EP3468566A1 - Diéthers d'archaea lipides synthétiques - Google Patents

Diéthers d'archaea lipides synthétiques

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Publication number
EP3468566A1
EP3468566A1 EP17735199.6A EP17735199A EP3468566A1 EP 3468566 A1 EP3468566 A1 EP 3468566A1 EP 17735199 A EP17735199 A EP 17735199A EP 3468566 A1 EP3468566 A1 EP 3468566A1
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EP
European Patent Office
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mage
liposome
lpr
integer
gage
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17735199.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
François LEMOINE
Véronique MATEO
Patrick Midoux
Chantal Pichon
Thierry Benvegnu
Loïc LEMIÈGRE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Rennes
Universite d Orleans UFR de Sciences
Sorbonne Universite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Rennes
Universite d Orleans UFR de Sciences
Sorbonne Universite
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
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    • C07H15/08—Polyoxyalkylene derivatives
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the present invention relates to the field of liposomes, their lipid compounds and their pharmaceutical uses.
  • the present invention relates to the production of novel synthetic compounds and the formulation of novel liposomes comprising at least one of these compounds for vaccine use.
  • Liposomes are a very effective way to deliver a molecule of interest into cells. Liposomes represent, for example, an alternative to viral vectors for the delivery of nucleic acids. They also have a major therapeutic interest in oncology. In addition to being used as drug vectors, liposomes are indeed developed for a therapeutic vaccination aimed at inducing an immune response against tumor cells.
  • the so-called conventional liposomes consist mainly of phosphoiipids similar to those present in the membranes of bacteria or eukaryotic cells.
  • the medical use of these liposomes can however be limited by stability problems and targeting problems.
  • the liposomes In order to be administered orally or by blood, the liposomes must indeed withstand an acid environment and / or interactions with the proteins and lipoproteins of the blood.
  • the liposomes must be recognized by the cells for which the molecules they transport are intended.
  • the liposomes used as vaccination vectors must be recognized and standardized by the antigen presenting cells so that they can induce a specific immune response to the antigen delivered by the liposomes.
  • lipid ethers or archaeo lipids.
  • These lipids naturally present in the membranes of archaebacteria, are characterized by the presence of ether bonds linking the phytosanitary aliphatic chains that constitute them to a glycerol.
  • the lipids present in the membranes of archaebacteria are therefore generally diethers or tetraethers of phytanois.
  • the structure of lipid ethers plays an important role in the resistance of archaebacteria to extreme conditions.
  • liposomes comprising these lipids also known as archaeosomes, generally possess increased stability to oxidative stress, high temperatures, acidic or alkaline conditions, the action of phospholipases, bile salts and serum proteins (Patei GB , Sprott GD, Archaeobacterial ether lipid liposomes (archeosomes) as novel vaccines and drug delivery systems, Crit Rev Biotechnol 1999; 19: 317-357).
  • WO9308202 thus describes archaeosomes with increased stability obtained from the total polar lipids extracted from archaebacteria.
  • CA2269502 discloses lipids derived from tetraethers and liposomes comprising them.
  • WO2006061396 discloses tetraethers of synthetic lipids analogous to those present in archaebacteria membranes and liposomes incorporating these lipid tetraethers. In addition to their increased stability, archaeosomes also have the advantage of having an intrinsic adjuvant effect, independent of any molecule they can carry.
  • WO0126683 thus describes in vitro and in vivo enetivation of macrophages and mouse dendritic cells by empty archaeosomes consisting of total polar lipids extracted from archaebacteria.
  • liposomes comprising such compounds having a polar sugar moiety can be recognized by the lectin receptors of antigen presenting cells (Benvegnu et al., Glycolipid-based nanosystems for delivery of drugs, genes and vaccine adjuvant applications, Carbohydr. ., 2014, 40: 341-377).
  • Espuelas et al. Glycolipid-based nanosystems for delivery of drugs, genes and vaccine adjuvant applications, Carbohydr. ., 2014, 40: 341-377.
  • DOG dioleylglycerol synthetic lipid
  • liposomes comprising these compounds can target and be fixed by human immature dendnestic cells but are not capable of inducing alone the expression of the CD83, CD86 and HLA-DR surface markers of these cells.
  • the compounds described by Espueias et al. Do not confer an intrinsic adjuvant effect on the liposomes which contain them.
  • WO2007112567 discloses diethers or tetraethers of semisynthetic lipids comprising only phytanyl chains obtained from total polar lipid extracts of archaebacteria. After isolation, these lipids are attached to sugar groups and the compounds obtained are used in the preparation of archaeosomes.
  • the present invention thus relates to synthetic compounds comprising a lipid diether bound to a. sugar group and liposomes comprising these compounds.
  • the compounds of the invention are characterized by the presence of a branched aliphatic chain and an unsubstituted linear aliphatic chain and by the presence of a glycoside group grafted to the lipid diether via a PEG spacer.
  • the synthetic compounds of the invention confer on the liposomes which comprise them an intrinsic adjuvant effect in vitro and in vivo.
  • the present invention thus relates to a compound of formula I:
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • Ri, Ri 'and Ri are identical or different, independently represent an H, or a group of the type:
  • R2 and R2 ' are the same or different, each independently represents H or a sugar residue selected from the list comprising mannose, glucose, fucose, oligomannoses comprising from 2 to 10 mannose units, glycans terminated by a mannose , fucose-terminated glycans, 3'-sulfo-Lewis a trisaccharide, Lewis b (Le b ) trisaccharide, Lewis x (Le x ) trisaccharide, N-acetylglucosamine tri (tri-GIcNAc), PIMs ( phosphatidylinositol mannosides), in particular the PIMi with PIMe (phosphatidylinositol mono- to hexa-mannoside), the oligosaccharide Man9GlcNAc2, the mannose-rich N-linked oligosaccharides, the oligosaccharide ⁇ -fucose-4G!
  • cNAc the oligosaccharide iacto- N-fucopentaose III containing the Le x trisaccharide, the GlcNAc2 Man 3 oligosaccharide, the Man 4 oligosaccharides, the Manal-3 (Mana-6) Manal oligosaccharide, the lipoarabinomannanes (LAMs), the mannosylated lipoarabinomannans (ManLAMs) ;
  • LAMs lipoarabinomannanes
  • ManLAMs mannosylated lipoarabinomannans
  • d represents an integer of 0 to 5; provided that at least one of R 2 and R 2 'is different from H and that R2 is different from H when R2' is absent;
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • Ri, Ri 'and Ri are identical or different, each independently represent an H or group 1
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • R2 and R2 ' are the same or different, each independently represents marmose, glucose, fucose, or oligomarmoses comprising from 2 to 10 mannose units,
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • R 1, R 1 and R 1 are identical or different, independently represent an H or the group:
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • R2 and R2 ' represent the grouping:
  • the present invention also relates to a compound of formula II:
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to
  • d represents an integer from 1 to 5, preferably 2, according to one embodiment, the present invention relates to the compound of formula II:
  • the present invention also relates to a liposome comprising at least one compound according to the invention.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound of the invention in proportions of from about 1% to about 15% by molar percentage relative to the total number of moles of lipids, preferably from about 2% to about 10%, more preferably about 5%.
  • the present invention also relates to a liposome of the invention further comprising at least one molecule of interest.
  • the molecule of interest included in the liposome of the invention is capable of inducing an immune reaction.
  • the molecule of interest included in the liposome of the invention is a nucleic acid. According to one embodiment, the molecule of interest included in the liposome of the invention is a cancer-associated antigen or a nucleic acid encoding a cancer-associated antigen.
  • the molecule of interest is a cancer-associated antigen selected from the group comprising: CAP-1, CD 4 / m, cell surface proteins of the Claudine CLAUDIN-6 family, CLAUDIN-18.2 and CLAUDIN -12, c-myc, CT, GnT-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NF 1, NY-BR-1, proteinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI / m , TPTE, CDK4 (cy clinin kinase 4), plS1 !
  • Pml-RARaTEL / AMLI NY-ESO-I
  • members of the MAGE (Melanoma-associated aniigen) family M AGE-A1, MAGE-A2, M AGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE -Al 0, M AGE-A1, MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, BAGE, DAM-6, DAM- 10.
  • the present invention also relates to a compound according to the invention for use as a vaccine adjuvant.
  • the present invention relates to a liposome comprising at least one compound according to the invention for use as a vaccine adjuvant.
  • the present invention also relates to a liposome comprising at least one compound of the invention and further comprising at least one molecule of interest capable of inducing an immune reaction for its use as a vaccine.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the compound according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention relates to the liposome according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • adjuvant refers to a molecule that stimulates the immune response to an antigen and / or modulates it to achieve the expected response.
  • adjuvants in the vaccine formulations is intended to improve, accelerate and prolong the specific immune response directed against the antigen (s) included in these vaccine formulations.
  • the benefits of adjuvants include improving the immunogenicity of antigens, modifying the nature of the immune response, reducing the amount of antigen (s) required to induce effective immunization, reducing the frequency of immunizations booster and improved immune response in elderly and immunocompromised individuals.
  • Antigen refers to any molecule that can initiate in a subject a cellular and / or humoral immune response.
  • Dendritic cells refers to antigen presenting cells of the immune system that under certain conditions have cytoplasmic extensions called dendrites. The function of the dendritic cells is notably to trigger the adaptive immune response induced in response to an antigen.
  • Lipid diether relates in the present invention a glycerol on which two alcohol functions are engaged in ether bonds with lipids,
  • “Pharmaceutically acceptable excipient” refers to an inert vehicle or carrier used as a solvent or diluent in which the pharmaceutically active agent is formulated and / or administered, and which does not produce an adverse, allergic or other reaction when administered to an animal, preferably a human being. This includes all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, absorption delaying agents and other similar ingredients.
  • preparations must meet standards of sterility, general safety and purity, as required by regulatory authorities, such as, for example, the Food and Drug Administration (FDA) or the European Medicines Agency (PEMA). ).
  • Crosscan refers to a polymer composed of monosaccharides linked together by a glycosidic bond.
  • glycoside refers to a sugar group attached to another non-sugar function by a glycosidic linkage.
  • the sugar group also called sugar residue, may be a simple sugar (a monosaccharide) or may contain several sugars (an oligosaceharide or a polysaccharide).
  • Immunogen relates to a molecule inducing an immune response in the subject to whom it is administered
  • Lectin refers to a protein that specifically and reversibly binds to certain carbohydrates.
  • lectins those present on the surface of certain immune cells are type C lectins.
  • Lipid relates to a linear or branched, saturated, unsaturated or polyunsaturated carbon chain
  • LPD Lipid - Polycation - DNA
  • LPR Lipid - ⁇ Polycation - RNA
  • “Liposome” relates to a vesicle formed of a bilayer of amphiphilic lipids containing an aqueous medium.
  • the polar heads of the amphiphilic lipids are grouped together and are directed either towards the aqueous external medium or towards the aqueous internal medium.
  • the hydrophobic tails are buried inside the bilayer so as to minimize their interaction with an aqueous medium.
  • Adaptive immune response refers, after the administration of a vaccine, to the development in a subject of a specific cellular and / or humoral response (mediated by antibodies).
  • Adaptive immune response generally includes, but is not limited to, one or more of the following effect (s): production of antibodies, B-cells, helper T-cells, and / or cytotoxic T lymphocytes, specifically directed against one or more antigen (s) included in the vaccine.
  • the vaccinated subject will develop a protective or therapeutic adaptive immune response such that its resistance to infection will be increased and / or the severity of the disease will be reduced.
  • “Sugar” in the present invention may refer to a simple sugar or a simple sugar polymer.
  • Simple sugars also called monosaccharides or oses, are polyhydroxy aldehydes or polyhydroxy ketones. Glucose, mannose, ribulose and fructose are some examples of simple sugars.
  • the simple sugar polymers can be distinguished into oligosaccharides, comprising from 2 to 20 osteoside residues and polysaccharides, comprising more than 20 saccharide residues.
  • Subject refers to an animal, preferably a human being.
  • a subject may be a patient, namely a person receiving medical care, undergoing or having undergone medical treatment, or monitored as part of the development of a disease.
  • Vaccine refers to any preparation comprising a substance or a group of substances inducing in a subject an immune response directed against an infectious agent, for example a bacterium (e.g.
  • Haemophilus influenzae type b Hib
  • Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Ciostridium tetani, Bordatella periussis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi
  • a virus eg influenza virus (influenza), chickenpox, hepatitis A, hepatitis B, immunodeficiency virus human (HIV), papillornavirus or poliovirus
  • Prophylactic vaccines are administered to prevent a subject from contracting a disease or to mitigate the disease if the disease is contracted.
  • Such vaccines generally comprise either an infectious agent (inactivated, or live but attenuated), or fragments of an infectious agent (such as surface molecules from the infectious agent) or toxins produced by the infectious agent. obtained by purification or genetic engineering.
  • Therapeutic vaccines are intended for the treatment of specific diseases, such as, for example, cancers.
  • Such vaccines comprise one or more tumor antigens and are intended in particular to induce a T cell-mediated, tumor-directed immune response that expresses the antigen (s).
  • the present invention relates to a compound comprising:
  • one of the aliphatic chains is a branched chain in which the number of carbon atoms of the linear chain is between 12 and 20, preferentially between 16 and 20, this number not including the branched carbons, and the other aliphatic chain is an unsubstituted linear chain in which the number of carbons is between 12 and 20, preferably between 16 and 20 ;
  • hydrophilic group selected from the list comprising mannose-terminated glycans, fucose-terminated glycans, 3'-sulfo-Lewis trisaceharide, Lewis trisaccharide b (Le b ), Lewis x trisaccharide (Le x ), tri N-acerylglucosamine (tri-GlcNAc), PIMs (phosphatidylinositol mamiosides), in particular PIMi at PIMe (phosphatidylinositol mono- to hexa-mannoside) ), the Man9GlcNAc2 oligosaccharide, the mannose-rich N-linked oligosaccharides, the ⁇ -fucose-4GlcNAc oligosaccharide, the lacto-N-fucopentaose III oligosaccharide containing the Le x trisaccharide, the GlcNAc2 Mail 3 oli
  • a [PEG] spacer separating the hydrophilic group from the aliplicial chains in which m is between 1 and 130, preferably between 5 and 20.
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • Ri, Ri 'and Ri are identical or different, each independently represent an H, or a group of the type:
  • R2 and R2 ' are the same or different, each independently represents H or a sugar residue selected from the list comprising mannose, glucose, fueose, oligomannoses comprising from 2 to 10 mannose units, glycans terminated by a mannose, fueose-terminated glycans, 3'-sulfo-Lewis trisaccharide, Lewis b (Le b ) trisaccharide, Lewis x (Le *) trisaccharide, N-acetylglucosamine tri (tri-GlcNAc), PIMs (phosphatidylinositol mannosides), in particular PIMi to PIM0 (phosphatidylinositol mono- to hexa-mannoside), oligosaccharide Man9GlcNAc2, mannose-rich N-linked oligosaccharides, roligosacciiaride a-fucose-1-4GlcNAc,
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • R2 and R2 ' are different from H and R2 is different from H when R2' is absent;
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • R 1, R 1 'and R 1 are identical or different, each independently represent an H or the group:
  • R2 and R2 ' are identical or different, each independently represents an H or a sugar residue selected from the list comprising mannose, glucose, fucose, origomannoses comprising from 2 to 10 mannose units, glvcanes terminated by a mannose , glycans terminated fucose, trisaccharide 3 ' ⁇ sulfo-Lewis a, the trisaccharide Lewis b (Le b), the trisaccharide Lewis x (Le *), tri N-acetylglucosamine (tri-GlcNAc), the PIMS ( phosphatidylinositol mannosides), in particular PIMj with PIM0 (phosphatidylinositol mono-hexa-mannoside), Poligosaceharide ⁇ -fucose-1-4GlcNAc, lacto-N-fucopentaose oligosaccharide III containing the trisaccharide Le x
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a is equal to 5;
  • R 1, R 1 'and R 1 are identical or different, each independently represent an H or the group:
  • R2 and 2 ' are the same or different, each independently represents H or a sugar residue selected from the list comprising mannose, glucose, fucose, oligomannose comprising from 2 to 10 mannose units, glvcanes terminated by a mannose , fucose-terminated glycans, 3'-sulfo-Lewis a trisaccharide, Lewis b trisaccharide (Le b ), Lewis x (Le *) trisaccharide, N-acetylglu-samine tri (tri-GlcNAc), PIMs.
  • PIMj Phosphatidylinositol mannosides
  • PIMj PIMj at ⁇ 0 (phosphatidylinositol mono- to hexa-mannoside)
  • oligosaccharide Man9GlcNAc2 N-linked oligosaccharides rich in niamiose, a-fucose-l-4GlcNAc oligosaccharide, lactose-N-fucopentaose III oligosaccharide containing Le x trisaccharide, GlcNAc2 Mail 3 oligosaccharide, Man 4 oligosaccharides, Manal oligosaccharide - 3 (Manal -6) Mana1, lipoarabinomannans (LAMs), lipoarabinomannans nies nosylated (ManLAMs);
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • R2 and R2 ' are different from H and R2 is different from H when R2' is absent;
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a represents an integer from 1 to 9;
  • b represents an integer of 1 to 3;
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • Ri, Ri 'and Ri are identical or different, each independently represent an H or the grouping:
  • d represents an integer of 0 to 5;
  • R 2 and R 2 ' represent the grouping:
  • the present invention relates to a compound of formula I:
  • a is equal to 5;
  • Ri, Ri 'and Ri are identical or different, each independently represent an H or the grouping:
  • R 2 and R 2 ' represent the grouping: with the proviso that at least one of R 1, R 1 'and R 1' is different from R 1, the present invention relates to a compound of formula I:
  • a is equal to 5;
  • Ri, Ri 'and Ri represent the group: in the equel d is equal to 2;
  • R 2 represents the grouping:
  • the present invention therefore relates to a trimannosyl compound of formula II:
  • c represents an integer from 1 to 130, preferably from 5 to 20;
  • d represents an integer from 1 to 5, preferably 2.
  • the present invention relates to a trimannosyl compound of formula II:
  • c represents an integer from 2 to 30, preferably from 3 to 20 and more preferably from 4 to 10;
  • d represents an integer of 1 to 5, preferably 2.
  • the present invention relates to a tri-mannosyl compound of formula II:
  • the present invention relates to a synthetic compound comprising a lipid having structural characteristics peculiar to lipids naturally present in archaebacteria membranes.
  • the lipids naturally present in archaebacteria membranes are characterized by the presence of ether bonds linking the aliphatic chains that constitute them to a glycerol molecule. They are also characterized by the presence of aliphatic phytanyl chains having regular branching.
  • the lipid ethers present in the membranes of archaebacteria are thus generally diethers of phytanols (such as Parchaeol) or tetraethers of phytanols (such as caldarchaeol).
  • the glycerolipids present in the membranes of bacteria and eukaryotic cells, so-called conventional, have them ester bonds connecting the fatty acids that constitute them to a molecule of glycerol.
  • fatty acids of these conventional lipids are generally saturated or saturated aliphatic chains, not including branches.
  • the structure of lipid ethers present in the archaebacteria membranes plays an important role in the resistance of archaebacteria to extreme conditions such as high temperatures or an acidic environment.
  • the present invention relates to a synthetic compound having two ether bonds, connecting a branched aliphatic chain and a linear aliphatic chain unsubstituted to a glycerol.
  • the present invention relates to a compound comprising a lipid diether.
  • the lipid diether of the invention comprises two epiphatic chains, the linear structures of which do not include the branched carbons are of the same length, connected to a glycerol by an ether linkage, one of the epiphatic chains. being a branched chain and the other aliphatic chain being an unsubstituted linear chain.
  • the lipiphatic chains of the lipid diether of the invention are saturated. In another embodiment, the lipiphatic chains of the lipid diether of the invention are unsaturated. In another embodiment, the branched aliphatic chain is saturated and the unsubstituted linear aliphatic chain is unsaturated. In another embodiment, the branched aliphatic chain is unsaturated and the unsubstituted linear aliphatic chain is saturated.
  • the linear structure of the same length of the branched chain and the unsubstituted linear chain of the lipid diether of the invention comprises between 12 and 20 carbons, preferably between 16 and 20 carbons, and more preferably 16 carbons.
  • the linear structure of the same length of the branched chain and the unsubstituted linear chain of the lipid diether of the invention comprises 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 carbons.
  • the present invention relates to a compound comprising a lipid diether to which is grafted a hydrophilic group, or polar group.
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is a glycoside.
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is a sugar recognized by lectins, proteins capable of binding sugar residues, and preferentially by type C lectins.
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is a sugar recognized by the lectins DC-SIGN (CD209), DEC205 / CD205, langerine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, and / or the mannose receptor (MR).
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is a sugar selected from the list comprising mannose-terminated glycids, the giycanes terminated by a fucose, the trisaceharide 3'-suifo-Lewis a, trisaccharide Lewis b (Le b ), trisaceharide Lewis x (Le : ⁇ ), tri N-acetylglucosamine (tri-GlcNAc), PIMs (phosphatidylinositol mannosides), in particular PIM 1 to PI Me (phosphatidylinositoi mono- to hexa-mannoside), the Man9GlcNAe2 oligosaccharide, the mannose-rich N-linked oligosaccharides, the ⁇ -fucose-1 -4GlcN Ac oligosaccharide, the lacto-N-fucopentaose III
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is a sugar selected from the list comprising mannose-terminated glycans, the giycanes terminated by a fucose, the 3'-sulfo-Lewis trisaccharide, Lewis trisaccharide b (Le b ), Lewis x trisaccharide (Le x ), tri N-acetylglucosamine (tri-GlcNAc), PIMs (phosphatidylinosiol mannosides), in particular PI Mi to PIM ⁇ (phosphatidylinositol mono- to hexa) -mannoside), the oligosaccharide ⁇ -fucose-4GlcNAc, the lacto-N-fucopentaose oligosaccharide III containing the Le x trisaccharide, the GlcN ⁇ c2 Man 3 oligosaccharide, the
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is an aerated sugar comprising 2, 3, 4 or 5 sugar residues attached by an oligo (propylene glycol) n spacer wherein n is between 1 and And preferably n :::: 2, the sugar residues being independently selected from the list comprising mannose, glucose, fucose, and oligomannoses comprising from 2 to 10 imitates mannose.
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is an aerated sugar comprising 2, 3, 4 or 5 fucoses attached by an oligoCpropylene glycol spacer n in which n is between 1 and 5 and preferential. lementn ::: 2.
  • the hydrophilic group grafted to the lipid diether of the invention is an antenna sugar comprising 2, 3, 4 or 5 oligomannoses comprising from 2 to 10 mannose units attached by an oligoipropylene spacer glyco l) n in which n
  • the present invention relates to a compound comprising a lipid diether to which is grafted a hydrophilic group, or polar group, via a polyethylene glycol spacer (PEG).
  • the PEG spacer has the following structure: in which c is between 1 and 130, preferably between 5 and 20.
  • c is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, or 50.
  • c is an integer ranging from 2 to 30, preferably from 3 to 20, and more preferably from 4 to 10. According to a particular embodiment, c is equal to 5.
  • a lipid diether according to the invention may be obtained from a derivative of glycerol itself synthesized from a phytol and a (R) -solketal.
  • the reaction of this glycerol derivative with hexadecyl triflate in the presence of a proton sponge makes it possible to obtain the corresponding diether.
  • the hydrogen lysis of the benzyloxy group leads to the alcohol which can then be converted to carboxylic acid or amine.
  • the diethers lipids thus obtained having a carboxylic acid function or an amine function can be used for the synthesis of compounds according to the invention.
  • the synthesis of the tri-mannosylated compound of formula II is carried out in a four-step scheme from the tri-mannosyl acid carboxylic acid and 1-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-0 hexadecane-s "glycerol subsequently designated lipid diether having a carboxylic acid function (or diether carboxylic acid):
  • the tri-mannosyl carboxylic acid ligand is prepared by benzylation of pentaerythritol trialiyl ether, followed by a hydroboration-oxidation alylation / hydroboration-oxidation sequence, a trimannosylation of free hydroxyls by a tetra-O-benzoyl trichloroacetimidate mannosyl donor deprotection of the pentaerythritol hydroxyl followed by oxidation to the carboxylic acid;
  • the present invention also relates to a liposome comprising at least one compound of the invention.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound of the invention in proportions of about 1% to about 15% by mol% relative to the total number of moles of lipids, preferably of about 2% to about 1.0%, more preferably about 5%.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound of the invention in amounts of about 1% to about 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%. %, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, or 15% mol% based on the total number of moles of lipids.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound of the invention in proportions of about 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%. , 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, or 14%, at about 15% mol% based on the total number of moles of lipids.
  • the liposome of the invention comprises about 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%. 13%, 14% or 15% of a compound of the invention in molar percentage relative to the total number of moles of lipids.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound of the invention in proportions of about 1% to about 15% by weight relative to the total weight of the liposome, preferably about 2%> at about 10%, more preferably about 5%.
  • the liposome of the invention comprises about 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%. 13%, 14% or 15% of a compound of the invention, by weight relative to the total weight of the liposome.
  • the liposome of the invention comprises at least one compound according to the invention alone or in admixture with one or more synthetic, semisynthetic or natural lipid (s).
  • the liposome of the invention comprises at least one compound according to the invention and the lipid KLN25 (0,0-dioleyl- [3N- (N-methylimidazoliumbromide) propylene] phosphoramidate) of formula:
  • the liposome of the invention comprises at least one compound according to the invention and the lipid MM27 ( ⁇ , ⁇ -dioleyl (-N- (histamine) phosphoramidate) of formula:
  • the liposome of the invention comprises at least one compound according to the invention, the lipid KLN25 and the lipid MM27.
  • the liposome of the invention comprises 5% of the compound according to the invention, 47.5% of lipid KLN25, and 47.5% of lipid MM27, in molar percentage relative to the total number of moles of lipids,
  • the liposome of the invention comprises at least one compound according to the invention and a cationic lipid.
  • the cationic lipid is a lipid having a polar head consisting of an imidazolium group.
  • the liposome of the invention is a cationic liposome.
  • the preparation of the liposome of the invention may be carried out by various methods well known to those skilled in the art.
  • the liposome of the invention may be prepared according to the method of hydration of a dry lipid film (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA Mol Mol. 969: 247-74).
  • the liposome of the invention comprises at least one molecule of interest. According to one embodiment, the liposome of the invention comprises at least one molecule of interest to be delivered in vitro or in vivo to a cell.
  • the molecule of interest is included within the lipid bilayer of the liposome of the invention. In another embodiment, the molecule of interest is included in the hydrophilic compartment of the liposome of the invention. In one embodiment, the molecule of interest is a nucleic acid, for example and non-exhaustively, the molecule of interest is a DNA, an RNA, an mRNA, a siAR, or a micro RNA. In another embodiment, the molecule of interest is a protein or a peptide. In another embodiment, the molecule of interest is a therapeutic agent. In another embodiment, the molecule of interest is a coloring agent or a marker.
  • the molecule of interest is an immunogenic molecule. In one embodiment, the molecule of interest is capable of inducing an immune response.
  • the molecule of interest is an antigen of bacterial origin, of fungal origin or of viral origin.
  • the molecule of interest is an antigen of bacterial origin selected from the non-exhaustive list comprising the capsular polysaccharide (polyribosyl ribitol phosphate or PRP) of Haemophilus influenzae type b; polysaccharide serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F Streptococcus pneumoniae; Neisseria meningitidis polysaccharide group A; the polysaccharide of Neisseria meningitidis group B; the capsular polysaccharide Vi of Salmonella typhi (strain Ty 2),
  • the molecule of interest is a cancer-associated antigen or a nucleic acid encoding a cancer-associated antigen.
  • the immunogenic molecule included in the liposome of the invention is a tumor antigen or a nucleic acid encoding a tumor antigen.
  • the tumor antigen may be chosen from the non-exhaustive list comprising: CD 4 (c clin-dependent kinase 4), pIs 4 ' 3 , p53, AFP, ⁇ -catenin, caspase 8, versions mutants of p21 Ras , Bcr-abl chimera, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, IAA0205, rabies, myosin / m, 707-AP, CDC27 / m, ETV 6 / AML, TEL / Amll, Dekcam, LDLR / FUT, Pml-RARaTEL / AMLI, Y-ESO-I, members of the MAGE (Melanoma-associated aniigen) family AGE-A
  • the tumor antigen may be chosen from the non-exhaustive list comprising: CAP-1, CD 4 / m, the cell surface proteins of the Claudine CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 and CLAUDIN-12 families, c-myc, CT, GnT-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NF1, NY-BR-1, proteinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI / m, TPTE, CDK4 cyclin-dependent kinase 4), pIs 1 " 1 ' 4 ' 3 , p53, AFP, ⁇ -catenin, caspase 8, mutated versions of p21 Ras , Bcr-abl chimera, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin / m, 707-AP,
  • G antigen GAGE- 1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, GAC-3, RCC G250-associated antigen, HPV-derived oncoproteins E6 and E7 (human papiloma virus), Epstein Barr virus EBNA2-6 antigens, LMP-I, LMP-2, gp77, gp100, MART-1 Me- A, tyrosinase, TRP-I and TRP-2 (tyrosinase-released protein), TRP-2-INT2, PSA, PS VI.
  • G antigen GAGE- 1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, GAC-3, RCC G250-associated antigen, HPV-derived oncoproteins E6 and E7 (human papiloma virus), Epstein Barr virus EBNA2-6 antigens, LMP-I
  • MC1R ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2 / neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, WT and WT1.
  • the tumor antigen is selected from the list comprising oncoproteins E6 and E7 derived from HPV (human papiloma virus), MART-1 / Melan-A.
  • the tumor antigen is the HPV-derived oncoprotein E7 (human papiloma virus).
  • the molecule of interest is a polypeptide.
  • the polypeptide is of bacterial origin, of fungal origin or of viral origin.
  • the molecule of interest is a polypeptide of bacterial origin corresponding to a protein, or a fragment of this protein, chosen from the non-exhaustive list comprising Pseudomonas aeruginosa XcpQ and PopB; factor H binding protein (or 1 ⁇ for factor H binding protein), Neisseria heparin binding antigen (or Neisserial Heparin Binding Antigen) for Neisseria meningitidis group B; Neisseria adhesin A (or NadA for Neisseria adhesin A) of Neisseria meningitidis group B, diphtheria toxoid (or diphtheria toxoid) of Corynebacterium diphtheriae; tetanus toxoid (or tetanus toxo
  • the molecule of interest is a polypeptide of viral origin corresponding to a protein, or a fragment of this protein, chosen from the non-exhaustive list comprising the GAG proteins (p24, p17, p9 and p7).
  • Pol p64, p51, p10 and p32
  • Env gp41 and gp!
  • human immunodeficiency virus HAV
  • pre-membrane or preM
  • M protein for membrane
  • EDIII domain of the E protein of the dengue virus
  • fusion glycoprotein or RSV-F for respiratory syncytial virus F protein
  • hemagglutinin of influenza A virus subtype H5N1 nuclear protein NP flu virus
  • surface antigen of hepatitis B virus S and pre-S2 proteins of hepatitis B virus
  • human papillomavirus L1 or HPV for human papilomavirus
  • human papiloma virus LI or HPV for human papiloma virus
  • human papilomavirus LI or HPV for human papiloma virus
  • 16 protein
  • human papilomavirus L1 or HPV for human papilomavirus
  • the preparation of the lipoplex of the invention may be carried out by various methods well known to those skilled in the art.
  • the lipoplex of the invention can be obtained by adding a nucleic acid solution to a liposome preparation according to the invention.
  • the lipoplex of the invention is obtained by mixing a solution comprising a nucleic acid, preferably an mRNA, encoding a tumor antigen to a liposome preparation according to the invention.
  • the lipoplex of the invention is obtained by mixing a solution comprising a nucleic acid, preferably an A Nm, coding a tumor antigen to a liposome preparation comprising 5% of compound according to the invention, 47, 5% of lipid KLN25, and 47.5% of lipid MM27, in molar percentage relative to the total number of moles of lipids.
  • the liposome of the invention forms a lipopolyplex comprising at least one compound of the invention.
  • the liposome of the invention comprises at least one nucleic acid complexed with a polycation.
  • the preparation of the lipopolyplex of the invention may be carried out by various methods well known to those skilled in the art.
  • the lipopolyplex of the invention can be obtained by mixing a complexed nucleic acid (cationic polymer) with a liposome preparation according to the invention.
  • the lipopolyplex of the invention is obtained by mixing:
  • nucleic acid preferably an mRNA, encoding a tumor antigen, the nucleic acid being complexed with the partially histidinylated polyiysin and comprising a PEG 5kDa molecule (PEG-Hp); and
  • the lipopolyplex of the invention is obtained by mixing: a nucleic acid, preferably an mRNA, encoding a tumor antigen, the nucleic acid being complexed with the partially histidinylated poly lysine and comprising a molecule of PEG 5kDa (PEG-Hp); and
  • a liposome preparation comprising 5% of compound according to the invention
  • the liposomes, lipopolyslexes or lipopolyplexes of the invention are dispersed in an aqueous solution.
  • the liposomes, liposomes or lipopolyplexes of the invention are dispersed in physiological saline or in PBS.
  • the invention also relates to an aqueous solution or a dispersion comprising the liposomes, lipopolyslexes or lipopolyplexes of the invention.
  • the present invention also relates to an emulsion comprising the liposomes, lipopolyslexes or lipopolyplexes of the invention.
  • the emulsion comprising the liposomes, lipoplexes or lipopolyplexes of the invention is an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion or a water-in-oil-in-water emulsion.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the liposomes, lipopolyslexes or lipopolyplexes of the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, water, salt water, dextrose, glycerol, and the like, or combinations of these excipients.
  • the pharmaceutical composition may also include humidifiers, emulsifiers, buffers, adjuvants, and the like.
  • the pharmaceutical composition further comprises at least one immune checkpoint inhibitor (also known as the "immune checkpoint inhibitor” or ICI).
  • immune checkpoint inhibitors include, but are not limited to, CTLA-4 inhibitors (e.g., ipil mab), PD-1 inhibitors (e.g., pembrolizumab and nivolumab), and inhibitors.
  • PD-L1 eg, azizolizumab, avelumab and durvalumab).
  • the pharmaceutical composition of the invention may be administered to the subject by any suitable method of administration.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated for oral administration, topical administration or injection.
  • the pharmaceutical composition of the invention may also be formulated for systemic, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraiiodal, intracoronary, intraarterial, subcutaneous, intradermal, transdermal, intratumoral, intraocular, pulmonary, inhalation administration. , by direct injection into a tissue, or by electroporation or sonoporation.
  • the pharmaceutical composition of the invention is formulated to be administered by injection, preferably by intradermal or intravenous injection, more preferably by intradermal injection.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is formulated for oral administration.
  • forms suitable for oral administration include, but are not limited to, tablets (including sustained release tablets), capsules, powders, granules, pills (including sugar-coated pills), capsules (including gelatin capsules flexible), oral suspensions, oral solutions, and other similar forms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated for injection.
  • suitable forms for administration by injection include, but are not limited to, sterile aqueous solutions, dispersions, emulsions, suspensions, solid forms suitable for the preparation of solutions or suspensions by the addition of a liquid prior to such use. that, for example, powders.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated for topical application.
  • suitable forms for administration by injection include, but are not limited to, milks, creams, balms, oils, lotions, gels, ointments, sprays or drops, such as eye drops.
  • the invention also relates to a vaccine adjuvant comprising the liposomes, lipoplexes or lipopoiypesxes of the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention also relates to a vaccine comprising the liposomes, lipoplexes or lipopoiypesxes of the invention, themselves comprising at least one immunogenic molecule, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the vaccine of the invention may further comprise at least one additional adjuvant.
  • the vaccine further comprises at least one immune checkpoint inhibitor.
  • the vaccine of the invention may be formulated in various forms, including for example a solution, a dispersion or an emulsion.
  • the vaccine preferably comprises one or more surfactant (s).
  • the vaccine of the invention can be lyophilized.
  • the vaccine of the invention can thus be in a freeze-dried form.
  • the vaccine comprises one or more agent (s) assisting with lyophilization. Freeze-drying agents are well known to those skilled in the art. These agents assisting in the lyophilization include in particular sugars such as lactose and mannitol.
  • the vaccine of the invention may comprise one or more stabilizing agent (s), for example to prolong the shelf life of the vaccine or to improve the effectiveness of lyophilization.
  • stabilizing agents include, but are not limited to, SPGA (Sucrose-Phosphate-Glutamate-Albumin), sugars such as sorbitol, mannitol, trehalose, starch, sucrose, dextran or glucose, proteins such as albumin or casein or their degradation products, mixtures of amino acids such as lysine or glycine, and buffers such as alkali metal phosphates.
  • the vaccine of the invention is administered to the subject by one of the conventional methods of vaccination including injection, for example intradermal, intramuscular, intraperitoneal, or subcutaneous; topical administration, for example transdermal application or intranasal spray application; or oral administration.
  • the vaccine of the invention may be administered in a single dose or in multiple doses.
  • the formulation to be injected may be in the form of a sterile solution or dispersion, or a sterile lyophilized powder for the extemporaneous preparation of a sterile injectable solution or dispersion.
  • one or more preserving agent (s) may be added to the vaccine such as antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thiomersal and other similar agents. It may also be preferable to add to the vaccine one or more isotonic agent (s) such as sugars or sodium chloride to reduce the pain caused by the injection.
  • one or more agent (s) delaying absorption can be added to the vaccine such as aluminum monostearate or gelatin.
  • the total daily use of the liposome, lipoplex, lipopolyplex, pharmaceutical composition or vaccine of the invention will be adjusted by the attending physician in the context of his medical opinion.
  • the therapeutically effective dose specific to each patient will depend on a variety of factors including the disorder being treated and its severity; the activity of the compound used; the specific composition used; age, weight, general health, sex and diet of the patient, duration and mode of administration; the duration of the treatment; the drugs used in combination or coincident with the compound used, and other similar factors known in the medical field.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered once, twice, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times. times, or 10 times about.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered to the subject at least once a day.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered once a day.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered to the subject at least once a week.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention may be administered once a week, twice, three times, four times or up to seven times a week.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered to the subject before the symptoms occur, ie liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the subject.
  • the invention is administered prophylactically.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered to the subject after the symptoms have occurred, ie, the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the subject.
  • the invention is therapeutically administered.
  • the liposome, lipoplex, lipopolyplexia, pharmaceutical composition or vaccine of the invention is administered according to an optimal administration protocol.
  • an optimal administration protocol comprises appropriate dose parameters and modes of administration which lead to the stimulation or triggering of an immune reaction in the subject.
  • the effective dose parameters can be determined by conventional methods for a particular disease. Examples of such methods include, but are not limited to, survival rates, side effects, progression or regression of the disease.
  • the efficacy of the dose of liposomes, lipoplexes, lipopolyplexes, pharmaceutical composition or vaccine according to the invention for treating cancer can be determined by the evaluation of the response rate, which corresponds to the proportion of patients whose tumor regress or does not progress on treatment.
  • the present invention also relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use for vectorization, that is to say the transmembrane transfer of a molecule of interest.
  • the present invention therefore also relates to the use of the liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for the vectorization, that is to say the membrane transfer of a molecule of interest.
  • the present invention relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplex according to the invention for its use for the transfection of cells, preferably for the in vivo transfection of cells.
  • the present invention relates to the use of a liposome, lipoplex or lipopolyplex according to the invention for the in vitro or ex vivo transfection of cells.
  • the present invention thus relates to a method of transfection in vitro or ex vivo of cells, comprising the use of a lipoplex or lipopolyplexe according to the invention.
  • the present invention relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use for the delivery of prodrugs, sensitizers or visualization agent.
  • the present invention relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use for gene therapy, topical treatments (dermatology, ophthalmology) or bactericidal activities.
  • the invention further relates to a cosmetic composition comprising a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention.
  • Another subject of the invention is also the cosmetic use of a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention.
  • the invention also relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplex according to the invention for its use for targeted targeting.
  • the present invention therefore also relates to the use of the liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for targeted targeting.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by a particular type of cell.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by the cells expressing on their surface a lectin.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by cells expressing on their surface a type C lectin.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by the cells expressing on their surface the lectins DC-SIGN ((1) 209). DEC205 / CD205, langerine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, and / or the mannose receptor (MR).
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by the antigen presenting cells.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplexe of the invention is recognized and fixed by macrophages, dendritic cells and / or Langerhans cells.
  • the compound of the invention included in the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is recognized and fixed by the dendritic cells.
  • the present invention relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use for transfection of antigen presenting cells, preferably for macrophage transfection, of cells dendritic and / or Langerhans cells, even more prefer! for the transfection of dendritic cells.
  • the invention also relates to a compound of the invention, a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use as an adjuvant.
  • the compound of the invention, the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention has an adjuvant effect in vitro.
  • the compound of the invention, the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention has an adjuvant effect in vivo.
  • the invention also relates to a compound of the invention, a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for use as a vaccine adjuvant.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention administered to a subject induces an immune response in the subject.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention administered to a subject induces an immune response in the subject that does not depend on the presence in the liposome, lipoplex, or lipopolyplex of the invention of a drug molecule. immunogenic interest.
  • the invention also relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention for its use for vaccination.
  • the invention also relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention comprising at least one molecule of interest capable of inducing an immune reaction for its use for vaccination.
  • the invention also relates to a liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention comprising at least one molecule of interest capable of inducing an immune reaction for its use as a vaccine.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is used for preventive vaccination. In another embodiment, the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is used for therapeutic vaccination.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention is used as an anti-cancer vaccine.
  • the liposome, The lipopolyplexic lipopolyplex of the invention is used for therapeutic vaccination in the treatment of cancer.
  • cancer or tumor includes all proliferative diseases.
  • proliferative diseases include neoplasms, dysplasias, premalignant or premalignant lesions, abnormal cell growths, malignant tumors, and cancers or metastases.
  • the cancer is selected from the group consisting of leukemia, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, central nervous system (CNS) cancer, melanoma, ovarian cancer, kidney cancer, prostate cancer, breast cancer, glomeria, colon cancer, bladder cancer, sarcoma, pancreatic cancer, colorectal cancer, cancer head or neck, liver cancer, bone cancer, cancer of the spinal cord, stomach cancer, bowel cancer, esophageal cancer, thyroid cancer , hematological cancer, and lymphoma.
  • CNS central nervous system
  • the cancer is breast cancer, melanoma or hepatocellular carcinoma.
  • breast cancer is a triple-negative breast cancer, i.e. breast cancer characterized by the absence of estrogen receptor expression, progesterone receptors, and HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) by cancer cells.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention used as an anti-cancer vaccine comprises at least one tumor antigen or at least one nucleic acid encoding a tumor antigen. In one embodiment, the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention used for an anti-cancer therapeutic vaccination comprises at least one tumor antigen or at least one nucleic acid encoding a tumor antigen.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention used for therapeutic anti-cancer vaccination comprises at least one tumor antigen or at least one nucleic acid encoding a tumor antigen selected from the non-exhaustive list comprising: CDK4 ( cy clin- depend kinase 4), plS 1 " 1 4'3 , AFP, ⁇ - catenin, caspase 8, p53, mutated versions of p21 Ras , Bcr-abl chimera, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin / m, 707-AP , CDC27 / m, ETV6 / AML, TEL / Amll, Dekcain, LDLR / FUT, Pml-RARaTEL / AML, NY-ESO-I, members of the MAGE (Melanoma-associated antigen) family
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplexis of the invention used for an anti-cancer therapeutic vaccination comprises at least one tumor antigen or at least one nucleic acid encoding a tumor antigen selected from the non-exhaustive list comprising: CAP-1 , CD 4 / m, cell surface proteins of the Claudine CLAUD1N-6 family, CLAUDIN-18.2 and CLAUDIN-12, c-myc, CT, Gn'TV, HAGE, HAST-2, LAGE, NF 1, NY- BR-1, proteinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI / m, TPTE, CDK4 (cyclin-dependent kiriase 4), pIs 1 " 1 ' 4 ' 3 , AFP, ⁇ -catenin , caspase 8, p53, mutated versions of p21 Ras , Bcr-abl chimera, MUM-I
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplex of the invention used for an anti-cancer therapeutic vaccination comprises at least one tumor antigen or at least one nucleic acid encoding a tumor antigen selected from the list comprising oncoproteins E6 and E7. derived from HFV (human papilloma virus), ART-1 / elan-A.
  • the liposome, lipoplex or lipopolyplexe of the invention used for an anti-cancer therapeutic vaccination comprises at least the oncoprotein E7 derived from HPV (human papilloma virus) or at least one nucleic acid encoding the oncoprotein. E7 or a peptide of oncoprotein E7.
  • the subject is susceptible or suspected of suffering from a disease, preferably an infectious disease or a cancer.
  • cancer development risks include, but are not limited to family or genetic susceptibility, age, alcohol consumption, smoking, exposure to toxic and / or carcinogenic substances, exposure to radiation, sun exposure, chronic inflammation, diet, and others.
  • risks of developing infectious diseases include, but are not limited to, exposure to bacteria, viruses, fungi, parasites, and others.
  • infectious diseases includes all diseases caused by an infectious agent, such as a bacterium, a virus, a fungus or the like and diseases caused by a parasite.
  • the infectious disease is selected from influenza, tuberculosis, bacterial pneumonia, viral pneumonias, Lyme disease, human immunodeficiency virus (HIV) infections, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • diseases caused by a virus include, but are not limited to, human immunodeficiency virus (HIV) infections, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), adenovirus infections, alpha virus infections, arbovirus infections, pneumonia of viral origin, Bell's palsy, Borna's disease, Bunyaviridae virus infections, infections with a virus of the family Caliciviridae, chickenpox, colds, eondyloma acuminata, infections with a coronavirus, infections with the Cocksackie virus, infections with a cytomegalovirus, Chikungunya, dengue fever, infections with a DNA viruses, RNA virus infections, contagious ecthyma, encephalitis, arbovirus encephalitis, her
  • the infectious disease is a disease caused by a virus and selected from Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) or Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection, viral hepatitis, or virus infections.
  • AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • viral hepatitis or virus infections.
  • hepatitis A (V HA) hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HDV hepatitis D virus
  • HPV human papillomavirus
  • diseases caused by a bacterium or a fungus include, but are not limited to, abscesses, actinomyeosis, anaplasmosis, anthrax, reactive arthritis, aspergillosis, baereremia, bacterial and mycotic infections, Bartonella infections, botulism, brain abscesses, brucellosis (or Malta fever), bacterial infections of the Burkholderia family, infections with a bacterium of the genus Campylobacter, candida dose such as candidiasis caused by Candida albicans, vulvovaginal candidiasis, cat scratch disease (or benign lymphocyticulosis of inoculation, or benign lymphogranuloma), cellulitis, central nervous system infections, chancre, chlamydial infections, cholera , Clostridium infections, coccidioidomycoses such as coccidioidomycosis caused by Coccidioid.es immitis
  • diseases caused by a parasite include, but are not limited to, malaria, sleeping sickness, leishmaniasis, toxoplasmosis, and others.
  • the subject suffers from a disease, preferably an infectious disease or a cancer.
  • the subject is an animal, preferably a mammal, more preferably a human. In one embodiment, the subject is a man. In another embodiment, the subject is a woman. In one embodiment, the subject is a child.
  • An object of the present invention is also a method for vectorizing, i.e., transferring a molecule of interest across a membrane, comprising the use of a liposome, lipoplex or lipopol.ypl.exe according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for inducing an immune response in a subject comprising administering the liposome, lipoplex or lipopolyplexe according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for vaccinating a subject comprising the administration of the liposome, lipoplex or lipopolyplex according to the invention, preferably a liposome, lipoplex or lipopolyplex comprising at least one molecule of interest capable of inducing an immune reaction. .
  • the vaccination is preventive. According to another embodiment, the vaccination is therapeutic.
  • the method for vaccinating a subject according to the invention is a method of vaccination against cancer, preferably a method of therapeutic vaccination against cancer.
  • Another subject of the present invention relates to a method for preventing cancer in a subject comprising the administration of the liposome, lipoplex or lipopolyplex according to the invention, preferably a liposome, lipoplex or lipopolyplex comprising at least one tumor antigen or an acid nucleic acid encoding a tumor antigen.
  • the present invention also relates to a method for treating cancer in a subject comprising administering the liposome, lipoplex, or lipopolyplexus according to the invention, preferably a liposome, lipoplex or Hpopolyplexe comprising at least one tumor antigen or a nucleic acid encoding a tumor antigen.
  • FIG. 1 is a set of graphs showing the binding of LPR-MN or LPR-triMN LPR lipopolyplexes to cells expressing lectin type receptors: (A) 293T cells expressing or not expressing the DC-SIGN receptor ; (B) monocyte-derived human dendritic cells (MoDCs); (C) human blood mononuclear cells (PBMCs); (D) human dendritic cells isolated from blood (panDCs).
  • A 293T cells expressing or not expressing the DC-SIGN receptor
  • MoDCs monocyte-derived human dendritic cells
  • PBMCs human blood mononuclear cells
  • panDCs human dendritic cells isolated from blood
  • Figure 2 is a set of graphs showing the binding of LPR-MN, LPR-MN diether or LPR-triMN lipopolyplexes to cells expressing lectin type receptors: (A) DC 2.4 murine dendritic cells; (B) murine splenocytes; (C) monocyte-derived human dendritic cells (MoDCs).
  • A DC 2.4 murine dendritic cells
  • B murine splenocytes
  • MoDCs monocyte-derived human dendritic cells
  • Figure 3.4 is a set of graphs showing the expression of the CD80 activation marker by FITC- or FITC + MoDCs dendritic cells after incubation in the presence of increasing concentrations of LPR-MN or LPR-triMN lipopolyplexes.
  • the FITC-cells did not capture the lipopolyplexes, the FITC + cells captured the lipopolyplexes.
  • Figure 3B is a histogram showing the expression of HLA-DR and CD83 activation markers by MoDCs cells having been incubated in the presence of 2.5 (ug / ml LPR-MN or LPR-triMN.
  • Figure 4A is a graph showing expression of GFP by MoDCs dendritic cells incubated at t0 with LPR-MN lipopolyplexes containing GFP mRNA and at t6h with LPS (positive control) or lipopolyplexes LPR-MN or LPR-tri N containing the single-stranded PolyU control RNA (ssPolyU).
  • Figure 4B is a graph showing the expression of the CD80 activation marker by MoDCs dendritic cells incubated at t0 with LPR-MNs containing the mRNA. GFP then at t6h with LPS (positive control) or LPR-MN or LPR-triMN containing the single-stranded PolyU control RNA (ssPoiyU).
  • Figure 4C is a histogram showing the expression of CD80, CD83 and HLA-DR activation markers by MoDCs dendritic cells first incubated with LPR-MNs containing GFP mRNA for 6ii then in a second time with LPS (positive control) o LPR-MN or LPR-triMN containing single-stranded PolyU control RNA (ssPoiyU) for 12h hours.
  • LPS positive control
  • ssPoiyU single-stranded PolyU control RNA
  • FIG. 5A is a set of photographs showing the two injection sites (indicated by arrows) at the back of the mouse that has been given 24h (1) and 48h (2) previously an injection of PBS, lipopolyplexes LPR-MN or LPR-triMN lipopolyplexes.
  • Figure 5B is a set of photographs showing the microscopic analysis after hematoxylin-eosm labeling of a 10 ⁇ m section of skin at the injection site (point 48h) and the inguinal ganglion draining the mouse injection sites. having received 24b (1) and 48h (2) before injection of PBS, LPR-MN or LPR-triMN.
  • Figure 6 is a set of photographs showing fluorescent microscopy analysis of popliteal lymph nodes taken from mice that had been injected 6 hours before with rhodamine-labeled PBS, LPR-MN or LPR-triMN.
  • the marker CD 169 anti-CD 169-APC
  • LPRs are visualized by means of rhodamine labeling.
  • the rhodamine signal colocalized with the signal CD 169 is indicated by asterisks (*).
  • the rhodamine signal located at extended branched cells not expressing CD 169 is indicated by arrows.
  • Figure 7 is a set of graphs showing: (A) the absolute value (number) and (B) the relative percentage of dendritic cells; and within these total dendritic cells, (C) the percentage of activated dendritic cells (cells .y6C ⁇ ) and (D) of inflammatory dendritic cells (LY6G + cells) present in the ganglia Draining the injection site taken from mice that received 24h before injection of PBS, LPR naked, LPR naked diether, LPR-MN, or LPR-triMN.
  • Figure 8 is a set of histograms showing the percentage of CD4 + (A) and CD8 + (B) cells expressing interferon- ⁇ after sensitization by dendritic cells incorporating the indicated lipopolyplexes containing oncoprotein mRNA.
  • E7 LPR naked, LPR-MN or LPR-triMN
  • stimulation by dendritic cells previously loaded with E7 peptides.
  • the mRNA is replaced by a single-stranded PolyU RNA (ssPolyU).
  • Fig. 9 is a set of graphs showing: (A) secretion of interieron- ⁇ by lymphocytes isolated from the spleen of mice vaccinated with LPR-triM-E7 / E7-DC-LAMP administered by different routes (IV: intravenous, SC: subcutaneous, ID: intradermal); (B) the secretion of interferon- ⁇ by lymphocytes isolated from the spleen of vaccinated mice at day 0 and day 2 with an injection of PBS, or of different LPRs (LPR-N, LPR-N-diether, LPR-MN, LPR-LPR).
  • FIG. 10A is a set of graphs showing the tumor volume developed by mice injected with 50000 cells of the TC-1 syngeneic tumor line and then vaccinated. with PBS, LPR-MN-ssPolyU, LPR-MN-E7 / E7-DC-LAMP, LPR-triMN-ssPolyU or LPR-triMN-E7 / E7-DC-LAMP. Each curve corresponds to the volume of the tumor developed by a mouse. The arrows indicate the days on which the mice were vaccinated (J7 and J9).
  • Figure 10B is a graph showing the survival rate of these mice.
  • Figure 11 is a set of graphs showing the tumor volume developed by mice injected with B16F0 tumor cells expressing MARTI (A) or EG7 tumor cells expressing OV (B) and which were subsequently vaccinated with PBS. , LPR-triMN-ssPolyU or LPR-triMN containing MARTI or OVA mRNA, respectively.
  • NS no statistically significant difference (ie p> 0.05), * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01.
  • BRUKER ARX 400 and BRUiCER Fourier transform spectrometers Avance 400 400.13 MHz for the proton, 100.61 MHz for the carbon, ENSCR).
  • the chemical shifts are expressed in parts per million (ppm) relative to the chemical shift of the deuterated solvent used as a reference.
  • the multiplicity of signals is explained using the following abbreviations: s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quadruplet; m, multiplet or mass not analyzable.
  • the coupling constants (J) are expressed in Hertz (Hz).
  • the 13C spectrometric data were determined from fully decoupled spectra and key heteron correlated 2D spectra. Mass spectrometry
  • MS / S ZabSpec TOF Micromass High Resolution Mass Spectrometer (Western Regional Physics Measurement Center, University of Rennes 1).
  • the ionization mode used is the positive Electrospray (SM-ESI +).
  • the ion acceleration voltage is 4kV and the source temperature is 60 ° C (melt-in mode).
  • the compounds are dissolved beforehand in methanol or dimethylsulfoxide.
  • DIA ⁇ , ⁇ '-diisopropylethylamine
  • Eb boiling temperature
  • EP petroleum ether
  • TBTU O- (benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate;
  • Step 1 Benzylation of pentaerythritol triallyl ether
  • the solvents are evaporated under vacuum on a rotary evaporator and then on a vane pump.
  • the yellowish residue is taken up in diehloromethane and then washed with water and with a saturated aqueous solution of NaQ.
  • the organic phase is dried over MgSO4 and concentrated in vacuo.
  • the crude product is purified by silica gel column chromatography (eluent: EP / AcOEt): 9/1, v / v) to provide the benzylated derivative (10.45 g) as a colorless oil in quantitative yield .
  • the triailyl compound (10 g, 28.8 mmol) is dissolved in 50 mL of anhydrous dioxane.
  • 9-BBN 0.5 M in THF
  • 519 mL, 0.259 mol is added to the reaction medium previously cooled to 0 ° C and the mixture is stirred for 24 hours at room temperature.
  • 3M sodium hydroxide (577 mL, 75 eq.)
  • 10 M hydrogen peroxide 115 mL, 1.15 mol are added at 0 ° C. to the reaction medium and the mixture is stirred for 12 hours at room temperature.
  • the triol (7.8 g, 19.4 mmol) is dissolved in 100 mL of anhydrous DMF and is added dropwise to the reaction medium! containing potassium hydride (3.9 g, 97 mmol) in DMF previously cooled to 0 ° C. The mixture is stirred for 10 minutes at 0 ° C. before introducing allyl bromide (8.35 mL, 97 mmol) dropwise. Stirring is continued for 24 hours at room temperature and the excess of potassium hydride is hydrolysed with 100 ml of distilled water.
  • reaction medium is extracted 3 times with diethyl ether and then the organic phase is washed with saturated aqueous NaCl solution, dried over MgSO 4, filtered, concentrated under reduced pressure and purified by chromatography on silica gel (killing EP / AcOEt: 85 15) to give 8.63 g of the triallyl product as a colorless oil with a yield of 78%.
  • Step 6 Debugging ⁇ oxidation
  • Step 7 Introduction of PEG chain on the acid lipid diether earboxyUque
  • Step 8 Reduce the azide function
  • Step 9 Coupling between the tri-mannosyl carboxylic acid ligand and the amino lipid
  • Step 10 Synthesis of the tri-mannosyl lipid by hydroxylation of the mannose units
  • a solution of the tri-mannosylated lipid in benzoyl form (435 mg, 0.139 mmol) in a CTfcCh / MeOH mixture (100 mL, 1/1) is added a solution of MeONa in methanol (5.3M, 48.8 ⁇ L, 0.258 mmol) freshly prepared.
  • the reaction medium 1 is stirred overnight at room temperature.
  • the mixture is neutralized by the addition of Amberlite resin 1R-120 H + and the resin is filtered on cotton. After evaporation of the solvents under reduced pressure, a viscous pale-gray yellowish product is isolated (255 mg, 97%) corresponding to the target tri-mannosylated lipid.
  • lipid KLN25 (0,0-dioleyl-N- [3N- (N-methylimidazoliumbromide) propylene] phosphoramidate) of formula:
  • Liposomes are prepared according to the method of hydration of a dry lipid film and dialyzed against a 10 mM HEPES buffer, pH 7.4 (Piehon C, idoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination wiih Tumor Antigen mRNA, Methods Mol Biol 969: 247-74).
  • compositions of the liposomes used are;
  • liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25 and MM27 to
  • liposomes diether or liposomes naked diether liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, M 27 and 1-O-carboxyl-2- ⁇ -Phytanyl-3-O-hexadecane-5 '"- glycerol (lipid diether) with 47.5% - 47.5% - 5% o respectively;
  • MN mono-mannosyl liposomes
  • mono-mannosyl liposomes diether liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, mono-mannosylated lipid and 1-O-carboxyl-2-O-
  • tri-mannosylated liposomes liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27 and tri-mannosylated lipids of the invention (the synthesis of which is described in Example 1) at 47.5% - 47.5% - 5% respectively.
  • Fluorescent liposome compositions used are:
  • liposomes nu-Flu: liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27 and Lip-Flu at 49.75%> - 49.75% - 0.5% respectively;
  • liposomes nu-Rlio liposomes consisting of a mixture of lipids LN25, MM27 and Lip-Rho 49.75% - 49.75% - 0.5% respectively;
  • liposomes diether-Flu liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, 10-carboxy-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecan-5'-glycerol and Lip-Flu 47.25% - 47, 25% - 5% - 0.5% respectively;
  • Rho-diether liposomes liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, M27, 10-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-n-glycerol and Lip-Rho 47.25% - 47, 25% - 5% - 0.5% respectively;
  • mono-mannosyl liposomes Flu: liposomes consisting of a mixture of lipids LN25, MM27, mono-mannose lipid ( ⁇ -D-mannopyranosyl-N-dodecylhexadecanamide) and Lip-Flu 47.25% - 47.25% - 5% - 0.5% respectively;
  • Rho liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, mono-mannose lipid and Lip-Rho 47.25% - 47.25% - 5% - 0.5% respectively;
  • liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, mono-mannosylated lipid, 10-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-, n-glycerol and Lip-Flu with 44.75% - 44.75% - 5% - 5% - 0.5% respectively;
  • mono-mannosyl liposomes diether Rho liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, mono-mannosylated lipid, 1-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-SM-glycerol and Lip-Rho at 44.75% - 44.75% - 5% - 5% - 0.5% respectively; tri-mannosyl liposomes Flu: liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, tri-mannosyl lipids of the invention (the synthesis of which is described in Example 1) and Lip-Fiu 47.25% -47, 25% - 5% - 0.5% respectively; tri-mannosyl liposomes Rho: liposomes consisting of a mixture of lipids KLN25, MM27, tri-Mannosylated lipids of the invention and Lip-Rho 47.25% -
  • the mRNA was complexed with the partially histidinylated polylysine and comprising a PEG 5kDa molecule (PEG-HpK) the synthesis of which is described in (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA Methods Mol Biol 969: 247-74).
  • PEG-HpK PEG 5kDa molecule
  • LPRs are prepared according to the method described in (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA, Methods Mol Biol 969: 247-74).
  • LPRs are obtained as follows. Briefly, 15 ⁇ l of PEG-HpK (in 10 ⁇ l of 10 mM HEPES pH 7.4 buffer) are first added to mNAP (5 ⁇ g in 25 ⁇ l of 10 mM HEPES pH 7.4 buffer). The mixture is vortexed for 4 sec and then allowed to stand for 30 min at 20 ° C. The LPRs are then formed by adding 10 ⁇ g of liposomes (5 ⁇ l to 5.4 mM in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4) by shaking the solution by round-robbing. The solution is allowed to stand for 15 minutes at 20 ° C before use. For in vitro transfection, the volume of solution is adjusted to 1 ml with serum-free medium.
  • the LPRs are obtained by previously adding 50 ⁇ (50 ⁇ g) of mRNA in a 1.5 ml Eppendorf tube containing 160 ⁇ l of 10 mM pH 7.4 HEPES buffer prepared in sterile water without endonuclease. 100 ⁇ (150 ⁇ l) of the PEG-HpK solution are then added and mixed for 4 seconds. After 30 min at 20 ° C., 50 ⁇ l of liposomes (100 g in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4, sterile, prepared in water without endonuclease) are added to the polymer / mRNA complex and gently mixed by pipetting. The solution is allowed to stand for 15 minutes at 20 ° C. For in vivo injection, the solution is adjusted to a final 5% sucrose concentration by adding 40 ⁇ l of a 50% sucrose solution prepared in water without endonuclease. The mice are injected with 100 ⁇ l of solution.
  • the lipopolyplexes used in the described experiments contain the single-stranded PolyU control RNA (ssPoiyU).
  • LPR-NPR, LPR-MN diether or LPR-diMether, LPR-MN, LPR-MN diether, LPR-triMN are obtained by mixing the corresponding liposomes (naked liposomes, liposomes diether or naked liposomes diether, liposomes MN, liposomes MN diether, triMN liposomes) with a cationic polymer (RNA complexed with the partially histidinylated polylysine and comprising a PEG 5kDa molecule),
  • the 293T cell line is a cell line derived from transformed renal human embryonic cells.
  • the 293T DC-SIGN cell line corresponds to 293T cells genetically modified to express DC-SIGN, a type C iectin.
  • MoDCs cells are monocyte-derived human dendritic cells.
  • PBMCs are mononuclear blood cells.
  • PanDCs cells are human dendritic cells identified within other peripheral blood cells (PBMCs). ELI Spot interferon -y
  • the secretion of interferon- ⁇ by T lymphocytes from the spleen is analyzed using the IFN- ⁇ ELISpot PLUS kit (Mabtech, Sweden). Briefly, the splenocytes to be analyzed are incubated in an ELISpot plate in the presence of the E749-57 antigen or concanavalin A (positive control) or culture medium (negative control). Interferon- ⁇ secreted is captured by antibodies attached to the plate. After an incubation of 36b at 37 ° C, the plate is washed and the cells are removed. The plate is then incubated with a biotinylated antibody directed against interferon-y and then with streptavidin coupled to alkaline phosphatase. The presence of spots corresponding to a secretion of interferon- ⁇ is revealed after incubation with the BCIP / NBT reaction buffer. The spots are analyzed by an ELISpot plate reader.
  • RNAs were extracted from skin samples using the ReliPrep RNA Tissue Miniprep System kit (Z6112, Promega), following the supplier's instructions. The RNAs were then retranscribed to cDNA using the Go Script Reverse Transcription System kit (A5000, Promega), according to the supplier's instructions. SYBR green (qRT-PCR) real-time quantitative PCR reactions were performed on the iGenSeq platform (Pitié-Salpêtrière Hospital, Paris, France) with the primers described in Table 1. The results were analyzed with Software 1536 Ligbtcycler (Roche, Basel, Switzerland) and gene expression was quantified by the relative method of ACTs, normalized by the expression of the ⁇ -actin and GAPH reference genes.
  • LPR-triMN targets cells expressing lectin receptors
  • LPR. naked popol.yplex.es
  • LPR-MN Mono-mannosylated lipopolyplexes
  • LPR-triMN tri-mannosylated lipopolyplexes
  • Lipopolyplexes all include a fluorescent lipid coupled with fluorescein.
  • the cell lines tested express on their surface type C lectins capable of binding sugar residues mannose, galactose or fiicose. The attachment of lipopolyplexes to these receptors is analyzed by flow cytometry.
  • the tri-mannosylated lipopolyplexes target DCSign 293T cells (FIG. 1A), MoDC cells (FIG.
  • PBMC cells FIG. 1B
  • panDC cells from PBMCs FIG. 1D
  • mono-mannose lipopolyplexes LPR-MN
  • the naked lipopolyplexes do not include lipids having a mannose group and do not target any of these cells regardless of the concentration of lipopolyplexes tested (FIG. 1).
  • LPR-MN mono-marmosylated lipopolyplexes
  • LPR-MN diether mono-mannosylated lipopolyplexes diether
  • LPR-triMN tri-mannosylated lipopolyplexes
  • tri-mannosylated lipids of the invention therefore gives LPR-triMN lipopolyplexes the ability to bind to cells expressing lectin type receptors. This property is specific to the tri-mannosylated lipopolyplexes of the invention, and lipopolyplexes comprising mono-marmosylated lipids (LPR-MN) or lipids mono-mannosylated and diether lipids (LPR-MN diether) possess reduced fixing capacity.
  • LPR-MN mono-marmosylated lipids
  • LPR-MN diether lipids mono-mannosylated and diether lipids
  • the MoDCs dendritic cells are cultured in the presence of LPS or increasing doses of LPR-MN or LPR-triMN comprising lipids labeled with fiuoresonin for 6 hours. Cytometric analysis makes it possible to identify the fluorescent MoDC cells that have captured the LPRs. Furthermore the expression of activation markers H LA-DR, CD80 and CD 83 is also measured.
  • Fluorescent MoDCs cells having captured the LPR-MNs do not express activation markers significantly compared to the LPS activation control (FIGS. 3A and 3B). Fluorescent MoDCs cells having captured the LPR-triMNs express the HLA-DR, CD80 and CD83 activation markers in a dose-dependent manner (FIG. 3A) and significantly with respect to the LPS activation control (FIG. 3B).
  • the presence of tri-mannosylated lipids of the invention therefore gives LPR-triMN the intrinsic property of activating the dendritic cells to which they bind.
  • Activated dendritic cells expressing co-stimulation molecules such as CD80 in turn enable the activation of CD4 + and CD8 + T cells. LPR-triMNs are therefore able to stimulate an immune response even when they do not contain a molecule. of immimogenic interest.
  • the dendritic MoDCs cells are cultured in the presence of LPR-MN containing GFP PARNm for 6 h. At the end of these 6 hours, the MoDCs cells are put in contact 12h extra with either LPS (positive activation control of MoDCs), or LPR-MN or LPR-triMN.
  • LPS positive activation control of MoDCs
  • LPR-MN or LPR-triMN LPR-MN
  • the lipopolyplexes used for this second stimulation do not contain coding RNA but contain single-stranded PolyU RNA (ssPolyU).
  • the expression of GFP and Activation markers HLA-DR, CD80 and CD83 is measured by cytometry after 18h of culture in total.
  • Figure 4 shows that the first incubation of MoDCs cells with LPR-MN induces GFP expression.
  • the secondary mcubation of the same cells with LPS or LPR-triMN ssPolyU lowers the expression level of GFP (FIG. 4A) and induces the expression of activation markers CD80 (FIG. 4B), CD83 and HLA- DR ( Figure 4C).
  • the addition of LPR-MN does not induce activation of dendritic cells, which continue to express GFP for a prolonged period.
  • mice were injected intradermally with PBS, LPR-MN or LPR-triMN.
  • Figure 1A shows that injection of LPR-triMN induces a local inflammatory reaction at the site of the injection.
  • Microscopic analysis of the site of the injection shows that the injection of LPR-triMN induces an increase in the volume of the inguinal draining lymph nodes.
  • CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Kabashima et al., (2007) CXCL12-CXCR4 Engagement Is Required for Migration of Cutaneous Dendritic Cells, Am J Pathol 171: 1249-57).
  • mice were intradermally injected into the arch with PBS, LPR-MN or LPR-triMN comprising a rhodamine-labeled lipid.
  • the draining ganglia of the mice were removed 6 hours after injection and then labeled with an anti-CD169 antibody (siglec-1).
  • the fluorescence microscopy analysis thus makes it possible to visualize the localization of LPR (rhodamine signal) and macrophages of the subcapsular sinus (CD169 + signal).
  • Figure 6 shows that naked LPRs, LPR-MN and LPR-triMN, are detectable in popliteal ganglia, at the cortical zone where dendritic cells (unlabeled) are also located. Some of the LPR-triMNs are also detectable in non-CD 169 labeled areas indicating that other cells can capture LPR-triMNs. It should be noted that dendritic cells are found in all ganglionic zones.
  • mice were intradermally injected into the arch with PBS, bare LPRs, diethyl ether LPRs, LPR-MNs or LPR-triMNs.
  • the popliteal lymph nodes of the mice were taken 24 hours after the injection.
  • the presence in the popliteal draining ganglia of dendritic cells (DCs), and more particularly activated dendritic cells expressing the Ly6C marker (Ly6C + cells) or Lyog (Ly6G + cells) was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 7 shows that the injection of LPR-triMN induces not only a significant increase in the number and percentage of dendritic cells (FIGS.
  • FIG. 7A and 7B but also the percentage of activated dendritic cells (FIG. 7C) and inflammatory cells (FIG. 7D). among the dendritic cells contained in the draining ganglia of the injected mice.
  • the number of dendritic cells, whether activated or not, is not significantly modified after the injection of LPR nudes, LPR us diether or LPR-MN versus control (PBS).
  • LPR-triMNs comprising the tri-mannosylated lipid of the invention can induce an immune reaction (recruitment and activation of the dendritic cells in the draining ganglia at the injection site) when they are injected into patients. mouse.
  • the LPR-triMNs contain single-stranded PolylJ RNA (ssPolyU) and do not serve as a vector for the introduction of molecules. of immunogenic interest.
  • ssPolyU single-stranded PolylJ RNA
  • MoDCs dendritic cells from HLA-A2 donors were incubated for 24 hours with naked LPRs, LPR-MNs or LPR-triMNs containing HPV16 E7 oncoprotein mRNA (E7 mRNA) or single-stranded PolyU (ssPolyU). MoDCs cells were then used to sensitize autologous CD3 + T cells in co-cure for 3 days. After 3 days of co-culture, the T cells were placed in a medium enriched in IL-7 and IL-15. At 17, the sensitized T cells were returned to the presence of MoDCs previously loaded with HLA-A2 restricted E7 peptides (HLA2 allele) for 16 h.
  • HLA2 allele HLA-A2 restricted E7 peptides
  • FIG. 8 shows that LPR-triMNs containing no coding RNA induce secretion of IFN- ⁇ in CD4 + lymphocytes (FIG. 8.4) and CD8 + lymphocytes (FIG. 8B) slightly higher than that induced by bare LPRs. This observation confirms the intrinsic adjuvant effect of LPR-triMN. LPR-triMNs containing E7 mRNA were able to induce INF- ⁇ secretion in CD4 + lymphocytes (FIG.
  • LPR-MN induce only a low secretion of INF- ⁇ , whether they contain ssPolyU RNA or E7 mRNA.
  • mice were vaccinated with an equimolar mixture of LPR-E7 and LPR-E7-DC-LAMP. provides a better response to vaccination (Mockey et al.
  • DC-LAMP is a glycoprotein of the membrane of lysosomes and late endosomes, which plays a role in the loading of peptides on MHC-II, allowing to actively induce Th1 responses
  • the use of a chimeric nucleic acid sequence makes it possible to orient E7 towards the MHC-II pathway and to improve the immune response.
  • mice Single-stranded (ysPolyU) coding was used as a control. Injections were performed on D0, D7 and D15. At day 21, the mice were sacrificed and their spleens removed. The splenocytes thus isolated were incubated in the presence of E7 peptides and their secretion of INF- ⁇ was analyzed by ELISpot. Different modes of vaccination were compared. Groups of 5 mice were thus vaccinated with 21 ⁇ g of LPR-triMN-ssPolyU (control) intravenously or with LPR-triMN-E7 / E7-DC-LAMP: 21 ⁇ g intravenously, 7 ⁇ intradermally or 7 ⁇ g ( Fig.
  • LPR-triMN are therefore effective vaccination vectors for the induction of an antigen-specific T response of interest in vaccinated subjects.
  • LPR-triMNs have a therapeutic vaccine effect in a mouse model of HPV-induced cancer.
  • the therapeutic effect of vaccination with LPR-E7 was evaluated in groups of 5 mice to which 50000 cells of the TC-1 syngeneic tumor line were administered by intradermal injection in the ectopic position (left flank). These tumor cells express the oncoprotein E7.
  • mice then received two intradermal injections (7 days and 9 days after tumor cell inoculation) of PBS (negative control) or 7 ⁇ g of: LPR-MN-ssPolyU, LPR-MN-E7 / E7-DC -LAMP, LPR-triMN-ssPolyU or LPR-triMN-E7 / E7-DC-LAMP.
  • Tumor growth was evaluated every 2 days by caliper measurement according to the formula (LxI 2 ) / 2. Animals whose tumor volume became critical (> 20G0 mm 2 ) were sacrificed.
  • Figure 10 shows that after 4 months, 9 of the 9 mice vaccinated with LPR-triMN-E7 / E7-DC-LAMP are still alive without having developed a tumor. After 4 months, 3 of the 10 mice immunized with LPR-triMN-ssPolyU, not containing coding mRNA, are also still alive without having developed a tumor. Their survival is likely attributable to the adjuvant effect of LPR-triMN, which can indeed stimulate the immune response of vaccinated mice. After 4 months, 3 of the 9 mice vaccinated with LPR-MN-E7 / E7-DC-LAMP are still alive without having developed a tumor. Injection of PBS or LPR-MN-ssPolyU has no therapeutic effect.
  • Figure 10B compares the survival of vaccinated mice with different LPRs.
  • the use of LPR-triMN for vaccination against an antigen expressed by Tumor cells has a significant therapeutic effect and prevents the formation of tumors in more than half of the vaccinated mice.
  • LPR-triMN As a therapeutic vaccine, two other tumor models were tested: the B16F0 melanoma model (expressing MARTI), and the EG17 cell expressing EG7 cell model.
  • the therapeutic effect of a vaccination with LPR-triMN was evaluated in groups of 10 mice to which cells of the tumor line B 16F0 or EG7 were administered by intradermal injection in the ectopic position (left flank). The mice were then vaccinated on days 7 and 9 post-injection with PBS, LPR-triMN comprising ssPolyU RNA or LPR-triMN comprising M ARTI or OVA mRNA. respectively.
  • Figure 11 shows that only vaccination with LPR-triMN comprising MARTI or OVA mRNA makes it possible to limit the growth of tumors.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux composés synthétiques, comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe sucre par l'intermédiaire d'un espaceur PEG, et de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés. En particulier la présente invention concerne de nouveaux composés synthétiques de formule générale (I) et de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés. L'invention concerne également ces nouveaux liposomes pour leur utilisation en tant que vecteurs et/ou en tant qu'adjuvants, notamment pour une utilisation vaccinale.

Description

DIÉTHERS D'ARCHAEA LIPIDES SYNTHÉTIQUES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des liposomes, de leurs composés lipidiques et de leurs utilisations pharmaceutiques. En particulier la présente invention concerne l'obtention de nouveaux composés synthétiques et la formulation de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés pour une utilisation vaccinale.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE Le développement de nouveaux composés possédant des propriétés avantageuses pour la préparation de liposomes représente un enjeu majeur dans la recherche médicale. Les liposomes constituent un moyen très efficace pour faire parvenir une molécule d'intérêt à l'intérieur de cellules. Les liposomes représentent par exemple une alternative aux vecteurs viraux pour la délivrance d'acides nucléiques. Ils possèdent également un intérêt thérapeutique majeur en cancérologie. En plus d'être utilisés comme vecteurs de médicaments, des liposomes sont en effet développés pour une vaccination thérapeutique visant à induire une réponse immunitaire contre les cellules tumorales.
Les liposomes dits conventionnels sont principalement constitués de phosphoiipides similaires à ceux présents dans les membranes de bactéries ou de cellules eucaryotes. L'utilisation médicale de ces liposomes peut cependant être limitée par des problèmes de stabilité et des problèmes de ciblage. Pour pouvoir être administrés par voie orale ou par voie sanguine, les liposomes doivent en effet résister à un milieu acide et/ou aux interactions avec les protéines et lipoprotéines du sang. Par ailleurs, les liposomes doivent être reconnus par les cellules auxquelles sont destinées les molécules qu'ils transportent. En particulier les liposomes utilisés comme vecteurs de vaccination doivent être reconnus et i ternalisés par les cellules présentatrices d'antigène afin que celles-ci puissent induire une réponse immunitaire spécifique à l'antigène délivré par les liposomes. Le problème de stabilité des liposomes peut être résolu par l'utilisation de lipides appelés éthers de lipides ou archaeo lipides. Ces lipides, naturellement présents dans les membranes des archaebactéries, sont caractérisés par la présence de liaisons éthers reliant les chaînes aliphatiques phytanyies qui les constituent à un glycérol. Les lipides présents dans les membranes des archaebactéries sont donc généralement des diéthers ou des tétraéthers de phytanois. La structure des éthers de lipides joue un rôle important dans la résistance des archaebactéries aux conditions extrêmes. De même, les liposomes comprenant ces lipides, aussi appelés archaeosomes, possèdent généralement une stabilité accrue au stress oxydatif, aux hautes températures, aux conditions acides ou alcalines, à l'action des phospholipases, des sels biliaires et des protéines du sérum (Patei GB, Sprott GD, Archaeob cterial ether lipid liposomes (archeosomes) as novel vaccines and drug delivery Systems. Crit Rev Biotechnol 1999; 19: 317-357). WO9308202 décrit ainsi des archaeosomes présentant une stabilité accrue obtenus à partir des lipides polaires totaux extraits d'archaebactéries. CA2269502 décrit des lipides dérivés de tétraéthers et des liposomes les comprenant. WO2006061396 décrit des tétraéthers de lipides de synthèse analogues à ceux présents dans les membranes d'archaebactéries et des liposomes intégrant ces tétraéthers de lipides. Outre leur stabilité accrue, les archaeosomes possèdent également l'avantage d'avoir un effet adjuvant intrinsèque, indépendant de toute molécule qu'ils peuvent transporter. WO0126683 décrit ainsi i'aetivation in vitro and in vivo de macrophages et de cellules dendritiques de souris par des archaeosomes vides constitués des lipides polaires totaux extraits d'archaebactéries.
Le problème d'adressage des liposomes peut être résolu par l'utilisation de composés comportant un lipide lié à un groupe polaire pouvant être reconnu par des récepteurs exprimés à la surface des cellules ciblées. Ainsi les liposomes comprenant de tels composés possédant un groupe polaire sucre peuvent être reconnus par les récepteurs lectines des cellules présentatrices d'antigène (Benvegnu et al., Glycolipid-based nanosystems for îhe delivery of drugs, gènes and vaccine adjuvant applications, Carbohydr. Chem., 2014, 40: 341-377). En particulier, Espuelas et ah, décrivent l'addition d'un, de deux ou de quatre groupe(s) mannose via un espaceur PEG à un lipide de synthèse dioléylgiycérol (DOG) possédant deux chaînes aliphatiques non phytanyies reliées à un glycérol par une liaison éther (Espuelas et al,, Influence of ligand valency on the targeting of immature human dendritic cells by mannosylated liposomes, Bioconjugate Chem. 2008, 19 :2385-2393). Espuelas et al, montrent que des liposomes comprenant ces composés peuvent cibler et être fixés par des cellules dendntiques immatures humaines mais ne sont pas capables d'induire seuls l'expression des marqueurs de surface CD83, CD86 et HLA-DR de ces cellules. Les composés décrits par Espueias et al, ne confèrent donc pas d'effet adjuvant intrinsèque aux liposomes qui les contiennent. WO2007112567 décrit des diéthers ou tétraéthers de lipides hémisynthétiques comprenant uniquement des chaînes phytanyles obtenus à partir des extraits de lipides polaires totaux d 'archaebactéries. Après isolement, ces lipides sont attachés à des groupes sucres et les composés obtenus sont utilisés dans la préparation d'archaeosomes.
L'obtention de composés hémisynthétiques comportant un diéther de lipides extraits des archaebactéries nécessite la mise en place de cuitures d'archaebactéries, de méthodes d'extraction et d'isolation difficiles à réaliser à grande échelle. Il est donc nécessaire de pouvoir obtenir des composés synthétiques comportant des diéthers de lipides attachés à un groupe sucre possédant les propriétés avantageuses des lipides d'archaebactéries.
La présente invention concerne ainsi des composés synthétiques comportant un diéther de lipides relié à un. groupe sucre et des liposomes comprenant ces composés. Les composés de l'invention sont caractérisés par la présence d'une chaîne aliphatique ramifiée et d'une chaîne aliphatique linéaire non substituée et par la présence d'un groupe glycoside greffé au diéther de lipides par l'intermédiaire d'un espaceur PEG. De manière inédite, les composés synthétiques de l'invention confèrent aux liposomes qui les comprennent un effet adjuvant intrinsèque in vitro et in vivo.
RÉSUMÉ
La présente invention concerne ainsi un composé de formue I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent indépendamment un H, ou un groupement du type :
d
dans lequel R2 et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3'-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétyiglucosamine (tri-GIcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMe (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l'oligosaccharide α-fucose- 1 -4G!cNAc, l'oligosaccharide iacto- N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l'oligosaccharide Manal- 3(Mana! -6)Manal , les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ;
d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu'au moins un des groupements R2 et R2' soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2' est absent ;
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. un mode de réaiisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri' et Ri " sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou ie groupement 1
d
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
dans lequel R2 et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment le marmose, le glucose, le fucose, ou les oligomarmoses comprenant de 2 à 10 unités mannose,
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentieilement de 5 à 20 ;
Ri, RI et Ri" sont identiques ou différents, représentent indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
dans lequel R2 et R2' représentent le groupement :
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. La présente invention concerne également un composé de formule II :
dans laquelle :
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à
d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2, Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule II :
dans laquelle :
c représente 5;
d représente 2.
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé selon l'invention. Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé de l'invention dans des proportions comprises d'environ 1% à environ 15% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides, préférentiellement d'environ 2% à environ 10%, plus préférentiellement d'environ 5%.
La présente invention concerne également un liposome de l'invention comprenant en outre au moins une molécule d'intérêt. Selon un mode de réalisation, la molécule d'intérêt comprise dans le liposome de l'invention est capable d'induire une réaction immunitaire.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'intérêt comprise dans le liposome de l'invention est un acide nucléique. Selon un mode de réalisation, la molécule d'intérêt comprise dans le liposome de l'invention est un antigène associé au cancer ou un acide nucléique codant un antigène associé au cancer.
Selon un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un antigène associé au cancer sélectionné dans le groupe comprenant : CAP-1, CD 4/m, les protéines de surface cellulaire de la famille Claudine CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 et CLAUDIN-12, c-myc, CT, GnT-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NF 1, NY-BR-1 , protéinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI/m, TPTE, CDK4 {cy clin- dépendent kinase 4), plSl! 4'3, p53, AFP, β-caténine, caspase 8, versions mutées de p21 Ras, chimère Bcr- abl, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, E.D1.R ί UT. Pml- RARaTEL/AMLI, NY-ESO-I, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated aniigen) M AGE- Al, MAGE-A2, M AGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE -Al 0, M AGE- Al 1, MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, BAGE, DAM-6, DAM- 10. les membres de la famille GAGE (G aniigen) GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA- 88 A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-Ï, LMP-2, gp77, g lOO, M ART- 1 /Melan- A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 (tyrosinase-related protein), TRP-2-INT2, PSA, PSM, MC1R, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, R I 2. SART-I, SART-2, SART-3, WT et WT1, ou un acide nucléique codant ledit un antigène associé au cancer.
La présente invention concerne également un composé selon l'invention pour son utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal. En outre, la présente invention concerne un liposome comprenant au moins un composé selon l 'invention pour son utilisation en tant qu ' adj u vant vaccinal .
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé de l 'invention et comprenant en outre au moins une molécule d'intérêt capable d'induire une réaction immunitaire, pour son utilisation en tant que vaccin.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le composé selon l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. En outre, la présente invention concerne le liposome selon l'invention et au moins un excipient pharmace u iquement acceptab le.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
« Adjuvant » fait référence à une molécule qui stimule la réponse immunitaire à un antigène et/ou qui la module de telle sorte à obtenir la réponse attendue. En particulier, l'ajout d'adjuvants dans les formulations vaccinales a pour but d'améliorer, d'accélérer et de prolonger la réponse immunitaire spécifique dirigée contre le(s) antigène(s) compris dans ces formulations vaccinales. Les avantages des adjuvants incluent l'amélioration de l'immunogénicité des antigènes, la modification de la nature de la réponse immunitaire, la réduction de la quantité d'antigène(s) nécessaire pour induire une immunisation efficace, la réduction de la fréquence des immunisations de rappel et l'amélioration de la réponse immunitaire chez les sujets âgés et les sujets immunodéprimés.
« Antigène » fait référence à toute molécule qui peut initier chez un sujet une réponse immunitaire cellulaire et/ou humorale.
« Cellules dendritiques » fait référence à des cellules du système immunitaire présentatrices d'antigène qui présentent dans certaines conditions des prolongements cytoplasm.iqu.es appelés dendrites. Les cellules dendritiques ont notamment pour fonction de déclencher la réponse immunitaire adaptative induite en réponse à un antigène. « Diéther de lipides » concerne dans la présente invention un glycérol sur lequel deux fonctions alcool sont engagées dans des liaisons éthers avec des lipides,
« Environ » placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
« Excipient pharmaceutiquemeiit acceptable » concerne un véhicule ou un support inerte utilisé en tant que solvant ou diluant dans lequel l'agent pharmaceutiquement actif est formulé et/ou administré, et qui ne produit pas une réaction indésirable, allergique ou autre lorsqu'il est administré à un animal, de préférence un être humain. Cela comprend tous les solvants, milieux de dispersion, revêtements, agents antibactériens et antifongiques, agents isotoniques, agents retardant l'absorption et autres ingrédients similaires. Pour l'administration humaine, les préparations doivent répondre à des normes de stérilité, de sécurité générale et de pureté, telles que requises par les offices de régulation, tels que par exemple la FDA {Food and Drug Administration) ou PEMA {Européen Medicines Agency).
« Clycane » fait référence à un polymère composé de monosaccharides reliés entre eux par une liaison glycosidique.
« Glycoside » fait référence à un groupe sucre attaché à une autre fonction non glucidique par une liaison glycosidique. Le groupe sucre, également appelé résidu sucre, peut être un sucre simple (un monosaccharide) ou comporter plusieurs sucres (un oligosaceharide ou un polysaccharide).
« Immunogène » concerne une molécule induisant une réponse immunitaire chez le sujet à qui elle est administrée,
« Lectine » concerne une protéine qui se lie spécifiquement et de manière réversible à certains glucides. Parmi les lectines, celles présentes à la surface de certaines cellules immunitaires sont des lectines de type C.
« Lipide » concerne une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée, saturée, insaturée ou polyinsaturée,
« Lipoplexe » concerne un complexe liposome - acide nucléique, en particulier un complexe liposome cationique - acide nucléique. « Lipopolyplexe » concerne un complexe ternaire liposome - polycation - acide nucléique. Lorsque l'acide nucléique est un ADN, le lipopolyplexe est appelé LPD (Lipid - Polycation - DNA). Lorsque l'acide nucléique est un A N, le lipopolyplexe est appelé LPR {Lipid -■ Polycation -- RNA).
« Liposome » concerne une vésicule formée d'une bicouche de lipides amphiphiles renfermant un milieu aqueux. Les têtes polaires des lipides amphiphiles se regroupent entre elles et sont dirigées soit vers le milieu extérieur aqueux, soit vers le milieu intérieur aqueux. Les queues hydrophobes sont enfouies à l'intérieur de la bicouche de manière à minimiser leur interaction avec un milieu aqueux.
« Réponse immunitaire adaptative » concerne, après l'administration d'un vaccin, le développement chez un sujet d'une réponse spécifique cellulaire et/ou humorale (médiée par des anticorps). La réponse immunitaire adaptative inclut généralement, de manière non exhaustive, un ou plusieurs des effet(s) suivant(s) : production d'anticorps, de lymphocytes B, de lymphocytes T auxiliaires et/ou de lymphocytes T cytotoxiques, dirigés de manière spécifique contre un ou plusieurs antigène(s) compris dans le vaccin. De manière préférentielle, le sujet vacciné développera une réponse immunitaire adaptative protectrice ou thérapeutique telle que sa résistance à une infection sera accrue et/ou la sévérité de la maladie sera réduite.
« Sucre » dans la présente invention, peut faire référence à un sucre simple ou à un polymère de sucres simples. Les sucres simples, également appelé oses ou monosaccharides, sont des aldéhydes polyhydroxylées ou des cétones polyhydroxylées. Le glucose, le mannose, le ribulose et le fructose sont quelques exemples de sucres simples. Les polymères de sucres simples peuvent être distingués en oligosaccharides, comprenant de 2 à 20 résidus d'osés et en poiysaccharides, comprenant plus de 20 résidus oses.
« Sujet » fait référence à un animal, de préférence à un être humain. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie. « Vaccin » concerne toute préparation comprenant une substance ou un groupe de substances induisant chez un sujet une réponse immunitaire dirigée contre un agent infectieux, par exemple une bactérie (par exemple Hœmophilus influenzœ de type b (Hib), Streptococcus pneumoniœ, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphthenœ, Ciostridium tetani, Bordatella perîussis, Vibrio cholerœ, Salmonella typhi) ou un virus (par exemple le virus de l'influenza (grippe), la varicelle, l'hépatite A, l'hépatite B, le virus de de l'immunodéficience humaine (VIH), les papillornavirus ou le poliovirus), ou contre une tumeur cancéreuse. Les vaccins prophylactiques sont administrés pour empêcher un sujet de contracter une maladie ou pour atténuer l'atteinte si la maladie est contractée. De tels vaccins comprennent généralement soit un agent infectieux (inactivé, ou vivant mais atténué), soit des fragments d'un agent infectieux (tels que des molécules de surface provenant de l'agent infectieux) ou encore des toxines produites par l'agent infectieux, obtenus par purification ou par génie génétique. Les vaccins thérapeutiques sont destinés au traitement de maladies spécifiques, telles que, par exemple, les cancers. De tels vaccins comprennent un ou plusieurs antigènes tumoraux et visent en particulier à induire une réponse immunitaire cellulaire, médiée par les lymphocytes T, dirigée contre la tumeur qui expriment ce ou ces antigène(s).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention concerne un composé comportant :
deux chaînes aiiphatiques linéaires et/ou ramifiées et de même longueur, chacune reliée à un glycérol par une liaison éther, caractérisées en ce que l'une des chaînes aiiphatiques est une chaîne ramifiée dans laquelle le nombre de carbones de la chaîne linéaire est compris entre 12 et 20, préférentiellement entre 16 et 20, ce nombre n'incluant pas les carbones branchés, et l'autre chaîne aliphatique est une chaîne linéaire non substituée dans laquelle le nombre de carbones est compris entre 12 et 20, préférentiellement entre 16 et 20 ;
un groupe hydrophile choisi dans la liste comprenant les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaceharide 3'-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaeeharide Lewis x (Lex), le tri N- acerylglucosamme (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mamiosides), en particulier les PIMi à PIMe (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, Poligosaccharide α-fucose- 1 -4GlcNAc, l'oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Mail 3, les oligosaccharides M an 4, l'oligosaccharide Manal -3(Manal -6)Manal , les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antemiés comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antemiés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose ;
- un espaceur [PEGjjni séparant le groupe hydrophile des chaînes alipliatiques dans lequel m est compris entre 1 et 130, préférentiellement entre 5 et 20.
La présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
RÎ, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :
d dans lequel R2 et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fueose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fueose, le trisaccharide 3'-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Le*), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIM0 (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, roligosacciiaride a-fucose-l-4GlcNAc, l'oligosaccharide lacto- N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l'oligosaccharide M anal - 3(Manal-6)Manal , les lipoarabmomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ;
d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
sous réserve qu'au moins un des groupements R2 et R2' soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2' est absent ;
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri ' et Ri" soit différent de H. un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiel lement de 5 à 20 ;
Ri, RI' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel R2 et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les origomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glvcanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3'~sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Le*), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNÀc), les PÏMs (phosphatidyiinositol mannosides), en particulier les PIMj à PIM0 (phosphatidyiinositol mono- à hexa-mannoside), Poligosaceharide α-fucose- 1 -4GlcNAc, l'oligosaccharide lacto-N- fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ;
d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
sous réserve qu'au moins un des groupements R2 et R2' soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2' est absent ; sous réserve qu'au moins deux des groupements Ri, Rj' et Rj" soient différent de H. un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a est égal à 5 ;
b est égal à 2 ;
c est égal à 5 ;
Ri, RI' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
d
dans lequel R2 et 2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glvcanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3'-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Le*), le tri N-aeétylglu samine (tri-GlcNAc), les PÏMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMj à ΡΙΜ0 (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), roligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en niamiose, roligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, roligosaccharide iacto- N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Mail 3, les oligosaccharides Man 4, l'oligosaccharide Manal- 3(Manal -6)Mana1 , les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes nia nosylés (ManLAMs) ;
d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
sous réserve qu'au moins un des groupements R2 et R2' soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2' est absent ;
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentieilement de 5 à 20 ;
Ri, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
d dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
dans lequel R2 et R2' représentent le groupement :
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a est égal à 5 ;
b est égal à 2 ;
c est égal à 5 ;
Ri, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
d dans l equel d est égal à 2 ;
dans lequel R2 et R2' représentent le groupement : sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. un mode de réaiisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a est égal à 5 ;
b est égal à 2 ;
c est égal à 5 ;
RÎ, Ri' et Ri" représentent le groupement : dans l equel d est égal à 2 ;
dans lequel R2 représente le groupement :
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne donc un composé tri- mannosylé de formule II :
dans laquelle :
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2, Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un composé tri- mannosylé de formule ÏI :
dans laquelle :
c représente un nombre entier de 2 à 30, préférentiellement de 3 à 20 et plus préférentiellement de 4 à 10 ;
d représente un nombre entier de 1 à 5, préfére iellement 2.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un composé tri- mannosvlé de formule II :
dans laquelle :
c représente 5 ;
d représente 2. La présente invention concerne un composé de synthèse comportant un lipide présentant des caractéristiques structurales propres aux lipides naturellement présents dans les membranes des archaebactéries.
Les lipides naturellement présents dans les membranes des archaebactéries sont caractérisés par la présence de liaisons éthers reliant les chaînes aliphatiques qui les constituent à une molécule de glycérol. Ils sont également caractérisés par la présence de chaînes aliphatiques phytanyles possédant des branchements réguliers. Les éthers de lipides présents dans les membranes des archaebactéries sont ainsi généralement des diéthers de phytanols (tel que Parchaeol) ou des tétraéthers de phytanols (tel que le caldarchaeol). Les glycérolipides présents dans les membranes des bactéries et des cellules eucaryotes, dits conventionnels, possèdent eux des liaisons esters reliant les acides gras qui les constituent à une molécule de glycérol. Par ailleurs, les acides gras de ces lipides conventionnels sont généralement des chaînes aliphatiques, saturées ou msaturées, ne comprenant pas de branchements. La structure des éthers de lipides présents dans les membranes des archaebactéries joue un rôle important dans la résistance des archaebactéries aux conditions extrêmes telles que de hautes températures ou un milieu acide.
La présente invention concerne un composé de synthèse comportant deux liaisons éthers, reliant une chaîne aliphatique ramifiée et une chaîne aliphatique linéaire non substituée à un glycérol. La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides. Selon un mode de réalisation, le diéther de lipides de l'invention comprend deux chaînes aîiphatiques, dont les structures linéaires n'incluant pas les carbones branchés sont de même longueur, reliées à un glycérol par une liaison éther, l' une des chaînes aîiphatiques étant une chaîne ramifiée et l'autre chaîne aliphatique étant une chaîne linéaire non substituée.
Dans un mode de réalisation, les chaînes aîiphatiques du diéther de lipides de l'invention sont saturées. Dans un autre mode de réalisation, les chaînes aîiphatiques du diéther de lipides de l'invention sont insaturées. Dans un autre mode de réalisation, la chaîne aliphatique ramifiée est saturée et la chaîne aliphatique linéaire non substituée est msaturée. Dans un autre mode de réalisation, la chaîne aliphatique ramifiée est insaturée et la chaîne aliphatique linéaire non substituée est saturée.
Dans un mode de réalisation, la structure linéaire de même longueur de la chaîne ramifiée et de la chaîne linéaire non substituée du diéther de lipides de l'invention comprend entre 12 et 20 carbones, préférentiellement entre 16 et 20 carbones, et plus préférentiellement 16 carbones.
Dans un mode de réalisation la structure linéaire de même longueur de la chaîne ramifiée et de la chaîne linéaire non substituée du diéther de lipides de l'invention comprend 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 carbones.
La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe hydrophile, ou groupe polaire.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un glycoside.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre reconnu par les lectines, des protéines capables de lier des résidus sucres, et préférentiellement par les lectines de type C.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre reconnu par les lectines DC-SIGN (CD209), DEC205/CD205, langérine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, et/ou le récepteur au mannose (MR). Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre choisi parmi la liste comprenant les giycanes terminés par un mannose, les giycanes terminés par un fucose, le trisaceharide 3'-suifo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaceharide Lewis x (Le:<), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIM 1 à PI Me (phosphatidylinositoi mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide Man9GlcNAe2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l'oligosaccharide a-fucose- 1 -4GlcN Ac, l'oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l'oligosaccharide Manal- 3(Manal -6)Manal , les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antennes comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligofpropylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentieliement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre choisi parmi la liste comprenant les giycanes terminés par un mannose, les giycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3'-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinosi ol mannosides), en particulier les PI Mi à PIMÔ (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide a- fucose- 1 -4GlcNAc, l'oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide GlcNÀc2 Man 3, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antennés comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentieliement n :::: 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose. Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisé en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 résidus sucres attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n :::: 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 imités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant 3 résidus sucres attachés par un espaceur oligofpropylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 mannoses attachés par un espaceur oligo(propylène glycoi)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 glucoses attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 fucoses attachés par un espaceur oligoÇpropylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiel lementn ::: 2. Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l'invention est un sucre antenne comprenant 2, 3, 4 ou 5 oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose attachés par un espaceur oligoipropylène glyco l)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe hydrophile, ou groupe polaire, par l'intermédiaire d'un espaceur poiyéthylène glyco 1 (PEG).
Dans un mode de réalisation, F espaceur PEG possède la structure suivante : dans laquelle c est compris entre 1 et 130, préférentiellement entre 5 et 20.
Selon un mode de réalisation, c est égal à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50.
Selon un mode de réalisation, c est un nombre entier allant de 2 à 30, préférentiellement de 3 à 20, et plus préférentiellement de 4 à 10. Selon un mode particulier de réalisation, c est égal à 5.
La synthèse du composé de l'invention pourra être réalisée par différentes voies connues de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation (décrit dans Lainé et al., Folaie-equippedpegyiated archaeal lipid derivatives : synthesis and transfection properties, Chem. Eur. J, 2008, 14, 83330- 8340), un diéther de lipides selon l'invention peut être obtenu à partir d'un dérivé du glycéroi lui-même synthétisé à partir d'un phytol et d'un (R)-solketal. La réaction de ce dérivé du glycéroi avec le triflate d'hexadécyle en présence d'une éponge à protons permet d'obtenir le diéther correspondant. L' hydrogène lyse du groupe benzyloxy conduit à l'alcool qui peut ensuite être converti en acide carboxylique ou en aminé. Les diéthers de lipides ainsi obtenus possédant une fonction acide carboxylique ou une fonction aminé peuvent être utilisés pour la synthèse de composés selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, la synthèse du composé tri-mannosylé de formule II est réalisée selon un schéma en quatre étapes à partir du iigand tri-mannosylé acide carboxylique et du l-0-carboxyl-2-0-Phytanyl-3-0-hexadecane-s«.-glycérol désigné par la suite par diéther de lipides possédant une fonction acide carboxylique (ou diéther acide carboxylique) :
1) le ligand tri-mannosylé acide carboxylique est préparé par benzylation du pentaerythritol trialiyléther, suivie d'une séquence hydroboration- oxydation al lylation/hydroboration-oxydation, d'une trimannosylation des hydroxyles libres par un donneur de mannosyle trichloroacétimidate tétra-O-benzoylé, une déprotection de l'hydroxyle du pentaérythritol suivie d'une oxydation en acide carboxylique ;
2) le couplage peptidique entre le diéther acide carboxylique et la chaîne poly(éthylène glycol) amino-azoture est réalisé par F intermédiaire d'un ester activé par un noyau benzotriazole (TBTU) en présence de la Ν,Ν'-diisopropyléthylamine (DÏEA), sous atmosphère inerte dans le dichlorométhane anhydre ;
3) après réduction de la fonction azoture dans des conditions de Staudinger, un second couplage peptidique en présence des réactifs TBTU et DIEA permet le greffage du ligand tri-mannosylé acide carboxylique ;
4) une déprotection des hydroxyles des motifs mannose dans des conditions de Zemplén ( eONa, CH2Cl2/MeOH) conduit au composé tri-mannosylé final.
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé de l'invention. Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé de l'invention dans des proportions d'environ 1% à environ 15% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides, préférentiel lement d'environ 2% à environ 1.0%, plus préférentiel lement d'environ 5%. Dans un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend au moins un composé de l'invention dans des proportions d'environ 1% à environ 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 1%, 12%, 13%, 14%, ou 15% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides. Dans un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé de l 'invention dans des proportions d'environ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 1%, 12%, 13%, ou 14%, à environ 15% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend environ 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 1%, 12%,, 13%, 14% ou 15%» d'un composé de l'invention en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides.
Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé de l'invention dans des proportions d'environ 1 % à environ 15% en poids par rappoxt au poids total du liposome, préférentieilement d'environ 2%> à environ 10%, plus pr éféren rie ί lement d ' environ 5 % .
Dans un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend environ 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 1%, 12%,, 13%, 14% ou 15%» d'un composé de l'invention, en poids par rapport au poids total du liposome.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend au moins un composé selon l'invention seul ou en mélange avec un ou plusieurs lipide(s) synthétique(s), hémisynthétique(s) ou naturel(s).
Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé selon l'invention et le lipide KLN25 (0,0-dioléyl- -[3N- (Nméthylimidazoliumbromure)propylène] phosphoramidate) de formule :
Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé selon l'invention et le lipide MM27 (Ο,Ο-dioiéyl (-N-(histamine)phosphoramidate) de formule : Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un composé selon l'invention, le lipide KLN25 et le lipide MM27.
Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend 5% de composé selon l'invention, 47,5% de lipide KLN25, et 47.5% de lipide MM27, en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides, Selon un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend au moins un composé selon l 'invention et un lipide cationique. Dans un mode de réalisation, le lipide cationique est un lipide possédant une tête polaire constituée d'un groupe imidazoiium. Dans un mode de réalisation, le liposome de l'invention est un liposome cationique.
La préparation du liposome de P invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l 'art. Par exemple, le liposome de l 'invention peut être préparé selon la méthode d'hydratation d'un film lipidique sec (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Méthode Mol Biol . 969:247-74).
Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins une molécule d'intérêt. Selon un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins une molécule d'intérêt à délivrer in vitro ou in vivo à une cellule.
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est comprise au sein de la bicouche lipidique du liposome de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d'intérêt est comprise au sein du compartiment hydrophile du liposome de l'invention. Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un acide nucléique, par exemple et de façon non exhaustive, la molécule d'intérêt est un ADN, un ARN, un ARNm, un siAR , ou un micro ARN. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d'intérêt est une protéine ou un peptide. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un agent thérapeutique. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un agent colorant ou un marqueur.
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est une molécule immunogène. Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est capable d'induire une réaction immunitaire.
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un antigène d'origine bactérienne, d'origine fongique ou d'origine virale. Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un antigène d'origine bactérienne choisi parmi la liste non exhaustive comprenant le polyoside capsulaire (polyrïbosyl ribitol phosphate ou PRP) de Hœmophilus influenz.œ de type b ; les polyosides sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9 V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B,17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F de Streptococcus pneumoniae ; le polyoside de Neisseria meningitidis groupe A ; le polyoside de Neisseria meningitidis groupe B ; le polyoside capsulaire Vi de Salmonella typhi (souche Ty 2),
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un antigène associé au cancer ou un acide nucléique codant un antigène associé au cancer.
Dans un mode de réalisation préféré, la molécule immunogène comprise dans le liposome de l'invention est un antigène tumoral ou un acide nucléique codant un antigène tumoral. Selon un mode de réalisation, l 'antigène tumoral peut être choisi parmi la liste non exhaustive comprenant : CD 4 {c clin- dépendent kinase 4), piSf ï 4'3, p53, AFP, β- caténine, caspase 8, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I MUM-2, MUM- 3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, IAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV 6/AML, TEL/Amll, Dekcam, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLI, Y-ESO-I, les membres de la famille MAGE {Melanoma-associated aniigen) AGE-AÏ, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE- 10, MAGE- 12, BAGE, DAM-6, DAM- 10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G 50, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papillorna virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, g lOO, MART- 1/Meian-A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 (tyrosinase-relaîed protein), PSA, PSM, MC1R, ART4, CAMEL, CE A, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RUl , RU2, SART-I, SART-2, SART-3, et WTl . Selon un mode de réalisation, l'antigène tumoral peut être choisi parmi la liste non exhaustive comprenant : CAP-1, CD 4/m, les protéines de surface cellulaire de la famille Claudine CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 et CLAUDIN-12, c-myc, CT, GnT-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NF1, NY-BR-1 , protéinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPÏ/m, TPTE, CDK4 {cyclin-dependent kinase 4), plS1"1'4'3, p53, AFP, β-caténine, caspase 8, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amli, Dekcain, E.DI .R ί ί 'Τ. Pml-RARaTEL/AMLI, NY-ESO-l, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antîgen) MAGE-AÏ, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE -A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, AGE-A8, MAGE-A9, MAGE- Al 0, MAGE- Al 1 , MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, BAGE, DAM-6, DAM- 10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE- 7B, GAGE-8, NA-88A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papiiloma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MART- 1 Me an-A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 {tyrosinase-relaîed protein), TRP-2-INT2, PSA, PS VI. MC1R, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RUl, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, WT et WTl .
Selon un mode de réalisation, l'antigène tumoral est choisi parmi la liste comprenant les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV {human papiiloma virus), MART-l/Melan-A. Selon un autre mode de réalisation, l'antigène tumoral est l'oncoprotéine E7 dérivée du HPV (human papiiloma virus).
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un polypeptide. Dans un mode de réalisation, le polypeptide est d'origine bactérienne, d'origine fongique ou d'origine virale. Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un polypeptide d'origine bactérienne correspondant à une protéme, ou à un fragment de cette protéine, choisie parmi la liste non exhaustive comprenant XcpQ et PopB de Pseudomonas aeruginosa ; protéine de liaison au facteur H (ou 1ΉΒΡ pour factor H binding protein), antigène de liaison à l'héparine de Neisseria (ou NHBA pour Neisserial Heparin Binding Antigen) de Neisseria meningitidis groupe B ; adhésine A de Neisseria (ou NadA pour Neisseria adhesin A) de Neisseria meningitidis groupe B, anatoxine diphtérique (ou toxoïde diphétrique) de Corynebacterium diphtheriœ ; anatoxine tétanique (ou toxoïde tétanique) de Clostridium tetani ; anatoxine pertussique (ou toxoïde de la coqueluche), hémagglutinine filamenteuse, pertactine de Bordatella pertussis ; sous-unité B de la toxine cholérique recombinante (ou rCTB pour recombinant choiera toxin B subunit) de Vibrio cholerœ.
Dans un mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un polypeptide d'origine virale correspondant à une protéine, ou un fragment de cette protéine, choisie parmi la liste non exhaustive comprenant les protéines GAG (p24, p 17, p9 et p7), Pol (p64, p51 , p 10 et p32) et Env (gp41 et gp!20) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ; protéine précurseur pré-membrane (ou preM) et protéme M (pour membrane) du virus Zika ; domaine EDIII de la protéine E du virus de la dengue ; glycoprotéine de fusion (ou RSV- F pour respiratory syncytial virus F protein) du virus respiratoire syncytial ; hémagglutinine du virus de la grippe A sous-type H5N1 ; protéine nucléaire NP du viras de la grippe ; antigène de surface du virus de l'hépatite B ; protéines S et pré-S2 du virus de l'hépatite B ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 6 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 1 1 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 16 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 18 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 31 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 33 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 45 ; protéme L 1 de papiilomavirus humain (ou HPV pour huma papiilomavirus) de type 52 ; protéine Ll de papiilomavirus humain (ou HPV pour human papiilomavirus) de type 58. Dans un mode de réalisation, le liposome de l'invention forme un lipoplexe comprenant au moins un composé de l'invention. En d'autres termes, dans un mode de réalisation, le liposome de l'invention comprend au moins un acide nucléique.
La préparation du lipoplexe de l'invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art. Par exemple, le lipoplexe de l'invention peut être obtenu en ajoutant une solution d'acide nucléique à une préparation de liposomes selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le lipoplexe de l'invention est obtenu en mélangeant une solution comprenant un acide nucléique, de préférence un ARNm, codant un antigène tumoral à une préparation de liposomes selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le lipoplexe de l'invention est obtenu en mélangeant une solution comprenant un acide nucléique, de préférence un A Nm, codant un antigène tumoral à une préparation de liposomes comprenant 5% de composé selon l'invention, 47,5% de lipide KLN25, et 47.5% de lipide MM27, en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l'invention forme un lipopolyplexe comprenant au moins un composé de l 'invention. En d'autres termes, dans un mode de réalisation, le liposome de l 'invention comprend au moins un acide nucléique complexé à un polycation. La préparation du lipopolyplexe de l'invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art. Par exemple, le lipopolyplexe de l'invention peut être obtenu en mélangeant un acide nucléique complexé (polymère cationique) à une préparation de liposomes selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le lipopolyplexe de l'invention est obtenu en mélangeant :
- un acide nucléique, de préférence un ARNm, codant un antigène tumoral, l'acide nucléique étant complexé à la polyiysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa (PEG-Hp ) ; et
une préparation de liposomes selon l'invention. Selon un mode de réalisation, le lipopolyplexe de l'invention est obtenu en mélangeant : - un acide nucléique, de préférence un ARNm, codant un antigène tumoral, l'acide nucléique étant complexé à la poly lysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa (PEG-Hp ) ; et
- une préparation de liposomes comprenant 5% de composé selon l'invention,
47,5% de lipide KLN25, et 47.5% de lipide MM27, en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides.
Selon un mode de réalisation, les liposomes, Iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention sont dispersés dans une solution aqueuse. Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes, Iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention sont dispersés dans du sérum physiologique ou dans du PBS.
Selon un mode de réalisation, l 'invention concerne également une solution aqueuse ou une dispersion comprenant les liposomes, Iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également une émulsion comprenant les liposomes, Iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention.
Dans un mode de réalisation, Γ émulsion comprenant les liposomes, Iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention est une émulsion huile dans eau, une émulsion eau dans huile ou une émulsion eau dans huile dans eau.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant les liposomes, iipoplexes ou lipopolyplexes de l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Des exemples d'excipients pharmaceutiquement acceptables incluent, mais ne se limitent pas à, l'eau, l'eau salée, le dextrose, le glycérol, et autres, ou des combinaisons de ces excipients. Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique peut également comprendre des humidificateurs, des émulsifiants, des tampons, des adjuvants, et autres.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un inhibiteur de point de contrôle immunitaire (plus connu sous le terme anglais « immune checkpoint inhibitor » ou ICI). De nombreuses tumeurs parviennent à exprimer des molécules qui inhibent la réponse immunitaire et à échapper ainsi au contrôle du système immunitaire. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaire sont des molécules qui agissent contre de tels mécanismes inhibiteurs développés par les cellules tumorales. Des exemples d'inhibiteur de point de contrôle immunitaire incluent, sans y être limités, des inhibiteurs de CTLA-4 (par exemple l'ipil mab), des inhibiteurs de PD-1 (par exemple le pembrolizumab et le nivolumab) et des inhibiteurs de PD-L1 (par exemple i'atezolizumab, l'avelumab et le durvalumab).
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée au sujet par n'importe quelle méthode d'administration appropriée. Ainsi, selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée pour une administration orale, une administration topique ou une injection. Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention peut également être formulée pour une administration systémique, intraveineuse, intrapéritonéaie, intramusculaire, intraiiodale, intracoronarienne, intraartérielie, sous- cutanée, intradermique, transdermique, intratumorale, intraoculaire, pulmonaire, par inhalation, par injection directe dans un tissu, ou par électroporation ou sonoporation. Dans un mode préféré de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention est formulée pour être administrée par injection, de préférence par injection intradermique ou intraveineuse, plus préférentiel] ement par injection intradermique. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique selon l'invention est formulée pour une administration orale. Des exemples de formes adaptées à une administration orale incluent, mais ne sont pas limités aux comprimés (dont les comprimés à libération prolongée), gélules, poudres, granulés, pilules (dont les pilules enrobées de sucre), capsules (dont les capsules de gélatine souple), suspensions orales, solutions buvables, et autres formes similaires.
Dans un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique de la présente invention est formulée pour être injectée. Des exemples de formes adaptées à une administration par injection incluent, mais ne sont pas limités aux solutions aqueuses stériles, dispersions, émulsions, suspensions, formes solides appropriées pour la préparation de solutions ou suspensions par addition d'un liquide avant utilisation telles que, par exemple, des poudres.
Dans un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique de la présente invention est formulée pour une application topique. Des exemples de formes adaptées à une administration par injection incluent, mais ne sont pas limités aux laits, crèmes, baumes, huiles, lotions, gels, pommades, sprays ou gouttes, telles que des gouttes ophtalmiques.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne également un adjuvant vaccinal comprenant les liposomes, lipoplexes ou iipopoiypiexes de l'invention et au moins un excipient phannaeeutiquernent acceptable. Selon un mode de réalisation, l 'invention concerne également un vaccin comprenant les liposomes, lipoplexes ou Iipopoiypiexes de l'invention comprenant eux-mêmes au moins une molécule immunogène, et au moins un excipient phaniiaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation, le vaccin de l'invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant supplémentaire. Dans un autre mode de réalisation, le vaccin comprend en outre au moins un inhibiteur de point de contrôle immunitaire.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l'invention peut être formulé sous différentes formes, incluant par exemple une solution, une dispersion ou une émulsion.
Dans le mode de réalisation selon lequel le vaccin de l'invention est formulé sous la forme d'émulsion, le vaccin comprend préférentiellement un ou plusieurs agent(s) surfactants, Selon un mode de réalisation et pour améliorer sa conservation, le vaccin de l'invention peut être lyophilisé. Le vaccin de l'invention peut ainsi se présenter sous une forme lyophilisée. Dans ce mode de réalisation, le vaccin comprend un ou plusieurs agent(s) aidant à la lyophilisation. Les agents aidant à la lyophilisation sont bien connus de l'homme du métier. Ces agents aidant à la lyophilisation comprennent notamment des sucres comme le lactose et le mannitol.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l'invention peut comprendre un ou plusieurs agent(s) stabilisant(s), par exemple pour prolonger la durée de conservation du vaccin ou pour améliorer l'efficacité de la lyophilisation. Des exemples d'agents stabilisants incluent, de façon non exhaustive, SPGA (Sucrose-Phosphate-Glutamate-Albumin), des sucres comme le sorbitol, le mannitol, le tréhalose, l'amidon, le sucrose, le dextrane ou le glucose, des protéines comme l'albumine ou la caséine ou leurs produits de dégradation, des mélanges d'acides aminés tels que la lysine ou la glycine, et des tampons comme les phosphates de métal alcalin.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l'invention est administré au sujet par l'une des méthodes conventionnelles de vaccination incluant une injection, par exemple intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, ou sous-cutanée ; une administration topique, par exemple une application transdermique ou une application par pulvérisation intranasale ; ou une administration orale. Le vaccin de l'invention peut être administré en une dose unique ou en plusieurs doses.
Dans le mode de réalisation selon lequel le vaccin est injecté, la formulation à injecter peut se présenter sous la forme d'une solution ou dispersion stérile, ou d'une poudre lyophilisée stérile permettant la préparation extemporanée d'une solution ou dispersion injectable stérile. Pour prévenir toute contamination par des microorganismes, un ou plusieurs agent(s) préservateurs) peuvent être ajoutés au vaccin comme par exemple des agents antibactériens et antifongiques tels que les parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique, le thiomersal et d'autres agents similaires. Il peut également être préférable d'ajouter au vaccin un ou plusieurs agent(s) isotonique(s) tels que des sucres ou du chlorure de sodium pour réduire la douleur provoquée par l'injection. Pour prolonger l'absorption d'un vaccin de l'invention injecté, un ou plusieurs agent(s) retardant l'absorption peu vent être ajoutés au vaccin comme par exemple le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. i l est entendu que l'usage journalier total du liposome, lipoplexe, lipopolyplexe, de la composition pharmaceutique ou du vaccin de l'invention sera ajusté par le médecin traitant dans le cadre de son avis médical. La dose thérapeutiquement efficace spécifique à chaque patient dépendra d'une variété de facteurs incluant le trouble traité et sa sévérité ; l'activité du composé utilisé ; la composition spécifique utilisée ; l'âge, le poids, l'état de santé général, le sexe et le régime alimentaire du patient, la durée et le mode d'administration ; la durée du traitement ; les médicaments utilisés en combinaison ou coïncidents avec le composé utilisé, et d'autres facteurs similaires connus dans le domaine médical.
Selon un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré une fois, deux fois, 3 fois, 4 fois, 5 fois, 6 fois, 7 fois, 8 fois, 9 fois, ou 10 fois au sujet.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré au sujet au moins une fois par jour. De préférence, le liposome, lipoplexe, iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré une fois par jour. Dans un autre mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré au sujet au moins une fois par semaine. Par exemple, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention peut être administré une fois par semaine, deux fois, trois fois, quatre fois ou jusqu'à sept fois par semaine. Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré au sujet avant que les symptômes n'apparaissent, i.e. le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré de manière prophylactique.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré au sujet après que les symptômes soient apparus, i.e. le liposome, lipoplexe, iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré de manière thérapeutique.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe, Iipopoiypiexe, la composition pharmaceutique ou le vaccin de l'invention est administré selon un protocole d'administration optimal. Selon l'invention, un protocole d'administration optimal comprend des paramètres de dose appropriés et des modes d'administration qui mènent à la stimulation ou au déclenchement d'une réaction immunitaire chez le sujet. Les paramètres de dose efficace peuvent être déterminés par des méthodes classiques pour une maladie en particulier. Des exemples de telles méthodes incluent, mais ne se limitent pas aux taux de survie, aux effets secondaires, à la progression ou régression de la maladie. En particulier, l'efficacité de la dose de liposomes, lipoplexes, lipopolyplexes, composition pharmaceutique ou vaccin selon ['invention pour traiter le cancer peut être déterminée par l'évaluation du taux de réponse, qui correspond à la proportion de patients dont la tumeur régresse ou n'évolue pas sous traitement.
La présente invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la vectorisation, c'est-à-dire le transfert transmembranaire d'une molécule d'intérêt. La présente invention concerne donc également l'utilisation du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour la vectorisation, c'est-à-dire le transfert membranaire d'une molécule d'intérêt.
Selon un mode de réalisation la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la transfection de cellules, de préférence pour la transfection in vivo de cellules. Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne l'utilisation d 'un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour la transfection in vitro ou ex vivo de cellules.
La présente invention concerne donc une méthode de transfection in vitro ou ex vivo de cellules, comprenant l'utilisation d'un lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la délivrance de prodrogues, de sensibilisateurs ou d'agent de visualisation.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la thérapie génique, les traitements topiques (dermatologie, ophtalmologie) ou des activités bactéricides. L'invention concerne en outre une composition cosmétique comprenant un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention. Un autre objet de l'invention est également l'utilisation cosmétique d'un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention.
L'invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la vectorisation ciblée. La présente invention concerne donc également l'utilisation du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour la vectorisation ciblée. Selon un mode de réalisation, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par un type de cellules particulier. Dans un mode de réalisation, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface une lectine. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l 'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface une lectine de type C. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface les lectines DC-SIGN (( 1)209 ). DEC205/CD205, langérine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, et/ou le récepteur au mannose (MR).
Dans un mode de réalisation, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par les cellules présentatrices d'antigène. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l 'invention est reconnu et fixé par les macrophages, les cellules dendritiques et/ou les cellules de Langerhans. Dans un mode de réalisation préféré, le composé de l'invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est reconnu et fixé par les cellules dendritiques.
Selon un mode de réalisation la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la transfection de cellules présentatrices d'antigène, de préférence pour la transfection de macrophage, de cellules dendritiques et/ou de cellules de Langerhans, encore plus préfèrent! ellement pour la transfection de cellules dendritiques.
L'invention concerne également un composé de l'invention, un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation en tant qu'adjuvant. Dans un mode de réalisation, le composé de l'invention, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention a un effet adjuvant in vitro. Dans un mode de réalisation, ie composé de l'invention, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention a un effet adjuvant in vivo.
L'invention concerne également un composé de l'invention, un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention administré à un sujet induit une réponse immunitaire chez le sujet. Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention administré à un sujet induit une réponse immunitaire chez le sujet qui ne dépend pas de la présence dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention d'une molécule d'intérêt immunogène.
L'invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention pour son utilisation pour la vaccination. L'invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention comprenant au moins une molécule d'intérêt capable d'induire une réaction immunitaire pour son utilisation pour la vaccination. L'invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l'invention comprenant au moins une molécule d'intérêt capable d'induire une réaction immunitaire pour son utilisation en tant que vaccin.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est utilisé pour une vaccination préventive. Dans un autre mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est utilisé pour une vaccination thérapeutique.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention est utilisé en tant que vaccin anti-cancer. Dans un mode de réalisation préféré, ie liposome, Iipoplexe on lipopolyplexe de l'invention est utilisé pour une vaccination thérapeutique dans le traitement du cancer.
Dans un mode de réalisation, le terme « cancer » ou « tumeur » inclut toutes les maladies prolifératives. Dans un mode de réalisation, les maladies prolifératives comprennent les néoplasmes, les dysplasies, les lésions prémalignes ou précancéreuses, les croissances cellulaires anormales, les tumeurs malignes, et les cancers ou métastases. Dans un mode de réalisation, le cancer est sélectionné parmi le groupe comprenant la leucémie, le cancer du poumon non-à-petites cellules, le cancer du poumon à petites cellules, le cancer du système nerveux central (SNC), le mélanome, le cancer de l'ovaire, le cancer du rein, le cancer de la prostate, le cancer du sein, le gliorne, le cancer du côlon, le cancer de la vessie, le sarcome, le cancer du pancréas, le cancer colorectal, le cancer de la tête ou du cou, le cancer du foie, le cancer des os, le cancer de la moelle épinière, le cancer de l'estomac, le cancer de l'intestin, le cancer de l'œsophage, le cancer de la thyroïde, le cancer hématologique, et le lymphome.
Dans un mode de réalisation, le cancer est un cancer du sein, un mélanome ou carcinome hépatocellulaire. Dans un mode de réalisation, le cancer du sein est un cancer du sein triple-négatif, c'est-à-dire un cancer du sein caractérisé par l'absence d'expression des récepteurs aux estrogènes, des récepteurs à la progestérone et de HER2 (human epidennal growîh factor receptor 2) par les cellules cancéreuses.
Dans un mode de réalisation, le liposome, iipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention utilisé en tant que vaccin anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique encodant un antigène tumoral. Dans un mode de réalisation, le liposome, iipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique encodant un antigène tumoral.
Dans un mode de réalisation, le liposome, iipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique codant un antigène tumoral choisi dans la liste non exhaustive comprenant : CDK4 (cy clin- dépendent kinase 4), plS1"1 4'3, AFP, β- caténine, caspase 8, p53, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLÏ, NY- ESO-I, les membres de la famille MAGE {Melanoma-associated antigen) MAGE-AÏ, MÀGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE- 10, MAGE- 12, BAGE, DAM- 6, DAM-10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-1, GAGE-2, GAGE- 3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE- 8, NA-88A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (hurnan papilioma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MARX- 1 /M élan- A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 (tyrosinase-related protein), PSA, PSM, MCIR, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, liTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME, RU1 , RU 2, SART-1 , SART-2, SART-3, et WT1. Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou iipopoiypiexe de Γ invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique codant un antigène tumoral choisi dans la liste non exhaustive comprenant : CAP-1, CD 4/m, les protéines de surface cellulaire de la famille Claudine CLAUD1N-6, CLAUDIN-18.2 et CLAUDIN-12, c-myc, CT, Gn'T-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NF 1, NY-BR-1, protéinase 3, SAGE, SCGB3A2, SCP1 , SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI/m, TPTE, CDK4 (cyclin-dependent kiriase 4), plS1"1'4'3, AFP, β-caténine, caspase 8, p53, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLI, Y-ESO-I, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antigen) MAGE-AÏ, MAGE-A2, M AGE- A3, M AGE- A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-AIO, M AGE-A 11 , MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, BAGE, DAM-6, DAM-10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (hurnan papilioma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MART- 1 Meian-A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 (tyrosinase -relaîed protein), TRP-2-INT2, PSA, PSM, MCIR, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME, RUI , RU2, SART-1, SART-2, SART-3, WT et WT1 . Selon un mode de réalisation, le liposome, iipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique codant un antigène tumoral choisi parmi la liste comprenant les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HFV (human papilloma virus), ART-l / elan-A. Selon un autre mode de réalisation, le liposome, Iipoplexe ou lipopolyplexe de l'invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins l'oncoprotéine E7 dérivée du HPV (human papilloma virus) ou au moins un acide nucléique codant l'oncoprotéine E7 ou un peptide de l'oncoprotéine E7.
Dans un mode de réalisation, le sujet est susceptible ou suspecté de souffrir d'une maladie, de préférence une maladie infectieuse ou un cancer.
Des exemples de risques de développement de cancer incluent, mais ne se limitent pas à une prédisposition familiale ou génétique, l'âge, la consommation d'alcool, le tabac, l'exposition à des substances toxiques et/ou cancérigènes, l'exposition à des radiations, l'exposition au soleil, une inflammation chronique, le régime alimentaire, et autres. Des exemples de risques de développement de maladies infectieuses incluent, mais ne se limitent pas à l'exposition à des bactéries, des virus, des champignons, des parasites, et autres.
Dans un mode de réalisation, le terme « maladies infectieuses » inclut toutes les maladies dues à un agent infectieux, tels qu'une bactérie, un viras, un champignon ou autre et les maladies dues à un parasite.
Dans un mode de réalisation, la maladie infectieuse est sélectionnée parmi la grippe, la tuberculose, les pneumonies d'origine bactérienne, les pneumonies d'origine virale, la maladie de Lyme, les infections au virus de rimmunodéfïcience humaine (VIH), et le syndrome d'immunodéfïcience acquise (Sida). Des exemples de maladies causées par un virus incluent, mais ne se limitent pas aux infections au virus de rimmunodéfïcience humaine (VIH), syndrome d'immunodéficience acquise (Sida), infections dAdénoviridae, infections d'alpha-virus, infections d'arbovirus, pneumonies d'origine virale, paralysie de Bell, maladie de Borna, infections par un vims de la famille des Bunyavïridae, infections par un virus de la famille des Caliciviridae, varicelle, rhume, eondylomes acuminés, infections par un coronavirus, infections par le virus Cocksackie, infections par un cytomégalovirus, Chikungunya, dengue, infections par un virus à ADN, infections par un virus à ARN, ecthyma contagieux, encéphalite, encéphalite due à un arbovirus, encéphalite due à l'herpès simplex virus, infections dues au virus Epstein-Barr, érythèmes infectieux, exanthème subit (ou roséole infantile), syndrome de fatigue chronique, infections par un hantavirus, fièvre hémoiTagique virale, maladie à virus Ebola, maladie à vims de Marburg, (hépatite virale ou infections au virus de l'hépatite A (VHÀ), au virus de l'hépatite B (VHB), au virus de l'hépatite C (VHC) ou au vims de l'hépatite D (VHD), herpès labial, herpès simplex, herpès zoster (zona), mononucléose infectieuse, grippe, fièvre de Lassa, rougeole, méningite virale, molluscum contagiosum, variole, oreillons, myélite, infections par un papiilomavims, infections par un papiliomavirus humain (HPV), infections par un virus de la famille des Paramyxoviridae, fièvre à phlébotomes, poliomyélite, infections par un polyomavirus, syndrome postpoliomyélite, rage, infections respiratoires dues au virus respiratoire syncytial (VRS ou RSV pour respiratory syncytial virus, rubéole, syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), panencéphalite sclérosante subaiguë, maladies transmises par les tiques, verrues, fièvre du Nil occidental, maladies virales, infections dues à un virus du genre fiavivirus, fièvre jaune, zika, zoonoses, et autres.
Dans un mode de réalisation, la maladie infectieuse est une maladie due à un virus et sélectionnée parmi le syndrome d'immunodéficience acquise (Sida) ou infection au virus de l'immunodéficienee humaine (VIH), les hépatites virales ou infections au virus de l'hépatite A (V HA), au virus de l'hépatite B (VHB), au vims de l'hépatite C (VHC) ou au virus de l'hépatite D (VHD), et infections par un papiliomavirus humain (HPV).
Des exemples de maladies causées par une bactérie ou un champignon incluent, mais ne se limitent pas aux abcès, actinomyeose, anaplasmose, anthrax, arthrite réactive, aspergillose, baetériémie, infections bactériennes et mycoses, infections par la bactérie Bartonella, botulisme, abcès cérébraux, brucellose (ou fièvre de Malte), infections par une bactérie de la famille Burkholderia, infections par une bactérie du genre Campylobacter, candi dose telles que la candidose causée par Candida albicans, candidose vulvovaginale, maladie des griffes du chat (ou iymphoréticulose bénigne d'inoculation, ou encore lymphogranulome bénin), cellulite, infections du système nerveux central, chancre, infections à chlamydias, choléra, infections à Clostridium, coccidioïdomycoses telles que la coccidioïdomycose causée par Coccidioid.es immitis, ulcère cornéen, infections croisées, blastomycose, cryptocoecose, dermatomycoses, diphtérie, ehrliehiose, empyème pleural, endocardite bactérienne, endophtalmite, entérocolite staphylococcique, érysipèle, infections dues à Escherichia coli, fasciite nécrosante, gangrène de Foumier, gangrène gazeuse, furonculose, infections par une bactérie du genre Fusobaeterium, gonorrhée, infections par une bactérie gram-négative, infections par une bactérie gram-positive, granulome inguinal, hidrosadénite suppurée, histoplasmose, hordéole (ou orgelet), impétigo, infections par une bactérie du genre Klebsielia, légionellose (maladie du légionnaire), lèpre, leptospirose, infections à Listeria, angine de Ludwig, abcès du poumon, maladie de Lyme, lymphogranulome vénérien, mycétome, mélioïdose, méningite bactérienne, infections par Mycobaeteriimi, infections par mycoplasme, mycoses, infections par Nocardia, onychomycose, ostéomyélite, panaris, maladie inflammatoire pelvienne, peste, pneumonies d'origine bactérienne, infections à pneumocoque, infections à Pseudomonas, psittacose, infection puerpérale, fièvre par morsure de rat, fièvre récurrente, infections des voies respiratoires, abcès rétropharyngé, fièvre rhumatismale, rhinosclérome, infections par Rickettsia, fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, fièvre Q, salmonelloses, scarlatine, typhus, typhus exanthématique, septicémie, maladies bactériennes sexuellement transmissibles, choc septique, maladies bactériennes cutanées, maladies infectieuses cutanées, infections à staphylocoques, infections à streptocoques, syphilis, tétanos, maladies transmises par les tiques, teigne, trachome, tuberculose, tularémie, fièvre typhoïde, infections des voies urinaires, ulcère gastrique lié à une infection par Helicobacîer pylori, maladie de Whipple, coqueluche, infections causées par Vibrio, pian, infections par Y ersinia, zoonoses, mucormycose ou zygomucose, et autres.
Des exemples de maladies causées par un parasite incluent, mais ne se limitent pas au paludisme, maladie du sommeil, leishmanioses, toxoplasmose, et autres. Dans un autre mode de réalisation, le sujet souffre d'une maladie, de préférence une maladie infectieuse ou un cancer.
Dans un mode de réalisation, le sujet est un animal, de préférence un mammifère, plus préférentieilemeni un humain. Dans un mode de réalisation, le sujet est un homme. Dans un autre mode de réalisation, le sujet est une femme. Dans un mode de réalisation, le sujet est un enfant.
Un objet de la présente invention est également une méthode pour vectoriser, c'est-à-dire transférer une molécule d'intérêt au travers d'une membrane, comprenant l'utilisation d'un liposome, lipoplexe ou lipopol.ypl.exe selon l'invention. La présente invention concerne également une méthode pour induire une réponse immunitaire chez un sujet comprenant l'administration du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon de l'invention.
La présente invention concerne également une méthode pour vacciner un sujet comprenant l'administration du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon de l'invention, de préférence un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe comprenant au moins une molécule d'intérêt capable d'induire une réaction immunitaire.
Selon un mode de réalisation, la vaccination est préventive. Selon un autre mode de réalisation, la vaccination est thérapeutique.
Dans un mode de réalisation, la méthode pour vacciner un sujet selon l'invention est une méthode de vaccination contre le cancer, de préférence une méthode de vaccination thérapeutique contre le cancer.
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode pour prévenir le cancer chez un sujet comprenant l'administration du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon de l'invention, de préférence un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe comprenant au moins un antigène tumoral ou un acide nucléique encodant un antigène tumoral.
La présente invention concerne également une méthode pour traiter le cancer chez un sujet comprenant l'administration du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon de l'invention, de préférence un liposome, lipoplexe ou Hpopolyplexe comprenant au moins un antigène tumoral ou un acide nucléique encodant un antigène tumoral.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 est un ensemble de graphiques montrant la fixation des lipopolyplexes LPR nus, LPR-MN ou LPR-triMN à des cellules exprimant des récepteurs de types lectines : (A) cellules 293T exprimant ou non le récepteur DC-SIGN ; (B) cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MoDCs) ; (C) cellules mononuclées humaines du sang (PBMCs) ; (D) cellules dendritiques humaines isolées du sang (panDCs). La Figure 2 est un ensemble de graphiques montrant la fixation des lipopolyplexes LPR- MN, LPR-MN diéther ou LPR-triMN à des cellules exprimant des récepteurs de types lectines : (A) cellules dendritiques murines DC 2.4 ; (B) splénocytes murins ; (C) cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MoDCs).
La Figure 3.4 est un ensemble de graphiques montrant l'expression du marqueur d'activation CD80 par des cellules dendritiques MoDCs FITC- ou FITC+ après incubation en présence de concentrations croissantes de lipopolyplexes LPR-MN ou LPR-triMN . Les cellules FITC- n'ont pas capté les lipopolyplexes, les cellules FITC+ ont capté les lipopolyplexes.
La Figure 3B est un histogramme montrant l'expression des marqueurs d'activation HLA-DR et CD83 par des cellules MoDCs ayant été incubées en présence de 2,5 (ug/ml de LPR-MN ou LPR-triMN.
La Figure 4A est un graphique montrant l'expression de la GFP par des cellules dendritiques MoDCs incubées à tO avec des lipopolyplexes LPR-MN contenant l 'ARNm de la GFP puis à t6h avec des LPS (contrôle positif) ou des lipopolyplexes LPR-MN ou LPR-tri N contenant l'ARN contrôle PolyU simple brin (ssPolyU).
La Figure 4B est un graphique montrant l'expression du marqueur d'activation CD80 par des cellules dendritiques MoDCs incubées à tO avec des LPR-MN contenant l'ARNm de la GFP puis à t6h avec des LPS (contrôle positif) ou des LPR-MN ou LPR-triMN contenant l'ARN contrôle PolyU simple brin (ssPoiyU).
La Figure 4C est un histogramme montrant l'expression des marqueurs d'activation CD80, CD83 et HLA-DR par des cellules dendritiques MoDCs incubées dans un premier temps avec des LPR-MN contenant l'ARNm de la GFP pendant 6ii puis dans un second temps avec des LPS (contrôle positif) o des LPR-MN ou LPR-triMN contenant l'ARN contrôle PolyU simple brin (ssPoiyU) pendant 12h heures.
La Figure 5A est un ensemble de photographies montrant les deux sites d'injection (indiqués par des flèches) au niveau du dos de souris ayant reçu 24h (1) et 48h (2) auparavant une injection de PBS, de lipopolyplexes LPR-MN ou de lipopolyplexes LPR- triMN.
La Figure 5B est un ensemble de photographies montrant l'analyse microscopique après marquage hématoxyline-éosme d'une coupe de 10 um de peau au niveau du site d'injection (point 48h) et du ganglion inguinal drainant les sites d'injection de souris ayant reç 24b (1) et 48h (2) auparavant une injection de PBS, de LPR-MN ou de LPR- triMN.
La Figure 6 est un ensemble de photographies montrant l'analyse par microscopie à fluorescence de ganglions poplités prélevés chez des souris ayant reçu 6h auparavant une injection de PBS, de LPR-MN ou de LPR-triMN marqués à la rhodamine. Le marqueur CD 169 (anti-CD 169-APC) permet de visualiser les macrophages résidants du sinus sous- capsulaire ganglionnaire. Les LPR sont visualisés grâce à un marquage à la rhodamine. Le signal rhodamine colocalisé avec le signal CD 169 est indiqué par des astérisques (*). Le signal rhodamine localisé au niveau de cellules aux ramifications étendues n'exprimant pas CD 169 (probablement des cellules dendritiques) est indiqué par des flèches.
La Figure 7 est un ensemble de graphiques montrant : (A) la valeur absolue (nombre) et (B) le pourcentage relatif de cellules dendritiques ; et au sein de ces cellules dendritiques totales, (C) le pourcentage de cellules dendritiques activées (cellules !.y6C · ) et (D) de cellules dendritiques inflammatoires (cellules LY6G+) présentes dans les ganglions drainants le site d'injection prélevés chez des souris ayant reçu 24h auparavant une injection de PBS, de LPR nus, de LPR nus diéther, de LPR-MN, ou de LPR-triMN.
La Figure 8 est un ensemble d'histogrammes montrant le pourcentage de lymphocytes CD4+ (A) et CD8+ (B) exprimant i'interféron-γ après une sensibi lisation par des cellules dendritiques ayant incorporé les lipopolyplexes indiqués contenant l'ARNm de l'oncoprotéine E7 (LPR nus, LPR-MN ou LPR-triMN) suivie d'une stimulation par des cellules dendritiques préalablement chargées avec des peptides E7. En contrôle, l'ARNm est remplacé par un ARN PolyU simple brin (ssPolyU).
La Figure 9 est un ensemble de graphiques montrant : (A) la sécrétion d'interiéron-y par des lymphocytes isolés de la rate de souris vaccinées par des LPR-triM -E7/E7-DC- LAMP administrés par différentes voies (IV : intraveineuse, SC : sous-cutanée, ID : intradermique) ; (B) la sécrétion d'interféron-γ par des lymphocytes isolés de la rate de souris vaccinées à jour 0 et jour 2 avec une injection de PBS, ou de différents LPR (LPR nu, LPR nu diéther, LPR-MN, LPR-triMN) contenant l'ARNm de l'oncoprotéine E7, La Figure 10A est un ensemble de graphiques montrant le volume de la tumeur développée par des souris auxquelles ont été injectées 50000 cellules de la lignée tumorale syngénique TC-1 et qui ont ensuite été vaccinées par du PBS, des LPR-MN-ssPolyU, des LPR-MN-E7/E7-DC-LAMP, des LPR-triMN-ssPolyU ou des LPR-triMN-E7/E7-DC- LAMP. Chaque courbe correspond au volume de la tumeur développée par une souris. Les flèches indiquent les jours auxquels les souris ont été vaccinées (J7 et J9).
La Figure 10B est un graphique représentant le taux de survie de ces souris.
La Figure 11 est un ensemble de graphiques montrant le volume de la tumeur développée par des souris auxquelles ont été injectées des cellules tumorales B16F0 exprimant MARTI (A) ou des cellules tumorales EG7 exprimant OVÀ (B) et qui ont ensuite été vaccinées par du PBS, des LPR-triMN-ssPolyU ou des LPR-triMN contenant l'ARNm de MARTI ou OVA, respectivement. NS : pas de différence statistiquement significative (i.e. p > 0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01. EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-iimitativement l'invention.
Matériels et Méthodes
Résonance Magnétique Nucléaire (RJylN)
Spectromètres à transformée de Fourier BRUKER ARX 400 et BRUiCER Avance 400 (400.13 MHz pour le proton, 100.61 MHz pour le carbone, ENSCR).
Les déplacements chimiques sont exprimés en partie par million (ppm) par rapport au déplacement chimique du solvant deutéré utilisé comme référence. La multiplicité des signaux est explicitée en utilisant les abréviations suivantes : s, singulet; d, doublet ; t, triplet ; q, quadruplet ; m, multiplet ou massif non analysable. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz). Les données spectrométriques 13C ont été déterminées à partir de spectres entièrement découplés et de spectres corrélés 2D hétéron cléaires. Spectrométrie de masse
Spectromètre de masse haute résolution MS/ S ZabSpec TOF Micromass (Centre Régional de Mesures Physiques de l'Ouest, Université de Rennes 1).
Le mode d'ionisation utilisé est l'Electrospray positif (SM-ESI+). La tension d'accélération des ions est de 4kV et la température de la source est égale à 60°C (mode d'introduction par mfusion). Les composés sont dissous au préalable dans du méthanol ou dans du diméth lsulfoxide.
Abréviations
AcOEt : acétate d'éthyie ;
DÏEA : Ν,Ν'-diisopropyléthylamine ;
Eb : température d'ébullition ; EP : éther de pétrole ;
Et : ét yle ;
EtOH : éthanol ;
HRMS : spectrométrie de masse haute résolution ;
e : méthyle ;
MeOH : méthanol ;
ppm. : partie par million ;
RMN : résonance magnétique nucléaire ;
TBTU : tétrafluoroborate de 0-(benzotriazol- 1 -yl)- 1 ,1,3 ,3-tétraméth luronium ;
TEMPO : 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine- l-oxyle ;
THF : tétrahydrofurane.
Synthèse du ligand tri-mannosylé acide carboxylique (comportant un espaceur oligo(propylène glycoï n où n = 2)
Étape 1 : Benzylation du pentaerythritol triallyl éther
A une suspension d'hydrure de sodium NaH (2.6 g, 90 mmol) dans le DMF anhydre (100 niL), est ajouté goutte à goutte le pentaérythritol allyl éther (7.70 g ; 300 mmol) commercial préalablement purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant cyclohexane/acétate d' éthyle : 9/1 , v/'v). Le milieu est agité 2 heures à 0°C puis du bromure de henzyle (7.7 g, 450 mmol) est ajouté goutte à goutte à cette température. Le milieu est laissé sous agitation à température ambiante pendant 17 heures puis du MeOH (6 mL) est ajouté goutte à goutte à 0°C. Les solvants sont évaporés sous vide à l'évaporateur rotatif puis à la pompe à palettes. Le résidu jaunâtre est repris dans du diehlorométhane puis est lavé à l'eau et par une solution aqueuse saturée en NaQ. La phase organique est séchée sur MgS04 et concentrée sous vide. Le produit brut est purifié par ehrornatographie sur colonne de gel de silice (éluant : EP/AcOEt) : 9/1, v/v) pour fournir le dérivé benzylé (10.45 g) sous la forme d'une huile incolore avec un rendement quantitatif.
RMN ' 1 1 (CDC13, 400 MHz) Ô (ppm) :
3.50 (6H, s, H3), 3.56 (2H, s, H2), 3.95 (6H, dt, J = 5.3, 1.5 Hz, H4), 4.65 (2H, s, Hl), 5.12 (3H, dq, J = 10.4, 1.7 Hz, H6a), 5.24 (3H, dq, J = 17.2, 1.7 Hz, H6b), 5.87 (3H, m, H5), 7.24-7.35 (7H, m, Har). Etape 2 : Hydroboration-oxydation
Le composé triailyle (10 g, 28.8 mmol) est dissous dans 50 mL de dioxane anhydre. Le 9-BBN (0.5 M dans THF) (519 mL, 0.259 mol) est ajouté au milieu réactionnel préalablement refroidi à 0°C et le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. La soude 3 M (577 mL, 75 éq.) et le peroxyde d'hydrogène 10 M (115 mL 1.15 mol) sont ajoutés à 0°C au milieu réactionnel et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Le mélange est extrait 3 fois à P AcOEt puis la phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, concentrée sous pression réduite et purifiée par ehrornatographie sur gel de silice (éluant AcOEt/EP/MeOH : 10/5/1) pour donner 9.57 g de triol sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 83%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) :
1.75 (6H, , J - 5.5, 5.3 Hz, 1 15 ). 3.28 (3H, s.large, OH), 3.42 (6H, s, H3), 3.44 (2H, s, H2), 3.56 (6H, t, J = 5.5 Hz, H4), 3.70 (6H, t, J = 5.3 Hz, H6), 4.62 (2H, s, Hl), 7.24-7.35 (7 H, m, Har).
Étape 3 : Allylation du trio!
Le triol (7.8 g, 19.4 mmol) est dissous dans 100 mL de DMF anhydre et est ajouté goutte à goutte au milieu réactionne! contenant l 'hydrure de potassium (3.9 g, 97 mmol) dans le DMF préalablement refroidi à 0°C. Le mélange est agité 10 minutes à 0°C avant d'introduire goutte à goutte le bromure d'allyle (8.35 mL, 97 mmol). L'agitation est prolongée 24 heures à température ambiante et l'excès d'hydrure de potassium est hydrolysé avec 100 mL d'eau distillée. Le milieu réactionnei est extrait 3 fois à Péther diéthylique puis la phase organique est lavée avec une solution saturée aqueuse de NaCl, séchée sur MgS04, filtrée, concentrée sous pression réduite et purifiée par chromatographie sur gel de silice (é tuant EP/AcOEt : 85/15) pour donner 8.63 g du produit triallyle sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 78%.
RM ' Π (CDC13, 400 MHz) 6 (ppm) :
1.81 (6H, q, J = 6.4 Hz, H5), 3.40 (6H, s, H3), 3.44-3.50 (14H, m, H2, H4, H6), 3.95 (6H, ddd, J - 5.7, 1.5, H7), 4.48 (2H, s, Hl), 5.15 (3H, ddd, J - 10.3, 3.3, 1.5 Hz, H9b), 5.26 (3H, ddd, J = 17.3, 3.5, 1.5 Hz, H9a), 5.90 (3H, ddt, J = 10.3, 6,8, 5.7 Hz, H8), 7.24-7.35 (7Π. m, Har). Etape 4 : Hydroboration-ox 'dation
A une solution du triallyie (7.9 g, 15 mmol) dissous dans 50 mL de dioxane anhydre est ajouté à 0°C le 9-BBN (0.5M dans THF) (272 mL, 0.136 mol) et le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. La soude 3 M (500 mL, 1 .5 mol ) et le peroxyde d'hydrogène 35% aqueux (60 mL, 0,6 mol) sont ajoutés à 0°C au milieu réactionnel et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Le mélange est extrait 3 fois à PAcOEt, séché sur MgS04, filtré, concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant AcOEt/EP/MeOH : 10/5/1) pour donner 8.51 g de triol sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 99%.
RMN ' I l (CDC13, 400 MHz) Ô (ppm) :
1.79 (12H, p, J = 5.7 Hz, H8, H5), 2.62 (3H, s.large, OH), 3.42 (6H, s, H3), 3.49-3.43 (14H, m, H2, i 14. H6), 3.55 (6H, t, J = 5.7 Hz, H7), 3.73 (6H, t, J - 5.4 Hz, H9), 4.64 (2H, s, Hl), 7.24-7.35 (7H, m, Har). Etape 5 : Glycosyiation du triol
A une solution de trichloroacétimidate (10 g, 13.4 mmol) et de triol ( 1.03 g, 1.79 mmol) solubilisés dans 125 mL de CH2CI2 anhydre est ajoutée la solution à 5% dans le CH2C12 de TMSOTf (640 ,uL, 0.179 mmol) et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 2 g de bicarbonate de sodium à la réaction, le milieu réactionnel est filtré, le précipité est rincé plusieurs fois au CH2CI2 et le filtrat est concentré sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant EP/AcOEt : 6/4) pour donner 3.44 g de produit tri-marmosylé sous la forme d'une poudre jaune clair avec un rendement de 82%).
V1N Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) :
1.77-1.84 (6H, m, J = 6.4 Hz, H5) , 1.91-2.00 (6Η, m, Η8), 3.41-3.57 (26Η, m, H2, H3, H4, 1 16. I I7 î. 3.57-3.68 (3H, m, H9b), 3.90-3.96 (3H, m, H9a), 4.40-4.50 (3H, m, \ \5' 4.46-4.50 (5H, m, Hl, H6b'), 5.08 (3H, d, J = 2.0 Hz, Hl '), 5.70 (3H, dd, J = 3.2, 1.8 Hz, H2'), 5.91 (3H, dd, j = 10.1 , 3.3 Hz, H3'), 6.1 1 (3 H, t, J+10.1 Hz, H4'), 7.24-8.11 (65H, m, Har).
Étape 6 : Débenzvhition■■ oxydation
A une solution de benzyl éther (3.44 g, 1.49 mmoi) dissous dans 30 mL d'un mélange CEbCk/MeOH (4/1 ) est ajoutée à température ambiante le Pd/C (340 mg, 10% en masse). Le milieu réactionnel est agité sous atmosphère d'hydrogène une nuit à température ambiante. Le milieu est dilué avec du CH2CI2, filtré sur celite puis concentré sous vide. Le composé est ensuite purifié par chromatographie sur gel de silice (éiuant Cyclohexane/AcOEt : 6/4) pour donner 2.61 g d'alcool sous la forme d'une poudre blanche avec un rendement de 79%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) :
1.81 (6H, p, J = 6.4 Hz, H5) , 1.93 (6H, p, J - 6.4 Hz, 1 18 }. 3.04 i l I L t, J - 6.1 Hz, OH), 3.43 (6H, s, H3), 3.47 (6H, t, J = 6.3 Hz, H6), 3.50 (6H, t, J = 6.5 Hz, H4), 3.55 (6H, m, H7), 3.68 (5H, m, H9a, H2), 3.91 (3H, dt, J = 9.7, 6.4 Hz, H9b), 4.39-4.43 (3H, m, H5'), 4.47 (3H, dd, J == 12.0, 4.2 Hz, H6a'), 4.68 (3H, dd, J = 12.0, 2.4 Hz, H6b'), 5.07 (3H, d, J = 1.7 Hz, Hl '), 5.69 (3H, dd, J = 3.3, 1.7 Hz, H2'), 5.91 (3H, dd, J = 10.1, 3.3 Hz, H3'), 6.1 1 (3H, t, J = 10.1 Hz, Η4'), 7.23-7.41 (20H, m, Har méta), 7.41-7.58 ( 20H, m, Har para), 7.82-8.08 (20H, m, Har ortho).
RMN 1 C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) :
29.69 (C8), 29.95 (C5), 44.81 (C3a), 62,84 (C6'), 65.56 (C9), 66.05 (C2), 66.94 (C4'), 67.37 (C7), 68.1 1 (C4), 68.67 (C6), 68.78 (C5 '), 70.14 (( 3 . 70.53 (C2'), 71.46 (C3), 97.61 (Cl '), 128.28 (CHar méta), 128.42 (CHar méta), 128.56 (CHar méta), 128.99 (Cqar), 129.09 (Cqar), 129.35 (Cqar), 129.72 (CHar ortho), 129.78 (CHar ortho), 129.83 (CHa ortho), 129.87 (Cqar), 133.03 (CHar para), 133.14 (CHar para), 133.41 (CHar para), 165.39 (COPh), 165.44 (COPh), 165.49 (COPh), 166.13 (COPh). A une solution de l'alcool (614 mg, 0.275 mmol) dissous dans 10 mL d'AcOEt, sont ajoutés 56 μΐ. d'une solution aqueuse de Br 0.5 M (0.028 mmol), le TEM PO (15 mg, 0.096 mmof), puis à 0°C, 1.2 mL de NaOCi (0.84 mmol). Après 3 heures à température ambiante, la réaction est arrêtée et acidifiée avec une solution aqueuse d'HCi à 5% (jusqu'à pH = 3), puis 560 Ε de aOaCl (1 .68 mmol) sont ajoutés. Le milieu réactioraiel est agité pendant une nuit à température ambiante (coloration jaune) puis il est extrait trois fois avec l'ÀcQEt. La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgS04, filtrée puis concentrée sous vide pour donner 614 mg d'acide carboxylique sous la forme d'une poudre blanche avec un rendement de 99%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) 6 (ppm) :
1 .83 (6H, p, J = 6.3 Hz, H5), 1 .96 (6H, p, 3 - 6.2 Hz, H8), 3.51 (6H, t, J = 6.3 Hz, H6),
3.53 (6H, t, J = 6.1 Hz, H4), 3,56 (6H, m, H7), 3.64 (6H, s, H3), 3,66 (3H, td, J = 9.7, 6.4 Hz, H9b), 3,94 (3H, td, J = 9.7, 6.4 Hz, H 9a ). 4,47-4,41 (3H, m, H5'), 4.49 (3H. dd. J = 12.0. 4.2 Hz, H6b), 4,71 (3H, dd, J = 12,0, 2.4 Hz. H6a), 5,10 (3H, d, J = 1.7 Hz, ΗΓ), 5,70 (3H, dd, J - 3.3, 1.7 Hz, H2'), 5,92 (3H, dd, J = 10.1 , 3.3 Hz, l i.V). 6, 13 (3H, t, j = 10.0 Hz, H4'), 7,59-7,24 (36H, m, Har), 8, 1 1-7,82 (24H, m, Har). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) :
29.60 (C8), 29.77 (C5), 52.86 (C3a), 60.34 (C2) 62.79 (C6'), 65.46 (C9), 66.85 67.31 (C7), 67.87 (C6), 68.59 (C4), , 68.73 (C5'), 69.07 (C3), 70.13 (C3'), 70.49 (C2'), 97.55 (Cl'), 128.24 (CHar), 128.38 (CHar), 128.52 (CHar), 128.92 (Cqar), 129.00 (Cqar), 129.27 (Cqar), 129.68 (CHar), 129.73 (CHar), 129.78 (Cl !ar). 133.02 (CHar), 133.12 (CHar), 133.37 (CHar), 133.39 (CHar), 165.39 (COPh), 165.42 (COPh), 165.50 (COPh), 166.15 (COPh), 173.45 (COOH).
Synthèse du lipide tri-mannosylê à partir du diéther acide earboxyUque et du ligamd tri- mannosylé acide earboxyUque (espaeeur oligofpropylène glyeol n où n ~ 2 et un espaeeur polyéthylène glycol (PEG)m où m ~ 5)
Étape 7 : Introduction de la chaîne PEG sur le diéther de lipides acide earboxyUque
A un mélange du diéther de lipides acide carboxvîique (291 mg, 0.831 mmoi) et du TBTU (347 mg, 1.08 mmoi) dans du CH2CI2 anhydre (15 mL), est additionnée sous atmosphère d'argon la DIEA (188 μί, 1.08 mmol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes sous atmosphère d'azote. Une solution du N3-PEG350-NH2 (291 mg, 0.831 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 mL) est ajoutée sous atmosphère d'azote. Le milieu réactionnei est agité à température ambiante pendant 12 heures sous atmosphère d'azote. Une solution aqueuse d'acide ch.lorhydri.que IN est ajoutée et la phase organique (pH = 1) est lavée par de l'eau. Les phases organiques sont regroupées, séchées (MgSG- , filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu est purifié par ehrornatographie sur colonne de silice (éluant CH?.Cl?/MeOH : 98/2) pour isoler le produit de couplage azoture (700 mg, 89%) sous la forme d'une huile incolore.
RMN Ή (CDCL3, 400 MHz) 6 (ppm) :
0.83-0.87 (m, 18H, 6 CH.- ). 1 .04-1 .78 (m, 52H, 24 CH2, 4 CH), 3.37-3.40 (m, 2H, H-f), 3.41-3.50 (m, 4H, H-a, H-4), 3.53-3.57 (m, 4H, H-b, H-5), 3.58-3.69 (m, 23H, PEG, H- e, H-3a), 3.75-3.78 (m, 1H, Η-3β), 3.88-3.90 (dd, J = 2.5.1 , 5.92 Hz, 1H, H-2), 7.02-7.05 (m. i l !. M ICO).
RMN ! 3C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) :
14.10 ( CH.: ). 19.58, 19.65, 19.72 (3 CH . 22.60, 22.69 (2 CH3), 22.66, 24.36, 24.47, 24.78, 26.03 (5 CH2), 27.94, 29.84, 32.76, 32.78 (4 CH), 29.34, 29.46, 29.52, 29.63, 29.68, 31.89, 37.26, 37.36, 37.39, 37.45, 37.50, 39.32 (19 CH2), 38.67 (C-a), 50.63 (C- fh 69.72 (C-5), 69.83 (C-b), 70,3-70,7 (C-PEG, C-e), 71 .47 (C-3), 71.68 (€-4), 80.48 (C- 2), 170.57 (C-l).
Étape 8 : Réduction de la fonction azoture
A une solution d'azoture (212 mg, 0.224 mmol) dans un mélange THF/H2O (25 mL, 1/1 ) est ajouté la triphénylphosphine (88 mg, 0.337 mmol) par portion. Le mélange est. agité à température ambiante pendant 18h. Après concentration sous pression réduite, le résidu est purifié sur ehrornatographie de gel de silice (CH2Cl2/MeOH : 9/1) pour isoler l'aminé (164 mg, 80%) sous la forme d'une huile jaune clair.
RMN ¾ ((1X 13. 400 MHz) δ (ppm) :
0.82-0.88 (m, 18H, 6 CH3), 0.99-1.69 (m, 52H, 24 CI¾, 4 CH), 3.16-3.18 (m, 2H, H-f), 3.39-3.49 (m, 4H, H-a, H-4), 3.54-3.57 (ni, 4H, H-b, H-5), 3.59-3.70 (m, 18H, PEG), 3.72-3.75 (m, 3H, H-c, H-3a), 3.76-3.77 (m, 1 H, Η-3β), 3.87-3.90 (m, 3H, 1:1-2, H -c i. 7.04-7.06 (m, 1H, M ICO).
RMN 1 C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) :
14.10 (Cï-h), 19.58, 19.65, 19.72 (3 CH3), 22.61 , 22.71 (2 CH3), 22.66, 24.34, 24.45, 24.76, 26.00 (5 CH2), 27.95, 29.77, 29.85, 32.79 (4 CH), 29.32, 29.45, 29.54, 20.61, 29.66, 31.88, 37.23, 37.34, 37.37, 37.43, 39.31 (19 CH2), 38.70 (C-a), 40.45 (C-f), 66.89 (C-e), 69.72-70.53 (C-PEG, C-5, C-b), 71 .45 (C-3), 71.70 (C-4), 80.47 (C-2), 170.63 (C- 1).
Étape 9 : Couplage entre le ligand tri-mannosylé acide carboxylique et le lipide aminé
A un mélange du le ligand tri-mannosylé acide carboxvlique (575 mg, 0.257 mmol) et du TBTU (124 mg, 0.386 mmol) dans du CH2CÎ2 anhydre (70 mL), est additionnée sous atmosphère d'argon la DIEA (1 12 μΕ, 0.643 mmol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes sous atmosphère d'azote. Une solution du lipide aminé (335 mg, 0.365 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (50 mL) est ajoutée sous atmosphère d'azote. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures sous atmosphère d'azote. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique I N est ajoutée (pH = 1 ) et la phase organique est lavée par de l'eau. Les phases organiques sont regroupées, séchées (MgSO-i), filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant Cyclohexane/AcOEt : 1 : 1 + 2% MeOH) pour isoler le produit de couplage azoture (500 mg, 62%) sous la forme d'un solide translucide.
RMN ¾ ((1X 13. 400 MHz) δ (ppm) :
0.83-0.89 (m, 21 H, (Ί Ι. 1-1.59 (m, 68Η, chaînes alkyles) , 1.79-1.86 (6H, q, H5), 1.93- 1.99 (6H, q, H8), 3.40-3.68 (65H, m, H3, H4, H6, H7, H9b, Hia, Hj, Hl , HPEG), 3.75- 3.78 (m, 1H, Ch)3.88-3.95(4H, m, H9a, Hib), 4.40-4.44 (3H, m, H5'), 4.48 (3H, dd, j = 4.1 , 12.0Hz, H6b'), 4.69 (3H, dd, J = 2.1, 12.1 Hz, H6a'), 5.09 (3H, d, J = 1.8 Hz, Η ), 5.69 (3H, dd, J - 1.6, 3.4Hz, H2'), 5.91 (3 H, dd, J = 3.2, 10.31 !/. H3'), 6.1 1 (3H, t, J = 10.3Hz, H4'), 7.24-8.11 (60H, m, Har).
RMN i3C {( ·[.)( 13. 100 MHz) δ (ppm) :
14.12, 19.62 ,19.68, 19.75, 22.63, 22.69 (CH3), 22.72-29.56 (CH2), 29.65 (C8), 29.70 (C5), 29.74, 29.84( C5), 29.91 , 31.10, 31 .43, 31 .63, 31.92, 32.80, 53.03 (C3a), 60.40 (C2), 62.85 (( (Y ). 65.53 (C9), 66.91 (C4'), 67.36 (C7), 67.92 (C6), 68.61 (C4), 68.78 (C5'), 68.95 (C3), 70.15 (C3'), 70.55 (C2'), 80.53 (Ch), 97.64 (Cl '), 128.30 (CHar), 128.44 (CHar), 128.57 (CHar), 129.00 (Cqar), 129.10 (Cqar), 129.35 (Cqar), 129.73 (CHar), 129.79 (CHar), 129.84 (CHar), 129.88 (CHar), 133.05 (CHar), 133.16 (CHar), 133.43 (COPh),165.4 (COPh), 165.50 (COPh), 166.14 (COPh), 170.69 (CONH).
Étape 10 : Synthèse du lipide tri-mannosylé par dêywtection des hvdroxyles des motifs mannose A une solution du lipide tri-mannosylé sous forme benzoylé (435 mg, 0.139 mmol) dans un mélange CTfcCh/MeOH (100 mL, 1/1) est ajoutée une solution de MeONa dans le méthanol (5.3M, 48.8 uL, 0.258 mmol) fraîchement préparée. Le milieu réactionne 1 est agité pendant une nuit à température ambiante. Le mélange est neutralisé grâce à l'ajout de résine Amberlite 1R-120 H+ et la résine est filtrée sur coton. Après évaporation des solvants sous pression réduite, un produit jaunâtre gris- pâle visqueux est isolé (255 mg, 97%) correspondant au lipide tri-mannosylé cible.
RMN ' Π (MeOD+CDC13, 70/30, 400 MHz) Ô (ppm) :
0,84-0,89 (m, 21 1 1, CH3), ! 04- ! 56 (m, 68H, chaînes alkyles), ! 79- ! 84 (12H, m. 1 15. H8), 3.31-3.88 (88H, m, H3, H4, H6, H7, H9, Hi, Hj, Hl, Ch, Η3', Η4', Η5', H6', HPEG), 4.74 (3H, s, Hl '), 7.55 (NH, s).
RMN 1 C (MeOD+CDC13, 70/30, 100 MHz) ô (ppm) :
13.66, 19.26, 19.30, 19.33, 19.37, 19.40, 19.44, 22,22, 22.31 , 22.50, 24.24, 24.31, 24.65, 25.92, 27.83, 29.21, 29.32, 29.39; 29.48, 29.50, 29.53, 29.64, 29.68, 29.72, 31.27, 31 ,78, 32.62, 32.64, 32.67, 36.59, 36.65, 36.72, 37.13, 37.23, 37.25, 37.30, 37.36, 37.39, 38.67, 38.95, 39.25, 52.25, 61.45, 64.22, 67.06, 67.52, 67.69, 68.41, 69.43, 69.48, 69.53, 69.61, 70.09, 70.1 1 , 70.23, 70.33, 70.35, 70.37, 70.70, 71 .1 1 , 71.15, 71.33, 71.65, 72.56, 80.34, 80.29, 100.08 (C D. 171.49 (CONH), 173.69 (CONH).
HRMS C194H1182N2034 : m/z théorique = 1906.24662, mesuré = 1906.2448 le 2 : Préparation de liposomes et de iipopolyp exes (LPR) selon l'invention comprenant des lipides tri-mannosy lés (LPR-t riMN)
le lipide KLN25 (0,0-dioléyl-N-[3N-(Nméthylimidazoliumbromure)propylène] phosphoramidate) de formule :
décrit par Mével et al. (Mével et ai, (2008) Synthesis and Transfection Activity ofNew Cationic Phosphoramidate Lipids: High efficiency of an Imidazolium derivative. ChemBioChem. 9, 1462-1471) ; le lipide MM27 (Ο,Ο-dioléyl (-N-(histamine)phosphoramidate) de formule :
décrit par Mével et al, (Mével et al, (2008) Novel neutral imidazoie-iipophosphoramides or transfection assays. Chem. Comm. 21 :3124-3126) ; le l-0-carboxyl-2-0-Phytanyl-3-0-hexadecane-s«-glycérol (diéther de lipides possédant une fonction acide carboxylique) de formule :
le lipide mono-mannosyié (β-D-mannopyranosyl-N-dodecylhexadecanamide) de formule : décrit par Perche et al., (Perche et al, (2011) Sélective gene delivery in dendritic ceiis with Mannosylated and Histidylated Lipopolyplexes. J Drug Targeting. 19: 315-325) ; le lipide marqué avec la fluorescéine (Lip-F3.u) de formule
décrit par Berchel et al., (Berchel et al, (201 1 ) Moduiar Construction of Fluorescent Lipophosphoramidates by Click Chemistry. Eur. J. Org. Chem 31 : 6294-6303) ; le lipide marqué avec la rhodamine (Lip-Rho) de formule :
décrit par Berchel et al., (Berchel et al., (201 1) Modular Construction of Fluorescent Lipophosphoramidates hy Click Chemistry, EUT. J. Org. Chem 31 : 6294-6303).
Liposomes Les liposomes sont préparés selon la méthode d'hydratation d'un film lipidique sec et dialysés contre un tampon HEPES 10 mM, pH 7,4 (Piehon C, idoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination wiih Tumor Antigen mRNA, Methods Mol Biol. 969:247-74).
Les compositions des liposomes utilisés sont ;
- liposomes nus : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25 et MM27 à
50%-50% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides ;
liposomes diéther ou liposomes nus diéther : liposomes constitués d' un mélange de lipides KLN25, M 27 et de l -0-carboxyl-2-< -Phytanyl-3-O-hexadecane-5'«- glycérol (diéther de lipides) à 47,5% - 47,5% - 5%o respectivement ;
liposomes mono-mannosylés (MN ) : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27 et lipide mono-mannosylé (β-D-mannopyranosyl-N- dodecyihexadecanamide) à 47,5% - 47,5% - 5% respectivement ;
liposomes mono-mannosylés diéther : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé et de 1 -O-carboxyl-2-O-
Phytanyi-3-O-hexadecane-sw-glycérol (diéther de lipides) à 45% - 45% - 5% - 5% respectivement ; liposomes tri-mannosylés (triMN) : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27 et lipides tri-mannosylé de l'invention (dont la synthèse est décrite dans l'exemple 1 ) à 47,5% - 47,5% - 5% respectivement. compositions des liposomes fluorescents utilisés sont :
liposomes nu-Flu : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27 et Lip-Flu à 49,75%> - 49,75% - 0,5% respectivement ;
liposomes nu-Rlio : liposomes constitués d'un mélange de lipides LN25, MM27 et Lip-Rho à 49,75% - 49,75% - 0,5% respectivement ;
liposomes diéther-Flu : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, de l-O-carboxyi-2-0-Phytanyl-3-O-hexadecane-5«-glycérol et Lip-Flu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ;
liposomes diéther-Rho : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, M27, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-0-hexadecane-.çn-glycéroi et Lip-Rho à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ;
liposomes mono-mannosylés Flu : liposomes constitués d'un mélange de lipides LN25, MM27, lipide mono-mannosyié (β-D-mannopyranosyl-N- dodecylhexadecanamide) et Lip-Flu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ;
liposomes mono-mannosylés Rho : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosyié et Lip-Rho à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ;
liposomes mono-mannosylés diéther Flu : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosyié, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl- 3-O-hexadecane-,în-glycérol et Lip-Flu à 44,75% - 44,75% - 5% - 5% - 0,5% respectivement ;
liposomes mono-mannosylés diéther Rho : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosyié, de 1 -O-earboxyl-2-O-Phytanyl- 3-O-hexadecane-SM-glycéro! et Lip-Rho à 44,75% - 44,75% - 5% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes tri-mannosylés Flu : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipides tri-mannosylé de l'invention (dont la synthèse est décrite dans l 'exemple 1) et Lip-Fiu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0.5% respectivement ; - liposomes tri-mannosylés Rho : liposomes constitués d'un mélange de lipides KLN25, MM27, lipides tri-mannosyié de l'invention et Lip-Rho à 47,25% -
47,25% - 5% - 0.5% respectivement.
Polymère c tionique
L'ARNm a été complexé avec la polylysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa (PEG-HpK) dont la synthèse est décrite dans (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylaîed and, Histidyl ted LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Methods Mol Biol. 969:247-74).
Lipopolyplexes (LPR)
Les différents LPR sont préparés selon la méthode décrite dans (Pichon C, Midoux P. (2013 ) Mannosylaîed and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA, Methods Mol Biol. 969:247-74).
En particulier, pour une transfection in vitro, les LPR sont obtenus de la manière suivante. Brièvement, 15 μ§ de PEG-HpK (dans 10 μΐ. de tampon 10 mM HEPES pH 7,4) sont d'abord ajoutés à PARNm (5 μg dans 25 μL de tampon 10 mM HEPES pH 7,4). L'ensemble est vortexé pendant 4 sec puis laissé au repos pendant 30 min à 20°C. Les LPR sont ensuite formés en ajoutant 10 μg de liposomes (5 μΐ. à 5,4 mM dans 10 mM HEPES buffer, pH 7,4) en agitant la solution par pipetage aller-retour. La solution est laissée au repos pendant 15 minutes at 20°C avant usage. Pour la transfection in vitro, le volume de solution est ajusté à 1 ml avec du milieu sans sérum.
Pour une injection in vivo, les LPR sont obtenus en ajoutant préalablement 50 μΐ (50 μg) d'ARNm dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 160 μΐ de tampon HEPES 10 mM à pH 7,4 stérile préparé dans de l'eau sans endonuciéase. 100 μΐ (150 ag) de la solution de PEG-HpK sont ensuite ajoutés et mélangés 4 secondes. Après 30 min à 20°C, 50 μΐ, de liposomes (100 g dans tampon HEPES 10 mM à pH 7,4 stérile préparé dans de l'eau sans endonucléase) sont ajoutés au complexe polymère/ ARNm et mélangés doucement par pipetage. La solution est laissée au repos pendant 15 min à 20°C. Pour l'injection in vivo, la solution est ajustée à une concentration finale en saccharose de 5% en ajoutant 40 μΐ d'une solution de saccharose à 50% préparée dans de l'eau sans endonucléase. Les souris sont injectées avec 100 μΐ de solution.
Sauf indication contraire, les lipopolyplexes (appeiés LPR) utilisés dans les expériences décrites contiennent l'ARN contrôle PolyU simple brin (ssPoiyU).
Les différents LPR (LPR nus, LPR diéther ou LPR nus diéther, LPR-MN, LPR-MN diéther, LPR-triMN) sont obtenus en mélangeant les liposomes correspondants (liposomes nus, liposomes diéther ou liposomes nus diéther, liposomes MN, liposomes MN diéther, liposomes triMN) avec un polymère cationique (ARN complexé avec la polylysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa),
Exemple 3 : Utilisation biologique des liposomes de l'invention
Matériel et Méthodes Lignées cellulaires
La lignée cellulaire 293T est une lignée cellulaire dérivant de cellules embryonnaires humaines rénales transformées.
La lignée cellulaire 293T DC-SïGN correspond à des cellules 293T génétiquement modifiées pour exprimer DC-SIGN, une iectine de type C. Les cellules MoDCs sont des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes.
Les cellules PBMCs sont des cellules mononuciées du sang.
Les cellules panDCs sont des cellules dendritiques humaines identifiées au sein des autres cellules du sang périphérique (PBMCs). ELI Spot înterféron -y
La sécrétion d'interféron-γ par les lymphocytes T provenant de la rate (splénocytes) est analysée à l'aide du kit IFN-γ ELISpotPLUS (Mabtech, Suède). Brièvement les splénocytes à analyser sont incubés dans une plaque ELïSpot en présence de l'antigène E749-57 ou de concanavaline A (contrôle positif) ou de milieu de culture (contrôle négatif). L'interféron- γ sécrété est capturé par des anticorps fixés à la plaque. Après une incubation de 36b à 37°C, la plaque est lavée et les cellules sont retirées. La plaque est ensuite incubée avec un anticorps biotinylé dirigé contre l'interféron-y puis avec de la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline. La présence de spots correspondant à une sécrétion d'interféron- γ est révélée après incubation avec le tampon de réaction BCIP/NBT. Les spots sont analysés par un lecteur de plaque ELISpot. qRT-PCR
Les ARN totaux ont été extraits d'échantillons de peau à l'aide du kit ReliPrep RNA Tissue Miniprep System (Z6112, Promega), en suivant les instructions du fournisseur. Les ARN ont ensuite été rétrotranscrits en ADNc à l'aide du kit Go Script Reverse Transcription System (A5000, Promega), selon les instructions du fournisseur. Les réactions de PCR quantitative en temps réel SYBR green (qRT-PCR) ont été réalisées sur la plateforme iGenSeq (Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, Paris, France) avec les amorces décrites dans le Tableau 1. Les résultats ont été analysés avec le logiciel 1536 Ligbtcycler (Roche, Bâle, Suisse) et l'expression des gènes a été quantifiée par la méthode relative des ACT, normalisée par l'expression des gènes références β-actine et GAPH.
Amorces utilisées pour les réactions de RT qPCR
Gène Amorce Séquence SEQ ID NO
Sens ACTCTCCATCCACCGAATTG 1
CCR7
Antisens CCTCATGTCAACCTGACTGG 2
Sens TCCAGAATGTGTGGTAAATTGAA 3
CXCR4
Antisens TCGGAATGAAGAGATTATGCAG 4
Sens ÀGTTGACGGACCCCAAAAG 5
ΙΙ,Ι β
Antisens AGCTGGATGCTCTCATCAGG 6
Sens CCAGAGGTAACCCACGTCAG 7
MMP9
Antisens CTTCAAGTCGAATCTCCAGACA 8
PGE2R1 Sens TGGCTTCATATTCAAGAAACCAG 9 Antisens GGTACACGCGTGACTTTCG 10
Sens AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG 11 β-actine
Antisens AAGCAATGCTGTCACCTTCCC 12
Sens < Π·Λ Γ! ·( :·(Ί Ο{ Π·(·Λ{ c 13
GAPDH
Antisens CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG 14
Les LPR-triMN ciblent les cellules exprimant des récepteurs de type lectines
Dans une première expérience, différentes lignées cellulaires ont été incubées avec différentes concentrations de l.i popol.yplex.es nus (LPR.), de lipopolyplexes mono- mannosylés (LPR-MN) ou de lipopolyplexes tri-mannosylés (LPR-triMN). Les lipopolyplexes comprennent tous un lipide fluorescent couplé à la fiuorescéine. Les lignées cellulaires testées expriment à leur surface des lectines de type C, capables de fixer des résidus sucrés mannose, galactose ou fiicose. La fixation des lipopolyplexes sur ces récepteurs est analysée par cytométrie de flux. Les lipopolyplexes tri-mannosylés ciblent les cellules 293T DCSign (figure 1À), les cellules MoDCs (figure 1B), les cellules PBMCs (figure 1C) et les cellules panDCs parmi les PBMCs (figure 1D). Dans une moindre mesure, les lipopolyplexes mono-mannosylés (LPR-MN) sont également capables de se fixer sur ces cellules (figure 1). Les lipopolyplexes nus ne comprennent pas de lipides possédant un groupe mannose et ne ciblent aucune de ces cellules quelle que soit, la concentration de lipopolyplexes testée (figure 1). Dans une deuxième expérience, trois lignées cellulaires différentes ont été incubées avec des concentrations croissantes de lipopolyplexes mono-marmosylés (LPR-MN), de lipopolyplexes mono-mannosylés diéther (LPR-MN diéther) et de lipopolyplexes tri- mannosylés (LPR-triMN). La figure 2 montre que les LPR-MN et LPR-MN diéther ciblent de manière identique les cellules dendritiques d'une lignée murine, les splénocytes murins et les cellules MoDCs. Les LPR-triMN se fixent à ces trois types de cellules de manière significativement plus importante, même à une faible concentration (1 ,25 ^ig/ml).
La présence de lipides tri-mannosylés de l'invention confère donc aux lipopolyplexes LPR-triMN la capacité de se fixer aux cellules exprimant des récepteurs de type lectines. Cette propriété est spécifique aux lipopolyplexes tri-mannosylés de l'invention, et des lipopolyplexes comprenant des lipides mono-marmosylés (LPR-MN) ou des lipides mono-mannosylés et des lipides diéther (LPR-MN diéther) possèdent une capacité de fixation réduite.
Les LPR-triMN activent les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques MoDCs sont mises en culture en présence de LPS ou de doses croissantes de LPR-MN ou LPR -triMN comprenant des lipides marqués à la fiuoreseéine pendant 6h. L'analyse par cytométrie permet d'identifier les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR. Par ailleurs l'expression des marqueurs d'activation H LA- DR, CD80 et CD 83 est également mesurée.
Les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR-MN n'expriment pas de marqueurs d'activation de manière significative par rapport au contrôle d'activation LPS (figures 3À et 3B). Les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR-triMN expriment les marqueurs d'activation HLA-DR, CD80 et CD83 de manière dose dépendante (figure 3A) et significative par rapport au contrôle d'activation LPS (figure 3B). La présence de lipides tri-mannosylés de l'invention confère donc aux LPR-triMN la propriété intrinsèque d'activer les cellules dendritiques auxquelles ils se fixent. Les cellules dendritiques activées exprimant des molécules de co-stimulation telles que CD80 permettent à leur tour l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+, Les LPR-triMN sont donc capables de stimuler une réponse immunitaire alors mêmes qu'ils ne contiennent pas de molécule d'intérêt immimogène.
Les LPR-triMN ont un effet adjuvant
Dans un premier temps, les cellules dendritiques MoDCs sont mises en culture en présence de LPR-MN contenant de PARNm GFP pendant 6h. Au bout de ces 6h, les cellules MoDCs sont mises en contact 12h supplémentaires avec soit des LPS (contrôle positif d'activation des MoDCs), soit des LPR-MN ou des LPR-triMN. Les lipopolyplexes utilisés pour cette seconde stimulation ne contiennent pas d'ARN codant mais contiennent de l'ARN PolyU simple brin (ssPolyU). L'expression de la GFP et des marqueurs d'activation HLA-DR, CD80 et CD83 est mesurée par cytométrie au bout de 18h de culture au total.
La figure 4 montre que la première incubation des cellules MoDCs avec des LPR-MN induit l'expression de GFP. L'mcubation secondaire des mêmes celluies avec des LPS ou des LPR-triMN ssPolyU fait chuter le niveau d'expression de la GFP (figure 4A) et induit l'expression des marqueurs d'activation CD80 (figure 4B), CD83 et HLA-DR (figure 4C). L'addition de LPR-MN n'induit pas d'activation des celluies dendritiques, ces dernières continuent à exprimer la GFP de manière prolongée.
L'incubation de cellules dendritiques avec des LPR-triMN ssPolyU permet d'induire l'activation de ces cellules. Cette expérience confirme que les LPR-triMN possèdent un effet adjuvant conféré par la présence des lipides tri-mannosyiés.
Les LPR-triMN ont un effet adjuvant in vivo
Dans une première expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique avec du PBS, des LPR-MN ou des LPR-triMN. La figure SA montre que l'injection de LPR- triMN induit une réaction inflammatoire locale au niveau du site de l'injection. L'analyse microscopique du site de l'injection (figure 5B) montre que l'injection de LPR-triMN induit une augmentation de volume des ganglions lymphatiques drainants inguinaux.
De plus, des analyses par qRT-PCR réalisées sur des échantillons de peau montrent une augmentation significative du nombre de produits de transcription des gènes CCR7 et CXCR4 (résultats non présentés). Ces récepteurs sont connus pour jouer un rôle dans la migration des cellules dendritiques de la peau vers les ganglions lymphatiques (Fors ter et al., (1999) CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell 99:23-33; Kabashima et al., (2007) CXCL12-CXCR4 Engagement Is Required for Migration of Cutaneous Dendritic Cells. Am J Pathol. 171 : 1249-57). Les résultats de qRT-PCR révèlent également une augmentation de la transcription des gènes MMP9, IL 1 β et PGE2R1 (résultats non présentés), qui sont impliqués dans la réponse inflammatoire. Dans une seconde expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique au niveau de la voûte plantaire avec du PBS, des LPR-MN ou des LPR-triMN comprenant un lipide marqué à la rhodamine. Les ganglions drainants po li tés des souris ont été prélevés 6h après l'injection puis marqués par un anticorps anti-CD169 (siglec-1). L'analyse par microscopie à fluorescence permet ainsi de visualiser la localisation des LPR (signal rhodamine) et des macrophages du sinus sous-capsuiaire (signal CD169+). La figure 6 montre que les LPR nus, LPR-MN et LPR-triMN, sont détectables dans les ganglions poplités, au niveau de la zone corticale où se situent également des cellules dendritiques (non marquées). Une partie des LPR-triMN est également détectable dans des zones non marquées par CD 169 ce qui indique que d'autres cellules peuvent capter les LPR-triMN. Il est à noter que les cellules dendritiques sont retrouvées dans toutes les zones ganglionnaires.
Enfin dans une troisième expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique au niveau de la voûte plantaire avec du PBS, des LPR nus, des LPR nus diéther, des LPR- MN ou des LPR-triMN. Les ganglions poplités des souris ont été prélevés 24h après l'injection. La présence dans les ganglions drainants poplités de cellules dendritiques (DCs), et plus particulièrement de cellules dendritiques activées exprimant le marqueur Ly6C (cellules Ly6C+) ou LyôG (cellules Ly6G+), a été analysée par cytométrie de flux. La figure 7 montre que l'injection de LPR-triMN induit non seulement une augmentation significative du nombre et du pourcentage de cellules dendritiques (figures 7A et 7B) mais également du pourcentage de cellules dendritiques activées (figure 7C) et inflammatoires (figure 7D) parmi les cellules dendritiques contenues dans les ganglions drainants des souris injectées. Le nombre de cellules dendritiques, activées ou non, n'est pas signifïcativement modifié après l'injection de LPR nus, de LPR us diéther ou de LPR-MN par rapport au contrôle (PBS).
L'ensemble de ces expériences montre que les LPR-triMN comprenant le lipide tri- mannosylé de l'invention peuvent induire une réaction immunitaire (recrutement et activation des cellules dendritiques dans les ganglions drainants le site d'injection) quand ils sont injectés à des souris. Dans ces expériences, les LPR-triMN contiennent de l'ARN PolylJ simple brin (ssPolyU) et ne servent pas de vecteur pour l'introduction de molécules d'intérêt immunogènes. Ces expériences démontrent que les lipopolyplexes triMN possèdent un effet adjuvant intrinsèque in vivo.
Les LPR-triMN induisent une meilleure réponse T spécifique in vitro chez l'Homme
Des cellules dendritiques MoDCs issues de donneurs HLA-A2 ont été incubées pendant 24h avec des LPR nus, des LPR-MN ou des LPR-triMN contenant l'ARNm de l'oncoprotéine E7 du virus HPV16 (ARNm E7) ou l'AR non-codant PolyU simple brin (ssPolyU). Les cellules MoDCs ont ensuite été utilisées pour sensibiliser des lymphocytes T CD3+ autologues en co-cuiture pendant 3 jours. Après 3 jours de co-culture les lymphocytes T ont été placés dans un milieu enrichi en IL-7 et IL-15. A 17, les lymphocytes T sensibilisés ont été remis en présence de MoDCs préalablement chargées avec des peptides E7 restreints à HLA-A2 (allèle HLA2) pendant 16h. Finalement I 'exocytose a été inhibée pendant 4h avant la réalisation d'un marquage intracellulaire de Pinterféron-γ (INF-γ) analysé par cytométrie. Une détection de l'expression des marqueurs membranaires CD3, CD4 et CD8 a également été réalisée. La figure 8 montre que les LPR-triMN ne contenant pas d'ARN codant induisent une sécrétion d' lNF-γ chez les lymphocytes CD4+ (figure 8.4) et les lymphocytes CD8+ (figure 8B) légèrement supérieure à celle induite par les LPR nus. Cette observation confirme l'effet adjuvant intrinsèque des LPR-triMN. Les LPR-triMN contenant l'ARNm E7 sont capables d'induire une sécrétion d'INF-γ chez les lymphocytes CD4+ (figure 8A) et les lymphocytes CD8+ (figure 8B) significativement supérieure à celle induite par les LPR nus ou les LPR-MN. Les LPR-MN n'induisent qu'une faible sécrétion d'INF-γ, qu'ils contiennent l'ARN ssPolyU ou l'ARNm E7.
Cette expérience montre donc que les LPR-triMN, utilisés en tant que vecteur pour la vaccination « anti-E7 », sont capables d'induire une réaction spécifique « anti-T7 ». Les LPR-trîMN induisent une meilleure réponse immunitaire in vivo
Des expériences de vaccination de souris ont été réalisées avec des lipopolyplexes contenant l'ARNm codant l'oncoprotéine E7 du virus HPV16. Ces souris ont été vaccinées par un mélange équimolaire de LPR-E7 et de LPR-E7-DC-LAMP ce qui permet d'obtenir une meilleure réponse à la vaccination (Mockey et al. (2007) mRNA- hased cancer vaccine: Prévention of B16 melanoma progression and metastasis by sy s ternie injection of MARTI mRNA hisiidylated Upopolyplexes, Cancer Gene Therapy 14, 802-814), En effet DC-LAMP est une glycoprotéine de la membrane des lysosomes et des endosomes tardifs, qui joue un rôle dans le chargement des peptides sur le CMH- II, permettant d'induire activement des réponses Thl , L'utilisation d'une séquence d'acide nucléique chimérique (par fusion de la séquence codant E7 et de la séquence codant DC-LAMP) permet d'orienter E7 vers la voie du CMH-II et d'améliorer la réponse immunitaire, Des LPR contenant de TARN non-codant po yU simple brin (ssPolyU) ont été utilisés comme contrôle. Les injections ont été réalisées à J0, J7 et J15. A J21 les souris ont été sacrifiées et leurs rates prélevées. Les splénocytes ainsi isolés ont été incubés en présence de peptides E7 et leur sécrétion d'INF-Ύ a été analysée par ELïSpot. Différents modes de vaccination ont été comparés. Des groupes de 5 souris ont ainsi été vaccinés avec 21 μg de LPR-triMN-ssPolyU (contrôle) par voie intraveineuse ou avec LPR-triMN-E7/E7- DC-LAMP : 21 ug en intraveineuse, 7 μ en intradermique ou 7 (ug en sous-cutanée. La figure 9A montre que les vaccinations par voie intraveineuse ou intradermique induisent une réponse immunitaire spécifique à l'antigène E7 significative chez les souris vaccinées. La voie intradermique semble cependant plus efficace et plus avantageuse car elle induit une réponse immunitaire d'intensité équivalente à celle induite par voie intraveineuse, mais après injection de 7 ig de LPR contre 21 .ug en voie intraveineuse. Des expériences similaires ont été réalisées pour comparer l'effet induit par l'injection de différents LPR. Des souris ont été vaccinées à J0 et J2 avec du PBS (contrôle) ou différents LPR (LPR nu, LPR nu diéther, LPR-MN diéther, LPR-tri ) contenant l'ARNm E7. A J14 les souris ont été sacrifiées et leurs rates prélevées. Les splénocytes ainsi isolés ont été incubés en présence de peptides E7 et leur sécrétion d'lNF-γ a été analysée par ELISpot. La figure 9B montre que les LPR-triMN induisent une réponse T spécifique significativement supérieure à celle induite par les LPR-MN diéther. L'injection de LPR nus ou de LPR diéther (LPR nus diéther) n'induit pas de réponse T spécifique significative par rapport au contrôle (PBS). En outre, les LPR mannosylés, bien que chargés positivement, ne s'accumulent pas dans les poumons (résultats non présentés).
Les LPR-triMN sont donc des vecteurs de vaccination efficaces pour l'induction d'une réponse T spécifique à un antigène d'intérêt chez les sujets vaccinés, Les LPR-triMN ont un effet vaccinal thérapeutique dans un modèle murin de cancer HPV-induit
L'effet thérapeutique d'une vaccination avec des LPR-E7 a été évalué chez des groupes de 5 souris auxquelles ont été administrées 50000 cellules de la lignée tumorale syngénique TC-1 par injection intradermique en position ectopique (flanc gauche). Ces cellules tumorales expriment l'oncoprotéine E7.
Les souris ont ensuite reçu deux injections intradermiques (7 jours et 9 jours après l'inoculation des cellules tumorales) de PBS (contrôle négatif) ou de 7 ^ig de : LPR-MN- ssPolyU, LPR-MN-E7/E7-DC-LAMP, LPR-triMN-ssPolyU ou de LPR-triMN-E7/ E7- DC-LAMP. La croissance tumorale a été évaluée tous les 2 jours par mesure au pied à coulisse, selon la formule (LxI2)/2. Les animaux dont le volume tumoral devient critique (>20G0 mm2) ont été sacrifiés.
La figure 10À montre qu'après 4 mois, 5 des 9 souris vaccinées avec LPR-triMN-E7/ E7-DC-LAMP sont toujours en vie sans avoir développé de tumeur. Après 4 mois, 3 des 10 souris vaccinées avec LPR-triMN-ssPolyU, ne contenant pas d'ARNm codant, sont également toujours en vie sans avoir développé de tumeur. Leur survie est vraisemblablement attribuable à l'effet adjuvant des LPR-triMN qui peuvent en effet stimuler la réponse immunitaire des souris vaccinées. Après 4 mois, 3 des 9 souris vaccinées avec LPR-MN-E7/ E7-DC-LAMP sont toujours en vie sans avoir développé de tumeur. L'injection de PBS ou de LPR-MN-ssPolyU n'a pas d'effet thérapeutique. La figure 10B permet de comparer la survie des souris vaccinées avec différents LPR. L'utilisation de LPR-triMN pour la vaccination contre un antigène exprimé par les cellules tumorales a un effet thérapeutique significatif et prévient la formation de tumeurs chez plus de la moitié des souris vaccinées.
Pour confirmer le bénéfice du LPR-triMN comme vaccin thérapeutique, deux autres modèles tumoraux ont été testés : le modèle de mélanome B16F0 (exprimant MARTI ), et le modèle de iymphome des cellules EG7 exprimant OVA. L'effet thérapeutique d'une vaccination avec des LPR-triMN a été évalué chez des groupes de 10 souris auxquelles ont été administrées des cellules de la lignée tumorale B 16F0 ou EG7 par injection intradermique en position ectopique (flanc gauche). Les souris ont ensuite été vaccinés aux jours 7 et 9 post-injection avec du PBS, du LPR-triMN comprenant un ARN ssPolyU ou un LPR-triMN comprenant un ARNm de M ARTI ou de OVA. respectivement.
La Figure 11 montre que seule la vaccination par le LPR-triMN comprenant un ARNm de MARTI ou de OVA permet de limiter la croissance des tumeurs.
Ces résultats démontrent l'intérêt des LPR-triMN pour la vaccination anti-cancer.

Claims

composé de formule I
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :
dans lequel R2 et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi panni la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycan.es terminés par un fucose, le trisaccharide 3'-suifo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acéty glucosamine (tri-GlcNAc), les Pi Ms (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMe (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l'oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, Poligosaceharide α-focose- 1 -4GlcNAc, l'oligosaccharide lacto- N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l'oligosaccharide G!cNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l'oligosaccharide anal- 3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les !ipoarabinomannanes mannosylés ( anLAMs) ;
d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
sous réserve qu'au moins un des groupements R2 et R2' soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque ¾' est absent ;
sous réserve qu'au moins un des groupements R ¾' et Ri" soit différent de H.
Le composé selon la revendication 1 de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentieilement de 5 à 20 ;
Ki, Ri' et i" sont identiques ou différents, représentent indépendamment un H ou le groupement :
d
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à dans lequel R et R2' sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment le mannose, le glucose, le fucose, ou les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose ;
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H. composé selon la revendication 1 de formule I
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ;
b représente un nombre entier de 1 à 3 ;
c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri' et Ri" sont identiques ou différents, représentent indépendamment un H ou le groupement :
d
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
dans lequel 2 et R2' représentent le groupement :
sous réserve qu'au moins un des groupements Ri, Ri' et Ri" soit différent de H
dans laquelle :
c représente un nombre entier de 1 à 130, préiérentiellement de 5 à 20 ;
d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiel! .ement 2. , Le composé selon la revendication 1 de formule II :
dans laquelle :
c représente 5 ;
d représente 2. , Un liposome comprenant le composé selon Lune quelconque des revendications 1 à 5 dans des proportions comprises d'environ 1% à environ 15% en pourcentage molaire par rapport au nombre total de moles de lipides, préférentiellement d'environ 2% à environ 10%, plus préférentiellement d'environ 5%. , Le liposome selon la revendication 6 comprenant en outre au moins une molécule d'intérêt. Le liposome selon la revendication 7, dans lequel ladite molécule d'intérêt est capable d'induire une réaction immunitaire.
9, Le liposome selon les revendications 7 ou S, dans lequel ladite molécule d'intérêt est un acide nucléique. 10. Le liposome selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ladite molécule d'intérêt est un antigène associé au cancer sélectionné dans le groupe comprenant : CAP-1, CD 4/m, les protéines de surface cellulaire de la famille Claudine CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 et CLAUDIN-12, c-myc, CT, GnT-V, HAGE, HAST-2, LAGE, NFl, NY-BR-1, protéinase 3, SAGE, 8CGB3A2, SCPl, SCP2, SCP3, SSX, SURVrVin, TPI/m, TPTE, CD 4 (cyclin-dependent Mnase 4), plS] 'T4'3, p53, AFP, β-caténine, caspase 8, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-Ï MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, IAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR FUT, Pml-RARaTEL/AM Lï, NY-ESO-Ï, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antigen) MAGE-AÏ, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE -A4,
MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE- 10, MAGE- Ai l, MAGE- 12, MAGE-B, MAGE-C, BAGE, DAM-6, DAM- 10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-l, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, CAG-3, l'antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV Qiuman apilloma virus), les antigènes
EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gpl OO, M ART- 1 /Melan- A, tyrosinase, TRP-I et TRP-2 (tyrosinase-related protein), TRP-2-INT2, PSA, PSM, MC1I , ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, WT et WT1 ou un acide nucléique codant ledit antigène associé au cancer.
11. Le composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour son utilisation en tant qu'adjuvant vaccinai.
12, Le liposome selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 pour son utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal. 13, Le liposome selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 pour son utilisation en tant que vaccin, de préférence en tant que vaccin anti-cancer,
14, Une composition pharmaceutique comprenant le composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 15. Une composition phannaceutique comprenant le liposome selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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