EP3458843A1 - Nouvelle propriete optique d'un marqueur fluorescent - Google Patents

Nouvelle propriete optique d'un marqueur fluorescent

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Publication number
EP3458843A1
EP3458843A1 EP17729005.3A EP17729005A EP3458843A1 EP 3458843 A1 EP3458843 A1 EP 3458843A1 EP 17729005 A EP17729005 A EP 17729005A EP 3458843 A1 EP3458843 A1 EP 3458843A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
interest
laser
sample
molecule
excitation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17729005.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Poncelet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocytex SRL
Original Assignee
Biocytex SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocytex SRL filed Critical Biocytex SRL
Publication of EP3458843A1 publication Critical patent/EP3458843A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to the field of fluorescent markers and, more specifically, their use for the detection of biological target in a sample.
  • CMF flow cytometry
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Flow cytofluorometry is a technique commonly used for individual cell analysis. It makes it possible to separate cell subpopulations both on the basis of their size and on the basis of the presence or absence of markers specific to their surface. The detection of these surface markers is then carried out by specific ligands coupled to fluorophores.
  • CMF is commonly used for the immunological analysis of blood cells with many applications for diagnostic purposes such as immuno-phenotyping of leukemias and lymphomas.
  • These approaches require the use of fluorescent conjugates based on monoclonal antibodies (AcMx) and other specific probes coupled to various fluorochromes covering a wide range of colors (wavelengths) within the visible light spectrum.
  • AcMx monoclonal antibodies
  • fluorochromes covering a wide range of colors (wavelengths) within the visible light spectrum.
  • these molecules are capable of generating fluorescence signals of spectra complementary to that of fluorescein, the main fluorochrome known as excitable by the 488 nm blue laser. But this type of laser has long been the only source of light excitation which was equipped with the first cytofluorometers.
  • PE phycoerythrin
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE has therefore for many years been a particularly interesting fluorochrome not only for CMF, but more broadly for all methods of analysis, detection or separation based on receptor / ligand-type molecular interactions.
  • the excitation (absorption) spectrum of the PE is generally described starting at 450 nm and comprises firstly a secondary peak at 490 nm and then a major peak at 560 nm.
  • PE has always been used with excitation light sources of wavelengths between 488 and 561 nm, and there is no reason to imagine that it would be a satisfactory fluorochrome with excitation at a wavelength of wave of the order of 405 nm.
  • the inventors of the present invention have now demonstrated that it was possible to use phycoerythrin as a fluorochrome, not only with lasers emitting between 488 and 561 nm, but also with a laser to violet (405 nm).
  • the present invention therefore relates to an unprecedented use of PE and its derivatives, such as its tandem derivatives, using an excitation wavelength close to 405 nm instead of the conventional 488 nm or 560 nm.
  • the invention relates to a method for detecting at least one molecule of interest in a sample, comprising the steps of: i) bringing the sample into contact with a ligand that is specific for this molecule; interest and which is coupled to a fluorochrome consisting of phycoerythrin or one of its derivatives,
  • step ii) Exciting the mixture of step i) with at least one light source of wavelength between 330 nm and 425 nm,
  • step iii) detecting a light emission by mixing after step ii) at a wavelength greater than or equal to 550 nm, and iv) determining the presence or absence of the molecule of interest in the sample against the results obtained in step iii).
  • the method of the invention can thus be implemented on a suitable system comprising at least one ligand coupled to a fluorochrome consisting of phycoerythrin or one of its derivatives, at least one light source emitting light of wavelength between 330 nm and 425 nm and at least one detector of the light emitted by the fluorochrome thus excited.
  • the method in question may also aim for the simultaneous detection of a second, a third, a fourth or even a fifth (or umpteenth) molecule of interest in the same sample.
  • Another subject of the invention relates to the use of a fluorochrome consisting of phycoerythrin or one of its derivatives for the detection of at least one molecule of interest in a sample characterized in that the wavelength excitation is used between 330 nm and 425 nm, preferably at 405 nm.
  • Figure 1 shows the absorption / excitation spectra (broken dashed lines) and emission (continuous lines and areas under gray curves) of phycoerythrin (R-PE) as well as three of its R-PE tandems.
  • R-PE phycoerythrin
  • -TexasRed, R-PE-Cy5.5 and R-PE-Cy7 adapted from Fluorescence SpectraViewer, Thermofisher Scientific.
  • the wavelengths (in nm) are on the abscissa and the ordinate axis shows the relative intensities of absorbance or emission (in%).
  • the curves are only described from 400-450 nm with obvious excitation peaks around 490, 530 and 560 nm for the R-PE.
  • R-PE-Cy5.5 660 nm
  • R-PE-Cy7 760 nm
  • the emission spectrum of the R-PE is a Gaussian centered on 575 nm.
  • the tandem emission spectra are shifted toward longer wavelengths and are centered on 615 nm (R-PE-Texas-Red), 694 nm (R-PE-Cy5.5) and 776 nm (R-PE-Cy5.5). PE-Cy7).
  • Figures 2 to 8 illustrate the absence of leakage of phycoerythrin excited by the blue laser in the reading channel of the violet laser.
  • Polystyrene beads coated with increasing amounts of R-PE serve as calibrators and are excited by blue and violet lasers.
  • FL2 corresponds to the signals coming from the blue laser (488 nm) and passing through a filter 575 BP 30, behind a dichroic mirror 595 DC SP.
  • FL10 corresponds to the signals from the violet laser (405 nm) and passing through an identical filter 575 BP 30, after reference by a dichroic mirror 480 DC SP.
  • the nominal powers of the blue and violet lasers are respectively 22 mW and 40 mW (FIGS. 2 and 5).
  • the singlet beads are first pre-selected by the "beads" region in a double scatter analysis and their FL2 and FL10 fluorescence analyzed correlatively.
  • the nominal power of the blue laser is reduced to 10 mW ( Figure 3) then 5mW ( Figure 4) while the nominal power of the violet laser is maintained at 40 mW.
  • the nominal power of the violet laser is reduced to 10 mW ( Figure 6) then 5m W ( Figure 7) while the nominal power of the blue laser is maintained at 22 mW.
  • the violet laser was blocked by an iris being analyzed to artificially pass its nominal power from 40 mW to 0 mW; the nominal power of the blue laser is kept constant at 22 mW ( Figure 8).
  • Figure 9 illustrates the ability of PE-Cy5.5 excited by a violet laser to discriminate a strongly labeled sample from a weakly labeled sample.
  • Capture beads coated or not with a variable amount of goat anti-mouse antibody are brought into the presence of anti-CD45-PE-Cy5.5 conjugated antibody.
  • the sample is excited successively by the violet and blue lasers, the separations in space and time allowing differentiated analyzes of the fluorescence signals from each of the lasers.
  • FL4 corresponds to the signals from the blue laser (488 nm) and passing through a filter 695 BP 30, behind a dichroic mirror 730 DC SP to collect the fluorescence of PE-Cy5.5.
  • FL10 corresponds to the signals from the violet laser (405 nm) and passing through an identical filter (695 BP 30), after reference by a dichroic mirror 480 DC SP.
  • Figure 10 shows the identification of blood cell subpopulations by flow cytometry of normal hematopoietic cells performed on the basis of the CD45 marker.
  • the excitation of the anti-CD45-PE conjugate at 488 nm is illustrated by Figures (A), (C) and (E).
  • Excitation of the anti-CD45-PE conjugate at 405 nm is illustrated by Figures (B), (D) and (F).
  • the identification and quantification of blood cell subpopulations is shown in Figures (A), (B), (C) and (D).
  • Figures (E) and (F) are a representation in mono-parametric histograms of the four subpopulations of lymphocytes (Ly), monocytes (Mo), granulocytes (PM) and residual red blood cells (Ery) of the blood.
  • Figure 11 shows the identification of cellular blood subpopulations by flow cytometry of normal and leukemic hematopoietic cells performed on the basis of the CD45 marker.
  • LP1 cells serving as a model for abnormal cells with a low level of CD45 expression, were added at a rate of 10% relative to the normal white cells.
  • the excitation of the anti-CD45-PE conjugate at 488 nm is illustrated by the figures (A), (C) and (E).
  • Excitation of the anti-CD45-PE conjugate at 405 nm is illustrated by Figures (B), (D) and (F).
  • the identification and quantification of cell subpopulations of blood supplemented in LP 1 cells are shown in Figures (A), (B), (C) and (D).
  • Figures (C) and (D) show only leukaemic blasts.
  • Figures (E) and (F) are a representation in combined monoparametric histograms of the lymphocyte (Ly), monocyte (Mo), granulocyte (PMN), residual red blood cell (Ery) and leukemia cell subpopulations. line LP 1 (LP1).
  • Figure 12 shows the identification of cellular blood subpopulations by flow cytometry of normal and leukemic hematopoietic cells performed on the basis of the CD45 and CD33 markers.
  • the HL60 and NB4 cells acting as a model for abnormal acute myeloid leukemia (AML) cells with low levels of CD45 expression (CD45 low), were added at 50,000 cells / sample.
  • Excitation of the anti-CD33-PE-Cy7 conjugate at 488 nm is illustrated in Figure (A).
  • Excitation of the anti-CD33-PE-Cy7 conjugate at 405 nm is illustrated in Figure (B).
  • Figures (A) and (B) are a two-color bi-parametric representation of the distribution of normal blood cell subpopulations including neutrophils (Neu and PMN2), lymphocytes (Ly), residual red blood cells (RBCs) of the blood, and added leukemia cells (HL60 and NB4).
  • neutrophils Neu and PMN2
  • Ly lymphocytes
  • RBCs residual red blood cells
  • a first subject of the invention relates to a method for detecting at least one molecule of interest in a sample, comprising the steps of: i) bringing the sample into contact with a ligand that is specific for this molecule; interest and which is coupled to a fluorochrome consisting of phycoerythrin or one of its derivatives,
  • step ii) Excitation of the mixture of step i) by at least one light source of wavelength between 330 and 425 nm, iii) detecting a light emission by mixing after step ii) at a wavelength greater than or equal to 550 nm, and iv) determining the presence or absence of the molecule of interest in the sample against the results of step (iii).
  • the inventors have demonstrated, as demonstrated in the examples below, that phycoerythrin has fluorescence properties following its excitation by a 405 nm laser such as to allow its use as a fluorochrome in connection with such a laser. .
  • molecule of interest is meant a biological marker whose presence in a sample is suspected.
  • a biological marker may be protein, nucleic, carbohydrate, lipid or glycolic lipid.
  • the biological marker detected by the method of the invention is a protein, a lipid, a carbohydrate, a lipid structure, glycolipidic structure or a carbohydrate unit. -.
  • the biological marker detected by the method of the invention is a protein.
  • Sample refers to any type of biological sample consisting of tissues (muscle, bone, organ, etc.), body fluids (blood, saliva, urine, tears, sperm, milk, bronchoalveolar fluid, pleural fluid, cerebrospinal fluid, etc.), liquid suspensions containing molecules of interest, particularly particles, particularly cells, eukaryotic or prokaryotic, such as in vitro culture media or fermentation liquids, bathing waters or consumption, injectable liquids.
  • tissues muscle, bone, organ, etc.
  • body fluids blood, saliva, urine, tears, sperm, milk, bronchoalveolar fluid, pleural fluid, cerebrospinal fluid, etc.
  • liquid suspensions containing molecules of interest particularly particles, particularly cells, eukaryotic or prokaryotic, such as in vitro culture media or fermentation liquids, bathing waters or consumption, injectable liquids.
  • the sample used in the detection method of the invention "comprises or is likely to comprise prokaryotic or eukaryotic cells, preferably eukaryotic cells, preferably derived from the animal body, in particular human.
  • the molecule of interest to be detected may be intracellular or anchored to the plasma membrane of the cell.
  • the molecule of interest is present in the sample at a density of at least 1000 copies per cell, more preferably at least 2500 copies per cell, more preferably at least 5000 copies per cell.
  • the molecule of interest is present on / in the cells of the sample at a density ranging from 1,000 to more than 2,000,000 copies per cell, more preferably from 7,500 to 1,500,000 copies per cell. more preferably still from 10,000 to 150,000 copies per cell.
  • the molecule of interest is present on / in the cells of the sample at a density of at least 7,500 copies per cell.
  • ligand is meant a macromolecule capable of physically binding with. the molecule of interest targeted, and this in a reversible way. This interaction is made possible by the existence of areas of complementarity between the molecule of interest and the specific ligand.
  • the binding between the ligand and the molecule of interest is by the establishment of non-covalent bonds, for example by electrostatic bonds, Van Der Waals forces, ionic bonds or hydrogen or through hydrophobic interactions.
  • the ligand can then be an "antibody, an antibody fragment or derived constructs (Fab ,, Fab'2, nanobody, aptamer, affimer ).
  • the ligand may be a bacterial lectin or toxin (eg FLAER for its affinity for the glyco-phosphatidyl-inositol anchors of many membrane antigens).
  • the ligand may be an affine protein such as (but not limited to) annexin, lactadherin, cholera toxin,. ..
  • the molecule of interest is a hapten (biotin, DNP, poly-His ...), avidin, streptavidin anti-hapten antibodies can be involved.
  • association stability between the ligand and the molecule of interest is quantifiable by determining the association or equilibrium constant (Ka) characteristic of this link .
  • Ka association or equilibrium constant
  • This constant is equal to the ratio between the concentration of the ligand-molecule of interest complex and the product of the concentration. of free ligand and molecule of free interest. For this bond to be qualified as specific, it must be greater than or equal to 10 6 L.mol "1 .
  • the ligand contacted with the sample in the detection method of the invention is anticoipses.
  • fluorochrome is meant any type of compound capable, after having been irradiated with a light beam in a range of wavelengths ranging from ultraviolet to infrared, to emit back a photon of lesser energy. Irradiation causes fluorescence which is typically an illumination. The emission of photons occurs during electronic transitions of a molecule of an excited state resulting from the absorption of light energy to a ground state (relaxation). Thus, the absorption of a photon by a fluorochrome leads to the emission of another photon of longer wavelength and lower energy than those of the exciter photon.
  • each fluorochrome has an absorption spectrum, a spectrum of excitation and a spectrum of emission which are its own.
  • the absorption spectrum of a fluorochrome is defined by its range of absorbed wavelengths, regardless of its excitation.
  • the excitation spectrum of a fluorochrome is defined by its range of wavelengths effectively inducing excitation and also reflects the range of excited states that the fluorochrome can reach.
  • the fluorochrome is excited at a wavelength different from its excitation maximum, the emission length is then the same, but the fluorescence intensity is lower.
  • the efficiency of the fluorescent light emission for a given fluorochrome is determined by the quantum efficiency phi ( ⁇ ) defined by the ratio between the number of fluorescence photons emitted and the number of photons absorbed by the fluorochrome.
  • phi quantum efficiency
  • fluorochromes have quantum efficiencies between 0.1 and 1.
  • the quantum efficiency ⁇ being independent of the excitation wavelength (Kasha's law), the shape of the emission spectrum of a Fluorochrome is invariant regardless of the wavelength of the excitatory light source. However, the intensity of the emission spectrum of a fluorochrome varies according to the excitation wavelength.
  • the absorption intensity, or extinction coefficient ⁇ , or specific absorbance, reflects the absorption probability: the higher ⁇ is and the higher the fluorescence at equal light intensity.
  • the fluorescence intensity or brightness of a fluorochrome is determined by the product of the extinction coefficient and the quantum yield. The higher the product, the brighter the fluorochrome.
  • fluorophore, fluorochrome or fluorescent probe are equivalent and may be used interchangeably.
  • phycoerythrin proteins of the family of phycobiliproteins extracted from cyanobacteria, red algae and certain Cryptophytes.
  • Phycobiliproteins consist of an apoprotein covalently bound to a chromophore called phycobilin.
  • the apoprotein has a monomeric structure comprising two distinct polypeptides called ⁇ and ⁇ subunits, organized as trimer ( ⁇ ) 3 or hexamer ( ⁇ ) 6 . These typical complexes - may also contain a third type of subunit, the ⁇ chain.
  • the absorbance characteristics of phycobiliproteins are due to the existence of open-chain tetrapyrrole prosthetic groups which are linked to the ⁇ , ⁇ and ⁇ subunits by means of a thioether linkage with a cysteine residue of at least one of the polypeptides.
  • Phycoerythrobilin and phycourobilin (PUB) are the two main types of phycoerythrin tetrapyrrole prosthetic groups extracted from red algae.
  • C-PE C-phycoerythrin
  • CU-PE CU-phycoerythrin
  • b-PE b-phycoerythrin
  • B-PE B-phycoerythrin
  • R-PE R-phycoerythrin
  • the ratio between the number of PEB and PUB groups defines the spectroscopic properties of the different phycoerythrins.
  • the maximum excitation peak of the PEs generally ranges from about 545 nm (b-PE) to about 565 nm (R-PE).
  • the fluorochrome is phycoerythrin-R (R-PE), and preferably the PE used in the detection method of the invention is extracted from red algae.
  • the absorption spectrum of phycoerythrin is measured over a range of 400-450 nm at 600 nm and shows 3 major peaks of abso ⁇ tion corresponding to the maximum absorption intensities located around 490 nm, 530 nm. and 560 nm, CMF's literature and all instructional manuals instruct the user to choose one of these 3 absorption peaks, taking advantage of the most accessible CMF laser sources such as the 488 nm blue laser, present in almost all devices in the current market, green at 530 nm and more recently a yellow laser at 560 nm.
  • the very low absorption at about 400 nm would allow a satisfactory excitation of the PE and thus the obtaining of a fluorescence applicable to the identification of sub-populations of hematological cells of potential diagnostic interest. like leukaemic blasts in human blood and moreover, reproducible. Indeed, a fluorochrome that absorbs light at a given wavelength is not necessarily excited effectively at this wavelength.
  • the excitation spectrum of a substance is obtained using a spectrofluorimeter by measuring the fluorescence emitted at a fixed wavelength and by varying the excitation wavelength.
  • the fluorescence emission spectrum is always shifted towards the long wavelengths relative to the absorption spectrum.
  • the emission spectrum of a substance is obtained by measuring the fluorescence emitted at different wavelengths emission, exciting with a fixed wavelength. Unlike most fluorochromes, the emission spectrum of PE does not correspond to a simple shift to longer lengths of its absorption spectrum. As illustrated in FIG. 1, the emission spectrum of the PE is a Gaussian centered on 575 nm, whereas the excitation spectrum shows a complex shape with a multiplicity of maxima.
  • the emission of the PE is however detectable from 550 nm. If the shape of the fluorescence emission spectrum does not depend on the excitation wavelength, the intensity of the fluorescence radiation is directly proportional to the power of the excitation beam absorbed by the fluorophore.
  • this fluorophore with either a blue light source, with a wavelength ranging from 480 nm to 500 nm, or a green / yellow light source, with a wavelength ranging from 530 to 565 nm.
  • Chromophores of PEs extracted from Cryptophytes contain
  • the fluorochrome is:; phycoerythrin-R (R-PE), and preferably the PE used in the detection method of the invention is extracted from red algae.
  • R-PE R-PE
  • SMCC Lyo
  • RPE ref Ll or L1 SM dispensed by FEBICO
  • FEBICO liquid form
  • PhycoPro TM RPE ref PB32 distributed by i: PROZYME or R-phycoerythrin, P801 reference distributed by INVITROGEN
  • FEBICO ammonium sulphate precipitate
  • the coupling of the fluorochrome with the ligand is carried out according to the techniques well known to those skilled in the art (M. Roederer, Conjugation of monoclonal antibodies (August 2004, http://www.drmr.com/abcon/)) . Briefly, after extraction and purification of the PE, it is activated chemically to make it reactive towards the thiol groups. The ligand undergoes a reduction step which allows the release of thiol groups ready to react. The covalent coupling of the ligand with the PE can then be performed.
  • kits containing all the reagents necessary to carry out the conjugation of the PE with the ligand eg PhycoLink® R-Phycoerythrin Conjugation Kit, PJ31K reference sold by PROZYME, R-Phycoerythrin Conjugation Kit, Abl ref 02918 marketed by Abcam).
  • tandem complexes By “phycoerythrin derivatives” is meant the tandem complexes formed between the PE and another fluorescent compound. The establishment of a covalent bond between the PE and this second fluorescent compound allows resonance energy transfer from the PE to this second fluorescent compound.
  • the PE is referred to as a donor fluorochrome and the second fluorescent compound is called a fluorochrome acceptor.
  • the purpose of these tandems is to obtain a resonance energy transfer (FRET) and consequently a large displacement between the primary excitation of the donor fluorochrome and the emission of the acceptor fluorochrome (Stokes displacement).
  • FRET resonance energy transfer
  • the tandem complexes made on the PE have an excitation / absorption spectrum corresponding to that of the PE and an emission spectrum corresponding to that of the second fluorescent compound.
  • Y-PE tandem complexes with Y any donor fluorochrome emitting after excitation a photon captured by the PE (ie fluorochrome acceptor) are excluded from the definition of phycoerythrin derivatives within the meaning of the present invention.
  • PE is always the donor fluorochrome.
  • the step of contacting the sample with the specific ligand of the molecule of interest is carried out in a liquid medium, preferably in aqueous solution.
  • light source is meant a device capable of emitting a monochromatic light beam.
  • the light source can be a laser, an arc lamp or a light emitting diode (LED).
  • Arc lamps eg mercury, xenon-mercury
  • a laser provides coherent light from a few milliwatts to several watts, with a narrow, well-defined and specific wavelength. Many lasers of different types are currently available.
  • Some lasers commonly used historically in CMF include argon lasers (351, 454, 488, 514 nm), krypton (406, 488, 532, 630 nm), helium-neon (632 nm), helium cadmium (325, 441). nm), Yag lasers (532 nm) and violet lasers (405 nm).
  • DPSS diode-pumped solid state
  • Jadite at least one light source for the excitation of-. mixture of step i) in the process of the invention has a wavelength between 3.30 and 425 nm, preferably between 350 and 420 nm, more preferably between 360 and 410 nm.
  • said at least one light source for exciting the mixture of step i) in the method of the invention a. a wavelength between 400 and 410 nm and preferably at 405 nm.
  • said at least one. light source for exciting the mixture of step i) in the process of. . the invention is a violet laser or a violet laser diode emitting at a length of 405 nm.
  • Step ii) of exciting the mixture of step i) corresponds to an illumination thereof by at least one light source.
  • the sample contains the molecule of interest and the ligand coupled to a fluorochrome has attached thereto, the light emitted by the mixture subsequent to step ii) is collected at an equal wavelength or greater than 550 nm, which corresponds to the beginning of the emission spectrum of the PE alone.
  • the maximum emission wavelengths of the tandems PE-TEXASRED TM, PE-Cy5 TM, PE-Cy5.5 TM, PE-Cy7 TM, PE-Alexafluor TM 610, PE-Alexafluor TM 647 , PE-DyLight TM 594, PE-Dyomics TM 590 and RT665 TM are 613 nm, 670 nm, 690 nm, 775 nm, 628 nm, 665 nm, 618 nm, 599 nm and 680 nm, respectively.
  • These emission wavelengths may vary from a few nanometers depending on the source and the extraction / purification protocol of the fluorophore. They represent the center of the optimal fluorescence collection zone which is often 20 to 50 nm wide, usually 30 nm, depending on the presence or absence in the analysis of other fluorochromes of nearby spectra.
  • a significant advantage of the excitation of the PE and its derivatives with a light source of wavelength between 360 and 410 nm, preferably 405 nm, is that it generates a very important Stokes shift between the wavelength of excitation and the emission wavelength, thus making it possible to use fluorescence filters (for PE) which are much less efficient and expensive than those required by excitation with a light source of wavelength at 488 nm, even even more at 530 nm or 560 nm.
  • Step iii) detecting light emitted by the mixture after excitation in step ii) is performed using an optical detector which can be a photomultiplier (PMT).
  • PMT photomultiplier
  • the signal emitted in the form of photons is converted by the photomultiplier into a quantifiable electrical signal.
  • the method of the invention further allows the simultaneous identification of at least one second, but also. potentially at least a third, a fourth, or even a fifth (or umpteenth) molecule of interest in the sample.
  • Such identification relies in particular on the use of a first ligand coupled to the PE and a second, third, fourth or even fifth ligand coupled to one of its tandems.
  • the light source having a wavelength of between 330 and 425 nm, preferentially 405 nm, makes it possible to simultaneously excite the PE and its tandem (s), which provide fluorescence of offset spectra.
  • the simultaneous identification of a second molecule of interest can be carried out using a second fluorophore excitable by a light source of the same wavelength as that used for excite the PE or one of its derivatives, but which has an emission spectrum distinct from that of the PE or one of its derivatives.
  • the light source having a wavelength of between 330 and 425 nm, preferably 405 nm makes it possible simultaneously to excite PE and / or one of its tandems and fluorochromes specifically created to be excitable at such lengths. 'wave.
  • fluorochromes include SYTO40, DAPI, DyLight® 405, Brilliant Violet 421 TM, HiLyte Fluor TM 405, Pacific Blue TM, Pacific Orange TM, Cascade® Blue, Alexa Fluor® 405, eFluor® 450, BD TM Horizon TM V450 , VioBlue®, VioGreen TM, Krome Orange TM, Calcein Violet 450 AM TM, Zombie Violet TM, Aminbmethylcoumarin (AMCA) or some Q-dot® 565/605/625/655/705/800.
  • the identification of a second molecule of interest can be carried out using a second fluorophore excitable by a light source of wavelength distinct from that used to excite PE. or one of its derivatives and has an emission spectrum shifted from that of the PE or one of its derivatives.
  • This particular embodiment requires at least two light sources, one of wavelength between 330 and 425 nm, preferably 405 nm, for simultaneously exciting the PE and / or one of its tandems and the second a higher wavelength light source such as for example a 530 nm or 560 nm laser or a 635/640 nm laser / diode, for exciting a second fluorophore distinct from the PE and / or one of its derivatives.
  • a 530 nm or 560 nm laser or a 635/640 nm laser / diode for exciting a second fluorophore distinct from the PE and / or one of its derivatives.
  • Step iv) of determining the presence or absence of the molecule of interest in the sample is based on the comparison of the results obtained in step iii) in this sample with those obtained for a reference sample which is known to be it does not contain the molecule of interest.
  • step iv) can also be used to calculate the number of copies of the molecule of interest in the sample. This quantification step can be performed in comparison with a standard range containing increasing and known amounts of the targeted molecule of interest.
  • the method for detecting at least one molecule of interest in a sample according to the invention can be implemented on a flow cytometer.
  • the detection method of the invention may be used for the separation, analysis or counting of cellular or particulate subpopulations in a biological sample.
  • the detection method of the invention may be used for the separation, analysis or counting of cellular or particulate subpopulations of hematopoietic origin.
  • a second subject of the invention relates to the use of a fluorochrome consisting of phycoerythrin or one of its derivatives for the detection of at least one molecule of interest in a sample, characterized in that the length of The excitation wave of the fluorochrome is between 330 and 425 nm, preferably between 350 and 420 nm, more preferably between 360 and 410 nm. According to a particular embodiment of the invention, the excitation wavelength of the fluorochrome is between 400 and 410 nm and preferably at 405 nm.
  • Some assay devices such as flow cytometers or cell sorters, can have up to 6 additional lasers in addition to the 405 nm violet laser.
  • these instruments are now equipped with 3 lasers namely i) a laser
  • a 405 nm violet laser which illuminates the cells above / before the blue laser reference illumination point.
  • This multi-point illumination system allows a double optical and temporal separation of the fluorescences coming from each of the illumination points. Indeed, the signal coming from each of the 3 lasers is i) shifted in time by a delay of the order of
  • the operation of a multi-laser cytometer involves the excitation of the particles to be analyzed by each of the lasers in an offset manner, in space and in time. Each cell / particle passes successively through the light beams.
  • a GALLIOS TM / NAVIOS cytometer (Beckman - Coulter, Villepinte, F) with 3 lasers (purple - blue - red or 405-488-640 nm), the order of passage is violet - blue - red, the distance between the points impact is -100 ⁇ and the delay of ⁇ 30 ⁇ .
  • the pick-up lens picks up the lights emitted at the three points of impact and focuses them on three independent optical fiber inputs, which then lead the light to a system. optical capable of independently dissociating the wavelengths from each of the optical fibers.
  • Each laser works routinely at a fixed power rating (violet 40 mW- blue 22 mW - red 25 mW).
  • a fixed power rating violet 40 mW- blue 22 mW - red 25 mW.
  • polystyrene beads with a diameter of 10 ⁇ and covered with varying amounts of PE are used as calibrators: the C1, C2, C3 and C4 beads have respectively 900, 7500, 1 15 000 and 1 250 000 R-PE / bille molecules .
  • Two batches of beads were synthesized and suspended in a solution of PBS + 0.1% BSA + 0.1% sodium azide.
  • Violet laser 40 - 30 - 20 - 5 - 1 mW
  • the blue laser must always remain functional since serving t 0 . It can be lowered in power but not completely blocked, unlike the other 2 lasers.
  • the arrangement of the filters of the optical bench has been modified to optimize the detection of fluorescence signals of the PE carried by the fibers coupled to the respective focusing points of the blue and violet lasers.
  • two identical copies of a bandpass filter 575 BP 30, optimal for the PE are used in parallel, one in front of the FL2 detector and the other in front of FL 10.
  • the FL2 channel thus measures the PE signal coming from the blue laser (488 nm) and passing au-through filter 575 BP 30, behind a dichroic DC 595 SP.
  • FL10 corresponds to the PE signals from the. "violet laser (405 nm) passing through a filter 575 BP 30 the same, after return by a mirror dichroic 480 DC SP.
  • the nominal powers of the blue and violet lasers are respectively 22 mW and 40 mW (figure 2, scale 4 decades and figure 5, scale 5 decades).
  • the singlet beads are first pre-selected by the "beads" region in a double scatter analysis and their FL2 and FL10 fluorescence analyzed correlatively.
  • the nominal power of the blue laser is reduced to 10 mW ( Figure 3) then 5mW ( Figure 4) while the nominal power of the violet laser is maintained at 40 mW.
  • the nominal power of the violet laser is reduced to 10 mW ( Figure 6) then 5mW ( Figure 7) while the nominal power of the blue laser is maintained at 22 mW.
  • FIG. 5 The reference (FIG. 5) remains identical to FIG. 2 but with the use of scales at 5 decades.
  • the power drop of the violet laser from 40 mW (FIG. 5) to 10 mW (FIG. 6) then to 5 mW (FIG. 7) reduces the intensity of all the peaks in FL10 (FIG. PE from the violet laser) without any impact on fluorescence in FL2 (PE from the blue laser).
  • Mouse Ig (immunoglobulin) capture beads are labeled with various conjugates. E and / or tandems of the PE. 3 marking levels so produced are ⁇ analyzed using the same bandpass filter FL2 respectively, FL4 and FL5 (excitation 488 nm reference PE respectively, PE-Cy5, and PE-Cy7) and FL10 (excitation 405 nm tested, filtered with the same filter as that used for respectively PE, PE-Cy5 and PE-Cy7).
  • FL2 bandpass filter
  • FL4 and FL5 excitation 488 nm reference PE respectively, PE-Cy5, and PE-Cy7
  • FL10 excitation 405 nm tested, filtered with the same filter as that used for respectively PE, PE-Cy5 and PE-Cy7).
  • Beads of captured Ig (H + L) mouse with a diameter of 7 ⁇ SPHERO-COMPROI Particles, ref. CMIgP-70-3K marketed by SPHEROTECH, Inc. are used according to the supplier's instructions.
  • the three populations of beads correspond to a negative control, a weakly charged bead and a bead heavily loaded with goat anti-mouse antibody and consequently with conjugated mouse Ig.
  • the same bandpass filter as that of the optimum FLi of the blue laser i.e. FL2, 4 or 5 is taken on a second Gallios TM cytometer similar to that of the test and placed on the FL10 channel.
  • R2 AI / AH 2 3 4 3
  • R2 a weakly marked vs. unlabeled sample
  • the values of the ratios show that the excitation of the PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5 and PE-Cy7 by a violet laser allows an excellent discrimination between a strongly marked vs. weakly marked sample, and even more so between a strongly labeled vs. unlabeled sample. Although to a lesser extent compared to what is observed during blue laser excitation, it is also possible to discriminate between a weakly labeled and unlabeled sample.
  • the model used consists of whole blood (WB) taken on EDTA containing an abnormal cell type represented here by the LP1 multiple myeloma line. This model illustrates a case of detection of leukemic hematopoietic cells which can be assimilated here to blasts.
  • LP1 cells were added to the whole blood sample at a concentration of 10% relative to the total white cells. 4.2 - Marking of the cells
  • the characterization of the different cell populations present in the sample was carried out using an anti-CD45 monoclonal antibody coupled to PE (BioCytex).
  • the density of CD45 is of the order of 200,000 molecules / lymphocyte versus 120,000 molecules / monocyte, respectively, 217 + 64 ⁇ 10 3 vs 103 ⁇ 44 ⁇ 10 3 , according to BIKOUE et al., (Cytometry, 26: 137-147 ( 1996)).
  • the technique involves incubating whole blood cells in the presence of anti-CD45-PE.
  • the red blood cells are then lysed, the remaining cells (white blood cells) are washed to remove the unbound fluorescent conjugate and analyzed by flow cytometry.
  • LP1 cells not being completely isolated from normal granulocytes (PMN) in a CD45 x SSC graph, a complementary parameter was used here ie a blue auto-fluorescence of LP1 cells in FL9 (Ex 405 nm / Em 460 / 20 nm) greater than those of normal blood cells which facilitates their identification and the colorization of the illustrated subpopulations.
  • the "side scatter” (SS) parameter allows the discrimination of the 3 major leukocyte subpopulations -i.e. lymphocytes, monocytes and granulocytes (also noted PMN for polymorphonuclear nuclear).
  • LP1 cells over-add to the usual array, positioned at the same SS level as the PMNs, and above the PMNs in forward scatter (FS) parameter.
  • the FS x SS graph also helps to put an analysis window on the residual red blood cells (RBCs) remaining after lysis.
  • the labeled cells were analyzed on a Gallios TM flow cytometer (Beckman Coulter). The analysis was carried out on approximately 30 ⁇ of labeled sample, acquiring at least 7000 events at a speed of 60 ⁇ / ⁇ . for 30 seconds. The data was analyzed using KALUZA ® computer software (Beckman Coulter).
  • the voltages of the PMTs FL2 and FL10 were respectively 350 V and 420 V and the light signals filtered by the same type of filter 575 nm / 30 (standard filter FL10 replaced by a filter 575 nm / 30) so as to collect on FL2 and FL10 the fluorescence of the PE excited respectively by the 488 nm blue laser and the 405 nm violet laser.
  • the analysis strategy firstly includes conditioning all the cells in a size / structure analysis window.
  • the PE fluorescence of the different cell subpopulations can be visualized on a bi-parametric graph representing the intensity of fluorescence on the y-axis according to a parameter related to the granularity of the cells (SS) and which allows a first classification of the leucocytes in the order of intensity SS, ie from left to right lymphocytes, monocytes and granulocytes / PMN (and LP1 in the case of LP1 overload) and on the abscissa the number of events.
  • the software renders an average fluorescence intensity (MFI) for each tube.
  • MFI average fluorescence intensity
  • the cells of the LP1 line are, on the other hand, isolated by the combination of two parameters, ie their size, seen on the FS parameter (more important than the other leucocytes) and their detectable auto-fluorescence in FL9 (460 nm + / - 20 nm).
  • the comparison of the CD45-PE vs SS graphs shows fairly similar distributions that the PE is excited by the blue laser (488 nm / FL2) or by the violet laser (405 nm / FL10). Both conditions allow good CD45 vs SS discrimination of major cell subpopulations of whole blood.
  • the ratio between the MFIs of the cell subpopulations is calculated and illustrated in the table below.
  • the discriminations that are observed, after independent excitation of,. the PE by a 488 nm blue laser (reference) and a 405 nm violet laser between sub- ⁇ -; cell populations marked at various levels by this fluorochrome show that the PE can be used as a fluorochrome with a violet laser, by making it possible to discriminate between cellular subpopulations of interest, such as the sub-populations. populations of: normal blood leukocytes and leukemic cells after labeling with a CD45 antibody.
  • the model used consists of whole blood (WB) taken on EDTA containing two
  • LAM lines HL60 and NB4 LAM lines HL60 and NB4. These models illustrate a case of detection of leukemic hematopoietic cells which can be assimilated here to blasts.
  • . . HL60 and NB4 cells were mixed at a concentration of 5 million / ml: - in PBS-BA. 10 ⁇ l of this mixture were added to 50 ⁇ l of whole blood sample, ie 50,000 cells of the HL60 and NB4 mixture for 50 ⁇ l of whole blood.
  • the characterization of the different cell populations present in the sample was carried out using an anti-CD45 monoclonal antibody coupled to PE (BioCytex) used alone or in multi-color labeling in the presence of other fluorescent reagents including an anti-CD33 monoclonal antibody coupled to PE-Cy7.
  • PE BioCytex
  • the technique involves incubating the overloaded whole blood in HL60 and NB4 cells in the presence of anti-CD45-PE alone or in combination with anti-CD33 coupled to PE-Cy7. The red blood cells are then partially lysed, the remaining cells are washed to remove the unbound fluorescent conjugate (s), and analyzed by flow cytometry.
  • red blood cells The efficiency of lysis of red blood cells was voluntarily limited to keep in the analysis a significant presence of residual red blood cells, useful for the demonstration. In fact, the residual red blood cells are by definition negative for all the markers tested.
  • cell subpopulations normal cells and leukaemic blasts
  • CD45 x SSC system not shown here
  • CD33 x SSC system Fig 12A and B
  • CD33xCD45 system Fig 12C and D
  • the labeled cells were analyzed on a Gallios TM flow cytometer (Beckman Coulter). The analysis was carried out on approximately 30 ⁇ of labeled sample, acquiring at least 7000 events at a speed of 60 L / min. for 30 seconds. The data was analyzed using KALUZA ® computer software (Beckman Coulter).
  • the voltages of the PMTs FL5 and FL10 were respectively 600 V and 900 V and the luminous signals filtered by the same type of filter 755 nm long pass (standard filter FL10 replaced by a 2 nd filter 755 nm long pass identical to that placed in FL5 ) so as to collect on FL5 and FL10 the fluorescence of the PE-Cy7 excited respectively by the 488 nm blue laser and the 405 nm violet laser.
  • the analysis strategy firstly includes conditioning all the cells in a size / structure analysis window.
  • the PE or PE-Cy7 fluorescence of the different cellular subpopulations can be visualized on a bi-parametric graph representing the intensity of fluorescence on the ordinate as a function of a parameter related to the granularity of the cells (SS) on the abscissa, and which allows a first classification of leukocytes in order of intensity SS, ie from left to right lymphocytes, monocytes and granulocytes / PMN (and blasts in the case of overload in HL60 + NB4).
  • the software For each cell type defined on the graph by a region of interest, the software renders a percentage of all the cells present in the graph and a mean fluorescence intensity (MFI, denoted "Y-Med").
  • the comparison of the CD33-PE-Cy.7 (CD33-PC7) vs SS graphs shows similar cellular distributions that the PE-Cy7 (PC7) is excited by the laser blue (488 nm / FL5) or the violet laser (405 nm / FL10). Both excitation conditions allow good CD33 vs SS discrimination of whole cell subpopulations (lymphocytes, monocytes, PMN and residual red blood cells) of whole blood as well as leukaemic blasts (HL60 and NB4). Moreover, the • ⁇ ? blasts are differentiated by the level of CD33 expression: HL60 cells have a higher level of CD33 expression than that observed for NB4 cells.
  • the 'discrimination that are observed after separate excitation of PE-Cy7 by a blue laser 488 nm (reference) and a violet laser 405 nm between subpopulations of cells labeled at various levels by the fluorochrome show that the PE-Cy7 can be used as a fluorochrome with a violet laser, allowing useful discrimination between cell subpopulations of interest, such as subpopulations of normal blood leukocytes and leukemic cells after labeling with a CD33 anticoips.
  • FIGS. 12 (C) and (D) the comparison of the graphs
  • CD33-PE-Cy7 FL5) vs CD45-PE (FL2) or CD33-PE-Cy7 (FL10) vs CD45-PE (FL2) shows comparable cell distributions, that the fluorescence measurement is performed in FL5 (exc. nm) or in FL10 (exc 405 nm).
  • This bi-parametric analysis even allows better discrimination of two neutrophil subpopulations (Neu and PMN2) on the basis of their level of CD33 expression. The discrimination of residual red blood cells and lymphocytes based on the level of CD45 expression is also better.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats de l'étape iii).

Description

NOUVELLE PROPRIETE OPTIQUE D'UN MARQUEUR FLUORESCENT
Cette demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français n°l 6/00792 déposée le 1 8 mai 2016, qui est incorporée ici par référence.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des marqueurs fluorescents et, plus spécifiquement, leur utilisation pour la détection de cible biologique dans un échantillon.
ART ANTERIEUR
L'identification et le comptage de sous-populations cellulaires au sein d'un échantillon biologique sont aujourd'hui un élément critique tant en recherche fondamentale qu'au sein des laboratoires d'analyse médicale à des fins de diagnostic.
Pour ce faire, différentes méthodes d'identification ont été développées, dont en particulier la technique de cytométrie en flux (CMF) ou FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) largement utilisée aujourd'hui.
La cytofluorométrie en flux (CMF-F) est une technique couramment employée pour l'analyse individuelle de cellules. Elle permet de séparer des sous-populations cellulaires à la fois sur la base de leur taille et sur la base de la présence ou non de marqueurs spécifiques à leur surface. La détection de ces marqueurs de surface est alors réalisée par des ligands spécifiques couplés à des fluorophores.
La CMF est en particulier couramment utilisée pour l'analyse immunologique de cellules sanguines avec de nombreuses applications à visée diagnostique comme l'immuno-phénotypage des leucémies et lymphomes. Ces approches nécessitent l'usage de conjugués fluorescents à base d'anticorps monoclonaux (AcMx) et autres sondes spécifiques couplés à des fluorochromes variés couvrant un large éventail de couleurs (longueurs d'ondes) au sein du spectre de lumière visible. Avec la disponibilité de nouvelles sources lasers dans le rouge (e.g. 633 nm ou
645 nm) et plus récemment dans le violet (405 nm), d'encombrement réduit et économiquement viables, la technologie de la CMF a évolué vers des instruments couramment équipés de 3 lasers, bleu (488 nm), rouge (645 nm) et violet (405 nm), relançant ainsi la course aux fluorochromes. En effet, ces lasers étant dissociés dans l'espace et le temps, il est possible de mesurer indépendamment et sans interférence les diverses « couleurs » de fluorescence induites par chaque laser.
En parallèle à cette évolution de la technologie, un nombre croissant de nouveaux marqueurs de surface de sous-populations cellulaires ou particulaires d'intérêt ont progressivement été identifiés. Ceci a rendu nécessaire de disposer de fluorophores se différenciant par leurs propriétés optiques, afin de pouvoir distinguer les différentes populations ciblées.
L'obtention de nouveaux fluorophores utiles pour un diagnostic différentiel constitue néanmoins un travail de recherche complexe. En effet, un « bon » fluorophore ne s'assimile pas à une simple molécule capable d'absorber la lumière à une longueur d'onde spécifique puis de restituer de la lumière, mais à une molécule répondant à des critères précis, à savoir:
1) Un coefficient d'extinction important
2) Un fort rendement quantique (0,8-0,9)
3) Un faible rendement triplet
4) Une durée de vie de(s) l'état(s) excité(s) courte (3ns)
5) Un grand décalage de Stokes
6) Un faible photo-blanchiment
Compte tenu de ces exigences, le panel de fluorophores actuellement disponibles reste encore limité, ce constat se faisant notamment pour certaines longueurs d'onde d'excitation (laser 405 nm).
Parmi les fluorophores qui ont été utilisés dès les premières applications de la CMF dans le phénotypage cellulaire, on trouve notamment les phycobiliprotéines.
Il s'agit d'une famille de pigments accessoires qui captent la lumière (et qui possèdent en outre des propriétés immuno-modulatrices, anti-inflammatoires, antioxydantes et nutritionnelles), dont les propriétés ont largement été décrites, en particulier dans les brevets US 4,542,104 / US 5,055,556 / US 4,859,582 et EP 0076695 Bl . Aujourd'hui encore, ces fluorophores sont fréquemment utilisés pour les analyses en CMF et autres méthodes de différentiation cellulaire.
En effet, ces molécules sont capables de générer des signaux de fluorescence de spectres complémentaires à celui de la fluorescéine, principal fluorochrome connu comme excitable par le laser bleu 488 nm. Or ce type de laser a longtemps constitué la seule source d'excitation lumineuse dont étaient équipés les premiers cytofluoromètres.
Au sein des phycobiliprotéines, la phycoérythrine (PE) en particulier a rapidement présenté un intérêt majeur du fait de son rendement quanti que élevé, (très supérieur à celui de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)), un pic d'excitation secondaire très utile vers 488 nm (en plus d'un pic majeur vers 560 nm) et une excellente complémentarité de son spectre d'émission par rapport à celui du FITC. Ces caractéristiques en ont fait jusqu'à ce jour un fluorochrome incontournable en immuno-phénotypage par CMF.
En outre, la demande pressante pour de nouvelles « couleurs » de fluorescence compatibles avec le laser 488 nm a incité le développement de tandems à base de PE (e.g. PE-Texas red ou ECD, PE-Cy5, PE-Cy7 ...) permettant des analyses immuno- phénotypique à 5 couleurs avec un seul laser. Enfin, à cette application majeure en CMF s'ajoute celle plus récente des immuno-dosages multiplex par CMF où la PE est le plus souvent utilisée comme révélateur de chaque fluoro-immuno-essai individuel sous forme de conjugués AcMx (« reporter conjugates»).
La PE est donc depuis de longues années un fluorochrome particulièrement intéressant non seulement pour la CMF, mais plus largement pour toutes les méthodes d'analyse, détection ou séparation basées sur des interactions moléculaires de type récepteur/ligand.
Comme illustré par la figure 1, le spectre d'excitation (absorption) de la PE est généralement décrit à partir de 450 nm et comprend d'abord un pic secondaire à 490 nm puis un pic majeur à 560 nm. De ce fait, la PE a toujours été utilisée avec des sources lumineuses d'excitation de longueur d'onde comprise entre 488 et 561 nm, et rien ne permettait d'imaginer qu'elle constituerait un fluorochrome satisfaisant avec une excitation à une longueur d'onde de l'ordre de 405 nm. Or, de façon tout à fait surprenante, les inventeurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence qu'il était possible d'utiliser la phycoérythrine comme fluorochrome, non plus seulement avec des lasers émettant entre 488 et 561 nm, mais aussi avec un laser vers le violet (405 nm).
La présente invention porte donc sur une utilisation inédite de la PE et ses dérivés, tels que ses dérivés tandems, en utilisant une longueur d'onde d'excitation proche de 405 nm au lieu des classiques 488 nm ou 560 nm.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés,
ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 nm et 425 nm,
iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats obtenus à l'étape iii).
Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en œuvre sur un système approprié comprenant au moins un ligand couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés, au moins une source lumineuse émettant une lumière de longueur d'onde comprise entre 330 nm et 425 nm et au moins un détecteur de la lumière émise par le fluorochrome ainsi excité.
Le procédé en question peut viser en outre la détection simultanée d'une seconde, d'une troisième, d'une quatrième, voire d'une cinquième (ou énième) molécule d'intérêt dans un même échantillon. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon caractérisée en ce que la longueur d'onde d'excitation utilisée est comprise entre 330 nm et 425 nm, préférentiellement à 405 nm.
DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente les spectres d'absorption/excitation (lignes discontinues en pointillés) et d'émission (lignes continues et aires sous les courbes en grisé) de la phycoérythrine (R-PE) ainsi que de trois de ses tandems R-PE-TexasRed, R-PE-Cy5.5 et R-PE-Cy7 (adapté de Fluorescence SpectraViewer, Thermofisher Scientific). Les longueurs d'onde (en nm) figurent en abscisse et l'axe des ordonnées illustre les intensités relatives d'absorbance ou d'émission (en %). Les courbes ne sont décrites qu'à partir de 400-450 nm avec des pics d'excitation évidents vers 490, 530 et 560 nm pour la R-PE. En plus de ces trois pics d'excitations, des pics supplémentaires d'excitation sont visibles pour la R-PE-Cy5.5 (660 nm) et la R-PE-Cy7 (760 nm). Le spectre d'émission de la R-PE est une gaussienne centrée sur 575 nm. Les spectres d'émission des tandems sont décalés vers les plus grandes longueurs d'ondes et sont centrés sur 615 nm (R-PE- Texas-Red), 694 nm (R-PE-Cy5.5) et 776 nm (R-PE-Cy7).
Les figures 2 à 8 illustrent l'absence de fuite de la phycoérythrine excitée par le laser bleu dans le canal de lecture du laser violet. Des billes de polystyrène recouvertes de quantités croissantes de R-PE servent de calibrant et sont excitées par les lasers bleu et violet. FL2 correspond aux signaux issus du laser bleu (488 nm) et passant au travers d'un filtre 575 BP 30, derrière un miroir dichroïque 595 DC SP. FL10 correspond aux signaux issus du laser violet (405 nm) et passant au travers d'un filtre identique 575 BP 30, après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP.
Les puissances nominales des lasers bleu et violet sont respectivement de 22 mW et 40 mW (figures 2 et 5). Les billes en singlets sont d'abord pré-sélectionnées par la région « beads » dans une analyse double scatter et leurs fluorescences FL2 et FL10 analysées de façon corrélée. La puissance nominale du laser bleu est réduite à 10 mW (figure 3) puis 5mW (figure 4) alors que la puissance nominale du laser violet est maintenue à 40 mW. La puissance nominale du laser violet est réduite à 10 mW (figure 6) puis 5m W (figure 7) alors que la puissance nominale du laser bleu est maintenue à 22 mW. Le laser violet a été bloqué par un iris en cours d'analyse permettant de faire passer artificiellement sa puissance nominale de 40 mW à 0 mW; la puissance nominale du laser bleu est maintenue constante à 22 mW (figure 8).
La figure 9 illustre la capacité de la PE-Cy5.5 excitée par un laser violet à discriminer un échantillon fortement marqué d'un échantillon faiblement marqué. Des billes de capture recouvertes ou non d'une quantité variable d'anticorps de chèvre antisouris sont mises en présence de l'anticorps conjugué anti-CD45-PE-Cy5.5. L'échantillon est excité successivement par les lasers violet et bleu, les séparations dans l'espace et le temps permettant des analyses différenciées des signaux de fluorescence issus de chacun des lasers. FL4 correspond aux signaux issus du laser bleu (488 nm) et passant au travers d'un filtre 695 BP 30, derrière un miroir dichroïque 730 DC SP pour collecter la fluorescence de PE-Cy5.5. FL10 correspond aux signaux issus du laser violet (405 nm) et passant au travers d'un filtre identique (695 BP 30), après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP.
La figure 10 montre l'identification de sous-populations cellulaires du sang par cytométrie en flux de cellules hématopoïétiques normales réalisée sur la base du marqueur CD45. L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 488 nm est illustré par les figures (A), (C) et (E). L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 405 nm est illustré par les figures (B), (D) et (F). Le repérage et la quantification des sous-populations cellulaires du sang sont représentés par les figures (A), (B), (C) et (D). Les figures (E) et (F) sont une représentation en histogrammes mono-paramétriques combinés des 4 sous- populations lymphocytes (Ly), monocytes (Mo), granulocytes (PM ) et globules rouges résiduels (Ery) du sang.
La figure 11 montre l'identification de sous-populations cellulaires du sang par cytométrie en flux de cellules hématopoïétiques normales et leucémiques réalisée sur la base du marqueur CD45. Les cellules LP1, servant de modèle de cellules anormales à faible niveau d'expression de CD45, ont été ajoutées à raison de 10% par rapport aux cellules blanches normales. L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 488 nm est illustré par les figures (A), (C) et (E). L'excitation du conjugué anti-CD45-PE à 405 nm est illustré par les figures (B), (D) et (F). Le repérage et la quantification des sous- populations cellulaires du sang complété en cellules LP 1 sont représentés par les figures (A), (B), (C) et (D). Les figures (C) et (D) ne laissent apparaître que les blastes leucémiques. Les figures (E) et (F) sont une représentation en histogrammes monoparamétriques combinés des 5 sous-populations lymphocytes (Ly), monocytes (Mo), granulocytes (PMN), globules rouges résiduels (Ery) du sang et les cellules leucémiques de la lignée LP 1 (LP1 ).
La figure 12 montre l'identification de sous-populations cellulaires du sang par cytométrie en flux de cellules hématopoïétiques normales et leucémiques réalisée sur la base des marqueurs CD45 et CD33. Les cellules HL60 et NB4, servant de modèle de cellules anormales de Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) à faible niveau d'expression de CD45 (CD45 low), ont été ajoutées à raison de 50 000 cellules/échantillon. L'excitation du conjugué anti-CD33-PE-Cy7 à 488 nm est illustré par la figure (A). L'excitation du conjugué anti-CD33-PE-Cy7 à 405 nm est illustré par la figure (B). Le repérage et les statistiques associées aux sous-populations cellulaires du sang complété en cellules HL60 et NB4 sont représentés par les figures (A) et (B). Les figures (C) et (D) sont une représentation bi-paramétrique deux couleurs de la distribution des sous-populations cellulaires sanguines normales incluant neutrophiles (Neu et PMN2), lymphocytes (Ly), globules rouges résiduels (GR) du sang, et des cellules leucémiques rajoutées (HL60 et NB4).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de : i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés,
ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats de l'étape iii). Les inventeurs ont mis en évidence, comme démontré dans les exemples ci-après, que la phycoérythrine présente des propriétés de fluorescence suite à son excitation par un laser à 405 nm de nature à permettre son utilisation en tant que fluorochrome en lien avec un tel laser.
Par « molécule d'intérêt», on désigne un marqueur biologique dont on suspecte la présence dans un échantillon. Un tel marqueur biologique peut être de nature protéique, nucléique, glucidique, lipidique ou encore glyco-lipidique.
. _ De préférence, le marqueur biologique détecté par le procédé de l'invention est une protéine, un lipide, un glucide, une structure lipidique, glycolipidique ou un motif glucidique. - . De préférence, le marqueur biologique détecté par le procédé de l'invention est une protéine.
, Par « échantillon », on désigne tout type d'échantillon notamment biologiques constitués par les tissus (muscle, os, organe, etc .), liquides corporels (sang, salive, urine, larmes, sperme, lait, liquide broncho-alvéolaire, liquide pleural, liquide céphalorachidien, etc .), suspensions liquides contenant des molécules d'intérêt, particulièrement des particules, particulièrement des cellules, eucaryotes ou procaryotes, telles que milieux de culture in vitro ou des liquides de fermentation, des eaux de baignade ou de consommation, des liquides injectables.
De préférence, l'échantillon utilisé dans le procédé de détection de l'invention .„ comprend ou est susceptible de comprendre des cellules, procaryotes ou eucaryotes, préférentiellement eucaryotes, préférentiellement issues du corps animal, notamment humain. Dans un tel cas, la molécule d'intérêt à détecter peut être intracellulaire ou ancrée à la membrane plasmique de la cellule. De préférence, la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon à une densité d'au moins 1 000 copies par cellule, plus préférentiellement d'au moins 2 500 copies par cellule, plus préférentiellement encore d'au moins 5 000 copies par cellule.
De préférence, la molécule d'intérêt est présente sur/dans les cellules de l'échantillon à une densité variant de 1 000 à plus de 2 000 000 de copies par cellule, plus préférentiellement de 7 500 à 1 500 000 copies par cellule, plus préférentiellement encore de 10 000 à 150 000 copies par cellule.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la molécule d'intérêt est présente sur/dans les cellules de l'échantillon à une densité d'au moins 7 500 copies par cellule.
... Par « ligand », on désigne une macromolécule capable de se lier physiquement avec . la molécule d'intérêt ciblée, et ceci de manière réversible. Cette interaction est rendue possible par l'existence de zones de complémentarité entre la molécule d'intérêt et le ligand qui lui est spécifique. La liaison entre le ligand et la molécule d'intérêt se fait par l'établissement de liaisons non covalentes, par exemples par des liaisons électrostatiques, forces de Van Der Waals, liaisons ioniques ou hydrogène ou encore grâce à des interactions hydrophobes. Lorsque la molécule d'intérêt est une protéine, le ligand peut alors être un„ anticorps, un fragment d'anticorps ou constructions dérivées (Fab,, Fab'2, nanobody, aptamère, affïmère...). Lorsque la molécule d'intérêt est un déterminant glycosylé, le ligand peut être une lectine ou une toxine bactérienne (ex. FLAER pour son affinité pour les ancres glyco-phosphatidyl-inositol de nombreux antigènes membranaires). Lorsque la molécule d'intérêt est un lipide (ex. phosphatidyl- sérine, céramide, GD2, GD3 ...), le ligand peut être une protéine affine telle que (sans limitation) une annexine, la lactadhérine, la toxine cholérique, ... Enfin lorsque la molécule d'intérêt est un haptène (biotine, DNP, poly-His ...), l'avidine, la streptavidine des anticorps anti-haptène peuvent être mis en jeu. Enfin, pour tout ligand, il est envisageable d'utiliser comme sonde l'un de ses récepteurs. Indépendamment de la nature du ligand ou de la molécule d'intérêt, la stabilité d'association entre le ligand et la molécule d'intérêt est quantifiable par la détermination de la constante d'association ou d'équilibre (Ka) caractéristique de cette liaison. Cette constante est égale au rapport entre la concentration du complexe ligand-molécule d'intérêt et le produit de la concentration de ligand libre et de molécule d'intérêt libre. Pour que cette liaison soit qualifiée de spécifique, elle doit être supérieure ou égale à 106 L.mol"1.
De préférence, le ligand mis en contact avec l'échantillon dans le procédé de détection de l'invention est un anticoips. Par « fluorochrome », on désigne tout type de composé capable, après avoir été irradié par un faisceau lumineux dans une gamme de longueurs d'ondes s'échelonnant de l'ultra-violet à l'infra-rouge, d'émettre en retour un photon de moindre énergie. L'irradiation provoque la fluorescence qui est typiquement une illumination. L'émission de photons se produit lors des transitions électroniques d'une molécule d'un état excité résultant de l'absorption de l'énergie lumineuse vers un état fondamental (relaxation). Ainsi, l'absorption d'un photon par un fluorochrome conduit à l'émission d'un autre photon de longueur d'onde plus importante et de plus faible énergie que celles du photon excitateur. En fonction de la longueur d'onde et de l'énergie du faisceau lumineux, le fluorochrome peut éventuellement atteindre différents états excités. Chaque fluorochrome possède un spectre d'absorption, un spectre d'excitation et un spectre d'émission qui lui sont propres. Le spectre d'absorption d'un fluorochrome est défini par sa gamme de longueurs d'ondes absorbées, sans considération de son excitation. Le spectre d'excitation d'un fluorochrome est défini par sa gamme de longueurs d'ondes induisant effectivement l'excitation et reflète également la gamme d'états excités que le fluorochrome peut atteindre. Lorsqu'on illumine (excite) le fluorochrome à une longueur d'onde correspondant à son maximum d'excitation, l'émission du fluorochrome est alors maximale. Si par contre le fluorochrome est excité à une longueur d'onde différente de son maximum d'excitation, la longueur d'émission est alors la même, mais l'intensité de fluorescence est plus faible. L'efficacité de l'émission de lumière fluorescente pour un fluorochrome donné est déterminée par le rendement quantique phi (φ) défini par le rapport entre le nombre de photons de fluorescence émis et le nombre de photons absorbés par le fluorochrome. Ainsi, ce rendement quantique permet de différencier à une longueur d'onde donnée, l'absorption et l'excitation. Typiquement, les fluorochromes ont des rendements quantiques compris entre 0,1 et 1. Le rendement quantique Φ étant indépendant de la longueur d'onde d'excitation (loi de Kasha), la forme du spectre d'émission d'un fluorochrome est invariante quelle que soit la longueur d'onde de la source lumineuse excitatrice. Toutefois, l'intensité du spectre d'émission d'un fluorochrome varie en fonction de la longueur d'onde d'excitation.
L'intensité d'absorption, ou coefficient d'extinction ε, ou absorbance spécifique, reflète la probabilité d'absorption : plus ε est élevée et plus est élevée la fluorescence à intensité lumineuse égale.
L'intensité de fluorescence ou brillance d'un fluorochrome est déterminé par le produit du coefficient d'extinction et du rendement quantique. Plus ce produit est élevé et plus le fluorochrome est lumineux. Les termes fluorophore, fluorochrome ou sonde fluorescente sont équivalents et pourront être employés indifféremment.
Par « phycoérythrine », on désigne des protéines de la famille des phycobiliprotéines extraites des cyanobactéries, des algues rouges et de certains Cryptophytes. Les phycobiliprotéines sont constituées d'une apoprotéine liée de manière covalente à un chromophore appelé phycobiline. L'apoprotéine possède une structure monomérique comprenant deux polypeptides distincts appelés sous-unités a et β, - organisées sous forme de trimère (αβ)3 ou d'hexamère (αβ)6. Ces complexes typiques - peuvent également contenir un troisième type de sous-unité, la chaîne γ.
Les caractéristiques d'absorbance des phycobiliprotéines sont dues à l'existence de groupes prosthétiques tétrapyrrole à chaîne ouverte qui sont liés aux sous-unités α, β et γ au moyen d'une liaison thioéther avec un résidu cystéine de l'un au moins des polypeptides.
La phycoérythrobiline (PEB) et la phycourobiline (PUB) constituent les deux principaux types de groupes prosthétiques tétrapyrrole des phycoérythrines extraites à partir des algues rouges.
Le nombre de groupes PEB et PUB peut varier en fonction de l'origine cellulaire de la phycoérythrine. Ainsi, cinq classes de phycoérythrine ont été identifiées : la C- phycoérythrine (C-PE) lie deux PEB par sous-unité a et trois PEB par sous-unité β, la CU-phycoérythrine (CU-PE) lie deux PEB par sous-unité a et trois PEB et une PUB par sous-unité β, la b-phycoérythrine (b-PE) lie deux PEB par sous-unité a et quatre PEB par sous-unité β, la B-phycoérythrine (B-PE) lie deux PEB par sous-unité a, trois PEB par sous-unité β et deux PEB et deux PUB par sous-unité γ, et la R- phycoérythrine (R-PE) lie deux PEB par sous-unité a, deux PEB et une PUB par sous-unité β et un PEB et trois PUB par sous-unité γ.
Le rapport entre le nombre de groupes PEB et PUB définit les propriétés spectroscopiques des différentes phycoérythrines. Ainsi, le pic d'excitation maximale des PE varie généralement de environ 545 nm (b-PE) à environ 565 nm (R-PE).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le fluorochrome est la phycoérythrine-R (R-PE), et de préférence la PE utilisée dans le procédé de détection de l'invention est extraite à partir d'algues rouges.
Comme illustré par la figure 1 , le spectre d'absorption de la phycoérythrine est mesuré sur une plage de 400-450 nm à 600 nm et montre 3 pics majeurs d'absoiption correspondant aux intensités maximales d'absorption situées vers 490 nm, 530 nm et 560 nm, La littérature de CMF et tous les manuels pédagogiques instruisent l'utilisateur de choisir l'un de ces 3 pics d'absorption, en tirant parti des sources lasers les plus accessibles en CMF que sont le laser bleu à 488 nm, présent dans la quasi-totalité des appareils du marché actuel, vert à 530 nm et, plus récemment un laser jaune à 560 nm. Maintenant, il n'était pas connu que la très faible absorption à 400 nm environ permettrait une excitation satisfaisante de la PE et donc l'obtention d'une fluorescence applicable à l'identification de sous-populations de cellules hématologiques d'intérêt diagnostique potentiel comme les blastes leucémiques dans le sang humain et qui plus est reproductible. En effet, un fluorochrome qui absorbe de la lumière à une longueur d'onde donnée n'est pas forcément excité efficacement à cette longueur d'onde. Le spectre d'excitation d'une substance est obtenu à l'aide d'un spectrofluorimètre en mesurant la fluorescence émise à une longueur d'onde fixe et en laissant varier la longueur d'onde d'excitation.
Le spectre d'émission de fluorescence est toujours déplacé vers les grandes longueurs d'onde relativement au spectre d'absorption. Le spectre d'émission d'une substance est obtenu en mesurant la fluorescence émise aux différentes longueurs d'onde d'émission, en excitant avec une longueur d'onde fixe. Contrairement à la plupart des fluorochromes, le spectre d'émission de la PE ne correspond pas à un simple décalage vers des longueurs plus élevées de son spectre d'absorption. Comme illustré par la figure 1, le spectre d'émission de la PE est une gaussienne centrée sur 575 nm, alors que le 5 spectre d'excitation montre une forme complexe avec une multiplicité de maxima.
L'émission de la PE est toutefois détectable dès 550 nm. Si la forme du spectre d'émission de fluorescence ne dépend pas de la longueur d'onde d'excitation, l'intensité du rayonnement de fluorescence est directement proportionnelle à la puissance du faisceau d'excitation absorbé par le fluorophore.
10 Sur la base de ce spectre, l'homme de l'art a depuis toujours utilisé les longueurs d'ondes correspondant aux intensités optimales ou légèrement sub-optimales d'excitation
; de ce fluorophore, avec soit une source lumineuse bleue, avec une longueur d'onde variant de 480 nm à 500 nm, soit une source lumineuse vert/jaune, avec une longueur d'onde variant de 530 à 565 nm.
15 . Les chromophores des PE extraites à partir des Cryptophytes contiennent
: . également de la cryptovioline (CV). C'est notamment le cas de la phycoérythrine-544 (PE-544) qui lie deux PEB et deux CV par sous-unité a et un PEB par sous-unité β. Les phycoérythrine-555 (PE-555) et phycoérythrine-568 (PE-568) lie la PEB aux deux types :v.:v ' de sous-unités a et β. Il semble que les PE extraites à partir des Cryptophytes ne 20 : comportent pas de sous-unité γ. Le spectre d'excitation des PE extraites à partir des " : ·■ . Cryptophytes varie généralement de 544 nm (PE-544) à 568 nm (PE-568).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le fluorochrome est la : ; phycoérythrine-R (R-PE), et de préférence la PE utilisée dans le procédé de détection de l'invention est extraite à partir d'algues rouges.
25 Des formes commerciales de la R-PE sont disponibles sous la forme de lyophilisats d'une forme déjà activée (ex. Lyo (SMCC)-RPE, réf. Ll ou L1 SM distribuée \ par FEBICO) ou sous forme liquide (ex. PhycoPro™RPE, réf. PB32 distribuée par i : PROZYME ou R-phycoerythrin, réf. P801 distribuée par INVITROGEN) ou encore le plus souvent sous forme d'un précipité au sulfate d'ammonium (FEBICO, PROZYME) à
30 re-solubiliser et à activer extemporanément lors de l'utilisation. Le couplage du fluorochrome avec le ligand est effectué selon les techniques bien connues de l'homme de l'art (M. Roederer, Conjugation of monoclonal antibodies (August, 2004 ; http://www.drmr.com/abcon/)). Brièvement, après extraction et purification de la PE, celle-ci est activée par voie chimique afin de la rendre réactive envers les groupements thiols. Le ligand subit une étape de réduction qui permet la libération de groupements thiols prêts à réagir. Le couplage covalent du ligand avec la PE peut alors être effectué.
Il existe des kits commerciaux contenant tous les réactifs nécessaires pour effectuer la conjugaison de la PE avec le ligand (ex. PhycoLink® R-Phycoerythrin Conjugation Kit, réf. PJ31K commercialisé par PROZYME, R-Phycoerythrin Conjugation Kit , réf. abl 02918 commercialisé par AbCAM).
Par « dérivés de la phycoérythrine », on désigne les complexes tandems formés _ entre la PE et un autre composé fluorescent. L'établissement d'une liaison covalente entre la PE et ce second composé fluorescent permet un transfert d'énergie par résonnance de la PE vers ce second composé fluorescent. Dans un tel cas, la PE est appelée fluorochrome donneur et le second composé fluorescent est appelé fluorochrome _ accepteur. L but de ces tandems est d'obtenir un transfert d'énergie par résonance (FRET) et par conséquent un grand déplacement entre l'excitation primaire du fluorochrome donneur et l'émission du fluorochrome accepteur (déplacement de Stokes). Ainsi, les complexes tandems faits sur la PE possèdent un spectre d'excitation/absorption correspondant à celui de la PE et un spectre d'émission correspondant à celui du second composé fluorescent. De tels complexes tandems commerciaux actuellement disponibles sont choisis parmi la PE-TEXAS-RED™, PE-Cy5™, PE-Cy5.5™, PE-Cy7™, PE- Alexafluor™610, PE-Alexafluor™647, PE-DyLight™594, PE-Dyomics™590 et RT665™ ainsi que tous les tandems PE-X avec X=tout composé fluorescent capable, après excitation par absorption du photon émis par la PE, d'émettre un photon d'une longueur d'onde supérieure à celui émis par la PE seule (i.e. supérieure à 575 nm).
Les complexes tandems Y-PE avec Y=tout fluorochrome donneur émettant après excitation un photon capté par la PE (i.e. fluorochrome accepteur) sont exclus de la définition des dérivés de la phycoérythrine au sens de la présente invention. En d'autres termes, dans les tandems PE-X selon l'invention la PE est toujours le fluorochrome donneur.
De préférence, l'étape de mise en contact de l'échantillon avec le ligand spécifique de la molécule d'intérêt est effectuée en milieu liquide, de préférence en solution aqueuse.
Par « source lumineuse », on désigne un dispositif capable d'émettre un faisceau de lumière monochromatique. La source lumineuse peut être un laser, une lampe à arc ou une diode électroluminescente (LED). Les lampes à arc (ex: mercure, xénon-mercure) sont des sources lumineuses qui fournissent une lumière incohérente de quelques milliwatts. Elles émettent à des longueurs d'ondes multiples qui doivent être filtrées pour sélectionner les longueurs d'onde désirées. Pour cette raison, la plupart des cytomètres en flux ont plutôt un laser voire plusieurs lasers pour source(s) lumineuse(s). Un laser fournit une lumière cohérente de quelques milliwatts à plusieurs watts, avec une longueur d'onde étroite, bien définie et spécifique. De nombreux lasers de différents types sont actuellement disponibles. Certains lasers couramment utilisés historiquement en CMF comprennent les lasers à argon (351 , 454, 488, 514 nm), au krypton (406, 488, 532, 630 nm), hélium-néon (632 nm), hélium cadmium (325, 441 nm), les lasers Yag (532 nm) et les lasers violets (405 nm). Les progrès technologiques récents ont amenés la disponibilité de lasers beaucoup moins encombrants et de temps de vie rallongé avec la technologie dite des lasers « solid-state » ou DPSS (diode-pumped solid state), que l'on trouve aujourd'hui dans une large gamme de longueurs d'ondes proches des classiques lasers à gaz, en particulier laser DPSS à 488 nm, 635 nm et à 405 nm. Les cytofluoromètres de flux du marché sont aujourd'hui couramment équipés de 3 lasers bleu, violet et rouge et cette, évolution a entraîné le développement de nouveaux fluorochromes excités idéalement par les lasers rouge et violet, en plus de la liste historique des fluorochromes excitables par le laser bleu, dont la PE et ses tandems. Enfin l'évolution rapide et récente de la technologie des lecteurs de CD-ROM et DVD a donné essor à des systèmes de diodes laser qui possèdent des caractéristiques et puissances qui les rendent utilisables comme sources d'excitation alternatives aux lasers DPSS, avec un coût très inférieur (ratio 1 : 100 voire 1 : 1000) du fait de leur production industrielle en grandes séries. On trouve ainsi sur le marché des diodes laser rouges (635 nm, incluses dans les lecteurs de CD-ROM), bleues (450 nm, incluses dans les lecteurs de DVD) et maintenant bleu-violettes (405 nm, incluses dans les lecteurs blue-ray). Il est important de noter qu'il n'existe pas sur le marché de lasers à diode performants et peu chers centrés à 488 nm et que de ce fait, un appareil comprenant uniquement une source laser (alternativement diode laser) à 370 nm ou 405 nm, ou deux sources violette et rouge (405 et 635 nm) sera à la fois plus compact (faible encombrement des diodes laser) et plus économique qu'un appareil réclamant la présence d'une source laser à 488 nm ou 530 nm ou 560 nm. L'utilisation d'un laser à diode bleu-violet (ligne à 405 nm, http://www.lasercomponents.com/fileadmin/user_upload/home/Datasheets/kimmon/blue- violet-laser-specs.pdf) peut également être envisagée pour des méthodologies bio- médicales diverses, dont par exemple la CMF. Des considérations économiques et industrielles (fiabilité, moindre encombrement, facilité d'intégration) confèrent aux diodes laser rouges et violettes (635 et 405 nm) un intérêt particulier pour la création d'instruments d'analyse bio-médicale. Ceci est d'autant plus intéressant avec le développement de nouveaux tests diagnostiques de type « point of care » destinés à être - effectués à proximité directe du patient, en cabinet médical, dans des pharmacies ou d'autres structures médicalisées, à la condition de pouvoir disposer du résultat à bref délai. De tels tests ont pour vocation de favoriser une prise en charge rapide des patients et la prescription immédiate de traitements adaptés.
De préférence, Jadite au moins une source lumineuse servant à l'excitation du- . mélange de l'étape i) dans le procédé de l'invention a une longueur d'onde comprise entre 3.30 et 425 nm, de préférence entre 350 et 420 nm, de préférence encore entre 360 et 410 nm.
.. . Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite au moins une source ... .· lumineuse servant à l'excitation du mélange de l'étape i) dans le procédé de l'invention a. une longueur d'onde comprise entre 400 et 410 nm et préférentiellement à 405 nm.
. .V. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ladite au moins une . source lumineuse servant à l'excitation du mélange de l'étape i) dans le procédé de , . . l'invention est un laser violet ou une diode laser violette émettant à une longueur de 405 nm. L'étape ii) d'excitation du mélange de l'étape i) correspond à une illumination de celui-ci par au moins une source lumineuse. Lorsque l'échantillon contient la molécule d'intérêt et que le ligand couplé à un fluorochrome s'est fixé sur celle-ci, la lumière émise par le mélange consécutivement à l'étape ii) est recueillie à une longueur d'onde égale ou supérieure à 550 nm, qui correspond au début du spectre d'émission de la PE seule. A titre d'exemple, les longueurs d'onde d'émission maximale des tandems PE-TEXASRED™, PE-Cy5™, PE- Cy5.5™, PE-Cy7™, PE-Alexafluor™610, PE-Alexafluor™647, PE-DyLight™594, PE- Dyomics™590 et RT665™ sont respectivement de 613 nm, 670 nm, 690 nm, 775 nm, 628 nm, 665 nm, 618 nm, 599 nm et 680 nm. Ces longueurs d'onde d'émission peuvent varier de quelques nanomètres en fonction de la source et du protocole d'extraction/purification du fluorophore. Elles représentent le centre de la zone de collecte optimale de la fluorescence qui est souvent large de 20 à 50 nm, le plus souvent 30 nm, en fonction de la présence ou l'absence dans l'analyse d'autres fluorochromes de spectres proches.
Un avantage significatif de l'excitation de la PE et ses dérivés avec une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 360 et 410 nm, préférentiellement 405 nm, est que cela génère un déplacement de Stokes très important entre la longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde d'émission, permettant ainsi d'utiliser des filtres de fluorescence (pour la PE) beaucoup moins performants et coûteux que ceux réclamés par une excitation avec une source lumineuse de longueur d'onde à 488 nm voire encore plus à 530 nm ou 560 nm.
■ L'étape iii) de détection de la lumière émise par le mélange après son excitation à l'étape ii) est réalisée à l'aide d'un détecteur optique qui peut être un photomultiplicateur (PMT). Dans ce cas, le signal émis sous forme de photons est converti par le photomultiplicateur en un signal électrique quantifiable. Le procédé de l'invention permet en outre l'identification simultanée d'au moins une seconde, mais aussi. potentiellement d'au moins une troisième, d'une quatrième, voire d'une cinquième (ou énième) molécule d'intérêt dans l'échantillon.
Une telle identification repose notamment sur une utilisation d'un premier ligand couplé à la PE et d'un second, troisième, quatrième, voire cinquième ligand couplé à l'un de ses tandems. La source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, préférentiellement 405 nm, permet d'exciter simultanément la PE et son (ses) tandems, lesquels fournissent des fluorescences de spectres décalés.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identification simultanée d'une seconde molécule d'intérêt peut être effectuée à l'aide d'un second fluorophore excitable par une source lumineuse de même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter la PE ou l'un de ses dérivés, mais qui possède un spectre d'émission distinct de celui de la PE ou de l'un de ses dérivés.
Ainsi, la source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, préférentiellement 405 nm, permet d'exciter simultanément la PE et/ou l'un de ses tandems et des fluorochromes spécifiquement créés pour être excitables à de telles longueurs d'onde. Parmi ces fluorochromes on trouve notamment SYTO40, DAPI, DyLight® 405, Brilliant Violet 421™, HiLyte Fluor™ 405, Pacific Blue™, Pacific Orange™, Cascade® Blue, Alexa Fluor® 405, eFluor® 450, BD™ Horizon™ V450, VioBlue®, VioGreen™, Krome Orange™, Calcein Violet 450 AM™, Zombie Violet™, Aminbmethylcoumarin (AMCA) ou encore certains Q-dot® 565/605/625/655/705/800.
Cette stratégie permet aussi d'associer des fluorochromes libres de droit, comme le DAPI, et la PE voire ses tandems, et donc plus économiques et plus accessibles pour des applications industrielles que des fluorochromes récemment développés pour les travaux avec un laser violet 405 nm. Selon encore un autre mode de réalisation particulier, l'identification d'une seconde molécule d'intérêt peut être effectuée à l'aide d'un second fluorophore excitable par une source lumineuse de longueur d'onde distincte de celle utilisée pour exciter la PE ou l'un de ses dérivés et qui possède un spectre d'émission décalé de celui de la PE ou de l'un de ses dérivés. Ce mode de réalisation particulier nécessite au moins deux sources lumineuses, l'une de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm, préférentiellement 405 nm, permettant d'exciter simultanément la PE et/ou l'un de ses tandems et la seconde source lumineuse de longueur d'onde plus élevée comme par exemple un laser 530 nm ou 560 nm ou encore un laser/diode à 635/640 nm, permettant d'exciter un second fluorophore distinct de la PE et/ou l'un de ses dérivés. Dans tous les cas, l'homme de l'art évitera ou minimisera au maximum que le signal lumineux émit par un fluorochrome déborde dans le canal de détection qui est censé enregistrer le signal émis par un autre fluorochrome. La limitation du chevauchement spectral de 2, 3, 4, 5 ou n fluorochromes permet une détection fiable de plusieurs molécules d'intérêt. Ce procédé est actuellement couramment appliqué en particulier avec un laser 488 nm qui permet en routine la mesure de 5 molécules différentes marquées par des Ac et des fluorochromes différents (e.g. FITC, PE, PE- Texas-Red ou ECD, PE-Cy5, PE-Cy7).
L'étape iv) de détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon repose sur la comparaison des résultats obtenus à l'étape iii) dans cet échantillon avec ceux obtenus pour un échantillon référence dont on sait qu'il ne contient pas la molécule d'intérêt.
Une fois la détermination de la présence de la molécule d'intérêt établie, l'étape iv) peut également servir à calculer le nombre de copies de la molécule d'intérêt dans l'échantillon. Cette étape de quantification peut être effectuée en comparaison avec une gamme étalon contenant des quantités croissantes et connues de la molécule d'intérêt ciblée.
Le procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon selon l'invention peut être mis en œuvre sur un cytomètre en flux. Le procédé de de détection de l'invention pourra être utilisé pour la séparation, l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires dans un échantillon biologique.
Le procédé de détection de l'invention pourra être utilisé pour la séparation, l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires d'origine hématopoïétique.
Un second objet de l'invention concerne l'utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce que la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est comprise entre 330 et 425 nm, de préférence entre 350 et 420 nm, de préférence encore entre 360 et 410 nm. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est comprise entre 400 et 410 nm et préférentiellement à 405 nm.
L'invention est illustrée par les exemples qui suivent sans pour autant que le 5 contenu de leur enseignement ne restreigne la portée de l'invention ni n'en constitue une limitation.
EXEMPLES
1 - Genèse de l'invention
C'est une observation fortuite qui est à l'origine de cette invention. Plus10 . spécifiquement, et lors d'une expérience classique de réglage de compensation de . fluorescence réalisée par un expert de ce type de cytomètre en flux à 3 lasers (BC Gallios™), une fuite parasite de faible niveau dans l'un des détecteurs associés au laser violet (canal FL10) à été remarquée par l'inventeur. En l'espèce, une bille de capture d'Ig de souris, du type de celle décrite dans l'exemple 2 et marquée uniquement par un 15 ..conjugué PE donnait -un niveau de signal non négligeable en FLI O (fluorescence entre 530 et 570 nm, filtre 550 BP40), là où la théorie aurait attendu une absence totale de fluorescence en absence de conjugué marqué au Krome-Orange™, fluorophore compatible avec cette gamme de longueurs d'ondes d'excitation et d'émission. L'inventeur, qui n'a pas trouvé anodine cette observation a souhaité comprendre le 0 pourquoi de cette fuite.
- Pour ce faire, il a fallu i) disposer d'un système similaire c'est-à-dire une bille marquée uniquement en PE et ii) modifier la structure standard du banc optique de cet appareil en déplaçant des filtres. Les différents filtres du banc optique ont été changés de . . place manuellement pour faire passer chaque filtre devant le détecteur FL10 lié à 5 l'excitation 405 nm. Ces modifications ont permis de vérifier que le signal maximum était obtenu avec le filtre optimisé pour la PE (575 BP 30), normalement installé en liaison avec le laser bleu 488 nm et sur le détecteur FL2. En conséquence, les résultats de ce test a suggéré qu'il puisse s'agir d'un signal fluorescent issu de la PE, seul fluorochrome présent sur ce type de bille mais dans le contexte inattendu d'une excitation à 405 nm.
Pour les vérifications qui ont suivi, des modifications non conventionnelles de l'appareil ont été nécessaires. Ces modifications ont visé à permettre la lecture de la 5 fluorescence de la PE simultanément sur les canaux FL2 (position normale liée à l'excitation à 488 nm, telle qu'enseignée dans les manuels d'utilisation) et FL10 (position anormale, liée à l'excitation à 405 nm), ce qui n'a pu être réalisé que par la disponibilité au même lieu de deux appareils similaires, le filtre PE du second cytomètre Gallios™ étant emprunté ponctuellement pour le placer en position FL10 du premier cytomètre 10 Gallios™. Ces manipulations anachroniques ont permis, comme le montrent les exemples ci-après, d'illustrer la possibilité de mesurer des niveaux variés de fluorescence PE sous excitation 405 nm avec une efficacité surprenante et une résolution proche de celle obtenue avec l'excitation conventionnelle à 488 nm.
2 - Etude de la contamination croisée des fluorescences inter-lasers
15 · .. . , . Certains dispositifs d'analyse, comme les cytomètres en flux ou les trieurs de cellules, peuvent posséder jusqu'à 6 lasers supplémentaires en plus du laser violet à 405 nm. Couramment, ces instruments sont aujourd'hui équipés de 3 lasers à savoir i) un laser
: . ' · ; bleu 488 nm, considéré comme le laser de référence temporelle et qui analyse les scatters en;plus de multiples fluorescences, ii) un laser rouge 640 nm qui illumine les cellules en-
20 dessous/après le point d'illumination de référence, iii) un laser violet à 405 nm qui illumine les cellules au-dessus/avant le point d'illumination de référence du laser bleu. Ce système d'illumination en points multiples permet une double séparation, optique et temporelle des fluorescences issues de chacun des points d'illumination. En effet, le signal issu de chacun des 3 lasers est i) décalé dans le temps d'un délai de l'ordre de
.25 quelques dizaines de micro-secondes (classiquement 30 à 40 μ$) et il) décalé dans l'espace d'une distance de L'ordre de quelques centaines de micromètres (classiquement 100 μπι) ce qui permet leur focalisation différentielle par l'optique de collecte vers des fibres optiques différentes (une par laser). De ce fait, il est classiquement considéré en CMF multi-couleurs que les fluorescences issues de l'un des trois lasers sont 30 essentiellement dépourvues de contamination optique issue de l'un des deux autres lasers.
2.1 - Principe Le fonctionnement d'un cytomètre multi-lasers met en jeu l'excitation des particules à analyser par chacun des lasers de façon décalée, dans l'espace et dans le temps. Chaque cellule/particule passe successivement au-travers des faisceaux lumineux. Sur cytomètre GALLIOS™/NAVIOS (Beckman-Coulter, Villepinte, F) à 3 lasers (violet - bleu - rouge soit 405-488-640 nm), l'ordre de passage est violet - bleu - rouge, la distance entre les points d'impact est -100 μηι et le délai de ~30 μβ. La lentille de collecte des signaux lumineux à 90° (« pick-up lens ») collecte différent) ellement les lumières émises aux 3 points d'impact et les focalise sur 3 entrées de fibres optiques indépendantes, lesquelles conduisent ensuite la lumière vers un système optique capable de dissocier indépendamment les longueurs d'ondes issues de chacune des fibres optiques.
Chaque laser travaille en routine à une puissance nominale fixe (violet 40 mW- bleu 22 mW - rouge 25 mW). En intervenant dans le module Service du GALLIOS™, il est .possible de modifier volontairement la puissance de chaque laser et d'étudier ainsi l'impact de la puissance d'excitation sur les signaux mesurés par le cytomètre.
. Ce principe a été mis à profit pour démontrer que la PE est effectivement excitable par un laser violet (405 nm) et éliminer tout risque d'artéfact qui viendrait d'une contamination croisée de fluorescences en inter-laser, en particulier une fuite de fluorescence induite par le laser bleu vers les détecteurs couplés au laser violet. 2.2 - Calibrateurs
Des. billes de polystyrène d'un diamètre de 10 μιη et couvertes de quantités variables de PE servent de calibrateurs : les billes Cl, C2, C3 et C4 possèdent respectivement 900, 7500, 1 15 000 et 1 250 000 molécules de R-PE/bille. Deux lots de billes ont été synthétisés et mis en suspension dans une solution de PBS + BSA 0,1% + azide de sodium 0,1%.
2.3 - Protocole Le signal du laser bleu donne le t0 pour une particule et les signaux associés à cette même particule par les autres lasers sont pris à respectivement à t0-30 (laser violet) et to+30 μ8 (laser rouge). Outre les analyses de référence faites en conditions standards de puissances lasers (violet 40 mW- bleu 22 mW - rouge 25 mW), on a pu tester des puissances variées de:
Laser bleu : 22- 20-10-5-3-1 mW
Laser violet : 40 - 30 - 20 - 5 - 1 mW Dans certains cas, il est aussi possible de couper le laser violet (via un iris commandé par le logiciel) en cours d'analyse. Maintenant, le laser bleu doit toujours rester fonctionnel puisque servant de t0. Il peut être baissé en puissance mais pas totalement bloqué, à la différence des 2 autres lasers.
L'agencement des filtres du banc optique a été modifié pour optimiser la détection des signaux de fluorescence de la PE véhiculés par les fibres couplées aux points de " focalisation respectifs des lasers bleu et violet. Dans ce montage particulier, deux exemplaires identiques d'un filtre passe-bande 575 BP 30, optimal pour la PE, sont utilisés en parallèle, l'un devant le détecteur FL2 et l'autre devant FL10. Le canal FL2 mesure ainsi le signal PE issu du laser bleu (488 nm) et passant au-travers du filtre 575 BP 30, derrière un dichroïque 595 DC SP. FL10 correspond aux signaux de PE issus du ." laser violet (405 nm) passant au-travers d'un filtre 575 BP 30 identique, après renvoi par un miroir dichroïque 480 DC SP.
2.4 - Résultats
Les puissances nominales des lasers bleu et violet sont respectivement de 22 mW et 40 mW (figure 2, échelle 4 décades et figure 5, échelle 5 décades). Les billes en singlets sont d'abord pré-sélectionnées par la région « beads » dans une analyse double scatter et leurs fluorescences FL2 et FL10 analysées de façon corrélée.
• Modulation du laser bleu (488 nm)
La puissance nominale du laser bleu est réduite à 10 mW (figure 3) puis 5mW (figure 4) alors que la puissance nominale du laser violet est maintenue à 40 mW.
Comme illustré par la Figure 2, on observe une :
Très nette; séparation des 4 pics en FL2, rapports des médianes égaux ou supérieurs à 10. Séparation effective mais légèrement moins marquée en FL10 (avec rapports des médianes maxi = 8), et spécialement dans les plus bas niveaux de densité de la PE.
La chute de puissance du laser bleu de 22 mW à 10 mW (figure 3), puis 5 mW (figure 4) fait baisser l'intensité de toiis les pics en FL2 (laser bleu) sans aucun impact sur la fluorescence en FL10 (laser violet). Cet effet se confirme pour des puissances inférieures à 5 mW, en particulier 3mW ou encore 1 mW (non illustré).
Des résultats comparables ont été obtenus sur un second lot de billes de calibrateur (non illustré). La chute de puissance maximale du laser bleu (diminué à 1 mW) impose un changement d'échelle sur les histogrammes pour une analyse optimale (5 décades au lieu de 4).
• Modulation du laser violet (405 nm)
La puissance nominale du laser violet est réduite à 10 mW (figure 6) puis 5mW (figure 7) alors que la puissance nominale du laser bleu est maintenue à 22 mW.
La référence (figure 5) reste identique à la figure 2 mais avec utilisation d'échelles à 5 décades.
Comme le montrent les figures 6 et 7, la baisse de puissance du laser violet de 40 mW (figure 5) à 10 mW (figure 6) puis à 5 mW (figure 7) fait baisser l'intensité de tous les pics en FL10 (PE issue du laser violet) sans aucun impact sur la fluorescence en FL2 (PE issue du laser bleu).
De plus, le blocage du laser violet à 0 mW par un iris en cours d'analyse (figure 8) conduit à une image rassemblant les fluorescences PE (FL2 et FL10) vues dans les deux conditions, avant et après blocage. On observe bien pour chaque sous-famille de billes PE la chute drastique d'intensité de FL10 pour le laser violet ouvert versus fermé, alors que celle de FL2 demeure inchangée.
En conclusion, l'étude de l'impact de la puissance laser sur la répartition de fluorescence PE d'un calibrant à 4 niveaux de charge de PE montre : 1) Que les modulations du laser bleu n'impactent que la résolution en FL2 (PE issue du laser bleu)
2) Que les modulations du laser violet n'impactent que la résolution en FL10 (PE issue du laser violet) Ceci permet d'éliminer tout risque d'artéfact qui viendrait d'une contamination croisée de fluorescences en inter-laser, en particulier une fuite de fluorescence PE induite par le laser bleu vers les détecteurs couplés au laser violet.
Finalement, la linéarité des profils obtenus permet de valider le fait que la fluorescence de la PE est bien consécutive à une excitation à 405 nm et donc confirme la possible utilisation de la PE en tant que fluorochrome avec un laser à 405 nm.
• 3 - i Etude de- l'excitation des tandems sur PE avec un laser à 405 nm (et/ou 488 nm)
3.1 - Principe
Des billes de capture d'Ig (immunoglobulines) de souris sont marquées par divers conjugués. E et/ou tandems de la PE. Les 3 niveaux de marquage ainsi produits sont ■ analysés en utilisant le même filtre passe-bande sur respectivement FL2, FL4 ou FL5 (excitation 488 nm de référence pour respectivement PE, PE-Cy5 et PE-Cy7) et sur FL10 (excitation 405 nm testée, filtrée avec le même filtre que celui utilisé pour respectivement PE, PE-Cy5 et PE-Cy7). 3.2 - Billes de captures
Des billes de capturé d'Ig (H+L) de souris d'un diamètre de 7 μιτι SPHERO- COMPtroI Particles, réf. CMIgP-70-3K commercialisées par SPHEROTECH, Inc. sont utilisées conformément aux instructions du fournisseur. Les trois populations de billes correspondent à un témoin négatif, une bille faiblement chargée et une bille fortement chargée par l'anticorps de chèvre anti-souris et par conséquence par l'Ig de souris conjuguée.
3.3 - Protocole Les billes de capture incubées avec 20 μΐ. de conjugué (anticorps de souris couplé à la PE ou l'un de ses dérivés PE-Cy5, PE-Cy5.5 ou PE-Cy7) à température ambiante, à l'obscurité pendant lh. Puis, on ajoute 500 μΐ. de tampon PBS-BSA.
Le même filtre passe-bande que celui de la FLi optimale du laser bleu (i.e. FL2, 4 ou 5) est pris sur un second cytomètre Gallios™ similaire à celui du test et placé sur le canal FL10.
3.4 - Résultats
Comme illustré par là figure 9, on observe une nette séparation de tous les 3 pics non seulement en FL4, mais également en FL10 pour un anticorps de souris couplé au tandem PE-Cy5.5. Des résultats comparables ont été obtenus pour des anticorps de souris couplés à la PE, PE-Cy5 et PE-Cy7.
Le tableau ci-dessous reprend l'intégralité des résultats obtenus pour les 4 anticorps testés.
¾f ;- - ¾PE>- , . ί PE-CY5 PE-CY5.5 PE-CY7 *
AH 1,4 2,9 1 1,1
Al 2,5 9,3 4,3 3
AJ 41,2 171,2 85 54,3
Rl= AJ/AI 16 18 20 18
R2= AI/AH 2 3 4 3
R3= AJ/AH 29 59 85 49 Le calcul des rapports RI, R2 et R3 rend compte respectivement de la capacité à discriminer :
RI : un échantillon fortement marqué vs faiblement marqué,
R2 : un échantillon faiblement marqué vs non marqué, et
- R3 : un échantillon fortement marqué vs non marqué.
Les valeurs des rapports montrent bien que l'excitation de la PE, PE-Cy5, PE- Cy5.5 et PE-Cy7 par un laser violet permet une excellente discrimination entre un échantillon fortement marqué vs faiblement marqué, et à plus forte raison entre un échantillon fortement marqué vs non marqué. Bien que dans une moindre mesure en comparaison de ce qui est observé lors d'une excitation par le laser bleu, il est également possible de discriminer un échantillon faiblement marqué vs non marqué.
4 - Identification de sous-populations cellulaires 4.1 - Echantillon Le modèle utilisé consiste en du sang total (WB) pris sur EDTA contenant un type cellulaire anormal représenté ici par la lignée de myélome multiple LP1. Ce modèle illustre un cas de détection de cellules hématopoïétiques leucémiques qui peuvent être ici assimilées à des blastes.
Les cellules LP1 ont été ajoutées à l'échantillon de sang total à une concentration de 10% par rapport aux cellules blanches totales. 4.2 - Marquage des cellules
: La caractérisation des différentes populations cellulaires présentes dans l'échantillon a été .réalisée grâce à un anticorps monoclonal anti-CD45 couplé à la PE (BioCytex). La densité de CD45 est de l'ordre de 200,000 molécules/lymphocyte versus 120,000 molécules/monocyte, respectivement, 217+ 64 x 103 vs 103 ± 44 x 103, selon BIKOUE et al, (Cytometiy, 26: 137-147 (1996)).
La technique consiste à incuber les cellules du sang total en présence de l'anti- CD45-PE. Les globules rouges sont ensuite lysés, les cellules restantes (globules blancs) sont lavées pour éliminer le conjugué fluorescent non lié, puis analysées par cytométrie en flux.
4.3 - Analyse par cytométrie en flux
Dans notre expérience et selon la littérature, les blastes recherchés en routine dans les formules-numérations sanguines seront le plus souvent mieux discriminés par ce système CD45 x SSC que les cellules LP1 de cet exemple, surtout si d'autres paramètres (volume, FSC) y contribuent.
Les cellules LP1 n'étant pas totalement isolées des granulocytes normaux (PMN) dans un graphe CD45 x SSC, on a tiré parti ici d'un paramètre complémentaire i.e. une auto-fluorescence bleue des cellules LP1 en FL9 (Ex 405 nm / Em 460/20 nm) supérieure à celles des cellules sanguines normales qui facilite leur repérage et la colorisation des sous-populations illustrées.
Classiquement, le paramètre « side scatter » (SS) permet la discrimination des 3 sous-populations majeures de leucocytes -i.e. lymphocytes, monocytes et granulocytes (notés aussi PMN pour polymorpho-nucléaires.). Les cellules LP1 se sur-ajoutent au tableau habituel, positionnées au même niveau de SS que les PMN, et au-dessus des PMN en paramètre « forward scatter » (FS). Le graphe FS x SS aide également à mettre une fenêtre d'analyse sur les globules rouges (GR) résiduels, restés après la lyse.
Les cellules marquées ont été analysées sur un cytomètre en flux Gallios™ (Beckman Coulter). L'analyse a été effectuée sur environ 30 μΐ d'échantillon marqué, en acquiérant au minimum 7000 événements à une vitesse de 60μί/ηιίη. pendant 30 secondes. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel informatique KALUZA® (Beckman Coulter). Les voltages des PMTs FL2 et FL10 étaient respectivement de 350 V et 420 V et lès signaux lumineux filtrés par le même type de filtre 575 nm/30 (filtre FL10 standard remplacé par un filtre 575 nm/30) de façon à collecter sur FL2 et FL10 la fluorescence de la PE excitée respectivement par le laser bleu 488 nm et le laser violet 405 nm.
La stratégie d'analyse comprend tout d'abord un conditionnement de l'ensemble des cellules dans une fenêtre d'analyse taille/structure. La fluorescence en PE des différentes sous-populations cellulaires peut être visualisée sur un graphe bi-paramétrique représentant l'intensité de fluorescence en ordonnée en fonction d'un paramètre lié à la granularité des cellules (SS) et qui permet une première classification des leucocytes dans l'ordre d'intensité SS, i.e. de gauche à droite lymphocytes, monocytes et granulocytes/PMN (et LP1 dans le cas de la surcharge en LP1) et en abscisse le nombre d'événements. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MFI) pour chaque tube. Les cellules de la lignée LP1 sont d'autre part isolées par l'association de deux paramètres, i.e. leur taille, vue sur le paramètre FS (plus importante que les autres leucocytes) et leur auto-fluorescence détectable en FL9 (460 nm +/- 20 nm).
4.4 - Résultats
• Sang normal
Comme illustré par les figures 10 (A) à (D), la comparaison des graphes CD45-PE vs SS montre des distributions assez similaires que la PE soit excitée par le laser bleu (488 nm/FL2) ou par le laser violet (405 nm/FL10). Les 2 conditions permettent une bonne discrimination CD45 vs SS des sous-populations cellulaires majeures du sang total.
La représentation en histogrammes mono-paramétriques combinés des 4 sous-populations (Lymphocytes, monocytes, granulocytes et globules rouges résiduels, Figures 10 (E) et (F)) montre que l'étagement des intensités de marquage CD45 est respecté.
Après excitation de la PE à l'aide de l'un de chacun de ces deux lasers et collecte de la lumière émise sur un filtre optimal pour la PE (condition standard Ex 488 nm / Em 575730 nm et condition testée Ex 405 nm / Em 575/30 nm), le ratio entre les MFI des sous populations cellulaires est calculé et illustré dans le tableau ci-dessous.
Ratios Laser 488 nm Laser 405 nm
Lymphbcytes/Monocytes 41/19,7 = 2,1 78,3/39,1 = 2,0
Lym phocytes/PM N 41/5,9 = 7,0 78,3/14 = 5,6
Lymphocytes/GR 41/0,6 = 68,3 78, 3/2,1 = 37,3
Monocytes/PMN 19,7/5,9 = 3,3 39,1/14 = 2,8
Monocytes/GR 19,7/0,6 - 32,7 39,1 /2,1 = 18,6
PMN/GR 5,9/0,6 = 9,8 14/2,1 = 6,7 On voit que, même s'ils sont très légèrement inférieurs dans le système 405 nm, ces ratios sont conservés et que F étagement des MFI entre les sous-populations est respecté.
Cet étagement de MFI similaire entre les deux systèmes 488 nm et 405 nm se traduit par des ratios entre sous-populations assez proches. La plus grande dynamique de mesure du système standard avec excitation de la PE à 488 nm (par rapport au système découvert ici d'excitation de la PE à 405 nm) ne s'observe vraiment que lorsque l'on compare une sous-population non marquée (GR) avec les sous-populations marquées, par ex. 68 vs 37 pour les ratios Lymphocytes/GR.
• Sang surchargé avec des blastes leucémiques Lorsque l'analyse CD45 vs SS est pré-conditionnée pour laisser apparaître les blastes leucémiques (LPl), on observe une modification de forme du nuage des PMN, qui est comparable dans les deux systèmes i.e. excitation du CD45-PE à 488 nm (Figure 1 1 (C)) ou à 405 nm (figure 11 (D)), ce qui suggère que l'un et l'autre système offre la possibilité de détecter des cellules pathologiques présentes dans le sang et caractérisées par un niveau d'expression CD45 anormal. De plus, les modifications sur le graphe CD45 x SS du sang et suggère que les cellules LPl se situent dans un nuage proche (et en superposition partielle) de celui des granulocytes.
La superposition des histogrammes mono-paramétriques de marquage CD45-PE sur l'ensemble des sous-populations de cet échantillon sanguin (Figures 1 1 (E) et (F)) illustre les similitudes de distribution du marquage dans les 2 systèmes à 488 nm et 405 nm. On y voit que l'histogramme des LPl se superpose sur celui des PMN.
Après excitation de la PE à l'aide de l'un de chacun de ces deux lasers et collecte de la lumière émise sur un filtre optimal pour la PE (condition standard Ex 488 nm / Em 575/30 nm et condition testée Ex 405 nm / Em 575/30 nm), le ratio entre les MFI des sous populations cellulaires normales et leucémique est calculé et illustré dans le tableau ci-dessous.
Ratios Laser 488 nm Laser 405 nm
Lymphocytes/ onocytes 41/19,7 = 2,1 78,3/39,1 = 2,0
Lymphocytes/PMN 41/5,9 = 7,0 78,3/14 = 5,6
Lymphocytes/GR 41/0,6 = 68,3 78, 3/2,1 = 37,3
Monocytes/PMN 19,7/5,9 = 3,3 39,1/14 = 2,8 Ratios Laser 488 nm Laser 405 nm
Monocytes/GR 19,7/0,6 = 32,7 39,1 /2,1 = 18,6
PMN/GR 5,9/0,6 = 9,8 14/2,1 = 6,7
Lymphocytes/Blastes 41/5,2 = 7,9 78,3/13,4 = 5,8
Monocytes/Blastes 19,7 /5,2 = 3,8 39,1 /13,4 = 2,9
PMN/Blastes 5,9/5,2 = 1,13 14 /13,4 = 1,04
Blastes/GR 5,2/0,6 = 8,7 13,4 /2,1 = 6,4
Là encore, les ratios de MFI entre blastes et cellules sanguines normales sont assez , proches dans les 2 systèmes à 488 nm et 405 nm, montrant ainsi que la discrimination de sous-populations de cellules sanguines à valeur diagnostique est faisable même en 5 excitant la PE à 405 nm
Au final, les discriminations qui sont observées, après excitation indépendante de , . la PE par un laser bleu 488 nm (référence) et par un laser violet 405 nm, entre des sous- ■— ; - populations de cellules marquées à des niveaux divers par ce fluorochrome montrent que la PE peut être utilisée comme fluorochrome avec un laser violet, en permettant d'utiles0 discriminations entre sous-populations cellulaires d'intérêt, comme par exemple les sous- . populations de: leucocytes sanguins normaux et de cellules leucémiques après un marquage par un anticorps CD45.
5 - Identification de blastes leucémiques
5.1 - Echantillon 5 ·. Le modèle utilisé consiste en du sang total (WB) pris sur EDTA contenant deux
, types cellulairès anormaux représentés ici par les lignées de LAM HL60 et NB4. Ces modèles illustrent un cas de détection de cellules hématopoïétiques leucémiques qui peuvent être ici assimilées à des blastes.
. . Les cellules HL60 et NB4 ont été mélangées à une concentration de 5 millions/ml0: - en PBS-BA. 10 μΐ de ce mélange ont été ajoutés à 50 μΐ d'échantillon de sang total, soit .. 50 000 cellules du mélange HL60 et NB4 pour 50 μΐ de sang total.
5.2 - Marquage des cellules
La caractérisation des différentes populations cellulaires présentes dans l'échantillon a été réalisée grâce à un anticorps monoclonal anti-CD45 couplé à la PE (BioCytex) utilisé seul ou en marquage multi-couleurs en présence d'autres réactifs fluorescents dont un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la PE-Cy7.
La technique consiste à incuber le sang total surchargé en cellules HL60 et NB4 en présence de l'anti-CD45-PE seul ou en combinaison l'anti-CD33 couplé à la PE-Cy7. Les globules rouges sont ensuite partiellement lysés, les cellules restantes sont lavées pour éliminer le(s) conjugué(s) fluorescent(s) non lié(s), puis analysées par cytométrie en flux.
L'efficacité de la lyse des globules rouges a été volontairement limitée afin de garder dans l'analyse une présence notable de globules rouges résiduels, utiles à la démonstration. En effet, les globules rouges résiduels sont par définition négatifs pour tous les marqueurs testés.
5.3 - Analyse par cytométrie en flux
Dans notre expérience, les sous-populations cellulaires (cellules normales et blastes leucémiques) seront le plus souvent discriminées par le système CD45 x SSC (non illustré ici) ou par le système CD33 x SSC (Fig 12A et B) et le système CD33xCD45 (Fig 12C et D).
Les cellules marquées ont été analysées sur un cytomètre en flux Gallios™ (Beckman Coulter). L'analyse a été effectuée sur environ 30 μΐ d'échantillon marqué, en acquiérant au minimum 7000 événements à une vitesse de 60 L/min. pendant 30 secondes. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel informatique KALUZA® (Beckman Coulter). Les voltages des PMTs FL5 et FL10 étaient respectivement de 600 V et 900 V et les signaux lumineux filtrés par le même type de filtre 755 nm long pass (filtre FL10 standard remplacé par un 2nd filtre 755 nm long pass identique à celui placé en FL5) de façon à collecter sur FL5 et FL10 la fluorescence de la PE-Cy7 excitée respectivement par le laser bleu 488 nm et le laser violet 405 nm.
La stratégie d'analyse comprend tout d'abord un conditionnement de l'ensemble des cellules dans une fenêtre d'analyse taille/structure. La fluorescence en PE ou PE-Cy7 des différentes sous-populations cellulaires peut être visualisée sur un graphe bi- paramétrique représentant l'intensité de fluorescence en ordonnée en fonction d'un paramètre lié à la granularité des cellules (SS) en abscisse, et qui permet une première classification des leucocytes dans l'ordre d'intensité SS, i.e. de gauche à droite lymphocytes, monocytes et granulocytes/PMN (et blastes dans le cas de la surcharge en HL60 + NB4). Pour chaque type cellulaire défini sur le graphe par une région d'intérêt, le logiciel rend un pourcentage de toutes les cellules présentes dans le graphe et une intensité de fluorescence moyenne (MFI, notée « Y-Med »).
Lors du marquage multi-couleurs (incluant CD45-PE et CD33-PE-Cy7), un graphe bi -paramétrique représentant les intensités de fluorescence correspondantes, respectivement en abscisse et en ordonnée, permet également de visualiser les différentes sous-populations cellulaires. 5.4 - Résultats
Comme illustré par les figures 12 (A) et (B), la comparaison des graphes CD33-PE- Cy.7 (CD33-PC7) vs SS montre des distributions cellulaires similaires que la PE-Cy7 (PC7) soit excitée par le laser bleu (488 nm/FL5) ou par le laser violet (405 nm/FL10). Les deux conditions d'excitation permettent une bonne discrimination CD33 vs SS des sous-populations cellulaires majeures (lymphocytes, monocytes, PMN et globules rouges résiduels) du sang total ainsi que des blastes leucémiques (HL60 et NB4). De plus, les • \? blastes se différencient par le niveau d'expression CD33 : les cellules HL60 possèdent un niveau d'expression de CD33 supérieur à celui observé pour les cellules NB4. i Après excitation de la PE-Cy7 à l'aide de l'un de chacun de ces deux lasers et collecte . de Ja lumière émise sur un filtre optimal pour la PE-Cy7 (condition standard Ex 488 nm / Em 755 nm long pass et condition testée Ex 405 nm / Em 755 nm long pass), le ratio entre lès MFI des sous populations cellulaires normales et leucémiques est calculé et illustré dans le tableau ci-dessous.
Là encore, les ratios de MFI entre blastes et cellules sanguines normales sont assez proches dans les 2 systèmes à 488 nm et 405 nm, montrant ainsi que la discrimination de sous-populations normales et leucémiques de cellules sanguines à valeur diagnostique est faisable même en excitant la PE-Cy7 à 405 nm.
Au final, les' discriminations qui sont observées, après excitation indépendante de la PE-Cy7 par un laser bleu 488 nm (référence) et par un laser violet 405 nm, entre des sous-populations de cellules marquées à des niveaux divers par ce fluorochrome montrent que la PE-Cy7 peut être utilisée comme fluorochrome avec un laser violet, en permettant d'utiles discriminations entre sous-populations cellulaires d'intérêt, comme par exemple les sous-populations de leucocytes sanguins normaux et de cellules leucémiques après un marquage par un anticoips CD33. En outre, comme illustré par les figures 12 (C) et (D), la comparaison des graphes
CD33-PE-Cy7 (FL5) vs CD45-PE (FL2) ou CD33-PE-Cy7 (FL10) vs CD45-PE (FL2) montre des distributions cellulaires comparables, que la mesure de fluorescence soit effectuée en FL5 (exc.488 nm) ou en FL10 (exc. 405 nm). Cette analyse bi-paramétrique permet même une meilleure discrimination de deux sous-populations de neutrophiles (Neu et PMN2) sur la base de leur niveau d'expression de CD33. La discrimination des globules rouges résiduels et des lymphocytes sur la base du niveau d'expression de CD45 est également meilleure.
Ces résultats montrent que les dérivés de la PE, illustrés ici par la PE-Cy7, sont utilisables à une longueur d'onde d'excitation de 405 nm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un procédé de détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, comprenant les étapes de :
i) Mise en contact de l'échantillon avec un ligand qui est spécifique de cette molécule d'intérêt et qui est couplé à un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés,
ii) Excitation du mélange de l'étape i) par au moins une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 330 et 425 nm,
iii) Détection d'une émission de lumière par le mélange consécutivement à l'étape ii) à une longueur d'onde supérieure ou égale à 550 nm, et iv) Détermination de la présence ou non de la molécule d'intérêt dans l'échantillon au regard des résultats de l'étape iii).
2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite au moins une molécule d'intérêt est une protéine, un lipide, un glucide, une structure lipidique, glycolipidique ou un motif glucidique.
3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel l'échantillon comprend ou est susceptible de comprendre des cellules.
4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le ligand spécifique de ladite au moins une molécule d'intérêt est un anticorps.
5. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le fluorochrome est la R-phycoérythrine (R-PE).
6. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ladite au moins une source lumineuse servant à exciter le mélange de l'étape i) a une longueur d'onde comprise entre 400 et 410 nm.
7. Le procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite au moins une source lumineuse servant à exciter le mélange de l'étape i) est un laser violet ou une diode laser violette émettant à une longueur d'onde de 405 nm.
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lequel permet en outre l'identification simultanée d'au moins une seconde molécule d'intérêt dans l'échantillon.
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, lequel est mis en œuvre sur un cytomètre en flux.
10. Une utilisation d'un fluorochrome consistant en la phycoérythrine ou l'un de ses dérivés pour la détection d'au moins une molécule d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce que la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est comprise entre 330 et 425 nm.
1 1 . Une utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la séparation, l'analyse ou la numération de sous-populations cellulaires ou particulaires dans un échantillon biologique.
12. Utilisation selon la revendication précédente caractérisée en ce que les sous- populations cellulaires ou particulaires sont d'origine hématopoiétique.
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