plus générale, Trichoderma reesei peut être utilisé comme souche plateforme pour la production de protéines d'intérêt industrielles homologues ou hétérologues. Afin d'optimiser les performances de Trichoderma reesei, il est essentiel d'améliorer les souches de Trichoderma reesei produisant les protéines d'intérêt.
Parmi les méthodes d'améliorations envisagées pour une diminution du coût de l'hydrolyse, l'ingénierie génétique de T. reesei est ainsi une solution. Elle permet d'améliorer les performances de sécrétion du champignon filamenteux producteur de cellulases, les propriétés des enzymes et de maîtriser la stabilité des souches en conditions industrielles.
La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l'ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Ceci peut permettre de générer des souches aux caractéristiques intéressantes d'un point de vue industriel. Il existe deux méthodes de mutagénèse couramment utilisées pour introduire des mutations chez T. reesei : la mutagénèse aléatoire et la mutagénèse dirigée.
La mutagénèse aléatoire consiste à induire des mutations non ciblées, n'importe où dans l'ADN. Ces mutations sont provoquées par l'exposition de l'organisme cible à des agents chimiques mutagènes ou à des radiations. Etant donné que les mutations sont un phénomène naturel, la mutagénèse aléatoire est donc considérée comme un accélérateur de ce processus naturel et les organismes ainsi obtenus sont considérés comme naturels et non comme organismes génétiquement modifiés (OGM) ; ils ne sont donc pas soumis à l'obligation de traçabilité. Cependant, cette méthode engendre en plus de la mutation responsable du caractère d'intérêt, un grand nombre de mutations indésirables dites « collatérales » qui contribuent, en s 'accumulant, à l'instabilité, à la mauvaise santé, voire à la létalité de l'organisme muté.
La mutagénèse dirigée permet d'introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l'ADN d'intérêt contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter où le mécanisme de réparation de l'ADN s'occupe de l'intégrer dans le génome. L'utilisation d'un marqueur de sélection permet d'identifier les cellules ayant intégré la mutation de celles qui ne l'ont pas intégrée. Cependant, les organismes ayant subi cette mutagénèse sont considérés comme des OGM (en raison de l'introduction d'ADN exogène), et sont donc soumis à une obligation de traçabilité.
Dans le cas de l'utilisation de T. reesei pour la production de biocarburants de deuxième génération, l'amélioration de l'étape d'hydrolyse, via l'introduction de mutations (aléatoires ou dirigées) chez T. reesei n'est donc pas satisfaisante, en raison de l'accumulation des mutations indésirables que cela entraine, ou bien en raison de l'introduction d'ADN exogène. Il existe donc un besoin pour une nouvelle méthode d'amélioration de l'étape d'hydrolyse.
Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une nouvelle méthode d'amélioration des performances de T. reesei en utilisant la reproduction sexuée de T. reesei. A ce jour la reproduction sexuée de T. reesei n'a jamais été utilisée comme outil d'amélioration car T. reesei a toujours été considéré comme ne pouvant pas faire de reproduction sexuée. Néanmoins la découverte d'une sexualité chez T. reesei (Seidl et ah, 2009) a ouvert de nouvelles possibilités d'amélioration génétique des souches. La reproduction sexuée permet, entre autres, de créer de la diversité génétique, de conserver les mutations bénéfiques et de supprimer du génome les mutations « collatérales ». T. reesei est un champignon dit hétérothallique, c'est-à-dire que la reproduction sexuée n'est possible qu'entre individus de type-sexuel compatibles (MAT1-1 et MAT1-2). De plus, T. reesei est hermaphrodite, c'est-à-dire qu'une souche produit à la fois des organes sexuels femelle et mâle (Figure 1).
La reproduction sexuée entre deux isolais naturels, fertiles et compatibles, de T. reesei donne lieu à des stromata qui contiennent la descendance (Figure 2A).
Afin de tester la reproduction sexuée sur les souches industrielles, une souche QM6a MAT1-1 a été construite par ingénierie génétique (Seidl et al., 2009). La reproduction sexuée entre les souches QM6a compatibles ne permet pas d'obtenir de stromata car ces souches sont femelles stériles (Figure 2B) (Seidl et al. , 2009).
Toutes les souches industrielles existantes connues de T. reesei ont été générées à partir de la souche naturelle QM6a. Etant donné que la souche naturelle QM6a est de type sexuel MAT1-2, toutes les souches industrielles de T. reesei sont aujourd'hui de type sexuel MAI 1-2, et sont femelles stériles mais mâles fertiles.
La reproduction sexuée peut être un outil d'amélioration rapide et efficace, mais si elle ne peut pas avoir lieu entre les souches industrielles, son utilité reste limitée. Des études scientifiques ont tenté de comprendre pourquoi les souches industrielles de T. reesei sont femelles stériles et comment y remédier. Ces recherches ont permis d'identifier le gène idcl comme déterminant de la stérilité femelle et montrent que le remplacement du gène défectueux par un gène fonctionnel permet de rétablir la fertilité femelle de la souche QM6a et de réaliser une reproduction sexuée (Kubicek et al, 2014 (WO2014/ 102241) ; Linke et al, 2015).
Néanmoins, cette stratégie présente un inconvénient majeur. En effet, cela nécessite d'introduire le gène fonctionnel dans chacune des souches industrielles à reproduire pour pouvoir rétablir la fertilité femelle des souches industrielles. D'autre part, cette stratégie ne prend pas en compte le fait que les souches industrielles sont issues de mutagénèses successives et qu'il est possible que d'autres gènes importants pour la fertilité femelle aient été modifiés. Ainsi, l'apport du gène idcl fonctionnel ne sera pas suffisant pour rétablir la fertilité femelle et ainsi rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei. Ainsi, être capable de rétablir la fertilité femelle dans la souche QM6a, ne signifie pas qu'elle pourra être rétablie dans les souches industrielles générées à partir de ladite souche QM6a.
Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, notamment la souche QM6a ou les souches industrielles femelles stériles dérivées de la souche QM6a ou toute autre souche femelle stérile de T. reesei.
Les inventeurs de la présente invention ont ainsi mis au point une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei qui ne nécessite ni d'introduire dans les souches femelles stériles une version fonctionnelle du gène idcl, qui ne nécessite pas de vérifier si la présence d'une version fonctionnelle du gène idcl est ou non suffisante pour rétablir la reproduction sexuée, ni même d'avoir à identifier et remplacer les autres gènes qui pourraient être défectueux. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei qui est simple et efficace à mettre en place.
La présente invention repose en effet sur les résultats des inventeurs selon lesquels l'utilisation d'une souche assistante ΔΜΑΤ (c'est-à-dire une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel, soit MAT 1-1 ou MAI 1-2, a été invalidé) en combinaison avec un arrosage séquentiel des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel permettait de rétablir la reproduction sexuée entre ces deux souches femelles stériles. L'utilisation d'une souche assistante a déjà été utilisée mais pas chez l'espèce T. reesei
(Silar, P. (2014)). Plus précisément, Jamet-Vierny et al. ont décrit l'utilisation d'une souche assistante qui permet d'apporter les protéines IDC1 nécessaires au développement des stromata dans le cadre de la reproduction des souches de Podospora anserina. Cette méthode qui repose sur la fabrication de tricaryon permet de rétablir la fertilité des souches de Podospora anserina. Cependant, il est à noter que cette méthode ne peut pas être utilisée avec les souches de T. reesei : en effet la seule utilisation de la méthode des tricaryons ne permet pas de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei (cf exemple 2a).
Les inventeurs de la présente invention ont néanmoins montré, de façon surprenante, que la méthode des tricaryons permettait de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei lorsqu'elle était utilisée en combinaison avec la technique de l'arrosage séquentiel (c'est-à-dire un arrosage avec des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel). Cet arrosage séquentiel, utilisé en combinaison avec une souche assistante ΔΜΑΤ, permet de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, et permet d'obtenir de façon répétitive des stromata (cf exemple 2i). Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei comprenant les étapes suivantes :
une incubation dans un milieu approprié d'une souche assistante ΔΜΑΤ, ladite souche étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé,
un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel,
un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel avec des conidies d'une deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel.
Le « rétablissement de la reproduction sexuée » selon l'invention s'entend de l'obtention de stromata à partir de conidies d'une première souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel et d'une deuxième souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel, à l'aide d'une souche ΔΜΑΤ.
Une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention s'entend de toutes les souches de T. reesei qui sont femelles stériles et mâles fertiles. Il s'agit des souches de T. reesei dont la fertilité femelle peut être rétablie et qui peuvent être utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention. De telles souches sont par exemples les souches QM6a, NG14, RUTC30, QM9414, CL847, QM9136, QM9978, QM9979, PC3-7, TU-6, ... En d'autres termes, il s'agit de toutes les souches produites à partir de la souche QM6a et qui sont femelles stériles mais cela peut aussi être des souches de T. reesei issues d'autres isolais géographiques et qui sont femelles stériles et maies fertiles.
Une « incubation dans un milieu approprié » selon l'invention s'entend d'une incubation dans un milieu de culture approprié pour la croissance des champignons. Un tel milieu est par exemple le milieu PDA (Potato Dextrose Agar), le milieu SDA (Sabouraud Dextrose Agar), le milieu SPDA (Sweet Potato Dextrose Agar), le milieu MEA (Malt Extract Agar), le milieu Oatmeal Agar, le milieu Cornmeal Agar, et est de préférence un milieu complet. Un milieu complet selon l'invention est un milieu qui contient en plus des composants du milieu minimum, les métabolites finaux qui sont nécessaires pour la croissance, comme les acides aminés, les vitamines,les bases,... contrairement au milieu minimum qui est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance d'un organisme.
Une « souche assistante ΔΜΑΤ » selon l'invention s'entend d'une souche de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel (mating-type) MAT 1-1 ou MAT1-2 a été invalidé. Ladite souche assistante ΔΜΑΤ peut être obtenue par toutes techniques d'invalidation de gènes/locus bien connues de l'homme du métier, ou par exemple par la méthode décrite dans l'exemple 1. La souche à partir de laquelle la souche assistante ΔΜΑΤ est obtenue doit être femelle fertile. Bien qu'appartenant à l'espèce T. reesei, cette souche assistante n'entre pas dans la définition d'une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention, en raison de l'invalidation du locus du mating type MAT1-1 ou MAT1-2. Cette souche assistante n'entre pas en jeu dans le processus de caryogamie puisqu'elle a été invalidée du locus du type-sexuel qui régule ledit processus. Le mécanisme de la souche assistante est inconnu, mais les hypothèses quant à son fonctionnement sont les suivantes :
- Dans le cas de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles : il peut y avoir fusion des noyaux, mais comme le gène idcl /la protéine IDCl sont défectueux, il n'y a pas de recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va se faire la caryogamie et le développement de la descendance.
Dans le cas de la reproduction entre deux souches femelles stériles et en présence de la souche assistante (Figure 3) : il peut y avoir fusion des noyaux parentaux. Dans ce cas il y a expression du gène idcl par la souche assistante, et ainsi synthèse de la protéine IDCl. Etant donné qu'il y a fusion de noyaux et présence des protéines IDCl, il peut y avoir recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va pouvoir se faire la caryogamie et le développement de la descendance. Les tissus femelles sont fournis par la souche JMAT, tandis que les tissus zygotiques sont fournis par les souches femelles stériles.
Le terme « conidies » selon l'invention s'entend d'une spore issue de la multiplication végétative d'un champignon (tel que T. reesei). Les conidies d'une souche de T. reesei du type sexuel MAT1-1 ou du type sexuel MAT1-2 sont obtenues selon les mêmes conditions. Par exemple, les conidies selon l'invention d'un premier type ou d'un deuxième type sexuel peuvent être obtenus par des mises en culture et incubations dans un milieu approprié (tel que le PDA), respectivement d'une souche de T. reesei d'un premier type sexuel ou d'une souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, jusqu'à l'apparition de conidies. De préférence les souches sont incubées à la lumière, et à une température d'environ 24-30°C jusqu'à l'apparition de conidies. Les conidies peuvent ensuite être récupérées par rinçage de la boite de culture avec de l'eau distillée/stérile. Le terme « conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une des deux souches de T. reesei utilisées dans le procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention. Le terme « conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une souche de T. reesei, compatible avec la première souche.
Selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT1-1 ou MAT1 -2, notamment MAT1 -1.
Selon l'invention, le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT 1-1 ou
MAT 1-2, notamment MA Tl -2.
Les termes « MAT 1-1 ou MAT 1-2 » font référence aux signes sexuels des champignons. Ce sont les deux types sexuels compatibles. Etant donné que T. reesei est un champignon dit hétérothallique, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT1- 1, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT1-2. Inversement, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT 1-2, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT1-1. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT 1-1, et le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT 1-2.
La première souche et la deuxième souche de T. reesei utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention peuvent être des souches identiques ou différentes, sous réserves que les types sexuels soient compatibles. Par exemple, lorsque les souches sont identiques la première souche peut être une souche QM6a MAT 1-1 et la deuxième souche peut être une souche QM6a MAT1-2. Au contraire, lorsque les souches sont différentes, la première souche peut être une souche NG14 MAT 1-1 et la deuxième souche peut être une souche RUTC30 MAT1-2.
Selon l'invention, la souche de T. reesei est toute souche femelle stérile, telle que la souche QM6a ou une souche dérivée de la souche QM6a. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée. De préférence, la souche QM6a MAT 1-2 fait référence à la souche déposée sous la référence ATCC® 13613. Une souche MATl-1 femelle stérile (telle que QM6a MATl-1) peut être obtenue (i) en remplaçant le locus MAT 1-2 par le locus MATl-1, (par exemple selon la méthode décrite dans l'article Linke, R. et al. (2015)) ; (ii) par croisement (par exemple une souche QM6a MAT 1-2 est croisée avec un isolât naturel de type sexuel MATl-1. Parmi les descendants obtenus, les individus de type sexuel MATl-1 femelle fertile peuvent être recroisés avec par exemple, la souche QM6a MAT1-2. Ce procédé est répété au moins 7 fois. Le fait de recroiser systématiquement le descendant avec le parent QM6a MAT 1-2 sept fois de suite permet d'obtenir un descendant final qui a une identité génétique identique à celle de la souche QM6a MAT1-2 à l'exception du type sexuel qui sera MATl-1. Il s'agit d'un rétrocroisement. Le descendant final est de type sexuel MATl-1 et est femelle stérile. Un exemple de rétrocroisement est donné dans la demande internationale WO2014/102241). Toutefois à chaque étape de ces rétrocroisements des souches stériles MATl-1 ou MAT 1-2 peuvent être obtenues et utilisées dans le procédé. Le terme « souche dérivée de la souche QM6a » selon l'invention s'entend de toutes les souches obtenues à partir de l'isolât naturel QM6a. Il s'agit notamment de toutes les souches industrielles de T. reesei connues à ce jour ou encore de toutes les souches de T. reesei femelles stériles.
Le terme « arrosage » selon l'invention s'entend du versement d'une solution contenant les conidies d'un premier type sexuel (par exemple 10 7 à 108 de conidies MATl-1) ou le versement d'une solution contenant les conidies d'un deuxième type sexuel (par exemple 10 7 à 108 de conidies MAT1-2). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est uniquement réalisé avec des conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel (par exemple sans ajout d'extrait cellulaire). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est réalisé à l'aide d'une solution appropriée contenant uniquement les conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel. Une solution appropriée s'entend par exemple de l'eau telle que de l'eau distillée ou de l'eau stérile.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ est une incubation à l'obscurité. L'obscurité limite la production de conidies et favorise l'accès des organes sexuels femelles par les organes sexuels mâles.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 6 jours. Plus particulièrement, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ dure au moins 4 jours, de préférence entre 4 et 5 jours. L'incubation pendant 4 à 5 jours permet d'optimiser le procédé de rétablissement (exemple 2i).
Selon un mode de réalisation de l'invention, les conidies de la première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 105 conidies/ml.
Plus particulièrement, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les conidies de la première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 106 conidies/ml, notamment de 106 à 108 conidies/ml, et de préférence de 107 à 108 conidies/ml. Une concentration de 10 7 à 108 conidies/ml permet d'optimiser le procédé de rétablissement (cf exemple 2i).
Les conditions optimales de l'arrosage séquentiel sont une incubation (ou pré- incubation) de la souche assistante ΔΜΑΤ pendant 4 ou 5 jours, ainsi qu'une concentration de conidies de 10 7 à 108 conidies/ml (cf exemple 2i).
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, entre le premier et le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel.
Selon un mode de réalisation, ledit premier arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 7 jours, et notamment au moins 3 ou 4 jours. Préférentiellement, selon ce mode de réalisation, ledit premier arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est effectué à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit).
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. Il s'agit de la condition la plus favorable à la reproduction sexuée (Seidl, V., et al. (2009)).
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, dure 5 à 7 jours, de préférence 7 jours.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre une étape d'obtention de stromata. Selon l'invention, le terme « stromata » s'entend des structures macroscopiques (de diamètre de 3-4mm à 2cm) qui résultent de la reproduction sexuée. Ces structures sont constituées de tissus d'origine maternelle (les tissus qui les constituent proviennent de la souche assistante jouant le rôle de femelle) et sont pigmentés (couleur marron) en surface.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, après le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, notamment jusqu'à l'apparition des stromata, et plus particulièrement jusqu'à ce que les stromata pigmentés soient visibles à l'œil nu.
Selon un mode de réalisation ledit deuxième arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, dure au moins 5 jours, de préférence entre 5 et 15 jours. Préférentiellement, selon ce mode de réalisation, ledit deuxième arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est effectuée à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend en outre, après l'apparition de stromata, une étape d'amplification desdits stromata. Ladite étape d'amplification est réalisée en effectuant au moins un transfert des stromata obtenus dans un nouveau milieu approprié (par exemple le PDA). Le nouveau milieu approprié peut être le même que celui utilisé précédemment, ou un milieu approprié différent. Le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié (par exemple dans une nouvelle boite de Pétri comprenant un milieu approprié) permet de multiplier de façon très significative et inattendue le nombre final de stromata obtenu (exemple 4). Selon cet aspect de l'invention plusieurs repiquages successifs peuvent être effectués, ce qui signifie que plusieurs transferts des stromata obtenus précédemment peuvent être transférés plusieurs fois dans un nouveau milieu approprié (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 transferts des stromata peuvent être effectués). Selon un mode de réalisation, ladite étape d'amplification dure au moins 3 jours, par exemple de 3 à 21 jours de préférence de 5 à 15 jours, et est de préférence effectuée à une alternance lumière/obscurité, notamment entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit), plus particulièrement 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. L'étape d'amplification (Le. le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié) permet (1) d'augmenter quantitativement le nombre de stromata, d'au moins 20% et même d'au moins 50% par rapport à un procédé sans étape d'amplification, mais également (2) d'augmenter la maturité des stromata.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, comprenant les étapes suivantes :
une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante MAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé, un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche femelle stérile MAI 1-1,
une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1,
un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1, avec des conidies d'une deuxième souche femelle stérile MAT 1-2,
une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1, avec des conidies de la deuxième souche femelle stérile MAT1-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata,
optionnellement une étape d'amplification des stromata.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, comprenant les étapes suivantes :
une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante ΔΜΑΤ, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé,
un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche QM6a MATl-1 ou d'une souche femelle stérile MAT 1-1,
une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante
ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1 ou d'une souche femelle stérile
MATl-1,
un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1, ou d'une souche femelle stérile MATl-1, avec des conidies d'une deuxième souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MAT1- 2 ou d'une souche femelle stérile MAT 1-2,
une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1, ou d'une souche femelle stérile MATl-1, avec des conidies de souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche femelle stérile MAT1-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata,
optionnellement une étape d'amplification des stromata. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement, comprend en outre l'obtention d'une souche de T. reesei. L'obtention de cette nouvelle souche de T. reesei, issue de souches de T. reesei femelles stériles, signifie que le rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei a bien été rétabli selon le procédé de l'invention.
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une souche de T. reesei obtenue par le procédé mentionné ci-dessus pour la production de cellulases ou de biocarburant. L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
FIGURES
La Figure 1 représente le principe de la reproduction sexuée chez le champignon filamenteux T. reesei.
La Figure 2 représente la reproduction sexuée chez T. reesei. La partie (A) représente la reproduction sexuée entre deux isolats naturels (A) et la partie (B) représente la reproduction sexuée entre deux souches QM6a.
La Figure 3 représente le principe de la méthode de la souche assistante.
La Figure 4 représente le protocole de la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention.
La Figure 5 représente les stromata obtenus suite à la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention.
La Figure 6 représente l'assemblage final de la cassette d'invalidation dans le plasmide pUC19 (plasmide utilisé pour obtenir la souche assistante ΔΜΑΤ selon la présente invention). Les traits correspondent aux amorces qui ne sont pas positionnées à l'échelle. Les numéros correspondent aux amorces : 1 = 5'matl-2-F ; 2 = 5'matl-2-R ; 3 = matl-2/Hph-F; 4 = matl-2/Hph-R ; 5 = 3'matl-2-F ; 6 = 3'matl-2-R ; 7 = K7 Del Matl-2-F et 8 = K7-Del- Matl-2-R.
La Figure 7 représente la position des amorces choisies pour l'amplification des différents fragments de la cassette d'invalidation. Le chiffre « (1) » représente le fragment « Flank5' + marqueur », et le chiffre « (2) » représente le fragment « marqueur + flank3' ». La Figure 8 représente l'amplification de stromata. Les stromata obtenus suite à la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention (tels que ceux obtenus à la Figure 5) sont présentés dans les boites de Pétri Al et Bl. Les stromata sont transférés sur un milieu PDA (cela correspond aux boites de Pétri A2 et B2) et le nombre de stromata peut être ainsi multiplié. Cette étape d'amplification/multiplication peut ainsi être répétée plusieurs fois, en transférant les stromata obenus sur un nouveau milieu PDA (cela correspond aux boites de Pétri A3 et B3).
EXEMPLES
Exemple 1 : Matériel & Méthodes
La présente invention met en jeu trois souches différentes. Les trois souches qui ont été utilisées dans les exemples sont les suivantes :
Les deux souches stériles à croiser : la souche QM6a MAT 1-1 et la souche QM6a MAT1-2. Pour obtenir la souche QM6a MAT1-1, le locus MAT1-2 a été remplacé par le locus MAT 1-1 dans la souche QM6a MAT 1-2. La souche QM6a MAT 1-2 a été obtenue auprès de l'ATCC (référence ATCC® 13631). Il s'agit de l'isolât naturel à l'origine de toutes les souches industrielles.
La souche assistante AMAT qui est une souche dans laquelle le locus de type sexuel MAT a été invalidé. Cette souche peut être construite selon le protocole indiqué ci- dessous :
Construction de la souche assistante AMAT
Cette souche doit être construite à partir d'une souche femelle fertile qui peut se croiser avec les deux souches stériles à croiser avant la manipulation génétique.
Pour construire la cassette d'invalidation du locus MAT 1-2, le gène de résistance à l'hygromycine B et les séquences 5' et 3' du locus MAT1-2 ont été assemblés dans un plasmide pUC19 (Figure 6) grâce au Gibson Assembly Kit (New England Biolabs) en suivant les recommandations du fabricant. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été utilisé comme marqueur de sélection dans la présente invention mais un autre marqueur de sélection peut tout à fait être utilisé.
Le plasmide receveur pUC19 a préalablement été digéré par les enzymes Xbal et EcoRI. Les séquences d'environ 1000 pb en amont et en aval du locus MAT1-2 ont été amplifiées en utilisant les amorces 5'matl-2-F et 5'matl-2-R pour la région amont et 3'matl- 2-F et 3'matl-2-R pour la région aval (Tableau 1). Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec pUC19 d'un côté et le gène de résistance à l'hygromycine de l'autre. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été amplifié à partir du plasmide pUT1140 à l'aide des amorces matl-2/Hph-F et matl-2/Hph-R. Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec le locus MAT 1-2 d'un côté et pUC19 de l'autre.
Dans un second temps, la cassette d'invalidation a été amplifiée à partir de l'ADN bactérien à l'aide des amorces K7-Del-Matl-2-F et K7-Del-Matl-2-R. Les produits PCR obtenus ont été purifiés à l'aide du PCR Purification Kit (Qiagen) et transformés dans des protoplastes de la souche sauvage fertile B31 à l'aide de CaCl2 et polyethylène-glycol (PEG). Une souche autre que la souche B31 aurait pu être utilisée, à la condition qu'elle soit femelle fertile. La séquence du plasmide ayant servi à transformer les souches B31 est représentée par la SEQ ID NO : 17.
La souche B31 (de type sexuel MAT1-2) est un descendant de la souche de T. reesei
CBS999.97 (ATCC® 204423) (Sexually Compétent, Sucrose- and Nitrate-Assimilating Strains of Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) from South American Soils). C'est l'équivalent de la souche CBS999.97 MAT1-2 de l'article de Seidl et al. (2009).
Les transformants ont été stabilisés et régénérés sur un milieu PDA contenant 0,8 M de saccharose et 100 μg/ml d'hygromycine B. Les colonies ont ensuite été repiquées et ont été purifiées par isolement des conidies sur le milieu de sélection PDA-hygromycine. Elles ont ensuite été soumises à un criblage phénotypique qui consiste à croiser les transformants B31 avec l'isolât naturel A2 qui est de type sexuel MAT1-1 et qui est compatible avec la souche B31 : si le locus MAT a bien été invalidé, alors il n'y aura pas de reproduction sexuée et donc absence de stromata.
Une amplification PCR permet ensuite de vérifier que le gène natif a bien été remplacé par la cassette d'invalidation. Cette validation se fait en deux étapes. La première consiste à vérifier l'invalidation du gène en réalisant une PCR avec les amorces permettant d'amplifier le gène (Matl-2-F interne et Matl-2-R interne) (Figure 7). Si ce dernier est bien invalidé, aucune amplification ne doit être obtenue. Cependant, afin de vérifier que ce résultat est bien une conséquence de l'absence du gène et non d'un mauvais fonctionnement de la PCR, un couple d'amorces témoin (EF1 et EF2) permettant l'amplification d'un fragment interne de 880 pb du gène tefl (codant pour le facteur d'élongation de la traduction al) présent dans le génome de toutes les souches de T. reesei est également utilisé. Dans un second temps, l'amplification des fragments « flank 5' + marqueur » et « marqueur + flank 3' » est réalisée afin de vérifier la présence de la cassette d'invalidation au locus. La position des amorces choisies est présentée sur la Figure 7. Pour valider l'insertion de la cassette génétique au site, les amorces doivent être choisies en aval du fragment flank5' et en amont du fragment flank3' (amorces Dmatl-2verif5F associée à verifHygro5' et Dmatl-2verif3R associée à verifHygro3').
Les séquences des amorces utilisées dans la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Nom des Séquence des amorces (5' -> 3')
amorces
5'matl-2-F TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCCTTCCTGACCCTGGACTG (SEQ ID NO : 1)
5'matl-2-R GGTACACTTGGACTGCGTTGACTGATGGTG (SEQ ID NO : 2) matl-2/Hph-F CAACGCAGTCCAAGTGTACCTGTGCATTCTG (SEQ ID NO : 3) matl-2/Hph-R CCTTTGCCAAGGCAGTGCTAGTGTGTGTAC (SEQ ID NO : 4)
3'matl-2-F TAGCACTGCCTTGGCAAAGGCTAGACACTAC (SEQ ID NO : 5)
3'matl-2-R TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATGTACAATTACCACATGCG (SEQ ID NO : 6)
K7-Del-Matl-2-F CCAGGGCTTTGAGAGCAGTA (SEQ ID NO : 7)
K7-Del-Matl-2-R CTGGTGGCTGACACTTGCTA (SEQ ID NO : 8)
Dmatl -2verif5F GTACTGGTTGTTGGGCTGTG (SEQ ID NO : 9)
Dmatl -2verif3R CGGAGCAACTCTCAGGAAAC (SEQ ID NO : 10)
verifHygro5' CTCCGTAACACCCAATACGC (SEQ ID NO : 11)
verifHygro3' CTCTGGGCAAAGCACCAATC (SEQ ID NO : 12)
Matl-2-F interne TTCAGTGTTGGCCATTTTGA (SEQ ID NO : 13)
Matl-2-R interne GCTTCTCAAGCAAGGCAAGT (SEQ ID NO : 14)
EF1 ATGGGTAAGGAGGACAAGAC (SEQ ID NO : 15)
EF2 GGAAGTACCAGTGATCATGTT (SEQ ID NO : 16)
Tableau 1 : Récapitulatifs des amorces utilisées pour l'invalidation et remplacement du locus MAT
Séquence du plasmide (SEQ ID NO
tgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgt cagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc gtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgat aagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctaca gcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttata gtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt tctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacg caaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggcttta cactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagacccttcctgaccctggactg tccagtggccaccggggcgtggctccagggctttgagagcagtaattggtgggagtttggtagttgacatggctgcgaaaattggtgtccttcagaagttggtcaaggttgattattgaatcagtttgcttcgagtg gtgatgaagaaatccccagagtatgagggtatgggatcagtgggatgttgaaggtgagaataacaggtctgcgaaggggccgccgagtccgtgtggggtcttcttcaggttgctaaggttctactctctgcaag tgaaataaaagtgaaggatcgaggtgaatggacgcttgtgcccatgagttcacctcacttttaactcactctgctgcatctgagaccctgcagaagtaaggcgaaagcttgtcagtgggaaaagacccacggca ccatttaaatgtttacgtatgtggatatccgctaaatacgcctgctgtttgtgttggctcttgccaagatcaatttcagcttctgccagtatttcaagtcaaacgttgtcatgaactacctccatgttgaaattcttcatgga tcgtacactgtccgtttggaatctcagatctgaatcgtatgaaataacagaatcgagctttcgcaactagatgtcccagcaacattgcgcccctggaaagtgataaactgcaactgcatttgtgtgaaaccattggc ataagtgattgcgctctctggcggaacggacgaagacatgttgcttgatcttatcctttccatggagatcgtatatattctgatttgatgcaaatggtatgtacataaatgtccttcacgaactttcaggttgttcccaaa gctaaacttcacgcgcatcttgggtgaagtactgcctcgaacgtcatgcacacctggagagcattttgctggtgtgcgaaatgaggatatctccacggtgggcgtattgttacgaagatgcacaccctctggcga tgggcgggtgggactgctagattctagccccaacacttcctttagaaggtacctaggtacgcttgcaaggttccttaggaggtagcttgtcgttggcaagcagaaatacatattacctagtagtacctaggtttcta ccttaccttcttacatatcagtagtacctagtcatttttccccaaggagggagggtgagaaaagagagataggtggggagcgcgcactgacctggcgctaaataacggaggggctgggggggcactattcag attcactcgctttgggttggcagctctcatcaataaaggccagtaagttgaatcaccacggcacgttccggctcacttgtagctcaccctccacccacagccttttcaattcttcaaagcattacctaggcgaccga aaacttcctacctctcaagttcctcctatcttccaactcctgcatcaacgttcatatcccatcttctcgcgatatattaccagagcaagcccgcaccatcagtcaacgcagtccaagtgtacctgtgcattctgggtaa acgactcataggagagttgtaaaaaagtttcggccggcgtattgggtgttacggagcattcactaggcaaccatgcatccttactattgtataccatcttagtaggaatgatttcgaggtttatacctacgatgaatgt gtgtcctgtaggcttgagagttcaaggaagaaacatgcaattatctttgcgaacccagggctggtgacggaattttcatagtcaagctatcagagtaaagaagaggagcatgtcaaagtacaattagagacaaat atatagtcgcgtggagccaagagcggattcctcagtctcgtaggtctcttgacgaccgttgatctgcttgatctcgtctcccgaaaatgaaaatagctctgctaagctattcttctcttcgccggagcctgaaggcgt tactaggttgcagtcaatgcattaatgcattgcagatgagctgtatctggaagaggtaaacccgaaaacgcgttttattcttgttgacatggagctattaaatcactagaaggcactctttgctgcttggacaaatgaa cgtatcttatcgagatcctgaacaccatttgtctcaactccggctagcgaattctcgactcattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccag acggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggt caagaccaatgcggagcatatacgcccggagtcgtggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacc tcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggccc aaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattcct tgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatagcctccgcgaccggttgtagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgt gcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagct atttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcgg tgagttcaggctttttcatgatggccctcctaccggtgatctcagctgtaggaaagagaagaaggttagtagtcgacatggtggccctcctatagtgagtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgattaat tgtcaacactaggcgccggtcacaactagtagatatcacttacgtgttgagaggcggcatgcgataagaggtgtaattacctgagaacatcttgttgccctgctttccgtgcgaaatactaccggtacttttgggaa acaagggaacaggagggcgctgctgtgcgcggttctgagtgttcaggattgaagctgaagaaggtgctgaggaagcgtagaactgttgcggacgcgagttctgagaagagctgtaccgattggtgaaagcc gaagaagtgagttggtgccctgttgcctggataatgtttgcaactcgctggttctgcagagacggagacaaatgctggctacgatgttgctgattcaggttgatacctcggtcgagacactgttttggtttgatagg gtggatttggttgcagagaagagaaaggaaggtcaaagagggaaaactgggcggagggaaggattttgtatcaggcagcaaactgccactgcagtggccctggcagtgccgggcgaggcacccacgca cggccgcgcaaccggttggtccttgcccaccacgaaacccttctgaaaggtcagatggaagtgtgcgacagtgcgcgtccccaagccaatgcaggcgccatgcactccccacccgcaagattcactgtgcg ttcttattggttgccgcaaggccagccaaagggggaagtatgagtcacagcaccgatacaagaaaattgcagaactaacatatggatgcgcgcgctattctgtagagctctgggcaaagcaccaatcctgcgg gtcggtacacacactagcactgccttggcaaaggctagacactacggaaatctcgcttcggtccttatagattctgtgagatattgtcgcttgtgccaatggtaaggccgaaatgatgcttttaatggaacagctca tctaacaggccacagatgatttcatagctaggctgaatgcctcgggcagtttcgggcatggtacaaacagagtaccacgtccctaaaacaggcggaactttcaccgctcagtttcctcgacagctttcagaggttt gtaagtgcaccttgctatctatttctctggacggcacagtaactgatcattgttacatgaacagtagttcttgccttggtggacgaggaaacagaccacttcataggaaatctttttggaacgacctgcagagatgtg caactacacaccgagttacccagactacaagttcagggccatggagccttgggcggagactacctaatatcagagagcaagctgtggctgcctctacaccgggtcaagcattggaatcaggctgtgtttttcaa gatagcgagagctttggttgtaatagggttccatcagcatactatgccgattgcctagtaggcactcataaccgtggcaaccaagccggacacaggtccttctagatcacagttccatattcttcgagatgataaat taaagtcaaatgctaccatctacaacctccaatctgcaactttgcttctctttcacactagacctctcgcctcccgtcactctgccaatgatgaacactagcatctcgtatatcgtgaaaggtttagctaccctcaaact tgagttgtggagatcaactgatctcgttcggactacattgcggcgacaacttgaattggacacgataaggaaaaggccaaactttgtgaggtgctgagggcagtaagcacgacagtctaaagagaaagaaatg ccgcgttcactacagccatttgaggtctaacaacaagctgattcaactgcaacaggcgctatgtcaagaaggtgatccgttccaatcgctgctccaaatgaaagtaccgcaccgccactcagagcctcgttcttt ctcgccggagggacctagcggccgggcgcagatatagaacgaccttcctgttagcaagtgtcagccaccagctggtctgcgcatgtggtaattgtacatgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgact gggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcc tgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacg ggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggt taatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaa taatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggca agagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacac tgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgag cgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcg ctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcat
Tableau 2 : Séquence du plasmide utilisé pour transformer les souches B31
Suite à ces vérifications phénotypiques et moléculaires, la souche assistante B31 ::Δ ΑΓ-1ιρ1ι a été obtenue. Il s'agit d'une souche assistante ΔΜΑΤ (une souche de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé) selon la présente invention.
Exemple 2 : Exemples comparatifs avec différents procédés visant à rétablir la reproduction sexuée entre deux souches industrielles QM6a de T. reesei
Tous les essais ont été effectués dans des boites de Pétri contenant du milieu PDA. C'est le milieu le plus optimal pour la reproduction sexuée de T. reesei. a/ Méthode 1 fabrication d'un tricaryon
Il s'agit de la même méthode que celle décrite chez P. anserina Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M. & Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina- spécifie gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219-1230).
Pour obtenir un tricaryon, les souches ont été incubées séparément pendant deux jours maximum à 30°C pour éviter la formation de conidies et obtenir seulement du mycélium. Après deux jours de croissance, un implant d'agar de 0,5 cm sur 0,5 cm de chacune des souches impliquées (trois pour un tricaryon) a été découpé et placé dans un tube Eppendorf de 2 ml contenant 500 μΐ^ d'eau stérile. Les mycéliums ont été mixés à l'aide d'un FastPrep®-24 (MP Biomedicals) pendant 20 secondes à une vitesse de 4 m/s, et 10 μΐ^ du broyât ont été déposé sur les boites de Pétri. Les boites ont été incubées dans une étuve à 24°C avec une alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.
L'expérience a été réalisée une première fois en triplicata. Aucun stromata n'a été obtenu. Les boites ont été maintenues à étuve jusqu'à ce que le milieu sèche, soit environ 1 mois.
L'obtention d'un tricaryon étant un événement rare, l'expérience a été répétée et 10 boites de Pétri différentes ont été inoculées. Aucun stromata n'a été obtenu. b/ Méthode 2 .'fabrication d'un tricaryon
Cette méthode est identique à la méthode 1 mais diffère par son incubation. Ici les boites de Pétri ne sont pas placées dans une étuve où il fait 24°C et où il y a 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité, mais sont laissées sur la paillasse du laboratoire dans lequel la température n'est pas constante (variation journalière) et où il n'y a pas de contrôle de la luminosité (luminosité naturelle). Le mélange des trois souches a été inoculé sur 10 boites de Pétri différentes. Aucun stromata n'a été obtenu. cl Méthode 3 : confrontation des trois souches
Les trois souches ont été inoculées sur une boite de Pétri à distance égale les unes des autres et à distance maximale du centre de la boite de Pétri. La boite a été incubée à 24°C avec une alternance jour/nuit (12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité). Aucun stromata n'a été obtenu. d/ Méthode 4 : mélange des trois souches au centre d'une boite de Pétri
Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevées, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep®, mélangés dans un ratio 1 : 1 : 1 puis déposés au centre d'une boite de Pétri avec différentes concentrations (1, 1/10, 1/100,1/1000). Aucun stromata n'a été obtenu. el Méthode 5 : inoculation isolée des trois souches
Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevés, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep, puis mélangés dans un ratio 1 : 1 : 1. Ce mélange a été inoculé dans un milieu liquide PD (Potatoes Dextose Broth) additionné de 1% de KH2P03 et incubé (avec ou sans agitation) pour un à deux jours pour être ensuite déposé au centre d'une boite de Pétri avec différentes concentrations (1, 1/10), avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Aucun stromata n'a été obtenu. fl Méthode 6 : inoculation des trois souches
Les trois souches ont été inoculées ensemble à partir de conidies dans un milieu liquide PD (Potatoes Dextose Broth) additionné de 1% de KH2P03i et incubé (avec ou sans agitation) pour 1 à 2 jours pour être ensuite déposé au centre d'une boite de PDA avec différentes concentrations (1, 1/10), avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Aucun stromata n'a été obtenu. g/ Méthode 7 : inoculation isolée des trois souches
Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevés, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep, puis mélangés avec un ratio 1 : 1 : 1 (QM6a 1-1 : QM6a 1-2 : MAT), ou 1 : 1 :2 ou 1 : 1 :5. Le mélange a été (i) soit étalé sur l'intégralité de la boite, (ii) soit inoculé au centre de la boite avec différentes dilutions (1, 1/10 et 1/100) sur milieu PDA, avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Les boites ont ensuite été incubées à 24°C, (i) soit en alternance jour/nuit, (ii) soit pour une incubation d'une nuit à l'obscurité puis une alternance jour/nuit, (iii) soit à l'obscurité pour trois jours suivi d'une alternance jour/nuit, (iv) soit à l'obscurité pour 15 jours suivi d'une alternance jour/nuit. Aucun stromata n'a été obtenu. hl Méthode 8 : arrosage séquentiel avec ajout d'extraits cellulaires
Des isolais sauvages fertiles de souches de T. reesei ont été mis en confrontation sur une feuille de cellophane déposée sur du PDA. Le matériel biologique de ces croisements a été récupéré de T=0 à T=96h après inoculation et est soumis à une extraction de protéines. Les extraits protéiques ont été stérilisés par filtration. Enfin, la méthode de l'arrosage a été appliquée et les différents extraits cellulaires obtenus ont été ajoutés aux conidies. Un premier arrosage avec les conidies MAI 1-1, puis un deuxième arrosage avec les conidies MAT 1-2 (ou vice- versa) a été effectué. Aucun stromata n'a été obtenu. il Méthode 9 : arrosage séquentiel selon l'invention
Obtention des conidies :
Quatre à six jours avant l'arrosage, des boîtes de Pétri sont ensemencées avec chacune des souches donneuses de conidies (MAT1-1 puis MATl-2) qui serviront pour l'arrosage de la souche assistante, et incubées à 30°C à la lumière pour qu'il y ait production de conidies.
Le jour de l'arrosage, on dépose 4 ml d'eau stérile sur la souche donneuse {MAT 1-1 ou
MATl-2) et on récolte les conidies. Les conidies sont comptées et leur concentration est ajustée entre 106 et 108 conidies/ml.
Arrosage :
Dans la technique de l'arrosage, la souche assistante AMAT a la fonction de souche femelle qui va fournir les tissus maternels nécessaires à la fabrication des stromata. La souche assistante va être successivement arrosée par les conidies MAT1-1 puis MATl-2.
La souche assistante AMAT est arrosée uniformément avec 1 ml de conidies du premier type sexuel, puis incubée 7 jours, arrosée avec 1 ml de conidies du deuxième type sexuel et incubée jusqu'à l'obtention de stromata.
La souche assistante AMAT est mise en culture sur un milieu PDA et incubée à 24°C pendant 4 jours et à l'obscurité. Après 4 jours d'incubation la souche assistante a été arrosée avec 1 mL de conidies de type-sexuel MAT 1-1 et mise à incuber à 24°C pendant 7 jours avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité.
Enfin, la souche assistante a été arrosée avec 1 mL de conidies MAT 1-2 et mise à incuber à 24°C avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité jusqu'à apparition des stromata. Cette méthode a permis l'obtention de stromata. Six expériences (exp 1 à exp 6) différentes ont été réalisées. Ces dernières diffèrent par le temps de pré-incubation (4, 5 ou 6 jours) et par le nombre de conidies qui a été arrosé. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-après.
Tableau 3 : Nombre total de stromata obtenus avec les 6 boites
* : Beaucoup de structures pigmentées qui ressemblent à des stromata, mais qui sont de très petite taille (environ 2mm) ont été obtenues. Ils sont tellement nombreux qu'ils sont collés les uns aux autres, ce qui rend leur comptage difficile.
La technique de l'arrosage séquentiel permet d'obtenir de façon répétitive des stromata. Les conditions optimales pour obtenir les stromata sont les suivantes :
Pré-incubation de la souche assistante : 4 ou 5 jours ;
Concentration de conidies : 10 7 et 108 conidies/ml.
Exemple 3 : Différentes conditions d'arrosage séquentiel selon l'invention
Dans cet exemple, et comme indiqué dans le Tableau 4, la souche assistante a été arrosée par :
Une souche de type sexuel MAT 1-1 puis la même souche du type sexuel MAI 1-2, ou - Une souche de type sexuel MAT 1-2 puis la même souche du type sexuel MAT1-1, ou
De l'eau à chacun des arrosages (contrôle négatif). Arrosage 1 Arrosage 2
Souche assistante AMAT MAT 1-1 MAT 1-2
Souche assistante AMAT MAT 1-2 MAT 1-1
Souche assistante AMAT H20 H20
Tableau 4 : Récapitulatif des c ifférentes conditions testées
Entre l'arrosage 1 et l'arrosage 2, il y a une incubation pendant 7 jours à 24°C avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité. Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-après.
Tableau 5 : Nombre total de stromata obtenus avec les 2 boites
Un premier arrosage avec une souche de type sexuel MAT1-1 favorise ainsi l'obtention d'un grand nombre de stromata, en comparaison avec un premier arrosage avec une souche de type sexuel MAT1 -2.
Exemple 4 : Amplification des stromata
L'amplification a été réalisée sous une alternance de 12h de lumière et de 12 h d'obscurité pendant une durée de 7 à 21 jours : le temps écoulé entre la première série de photos (Al ou Bl) et la deuxième série de photos (A2 ou B2) est de 15 jours. Les stromata des boites de Pétri Al/Bl obtenus selon l'invention (par exemple tels que ceux obtenus dans l'exemple 2) ont été transférés dans un nouveau milieu approprié (ici le PDA). Les stromata obtenus à l'issue de ce transfert sont réprésentés dans les boites de Pétri A2/B2. Un deuxième transfert dans un nouveau milieu approprié a ensuite été effectué : les stroamtas des boites de Pétri A2/B2 ont été transférés dans un nouveau milieu approprié. Les stromata obtenus à l'issue de ce transfert sont réprésentés dans les boites de Pétri A3/B3.
Les résultats de ces transferts sont représentés à la Figure 8.
L'analyse du nombre de stromata obtenu a permet de conclure que : 1) l'étape d'amplification (Le. le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié) permet d'augmenter quantitativement le nombre de stromata, d'au moins 20% et même d'au moins 50% par rapport à un procédé sans étape d'amplification,
2) l'étape d'amplification permet aussi d'augmenter la maturité des stromata.
Références :
Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M., and Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina- specific gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219- 1230.
Kubicek, C, Linke, R., Seiboth, B., Haarmann, T. and Lorenz, P. (2014). Genes/Genetic Eléments Associated With Mating Impariment In Trichoderma reesei QM6a And Its Derivatives And Process For Their Identification (WO2014/102241).
Linke, R., Thallinger, G. G., Haarmann, T., Eidner, J., Schreiter, M., Lorenz, P., Seiboth, B., and Kubicek, C.P. (2015). Restoration of female fertility in Trichoderma reesei QM6a pro vides the basis for inbreeding in this industrial cellulase producing fungus. Biotechnology for biofuels 8, 155.
Seidl, V., Seibel, C, Kubicek, C.P., and Schmoll, M. (2009). Sexual development in the industrial workhorse Trichoderma reesei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 13909-13914.
Silar, P. (2014). Simple Genetic Tools to study fruiting body development in Fungi. The Open Mycology Journal, 8, 148-155); Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M. & Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina-specific gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219-1230

Claims

REVENDICATIONS ί. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei comprenant les étapes suivantes :
a) une incubation dans un milieu approprié d'une souche assistante ΔΜΑΤ, ladite souche étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé,
b) un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel,
- c) un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape b) avec des conidies d'une deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel.
2. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon la revendication 1, dans lequel le premier type sexuel de la première souche de Trichoderma reesei est MAT1-1 ou MAI 1-2, notamment MAT 1-1.
3. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon la revendication 1, dans lequel le deuxième type sexuel de la deuxième souche de Trichoderma reesei est MAT 1-1 ou MAI 1-2, notamment MAT 1-2.
4. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la souche de Trichoderma reesei est la souche QM6a ou une souche dérivée de la souche QM6a.
5. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape a) d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 6 jours, notamment au moins 4 jours, de préférence entre 4 et 5 jours.
6. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape a) d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ est une incubation à l'obscurité.
7. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les conidies de la première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 105 conidies/ml, de préférence 106 conidies/ml, notamment de 106 à
8 7 8
10 conidies/ml, et de préférence de 10 à 10 conidies/ml.
8. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, entre le premier et le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape b).
9. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape b), et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape b), dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 7 jours, et notamment au moins 3 ou 4 jours.
10. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape b), et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape b), est effectuée à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière et entre 12 à 21 heures d'obscurité.
11. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, après le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape c), notamment jusqu'à l'apparition de stromata.
12. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape c), et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape c), dure au moins 5 jours, de préférence entre 2 et 15 jours.
13. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape c), et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante ΔΜΑΤ issue de l'étape c), est effectuée à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière et entre 12 à 21 heures d'obscurité.
14. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre, après l'apparition de stromata, une étape d'amplification des stromata.
15. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, l'obtention d'une souche de Trichoderma reesei.
16. Utilisation d'une souche de Trichoderma reesei obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la production de cellulases ou de biocarburant.
EP18753447.4A 2017-07-07 2018-07-09 Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei Withdrawn EP3649262A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1756469A FR3068710B1 (fr) 2017-07-07 2017-07-07 Procede de retablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei
PCT/FR2018/051721 WO2019008303A1 (fr) 2017-07-07 2018-07-09 Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3649262A1 true EP3649262A1 (fr) 2020-05-13

Family

ID=60080960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP18753447.4A Withdrawn EP3649262A1 (fr) 2017-07-07 2018-07-09 Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11401497B2 (fr)
EP (1) EP3649262A1 (fr)
JP (1) JP7105815B2 (fr)
CN (1) CN110832064B (fr)
BR (1) BR112020000294A2 (fr)
FR (1) FR3068710B1 (fr)
WO (1) WO2019008303A1 (fr)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009054330A1 (fr) * 2007-10-21 2009-04-30 Tokyo University Of Agriculture And Technology Procédé de conjugaison d'un champignon présentant une défaillance de conjugaison
US9920384B2 (en) * 2012-12-28 2018-03-20 Ab Enzymes Gmbh Genes/genetic elements associated with mating impairment in Trichoderma reesei QM6a and its derivatives and process for their identification
US20160304887A1 (en) * 2013-12-10 2016-10-20 Technische Universitat Wein Introducing or Inactivating Female Fertility in Filamentous Fungal Cells
CN104263658A (zh) * 2014-09-26 2015-01-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种里氏木霉菌株及其应用
CN106367409A (zh) * 2016-08-26 2017-02-01 上海交通大学 一种同时高产纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶的方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112020000294A2 (pt) 2020-07-14
FR3068710A1 (fr) 2019-01-11
CN110832064A (zh) 2020-02-21
JP2020526189A (ja) 2020-08-31
CN110832064B (zh) 2023-09-15
WO2019008303A1 (fr) 2019-01-10
US11401497B2 (en) 2022-08-02
US20210009938A1 (en) 2021-01-14
JP7105815B2 (ja) 2022-07-25
FR3068710B1 (fr) 2025-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1716238B1 (fr) Methode pour modifier l'expression genique d' un champignon phytopathogene
Zhu et al. Laser mutagenesis of Phellinus igniarius protoplasts for the selective breeding of strains with high laccase activity
EP0329501A1 (fr) Séquence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procédé pour sa préparation
CA3018127A1 (fr) Souche de trichoderma reesei hyperproductrice et presentant une activite .beta.-glucosidase amelioree
EP3344763A1 (fr) Souches de levure co-exprimant des glucoamylases exogenes, leur procede d'obtention et leur utilisation pour produire du bioethanol
EP3108016B1 (fr) Souche fermentant les pentoses a propagation optimisée
Choi et al. Phylogenetic analyses allow species-level recognition of Leptographium wageneri varieties that cause black stain root disease of conifers in western North America
EP3110832B1 (fr) Plantes a rendement accru et methode d'obtention de telles plantes
WO2009136049A1 (fr) Procede d'obtention de mycelium de tuber magnatum et mycelium obtenu par le procede
EP3649262A1 (fr) Procede de rétablissement de la reproduction sexuee chez le champignon trichoderma reesei
Song et al. Multi-stage nuclear transcriptomic insights of morphogenesis and biparental role changes in Lentinula edodes
Djajanegara et al. Protoplast fusion between white and brown oyster mushrooms
JP2024045256A (ja) 農作物の栽培方法
EP2018396B1 (fr) Modelisation chez la levure des mutations du gene mitochondrial atp6 responsables du syndrome narp chez l'homme et ses applications pour le criblage de medicaments
JP7668458B2 (ja) 植物高品質化剤の製造方法、植物高品質化剤、及び、植物高品質化方法
Hernández-Navarro et al. Discovery of Pleurotus cystidiosus (Agaricales, Pleurotaceae) in the north of Mexico
JP2022134729A (ja) 植物高品質化剤の製造方法、植物高品質化剤、及び、植物高品質化方法
EP4262398B1 (fr) Agent de biocontrôle et son utilisation pour la lutte contre des maladies fongiques de plantes
FR3092473A1 (fr) Obtention de plantes ayant une digestibilite de la biomasse améliorée
Krishnapriya et al. Protoplast fusion between Pleurotus opuntiae and Pleurotus cystidiosus
Lizarraga Escobar Discovery of Pleurotus cystidiosus (Agaricales, Pleurotaceae) in the north of Mexico
JP2023182951A (ja) トマト果実の高糖度化方法、トマト果実の高糖度化剤及びその製造方法
FR3153829A1 (fr) Marqueur de selection non antibiotique pour les champignons filamenteux
FR2947838A1 (fr) Moyens et methodes de detection et d'identification d'une nouvelle bacterie responsable d'affections phytosanitaires sur des plantes (courgettes) et nouvelles plantes resistantes
Hernández-Navarro et al. Discovery of Pleurotus cystidiosus (Agaricales, Pleurotaceae) in the north of Mexico Hallazgo de Pleurotus cystidiosus (Agaricales, Pleurotaceae) en el norte de México

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20200131

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20220118

GRAJ Information related to disapproval of communication of intention to grant by the applicant or resumption of examination proceedings by the epo deleted

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSDIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: GRANT OF PATENT IS INTENDED

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20240226

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20240627