EP3308169A1 - Methode de pronostic d'hemopathies lymphoïdes - Google Patents

Methode de pronostic d'hemopathies lymphoïdes

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Publication number
EP3308169A1
EP3308169A1 EP16734438.1A EP16734438A EP3308169A1 EP 3308169 A1 EP3308169 A1 EP 3308169A1 EP 16734438 A EP16734438 A EP 16734438A EP 3308169 A1 EP3308169 A1 EP 3308169A1
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EP
European Patent Office
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cells
secreting
antibody
represented
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16734438.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Guillaume Cartron
Edouard TUAILLON
Anne-Laure GAGEZ
Renaud CEZAR
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57505—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the blood, e.g. leukaemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
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    • G01N2333/5428—IL-10
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    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a prognostic method for lymphoid hemopathies, including lymphoid leukemias and lymphomas.
  • rituximab (MabThera®) has improved the survival of patients with lymphoma or chronic lymphocytic leukemia and the quality of life of patients with dysimmune disease.
  • Rituximab is a chimeric lgG1 immunoglobulin recognizing CD20 expressed by B cells of the pro-lymphocyte stage at the plasma cell stage. Different mechanisms of action of rituximab have been described in vitro, some dependent on its variable portion Fv (apoptosis), the others of its constant portion Fc (ADCC, CDC, phagocytosis). Fc ⁇ RIIIa is expressed by natural killer cells (NK cells) and macrophages, effector cells of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
  • NK cells natural killer cells
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • FCGR3A gene leading to a substitution of amino acid 158 on the receptor makes it possible to distinguish good responder patients (homozygous 158-V) from rituximab of patients with poorer responders ( homozygous 158-F and heterozygous).
  • FCGR3A genotype of a subject can be used for patients suffering from malignant tumors, in particular lymphoma, and is suitable for the selection of the best responders and / or the treatment condition or protocol adjustment for low response profile responders.
  • Interleukin-10 (IL-10) secreting B cells are immunocompromising cytokines that have the function, inter alia, of limiting the cytotoxic T response. These cells are present in mice and in humans. Tumor B cells can have a function B10, namely to secrete IL-10.
  • One of the aims of the invention is to overcome these disadvantages.
  • Another object of the invention is to provide a prognostic method allowing simply and rapidly to determine which therapeutic protocol to apply in a given pathological situation, taking into account the chances of success and in order to limit the costs related to therapeutic failures.
  • Yet another object of the invention is to provide a kit or a prognostic kit for implementing said method.
  • the invention relates to an in vitro prognostic method for therapeutic antibody-mediated therapeutic response in a tumor sample from a patient with hematology,
  • said antibody being an antibody depleting the cells of said hemopathy
  • the method comprising determining in vitro the amount of Interleukin-secreting L cell B in said tumor sample, such that a patient from which the sample is derived tumor, having a quantity of IL-10 secreting B cells less than 5% of the total amount of said sample cell will have more than 50% chance of depletion of more than 90% of the cells of said hematopathy after treatment with said therapeutic antibody.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors, on the one hand, that the aforementioned hemopathies have a population of B cells secreting IL-10, and on the other hand that the quantity of these cells influences the prognosis of the patient if treated with a therapeutic antibody.
  • the inventors have found that the lower the amount of cells secreting IL-10 before treatment, the better the response to treatment, and therefore the better the patient's prognosis.
  • the inventors have been able to show that if the amount of cells secreting IL-10 is less than 5% of the total number of circulating cells of the hematology, the prognosis of the patient after treatment will be favorable in more than half cases.
  • tumor sample from a patient suffering from hemopathy a blood sample, or a biopsy of which all or part of the sample or biopsy comprises tumor cells.
  • the aforementioned tumor sample is obtained from the patient before the start of treatment to eradicate the hematological disorder.
  • Red blood cells, anucleate cells, are not taken into consideration.
  • the prognostic method of the invention relates to therapeutic antibodies or more generally "antibodies". Both appellations will be used below, unless specifically specified.
  • the term "therapeutic antibody” is intended to mean an antibody whose function is to eliminate specific target cells in an individual or a patient. Examples of target cells are tumor cells, cells infected with one or more viruses, pathological immunocompetent cells (for example B or T lymphocytes, antigen-presenting cells, etc.) involved in allergies, autoimmune diseases. ... or even normal cells (endothelial cells in an anti-angiogenic therapeutic strategy). Preferred target cells are tumor cells and infected cells.
  • IgG1 isotype therapeutic antibodies such as rituximab can mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity or ADCC, but also antibody-dependent cellular phagocytosis or ADPC and complement-dependent cell lysis or CDC.
  • the therapeutic antibodies according to the invention may be produced by hybridomas or by genetic engineering, and are advantageously of IgG1 or IgG3 isotype.
  • the preferred therapeutic antibodies in the invention are antibodies, of the aforementioned isotype, directed against tumor antigens (molecules expressed on the surface of tumors) such as CD20, CD22, CD25, CD38, or more generally the hematopoietic tumor antigens, preferably lymphoid.
  • depleting antibody in the invention an antibody that is capable of inducing the depletion of the target cells, that is to say their reduction or depletion.
  • the prognosis of the invention is based on the determination of the amount of tumor B cells that are capable of secreting interleukin 10 or IL-10.
  • IL-10 has an inhibitory effect on the immune response, by inhibiting the production of certain cytokines, such as interleukin 2, interleukin 3, TNF and some interferons.
  • IL-10 also acts on immunity by modulating the number of different cells involved in the immune system (mast cells, lymphocytes, etc.).
  • the inventors By quantifying the number of IL-10 secreting B cells in hemopathies, the inventors found that tumors with less than 5% of these cells prior to treatment had a better response to therapy with a therapeutic antibody. leads to a better prognosis for the patient. It is then possible to envisage for the patient a therapy based on this single therapeutic antibody, or in combination with other protocols (chemotherapy, radiotherapy, etc.). Beyond the 5% threshold of IL-10 secreting B cells, the prognosis of the patient treated with a single therapeutic antibody is unlikely to be very good, and it is therefore recommended to consider a different, more appropriate treatment regimen. .
  • the prognosis of the invention makes it possible to determine the chance of success of a treatment with the aid of a therapeutic antibody, and to determine the best therapy to offer the patient, while rationalizing the costs, avoiding giving heavy and expensive treatments to patients who will not respond well, if at all.
  • the invention relates to the abovementioned prognostic method, which furthermore comprises the determination of the amino acid at position 176 of the Fc ⁇ RIIIa receptor sequence, as represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or in position 158 of the FcYRIIIa receptor sequence, as represented by the sequence SEQ ID NO: 2,
  • FcYRIIIa as represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or at position 158 of the sequence of the FcYRIIIa receptor as represented by the sequence SEQ
  • the invention relates to a method for in vitro prognosis of the therapeutic response mediated by a therapeutic antibody in a tumor sample from a patient suffering from hemopathy, said antibody being an antibody depleting the cells of said hemopathy, the method comprising determining in vitro in the cells of said sample:
  • the inventors made a second surprising observation: if the determination of the amount of IL-10 secreting B lymphocytes is combined with the determination of a particular polymorphism of the Fc ⁇ RIIIa receptor, the patient's prognosis will be significantly improved.
  • the determination of the single polymorphism of the Fc ⁇ RIIIa receptor does not provide sufficient information to predict a correct response of patients to treatment with a therapeutic antibody.
  • the polymorphism of the Fc ⁇ RIIIa receptor has already been described in the state of the art and in particular in the international application WO2003035904. Depending on whether the amino acid at position 176 of the protein, or at position 158 of the modified mature protein, is phenylalanine (F) or valine (V), the therapeutic response to a therapeutic antibody will be different.
  • the protein consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the FcYRIIIa protein
  • the protein consisting of the sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to the mature FcYRIIIa protein
  • 176V / V (or 158V / V), 176V / F (or 158V / F) and 176F / F (or 158F / F).
  • the level of IL-10-secreting B cells is less than 5% of the total amount of cells in the tumor. This means that rates of 4.9%, 4.8%, 4.7%, 4.6%, 4.5%, 4.4%, 4.3%, 4.2%, 4.1% , 4%, 3.9%, 3.8%, 3.7%, 3.6%, 3.5%, 3.4%, 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3% %, 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.3%, 2.2%, 2.1%, 2%, 1, 9%, 1, 8%, 1, 7%, 1, 6%, 1, 5%, 1, 4%, 1, 3%, 1, 2%, 1, 1%, 1%, 1%, 0, 9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% or 0.1% of cells secreting IL-1 10 are particularly advantageous.
  • the invention relates to the above-mentioned prognostic method, in which the hematopathy is a hematology whose cells express the CD20 surface marker, that is to say whose tumor cells express the CD20 surface marker.
  • CD20 is the first human B-cell differentiation antigen to have been identified using monoclonal antibodies. It is a specific marker of B cells during their development from the pre-B stage to the mature B cell stage. It is nevertheless absent from the surface of the plasma cells.
  • the coding gene is located in chromosome 11.
  • CD20 belongs to a family of molecules comprising CD20, the ⁇ chain of the high affinity IgE receptor and the HTm4 molecule present on the surface of lymphoid and myeloid hematopoietic cells and whose function is unknown.
  • the invention relates to the aforementioned prognostic method, in which the hematopathy is selected from chronic lymphocytic leukemia B (CLL), diffuse large B cell lymphoma and all these histological variants expressing CD20, follicular lymphomas and mantle lymphomas, marginal zone lymphomas, MALT lymphoma (MALT) lymphoma, Burkitt lymphoma, lymphoplasmocytic lymphoma, Waldenstrom's disease, prolymphocytic leukemia B, and all unclassifiable CD20 + B lymphomas
  • CLL chronic lymphocytic leukemia B
  • MALT lymphoma (MALT) lymphoma Burkitt lymphoma
  • lymphoplasmocytic lymphoma Waldenstrom's disease
  • prolymphocytic leukemia B and all unclassifiable CD20 + B lymphomas
  • the invention relates to a method of in vitro prognostic above the therapeutic response mediated by a therapeutic antibody in a tumor sample from a patient with chronic lymphocytic leukemia.
  • the invention relates to a prognostic method as defined above, in which the amount of IL-10 secreting B cells in the sample is measured by flow cytometry, after activation of secretion of IL10, or by measuring the circulating level of IL-10 in the serum.
  • the advantageous method of the invention is flow cytometric detection.
  • the nucleated cells isolated from a patient are cultured and treated with compounds stimulating the secretion of IL-10. It is then possible either to determine the amount of IL-10 secreted in the culture medium, which is not good quantitative information insofar as the stimulation is artificial, or to proceed to a step of blocking the secretion, so that the IL-10 produced is sequestered in the secretory B cells.
  • the cells can then be labeled with an anti-IL-10 antibody, and quantified by flow cytometry. Experimental details are given in the example below.
  • the inventors have also shown that there is a correlation between the amount of IL-10 secreting B cells in the tumor of a patient suffering from hemopathy as defined above and the amount of circulating IL-10. in the plasma of said patients (see also example below). Also, by a simple assay of IL-10 in the serum, it is possible to determine, certainly more approximately, the proportion of IL-10 secreting B cells in the patient.
  • the invention relates to the abovementioned prognostic method, in which the in vitro determination of the amino acid at position 176 of the FcvRIIIa receptor sequence, as represented by the sequence SEQ ID NO: 1 , or in position 158 of the FcvRIIIa receptor sequence as represented by the sequence SEQ ID NO: 2 is carried out by polymerase chain reaction (PCR), such as PCR, reverse transcription-coupled PCR (RT-PCR) ) or nested PCR, using conventional methods and specific oligonucleotides (primers).
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription-coupled PCR
  • primers specific oligonucleotides
  • Genotyping of the gene encoding the FCYRI IIA receptor can be accomplished by a variety of techniques including nucleic acid or protein analysis. Assays can be performed by specific digestion with restriction enzymes, hybridizations, or advantageously amplification / separation / sequencing. It may even be possible to determine and identify polymorphism from RNAs.
  • the techniques described in the application WO2003035904 apply mutatis mutandis.
  • the oligonucleotides used as primers will preferably be single-stranded oligonucleotides comprising 50 nucleotides, advantageously about 30 nucleotides, preferably from 17 to 25 nucleotides. It is preferable that the oligonucleotides have at least 5 or even at least 8 nucleotides strictly complementary to the target sequence to be amplified, and in particular the nucleotide at the 3 'position of said oligonucleotide.
  • one skilled in the art can use the sequence of the human FCGR3A gene, accessible in the databases, in particular under the number AL590385 in the GenBank database, or else the sequence of the complementary DNA accessible in the GenBank database under the number NM_000569.
  • oligonucleotides for determining the prognosis are the oligonucleotides represented by the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the invention is not limited to these specific oligonucleotides, and the person skilled in the art is capable of designing other specific oligonucleotides.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said therapeutic antibody is a IgG1 or IgG3 immunoglobulin, in particular an anti-CD20 antibody, in particular rituximab.
  • the therapeutic antibody which is used in the context of the method of the invention is therefore advantageously an anti-CD20 antibody, and in particular rituximab.
  • the method of the invention is advantageously intended to provide a prognosis of response for patients treated with this antibody for chronic lymphocytic leukemia B or B-cell lymphoma.
  • Rituximab is a chimeric monoclonal antibody directed against the CD20 surface molecule.
  • the variable Fab part of rituximab binds to the CD20 antigen of B lymphocytes, and its constant Fc portion can generate immune effector functions that cause lysis of these lymphocytes.
  • the possible mechanisms of effector-mediated cell lysis are complement-dependent cytotoxicity (CDC), involving the binding of the C1q fragment, an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), through one or more of the Fc ⁇ receptors on the surface.
  • granulocytes, macrophages and NK cells and phagocytosis (or ADPC) also passing through the interaction with Fc ⁇ receptors on the surface of granulocytes, macrophages. It has also been shown that rituximab, by binding to the CD20 antigen of B cells, induces cell death by apoptosis.
  • the invention relates to a method for in vitro prognosis of the therapeutic response mediated by an anti-CD20 therapeutic antibody of lgG1 or IgG3 isotype in a tumor sample from a patient suffering from chronic lymphocytic leukemia. or a B-cell lymphoma, the method comprising determining in vitro in the cells of said sample:
  • FcYRIIIa as represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or in position 158 of the FcYRIIIa receptor sequence as represented by the sequence SEQ ID NO: 2, and
  • the invention relates to a kit for the in vitro prognosis of a patient suffering from a hematological disorder that can be treated with a therapeutic antibody, particularly for the prognosis of chronic lymphocytic leukemia or B-cell lymphoma. , comprising:
  • the kit or prognostic kit of the invention provides the means for measuring the two parameters which are essential for the above-mentioned method: the polymorphism of the receptor and the amount of IL-10 secreting B cells.
  • the kit or kit also contains control samples that correspond to samples from healthy individuals (negative controls) and / or individuals with poor prognosis (positive controls) and / or individuals have been diagnosed with poor prognosis (positive controls).
  • control samples may also be indications or computer data on a physical medium allowing calibration of a flow cytometer to determine the amount of IL-10 secreting B cells.
  • the means for detecting the amount of IL-10 secreting B cells may be antibodies for cytometric evaluation of flow of cells, but also drugs to stimulate and / or inhibit the production of IL-10. It may also be antibodies for measuring the level of IL-10 circulating in the plasma.
  • the invention relates to a kit for the prognosis as defined above, wherein the means for detecting the amino acid at position 176 of the Fc ⁇ RIIIa receptor as represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or in position 158 of the FcYRIIIa receptor sequence, as represented by the sequence SEQ ID NO: 2, comprise the oligonucleotides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 sequences.
  • oligonucleotides to PCR amplify the region corresponding to the polymorphism, and determine which are the alleles carried by the patient who is tested.
  • the invention relates to a computer program product on a carrier suitable for the in vitro detection of IL-10 secreting B cells in a sample of a patient with hematology.
  • Another aspect of the invention is a software or computer program product designed to implement the detection of IL-10 secreting B cells by flow cytometry and / or comprising portions / means / instructions of program code for executing said detection when said program is executed on a computer, in particular connected to a flow cytometer.
  • said program is included in a computer-readable data recording medium.
  • a medium is not limited to a portable recording medium such as a CD-ROM but may also be part of a device comprising an internal memory in a computer (for example RAMs and / or ROMs), or external memory device such as hard disks or USB keys, or a server nearby or remotely.
  • the invention relates to a computer program product on a suitable support for the implementation of the prognostic method as defined above, said computer program product for determining the amount of B cells secreting IL-1.
  • the invention relates to a method for improving the treatment of hematological diseases by therapeutic antibodies comprising the use of at least one inhibitor of secretion or activity of IL-10 by lymphocytes.
  • the invention relates to a method for improving the treatment of hemopathies with an anti-CD20 antibody, including rituximab comprising the use of at least one inhibitor of the secretion or activity of IL-10 by lymphocytes.
  • the invention in another aspect, relates to a method for improving the treatment of hematological disorders with therapeutic antibodies comprising the use of at least one IL-10 secreting lymphocyte inhibitor.
  • the invention relates to a method for improving the treatment of hematological diseases by an anti-CD20 antibody, including rituximab comprising the use of at least one inhibitor of B cells secreting IL-10.
  • IL-10 secreting B-cell inhibitor or IL-10 secreting lymphocytes
  • IL-10 secreting lymphocytes is meant in the invention compounds or molecules, or mixtures thereof, capable of interfering with the activity of IL-10 secreting cells.
  • B10 lymphocytes either by inhibiting their ability to secrete IL-10, by inhibiting their proliferation, or by inducing their death, in particular by apoptosis.
  • Secretion inhibitors such as Brefeldin A can be used.
  • IL-10 inhibitors such as antibodies directed against NL10, or the use of mimetic peptides which will saturate the targets of interleukin and thus inhibit the action of the native protein.
  • the invention also relates to the use of inhibitors of the activity or secretion of IL-10 for the preparation of a medicament for promoting the treatment of hematological diseases by therapeutic antibodies, in particular an anti-CD20 or rituximab.
  • the invention relates to an inhibitor of the activity or secretion of IL-10 for use in the treatment of blood disorders treated with at least one therapeutic antibody, especially an anti-CD20 antibody or rituximab.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one inhibitor of the activity or secretion of IL-10 and at least one antibody therapeutic, in particular an anti-CD20 antibody or rituximab, for the treatment of hematological diseases in which the tumor cells have a valine at position 176 of the FcvRIIIa receptor sequence, as represented by the sequence SEQ ID NO: 1, or position 158 of the FcvRIIIa receptor sequence as represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the x-axis represents the amount of IL-10 in the plasma in ⁇ g / mL and the y-axis represents the percentage of B10 cells expressed in%.
  • the abscissa axis represents the% lymphodepletion percentage and the ordinate axis represents the percentage of B10 cells expressed in%.
  • Figure 3 is a graph showing that lymphocyte depletion is statistically greater for patients carrying the FcYRIIIa-158V allele
  • ROC receiver operating curve
  • FIG. 5 represents a graph comparing the number of regulatory B cells (listed by cytometry - abscissa axis) with the IL-10 secretion assay (rapid method - ordinate axis).
  • the broken line rectangle corresponds to individuals with a low risk of suboptimal response with an anti-CD20 antibody.
  • the rectangle with solid lines corresponds to individuals with a high risk of suboptimal response with an anti-CD20 antibody.
  • R 0.79.
  • rituximab (marketed under the brand names MabThera®, Rituxan®) remain unknown and could be different depending on the subtype lymphoproliferative disorder B.
  • Rituximab is known to induce in vitro apoptosis, complement-mediated lysis (CDC), antibody-mediated cellular cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent phagocytosis (ADPC), and some outcomes. tend to involve these mechanisms in vivo.
  • the inventors had previously observed that the Fc ⁇ RIIIa V / F receptor polymorphism affects the clinical response to rituximab treatment. Since this polymorphism modifies the affinity of the constant portion of IgG1 for the Fc ⁇ RIIIa receptor, (expressed on the surface of NK cells and macrophages), the inventors hypothesized that the mechanism of ADCC should be important in the treatment of follicular lymphoma treated with rituximab.
  • B10 or B10 cells are characterized by their ability to modulate inflammation, autoimmunity, and the innate or adaptive immune response due to IL-10 production.
  • B10 cells would be able to inhibit anti-CD20 antibody-induced lymphoma cell removal by acting on the monocytic functions mediated by the constant parts of immunoglobulins (Fc parts).
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • the inventors then considered that competent IL-10 cells of CLL could have an influence on the efficacy of rituximab treatment of patients suffering from this type of leukemia.
  • a prospective and randomized phase II study was conducted in 59 French centers including 140 patients between June 2012 and January 2013. Patients who received no prior treatment (aged 18 to 65 years) and whose diagnosis of lymphoid leukemia Chronic was confirmed by immunophenotyping according to the criteria IWCLL 2008 (Binet of stage C, or binet of stage A or B with an active disease), were enrolled in this test. An additional inclusion criterion was taken into account: the absence of deletion 17p, evaluated by FISH ( ⁇ 10% positive nuclei). All patients provided informed written consent prior to inclusion.
  • Patients are stratified according to their IGVH mutational status after FISH analysis (deletion 11q) and are randomly assigned with a ratio of 1: 1 to receive either the standard dose of FCR chemotherapy (fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab) for arm A or Dense-FCR with a prephase of rituximab prior to standard FCR treatment for arm B.
  • FCR chemotherapy fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab
  • the standard FCR treatment consists of 6 courses spaced 28 days of rituximab (375 mg / m 2 for the first treatment, J1 and 500 mg / m2 for the other courses), fludarabine (40 mg / m2 / day J2-4) cyclophosphamide (250 mg / m2 / day).
  • the FCR treatment is preceded by a rituximab prephase composed of 4 successive infusions, distributed as follows: 500 mg on day 0, and 2000 mg on day 1, day 8 and day 15.
  • Treatment 1 begins at D22 for the patients and the following courses are spaced 28 days apart.
  • IL-10 competent CLL cells are identified by flow cytometry from purified mononuclear blood cells after polyclonal stimulation.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • medium RPMI 1640 - Biotech GmbH, Aidenbach, Germany
  • 10% fetal calf serum EUROPEAN, Courtaboeuf, France
  • 2 mM L-glutamine Eurobio, Courtaboeuf, France
  • 100 U / mL penicillin 100 ⁇ g / mL streptomycin
  • 2.5 ⁇ g / mL amphotericin All antibiotics are obtained from Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France).
  • CpG ODN 2006, 10 g / mL, InvivoGen, San Diego, USA
  • CD40L 50 ng / mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA
  • anti-polyHistidine 500 ng / mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA
  • Phorbol acetate and myristate PMA, 50 ng / mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • ionomycin (1 g / mL, Sigma-Aldrich, St.
  • the cells were labeled with the following antibodies: anti CD19 BV421 (HIB 19), anti CD69 PE / Cy7 (FN 50), anti CD38 APC (HIT 2), anti IL-10 PE (JES3-9D7) at BioLegend (San Diego, CA, USA), and anti CD45 KO (J.33) and anti CD5 FITC (BL1a) from Beckman Coulter (Brea, CA, USA).
  • Clonal LLC cells were identified as lymphocytes CD19 + CD5 + CD20int. Assays were performed using a CyAnTM ADP flow cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
  • Plasma IL-10 levels were determined using Luminex® magnetic bead technology, using a dual laser reading system, as recommended by the manufacturer (R & D Systems, Minneapolis, USA). The plasma of the 68 patients was incubated with superparamagnetic beads coated with anti-IL-10 antibody for 2h, at room temperature, diluted to 1 ⁇ 2. Plasma IL-10 is quantified by the combination of two antibodies for detection: a biotinylated IL-10 antibody and a streptavidin antibody conjugated to phycoerythrin.
  • FCYRI I IA-158VF polymorphism is determined by nested PCR. Briefly, single-stage allele-specific multiplex PCR assays were performed as described in DallOzzo et al. (Dallozzo et al J Immunol Methods, 2003, 277 (1-2): 185-192) with some modifications.
  • the 25 ⁇ l of the reaction mixture comprises genomic DNA, 400 nM sense primer (5'-TCCAAA AGCCACACTCAAAGTC-3 '(SEQ ID NO: 3)), 400 nM antisense primer specific for the V allele (5' - AGACACATTTTTACTCCCATC -3 '(SEQ ID NO: 4)) and 200nM of antisense primer specific for the F allele (5 -
  • the PCR conditions are: 3.5 min at 95 ° C followed by 35 cycles, each cycle consisting of 95 ° C for 20 sec, 56 ° C for 20 sec, 72 ° C for 30 sec.
  • the PCR products (137bp for the F allele and 81bp for the "allele B") are separated on 8% acrylamide gel (Invitrogen, Carlsbad, USA) and visualized by ethidium bromide labeling.
  • the median number of leukemia lymphocytes before the four doses of rituximab (J0) was 91.13 G / L (range: 3.74-497.40) and was 2.60 G / L (range: 0.14- 189.40) at the end of the prephase treatment rituximab alone (J22).
  • the median lymphocyte depletion after prephase treatment with rituximab alone (J22) was 95.1% (range 77.0-99.9), of which 66% achieved a depletion of more than 90%.
  • B10 (not shown).
  • the frequency of B10 cells does not vary according to the characteristics of patients, nor is it significantly different in patients with CLL with or without IGVH mutation (median: 6.29%, range: 0.12 to 15.83 versus median: 1.85% , range: 0.23 to 20.81, respectively).
  • such frequencies of B10 cells do not correlate with cytogenetic alterations (del11q, del13q, trisomy 12) either.
  • VN true negatives
  • the double detection makes it possible to obtain, for thresholds lower than 5% of B10, a good sensitivity (approximately 86%).
  • the inventors have therefore determined a B10 population in patients with chronic lymphocytic leukemia and receiving rituximab. At the same time they determined the FcYRIIIa-158VF phenotype of these patients. They showed that the frequency of B10 cells and the FcgYRIIIa-158VF polymorphism influenced the response to rituximab in patients with chronic lymphocytic leukemia. Analysis of these two factors combined improves the sensitivity and specificity of predicting the prognostic response. Lymphodepletion Lymphodepletion ⁇ 90% Analysis
  • Table 1 Parameters influencing rituximab-induced lymphocytosis monotherapy in 68 patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). The group of patients with lymphocyte inhibition of less than 90% was used as a reference for odds ratios.
  • the inventors have also proposed a simple and rapid method for analyzing the frequency of regulatory B cells. This method was compared to the reference method which is based on intracytoplasmic detection of IL-10 synthesis in flow cytometry.
  • the method consists of a first step of enriching the population of B lymphocytes that are normally very minor among the leucocytes by negative selection from a peripheral blood sample.
  • the blood is collected on a phase separation tube (BD type vacutainaer CPT).
  • the blood can be transferred from a primary tube containing an anticoagulant into the phase separation tube.
  • a RosetteSep StemCell depletion cocktail is added to the blood sample in order to enrich the leukocyte phase in the B lymphocyte.
  • a separation by centrifugation and two cell washing centrifugations a population containing more 90% of B lymphocytes is obtained.
  • the cells are enumerated by visual counting (cells under a microscope) or by cytometry to prepare a concentration of 6 million cells per ml and cultured in a medium containing RPMI + 10% fetal calf serum.
  • the cells are stimulated by a cocktail of polyclonal activators such as a mixture of CPG motifs and CD40 lignant-histidine + antibodies.
  • An unstimulated well is made in parallel.
  • the culture is kept 18h to 48h at 37 ° C without intervention.
  • the cell culture is centrifuged and the culture supernatant collected and stored at -20 ° C or tested immediately by an enzyme immunoassay (EIA) technique to determine the secreted IL-10 concentration.
  • EIA enzyme immunoassay

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Abstract

L'invention concerne une méthode de pronostic comprenant la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 dans un échantillon biologique, de sorte qu'un patient dont est issu l'échantillon ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans ledit échantillon inférieure à 5% aura plus de 50% de chances d'avoir un bon pronostic suite à un traitement.

Description

Méthode de pronostic d'hémopathies lymphoïdes
La présente invention concerne une méthode de pronostic d'hémopathies lymphoïdes, notamment des leucémies lymphoïdes et des lymphomes.
Les anticorps monoclonaux ont révolutionné la prise en charge thérapeutique dans un grand nombre de pathologie incluant les cancers et les maladies dysimmunitaires. Le rituximab (MabThera®) a permis par exemple d'améliorer la survie des patients atteints d'un lymphome ou d'une leucémie lymphoïde chronique et la qualité de vie des patients atteints d'une maladie dysimmunitaire.
Le rituximab est une immunoglobuline lgG1 chimérique reconnaissant le CD20 exprimé par les lymphocytes B du stade pro-lymphocyte au stade plasmocytaire. Différents mécanismes d'action du rituximab ont été décrits in vitro, les uns dépendants de sa portion variable Fv (apoptose), les autres de sa portion constante Fc (ADCC, CDC, phagocytose). FcYRIIIa est exprimé par les cellules tueuses naturelles (cellules NK) et les macrophages, cellules effectrices de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC).
Il a été montré qu'un polymorphisme du gène FCGR3A conduisant à une substitution de l'acide aminé 158 sur le récepteur (FcYRIIIa-158VF) permettait de distinguer les patients bons répondeurs (homozygote 158-V) au rituximab des patients moins bons répondeurs (homozygote 158-F et hétérozygote).
En particulier, il est connu de la demande de brevet WO2003035904 que la détermination du génotype FCGR3A d'un sujet peut être utilisée pour des patients souffrant de tumeurs malignes, notamment de lymphome, et convient à la sélection des meilleurs sujets répondants et/ou à l'ajustement de condition de traitement ou de protocole pour les sujets répondants à profil de réponse faible.
Malgré tout, les mécanismes d'action des anti-CD20 in vivo restent mal compris et pourraient être différents en fonction de la pathologie. De plus, il est important de noter que la prédiction de l'efficacité par l'analyse du polymorphisme FcYRIIIa-158VF n'est actuellement pas d'usage clinique puisque 67% des patients avec un phénotype défavorable répondent quand même au rituximab. Il existe donc un intérêt à mieux comprendre les mécanismes d'action afin de proposer de nouvelles stratégies d'amélioration du traitement mais aussi pour mieux sélectionner les patients qui pourraient ne pas répondre à ce type de traitement onéreux afin de les orienter vers d'autres alternatives thérapeutiques.
Il existe parmi les cellules de l'immunité des lymphocytes B sécréteurs dl'interleukine-10 (IL-10) (cellules B10), une cytokine immunomodulatrice ayant notamment pour fonction de limiter la réponse T cytotoxique. Ces cellules sont présentes chez la souris et chez l'homme. Les lymphocytes B tumoraux peuvent présenter une fonction B10, à savoir sécréter de l'IL-10.
Il a été montré dans un modèle de lymphome murin que la fréquence de B10 chez la souris interférait avec la réponse au traitement par un anti-CD20 murin (Horikawa et al. J Clin Invest. 2011 Nov 1 ; 121 (11 ): 4268-4280). Toutefois, la fréquence des cellules B10 chez l'homme n'a pas été reliée à la réponse thérapeutique des patients traités avec un anticorps anti CD20 dans la mesure où l'étude a été menée chez la souris. Par ailleurs l'activité biologique des différents isotypes d'immunoglobulines ainsi que l'expression des récepteurs à la portion Fc des immunoglobulines sont très différentes entre l'homme et la souris. L'extrapolation des résultats obtenus chez la souris à l'homme n'est donc pas possible et en aucun cas les résultats obtenus dans un modèle murin ne sont applicables à l'homme sans démonstration en clinique.
La compréhension de la réponse à l'immunothérapie demeure, et il est nécessaire de disposer d'éléments permettant d'adapter le traitement des patients.
Un des buts de l'invention est de pallier ces inconvénients.
Un autre but de l'invention est de fournir une méthode de pronostic permettant simplement et rapidement de déterminer quel protocole thérapeutique appliquer dans une situation pathologique donnée, en tenant compte des chances de succès et en vue de limiter les coûts liés aux échecs thérapeutiques.
Encore un autre but de l'invention est de fournir une trousse ou un kit de pronostic permettant de mettre en œuvre ladite méthode.
L'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie,
ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 dans ledit échantillon tumoral, de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 inférieure à 5% de la quantité totale de cellule du dit échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique.
L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs d'une part que les hémopathies susmentionnées présentent une population de cellules B sécrétant de l'IL-10, et d'autre part que la quantité de ces cellules influe sur le pronostic du patient s'il est traité avec un anticorps thérapeutique. En outre, les inventeurs ont constaté que plus la quantité de cellules sécrétant de l'IL-10 est faible avant le traitement, meilleure sera la réponse au traitement, et donc meilleur sera le pronostic du patient. En particulier, les inventeurs ont pu montrer que si la quantité de cellules sécrétant de l'IL-10 est inférieure à 5% du nombre total des cellules circulantes de l'hémopathie, le pronostic du patient après traitement sera favorable dans plus de la moitié des cas.
Dans le cadre de l'invention on entend par « échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie », un prélèvement de sang, ou une biopsie dont tout ou partie du prélèvement ou de la biopsie comprend des cellules tumorales. L'échantillon tumoral susmentionné est obtenu chez le patient avant le début du traitement visant à éradiquer l'hémopathie.
Les hématies, cellules anucléées, ne sont pas prises en considération.
La méthode de pronostic de l'invention concerne des anticorps thérapeutiques ou plus généralement « anticorps ». Les deux appellations seront utilisées ci-après, à moins de précisions spécifiques. On considère comme « anticorps thérapeutique » un anticorps dont la fonction est d'éliminer des cellules cibles déterminées chez un individu ou un patient. Les exemples de cellules cibles sont des cellules tumorales, des cellules infectées par un ou plusieurs virus, des cellules immunocompétentes pathologiques (par exemple des lymphocytes B ou T, des cellules présentatrices d'antigènes...) impliquées dans les allergies, les maladies autoimmunes... voire même des cellules normales (cas des cellules endothéliales dans une stratégie thérapeutique anti angiogénique). Les cellules cibles préférées sont les cellules tumorales et les cellules infectées.
Les anticorps thérapeutiques d'isotype lgG1 tel que le rituximab peuvent médier une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou ADCC, mais aussi une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps ou ADPC et une lyse cellulaire complément dépendante ou CDC.
Les anticorps thérapeutiques selon l'invention peuvent être produits par des hybridomes ou par génie génétique, et sont avantageusement d'isotype lgG1 ou lgG3. Les anticorps thérapeutiques préférés dans l'invention sont des anticorps, d'isotype susmentionné, dirigés contre des antigènes tumoraux (molécules exprimées à la surface des tumeurs) tels que les CD20, CD22, CD25, CD38, ou plus généralement les antigènes tumoraux hématopoïétiques, de préférence lymphoïdes.
Par anticorps « déplétant » on entend dans l'invention un anticorps qui est capable d'induire la déplétion des cellules cibles, c'est à dire leur réduction ou leur appauvrissement.
Le pronostic de l'invention est basé sur la détermination de la quantité de cellules B de la tumeur qui sont capables de sécréter de l'interleukine 10 ou IL-10. L'IL-10 a un effet inhibiteur de la réponse immunitaire, en inhibant la production de certaines cytokines, comme l'interleukine 2, l'interleukine 3, le TNF et certains interférons. L'IL-10 agit également sur l'immunité en modulant le nombre des différentes cellules intervenant dans le système immunitaire (mastocytes, lymphocytes, etc .).
En quantifiant le nombre de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 dans les hémopathies, les inventeurs ont constaté que les tumeurs présentant moins de 5% de ces cellules avant le traitement avaient une meilleure réponse à un traitement avec un anticorps thérapeutique, ce qui conduit à un meilleur pronostic pour le patient. Il est alors possible d'envisager pour le patient une thérapie basée sur ce seul anticorps thérapeutique, ou en association avec d'autres protocoles (chimiothérapie, radiothérapie, etc .). Au-delà du seuil de 5% de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10, le pronostic du patient traité avec un seul anticorps thérapeutique ne sera probablement pas très bon, et il est donc recommandé d'envisager un autre schéma thérapeutique plus adapté.
Aussi, le pronostic de l'invention permet de déterminer la chance de réussite d'un traitement à l'aide d'un anticorps thérapeutique, et de déterminer la meilleure thérapie à offrir au patient, tout en rationnalisant les coûts, en évitant de donner des traitements lourds et coûteux à des patients qui ne répondront pas bien, voire pas du tout.
Avantageusement, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, qui comprend en outre la détermination de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2,
de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral,
- ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur
FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ
ID NO : 2, et
- ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon avant traitement
aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique.
En d'autres termes, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro dans les cellules dudit échantillon:
- de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et
- la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 avant traitement,
de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral,
- ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et
- ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon
aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique.
Les inventeurs ont fait une seconde constatation surprenante : si l'on combine la détermination de la quantité de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 avec la détermination d'un polymorphisme particulier du récepteur FcYRIIIa, le pronostic du patient en sera nettement amélioré.
En effet, comme le montre l'exemple ci-après, la détermination du seul polymorphisme du récepteur FcYRIIIa ne permet pas de disposer d'informations suffisantes pour prédire une réponse correcte des patients au traitement avec un anticorps thérapeutique.
Le polymorphisme du récepteur FcYRIIIa a déjà été décrit dans l'état de la technique et notamment dans la demande internationale WO2003035904. Selon que l'acide aminé en position 176 de la protéine, ou en position 158 de la protéine mature ayant subi une modification, est une phénylalanine (F) ou une valine (V), la réponse thérapeutique à un anticorps thérapeutique sera différente.
Dans l'invention, la protéine constituée de la séquence SEQ ID NO : 1 correspond à la protéine FcYRIIIa, et la protéine constituée de la séquence SEQ ID NO : 2 correspond à la protéine FcYRIIIa mature.
L'Homme étant diploïde, il existe donc trois génotypes possibles concernant ce polymorphisme : 176V/V (ou 158V/V), 176V/F (ou 158V/F) et 176F/F (ou 158F/F).
Dans le cadre du procédé susmentionné, les individus ou patients ayant une valine en position 176, ou 158, sur leurs deux allèles du gène FCGR3A sont considérés comme les patients homozygotes V/V. Ainsi, un patient qui est homozygote V/V en position 176 (158) du récepteur FcYRIIIa et qui a un niveau de lymphocytes B sécrétant de l'IL-10 inférieur à 5% par rapport aux cellules totales de la tumeur avant le traitement aura plus de 50% de chances de bien répondre au traitement avec l'anticorps thérapeutique, et de présenter une déplétion de plus de 90% des cellules tumorales après le traitement.
Il est avantageux que le taux de cellules B sécrétant de l'IL-10 soit inférieur à 5% de la quantité totale de cellules dans la tumeur. Cela signifie que des taux de 4,9%, 4,8%, 4,7%, 4,6%, 4,5%, 4,4%, 4,3%, 4,2%, 4,1 %, 4%, 3,9%, 3,8%, 3,7%, 3,6%, 3,5%, 3,4%, 3,3%, 3,2%, 3,1 %, 3%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,3%, 2,2%, 2,1 %, 2%, 1 ,9%, 1 ,8%, 1 ,7%, 1 ,6%, 1 ,5%, 1 ,4%, 1 ,3%, 1 ,2%, 1 ,1 %, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% ou 0,1% de cellules sécrétant de l'IL-10 sont particulièrement avantageux.
Avantageusement, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, dans laquelle l'hémopathie est une hémopathie dont les cellules expriment le marqueur de surface CD20, c'est-à-dire dont les cellules tumorales expriment le marqueur de surface CD20.
Le CD20 est le premier antigène de différenciation des lymphocytes B humains à avoir été identifié à l'aide d'anticorps monoclonaux. Il est un marqueur spécifique des cellules B au cours de leur développement du stade pré-B au stade du lymphocyte B mature. Il est néanmoins absent de la surface des plasmocytes. Le gène codant est localisé dans le chromosome 11. Le CD20 appartient à une famille de molécules comprenant le CD20, la chaîne β du récepteur à haute affinité des IgE et la molécule HTm4 présente à la surface des cellules hématopoïétiques lymphoïdes et myéloïdes et dont la fonction est inconnue.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, dans laquelle l'hémopathie est choisie parmi la leucémie lymphoïde chronique B (LLC), les lymphomes diffus à grande cellules B et tous ces variants histologiques exprimant le CD20, les lymphomes folliculaires et les lymphomes du manteau, les lymphomes de la zone marginale, les lymphomes du MALT (en anglais mucosa-associated lymphoid tissue), les lymphomes de Burkitt, les lymphomes lymphoplasmocytaire, la maladie de Waldenstrôm, la leucémie prolymphocytaire B, et tous les lymphomes B CD20+ inclassables
Aussi, avantageusement, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro susmentionnée de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une leucémie lymphoïde chronique.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de pronostic telle que définie ci-dessus, dans laquelle la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon est mesurée par cytométrie de flux, après activation de la sécrétion de l'IL10, ou par mesure du taux circulant d'IL-10 dans le sérum. Bien qu'il existe plusieurs moyens de déterminer la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon tumorale, la méthode avantageuse de l'invention consiste en la détection par cytométrie de flux.
Pour ce faire, les cellules nucléées isolées à partir d'un patient, sont mises en culture et traitées avec des composés stimulant la sécrétion de l'IL-10. Il est alors possible soit de déterminer la quantité d'IL-10 sécrété dans le milieu de culture, ce qui n'est pas une bonne information quantitative dans la mesure où la stimulation est artificielle, soit de procéder à une étape de blocage de la sécrétion, de sorte que l'IL-10 produite est séquestrée dans les cellules B sécrétrices. Les cellules peuvent alors être marquées avec un anticorps anti IL-10, et quantifiées par cytométrie de flux. Des détails expérimentaux sont donnés dans l'exemple ci-après.
Les inventeurs ont également montré qu'il existait une corrélation entre la quantité de cellules B sécrétrices d'IL-10 dans la tumeur d'un patient atteint d'une hémopathie telle que définie ci-dessus et la quantité d'IL-10 circulante dans le plasma desdits patients (voir aussi exemple ci-après). Aussi, par un simple dosage de l'IL-10 dans le sérum, il est possible de déterminer, certes plus approximativement, la proportion de cellules B sécrétant de l'IL-10 chez le patient.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de pronostic susmentionnée, dans laquelle la détermination in vitro de l'acide aminé en position 176 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est réalisée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), telle que la PCR, la PCR couplée à une transcription inverse (RT- PCR) ou la PCR nichée (nested PCR), en utilisant des méthodes conventionnelles et des oligonucléotides (amorces) spécifiques.
Le génotypage du gène codant le récepteur FCYRI IIA peut être réalisé par différentes techniques comprenant l'analyse des acides nucléiques ou des protéines. Les analyses peuvent être réalisées par digestion spécifique par des enzymes de restriction, des hybridations, ou de manière avantageuse de l'amplification/séparation/séquençage. Il peut même être envisagé de déterminer et d'identifier le polymorphisme à partir des ARN. Les techniques décrites dans la demande WO2003035904 s'appliquent mutatis mutandis.
Dans le cadre de l'utilisation de réaction d'amplification, telles que les techniques de PCR, les oligonucléotides utilisés comme amorces seront préférentiellement des oligonucléotides simple brin comprenant 50 nucléotides, avantageusement environ 30 nucléotides, de préférence de 17 à 25 nucléotides. Il est préférable que les oligonucléotides possèdent au moins 5, voire au moins 8 nucléotides strictement complémentaires de la séquence cible à amplifier, et en particulier le nucléotide en position 3' dudit oligonucléotide. Pour déterminer des oligonucléotides avantageux, l'homme du métier pourra utiliser la séquence du gène FCGR3A humain, accessible dans les bases de données, notamment sous le numéro AL590385 dans la base de données GenBank, ou encore la séquence de l'ADN complémentaire accessible dans la base de donnée GenBank sous le numéro NM_000569.
Des oligonucléotides particulièrement avantageux pour déterminer le pronostic selon l'invention sont les oligonucléotides représentés par les séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.
Bien évidemment, l'invention n'est pas limitée à ces oligonucléotides spécifiques, et l'homme du métier est capable de concevoir d'autres oligonucléotides spécifiques.
Dans encore un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode susmentionnée, où ledit anticorps thérapeutique est une immunoglobuline lgG1 ou lgG3, notamment un anticorps anti CD20, en particulier le rituximab.
L'anticorps thérapeutique qui est utilisé dans le cadre de la méthode de l'invention est donc avantageusement un anticorps anti CD20, et en particulier le rituximab. Dans cette configuration la méthode de l'invention vise avantageusement à proposer un pronostic de réponse pour les patients traités par cet anticorps pour une leucémie lymphoïde chronique B ou un lymphome B.
Le rituximab est un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la molécule de surface CD20. La partie variable Fab du rituximab se lie à l'antigène CD20 des lymphocytes B, et sa partie constante Fc peut générer des fonctions d'effecteurs immunitaires qui entraînent la lyse de ces lymphocytes. Les mécanismes possibles de la lyse cellulaire induite par les effecteurs sont une cytotoxicité dépendante du complément (CDC), faisant intervenir la liaison du fragment C1q, une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), passant par un ou plusieurs des récepteurs Fcy de la surface des granulocytes, des macrophages et des cellules NK et une phagocytose (ou ADPC) passant aussi par l'interaction avec les récepteurs Fcy de la surface des granulocytes, des macrophages. Il a aussi été démontré que le rituximab, en se liant à l'antigène CD20 des lymphocytes B, induit une mort cellulaire par apoptose.
Aussi, dans cet aspect avantageux, l'invention concerne une méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique anti CD20 d'isotype lgG1 ou lgG3 dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une leucémie lymphoïde chronique ou d'un lymphome B, la méthode comprenant la détermination in vitro dans les cellules dudit échantillon :
- de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcvRllla, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et
- la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10,
de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral,
- ayant une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur
FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et
- ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon
aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite leucémie ou ledit lymphome après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique anti-CD20.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit pour le pronostic in vitro d'un patient atteint d'une hémopathie susceptible d'être traitée avec un anticorps thérapeutique, notamment pour le pronostic de la leucémie lymphoïde chronique ou d'un lymphome B, comprenant :
- des moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2,
- des moyens de détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'IL-10, et
- un ou plusieurs échantillons contrôles.
Le kit ou la trousse de pronostic de l'invention fournit les moyens de mesurer les deux paramètres qui sont essentiels de la méthode susmentionnée : le polymorphisme du récepteur et la quantité de cellules B sécrétrices d'IL-10. Afin de normaliser le pronostic, le kit ou la trousse contient également des échantillons contrôles qui correspondent à des échantillons issus d'individus sains (témoins négatifs) et/ou d'individus malades de mauvais pronostic (témoins positifs) et/ou d'individus ayant été diagnostiqués de mauvais pronostic (témoins positifs).
Ce ou ces échantillons contrôles peuvent également être des indications ou des données informatiques sur un support physique permettant un calibrage d'un cytomètre de flux pour déterminer la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10.
Comme mentionné plus haut, les moyens de détection de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 peuvent être des anticorps pour une évaluation par cytométrie de flux des cellules, mais également des drogues pour stimuler et/ou inhiber la production d'IL-10. Il peut s'agir également d'anticorps permettant de mesurer le taux d'IL-10 circulant dans le plasma.
Avantageusement, l'invention concerne un kit pour le pronostic tel que défini ci- dessus, dans lequel les moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, comprennent les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.
Bien évidemment, l'homme du métier peut proposer d'autres oligonucléotides pour amplifier par PCR la région correspondant au polymorphisme, et déterminer quels sont les allèles portés par le patient qui est testé.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un produit programme d'ordinateur sur un support approprié pour la détection in vitro de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans un échantillon d'un patient atteint d'une hémopathie.
Un autre aspect de l'invention porte sur un logiciel ou un produit programme d'ordinateur conçu pour mettre en œuvre la détection des cellules B sécrétant de l'IL-10 par cytométrie de flux et/ou comprenant des portions/moyens/instructions de code de programme pour l'exécution de ladite détection lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur, notamment relié à un cytomètre de flux. Avantageusement ledit programme est compris dans un support d'enregistrement de données lisible par ordinateur. Un tel support n'est pas limité à un support d'enregistrement portable tel qu'un CD-ROM mais peut également faire part d'un dispositif comprenant une mémoire interne dans un ordinateur (par exemple des RAM et/ou ROM), ou de dispositif à mémoires externes tels des disques durs ou des clefs USB, ou un serveur à proximité ou à distance.
Aussi l'invention concerne un produit programme d'ordinateur sur un support approprié pour la mise en œuvre de la méthode de pronostic telle que définie précédemment, ledit produit programme d'ordinateur permettant détermination de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10.
Ce programme d'ordinateur permet notamment d'effectuer des réglages automatiques, et normalisés, de sorte que l'utilisateur n'a plus qu'à charger les informations dans le cytomètre et passer les cellules de la tumeur pour obtenir, de manière reproductible, la détermination de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10. Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par des anticorps thérapeutiques comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la sécrétion ou de l'activité de l'IL-10 par les lymphocytes. En particulier, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par un anticorps anti-CD20, notamment le rituximab comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la sécrétion ou de l'activité de l'IL-10 par les lymphocytes.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par des anticorps thérapeutiques comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur de lymphocytes sécrétant de l'IL-10.
En particulier, l'invention concerne une méthode visant à améliorer le traitement des hémopathies par un anticorps anti-CD20, notamment le rituximab comprenant l'utilisation d'au moins un inhibiteur des cellules B sécrétant de l'IL-10.
Par inhibiteur des cellules B sécrétant de l'IL-10, ou des lymphocytes sécrétant de l'IL-10, on entend dans l'invention des composés ou molécules, ou mélanges de ceux- ci, capables d'interférer avec l'activité des lymphocytes B10, soit en inhibant leur capacité de sécréter de l'IL-10, soit en inhibant leur prolifération, ou encore en induisant leur mort, notamment par apoptose.
Comme les inventeurs ont identifié l'influence des cellules B10 sur l'efficacité du rituximab, et la corrélation entre la sécrétion de l'IL-10, il est avantageux de proposer une méthode qui vise justement :
- soit à inhiber la production d'IL-10 par les lymphocytes B, par exemple en inhibant la synthèse ou la sécrétion,
- soit à inhiber l'activité biologique de l'IL-10.
Des inhibiteurs de la sécrétion comme la bréfeldine A peuvent être utilisés.
Il est également envisageable d'utiliser des inhibiteurs de l'IL-10 comme des anticorps dirigés contre NL10, ou l'utilisation de peptides mimétiques qui vont saturer les cibles de l'interleukine et ainsi inhiber l'action de la protéine native.
L'homme du métier, avec ses connaissances générales peut aisément proposer une méthode pour cribler des molécules inhibitrices de l'IL-10, ou des molécules inhibant sa sécrétion.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'inhibiteurs de l'activité ou de la sécrétion de l'IL-10 pour la préparation d'un médicament visant à favoriser le traitement d'hémopathies par des anticorps thérapeutiques, notamment un anti-CD20 ou le rituximab.
L'invention concerne un inhibiteur de l'activité ou de la sécrétion de l'IL-10 pour son utilisation dans le cadre du traitement des hémopathies traitées avec au moins un anticorps thérapeutique, notamment un anticorps anti-CD20 ou le rituximab.
Avantageusement, l'invention concerne une composition comprenant au moins un inhibiteur de l'activité ou de la sécrétion de l'IL-10 et un au moins un anticorps thérapeutique, notamment un anticorps anti-CD20 ou le rituximab, pour le traitement des hémopathies dont les cellules tumorales présentent une valine en position en position 176 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
L'invention sera mieux comprise à la lumière des quatre figures et de l'exemple qui suivent :
Légende des figures :
La figure 1 représente un graphique montrant que la fréquence des cellules B leucémiques (LLC) IL-10 compétentes corrèle avec le taux d'IL-10 plasmatique au jour JO, c'est-à-dire avant le traitement (p=0,0166, r=3969). L'axe des abscisses représente la quantité d'IL-10 dans le plasma en pg/mL et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de cellules B10 exprimé en %.
La figure 2 représente un graphique montrant que la déplétion lymphocytaire observée après le traitement par rituximab seul (J22) est statistiquement influencée par la fréquence des cellules B LLC IL-10 compétentes à JO (p=0,004). L'axe des abscisses représente le pourcentage de lymphodéplétion en % et l'axe des ordonnées représente le pourcentage de cellules B10 exprimé en %.
La figure 3 représente un graphique montrant que la déplétion lymphocytaire est statistiquement plus importante pour les patients portant l'allèle FcYRIIIa-158V
La figure 4 représente des courbes de ROC (en anglais Receiver operating curve) générées par régression logistique pour le pourcentage de cellules B LLC IL-10 compétentes seul (A) (AUC=0,763), les porteurs des allèles V vs F/F pour le polymorphisme FCGR3A (B) (AUC=0,675) et une combinaison du pourcentage de cellules B LLC IL-10 compétentes et des porteurs des allèles V vs F/F pour le polymorphisme FCGR3A (C) (AUC=0,855).
La figure 5 représente un graphique comparant le nombre de cellules B régulatrices (énumérées par cytométrie - axe des abscisses) au dosage de la sécrétion d'IL-10 (méthode rapide - axe des ordonnées). Le rectangle aux lignes interrompues correspond aux individus ayant un faible risque de réponse suboptimale avec un anticorps anti-CD20. Le rectangle avec des lignes pleines correspond aux individus ayant un fort risque de réponse suboptimale avec un anticorps anti-CD20. Une bonne corrélation est observée entre les résultats obtenus par les deux méthodes (R = 0,79).
EXEMPLES EXEMPLE 1
Les mécanismes d'action du rituximab (commercialisé sous les marques MabThera®, Rituxan®) restent inconnus et pourraient être différents selon le sous-type de désordre lymphoprolifératif B. Le rituximab est connu pour induire in vitro l'apoptose, la lyse médiée par le complément (CDC), la cytotoxicité cellulaire médiée par les anticorps (ADCC) et la phagocytose dépendante des anticorps (ADPC), et certains résultats tendent à impliquer ces mécanismes in vivo.
Certains facteurs affectant la réponse au rituximab ont récemment été décrits
Les inventeurs avaient précédemment observé que le polymorphisme du récepteur FcYRIIIa V/F affecte la réponse clinique au traitement rituximab. Comme ce polymorphisme modifie l'affinité de la partie constante des lgG1 pour le récepteur FcYRIIIa, (exprimé à la surface des cellules NK et des macrophages), les inventeurs ont émis l'hypothèse que le mécanisme d'ADCC devait être important dans le cadre du traitement des lymphomes folliculaires traités au rituximab.
Des cellules B régulatrices ont récemment été identifiées chez l'homme et la souris en tant que sous type cellulaire capable de sécréter de l'IL-10. Ces cellules B, également appelées cellules B10 ou B10, sont caractérisées par leur capacité à moduler l'inflammation, l'auto-immunité et la réponse immune innée ou adaptative du fait de la production d'IL-10. Dans un modèle murin, les cellules B10 seraient capables d'inhiber l'élimination des cellules de lymphomes induite par un anticorps anti CD20, en agissant sur les fonctions monocytaires médiées par les parties constantes des immunoglobulines (parties Fc).
Plus récemment, il a été montré que les cellules d'une leucémie lymphoïde chronique clonale (LLC) présentaient des propriétés immunosuppressives et une compétence pour l'IL-10.
Les inventeurs ont alors considéré que les cellules IL-10 compétentes des LLC pourraient avoir une influence sur l'efficacité du traitement au rituximab des patients atteints de ce type de leucémie.
Patients et traitement
Les patients.
Une étude prospective et randomisée de phase II a été conduite dans 59 centres français incluant 140 patients entre Juin 2012 et Janvier 2013. Les patients n'ayant reçus aucun traitement au préalable (âgés de 18 à 65 ans) et dont le diagnostic de leucémie lymphoïde chronique a été confirmé par immunophénotypage selon les critères IWCLL 2008 (Binet de stade C, ou binet de stade A ou B avec une maladie active), ont été enrôlés dans cet essai. Un critère additionnel d'inclusion a été pris en compte : l'absence de délétion 17p, évaluée par FISH (<10% noyaux positif). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé par écrit avant l'inclusion.
La randomisation.
Les patients sont stratifiés selon leur statut mutationnel IGVH après analyse FISH (délétion 11 q) et sont assignés au hasard avec un ratio de 1 :1 pour recevoir, soit la dose standard de chimiothérapie FCR (fludarabine, cyclophosphamide, et rituximab) pour le bras A ou Dense-FCR avec une préphase de rituximab avant le traitement standard FCR pour le bras B.
Le traitement.
Le traitement standard FCR consiste en 6 cures espacées de 28 jours de rituximab (375 mg/m2 pour la 1 ère cure, J1 and 500 mg/m2 pour les autres cures), fludarabine (40 mg/m2/j J2-4), cyclophosphamide (250 mg/m2/j J2-4). Pour le bras expérimental, le traitement FCR est précédé par une préphase de rituximab composée de 4 infusions successives, distribuées comme suit : 500 mg à J0, and 2000 mg à J1 , J8 et à J15. La cure 1 débute à J22 pour les patients et les cures suivantes sont espacées de 28 jours.
Identification des cellules IL-10 compétentes dans les LLC, essai IL-10 et génotypage FCGR3A
Les cellules IL-10 compétentes des LLC sont identifiées par cytométrie de flux à partir de cellules sanguines mononucléées purifiées après stimulation polyclonale.
Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été purifiées à partir des patients atteints de LLC du bras B de l'étude à l'aide d'un gradient de densité Ficoll-Hypaque (Eurobio, Courtaboeuf, France).
Les PBMC ont été resuspendus (9 x 10e cellules/mL) dans du milieu (RPMI 1640 - Biotech GmbH, Aidenbach, Allemagne) contenant 10% de sérum de veau fétal (Eurobio, Courtaboeuf, France), 2 mM de L-glutamine (Eurobio, Courtaboeuf, France), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, et 2.5 μg/mL amphotéricine (Tous les antibiotiques sont obtenus chez Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France). L'activation clonale des lymphocytes B a été réalisée avec du CpG (ODN 2006, 10 g/mL; InvivoGen, San Diego, USA), du CD40L (50 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) et de l'anti-polyHistidine (500 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) pendant 48h à 37°C dans une atmosphère humide comprenant un mélange 5% C02- 95% air. De l'acétate et myristate de phorbol (PMA, 50 ng/mL; Sigma-AIdrich, Saint Louis, MO, USA) et de l'ionomycine (1 g/mL; Sigma-AIdrich, Saint Louis, MO, USA) ont été ajoutés pour stimuler la production d'IL-10. Après 4h à 37°C dans une atmosphère humide comprenant un mélange 5% C02-95% air, de la bréfeldine A (1 X solution/mL; BioLegend, San Diego, CA, USA) a été ajoutée pour bloquer la sécrétion d'IL-10 en vue d'identifier les cellules B10. Les cellules ont été marquées à l'aide des anticorps suivants : anti CD19 BV421 (HIB 19), anti CD69 PE/Cy7 (FN 50), anti CD38 APC (HIT 2), anti IL-10 PE (JES3-9D7) de chez BioLegend (San Diego, CA, USA), et anti CD45 KO (J.33) et anti CD5 FITC (BL1a) de chez Beckman Coulter (Brea, CA, USA). Les cellules LLC clonales ont été identifiées comme étant des lymphocytes CD19+ CD5+ CD20int. Les analyses ont été réalisées à l'aide d'un cytomètre de flux CyAnTM ADP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
Le taux d'IL-10 plasmatique a été déterminé à l'aide de la technologie Luminex® sur billes magnétiques, par un système de double lecture laser, selon les recommandations du fabricant (R&D Systems, Minneapolis, USA). Le plasma des 68 patients a été incubé avec des billes superparamagnétiques recouvertes d'anticorps anti-IL-10 pendant 2h, à température ambiante, dilué au ½. L'IL-10 plasmatique est quantifiée grâce à la combinaison de deux anticorps pour la détection : un anticorps biotinylé IL-10 et un anticorps streptavidine conjugué à la phycoérythrine.
Le polymorphisme FCYRI I IA-158VF est déterminé par PCR nichée. Brièvement, des tests PCR multiplex spécifique d'allèle en une étape ont été réalisés comme décrit dans DallOzzo et al. (DallOzzo et al. J Immunol Methods. 2003;277(1-2):185-192) avec quelques modifications. Les 25 μί de mélange réactionnel comprennent d'ADN génomique, 400 nM d'amorce sens (5'-TCCAAA AGCCACACTCAAAGTC-3' (SEQ ID NO: 3)), 400nM d'amorce antisens spécifique de l'allèle V (5'- AGACACATTTTTACTCCCATC -3' (SEQ ID NO: 4)) et 200nM d'amorce antisens spécifique de l'allèle F (5 -
GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCGGTGATGTTCACAGTCTCTGATCACACA TTTTTACTCCCATA-3' (SEQ ID NO: 5)), 400 μΜ de chaque nucléotide (dNTP), 2mM de MgCI2 et 0,5U de Taq DNA polymerase dans son tampon (Promega, Madison, USA). Les conditions de PCR sont: 3.5 min à 95°C suivi de 35 cycles, chaque cycle consistant en 95°C pendant 20 sec, 56°C pendant 20 sec, 72°C pendant 30 sec. Après amplification, les produits de PCR (137bp pour l'allèle F et 81 bp pour I »allèle B) sont séparés sur gel d'acrylamide 8% (Invitrogen, Carlsbad, USA) et visualisés par marquage au Bromure d'éthidium.
Analyses statistiques
Les distributions des données ont été testées à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Les tests de χ2 et de Fisher ont été utilisés pour les données catégorielles.
La comparaison des médianes a été réalisée par un test T de Student ou un test de Mann-Whitney.
Toutes les variables avec une valeur p < 0,10 dans l'analyse univariée sont incluses dans un modèle intermédiaire. Les variables du modèle final ont été déterminées par la méthode d'élimination progressive utilisant un test T de Student (p<0.05 comme modèle significatif).
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées par la mise en œuvre à un niveau a 0,05 d'un test bilatéral en utilisant la version 3.0.2.10 du logiciel R.
Résultats et discussion La déplétion lymphocytaire après une monothérapie au rituximab a été évaluée au jour 22 (J22) pour étudier l'influence des cellules leucémiques compétentes IL-10 (B10) sur l'efficacité in vivo du rituximab, chez 68 patients inclus dans le bras expérimental de l'étude.
La médiane du nombre de lymphocytes leucémiques avant les quatre doses de rituximab (J0) était 91.13 G/L (gamme: 3.74-497.40) et était de 2.60 G/L (gamme: 0.14- 189.40) à la fin de la préphase de traitement au rituximab seul (J22). Ainsi, la médiane de déplétion lymphocytaire après la préphase de traitement au rituximab seul (J22) était de 95,1 % (gamme 77.0-99.9), parmi lesquels 66% obtenaient une déplétion de plus de 90%.
Les caractéristiques des patients et leurs distributions selon la lymphodéplétion de 90% sont présentées dans le tableau 1 , ci-après.
Aucune corrélation significative n'a été trouvée entre la lymphodéplétion à 90% et les paramètres cliniques d'âge, de sexe, de stade Binet, d'ECOG, de mutation IGHV, d'anomalie cytogénétique ou de la β2 microglobuline.
Un sous-groupe de cellules B10 a été identifié chez tous les patients testés (n=47, médiane: 3.06% des cellules LLC, range: 0.12 to 29.55). La fréquence de cellules B10 parmi les cellules leucémiques corrèle avec la quantité d'IL-10 plasmatique (Figure 1 , r=0.39, p=0.02), alors que le niveau d'IL-10 plasmatique ne corrèle pas avec les cellules leucémiques non B10 (non montré). La fréquence de cellules B10 ne varie pas selon les caractéristiques de patients, et n'est pas non plus significativement différente chez des patient atteints de LLC avec ou sans mutation IGVH (médiane: 6.29%, gamme: 0.12 à 15.83 versus médiane: 1.85%, gamme: 0.23 to 20.81 , respectivement). De plus, de telles fréquences de cellules B10 ne corrèlent pas non plus avec les altérations cytogénétiques (del11q, del13q, trisomie 12).
Une analyse univariée montre que la fréquence des cellules B10 affecte la lymphodéplétion supérieure à 90% après la préphase de traitement au rituximab seul (J22) (Figure 2, p=0.004). La fréquence de cellules B10 permet aussi de prédire la réponse clinique 3 mois (réponse complète) après la fin du traitement par l'association fludarabine-cyclophosphamide et rituximab, considéré comme le traitement de référence des patients atteints d'une leucémie lymphoïde chronique (p=0,04).
Ces résultats montrent que tous les patients CLL présentent une sous-population de cellules B10 qui représentent un pourcentage variable des cellules B leucémiques et qui exercent un effet inhibiteur in vivo cliniquement significatif sur l'activité du rituximab. Comme le polymorphisme FcYRIIIa-158V/F corrèle avec l'efficacité in vivo du rituximab dans les lymphomes folliculaires, les inventeurs ont déterminé ce polymorphisme chez les différents patients de la cohorte. Le polymorphisme FcYRIIIa-158V/F est significativement associé à un nombre normal de lymphocytes (< 5G/L) (p=0.03) et une lymphodéplétion de 90% (p=0.03) à J22. C'est également le cas pour les porteurs du polymorphisme FcYRIIIa-158V (p=0.01 ) (Figure 3).
Par contre, le polymorphisme FcYRIIIa-158V/F ne corrèle pas avec la réponse clinique 3 mois après l'immuno-chimiothérapie. Aussi, ces résultats suggèrent que les fonctions immunes médiées par le FcYRIIIa jouent un rôle critique dans l'activité du rituximab, mais que l'implication du polymorphisme FcYRIIIa-158V/F pourrait être masquée soit par la haute activité de l'immuno-chimiothérapie, soit par une inhibition directe des cellules immunitaires effectrices par la chimiothérapie.
Des analyses de régression logistique montrent que seuls la fréquence des cellules B10 et le polymorphisme FcYRIIIa-158V/F sont associés à une lymphodéplétion de 90% après la préphase de traitement au rituximab seul (J22) (risque relatif rapproché (OR) = 0,83; intervalle de confiance (IC): 0,72-0,3; p=0.002, et OR = 4,95; 95% IC : 1 ; 07-27.48; p=0.04, respectivement).
La courbe fonction d'efficacité du récepteur (ROC) construite en utilisant les fréquences des cellules B10 et du polymorphisme FcYRIIIa-158V/F montre une aire sous la courbe (AUC) fortement significative (AUC=0.855; 95% Cl: 0.732-0.978), conduisant à une bonne distinction entre les patients qui ont une déplétion de leurs lymphocytes de plus de 90% de ceux qui n'ont pas une telle déplétion (Figure 4).
A partir de la courbe ROC (Figure 4) les données suivantes peuvent être extraites : 1- Données obtenues à partir du génotypage du récepteur FcYRIIIA seul
Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44) (Aire sous la courbe (AUC=0,669), 95%CI=0,514-0,824, les résultats obtenus sont les suivants
Lymphodéplétion > Lymphodéplétion <
Tableau 2
90% 90%
Probabilité > 0.5 d'obtenir une 30 14
lymphodéplétion >90% (vrais positifs) (faux positifs)
Probabilité < 0.5 d'obtenir une 0 0
lymphodéplétion > 90% (faux négatifs) (vrais négatifs)
Sensibilité = 100%
Spécificité = 0%
Légende du tableau 2. Sensibilité et spécificité pour une lymphodéplétion de 90% obtenues en utilisant les probabilités prédites calculées.
On constate que de très nombreux faux positifs sont identifiés (environ 33%). 2- Données obtenues à partir du nombre de cellules B10 seul a. Avec un seuil de 4,34 %
Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,779, 95%CI=0, 652-0, 905, les résultats obtenus sont les suivants :
Lymphodéplétion > Lymphodéplétion <
Tableau 3
90% 90%
Probabilité > 0.5 d'obtenir une 21 2
lymphodéplétion >90% (vrais positifs) (faux positifs)
Probabilité < 0.5 d'obtenir une 9 12
lymphodéplétion > 90% (faux négatifs) (vrais négatifs)
Sensibilité = 70,00%
Spécificité = 85,71 %
Légende du tableau 3 : identique à la légende du tableau 2.
b. Avec un seuil de 3 %
Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,729, 95%CI=0, 598-0, 589, les résultats obtenus sont les suivants :
Lymphodéplétion > Lymphodéplétion <
Tableau 4
90% 90%
Probabilité > 0.5 d'obtenir une
18 2
lymphodéplétion >90%
Probabilité < 0.5 d'obtenir une
12 12
lymphodéplétion > 90%
Sensibilité = 60,00%
Spécificité = 85,71 %
Légende du tableau 4 : identique à la légende du tableau 2.
c. Avec un seuil de 5 %
Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44), AUC=0,726, 95%CI=0, 586-0, 866, les résultats obtenus sont les suivants :
Lymphodéplétion > Lymphodéplétion <
Tableau 5
90% 90%
Probabilité > 0.5 d'obtenir une
21 3
lymphodéplétion >90%
Probabilité < 0.5 d'obtenir une
9 11
lymphodéplétion > 90%
Sensibilité = 70,00%
Spécificité = 78,57%
Légende du tableau 5 : identique à la légende du tableau 2.
On constate qu'en imposant le seuil à moins de 5% de cellules B10, le taux de faux positifs tombe à environ 5%. La détection des B10 améliore significativement le pronostic par rapport au polymorphisme.
3- Données obtenues à partir du génotypage du récepteur FcYRIIIA et B10
Sur la base de population utilisée lors de l'analyse multivariée (n=44) (Aire sous la courbe (AUC=0,0855), 95%CI=0,732-0,978, les résultats obtenus sont les suivants
Lymphodéplétion > Lymphodéplétion <
Tableau 6
90% 90%
Probabilité > 0.5 d'obtenir une
26 5
lymphodéplétion >90%
Probabilité < 0.5 d'obtenir une
9
lymphodéplétion > 90%
Sensibilité = 86,67%
Spécificité = 64,29%
Légende du tableau 6 : identique à la légende du tableau 2.
Dans les tableaux 2 à 6 précédents, la sensibilité est la mesure de la capacité du test à identifier une condition quand elle est présente. C'est la proportion de vrais positifs (VP) qui est détectée par le test comme ayant la « condition » [Se = VP/(VP+FN)]. Les faux négatifs sont les patients ayant la « condition » mais non détectés par le test. Une forte sensibilité est préférée dans un criblage, car il est plus facile d'écarter les patients n'ayant pas la condition.
La spécificité est la capacité du test d'exclure une condition quand elle est absente. C'est la proportion de vrais négatifs (VN) qui est détectée par le test comme n'ayant pas la « condition » [Sp = VN/(VN+FP)]. Les faux positifs sont les patients n'ayant pas la « condition », mais détectés par le test comme étant positifs.
En combinant la détection du polymorphisme et du nombre de cellules B10, on constate une amélioration du pronostic, et notamment une réduction très significative du nombre de patients considérés comme faux négatifs. En outre, la double détection permet d'obtenir, pour des seuils inférieurs à 5% de B10 une bonne sensibilité (environ 86%).
Les inventeurs ont donc déterminé une population B10 chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique et recevant du rituximab. Dans le même temps ils ont déterminé le phénotype FcYRIIIa-158VF de ces patients. Ils ont pu ainsi montrer que la fréquence des cellules B10 et le polymorphisme FcgYRIIIa-158VF influençaient la réponse au rituximab chez des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique. L'analyse de ces deux facteurs combinés permet d'améliorer la sensibilité et la spécificité de prédiction de la réponse pronostique. Lymphodéplétion Lymphodéplétion <90% Analyse
Analyse univariée
55.72 23 53.99 (52.07-
Age (années) 44 (100.00) 0.792
0.51
Stade Binet AB 36 (81.82) 16 (69.57) 0.404
0.50
IGHV on muté 25 (56.82) 16 (72.73) 0.324
[0.15-1.50]
Anomalies cytogéntiques
1.31
Del(13q) 18 (51.43) 8 (44.44) 0.848
0.40
Trisomie 12 2 (6.06) 2 (14.29) 0.572
[0.03-6.04]
β2 microglobuline 2 90 (2.33 2.76
39 (88.64) 22 (95.65) 0 857
(mg/L) 3.66) (2.33-4.29)
Lymphodéplétion Lymphodéplétion <90% Analyse
Analyse univariée
=44) (n=23) multivariée
Tableau 1
(suite) AU
Médiane Médiane OR Valeur C OR Valeur
N (%) N (%)
(IQR) (IQR) [95% IC] de p [95% [95% Cl] de p
CI]
2.00 10.50
CD38+ (%) 34 (77.27) 17 (73,91 ) 0.133
FCGR3A 0.028
V/V 5 (11.91 ) I: 111
V/F 25 (59.52) 7 (31.82)
F/F 12 (28 57) 14 (63.63)
4.23 0.675 4.95
Porteurs
30 (71.43) 8 (36.36) [1.43- 0.014 [0.551- [1.07- 0.043 FCGR3A V
13.42] 0.799] 27.48]
Tableau 1 : Paramètres influençant la lymphocytose induite par le rituximab en monothérapie chez 68 patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC). Le groupe des patients ayant une inhibition lymphocytaire de moins de 90% a été utilisé comme référence pour les rapports des chances (odds ratio).
EXAMPLE 2
Les inventeurs ont également proposé une méthode simple et rapide pour l'analyse de la fréquence des cellules B régulatrices. Cette méthode a été comparée à la méthode de référence qui est basée sur la détection intra-cytoplasmique de la synthèse d'IL-10 en cytométrie de flux.
La méthode consiste en une première étape d'enrichissement de la population des lymphocytes B normalement très minoritaires parmi les leucocytes par sélection négative à partir d'un prélèvement de sang périphérique. Le sang est collecté sur un tube de séparation de phase (de type BD vacutainaer CPT). Alternativement, le sang peut être transféré d'un tube primaire contenant un anticoagulant dans le tube de séparation de phase.
Un cocktail de déplétion de type RosetteSep StemCell est ajouté au prélèvement sanguin afin d'enrichir la phase leucocytaire en lymphocyte B. A l'issue de cette étape comprenant une incubation, une séparation par centrifugation et deux centrifugations de lavage cellulaire, une population contenant plus 90% de lymphocytes B est obtenue.
Les cellules sont dénombrées par comptage visuel (cellules au microscope) ou par cytométrie afin de préparer une concentration de 6 millions de cellules par mL et mise en culture dans un milieu contenant du RPMI + 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules sont stimulées par un cocktail d'activateurs polyclonaux comme un mélange de motifs CPG et de CD40 lignant-histidine + anticorps. Un puits non stimulé est réalisé en parallèle. La culture est maintenue 18h à 48h à 37°C sans intervention.
Au terme de cette incubation, la culture cellulaire est centrifugée et le surnageant de culture collecté et conservé à -20°C ou testé immédiatement par une technique immuno-enzymatique (EIA) afin de déterminer la concentration en IL-10 sécrétée.
Les données obtenues comparativement à la méthode de référence en cytométrie montrent que la méthode par dosage de la sécrétion d'IL-10 EIA fournit des résultats bien corrélée entre les deux méthodes. Ainsi, les échantillons cellulaires contenant une proportion de cellules B régulatrices supérieur à 5% sont correctement identifiés (Figure 5).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie,
ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 dans ledit échantillon,
de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral, ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 inférieure à 5% de la quantité totale de cellule dudit échantillon aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique.
2. Méthode de pronostic in vitro de la réponse thérapeutique médiée par un anticorps thérapeutique dans un échantillon tumoral issu d'un patient atteint d'une hémopathie, ledit anticorps étant un anticorps déplétant les cellules de ladite hémopathie, la méthode comprenant la détermination in vitro dans les cellules dudit échantillon:
- de l'acide aminé se trouvant en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position
158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 et
- la détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'interleukine 10 avant le traitement,
de sorte qu'un patient, dont est issu l'échantillon tumoral,
- ayant une valine en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, et
- ayant une quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% des cellules totales de l'échantillon
aura plus de 50% de chances d'avoir une déplétion de plus de 90% des cellules de ladite hémopathie après le traitement avec ledit anticorps thérapeutique.
3. Méthode de pronostic selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'hémopathie une hémopathie dont les cellules expriment le marqueur de surface CD20.
4. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'hémopathie est choisie parmi la leucémie lymphoïde chronique B (LLC), les lymphomes diffus à grande cellules B et tous ces variants histologiques exprimant le CD20, les lymphomes folliculaires et les lymphomes du manteau, les lymphomes de la zone marginale, les lymphomes du MALT (en anglais mucosa-associated lymphoid tissue), les lymphomes de Burkitt, les lymphomes lymphoplasmocytaire, la maladie de Waldenstrôm, la leucémie prolymphocytaire B, et tous les lymphomes B CD20+ inclassables.
5. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 dans l'échantillon inférieure à 5% est mesurée par cytométrie de flux, après activation de la sécrétion de l'ILI O, ou par mesure du taux circulant d'IL-10 dans le sérum.
6. Méthode de pronostic selon la revendication 5, dans laquelle la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10 est mesurée par cytométrie de flux, après activation de la sécrétion de l'ILI O et inactivation de cette sécrétion.
7. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la détermination in vitro de l'acide aminé en position 176 de la séquence du récepteur FcYRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 est réalisée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), telle que la PCR, la PCR couplée à une transcription inverse (RT-PCR) ou la PCR nichée (nested PCR).
8. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où ledit anticorps est une lgG1 ou un lgG3, notamment un anticorps anti CD20, en particulier le rituximab.
9. Kit pour le pronostic in vitro d'un patient atteint d'une hémopathie susceptible d'être traitée avec un anticorps thérapeutique comprenant :
- des moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcYRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2,
- des moyens de détermination de la quantité de cellules lymphocytaires B sécrétant de l'IL-10, et
- un ou plusieurs échantillons contrôles.
10. Kit pour le pronostic selon la revendication 9, dans lequel les moyens de détection de l'acide aminé en position 176 du récepteur FcvRIIIa tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , ou en position 158 de la séquence du récepteur FcvRIIIa, tel que représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, comprennent les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.
11. Produit programme d'ordinateur sur un support approprié pour la mise en œuvre de la méthode de pronostic telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit produit programme d'ordinateur permettant la détermination de la quantité de cellules B sécrétant de l'IL-10.
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