EP3516036A1 - Bioreacteur pour la selection de microalgues - Google Patents

Bioreacteur pour la selection de microalgues

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Publication number
EP3516036A1
EP3516036A1 EP17783917.2A EP17783917A EP3516036A1 EP 3516036 A1 EP3516036 A1 EP 3516036A1 EP 17783917 A EP17783917 A EP 17783917A EP 3516036 A1 EP3516036 A1 EP 3516036A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
culture medium
temperature
microalgae
working time
photosynthetic microorganisms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP17783917.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Bernard
Hubert BONNEFOND
Antoine SCIANDRA
Eric PRUVOST
Ghjuvan GRIMAUD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de Recherche en Informatique et en Automatique INRIA
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de Recherche en Informatique et en Automatique INRIA
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de Recherche en Informatique et en Automatique INRIA, Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3516036A1 publication Critical patent/EP3516036A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/02—Photobioreactors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C12M31/02—Means for providing, directing, scattering or concentrating light located outside the reactor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/06—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of illumination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture

Definitions

  • the present invention relates to a bioreactor capable of inducing cellular stress on microalgae cells by means of temperature variations.
  • the invention also relates to a method for selecting microalgae based on a cellular stress induced by temperature variations.
  • microalgae There are prokaryotic and eukaryotic photosynthetic microorganisms, commonly referred to as microalgae.
  • Prokaryotic photosynthetic microorganisms are represented by cyanobacteria (sometimes called “blue-green algae”).
  • the eukaryotic photosynthetic microorganisms are represented by a multitude of classes, among which chlorophyceae, diatoms, chrysophyceae, coccolithophyceae, euglenophyceae and rhodopoeias. In general, the size of a microalgae cell is between 1 ⁇ and 100 ⁇ .
  • Microalgae are ubiquitous and are found in both freshwater and brackish and marine waters.
  • microalgae synthesize many different types of products among which may be mentioned proteins, antioxidants, pigments, long-chain polyunsaturated fatty acids DHA (docosahexaenoic acid) and EPA (eicosapentaenoic acid).
  • proteins proteins, antioxidants, pigments, long-chain polyunsaturated fatty acids DHA (docosahexaenoic acid) and EPA (eicosapentaenoic acid).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • microalgae find application in several technological fields and in particular in the cosmetics industry, the pharmaceutical industry, aquaculture, the food industry or food supplements.
  • microalgae are used in the production of bioenergy.
  • Microalgae have the ability to capture light energy to fix and metabolize inorganic carbon from carbon dioxide (CO2) in energetic molecules.
  • CO2 carbon dioxide
  • the coupling of microalgae with CO2 and the fact that microalgae are often rich in sugars or oils have the consequence that microalgae are of great interest in the production of biofuels. This coupling is also at the origin of purifying capabilities that microalgae present.
  • Microalgae are photosynthetic species. Microalgae cells need light to proliferate. Microalgae can be grown using natural light (sunlight) or artificial light.
  • all culture systems have a tank for receiving a culture medium which comprises nutrients.
  • the microalgae are dispersed in this culture medium and receive light at a fixed temperature or at a variable temperature according to natural climatic conditions.
  • the temperature is usually chosen close to the temperature of the natural microalgae environment. This allows a good cell growth rate. But this is sometimes only difficult to achieve or expensive.
  • microalgae culture systems In microalgae culture systems, light plays an important role for growth. In a simplified way, the more the microalgae absorb light, the more their growth is favored. However, in systems of the state of the art, the light is mainly absorbed by the cells close to the light source. When the density of microalgae is high, a large part of the light fails to penetrate the depth of the tank. As a result, the microalgae deep in the tanks are found in the dark and can not proliferate properly. Cropping systems therefore have a problem of light overexposure of the cells close to the light source and a problem of underexposure of the cells located at depth of the culture medium. This light gradient within the culture systems limits the production of microalgae. Thus, the light source and the light intensity is a limiting factor for the production processes.
  • the state of the art proposes an approach that involves genetically modifying microalgae. It is a question of reducing the size or the number of collector antennas (chlorophyll molecules) and / or modifying the ratios between the various pigments (in particular chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c, carotenoids and other pigments) of the microalgae for the make it more transparent.
  • WO 2014/089533 discloses mutant microalgae with reduced collecting antennae. Each microalga cell captures a lesser amount of light which allows the light to penetrate deep into the vats. The cells located in the zones furthest away from the light source are therefore less shaded.
  • the culture systems comprise only one type of mutant: they are monocultures of microalgae. Monocultures are less robust, especially in the face of industrial exploitation conditions. Light gradient problems in cropping systems remain limiting factors in production processes, especially in systems that tend to maximize biomass production. The need to improve the yield of cropping systems persists.
  • the state of the art also proposes culture systems in which microalgae are specifically selected to increase the production yield.
  • WO 2013/012329 discloses a method for selecting microalgae having an increased storage capacity for components useful for the production of biofuels.
  • a culture of different strains of microalgae is subject to nutritional stress. Only strains capable of storing a high concentration of nutrients survive the stress. The strains are then harvested and cultured in the crop systems described above.
  • the present invention improves the situation.
  • the invention introduces a bioreactor comprising a vessel adapted to be driven during a working time, said vessel being intended to receive a culture medium comprising a cell culture of photosynthetic micro-organisms, a light source arranged for emit incident light of input light intensity selected in the direction of the tank, a temperature probe for measuring the temperature of said culture medium in the tank, and a temperature controller adapted to increase and lower the temperature of said culture medium in the tank.
  • the bioreactor of the invention further comprises a control of the temperature controller arranged to adjust the temperature of the culture medium to a low setpoint value during a first time, and to adjust the temperature of the culture medium to a high setpoint. during a second stage, the succession of said first and second times making it possible to induce cellular stress in at least some of said photosynthetic microorganisms during working time.
  • the bioreactor further comprises a light sensor disposed opposite the light source, the sensor being capable of measuring an output light intensity and transmitting data relating to this intensity to the controller for calculating the concentration. of the cell culture and to control the cell at said selected cell culture concentration in the culture medium during the working time.
  • the bioreactor further comprises a controller arranged to control the cell at a chosen cell culture concentration (,), preferably at a concentration substantially lower than or equal to 1.0 g / L, in the medium of culture during working time.
  • a controller arranged to control the cell at a chosen cell culture concentration (,), preferably at a concentration substantially lower than or equal to 1.0 g / L, in the medium of culture during working time.
  • microalgae The stress induced on the cells results in a selection and / or adaptation of the cell culture of photosynthetic micro-organisms (microalgae). Only strains capable of surviving stress are harvested after the process of the invention (that is to say preferably after several successive cycles of working time). Harvested strains have valuable properties (including increased lipid storage capabilities or increased lipid synthesis of interest to the industry).
  • control is arranged to determine the low setpoint value and said high setpoint value and said first and second times so as to maintain an average value of setpoint V M during the working time.
  • the average value of setpoint V M is equal to the sum of the product of said low setpoint value and said first time and the product of said high setpoint value and said second time, divided by the working time. : VM (va ⁇ eur d e x low setpoint first time) + (high set value x second time) working time This allows to induce controlled stress on the cell culture during working time. The adaptation and / or selection of microalgae is performed by avoiding cell damage or excessive cell death.
  • the algae cells acclimate to the average setpoint temperature.
  • Working time can be repeated several times. Each working time can redefine an average value of setpoint V M. As a result, during each working time the algae cells can acclimate to a new average setpoint temperature. According to one embodiment, the average value of setpoint V M is increased as successive working times. According to another embodiment, the average value of setpoint V M is decreased as successive working times. Thus, the algae cells acclimate to an average temperature respectively higher and higher and lower and lower.
  • the average setpoint value may be substantially equal to the optimum growth temperature (T op t) of the cell culture of photosynthetic microorganisms. Adaptation and / or selection of microalgae is therefore carried out around optimum growth temperature. This embodiment takes into account the sensitivity of microalgae and their natural evolution environment. This further avoids cell damage or excessive cell death.
  • the selected input light intensity I in the incident light is preferably fixed during the working time. This avoids excessive stress induced by light variations.
  • the input light intensity can be between 100 and 2000 ⁇ quanta m "2 s " 1 .
  • the input light intensity is equal to about 250 ⁇ quanta m "2 s " 1 .
  • the working time is 24 hours, and wherein the first time is 8 hours and the second time is 16 hours.
  • This application scheme for the low and high setpoint values allows a good adaptation of the cells of microalgae.
  • the working time is reiterated once completed. This allows to initiate a new selection cycle. After several iterations, the selection and / or adaptation of the cells is striking.
  • the working time is reiterated 7 to 360 times.
  • the control is arranged to receive data relating to the growth rate of the cell culture of photosynthetic micro-organisms after one or more working times.
  • the command sets the low setpoint value and said high setpoint value after said reception of the data relating to the growth rate of said photosynthetic microorganism cell culture.
  • the growth rate data for the cell culture indicate whether it is growing or not. When growth stagnates the pattern of temperature variation is not changed to allow microalgae cells to adapt to climatic conditions. As the cell culture grows, the temperature variation pattern is made more strict: the difference between the low and high setpoint values is increased. Only cells capable of adapting to new and more extreme weather conditions survive. This makes it possible to increase the selection and / or adaptation criteria and thus to harvest final strains with improved properties. The final strains are of great interest in industry.
  • the invention also provides a method for selecting photosynthetic microorganisms, comprising the following steps:
  • the low setpoint and the high setpoint and the first and second times are set to maintain a set mean value (V M ) during the working time, the average value being equal to the sum of the product of said set low value and said first time and the product of said high setpoint value and said second time, divided by the working time: low setpoint x first time) + (high setpoint x second time) working time
  • the average set value may be substantially equal to the optimum growth temperature (T op t) of the cell culture of photosynthetic micro-organisms.
  • the average value is chosen to meet a biologically acceptable temperature criterion specific to a selected microalgae strain.
  • the average set value can take any biologically acceptable temperature for the microalgae strain (s) present in the tank.
  • the working time can be equal to 24 hours. The first time is then preferably equal to 8 hours and the second time is then equal to 16 hours.
  • the second time lasts twice as long (double) as the first time.
  • the temperature control step 5 is advantageously repeated 2 to 360 times. This increases the criterion of selection and / or adaptation.
  • the method of the invention may further comprise the following steps:
  • the temperature control step 5 is repeated more than 2 times so as to cause a cellular degradation of at least a part of said photosynthetic micro-organisms and thus select the photosynthetic micro-organisms having valuable properties.
  • the harvest in step 6 is preferably carried out when the culture medium comprises a cell culture of photosynthetic microorganisms consisting of more than 75%, preferably more than 90%, even more preferentially substantially 100% microorganisms. photosynthetic organisms with valuable properties.
  • the method of the invention further comprises the following steps:
  • the temperature control step 5 is repeated 2 to 360 times.
  • the control receives data relating to the growth rate of the cell culture of photosynthetic micro-organisms after one or more working times.
  • the control sets the low setpoint and said high setpoint after receiving the growth rate data as follows:
  • the low set point and the high set point remain unchanged for the next working time (or cycle).
  • the low setpoint is revised downwards for the next working time, and the high setpoint is revised upwards for the next working time.
  • the photosynthetic micro-organism cells are cells of the species Tisochrisis lutea, preferably the strain Tisochrisis lutea CCAP 927/17.
  • Figure 1 shows a diagram of biomass production of microalgae in a bioreactor according to the invention
  • Figure 2 shows a general flowchart of a selection method according to the invention
  • FIG. 3 shows an evolution of the temperature during a working time of the process of the invention
  • Figure 4 shows an evolution of the temperature during another working time of the method of the invention
  • FIG. 5 shows a comparative diagram of thermal niches between a microalgae strain of the state of the art and two microalgae strains selected and / or modified according to the invention
  • FIG. 6 shows a comparative diagram of the growth rate between a microalgae strain of the state of the art and two microalgae strains selected and / or modified according to the invention
  • FIG. 7 shows a comparative diagram of growth temperatures and thermal niches between a microalgae strain of the state of the art and two microalgae strains selected and / or modified according to the invention
  • FIG. 8 shows a comprative diagram of the total level of lipids present in the strains obtained according to the invention and of strains of the state of the art.
  • microalgae or biomass of microalgae
  • a culture medium rich in nutrients (nitrogen, phosphorus, sulfur, trace elements, vitamins) with optimal values of temperature and pH for the microalgae, and to bring enough light.
  • nutrients nitrogen, phosphorus, sulfur, trace elements, vitamins
  • the presence of nutrients is necessary to enable microalgae to convert light energy by metabolizing CO2.
  • This conversion results in the production of oxygen and the increase in biomass by the proliferation of microalgae (multiplication by cell division).
  • a portion of the culture medium comprising microalgae is removed from the tank, and fresh culture medium is poured into the tank.
  • the culture medium is renewed proportionally with respect to the growth rate of the microalgae cells (here preferably by a coefficient of proportionality equal to 1).
  • the method of the invention provides an average renewal rate of the culture medium of about 10% over all of the working time.
  • a light source capable of emitting light at a wavelength that is strongly absorbed by the microalgae is used, in order to obtain a high growth rate.
  • FIG. 1 shows a diagram of biomass production of microalgae in a bioreactor of the invention operating in continuous feed.
  • the continuous feed bioreactors have the advantage of having an inlet and a outlet of culture medium, associated with a controller for continuously controlling the tank at a selected concentration of microalgae in the culture medium during a working time.
  • the bioreactor comprises a tank 100 capable of receiving a culture medium comprising microalgae.
  • the microalgae are dispersed in the culture medium or in the form of biofilm.
  • Microalgae consist of C cells of photosynthetic microorganisms.
  • the bioreactor comprises an inlet 102 and an outlet 104 respectively associated with a flow control device.
  • the inlet 102 and the outlet 104 are respectively associated with a first valve (or pump) 106 and a second valve (or pump) 108 for opening and closing the inlet 102 and the outlet 104.
  • the inlet 102 and the first valve 106 make it possible to control the supply of the fresh culture medium into the tank 100.
  • the outlet 104 and the second valve 108 make it possible to control the evacuation of the culture medium and, if appropriate, at least some of the C-cells.
  • the inlet and the outlet make it possible to continuously control the bioreactor for a production P of microalgae biomass.
  • the control of biomass production in a continuous feed culture system relies on the control of the cell growth of the microalgae culture.
  • the concentration x [g / L] of microalgae in the culture medium changes according to the specific growth rate ⁇ ( ⁇ ) [h 1 ].
  • the concentration also changes as a function of the dilution rate D [h -1 ] of the culture medium.
  • Dilution rate D is defined by the input flow rate (L / h) divided by the volume (L) of the culture medium.
  • ⁇ ( ⁇ )> D the cells multiply (by cell division) faster than they are evacuated, their number and therefore their concentration (biomass) will increase.
  • ⁇ ( ⁇ ) ⁇ D the cells multiply (by cell division) less quickly than they are evacuated, their number and therefore their concentration (biomass) will decrease.
  • ⁇ ( ⁇ ) D: the number of cells remains constant over time.
  • the number of cells evacuated with the culture medium of the tank is equal to the number of cells obtained by multiplication in the culture medium in the tank.
  • the concentration is stable.
  • the bioreactor comprises a light source 200.
  • the light source 200 is able to emit incident light L.
  • the light L is typically chosen to cover the entire solar spectrum including blue light (preferably from 430 nm to 470 nm) and red (preferably 650 nm to 700 nm). These ranges of wavelengths allow a good growth rate of microalgae because they are strongly absorbed by them.
  • the phenomena of optics, absorbance and photon metabolism in a bioreactor tank are detailed in the books Microalgal biotechnology: potential and production, C. Posten and C. Walter, of Gruyter, 2012 and Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology, 2nd Edition, A. Richmond and Q. Hu, Wiley-Blackwell, 2013.
  • the cell concentration in the present invention is chosen so as to avoid problems related to a light gradient (self-shading phenomenon).
  • the cell concentration x is between 0.01 g / L and 5.0 g / L.
  • the concentration is about 0.1 g / L.
  • An object of the present invention is to select and cultivate microalgae rich in substances of industrial interest.
  • the Applicant proposes a new selection process based on the induction of heat stress on microalgae.
  • the Applicant has discovered, not without surprise, that in a culture system, a particular scheme of successive temperature phases makes it possible to select and / or modify microalgae suitable for industrial exploitation.
  • the system of the invention can be controlled continuously or semi-continuously typefed-batch.
  • microalgae Some species of microalgae are able to adapt to temperatures that do not correspond to the temperatures of their natural environment. Microalgae exposed to temperatures lower and / or higher than their optimum growth temperature can acclimate by increasing their storage capacity of certain metabolites. For example, some microalgae cells increase their polar lipid storage capacity rich in polyunsaturated fatty acids such as docosahéxanoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) in response to thermal stresses. These are products of great industrial interest.
  • DHA docosahéxanoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • thermal specialists thermal specialists
  • thermal generalists cf. Evolution in changing environments, Levins, Princeton University Press Princeton NJ, 1968, 2 (2), 120; and Hotter is better and broader: thermal sensitivity of a population of bacteriophages, Knies et al., The American Naturalist, 2009, 173 (4), 419-430.
  • Thermal microorganisms have a narrow thermal niche and a high growth rate.
  • Thermal micro-organisms have a large thermal niche and a low growth rate.
  • An object of the invention is therefore to generate new microalgae strains which have an increased content of products of industrial interest (enzymes, proteins, etc.).
  • the invention makes it possible to obtain important biomasses of this precious microalgae cell.
  • Thermal stress results in cell death or, where appropriate, adaptation of microalgae cells. This adaptation is reflected in particular by genetic mutations within microalgae cells. In other words, natural genetic mutations induced by heat stress lead to genetic adaptation mechanisms. Genetic mutations are likely to be transmitted from a cell to its descendants, and thus to be transmitted from generation to generation.
  • a genetic mutation can, for example, result in the increase of lipids or membrane proteins in microalgae cells. It can also lead to the accumulation of metabolites within the cells. In this way, the microalgae become more resistant to temperature variations away from the optimal growth temperature.
  • FIG. 2 shows a general flowchart of a selection method according to the invention.
  • An EMP operation comprises providing a microalgae cell culture and a nutrient culture medium suitable for growing the selected crop.
  • the operation comprises a sub-operation which consists in filling the tank 100 with the culture medium and inoculating this medium with the microalgae cells.
  • a CYCLE 1 operation comprises a microalgae growth phase under optimal growing conditions.
  • the temperature T ° C is set to an optimum growth value V ⁇ .
  • the optimum value of growth V ⁇ varies according to the species of microalgae.
  • the operation CYCLE 1 is followed by a CYCLE 2 operation of the invention.
  • the CYCLE 2 operation comprises a first phase C2I in which the temperature is set to a first low reference value VCBI.
  • the low VCBI setpoint is chosen to respond to colder temperature conditions than optimal growth temperature conditions (VCBI ⁇ V ⁇ ). Thus, the low set point induces a thermal stress on microalgae.
  • the CYCLE 2 operation comprises a second phase C2I I in which the temperature is set to a first high setpoint value Vcm.
  • the high setpoint Vcm is chosen to respond to warmer temperature conditions than optimum growth temperature conditions (Vcm> V ⁇ ). Thus, the high setpoint induces a thermal stress on microalgae.
  • the succession of the first and second phases can be repeated seven times, for example.
  • the CYCLE 2 operation can last for 7 days.
  • Figure 3 shows the change in temperature during CYCLE 2 as a function of time over a period of 24 hours.
  • the CYCLE 2 operation is followed by an MES operation for measuring the specific growth rate ⁇ of the microalgae. If ⁇ is less than or equal to zero, CYCLE 2 is repeated; if ⁇ is greater than zero a subsequent operation CYCLE 3 is engaged.
  • the CYCLE 3 operation comprises a first phase C3I in which the temperature is set to a second low setpoint value VCB2.
  • the low set point VCB2 is chosen to respond to colder temperature conditions than the first low setpoint in CYCLE 2 operation (VCB2 ⁇ VCBI).
  • the second low setpoint induces a thermal stress on microalgae.
  • the CYCLE 3 operation comprises a second phase C3I I in which the temperature is set to a second high setpoint value VCH2.
  • the second high setpoint value VCH2 is chosen to respond to warmer temperature conditions than the first high setpoint in CYCLE 2 operation (VCH2> Vcm).
  • the high setpoint induces a thermal stress on microalgae.
  • the succession of the first and second phases can be repeated seven times, for example.
  • the operation CYCLE 3 can last between 7 days.
  • Figure 4 shows the evolution of the temperature during the CYCLE 3 operation as a function of time over a period of 24 hours.
  • the CYCLE 3 operation may be followed by a new operation for measuring the specific growth rate ⁇ of the microalgae. If ⁇ is less than or equal to zero, the CYCLE 3 operation can be repeated; if ⁇ is greater than zero, a subsequent CYCLE 4 operation can be initiated. The CYCLE 4 operation then has low and high setpoint values respectively lower and higher than the values set in the CYCLE 3 operation. This will induce thermal stress on the microalgae cells. EXAMPLE OF REALIZATION
  • the bioreactor of the present embodiment comprises a vessel 100 with a culture medium.
  • the culture medium comprises a dispersion of a cell culture of photosynthetic microorganisms.
  • the cell culture of selected starting photosynthetic microorganisms is the microalgae strain Tisochrisis lutea CCAP 927/17. In the remainder of the present description, this strain is called W2X.
  • the initial W2X strain has a good triglyceride productivity, cf. Bougaran et al. Enhancement of neutral lipid productivity in the microalga Isochrysis affinity Galbana (T-lso) by a mutation-selection procedure, Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109 (11), 2737-45 and Carrier et al. Tisochrysis lutea provides insights into the genetic basis, lipid metabolism and life cycle, PLoS ONE, 2014, 9 (1).
  • the tank has a volume capacity of 1.9 L.
  • the culture medium is of f / 2 type, cf.
  • the vat 100 further comprises means for mixing the culture medium. This is a magnetic stirrer and a blower (air pump type) capable of generating fine bubbles within the culture medium.
  • the bioreactor comprises an inlet 102 and an outlet 104.
  • the inlet 102 makes it possible to bring fresh culture medium into the tank 100.
  • the outlet 104 makes it possible to evacuate culture medium and microalgae from the tank 100.
  • input 102 and output 104 are associated with a controller.
  • the controller makes it possible to control the tank 100 continuously during a working time. The working time varies according to the microalgae strains present in the culture medium.
  • the working time preferably extends to at least 1 month (no upper limit of time) which generally corresponds to at least 20 generations of microalgae (that is to say 20 successive cell divisions). According to the invention, the working time is greater than the time required for a microalgae cell cycle (cell division). In the present embodiment, the working time is 260 days.
  • the tank of the bioreactor is cleaned regularly (for example every month). The cleaning can be carried out using 70% ethanol followed by a washing of hydrochloric acid (HCl) and rinsing with fresh culture medium. during the cleaning of the tank, the culture medium comprising the cell culture is preserved under sterile conditions.
  • HCl hydrochloric acid
  • the bioreactor comprises a light source 200 which emits incident light L of an input light intensity I in sufficiently high to pass through the tank 100 filled with the culture medium comprising the microalgae dispersion.
  • the light source 200 is capable of emitting an input light intensity I in which up to 5000 ⁇ quanta m "2 s " 1 can be emitted.
  • the light source is arranged to emit a fixed intensity of 250 ⁇ quanta m "2 s " 1 .
  • the light source 200 emits a constant value of input intensity I in during the working time.
  • the light source comprises light-emitting diodes from Nichia Corporation NVSL219BT 2700 ° K.
  • a controller 600 controls the tank 100 continuously at a dilution ratio D.
  • the controller 600 comprises one or more light sensors 300 such as photocells for measuring the optical density of the culture medium / microalgae assembly. within the vessel 100. in this manner the controller 600 can maintain the concentration of cell culture 3 ⁇ 4 ⁇ in the culture medium at a chosen value, for example about 1.0 g / L, during the working time.
  • the controller is arranged to adapt the dilution ratio D by supplying and evacuating the culture medium.
  • a concentration of about 1.0 g / L allows a good diffusion of light within the tank 100.
  • the bioreactor comprises a light sensor 300 from Skye Instruments SKL2620.
  • the selection protocol of the invention is conducted in a continuous feed-type bioreactor.
  • Turbidity is kept constant at about 9 x 10 5 cells / ml. This is achieved by continuous measurement at 800 nm by the sensor 300 and control by dilution adjustment by the controller 600. Reference is made here to the selection mode "SFturb".
  • the selection protocol of the invention is conducted in a fed-batch type bioreactor. Dilution with fresh culture medium is performed every seven days; 5% to 10% of the culture medium / microalgal cell mixture is stored before dilution. The initial cell concentration after dilution is therefore about 5 x 10 5 cells / L.
  • the bioreactor further comprises a temperature controller 500 able to increase and lower the temperature of said culture medium in the tank.
  • the regulator comprises a cooling / heating system produced by means of a double-water jacket arranged around the perimeter of the tank 100.
  • the bioreactor comprises a temperature probe 400 for measuring the temperature of said culture medium in the tank .
  • the bioreactor further comprises a control 700 of the temperature controller 500 arranged to adjust, for a first time, the temperature of the culture medium to a low set point VCB, and during a second time the temperature of the culture medium to a value high setpoint VCH, the succession of said first and second time to induce cellular stress in at least some of said photosynthetic microorganisms during working time.
  • the control 700 comprises a thermostat of the Lauda Brinkmann company of the Proline RP 845 type.
  • the setting of the temperature in order to reach the high and low setpoint temperatures can be achieved in different ways by the control.
  • the decrease and / or the increase in temperature can in particular be carried out linearly, exponentially, or in steps.
  • the average temperature T M of the culture medium (and thus received by microalgae cell) is kept constant during the working time. This is radically different from prior art approaches which aim to gradually increase the average temperature received per cell.
  • the control 700 is arranged to respond to the average temperature condition during the following working time:
  • the amplitude (or deviation) between the low and high setpoint values is increased from cycle to cycle (or from working time to working time).
  • This selection protocol provides cycles of temperature variation every 24 hours.
  • the optimum growth temperature T opt (temperature value V ⁇ ) for strain W2X (Tisochrisisis lutea CCAP 927/17) is equal to 28 ° C.
  • Each cycle (working time) comprises a first time for which the temperature of the culture medium is set to a temperature T
  • Each cycle (working time) further comprises a second time for which the temperature of the culture medium is set to a Thigh temperature hotter than the optimum growth temperature. The control adjusts the temperature to the high setpoint VCH. In the present embodiment the second time is 16 hours.
  • the succession of said first and second times makes it possible to induce cellular stress in at least some of said cells of the W2X strain.
  • the low setpoint VCB (TI 0W ) is 26 ° C.
  • the high setpoint VCH (Thigh) is equal to 29 ° C.
  • microalgae are exposed for 8 hours at 26 ° C, followed by 16 hours at 29 ° C.
  • the average temperature received by microalgae in 24 hours is equal to 28 ° C (T op t).
  • 1 selection cycle is repeated for 7 days. After 7 days, the growth rate ⁇ is determined. If ⁇ is lower than or equal to zero, the temperature conditions of 1 cycle of selection are repeated identically; If ⁇ is greater than zero, 2 nd selection round is engaged.
  • the low set point value (VCB 0W TI) is equal to 24 ° C.
  • the high setpoint VCH (Thigh) is equal to 30 ° C.
  • microalgae are exposed for 8 hours at 24 ° C, followed by 16 hours at 30 ° C.
  • the average temperature received by microalgae in 24 hours is equal to 28 ° C (T op t).
  • the 2nd selection cycle is repeated for 7 days. After 7 days, the growth rate ⁇ is determined. If ⁇ is lower than or equal to zero, the temperature conditions of the 2nd round of selection are repeated; If ⁇ is greater than zero, a 3 rd selection cycle is engaged.
  • Each subsequent cycle (or working time) decreases, on the one hand, the low VCB (Tiow) setpoint from 0.5 ° C to 1 ° C, and increases, on the other hand, the high setpoint VCH (Thigh) from 0.25 ° C to 0.5 ° C, while the first and second times remain the same (respectively 8 hours and 16 hours).
  • the temperature conditions are increasingly extreme from one working time to another.
  • the low reference value VCB (TI 0W ) can for example reach 12 ° C
  • the high setpoint value VCH (Thigh) can for example reach 36 ° C.
  • the selection is more and more strict by increasing the number of successive working hours.
  • the 24 hour working time is reiterated 259 times (total of 260 days).
  • the first and second time are changed.
  • the first beat is set at 6 o'clock and the second beat is set at 12 o'clock. It is then expected a third time during which the temperature is maintained equal to the optimum growth value (V ⁇ ).
  • V ⁇ the optimum growth value
  • the average temperature received by microalgae remains constant over 24 hours.
  • a selection cycle in which: the temperature T
  • the temperature T op t at the optimum growth value V ⁇ equal to 28 ° C. is maintained for a third time equal to 6 hours.
  • the average temperature received per microalgae cell in 24 hours is then equal to
  • FIG. 5 shows the growth rate per day (j _1 ) relative to the temperature (° C) of the initial strain W2X and of the W2X strains that have been subjected to the selection protocol of the invention, namely respectively W2XSTurb (for the strain W2X selected in the continuous bioreactor) and W2XSFb (for the strain W2X selected in the fed-batch bioreactor).
  • Figure 5 shows that the thermal niche of the adapted strains W2XSTurb and W2XSFb is increased compared to the initial strain W2X.
  • Extreme temperatures, namely the minimum temperatures T m in of growth and the maximum temperatures T ma x of The growth rates for each strain were calculated according to the model proposed in Bernard & Émond, Bioresource Technology, 2012, 123, 520-7.
  • FIG. 6 shows a comparative diagram between the initial strain W2X and the strains modified by the process of the invention W2XSFb and W2XSTurb.
  • the strains generated according to the invention have an increased growth rate relative to the initial strain W2X.
  • Figure 7 shows a comparative diagram of strains W2X, W2XSFb and W2XSTurb between the minimum temperatures T m in growth, the maximum temperatures T ma x growth, the optimum temperature T opt of growth and the thermal niches.
  • Figures 5 and 6 show that the growth rates of the adapted strains W2XSTurb and W2XSFb are higher than the growth rate of the initial strain W2X.
  • Figure 7 shows that the thermal niches of the adapted strains W2XSTurb and W2XSFb are wider than the thermal niche of the initial strain W2X.
  • Figures 5 to 7 demonstrate that microalgae modified by the selection method of the invention have a high growth rate and an enlarged niche.
  • Figure 8 shows a comprative diagram of the total lipid content present in a wild-type strain Tisochrisis lutea, namely the strain CCAP 927/14 (see Bougaran et al., Enhancement of neutral lipid productivity in the microalga Isochrysis affinis Galbana (T-Iso) by a mutation-selection procedure, Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109 (11), 2737-45), in the initial strain W2X, in the strain W2XSFb and in the strain W2XSTurb.
  • Strains modified by the method of the invention W2XSFb and W2XSTurb have lipid levels of lipids per ⁇ g of algae carbon increased relative to the wild-type strain and to the initial W2X strain.
  • Table 1 Comparison between the fatty acid compositions of the adapted W2XSFb and W2XSTurb strains and the initial fatty acid composition in the W2X strain.
  • the modification of the strain W2X by the bioreactor of the invention results in modified strains of W2X (here W2XSFb and W2XSTurb) having a thermal niche increased by several degrees Celsius (here up to 3 ° C).
  • the W2X strains modified according to the invention also have an increased level of fatty acids relative to the initial strain W2X (especially in DHA).
  • the growth rate of modified W2X strains according to the invention is increased compared to the initial W2X strain.

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Abstract

L'invention vise bioréacteur comportant une cuve (100) apte à être pilotée durant un temps de travail, ladite cuve (100) étant destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, une source de lumière (200) agencée pour émettre une lumière incidente d'une intensité lumineuse d'entrée choisie (Iin) en direction de la cuve, une sonde de température (400) pour mesurer la température dudit milieu de culture dans la cuve, et un régulateur de température (500) apte à augmenter et à baisser la température dudit milieu de culture dans la cuve, et comprenant en outre une commande (700) du régulateur de température agencée pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse (VCB) durant un premier temps, et pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute (VCH) durant un deuxième temps, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail..

Description

BIORÉACTEUR POUR LA SÉLECTION DE MICROALGUES
La présente invention se rapporte à un bioréacteur capable d'induire un stress cellulaire sur des cellules de microalgues au moyen de variations de température. L'invention se rapporte également à un procédé de sélection de microalgues basée sur un stress cellulaire induit par des variations de température.
Il existe des micro-organismes photosynthétiques procaryotes et eucaryotes, regroupés communément sous le terme de microalgues. Les micro-organismes photosynthétiques procaryotes sont représentés par les cyanobactéries (parfois appelées « algues bleu-vert »). Les micro-organismes photosynthétiques eucaryotes sont représentés par une multitude de classes parmi lesquelles on peut citer les chlorophycées, les diatomées, les chrysophycées, les coccolithophycées, les euglénophycées et les rhodopycées. D'une manière générale, la taille d'une cellule de microalgue est comprise entre 1 μιτι et 100 μιτι.
On estime aujourd'hui qu'il existe plus d'un million d'espèces de microalgues dont quelques dizaines de milliers d'espèces sont référencées. Les microalgues sont ubiquistes et on les trouve aussi bien dans les eaux douces et que dans les eaux saumâtres et marines.
La production de microalgues est un secteur qui prend de plus en plus d'ampleur. En effet, les microalgues synthétisent de nombreux produits de natures différentes parmi lesquels on peut citer les protéines, les antioxydants, les pigments, les acides gras polyinsaturés à longues chaînes DHA (acide docosahexaénoïque) et EPA (acide eicosapentaénoïque).
Ainsi, les microalgues trouvent une application dans plusieurs domaines technologiques et notamment dans l'industrie cosmétique, l'industrie pharmaceutique, l'aquaculture, l'industrie des alicaments ou des compléments alimentaires.
De plus, les microalgues sont utilisées dans la production de bioénergie. Les microalgues ont une capacité à capter l'énergie lumineuse pour fixer et métaboliser le carbone inorganique à partir du dioxyde de carbone (CO2) dans des molécules énergétiques. Le couplage des microalgues avec le CO2 et le fait que les microalgues sont souvent riches en sucres ou en huiles ont pour conséquence que les microalgues présentent un grand intérêt dans la production de biocarburants. Ce couplage est aussi à l'origine de capacités épuratoires que présentent les microalgues. Les microalgues sont des espèces photosynthétiques. Les cellules de microalgues ont besoin de la lumière pour proliférer. Les microalgues peuvent être cultivées en utilisant de la lumière naturelle (lumière solaire) ou de la lumière artificielle. Il existe des systèmes de culture ouverts de type bassin de culture (aussi appelé bassin « raceway») et des systèmes de culture fermés comme les bioréacteurs d'alimentation par batch, les bioréacteurs d'alimentation par fed- batch ou les bioréacteurs d'alimentation continu.
D'une manière générale, tous les systèmes de culture présentent une cuve destinée à recevoir un milieu de culture qui comprend des nutriments. Les microalgues sont dispersées dans ce milieu de culture et reçoivent de la lumière à une température fixée ou à une température variable selon les conditions climatiques naturelles.
Dans l'idéal, la température est généralement choisie proche de la température de l'environnement naturel des microalgues. Ceci permet un bon taux de croissance des cellules. Mais ceci n'est parfois que difficilement réalisable ou coûteux.
Dans les systèmes de cultures pour microalgues, la lumière joue un rôle important pour la croissance. D'une manière simplifiée, plus les microalgues absorbent de la lumière, plus leur croissance est favorisée. Toutefois, dans les systèmes de l'état de la technique, la lumière est majoritairement absorbée par les cellules proches de la source lumineuse. Lorsque la densité de microalgues est élevée, une grande partie de la lumière ne parvient pas à pénétrer en profondeur de la cuve. En conséquence, les microalgues en profondeur des cuves se retrouvent dans l'obscurité et ne peuvent pas proliférer correctement. Les systèmes de cultures présentent donc un problème de surexposition lumineuse des cellules proches de la source lumineuse et un problème de sous-exposition des cellules situées en profondeur du milieu de culture. Ce gradient de lumière au sein des systèmes de culture limite la production de microalgues. Ainsi, la source lumineuse et l'intensité lumineuse est un facteur limitant pour les procédés de production.
L'état de la technique propose une approche qui consiste à modifier génétiquement les microalgues. Il s'agit de réduire la taille ou le nombre des antennes collectrices (molécules de chlorophylle) et/ou de modifier les ratios entre les différents pigments (notamment chlorophylle a, chlorophylle b, chlorophylle c, caroténoïdes et autres pigments) des microalgues pour les rendre plus transparentes. Le document WO 2014/089533 divulgue des microalgues mutantes présentant des antennes collectrices réduites. Chaque cellule de microalgue capte une quantité moindre de lumière ce qui permet à la lumière de pénétrer en profondeur des cuves. Les cellules localisées dans les zones les plus éloignées de la source lumineuse sont donc moins ombragées. Toutefois, cette approche requiert des méthodes complexes et coûteuses de génie génétique ou de mutation- sélection telles que la mutagenèse chimique ou le traitement par ultraviolet ou irradiation gamma. Par ailleurs, les systèmes de cultures ne comprennent qu'un seul type de mutant : il s'agit de monocultures de microalgues. Les monocultures sont moins robustes, notamment face à des conditions d'exploitation industrielle. Les problèmes liés au gradient de lumière au sein des systèmes de culture restent des facteurs limitants dans les procédés de production, et tout particulièrement dans les systèmes tendant à maximiser la production en biomasse. Le besoin d'améliorer le rendement des systèmes de cultures persiste.
L'état de la technique propose par ailleurs des systèmes de culture dans lesquelles des microalgues sont spécifiquement sélectionnées pour augmenter le rendement de production.
Le document WO 2013/012329 divulgue un procédé de sélection de microalgues présentant une capacité de stockage accrue en composants utiles pour la production de biocarburants. Une culture de différentes souches de microalgues est soumise à un stress nutritionnel. Seules les souches capables de stocker une forte concentration en nutriments survivent le stress. Les souches sont ensuite récoltées et cultivées dans les systèmes de cultures décrits plus hauts.
Toutefois, le nombre de souches pouvant survivre un stress nutritionnel est limité. De plus, le besoin de cultiver les microalgues dans un environnement simulant les températures d'un environnement naturel de microalgues requiert une adaptation d'une souche à une autre. Ceci est accompagné par un programme de chauffage/refroidissement qui a pour conséquence des coûts élevés et des pertes d'énergies importantes.
La présente invention vient améliorer la situation.
À cet effet, l'invention vient introduire un bioréacteur comportant une cuve apte à être pilotée durant un temps de travail, ladite cuve étant destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, une source de lumière agencée pour émettre une lumière incidente d'une intensité lumineuse d'entrée choisie en direction de la cuve, une sonde de température pour mesurer la température dudit milieu de culture dans la cuve, et un régulateur de température apte à augmenter et à baisser la température dudit milieu de culture dans la cuve. Le bioréacteur de l'invention comprend en outre une commande du régulateur de température agencée pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse durant un premier temps, et pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute durant un deuxième temps, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail.
Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend en outre un capteur de lumière disposé en regard de la source de lumière, le capteur étant capable de mesurer une intensité lumineuse en sortie et de transmettre des données relatives à cette intensité au contrôleur pour calculer la concentration de la culture cellulaire et de piloter la cuve à ladite concentration de culture cellulaire choisie dans le milieu de culture durant le temps de travail.
Dans un autre mode de réalisation le bioréacteur comprend en outre un contrôleur agencé pour piloter la cuve à une concentration de culture cellulaire choisie ( ,), de préférence à une concentration sensiblement inférieure ou égale à 1,0 g/L, dans le milieu de culture durant le temps de travail.
Le stress induit sur les cellules a pour conséquence une sélection et/ou adaptation de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques (microalgues). Seules les souches capables de survivre au stress sont récoltées après le procédé de l'invention (c'est-à-dire de préférence après plusieurs cycles successifs de temps de travail). Les souches récoltées présentent des propriétés précieuses (notamment des capacités de stockage accrues en lipides ou la synthèse accrue en lipides d'intérêt pour l'industrie).
Dans un mode de réalisation, la commande est agencée pour déterminer la valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute et lesdits premier et deuxième temps de sorte à maintenir une valeur moyenne de consigne VM durant le temps de travail. Dans ce mode de réalisation, la valeur moyenne de consigne VM est égale à la somme du produit de ladite valeur de consigne basse et dudit premier temps et du produit de ladite valeur de consigne haute et dudit deuxième temps, divisée par le temps de travail : VM (va^eur de consigne basse x premier temps) + (valeur de consigne haute x deuxième temps) temps de travail Ceci permet d'induire un stress contrôlé sur la culture cellulaire au cours du temps de travail. L'adaptation et/ou sélection des microalgues est réalisée en évitant des dégradations cellulaires ou des morts cellulaires excessifs.
Les cellules d'algues s'acclimatent à la température moyenne de consigne. Le temps de travail peut être réitéré plusieurs fois. Chaque temps de travail peut redéfinir une valeur moyenne de consigne VM. En conséquence, durant chaque temps de travail les cellules d'algues peuvent s'acclimater à une nouvelle température moyenne de consigne. Selon un mode de réalisation, la valeur moyenne de consigne VM est augmentée au fur et à mesure de temps de travail successifs. Selon un autre mode de réalisation, la valeur moyenne de consigne VM est diminuée au fur et à mesure de temps de travail successifs. Ainsi, les cellules d'algues s'acclimatent à une température moyenne respectivement de plus en plus élevée et de plus en plus basse.
La valeur moyenne de consigne peut-être sensiblement égale à la température de croissance optimale (Topt) de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques. L'adaptation et/ou la sélection des microalgues est donc réalisée autour de température de croissance optimale. Ce mode de réalisation tient compte de la sensibilité des microalgues et de leur environnement naturel d'évolution. Ceci évite davantage des dégradations cellulaires ou des morts cellulaires excessifs.
L'intensité lumineuse d'entrée choisie Iin de la lumière incidente est de préférence fixe durant le temps de travail. Ceci évite des stress excessifs induits de par des variations de lumière. L'intensité lumineuse d'entrée peut être comprise entre 100 et 2000 μιτιοΙ quanta m"2 s"1. Plus la concentration de la culture cellulaire dans le milieu de culture est élevée, plus l'intensité lumineuse réglée élevée. Ceci permet une bonne diffusion de la lumière au sein de la cuve du bioréacteur. Avantageusement, l'intensité lumineuse d'entrée est égal à environ 250 μιτιοΙ quanta m"2 s"1. Ceci permet un bon pilotage à une concentration de culture cellulaire choisie ¾■ dans le milieu de culture sensiblement égale à 1,0 g/L. Dans ces conditions, la diffusion de lumière au sein de la cuve et les conditions nutritionnelles du milieu de culture sont aisément contrôlable. Ceci a pour conséquence un bon taux de croissance et donc un bon rendement général.
Dans un mode de réalisation, le temps de travail est égal à 24 heures, et dans lequel le premier temps est égal à 8 heures et le deuxième temps est égal à 16 heures. Ce schéma d'application pour les valeurs de consignes basse et haute, permet une bonne adaptation des cellules de microalgues. De préférence, le temps de travail est réitéré une fois achevé. Ceci permet d'engager un nouveau cycle de sélection. Après plusieurs itérations, la sélection et/ou adaptation des cellules est marquante. Selon un mode de réalisation, le temps de travail est réitéré 7 à 360 fois. Dans un mode de réalisation préférentiel, la commande est agencée pour recevoir des données relatives au taux de croissance de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques après un ou plusieurs temps de travail. Après réception, la commande fixe la valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute après ladite réception des données relatives au taux de croissance de ladite culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques. Les données relatives au taux de croissance de la culture cellulaire indiquent si elle se trouve en situation de croissance ou non. Lorsque la croissance stagne le schéma de variation de température n'est pas modifié pour permettre aux cellules de microalgues de s'adapter aux conditions climatiques. Lorsque la culture cellulaire croît, le schéma de variation de température est rendu plus strict : l'écart entre les valeurs de consignes basse et haute est augmenté. Seules les cellules capables de s'adapter aux nouvelles conditions climatiques plus extrêmes survivent. Ceci permet d'augmenter les critères de sélection et/ou adaptation et ainsi de récolter des souches finales présentant des propriétés améliorées. Les souches finales présentent un grand intérêt en industrie.
L'invention vise également un procédé de sélection de micro-organismes photosynthétiques, comprenant les étapes suivantes :
1 Mettre à disposition un bioréacteur tel que décrit ci-avant ;
2 Emplir la cuve d'un milieu de culture ;
3 Inoculer le milieu de culture avec une culture cellulaire constituée de microorganismes photosynthétiques ;
4, Piloter la cuve durant un temps de travail, de préférence à une concentration de culture cellulaire ¾■ choisie dans le milieu de culture, et régler l'intensité lumineuse d'entrée (Iin) à une valeur choisie ;
5 Régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse (VCB) durant un premier temps, et à régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute (VCH) durant un deuxième temps, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail ; 6. Récolter les micro-organismes photosynthétiques.
La valeur de consigne basse et la valeur de consigne haute et les premier et deuxième temps sont réglés de manière à maintenir une valeur moyenne (VM) de consigne durant le temps de travail, la valeur moyenne étant égale à la somme du produit de ladite valeur de consigne basse et dudit premier temps et du produit de ladite valeur de consigne haute et dudit deuxième temps, divisée par le temps de travail : valeur de consigne basse x premier temps) + (valeur de consigne haute x deuxième temps) temps de travail
La valeur moyenne de consigne peut être sensiblement égale à la température de croissance optimale (Topt) de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques. Dans un autre mode de réalisation, la valeur moyenne est choisie pour répondre à un critère de température biologiquement acceptable spécifique à une souche de microalgue choisie. En d'autres termes, la valeur moyenne de consigne peut prendre toute température biologiquement acceptable pour la/les souche(s) de microalgues présent(s) dans la cuve. Le temps de travail peut être égal à 24 heures. Le premier temps est alors de préférence égal à 8 heures et le deuxième temps est alors égal à 16 heures.
D'une manière générale, pour un temps de travail donné (prédéfini), le deuxième temps dure deux fois plus longtemps (le double) que le premier temps.
L'étape 5. de régulation de température est avantageusement réitérée 2 à 360 fois. Ceci augmente le critère de sélection et/ou adaptation.
Le procédé de l'invention peut en outre comprendre les étapes suivantes :
4a. Prélever une partie du milieu de culture comportant au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques ; et
4b. Compenser ladite partie du milieu de culture comportant au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques prélevée par du milieu de culture frais.
De préférence, l'étape 5. de régulation de température est réitérée plus de 2 fois de manière à provoquer une dégradation cellulaire d'au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques et ainsi sélectionner les micro-organismes photosynthétiques présentant des propriétés précieuses. La récolte à l'étape 6. est de préférence réalisée lorsque le milieu de culture comporte une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques constituée à plus de 75%, préférentiellement à plus de 90%, encore plus préférentiellement sensiblement à 100% de micro-organismes photosynthétiques présentant de propriétés précieuses. Dans un mode de réalisation le procédé de l'invention comporte en outre les étapes suivantes :
7. Inoculer un milieu de culture frais avec les micro-organismes photosynthétiques modifiés récoltés à l'étape 6. dans un bioréacteur ; et
8. Piloter le bioréacteur de l'étape 7. pour une production de biomasse constituée desdits micro-organismes photosynthétiques modifiés.
Ceci permet de cultiver les souches récoltées en fin de l'étape 6. pour une exploitation industrielle.
Selon un mode de réalisation préférentiel, l'étape 5. de régulation de température est réitérée 2 à 360 fois. Dans ce mode de réalisation, à chaque itération la commande reçoit des données relatives au taux de croissance de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques après un ou plusieurs temps de travail. La commande fixe alors la valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute après cette réception des données relatives au taux de croissance de la manière suivante :
• Lorsque le taux de croissance est inférieur ou égal à zéro :
la valeur de consigne basse et la valeur de consigne haute restent inchangées pour le prochain temps de travail (ou cycle).
• Lorsque le taux de croissance est supérieur à zéro :
la valeur de consigne basse est revue à la baisse pour le prochain temps de travail, et la valeur de consigne haute est revue à la hausse pour le prochain temps de travail.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules de micro-organismes photosynthétiques sont des cellules de l'espèce Tisochrisis lutea, de préférence la souche Tisochrisis lutea CCAP 927/17.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels : la figure 1 montre un schéma de production de biomasse de microalgues dans un bioréacteur selon l'invention ;
la figure 2 montre un organigramme général d'un procédé de sélection selon l'invention ;
- la figure 3 montre une évolution de la température durant un temps de travail du procédé de l'invention ;
la figure 4 montre une évolution de la température durant un autre temps de travail du procédé de l'invention ;
la figure 5 montre un diagramme comparatif de niches thermales entre une souche de microalgues de l'état de la technique et deux souches de microalgues sélectionnées et/ou modifiées selon l'invention ;
la figure 6 montre un diagramme comparatif du taux de croissance entre une souche de microalgues de l'état de la technique et deux souches de microalgues sélectionnées et/ou modifiées selon l'invention ;
- la figure 7 montre un diagramme comparatif de températures de croissances et de niches thermales entre une souche de microalgues de l'état de la technique et deux souches de microalgues sélectionnées et/ou modifiées selon l'invention ; et la figure 8 montre un diagramme compratif du taux total de lipides présents dans les souches obtenues selon l'invention et de souches de l'état de la technique. Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
Pour une bonne production de microalgues (ou biomasse de microalgues) il convient de les cultiver dans un milieu de culture riche en nutriments (azote, phosphore, souffre, oligoéléments, vitamines) à des valeurs de température et de pH optimales pour les microalgues, et d'apporter suffisamment de lumière. La présence des nutriments est nécessaire pour permettre aux microalgues de convertir l'énergie lumineuse en métabolisant le CO2. Cette conversion a pour conséquence la production d'oxygène et l'augmentation en biomasse par la prolifération des microalgues (multiplication par division cellulaire). Après un ou plusieurs temps de travail, une partie du milieu de culture comportant des microalgues est prélevé de la cuve, et du milieu de culture frais est versé dans la cuve. En effet, après un ou plusieurs temps de travail les nutriments du milieu de culture sont épuisés et les microalgues peuvent sécréter/produire des composants toxiques. Il convient alors d'éliminer une partie du milieu de culture avec une partie des microalgues et de remplacer cette partie par du milieu de culture frais. Classiquement, le milieu de culture est renouvelé proportionnellement par rapport au taux de croissance des cellules de microalgues (ici de préférence par un coefficient de proportionnalité égal à 1). Dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention prévoit un taux de renouvellement moyen du milieu de culture d'environ 10% sur l'ensemble du/des temps de travail.
Classiquement on utilise une source de lumière capable d'émettre une lumière à une longueur d'onde qui est fortement absorbée par les microalgues, afin d'obtenir un taux de croissance élevé.
Les publications Light requirements in microalgal photobioreactors: an overview of biophotonic aspects - Carvalho et al., Appl Microbiology and Biotechnology, 2011, vol. 89, no. 5: 1275-1288 , Light emitting diodes (LEDs) applied to microalgal production - Schulze et al., Trends in Biotechnology, 2014, vol. 32, no. 8: 422-430 et Optimizing conditions for the continuous culture of Isochrysis affinis galbana relevant to commercial hatcheries - Marchetti, Bourgaran & Dean, Aquaculture, 2012, 326-329, 106-105 décrivent l'utilisation de la lumière dans les systèmes de culture des microalgues ou les conditions de température et de pH pour obtenir une bonne croissance cellulaire en fonction des microalgues. La figure 1 montre un schéma de production de biomasse de microalgues dans un bioréacteur de l'invention fonctionnant en alimentation continue. Les bioréacteurs d'alimentation en continu ont l'avantage de présenter une entrée et une sortie de milieu de culture, associées à un contrôleur permettant de piloter la cuve en continue à une concentration choisie de microalgues dans le milieu de culture durant un temps de travail. Le bioréacteur comprend une cuve 100 apte à recevoir un milieu de culture comportant des microalgues. Les microalgues sont dispersées dans le milieu de culture ou sous forme de biofilm. Les microalgues sont constituées de cellules C de micro-organismes photosynthétiques. Le bioréacteur comprend une entrée 102 et une sortie 104 respectivement associées à un dispositif de régulation de débit. Ainsi, l'entrée 102 et la sortie 104 sont respectivement associées à une première vanne (ou pompe) 106 et une deuxième vanne (ou pompe) 108 pour ouvrir et fermer l'entrée 102 et la sortie 104. L'entrée 102 et la première vanne 106 permettent de contrôler l'apport du milieu de culture frais dans la cuve 100. La sortie 104 et la deuxième vanne 108 permettent de contrôler l'évacuation du milieu de culture et, le cas échéant, de certaines au moins des cellules C. L'entrée et la sortie permettent de piloter en continu le bioréacteur pour une production P de biomasse de microalgues.
D'une manière générale, le contrôle de la production de biomasse dans un système de culture à alimentation en continu s'appuie sur la maîtrise de la croissance cellulaire de la culture de microalgues. La concentration x [g/L] de microalgues dans le milieu de culture évolue en fonction du taux de croissance spécifique μ(χ) [h 1]. Dans les systèmes continus la concentration évolue aussi en fonction du taux de dilution D [h _1] du milieu de culture. Le taux de dilution D est défini par le débit d'entrée (L/h) divisé par le volume (L) du milieu de culture.
La concentration x [g/L] de microalgues dans le milieu de culture évolue au cours du temps. Pour une souche de microalgues donnée cette évolution peut être exprimée par la formule Fl suivante : x = μ χ — D x [Fl]
En conséquence, pour la production de biomasse dans la cuve 100 du bioréacteur (à volume constant):
Si μ(χ) > D : les cellules se multiplient (par division cellulaire) plus vite qu'elles ne sont évacuées, leur nombre et donc leur concentration (biomasse) va augmenter.
Si μ(χ) < D : les cellules se multiplient (par division cellulaire) moins vite qu'elles ne sont évacuées, leur nombre et donc leur concentration (biomasse) va diminuer.
Si μ(χ) = D : le nombre de cellules demeure constant au cours du temps. Le nombre de cellules évacuées avec le milieu de culture de la cuve est égal au nombre de cellules obtenues par leur multiplication dans le milieu de culture au sein de la cuve. La concentration est stable.
Le bioréacteur comprend une source de lumière 200. La source de lumière 200 est apte à émettre une lumière incidente L. La lumière L est typiquement choisie pour couvrir tout le spectre solaire incluant la lumière bleue (de préférence de 430 nm à 470 nm) et rouge (de préférence de 650 nm à 700 nm). Ces plages de longueurs d'ondes permettent un bon taux de croissance des microalgues car elles sont fortement absorbées par celles-ci. Les phénomènes d'optique, d'absorbance et de métabolisation de photons dans une cuve de bioréacteur sont détaillés dans les ouvrages Microalgal biotechnology: potential and production, C. Posten and C. Walter, de Gruyter, 2012 et Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology, 2eme Édition, A. Richmond and Q. Hu, Wiley-Blackwell, 2013.
La concentration cellulaire dans la présente invention est choisie de sorte à éviter les problèmes liés à un gradient de lumière (phénomène d'auto-ombrage). De manière générale, la concentration cellulaire x, est comprise entre 0,01 g/L et 5,0 g/L. De préférence, la concentration est d'environ 0,1 g/L. Un objectif de la présente invention est de sélectionner et de cultiver des microalgues riches en substances d'intérêt industriel. Ainsi, la Demanderesse propose un nouveau procédé de sélection basée sur l'induction d'un stress thermique sur des microalgues. La Demanderesse a découvert non sans surprise que, dans un système de culture, un schéma particulier de phases de températures successives permet de sélectionner et/ou de modifier des microalgues convenants à une exploitation industrielle. Le système de l'invention peut être piloté en continu ou en semi-continu de typefed-batch.
Certaines espèces de microalgues sont capables de s'adapter à des températures ne correspondant pas aux températures de leur environnement naturel. Les microalgues exposées à des températures plus basses et/ou plus hautes que leur température optimale de croissance peuvent s'acclimater en augmentant leur capacité de stockage de certains métabolites. Par exemple, certaines cellules de microalgues augmentent leur capacité de stockage lipide polaires riches en acides gras polyinsaturés tels que l'acide docosahéxanoique (DHA) et l'acide eicosapentaenoique (EPA) en réponse à des stress thermiques. Il s'agit de produits présentant un grand intérêt industriel. La publication Validation of a simple model accounting for light and température effect on microalgal growth, Bernard & Rémond, Bioresource Technology, 2012, 123, 520-7 identifie des températures critiques pour microalgues. Il s'agit notamment d'une température optimale de croissance ainsi que de températures maximales et minimales au-delà desquelles la croissance est inhibée. La différence entre température maximale et minimale de croissance est appelée niche thermale. L'état de la technique fait une distinction entre les micro-organismes dits « spécialistes thermiques » (en anglais : thermal specialists) et les micro-organismes dits « généralistes thermiques » (en anglais : thermal generalists), cf. Evolution in changing environments, Levins, Princeton Univ Press Princeton NJ, 1968, 2(2), 120 ; et Hotter is better and broader: thermal sensitivity offitness in a population of bacteriophages, Knies et al., The American Naturalist, 2009, 173(4), 419-430. Les micro-organismes spécialistes thermiques présentent une niche thermale étroite et un taux de croissance élevé. Les micro-organismes généralistes thermiques présentent une niche thermale large et un taux de croissance faible.
L'approche de la Demanderesse est radicalement opposée à l'enseignement de l'état de la technique. En effet, la Demanderesse a découvert non sans surprise que la modification des températures minimale et maximale de croissance (augmentation de la niche thermale) permet d'augmenter le taux de croissance de microalgues. La productivité et le rendement sont augmentés.
Un objectif de l'invention est donc de générer de nouvelles souches de microalgues qui présentent une teneur accrue en produits d'intérêt industriel (enzymes, protéines, etc.). L'invention permet d'obtenir des biomasses importantes ce cellules précieuses de microalgues.
Un stress thermique a pour conséquence la mort cellulaire ou, le cas échéant, une adaptation des cellules de microalgues. Cette adaptation se traduit notamment par des mutations génétiques au sein des cellules de microalgues. En d'autres termes, les mutations génétiques naturelles induites par le stress thermique conduisent à des mécanismes d'adaptation génétique. Les mutations génétiques sont susceptibles d'être transmises d'une cellule à ses descendantes, et donc de se transmettre de génération à génération.
Une mutation génétique peut, par exemple, résulter en l'augmentation de lipides ou de protéines membranaires dans les cellules de microalgues. Elle peut également conduire à l'accumulation de métabolites au sein des cellules. De cette manière, les microalgues deviennent plus résistantes à des variations de températures s'éloignant de la température de croissance optimale.
La figure 2 montre un organigramme général d'un procédé de sélection selon l'invention. Une opération EMP comporte la mise à disposition d'une culture cellulaire de microalgues et d'un milieu de culture nutritionnel adapté pour la croissance de la culture choisie. L'opération comprend une sous-opération qui consiste à emplir la cuve 100 du milieu de culture et d'inoculer ce milieu avec les cellules de microalgues.
Une opération CYCLE 1 comprend une phase de croissance des microalgues dans des conditions de croissances optimales. À cet effet, la température T°C est réglée à une valeur croissance optimale V∞. La valeur optimale de croissance V∞ varie selon l'espèce de microalgues. La durée de l'opération CYCLE 1 est variable. D'une manière générale, une opération de croissance dans la présente invention dure 24 heures. Chaque opération de croissance peut être réitérée. Ainsi, l'opération CYCLE 1 peut durer un temps égal à 24h (t = to). L'opération CYCLE 1 peut être réitérée deux à sept fois par exemple. Ainsi, l'opération CYCLE 1 peut durer entre 48h et 7 jours.
L'opération CYCLE 1 est suivie par une opération CYCLE 2 de l'invention. L'opération CYCLE 2 comporte une première phase C2I dans laquelle la température est réglée à une première valeur de consigne basse VCBI. La valeur de consigne basse VCBI est à choisie de sorte à répondre à des conditions de températures plus froides par rapport aux conditions de températures de croissance optimale (VCBI < V∞). Ainsi, la valeur de consigne basse induit un stress thermal sur les microalgues. La première phase C2I est maintenue pendant une durée prédéfinie t = ti.
L'opération CYCLE 2 comporte une deuxième phase C2I I dans laquelle la température est réglée à une première valeur de consigne haute Vcm. La valeur de consigne haute Vcm est à choisie de sorte à répondre à des conditions de températures plus chaudes par rapport aux conditions de températures de croissance optimale (Vcm > V∞). Ainsi, la valeur de consigne haute induit un stress thermal sur les microalgues. La deuxième phase C2II est maintenue pendant une durée prédéfinie t = t2.
Les durées respectives des première et deuxième phases sont choisies de sorte que ti + t2 = 24 heures. La succession des première et deuxième phases peut être réitérée sept fois par exemple. Ainsi, l'opération CYCLE 2 peut durer entre 7 jours.
La figure 3 montre l'évolution de la température durant l'opération CYCLE 2 en fonction du temps, sur une durée de 24 heures. L'opération CYCLE 2 est suivie par une opération MES de mesure du taux de croissance spécifique μ des microalgues. Si μ est inférieure ou égale à zéro l'opération CYCLE 2 est réitérée ; si μ est supérieur à zéro une opération suivante CYCLE 3 est engagée.
L'opération CYCLE 3 comporte une première phase C3I dans laquelle la température est réglée à une deuxième valeur de consigne basse VCB2. La valeur de consigne basse VCB2 est à choisie de sorte à répondre à des conditions de températures plus froides par rapport à la première valeur de consigne basse dans l'opération CYCLE 2 (VCB2 < VCBI). La deuxième valeur de consigne basse induit un stress thermal sur les microalgues. La première phase C3I est maintenue pendant une durée prédéfinie t = t3. L'opération CYCLE 3 comporte une deuxième phase C3I I dans laquelle la température est réglée à une deuxième valeur de consigne haute VCH2. La deuxième valeur de consigne haute VCH2 est à choisie de sorte à répondre à des conditions de températures plus chaudes par rapport à la première valeur de consigne haute dans l'opération CYCLE 2 (VCH2 > Vcm). La valeur de consigne haute induit un stress thermal sur les microalgues. La deuxième phase C3II est maintenue pendant une durée prédéfinie t = t4.
Les durées respectives des première et deuxième phases sont choisies de sorte que t3 + t4 = 24 heures. La succession des première et deuxième phases peut être réitérée sept fois par exemple. Ainsi, l'opération CYCLE 3 peut durer entre 7 jours.
La figure 4 montre l'évolution de la température durant l'opération CYCLE 3 en fonction du temps, sur une durée de 24 heures.
Le schéma des opérations successives (ici : CYCLE 2, puis MES, puis CYCLE 3) ci-dessus peut être réitéré un nombre prédéfini de fois, par exemple en fonction des espèces de microalgues.
Ainsi, l'opération CYCLE 3 peut être suivie d'une nouvelle opération de mesure du taux de croissance spécifique μ des microalgues. Si μ est inférieure ou égale à zéro l'opération CYCLE 3 peut être réitérée ; si μ est supérieur à zéro une opération suivante CYCLE 4 peut être engagée. L'opération CYCLE 4 comporte alors des valeurs de consignes basse et haute respectivement inférieure et supérieure par rapport aux valeurs consignes de l'opération CYCLE 3. Ceci induira des stress thermaux sur les cellules de microalgues. EXEMPLE DE RÉALISATION
Le bioréacteur du présent mode de réalisation comprend une cuve 100 avec un milieu de culture. Le milieu de culture comprend une dispersion d'une culture cellulaire de microorganismes photosynthétiques. La culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques de départ choisie est la souche de microalgues Tisochrisis lutea CCAP 927/17. Dans la suite de la présente description, cette souche est appelée W2X.
La souche W2X initiale présente une bonne productivité de triglycérides, cf. Bougaran et al. Enhancement of neutral lipid productivity in the microalga Isochrysis affinis Galbana (T-lso) by a mutation-sélection procédure, Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109(11), 2737-45 et Carrier et al. Comparative transcriptome of wild type and selected strains of the microalgae Tisochrysis lutea provides insights into the genetic basis, lipid metabolism and the life cycle, PLoS ONE, 2014, 9(1).
La cuve présente une capacité volumique de 1,9 L. Ici, le milieu de culture est de type f/2, cf. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, Culture of Marine Invertebrate Animais - Plénum, 1975. La cuve 100 comprend en outre des moyens de mélange du milieu de culture. Il s'agit ici d'un agitateur magnétique et d'une soufflerie (de type pompe à air) apte à générer des fines bulles au sein du milieu de culture. Le bioréacteur comprend une entrée 102 et une sortie 104. L'entrée 102 permet d'apporter du milieu de culture frais dans la cuve 100. La sortie 104 permet d'évacuer du milieu de culture et des microalgues de la cuve 100. L'entrée 102 et la sortie 104 sont associées à un contrôleur. Le contrôleur permet de piloter la cuve 100 en continu pendant un temps de travail. Le temps de travail varie selon les souches de microalgues présentes dans le milieu de culture. Le temps de travail s'étend préférentiellement à minima sur 1 mois (sans limite supérieure de temps) ce qui correspond généralement à au moins 20 générations de microalgues (c'est-à-dire 20 divisions cellulaire successives). Selon l'invention, le temps de travail est supérieur au temps nécessaire pour un cycle cellulaire de microalgues (division cellulaire). Dans le présent mode de réalisation, le temps de travail est de 260 jours. Avantageusement, la cuve du bioréacteur est nettoyée régulièrement (par exemple chaque mois). Le nettoyage peut être réalisé au moyen d'éthanol 70% suivi d'un lavage d'acide chlorhydrique (HCI) et rinçage à milieu de culture frais. Pendant le nettoyage de la cuve, le milieu de culture comprenant la culture cellulaire est conservé dans des conditions stériles.
Le bioréacteur comprend une source de lumière 200 qui émet une lumière incidente L d'une intensité lumineuse d'entrée Iin suffisamment élevée pour traverser la cuve 100 emplie du milieu de culture comprenant la dispersion de microalgues. La source de lumière 200 est capable d'émettre une intensité lumineuse d'entrée Iin qui peut aller jusqu'à 5000 μιτιοΙ quanta m"2 s"1. Dans le présent mode de réalisation, la source de lumière est agencée pour émettre une intensité fixe de 250 μιτιοΙ quanta m"2 s"1. La source de lumière 200 émet une valeur constante d'intensité d'entrée Iin durant le temps de travail. Ici, la source de lumière comprend des diodes électroluminescentes de la société Nichia Corporation de type NVSL219BT 2 700°K. Un contrôleur 600 pilote la cuve 100 en continu à un taux de dilution D. Pour cela, le contrôleur 600 comprend un ou plusieurs capteurs 300 de lumière tels que des cellules photoélectriques pour mesurer la densité optique de l'ensemble milieu de culture/microalgues au sein de la cuve 100. De cette manière le contrôleur 600 peut maintenir la concentration de culture cellulaire ¾■ dans le milieu de culture à une valeur choisie, par exemple environ 1,0 g/L, durant le temps de travail. Le contrôleur est agencé pour adapter le taux de dilution D en apportant et évacuant du milieu de culture. Une concentration d'environ 1,0 g/L permet une bonne diffusion de la lumière au sein de la cuve 100. Ici, le bioréacteur comporte un capteur 300 de lumière de de la société Skye Instruments de type SKL2620. Dans le présent exemple de réalisation le protocole de sélection de l'invention est conduit dans un bioréacteur de type alimentation continue. La turbidité est maintenue constante à environ 9 x l05 cellules/mL. Ceci est réalisé par une mesure en continue à 800 nm par le capteur 300 et un pilotage par ajustement de dilution par le contrôleur 600. Il est fait ici référence au mode de sélection « SFturb ». Parallèlement, le protocole de sélection de l'invention est conduit dans un bioréacteur de type fed-batch. Une dilution au moyen de milieu de culture frais est réalisée tous les sept jours ; 5% à 10% du mélange milieu de culture/cellules de microalgues est conservé avant la dilution. La concentration cellulaire initiale après dilution est donc d'environ 5 x 105 cellules/L. Il est fait ici référence au mode de sélection « SFb ». Le pH du milieu de culture comprenant les microalgues est maintenu à pH = 8,2 par ajout de dioxyde de carbone (CO2) durant le temps de travail. Le bioréacteur comprend en outre un régulateur de température 500 apte à augmenter et à baisser la température dudit milieu de culture dans la cuve. Ici, le régulateur comporte un système de refroidissement/chauffage réalisé au moyen d'un double-manteau à eau agencée sur le pourtour de la cuve 100. Le bioréacteur comporte une sonde de température 400 pour mesurer la température dudit milieu de culture dans la cuve. Le bioréacteur comporte en outre une commande 700 du régulateur de température 500 agencée pour régler, durant un premier temps, la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse VCB, et durant un deuxième temps la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute VCH, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail. Ici, la commande 700 comporte un thermostat de la société Lauda Brinkmann de type Proline RP 845.
Le réglage de la température en vue d'atteindre les températures de consigne haute et basse peut être réalisé selon différent manières par la commande. Ainsi, la baisse et/ou l'augmentation de température peut notamment être réalisée de façon linéaire, exponentielle, ou par pallier.
Selon l'invention la température moyenne TM du milieu de culture (et donc reçue par cellule de microalgue) est maintenue constante durant le temps de travail. Ceci est radicalement différent des approches de l'état de la technique qui visent à augmenter progressivement la moyenne de température reçue par cellule. La commande 700 est agencée pour répondre à la condition de température moyenne durant le temps de travail suivante :
(VCB x premier temps) + (VCH x deuxième temps)
temps de travail
L'amplitude (ou l'écart) entre les valeurs de consignes basses et de consignes hautes est augmentée de cycle en cycle (ou de temps de travail à temps de travail). Le présent protocole de sélection prévoit des cycles de variation de températures toutes les 24 heures.
La température de croissance optimale Topt (valeur de température V∞) pour la souche W2X (Tisochrisis lutea CCAP 927/17) est égale à 28°C. La température moyenne choisie sur 24 heures dans le présent exemple de réalisation est égale à 28°C Chaque cycle (temps de travail) comporte un premier temps pour lequel la température du milieu de culture est réglée à une température T|0W plus froide que la température croissance optimale. La commande règle la température à la valeur de consigne basse VCB. Dans le présent mode de réalisation le premier temps est de 8 heures. Chaque cycle (temps de travail) comporte en outre un deuxième temps pour lequel la température du milieu de culture est réglée à une température Thigh plus chaude que la température croissance optimale. La commande règle la température à la valeur de consigne haute VCH. Dans le présent mode de réalisation le deuxième temps est de 16 heures.
La succession desdits premier et deuxième temps permet d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits cellules de la souche W2X.
Dans le 1er cycle de sélection, la valeur de consigne basse VCB (TI0W) est égale à 26°C. Dans le 1er cycle de sélection, la valeur de consigne haute VCH (Thigh) est égale à 29°C.
Ainsi, les microalgues sont exposées pendant 8 heures à 26°C, suivi de 16 heures à 29°C. La moyenne de température reçue par les microalgues en 24 heures est égale à 28°C (Topt). Le 1er cycle de sélection est réitéré pendant 7 jours. Après 7 jours, le taux de croissance μ est déterminé. Si μ est inférieur ou égale à zéro, les conditions de températures du 1er cycle de sélection sont réitérés à l'identique ; Si μ est supérieur à zéro, un 2eme cycle de sélection est engagé.
Dans le 2eme cycle de sélection, la valeur de consigne basse VCB (TI0W) est égale à 24°C. Dans le 2eme cycle de sélection, la valeur de consigne haute VCH (Thigh) est égale à 30°C.
Ainsi, les microalgues sont exposées pendant 8 heures à 24°C, suivi de 16 heures à 30°C. La moyenne de température reçue par les microalgues en 24 heures est égale à 28°C (Topt).
Le 2eme cycle de sélection est réitéré pendant 7 jours. Après 7 jours, le taux de croissance μ est déterminé. Si μ est inférieur ou égal à zéro, les conditions de températures du 2eme cycle de sélection sont réitérées ; Si μ est supérieur à zéro, un 3eme cycle de sélection est engagé.
Chaque cycle (ou temps de travail) subséquent baisse, d'une part, la valeur de consigne basse VCB (Tiow) de 0,5°C à 1°C, et augmente, d'autre part, la valeur de consigne haute VCH (Thigh) de 0,25°C à 0,5°C, tandis que les premier et deuxième temps restent identique (respectivement 8 heures et 16 heures). Les conditions de températures sont de plus en plus extrêmes d'un temps de travail à un autre. Ainsi, la valeur de consigne basse VCB (TI0W) peut par exemple atteindre 12°C et la valeur de consigne haute VCH (Thigh) peut par exemple atteindre 36°C. La sélection est de plus en plus stricte en augmentant le nombre de temps de travails successifs. Dans le présent exemple de réalisation, le temps de travail de 24 heures est réitéré 259 fois (total de 260 jours).
En variante il est possible de modifier les premier et deuxième temps. Par exemple, dans un mode de réalisation le premier temps est fixé à 6 heures et le deuxième temps est fixé à 12 heures. Il est alors prévu un troisième temps durant lequel la température est maintenue égale à la valeur optimale de croissance (V∞). Ainsi, la température moyenne reçue par les microalgues reste constante sur 24 heures. À titre d'exemple on peut citer un cycle de sélection, dans lequel : la température T|0W à la valeur de consigne VCB basse égale à 26°C est maintenue pendant 6 heures ;
- la température Thigh à la valeur de consigne haute VCH égale à 29°C est maintenue pendant 12 heures, et dans lequel
la température Topt à la valeur de croissance optimale V∞ égale à 28°C est maintenue durant un troisième temps égal à 6 heures.
La moyenne de température reçue par cellule de microalgue en 24 heures est alors égale à
Dans cette variante, le postulat général dans lequel pour un temps de travail donné (prédéfini), le deuxième temps dure deux fois plus longtemps (le double) que le premier temps, est vérifié. Il s'y ajoute un troisième temps pour compléter ledit temps de travail donné.
La figure 5 montre le taux de croissance par jour (j _1) par rapport à la température (°C) de la souche initiale W2X et des souches W2X ayant été soumis au protocole de sélection de l'invention, à savoir respectivement W2XSTurb (pour la souche W2X sélectionnée dans le bioréacteur en continue) et W2XSFb (pour la souche W2X sélectionnée dans le bioréacteur en fed-batch). La figure 5 montre que la niche thermale des souches adaptées W2XSTurb et W2XSFb est accrue par rapport à la souche W2X initiale. Les températures extrêmes, à savoir les températures minimales Tmin de croissance et les températures maximales Tmax de croissance pour chaque souche ont été calculées selon le modèle proposé dans Validation of a simple model accounting for light and température effect on microalgal growth, Bernard & émond, Bioresource Technology, 2012, 123, 520-7.
La figure 6 montre un diagramme comparatif entre la souche initiale W2X et les souches modifiées par le procédé de l'invention W2XSFb et W2XSTurb. Les souches générées selon l'invention ont un taux de croissance accrue par rapport à la souche initiale W2X.
La figure 7 montre un diagramme comparatif des souches W2X, W2XSFb et W2XSTurb entre les températures minimales Tmin de croissance, les températures maximales Tmax de croissance, la température optimale Topt de croissance et les niches thermales. Les figures 5 et 6 montrent que les taux de croissance des souches adaptées W2XSTurb et W2XSFb sont plus élevées que le taux de croissance de la souche initiale W2X. La figure 7 montre que les niches thermales des souches adaptées W2XSTurb et W2XSFb sont plus larges que la niche thermale de la souche initiale W2X. Ainsi, les figures 5 à 7 démontrent que les microalgues modifiées au moyen du procédé de sélection de l'invention présentent un taux de croissance élevé et une niche thermale élargie. Ceci est contraire aux résultats et modèles de l'état de la technique qui associent une niche thermale large à un taux de croissance faible. L'intérêt pour une exploitation industrielle des souches adaptées W2XSTurb et W2XSFb est accrue par rapport à la souche initiale W2X à niche thermale plus étroite.
La figure 8 montre un diagramme compratif du taux total de lipides présents dans une souche sauvage (wild-type) Tisochrisis lutea à savoir la souche CCAP 927/14 (cf. Bougaran et al. Enhancement of neutral lipid productivity in the microalga Isochrysis affinis Galbana (T-Iso) by a mutation-sélection procédure, Biotechnology and Bioengineering, 2012, 109(11), 2737-45), dans la souche initiale W2X, dans la souche W2XSFb et dans la souche W2XSTurb. Les souches modifiées par le procédé de l'invention W2XSFb et W2XSTurb ont des taux de lipides ^g de lipides par μg de carbone d'algue) accrues par rapport à la souche sauvage et à la souche W2X initiale.
Les acides gras et leur taux respectif, contenus dans les échantillons de la souche initiale W2X, de la souche W2XSFb et de la souche W2XSTurb, ont été identifiés en chromatographie en phase gazeuse (CPG).. La composition des acides-gras et les quantités respectives de ces acides ont été déterminées. Le tableau 1 montre les résultats. Acide Gras W2XSTurb W2XSTurb W2XSFb W2X
[1er Échantillon] [2ème Échantillon]
Acides Gras Saturés :
C14:0 24.70 24.24 21.73 22.1
C15:0 0.32 0.33 0.29
C16:0 14.21 14.12 14.57 16.9
C18:0 0.50 0.54 0.79 0.7
Total 40.47 39.93 38.071 39.9
Acides Gras Mono- insaturés :
Monoène
C14:ln-5 0.55 0.63 0.45
C16:ln-7 2.28 2.09 2.56 5.1
C18:ln-9 21.71 22.99 22.99 28.9
C18:ln-7 1.282 1.29 1.70 1.1
Total 27.60 29.23 29.87 37.9
Acides Gras
Polyinsaturés :
Diène
C16:2n-6 0.13 0.12 0.15 0.1
C16:2n-4 0.31 0.31 0.41 0.2
C18:2n-6 4.41 4.97 3.45 3.8
C20:2n-6 0.064 0.081 0.13 0.1
Triène
C18:3n-3 3.81 3.891 4.63 3.1
C20:3n-6 0.0531 0.049 0.079 0.1 C20:3n-3 0.0351 0.031 0.092 0.2 tétraène
C18:4n-3 7.746 7.25 9.70 6.8
C20:4n-6 0.072 0.10 0.089 0.1
C20:4n-3 0.024 0.0031 0.020 0.3
Pentaène
C18:5n-3 0.65 0.59 0.76 0.4
C20:5n-3 (EPA) 0.24 0.23 0.21 0.2
C22:5n-6 2.16 2.06 1.94 0.8
C22:5n-3 0.095 0.14 0.33 0.9
C22:6n-3 (DHA) 11.39 10.21 9.32 5
Total Poly 31.92 30.83 32.06 22.4
Tableau 1 : Comparatif entre les compositions en acides-gras des souches adaptées W2XSFb et W2XSTurb et la composition en acide-gras initiale dans la souche W2X.
Les résultats figurants dans le tableau 1 montrent que les souches de microalgues adaptées (notamment génétiquement modifiées) par le procédé de l'invention présentent des quantités accrues en acides gras. Tout particulièrement une augmentation significative est observée pour le DHA qui présente un grand intérêt industriel.
La modification de la souche W2X par le bioréacteur de l'invention résulte en des souches modifiées de W2X (ici W2XSFb et W2XSTurb) présentant une niche thermale augmentée de plusieurs degrés Celsius (ici jusqu'à 3°C). Les souches de W2X modifiées selon l'invention présentent en outre un taux accru d'acides gras par rapport à la souche initiale W2X (notamment en DHA). Le taux de croissance des souches de W2X modifiées selon l'invention est accru par rapport à la souche W2X initiale.

Claims

REVENDICATIONS
1. Bioréacteur caractérisé en ce qu'il comporte une cuve (100) apte à être pilotée durant un temps de travail, ladite cuve (100) étant destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, une source de lumière (200) agencée pour émettre une lumière incidente d'une intensité lumineuse d'entrée choisie (Iin) en direction de la cuve, une sonde de température (400) pour mesurer la température dudit milieu de culture dans la cuve, et un régulateur de température (500) apte à augmenter et à baisser la température dudit milieu de culture dans la cuve, et en ce qu'il comprend en outre une commande (700) du régulateur de température agencée pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse (VCB) durant un premier temps, et pour régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute (VCH) durant un deuxième temps, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail.
2. Bioréacteur selon la revendication 1, dans lequel la commande (700) est agencée pour déterminer ladite valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute et lesdits premier et deuxième temps de sorte à maintenir une valeur moyenne (VM) de consigne durant le temps de travail, la valeur moyenne étant égale à la somme du produit de ladite valeur de consigne basse et dudit premier temps et du produit de ladite valeur de consigne haute et dudit deuxième temps, divisée par le temps de travail.
3. Bioréacteur selon la revendication 2, dans lequel ladite valeur moyenne de consigne est sensiblement égale à la température de croissance optimale (Topt) de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques.
4. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite intensité lumineuse d'entrée choisie (Iin) de la lumière incidente est fixe durant le temps de travail.
5. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite intensité lumineuse d'entrée choisie (Iin) de la lumière incidente est comprise entre 100 et 2000 μιτιοΙ quanta m"2 s"1, de préférence égal à environ 250 μιτιοΙ quanta m"2 s"1.
6. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un contrôleur (600) agencé pour piloter la cuve à une concentration de culture cellulaire choisie (¾■), de préférence à une concentration sensiblement inférieure ou égale à 1,0 g/L, dans le milieu de culture durant ledit temps de travail.
7. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un capteur de lumière (300) disposé en regard de la source de lumière (200), le capteur étant capable de mesurer une intensité lumineuse en sortie (Iout) et de transmettre des données relatives à cette intensité (Iout) au contrôleur pour calculer la concentration de la culture cellulaire et de piloter la cuve à ladite concentration de culture cellulaire choisie ( ,) dans le milieu de culture durant le temps de travail.
8. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, apte à réitérer le temps de travail une fois achevé.
9. Bioréacteur selon la revendication 8, dans lequel la commande est en outre agencée pour recevoir des données relatives au taux de croissance de ladite culture cellulaire de microorganismes photosynthétiques après un ou plusieurs temps de travail, et dans lequel la commande fixe la valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute après ladite réception des données relatives au taux de croissance de ladite culture cellulaire de microorganismes photosynthétiques.
10. Procédé de sélection de micro-organismes photosynthétiques, comprenant les étapes suivantes :
1 Mettre à disposition un bioréacteur selon la revendication 1 ;
2 Emplir la cuve d'un milieu de culture ;
3 Inoculer le milieu de culture avec une culture cellulaire constituée de microorganismes photosynthétiques ;
4, Piloter la cuve durant un temps de travail et régler l'intensité lumineuse d'entrée (Iin) à une valeur choisie ;
5 Régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne basse (VCB) durant un premier temps, et régler la température du milieu de culture à une valeur de consigne haute (VCH) durant un deuxième temps, la succession desdits premier et deuxième temps permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques durant le temps de travail ;
6, Récolter les micro-organismes photosynthétiques.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite valeur de consigne basse et ladite valeur de consigne haute et lesdits premier et deuxième temps sont réglés de manière à maintenir une valeur moyenne (VM) de consigne durant le temps de travail, la valeur moyenne étant égale à la somme du produit de ladite valeur de consigne basse et dudit premier temps et du produit de ladite valeur de consigne haute et dudit deuxième temps, divisée par le temps de travail.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, dans lequel ladite valeur moyenne de consigne est sensiblement égale à la température de croissance optimale (Topt) de la culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques. 13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, comprenant en outre les étapes suivantes :
4a. Prélever une partie du milieu de culture comportant au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques ; et
4b. Compenser ladite partie du milieu de culture comportant au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques prélevée par du milieu de culture frais.
14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel l'étape 5. de régulation de température est réitérée plus de 2 fois de manière à provoquer une dégradation cellulaire d'au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques et ainsi sélectionner les microorganismes photosynthétiques présentant des propriétés précieuses.
15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel la récolte à l'étape 6. est réalisée lorsque le milieu de culture comporte une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques constituée à plus de 75%, préférentiellement à plus de 90%, encore plus préférentiellement sensiblement à 100% de micro-organismes photosynthétiques présentant des propriétés précieuses.
16. Procédé selon la revendication 15, comprenant en outre les étapes suivantes :
7. Inoculer un milieu de culture frais avec les micro-organismes photosynthétiques présentant des propriétés précieuses dans un bioréacteur ; et
8. Piloter le bioréacteur de l'étape 7. pour une production de biomasse constituée desdits micro-organismes photosynthétiques présentant des propriétés précieuses.
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