EP3292195A1 - Modular system and method for continuously producing and/or preparing a product in a disinfected manner - Google Patents

Modular system and method for continuously producing and/or preparing a product in a disinfected manner

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EP3292195A1
EP3292195A1 EP16722580.4A EP16722580A EP3292195A1 EP 3292195 A1 EP3292195 A1 EP 3292195A1 EP 16722580 A EP16722580 A EP 16722580A EP 3292195 A1 EP3292195 A1 EP 3292195A1
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EP
European Patent Office
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product
germ
filter
steps
protein
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Withdrawn
Application number
EP16722580.4A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Benjamin Maiser
Peter Schwan
Martin Lobedann
Volker MÖHRLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/16—Diafiltration

Definitions

  • the invention relates to a modular system and a method for the continuous, germ-reduced production and / or preparation of a product from a heterogeneous cell culture fluid mixture.
  • proteins in the biotechnological production are batch-cleaned - this means that the individual production cycles are handled batchwise, discontinuously, and after the completion of a production cycle the product is taken from the whole Then a newer product cycle or batch can be started separately.
  • SIP sterilization-in-place
  • the loss of use of the reactors due to the provisioning procedures may be on the order of the reactor availability, in particular in the case of short periods of use and frequent product changes.
  • WO2012 / 078677 describes a process and a plant for the continuous preparation of biopharmaceutical products by chromatography and their integration in a production plant, in particular in a disposable plant. Although WO2012 / 078677 provides approaches for the continuous production of biopharmaceutical and biological products, the disclosed solution is not sufficient in practice. WO2012 / 078677 also does not disclose the use of a sterilized chromatography column.
  • US 2014/0255994 A1 discloses an integrated continuous process for the production of therapeutic proteins.
  • US 2014/0255994 Al does not disclose the feature that sterilized chromatography columns could be used in such a process.
  • EP 2 182 990 A1 discloses a method for sterilizing chromatography columns by using hot steam.
  • a continuous process means any process for carrying out at least two process steps in series, in which the output stream of an upstream step is conveyed into a downstream step.
  • the downstream step begins processing the product stream before the upstream step is completed.
  • a part of the product stream is always carried in the production plant and becomes Accordingly, a continuous transport or transfer of a product stream from an upstream unit to a downstream unit means that the downstream unit is already operating before the upstream unit is taken out of service, ie, two units connected in series will simultaneously stream the product process it, which flows through it.
  • germ-reduced in the context of the invention means a state of reduced germ count, ie a number of microorganisms per unit area or volume unit of almost zero, which can be achieved by a suitable germ reduction method, whereby this germ reduction method can be selected from gamma irradiation, beta Irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment and steam-in-place (SIP) treatment.
  • the term "disposable article” means that the product-contacted parts in question, in particular apparatuses, containers, filters and connecting elements, are disposable with disposable use, these containers being made of plastic as well as plastic also be made of metal.
  • the term also includes reusable articles, for example of steel, which are used only once in the process according to the invention and are then no longer used in the process. These reusable articles, e.g. In the context of the invention, articles used for this purpose are also referred to as “articles used as disposable articles.”
  • Such disposable articles used can also be referred to as “disposable” or “single-use” articles in the process according to the invention ("SU technology").
  • product stream means within the scope of the invention, the particle-free fluid from a heterogeneous cell culture fluid mixture containing the product, as well as the result of any other process steps of the inventive method, ie the product stream after filtration, after chromatography Virus depletion, after ultrafiltration, after diafiltration, or after further steps of the method according to the invention, wherein these product streams may then have different concentrations and degrees of purity.
  • virus depletion in the context of the invention means a reduction in the concentration of active viruses per unit volume of the fluid to be treated, to the complete inactivation and / or removal of the viruses contained in the fluid to be treated.
  • microbicide in the context of the invention means a substance which can slow down or completely inhibit the growth of microorganisms, it being possible to use this microbicide in the form of a microbicidal buffer, in particular within the scope of the process according to the invention during ultrafiltration.
  • bubble trap in the context of the invention means a device for collecting gas bubbles, wherein the relevant fluid is degassed.
  • module means within the scope of the invention that the individual steps of the method according to the invention can be carried out in separate, interconnected modules, wherein the modules are preconfigured and germ-reduced and can be interconnected in different combinations with one another
  • Plant "in the context of the invention means a series of interconnected modules (" units ") for carrying out at least two downstream and / or upstream steps in which a fluid (“ product flow ”) can be conveyed continuous operation of a step and can be operated with a continuous fluid flow (“product flow”), whereby the individual modules of the "modular plant” can be interconnected in any combination.
  • modules in the sense of the invention are the filtration module 2, the chromatography module 3, the ultrafiltration module 6, the diafiltration module 7 and the dialysis module 8.
  • closed in the context of the invention means the mode of operation of the method according to the invention and the modular system according to the invention be driven so that the product that is produced and / or processed with this method and this modular system is not exposed to the room environment.
  • materials, objects, buffers and the like can be added externally, but this addition takes place in such a way that exposure of the produced and / or processed product to the room environment is avoided ,
  • a feedbatch culture may also be provided,
  • a biological product such as a protein, for example, a therapeutic protein.
  • the nutrient solution is also an ideal growth medium for microorganisms, such as bacteria and spores, resulting in a problem with regard to the unwanted growth of such microorganisms.
  • This undesirable growth of microorganisms becomes a problem, especially with longer maturities, because the nutrient solution becomes more and more contaminated with increasing runtime of the process, up to an exponential growth of microorganisms and thus total loss of the relevant batch of biological product produced.
  • the invention achieves this object by providing a method for the continuous, germ-reduced production and / or preparation of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture fluid mixture, comprising the steps:
  • (E) at least one ultrafiltration and / or at least one diafiltration of the product stream of steps (b), (c), and / or (d), characterized in that the at least two chromatographic steps of (c) a purification over at least two chromatography columns and / or membrane adsorber and that the process is closed and modular.
  • the particle-free fluid from a heterogeneous cell culture-fluid mixture provided in step a) can preferably originate from a continuous perfusion and fermentation process, for example a cell culture or tissue culture, or a perfusion reactor.
  • a perfusion reactor can be operated in parallel, for example two perfusion reactors.
  • the fluid can first be continuously removed by suitable cell restraint systems, such as a slant plate separator (settler), through which a majority of the cells can be retained. Subsequent filtration and / or centrifugation steps or other suitable separation processes may then free the fluid from particles contained in the fluid, thereby obtaining a particle-free fluid in which the biopharmaceutical, biological macromolecular product is located.
  • the filtration step (b) may be e.g. a filtration of the particle-free fluid obtained after step (a) to obtain a filtrate.
  • the process according to the invention can also comprise further filtration steps at suitable points of the process.
  • the filtration step b) can be carried out by suitable filtering methods, e.g. a 0.2 ⁇ m filter, or several filters operated in parallel.
  • a suitable filter for the filtration step is for example a Sartoguard NF 0.2 ⁇ m filter, several of which can be operated in parallel.
  • the filtration step (b) comprises a depth filter with an additional possibility of depleting contaminants such as DNA, ProtA, HCP.
  • a depth filter with an additional possibility of depleting contaminants such as DNA, ProtA, HCP.
  • These may be depth filters with sufficient zeta potential (Zetapor 3M, Posidyne, Pall) or activated carbon activated carbon filters (Millistak Merck Millipore).
  • the at least two chromatographic steps for purifying the product of step c) comprise purification via at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers.
  • the chromatography columns and / or membrane adsorbers may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions or van der Waals Kräfie.
  • the first chromatographic step of the at least two chromatography steps may be affinity chromatography (eg, a ligand having affinity for the product, such as protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, IgG different recombinant protein which has an affinity for the product).
  • step c Another (second) chromatography step, such as chromatography on ionic interactions.
  • the process according to the invention is flexible here and can comprise in step c), depending on the degree of purity and concentration of the product to be achieved, any suitable chromatography principle in any order.
  • the technical effect of using at least two chromatographic steps over at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers according to step c), is that usually a single chromatography step does not sufficiently clean the contaminants such as host cell impurities, aggregates, DNA, protein A etc. can ensure.
  • one or more further steps for adjusting the pH and / or for adjusting the conductivity and / or filtration take place between the at least two chromatographic steps in (c) and / or after the virus inactivation in step (d) - and / or concentration steps and / or a buffer exchange. This allows a process-customizable driving style of the process.
  • the at least one virus removal of step d) can be carried out in particular by adjusting the pH of the particle-free fluid, preferably to a pH of ⁇ 4.0. Adjustment of the pH of the particle-free fluid to be inactivated to ⁇ 4.0 can be effected, for example, by addition of HCl solution. The addition is typically in advance of the virus depletion device. Typically, the pH is adjusted to> 4 with a base, for example, sodium hydroxide solution (NaOH) to terminate the virus depletion.
  • a base for example, sodium hydroxide solution (NaOH)
  • the at least one virus removal of step d) can also be effected by a solvent-detergent step in which virus depletion by solvent / detergent is achieved.
  • the virus removal can also be achieved by UV treatment and / or by thermal treatment.
  • the at least one virus removal of step d) can be carried out in particular in a residence zone into which a segmented product stream can be introduced.
  • all product-contacted elements used in steps (a) to (e) are germ-reduced by a suitable germ reduction method.
  • the germ reduction method may be selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
  • ETO ethylene oxide
  • O3 ozone treatment
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide treatment
  • SIP steam-in-place
  • the articles and elements of the modules used in the process according to the invention are preferably germ-reducible and / or sterilizable, preferably autoclavable, gamma-irradiated, gassable with ethylene oxide (ETO), treatable with ozone (O 3), can be treated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or treated with a steam-in-place (SIP) treatment, which enables a germ-reduced or even aseptic operation of the method according to the invention.
  • ETO ethylene oxide
  • O 3 treatable with ozone
  • SIP steam-in-place
  • all product-contacting elements used starting from filtration step (b) are disposable articles or are used as disposable articles.
  • Such used disposable articles can then also be referred to as "disposable” or “single-use” articles in the process according to the invention ("SU technology").
  • SU technology single-use
  • all input fluids are filtered through a germ reduction filter, such as a Sartorius Sartoguard NF filter.
  • a germ reduction filter such as a Sartorius Sartoguard NF filter.
  • all exits may preferably be protected by a germ barrier which prevents a re-growth of microorganisms.
  • a Sartorius NF filter from Sartorius can also be used as a germ barrier here.
  • An additional security of the germ barrier 11 can be achieved by a changeover of filters and / or waste line.
  • Another measure to ensure the germ-reduced conditions can be achieved by a periodic sanitization of the waste line, preferably after filtration with eg NaOH solution. Other methods would be UV irradiation and heat treatment.
  • the modular method steps of the method according to the invention are preferably carried out in modules in a further embodiment, wherein the modules are interconnected.
  • the modules may preferably be connected to one another by welding or by aseptic connectors.
  • welding e.g. the device "TC Weider” of the company Sartorius can be used.
  • all the liquids, gases and solids used are germ-reduced in steps (a) to (e).
  • the germ reduction preferably takes place by filtration through a filter having a pore size of preferably ⁇ 0.45 ⁇ m. In this case, preferably no in-process sterilization is carried out during the process.
  • the seed reduction may also be performed by filtration through a filter having a pore size of preferably ⁇ 0.20 ⁇ m.
  • a degassing of all fluids is carried out before the chromatography step (c), which come to the at least two chromatography columns, the degassing preferably by at least one bubble trap and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane Vacuum and / or by treatment with ultrasound and / or by bubbling with a poorly soluble gas, such as Helium takes place.
  • the particle-free fluid from step a) is subjected to at least one ultrafiltration against a buffer containing microbicide.
  • a buffer containing microbicide By ultrafiltration, the nutrients contained in the fluid are exchanged for a microbicide-containing buffer, which microorganisms / germs should be removed from the growth base in the fluid. This further improves the germ reduction of the process.
  • microbicide used here may preferably be selected from the group consisting of imidazole, benzoic acid, sorbic acid, para-hydroxybenzoic acid esters, sulfites, disulfites, azides, orthophenylphenol, nisin, natamycin, hexamethylenetetramine, dimethyldicarbonate, nitrites, nitrates , Acetic acid, ascorbic acid, isoascorbic acid, L-lactic acid, propionic acid, boric acid and lysozyme.
  • microbicides contained in the microbicide-containing buffer may further be one or more microbicides selected from the group consisting of:
  • E210 to E213 benzoic acid and its salts, 0.05-0.1% in solvent in acidic medium, 2-3gkg in LM;
  • E200 to E203 sorbic acid and its salts, 300-2000 mgkg;
  • E220 to E228 sulfites and disulfites
  • E231 and E232 orthophenylphenol, 12 mg kg;
  • E249-E252 nitrites and nitrates, 300 mg / kg;
  • E260 acetic acid, 0.5-3%
  • E300-E302 Ascoic acid, 300 mg kg
  • E315-E316 isoascorbic acid, 1500 mgkg
  • E280 to E283 propionic acid and its salts, 1-3 g / kg;
  • the biopharmaceutical, biological macromolecular product is a protein or peptide selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant proteins and vaccines, preferably DNA and RNA vaccines.
  • the chromatography columns and / or membrane adsorbers used in step c) may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions or pure van der Waals forces.
  • the first chromatographic step of the at least two chromatography steps may be affinity chromatography (eg, a ligand having affinity for the product, such as protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, IgG different recombinant protein which has an affinity for the product).
  • affinity chromatography eg, a ligand having affinity for the product, such as protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, IgG different recombinant protein which has an affinity for the product.
  • second chromatography step such as chromatography on ionic interactions.
  • the process according to the invention is flexible here and can comprise in step c), depending on the degree of purity and concentration of the product to be achieved, any suitable chromatography principle in any order.
  • the at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers of step (c) comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, and IgG different recombinant protein, which has an affinity for the product.
  • the process of steps (a) to (e) has a duration of at least 4 hours), preferably of at least 8 hours, preferably of at least 12 hours, preferably of at least 24 hours, more preferably of at least 48 Hours, more preferably of at least 7 days, more preferably of at least 4 weeks, and particularly preferably of at least 8 weeks to such a long duration of several weeks of continuous driving is only possible by the closed, modular and above all germ-reduced driving style of the process.
  • At least one filtration step comprising at least one filter is carried out between steps a) to e) and / or thereafter.
  • the filter is automatically changed under germ-reduced conditions, the automatic filter change preferably comprising the following steps:
  • venting the new filter via an air filter having a pore size of preferably ⁇ 0.25 ⁇ m at the venting valve of the new filter, preferably with transport of product into the new filter by a feed pump, or into a germ-reduced connected closed bag, (iii) detecting the completion of the venting of the new filter on the non-filtrate side by the pressure sensor or a level sensor or a balance or a liquid detector,
  • the simultaneous or downstream promotion of product in the new filter can be done for example by a feed pump.
  • the filter change switching from a used to a new filter element
  • the filter venting proves to be problematic here, but this is required and must be performed manually in the filters currently available.
  • the filter of a germ reduction method by possibly ETO. Subjected to autoclaving or gamma irradiation and then connected to the process. Thereafter, the filter can be filled on the unfiltrate side, while the vent valve is open, which must be closed after successful venting, so that the actual filtration can be performed.
  • germ reduction results in the problem that is displaced during germ reduction with closed vent valve, the microbial limit when opening the vent valve.
  • a germ-afflicted area is introduced into the germ-reduced area, and the germ reduction is thereby eliminated.
  • Germinating with the filter valve open is not recommended because the open position has no fixed position, which can easily damage the valve.
  • the open position is usually shaky, so that the normal handling of the filter can lead to a shift in the microbial limit.
  • vent valve For the automatic filter ventilation, it is advantageous to avoid the rotational movement of the vent valve during commissioning, so that the venting can be performed only by simple measures.
  • the vent valve can now be modified so that it is continuous even in the closed state, but still reliable seals to the environment The valve is thus in the safe state "closed", which is characterized by a tight fit.
  • the state "open” is usually not clearly defined, since the valve body in the guide shakes strong and allows a shift of the limit.
  • This automatic filter change is shown by way of example in FIG. 2, where the working principle of the filtration step of the method and the installation is schematically illustrated by replacing a worn-out filter 17 by welding in a new filter 16.
  • the ready-cleaned biopharmaceutical, biological macromolecular products from the heterogeneous cell culture fluid mixture can be filtered one final time at the end of the process by a final filtration, preferably through a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • the final filtration can be gamma-irradiated, for example Sartopore 2 apsulen (Midicap size 7, 0.05m 2 ) are made into a gammabestrahkes 5L GE ReadCircuit Bag.
  • the invention further achieves this object by providing a modular system for the continuous, germ-reduced production and / or processing of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture fluid mixture comprising the following modules: (a) at least one filtration module,
  • the at least one chromatography module may also comprise more than two chromatography columns and / or membrane adsorbers, e.g. three or four chromatography columns and / or membrane adsorbers.
  • all of the modules (a) to (d) used and germinated with product contact elements by a germ reduction method is preferably selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving , Ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
  • the germ reduction method is preferably selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving , Ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
  • the modular system itself, as well as the elements of the modules that come into contact with product flow, germ-reducible and / or sterilizable, preferably autoclavable, gamma-irradiated, gassed with ethylene oxide (ETO), treatable with ozone (O3), with hydrogen peroxide ( H 2 O 2 ) treatable or with a steam-in-place (SIP) treatment treatable, which allows a germ-free or even aseptic operation of the modular system according to the invention.
  • ETO ethylene oxide
  • O3 ozone
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • SIP steam-in-place
  • all product-contacting objects used in the modules (a) to (d) are disposable articles or are used as disposable articles.
  • the modules are preferably connected to one another by welding or by aseptic connectors.
  • aseptic "ReadyMate" connectors from GE are preferably aseptic connectors used in the modular system according to the invention.
  • Prefabricated disposable articles (“disposables", "ready-to-use") are preferably used as gamma-irradiated elements.
  • all input fluids pass through a germ reduction filter, wherein preferably all exits are protected by a germ barrier which prevents regress growth.
  • the final purified biopharmaceutical biological macromolecular products from the heterogeneous cell culture fluid mixture may be filtered one final time at the end of the modular unit by a final filtration, preferably through a filter having a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • Final filtration can be done, for example, via gamma-irradiated Sartopore 2 capsules (Midicap size 7, 0.05m 2 ) into a gamma-irradiated 5L GE ReadCircuit Bag. If the fill level of the final bag is sufficient then this bag can be welded off and a new bag welded to the process.
  • FIG. 1 shows schematically a process diagram of an embodiment of the method according to the invention.
  • the numbers in parentheses are references to the mass balance as listed in Example 1 and Table 1.
  • FIG. 2 schematically shows the operating principle of the filtration step of the method and the installation with replacement of a spent filter 17 by welding a new filter 16.
  • FIG. 3 shows, by way of example, the two method steps of virus inactivation and neutralization - two units which are of modular construction, wherein the pH probes pH0501 and pH0502 are autoclaved and the remainder are each gamma-negative. The pH probes pH0501 and pH0502 are then welded into an assembly. The bags are connected via aseptic GE ReadyMate ® connectors. The connection to Prot-A and the filtration unit is first welded shut and then welded to the respective units.
  • the exemplary modular plant 1 consists of three filtration modules 2 each having two mutually operated filters 13, two chromatography modules 3 with two chromatography columns 4 and two membrane adsorbers 5 a virus removal step e.g. Virus inactivation 9, an ultrafiltration module 6 and a diafiltration module 7.
  • the buffers are freed of gas bubbles via a hydrophobic filter 15 or bubble trap 14.
  • Table 1 shows the mean flow rates and antibody concentrations of the positions shown in FIG.
  • a miniplant was constructed with the following modules and associated process steps: Unless otherwise stated, MasterFlex peristaltic pumps with an EasyLoad-II pump head were used in the process.
  • the hoses used were Masterflex LS 16 or Cflex or Sanipure. All product wetted components used were gamma-irradiated with 25kGy. In exceptional cases, when gamma-ray suspending was not permitted in terms of materials, components were autoclaved at 121 ° C for 20 minutes. Subassemblies with pH probes or virus filters.
  • a 10 L perfusion reactor was used for the continuous production of a monoclonal antibody IgG.
  • the viable cell density in the stationary state was 60-70 million cells / mL.
  • the titer was ⁇ 115 mg / L.
  • the production was operated with two parallel perfusion reactors for 28 days. ii) cell retention system
  • Fig. 2 shows how a closed germ-free process was realized here.
  • Both the filters and the hose assembly were gamma irradiated.
  • the input and output lines were connected via aseptic connectors to gamma-irradiated bags (GE ReadyCircuit 1 L), which served as equalization volumes for fluctuating flow rates.
  • GE ReadyCircuit 1 L gamma-irradiated bags
  • To deaerate the filters were coupled to hydrophobic 0.2 micron air filter whereby the module was closed in the context of the invention ( Figure 2).
  • the air filter was either an Emflon II from Pall Corp. or a Midisart2000 of the company Sartorius Stedim.
  • vent valves were modified in such a way that they were consistent even when closed, but still reliably sealed to the environment.
  • the inner sealing ring of the vent valve was removed and the valve was closed before the gamma irradiation. This valve was additionally secured against opening. As a result, the valve was in a safe condition "closed", which was characterized by a tight fit.
  • the vent valve was connected to the air filter via a hose. Between the vent valve and the air filter, the hose was inserted into a pinch valve. The filter was infested until liquid entered the air filter through the vent valve and hose. The hydrophobic vent filter then blocked the liquid.
  • the process plant blocked the flow of production through a valve on the filtrate side, causing the pressure in front of the filter to rise. This pressure increase was detected by a Pendotech pressure sensor. If a threshold of 0.5 bar was exceeded, the breather valve pinch valve was closed and the valve on the filtrate side opened.
  • the filtrate from i) cell clarification filtration was first passed through an ultrafiltration hollow fiber membrane (GE Healthcare Ready to Process, 0.2m 2 , gamma irradiated). continuously concentrated by a factor of 10.
  • the circulation pump was a disposable QuattroFlow 1200 SU pump whose pump head was integrated into the hose assembly before the gamma radiation.
  • the media components of the concentrated product were then exchanged with a 50 mM imidazole / NaCl buffer over a Gambro Revaclear 300 dialysis membrane.
  • the module is supplied sterile packaged by the manufacturer and connected to the gamma-braided tubing assembly under a sterile bench.
  • the permeate from the concentration and the media-laden waste stream were passed into a gamma-irradiated 200L Sartorius Flexboy.
  • the replacement of the Flexboys was carried out by welding with a Sartorius welding machine.
  • the product was continuously filtered with gamma-irradiated Sartoguard NF filters (MaxiCap Size 8) in a 200L Flexboy before filling. Construction and operation was analogous to B. Downstream DSP-1 i) cell clarification filtration.
  • Mabselect Sure was used as Prot-A resin to isolate the IgG.
  • the IgG was concentrated up to a factor of 10 and most of the contaminants were removed.
  • a continuous BioSMB plant from Tarpon Biosystems, Inc. was used with 12 columns (ID 16 mm, L 80 mm) with 8 columns in the loading zone (2 columns in series and 4 parallel series). The entire flow path, including the columns, was rendered germ-free by sanitization or gamma irradiation.
  • the loading per cycle was 32 column volumes per column.
  • As buffer were acetate buffer with different Molarity, pH and conductivities used.
  • Virus inactivation and neutralization consisted of three modules and was between capture chromatography and a 0.2 ⁇ m filtration: (a) a homogenization loop with a peristaltic loop M0502 (b) tube schematically shown as a coiled tubing (c) a neutralization bag in the the pH could be adjusted to 7.5.
  • the modules were individually prefabricated and gamma-irradiated according to the welds in Figure 3, the ends were respectively welded shut.
  • Bags were shown connected via aseptic GE Ready Mate ® connectors.
  • the connections to the protein A Ehiat line and filtration module were initially sealed and then welded to the respective modules.
  • Proteins were able to precipitate after a pH shift, whereby the precipitated protein was filtered off.
  • the product from the above 0.2 ⁇ m filtration was passed through two chromatographic steps by first using four sequentially (4-PCC) 2.5ml Capto Adhere (2.5ml GE) and then two 20ml alternating anion exchangers (Pall Hypercel StarAX). purified. ProtA leachables, DNA, HCP and aggregates were purified.
  • the two chromatography steps were a gammabestrahles Bag (GE Circuit Ready ® 1 L) connected with each other, in which the conductivity were adjusted according to the requirement of the anion exchanger on 7,5mS / cm by adding water.
  • the entire river route including the columns was sanitized or gamma-irradiated.
  • the loading per cycle was 50 column volumes per column.
  • the product Ström was collected again in a gamma-ray product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
  • the product solution was first prefiltered from the product bag of the Polish Chromatography via a 0.1 ⁇ m capsule (Sartopore2, MidiCap size 9, 0.2 m 2 ). Implementation and setup were analogous to the B. Downstream DSP-1 i) cell clarification filtration.
  • the output line from the prefiltration was connected directly via a peristaltic pump to the input of virus filtration from C. Downstream DSP-II via welding. Otherwise, the setup and operation of virus filtration from C. Downstream DSP-II was analogous to C. Downstream DSP-II 0.2 ⁇ m filtration. However, the virus filter used was a Virosart CPV filter (MidiCap size 9, 0.2 m 2 ), which was rinsed and autoclaved according to the manufacturer's instructions. Again, the filters were in the assembly shrink wrapped. The product stream was pumped again into a gamma-irradiated product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
  • the final concentration and rebuffering was analogous to the above B. DSP-I ii) concentration and rebuffering and differed only in that an autoclaved UV cell was involved in monitoring the product concentration in the concentration loop. The rebuffering was also carried out analogously to the above B. DSP-I ii) concentration and rebuffering, here a 50mM phosphate buffer pH 7.5 were used. The product stream was pumped again into a gamma-irradiated product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
  • a regularly run time of the method according to the invention was 3 days without germ growth, wherein the chromatography columns were sanitized by a 40% isopropanol + 0.5 M NaOH. At run times of the inventive method of more than 3 days, the chromatography columns were gamma-irradiated.
  • the average flow rates and antibody concentrations of the positions shown in FIG. 1 are summarized in Table 1.

Abstract

The invention relates to a method for continuously producing and/or preparing a biopharmaceutical biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture/fluid mixture in a disinfected manner, having the following steps: (a) providing a particle-free fluid from a heterogeneous cell culture/fluid mixture, said fluid containing the product, in the form of a product flow, (b) carrying out at least one filtering process, whereby a filtrate is obtained, (c) carrying out at least two chromatography steps for cleaning the product, (d) carrying out at least one virus-removing process, and (e) carrying out at least one ultrafiltration process and/or at least one diafiltration process on the product flow from step (b), (c), and/or (d), said method being characterized in that the at least two chromatography steps from step (c) include a cleaning process using at least two respective chromatography columns and/or membrane adsorbers and in that the method is carried out in a closed and modular manner. The invention further relates to a corresponding modular system for carrying out the method.

Description

Modulare Anlage und Verfahren zur kontinuierlichen., k imreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines Produktes  Modular plant and process for the continuous., K-reduced production and / or processing of a product
Die Erfindung betrifft eine modulare Anlage und ein Verfahren zur kontinuierlichen, keimreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung. The invention relates to a modular system and a method for the continuous, germ-reduced production and / or preparation of a product from a heterogeneous cell culture fluid mixture.
Gewöhnlich werden Proteine in der biotechnologischen Herstellung im Batch aufgereinigt (englisch batch:„Stapel")- Das bedeutet, dass die einzelnen Produktionszyklen chargenweise, diskontinuierlich gehandhabt werden, wobei nach dem Abschluss eines Produktionszyklus das Produkt alles Ganzes entnommen wird. Für eine erneute Produktion muss dann separat ein neuere Produktzyklus bzw. Batch gestartet werden. Usually, proteins in the biotechnological production are batch-cleaned - this means that the individual production cycles are handled batchwise, discontinuously, and after the completion of a production cycle the product is taken from the whole Then a newer product cycle or batch can be started separately.
In den letzten Jahren hat sich nun mehr und mehr gezeigt, dass eine kontinuierliche Verfahrensweise auch in der biotechnologischen Herstellung gefahren werden kann, wobei das Verfahren im Gegensatz zum Batch- Verfahren ohne Unterbrechungen laufen kann. In recent years it has become more and more evident that a continuous procedure can also be used in biotechnological production, whereby the process can run without interruptions, in contrast to the batch process.
Die stark regulierte pharmazeutische Produktion erfordert einen großen zeitlichen, technischen und personellen Aufwand für die Bereitstellung gereinigter und sterilisierter Bioreaktoren und Gewährleistung eines keimfreien Produkts. Um Kreuzkontaminationen bei einem Produktwechsel in einer Multi-Purpose- Anlage oder zwischen zwei Produktchargen sicher zu vermeiden, wird außer der Reinigung eine sehr aufwändige Reinigungsvalidierung benötigt, welche bei einer Prozessadaption ggf. wiederholt werden muss. Highly regulated pharmaceutical production requires a great deal of time, technical and human resources to provide purified and sterilized bioreactors and ensure a germ-free product. In order to reliably avoid cross-contamination during a product change in a multi-purpose system or between two product batches, a very elaborate cleaning validation is required in addition to cleaning, which may need to be repeated during a process adaptation.
Dies gilt sowohl für das Upstream-Processing (USP), d.h. die Herstellung biologischer Produkte in Fermentern als auch für das Downstream-Processing (DSP), d. h. die Aufreinigung der Fermentationsprodukte. This applies to both upstream processing (USP), i. the production of biological products in fermenters as well as for downstream processing (DSP), d. H. the purification of the fermentation products.
Gerade bei der Fermentation ist eine keimfreie Umgebung für eine erfolgreiche Kultivierung essentiell. Zur Sterilisation von Batch- oder Fedbatch-Fermentern kommt in der Regel die SIP-Technik zum Einsatz (SIP = sterilization-in-place).  Especially in fermentation, a germ-free environment is essential for successful cultivation. For the sterilization of batch or fed-batch fermenters, the SIP technique is usually used (SIP = sterilization-in-place).
Der durch die Bereitstellungsprozeduren bedingte Nutzungsausfall der Reaktoren kann insbesondere bei kurzen Nutzungsperioden und häufigem Produktwechsel in der Größenordnung der Reaktorverfügbarkeit liegen. Betroffen sind im USP der biotechnologischen Produktion z. B. die Prozessschritte der Medienherstellung und Fermentation und im DSP das Solubilisieren, Einfrieren, Auftauen, pH-Adjustieren, Produkttrennung wie z. B. durch Chromatographie, Fällen, oder Kristallisieren, das Umpuffern und die Virusinaktivierung. The loss of use of the reactors due to the provisioning procedures may be on the order of the reactor availability, in particular in the case of short periods of use and frequent product changes. Affected in the USP of biotechnological production z. B. the process steps of media production and fermentation and DSP solubilization, freezing, thawing, pH adjustment, Product separation such. By chromatography, precipitation, or crystallization, rebuffering, and virus inactivation.
Die regulatorischen Anforderungen sind dabei im Downstream-Bereich eine keimarme Prozessführung. Daher ist eine sterile Fahrweise im Falle des Batch-Betriebes nicht gefordert. In einem kontinuierlichen Verfahren jedoch wird die Reinigung des Proteins über einen längeren Zeitraum möglichst ohne Reinigungsschritte betrieben. Dies geschieht bevorzugt ohne Sterilisationsschritte während der Reinigung. Dabei ist aber das Verkeimungsrisiko um ein vielfaches höher als bei einem reinen Batchbetrieb. The regulatory requirements in the downstream area are low-germ litigation. Therefore, a sterile procedure in the case of batch operation is not required. In a continuous process, however, the purification of the protein is operated over a longer period of time as possible without purification steps. This is preferably done without sterilization steps during cleaning. However, the risk of contamination is many times higher than in a pure batch mode.
WO2012/078677 beschreibt ein Verfahren und eine Anlage zur kontinuierlichen Aufbereitung von biopharmazeutischen Produkten durch Chromatographie und deren Integration in einer Produktionsanlage insbesondere in einer Einweg-Anlage. Obwohl WO2012/078677 Ansätze zur kontinuierlichen Produktion von biopharmazeutischen und biologischen Produkten liefert, reicht die offenbarte Lösung in der Praxis nicht aus. WO2012/078677 offenbart auch nicht die Verwendung einer sterilisierten Chromatographiesäule. WO2012 / 078677 describes a process and a plant for the continuous preparation of biopharmaceutical products by chromatography and their integration in a production plant, in particular in a disposable plant. Although WO2012 / 078677 provides approaches for the continuous production of biopharmaceutical and biological products, the disclosed solution is not sufficient in practice. WO2012 / 078677 also does not disclose the use of a sterilized chromatography column.
US 2014/0255994 AI offenbart ein integriertes kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Proteinen. US 2014/0255994 AI offenbart allerdings nicht das Merkmal, dass in so einem Verfahren sterilisierte Chromatographiesäulen verwendet werden könnten. US 2014/0255994 A1 discloses an integrated continuous process for the production of therapeutic proteins. However, US 2014/0255994 Al does not disclose the feature that sterilized chromatography columns could be used in such a process.
EP 2 182 990 AI offenbart ein Verfahren zur Sterilisation von Chromatographiesäulen durch Verwendung von heißem Wasserdampf. EP 2 182 990 A1 discloses a method for sterilizing chromatography columns by using hot steam.
Zunächst seien einige Begriffe näher definiert. First, some terms are defined in more detail.
Ein kontinuierliches Verfahren meint im Rahmen der Erfindung jeden Prozess zur Durchfuhrung von mindestens zwei Prozessschritten in Serie, in dem der Ausgangsstrom eines vorgeschalteten Schrittes in einen nachgeschalteten Schritt befördert wird. Der nachgeschaltete Schritt beginnt die Bearbeitung des Produktstroms, bevor der vorgeschaltete Schritt abgeschlossen ist. Üblicherweise wird in einem kontinuierlichen Verfahren immer ein Teil des Produktstroms in der Produktionsanlage befördert und wird als „kontinuierlicher Produktstrom" bezeichnet. Entsprechend bedeutet eine kontinuierliche Beförderung oder Transfer eines Produktstroms von einer vorgeschalteten Unit in eine nachgeschaltete Unit, dass die nachgeschaltete Unit bereits arbeitet, bevor die vorgeschaltete Unit außer Betrieb genommen wird, d.h. dass zwei nacheinander geschaltete Units den Produktstrom gleichzeitig prozessieren, der sie durchfließt. In the context of the invention, a continuous process means any process for carrying out at least two process steps in series, in which the output stream of an upstream step is conveyed into a downstream step. The downstream step begins processing the product stream before the upstream step is completed. Usually, in a continuous process, a part of the product stream is always carried in the production plant and becomes Accordingly, a continuous transport or transfer of a product stream from an upstream unit to a downstream unit means that the downstream unit is already operating before the upstream unit is taken out of service, ie, two units connected in series will simultaneously stream the product process it, which flows through it.
Der Begriff„keimreduziert" meint im Rahmen der Erfindung einen Zustand reduzierter Keimzahl, also einer Zahl an Mikroorganismen pro Flächen- oder Volumeneinheit von nahezu Null, der durch eine geeignete Keimreduktionsmethode erreichbar ist, wobei diese Keimreduktionsmethode ausgewählt sein kann aus Gamma-Bestrahhing, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)-Behandlung und„steam-in-place" (SIP)-Behandlung. The term "germ-reduced" in the context of the invention means a state of reduced germ count, ie a number of microorganisms per unit area or volume unit of almost zero, which can be achieved by a suitable germ reduction method, whereby this germ reduction method can be selected from gamma irradiation, beta Irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment and steam-in-place (SIP) treatment.
Der Begriff„Einwegartikel" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die betreffenden produkt-berührten Teile, insbesondere Apparaturen, Behältern, Filter und Verbindungselemente, zum einmaligen Gebrauch mit anschließendem Wegwerfen geeignet sind (Englisch„disposable"), wobei diese Behälter sowohl aus Kunststoff als auch aus Metall sein können. Im Rahmen der Erfindung umfasst der Begriff auch Mehrwegartikel, etwa aus Stahl, die im erfindungsgemäßen Verfahren nur einmal verwendet werden und dann im Verfahren nicht mehr zum Einsatz kommen. Diese Mehrwegartikel, z.B. aus Stahl, werden dann im Rahmen der Erfindung auch„als Einwegartikel benutzte" Gegenstände bezeichnet. Solche eingesetzten Einwegartikel können dann im erfindungsgemäßen Verfahren auch als„disposabel" bzw.„Single-Use"- Artikel bezeichnet werden („SU Technologie"). Dadurch wird der keimreduzierte Zustand des erfindungsgemäßen Verfahrens und modularer Anlage noch weiter verbessert. In the context of the invention, the term "disposable article" means that the product-contacted parts in question, in particular apparatuses, containers, filters and connecting elements, are disposable with disposable use, these containers being made of plastic as well as plastic also be made of metal. In the context of the invention, the term also includes reusable articles, for example of steel, which are used only once in the process according to the invention and are then no longer used in the process. These reusable articles, e.g. In the context of the invention, articles used for this purpose are also referred to as "articles used as disposable articles." Such disposable articles used can also be referred to as "disposable" or "single-use" articles in the process according to the invention ("SU technology"). As a result, the germ-reduced state of the method according to the invention and modular system is further improved.
Der Begriff„Produktstrom" meint im Rahmen der Erfindung das partikel-freie Fluid aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, welche das Produkt enthält, sowie das Ergebnis jeder anderen Verfahrensschritte des erfindungs gemäßen Verfahrens, also den Produktstrom nach Filtration, nach Chromatographie, nach Virenabreicherung, nach Ultrafiltration, nach Diafiltration, oder nach weiteren Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei diese Produktströme dann unterschiedliche Konzentrationen und Reinheitsgrade aufweisen können. Der Begriff„Virenabreicherung" meint im Rahmen der Erfindung eine Verringerung der Konzentration an aktiven Viren pro Volumeneinheit des zu behandelnden Fluids, bis hin zur vollständigen Inaktivierung und/oder Entfernung der in dem zu behandelnden Fluid enthaltenen Viren. The term "product stream" means within the scope of the invention, the particle-free fluid from a heterogeneous cell culture fluid mixture containing the product, as well as the result of any other process steps of the inventive method, ie the product stream after filtration, after chromatography Virus depletion, after ultrafiltration, after diafiltration, or after further steps of the method according to the invention, wherein these product streams may then have different concentrations and degrees of purity. The term "virus depletion" in the context of the invention means a reduction in the concentration of active viruses per unit volume of the fluid to be treated, to the complete inactivation and / or removal of the viruses contained in the fluid to be treated.
Der Begriff „Mikrobizid" meint im Rahmen der Erfindung einen Stoff, welcher das Wachstum von Mikroorganismen verlangsamen oder ganz hemmen kann, wobei dieses Mikrobizid in Form eines mikrobizid-haltigen Puffers, insbesondere im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens während einer Ultrafiltration verwendet werden kann. The term "microbicide" in the context of the invention means a substance which can slow down or completely inhibit the growth of microorganisms, it being possible to use this microbicide in the form of a microbicidal buffer, in particular within the scope of the process according to the invention during ultrafiltration.
Der Begriff „Bubble-Trap" meint im Rahmen der Erfindung eine Vorrichtung zum Auffangen von Gasblasen, wobei dabei das betreffende Fluid entgast wird. The term "bubble trap" in the context of the invention means a device for collecting gas bubbles, wherein the relevant fluid is degassed.
Der Begriff„modular" meint im Rahmen der Erfindung, dass die einzelnen Schritte des erfindungsgemäße Verfahrens in separaten, miteinander verbundenen Modulen durchgeführt werden können, wobei die Module vorkonfiguriert und keimreduziert sind und geschlossen, in unterschiedlichen Kombinationen miteinander verschaltet werden können. Der Begriff „modulare Anlage" meint im Rahmen der Erfindung eine Serie von miteinander verbundenen Modulen („Units") zur Durchführung von mindestens zwei Downstream- und / oder Upstream-Schritten, in denen ein Fluid ( "Poduktstrom") befördert werden kann. Erfindungsgemäß sind die Units zur kontinuierlichen Durchfuhrung eines Schrittes geeignet und können mit einem kontinuierlichen Fluidstrom ("Produktstrom") betrieben werden. Die einzelnen Module der„modularen Anlage" können dabei in jeder Kombination miteinander verschaltet weiden. Beispiele für Module im Sinne der Erfindung sind das Filtrationsmodul 2, das Chromatographiemodul 3, das Ultrafiltrationsmodul 6, das Diafiltrationsmodul 7 und das Dialysemodul 8. Der Begriff „geschlossen" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Fahrweise des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen modularen Anlage, welche so gefahren werden, dass das Produkt, welches mit diesem Verfahren und dieser modularen Anlage produziert und/oder aufbereitet wird, nicht an die Raumumgebung exponiert wird. In das erfindungsgemäße geschlossene Verfahren und die entsprechende erfindungsgemäße geschlossene modulare Anlage können von außen Materialien, Gegenstände, Puffer und dergleichen zugegeben werden, wobei aber diese Zugabe in einer solchen Weise erfolgt, dass eine Exposition des produzierten und/oder aufbereiteten Produktes an die Raumumgebung vermieden wird. The term "modular" means within the scope of the invention that the individual steps of the method according to the invention can be carried out in separate, interconnected modules, wherein the modules are preconfigured and germ-reduced and can be interconnected in different combinations with one another Plant "in the context of the invention means a series of interconnected modules (" units ") for carrying out at least two downstream and / or upstream steps in which a fluid (" product flow ") can be conveyed continuous operation of a step and can be operated with a continuous fluid flow ("product flow"), whereby the individual modules of the "modular plant" can be interconnected in any combination. Examples of modules in the sense of the invention are the filtration module 2, the chromatography module 3, the ultrafiltration module 6, the diafiltration module 7 and the dialysis module 8. The term "closed" in the context of the invention means the mode of operation of the method according to the invention and the modular system according to the invention be driven so that the product that is produced and / or processed with this method and this modular system is not exposed to the room environment. In the closed method according to the invention and the corresponding closed modular system according to the invention, materials, objects, buffers and the like can be added externally, but this addition takes place in such a way that exposure of the produced and / or processed product to the room environment is avoided ,
Die im Stand der Technik bekannten, üblichen Verfahren weisen eine Reihe von Nachteilen auf, welche im Folgenden behandelt werden. Bekannte Verfahren zur Herstellung von biopharmazeutischen und biologischen Produkten umfassen üblicherweise folgende Produktionsschritte, die miteinander verschaltet werden: The conventional processes known in the art have a number of disadvantages, which will be dealt with below. Known methods for the production of biopharmaceutical and biological products usually comprise the following production steps, which are interconnected:
1. Perfusionskultur  1. perfusion culture
2. Zellrückhaltesystem, alternativ zu Schritt 1 und 2 kann auch eine Feedbatchkultur vorgesehen sein,  2. cell restraint system, alternatively to step 1 and 2, a feedbatch culture may also be provided,
3. Zellabtrennung 3. cell separation
4. Puffer- bzw. Medienaustausch bevorzugt mit Konzentrierung  4. Buffer or media exchange preferably with concentration
5. BioBurden-Reduzierung bevorzugt durch Sterilfiltration  5. BioBurden reduction preferably by sterile filtration
6. Capture Chromatographie Üblicherweise werden weitere Schritte zur weiteren Reinigung des Produktstroms durchgeführt, insbesondere:  6. Capture Chromatography Usually, further steps are taken to further purify the product stream, in particular:
7. Virusinaktivierung  7. Virus inactivation
8. Neutralisation, und  8. Neutralization, and
9. Optional eine weitere Tiefenfiltration, BioBurden-Reduzierung (Sterilfiltration). Angesichts der hohen Qualitätsstandards bei der Herstellung von Biopharmazeutika folgen üblicherweise darüber hinaus folgende Schritte:  9. Optional further depth filtration, BioBurden reduction (sterile filtration). In view of the high quality standards in the production of biopharmaceuticals, the following steps usually follow:
10. Chromatographische Zwischen- und Feinreinigung  10. Chromatographic intermediate and fine cleaning
11. BioBurden Reduzierung z. B. Sterilfiltration  11. BioBurden reduction z. B. Sterile filtration
12. Virenfiltration  12. Virus filtration
13. Pufferaustausch und bevorzugt Konzentrierung, und  13. buffer exchange and preferably concentration, and
14. Sterilfiltration. Bei der oben beschriebenen Herstellung stellen Zellen in einem Fermenter mit Nährstofflösung ein biologisches Produkt her, etwa ein Protein, beispielsweise ein therapeutisches Protein. Die Nährstofflösung ist dabei auch ein ideales Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wie Bakterien und Sporen, woraus sich ein Problem hinsichtlich des ungewünschten Wachstums solcher Mikroorganismen ergibt. Dieses ungewünschte Wachstum von Mikroorganismen wird besonders bei längeren Laufzeiten ein Problem, weil die Nährstofflösung mit ansteigender Laufzeit des Verfahrens mehr und mehr kontaminiert wird, bis hin zu einem exponentiellen Wachstum von Mikroorganismen und damit Totalverlust der betreffenden Charge an hergestelltem biologischen Produkt. 14. Sterile filtration. In the preparation described above, cells in a fermentor with nutrient solution produce a biological product, such as a protein, for example, a therapeutic protein. The nutrient solution is also an ideal growth medium for microorganisms, such as bacteria and spores, resulting in a problem with regard to the unwanted growth of such microorganisms. This undesirable growth of microorganisms becomes a problem, especially with longer maturities, because the nutrient solution becomes more and more contaminated with increasing runtime of the process, up to an exponential growth of microorganisms and thus total loss of the relevant batch of biological product produced.
Um der Forderung an ein schnelles und flexibles Neubeschicken der Produktionsanlage unter Wahrung maximaler Sauberkeit und Keimfreiheit gerecht zu werden, erfreuen sich auf dem Markt Konzepte für eine kontinuierliche Produktion bevorzugt mit Einwegtechnologie eines ständig wachsenden Interesses. In order to meet the demand for a fast and flexible new shipment of the production plant while maintaining maximum cleanliness and sterility, the market enjoys concepts for continuous production, preferably with disposable technology of ever increasing interest.
Für längere Laufzeiten eines solchen Verfahrens von mehreren Stunden über Tage bis Wochen reichen aber gewöhnliche Maßnahmen zur Sanitisierung nicht, etwa die üblichen „Clean-in-Place" (CIP)-Maßnahmen, wie z.B. Sanitisierung durch IM NaOH. Bei Laufzeiten ab mehreren Stunden haben solche gewöhnlichen Verfahren und Anlagen daher den Nachteil, dass sie hinsichtlich möglicher Kontamination und/oder möglichen Keimwachstums sehr anfällig sind. For longer periods of such a procedure from several hours over days to weeks, however, usual measures for sanitizing are not sufficient, for example the usual "clean-in-place" (CIP) measures, such as sanitation by IM NaOH Such conventional methods and equipment therefore have the disadvantage that they are very vulnerable to possible contamination and / or possible germ growth.
Es bestand daher ein Bedarf an einem Verfahren zur kontinuierlichen Reinigung eines Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, welches durch seine weitgehende Keimarmut eine kontinuierliche Fahrweise von bis zu mehreren Wochen ermöglicht There was therefore a need for a process for the continuous purification of a product from a heterogeneous cell culture-fluid mixture, which allows a continuous driving of up to several weeks due to its extensive germ reduction
Es war daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine entsprechende Anlage zu entwickeln, mit dem ein Produkt, etwa ein Protein, kontinuierlich über einen Zeitraum von mehreren Stunden bis hin zu mehreren Wochen gereinigt werden kann. It was therefore the object of the present invention to develop a method and a corresponding system with which a product, for example a protein, can be purified continuously over a period of several hours to several weeks.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellen eines Verfahrens zur kontinuierlichen, keimreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid- Mischung, umfassend die Schritte: The invention achieves this object by providing a method for the continuous, germ-reduced production and / or preparation of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture fluid mixture, comprising the steps:
(a) Bereitstellen eines partikel- freien Fluids aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid- Mischung, welche das Produkt enthält, in Form eines Produktstroms, (a) providing a particle-free fluid from a heterogeneous cell culture-fluid mixture containing the product in the form of a product stream,
(b) mindestens eine Filtration, wobei ein Filtrat erhalten wird,  (b) at least one filtration, whereby a filtrate is obtained,
(c) wenigstens zwei Chromatographieschritte zur Reinigung des Produktes, (c) at least two chromatographic steps to purify the product,
(d) mindestens eine Virenabreicherung, (d) at least one virus depletion,
(e) mindestens eine Ultrafiltration und/oder mindestens eine Diafiltration des Produktstroms der Schritte (b), (c), und/oder (d), dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Chromatographieschritte aus (c) eine Reinigung über wenigstens jeweils zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber umfasst und, dass das Verfahren geschlossen und modular durchgeführt wird.  (E) at least one ultrafiltration and / or at least one diafiltration of the product stream of steps (b), (c), and / or (d), characterized in that the at least two chromatographic steps of (c) a purification over at least two chromatography columns and / or membrane adsorber and that the process is closed and modular.
Die Grundprinzipien des erfindungsgemäßen Verfahrens beruhen auf seinen vier Kernprinzipien und damit Kernmerkmalen: The basic principles of the method according to the invention are based on its four core principles and thus core features:
1. kontinuierliche 1. continuous
2. keimreduzierte 2. germ-reduced
3. geschlossene, und  3. closed, and
4. modulare Produktion eines biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produktes.  4. Modular production of a biopharmaceutical, biological macromolecular product.
Diese vier Merkmale gemeinsam verringern das gewöhnlich auftretende Problem des ungewünschten Wachstums von Mikroorganismen derart drastisch, dass Laufzeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer kontinuierlichen Fahrweise von bis zu 8 Wochen möglich werden.  Together, these four features dramatically reduce the commonly encountered problem of undesirable microorganism growth, allowing run times of the process of the present invention to be up to 8 weeks continuous.
Das in Schritt a) bereitgestellte partikel- freie Fluid aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid- Mischung kann bevorzugt aus einem kontinuierlichen Perfusions- und Fermentationsprozesses stammen, etwa eine Zellkultur bzw. Gewebekultur, oder ein Perfusionsreaktor. Dabei können sogar mehr als ein Perfusionsreaktor parallel betrieben werden, etwa zwei Perfusionsreaktoren. Das Fluid kann zunächst durch geeignete Zellrückhaltesysteme, etwa einen Schrägplattenabscheider (Settier) kontinuierlich abgeführt werden, durch den ein Großteil der Zellen zurückgehalten werden kann. Durch nachfolgende Fihrations- und/oder Zentrifugationsschritte oder andere geeignete Trennverfahren kann dann das Fluid von im Fluid enthaltenden Partikeln befreit werden, wodurch ein partikel-freies Fluid erhalten wird, in welchem sich das biopharmazeutische, biologische makromolekulare Produkt befindet. The particle-free fluid from a heterogeneous cell culture-fluid mixture provided in step a) can preferably originate from a continuous perfusion and fermentation process, for example a cell culture or tissue culture, or a perfusion reactor. In this case, even more than one perfusion reactor can be operated in parallel, for example two perfusion reactors. The fluid can first be continuously removed by suitable cell restraint systems, such as a slant plate separator (settler), through which a majority of the cells can be retained. Subsequent filtration and / or centrifugation steps or other suitable separation processes may then free the fluid from particles contained in the fluid, thereby obtaining a particle-free fluid in which the biopharmaceutical, biological macromolecular product is located.
Der Filtrationsschritt (b) kann z.B. eine Filtration des nach Schritt (a) erhaltenen partikel- freien Fluids sein, wobei ein Fihrat erhalten wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch weitere Filtrationsschritte an geeigneten Stellen des Verfahrens umfassen. The filtration step (b) may be e.g. a filtration of the particle-free fluid obtained after step (a) to obtain a filtrate. However, the process according to the invention can also comprise further filtration steps at suitable points of the process.
Der Filtrationsschritt b) kann durch geeignete Filterverfahren erfolgen, z.B. einen 0,2μm Filter, oder mehrerer parallel betriebene Filter. Ein geeigneter Filter für den Filtrationsschritt ist beispielsweise ein Sartoguard NF 0,2μm Filter, von dem mehrere parallel betrieben werden können. The filtration step b) can be carried out by suitable filtering methods, e.g. a 0.2μm filter, or several filters operated in parallel. A suitable filter for the filtration step is for example a Sartoguard NF 0.2μm filter, several of which can be operated in parallel.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der Filtrationsschritt (b) einen Tiefenfilter mit einer zusätzlichen Möglichkeit der Abreicherung von Kontaminanten wie DNA, ProtA, HCP. Dies können Tiefenfilter mit ausreichendem Zetapotential (Zetapor 3M, Posidyne, Pall) oder Tiefenfilter mit Aktivkohle (Millistak MerckMillipore) sein.  In a further embodiment of the method according to the invention, the filtration step (b) comprises a depth filter with an additional possibility of depleting contaminants such as DNA, ProtA, HCP. These may be depth filters with sufficient zeta potential (Zetapor 3M, Posidyne, Pall) or activated carbon activated carbon filters (Millistak Merck Millipore).
Die wenigstens zwei Chromatographieschritte zur Reinigung des Produktes des Schrittes c) umfassen eine Reinigung über wenigstens jeweils zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber. Dabei können die Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber jedes geeignete Bindungsprinzip aufweisen, etwa Affiniät des Produktes zu einem Liganden, ionische Wechselwirkungen, Metalchelat-Bindung, hydrophobe Interaktionen oder van-der-Waals-Kräfie. Beispielsweise kann der erster Chromatographieschritt der wenigstens zwei Chromatographieschritte eine Affinitätschromatographie sein (z.B. ein Ligand mit Affinität zum Produkt, wie z.B. Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und ein von Protein A, Protein G und Protein L, IgM, IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat). Danach folgt dann ein weiterer (zweiter) Chromatographieschritt, etwa eine Chromatographie über ionische Wechselwirkungen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist hier flexibel und kann in Schritt c) je nach zu erzielendem Reinheitsgrad und Konzentration des Produktes jedes geeignete Chromatographieprinzip in jeder Reihenfolge umfassen. Der technische Effekt der Verwendung von wenigstens zwei Chromatographieschritten über wenigstens jeweils zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorbern gemäß Schritt c), besteht darin, dass in der Regel ein einzelner Chromatographieschritt keine ausreichende Aufreinigung der Kontaminaten wie z.B. Host Cell Impurities, Aggregate, DNA, Protein A usw. gewährleisten kann. The at least two chromatographic steps for purifying the product of step c) comprise purification via at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers. The chromatography columns and / or membrane adsorbers may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions or van der Waals Kräfie. For example, the first chromatographic step of the at least two chromatography steps may be affinity chromatography (eg, a ligand having affinity for the product, such as protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, IgG different recombinant protein which has an affinity for the product). This is followed by another (second) chromatography step, such as chromatography on ionic interactions. The process according to the invention is flexible here and can comprise in step c), depending on the degree of purity and concentration of the product to be achieved, any suitable chromatography principle in any order. The technical effect of using at least two chromatographic steps over at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers according to step c), is that usually a single chromatography step does not sufficiently clean the contaminants such as host cell impurities, aggregates, DNA, protein A etc. can ensure.
Außerdem wird dadurch eine kontinuierliche Produktion in einem Chromatographieschritt ermöglicht, da mindestens eine Chromatographiesäule und/oder Membranads orber mit ungereinigtem Produkt beladen werden kann, während mindestens eine andere Chromatographiesäule und/oder Membranadsorber regeneriert bzw. ehiiert werden kann, wodurch eine kontinuierliche und effektive Fahrweise des Verfahrens erzielt werden kann. It also allows continuous production in a chromatographic step, since at least one chromatography column and / or membrane adsorbent can be loaded with unpurified product while at least one other chromatography column and / or membrane adsorber can be regenerated, thereby providing a continuous and effective mode of operation Method can be achieved.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen zwischen den wenigstens zwei Chromatographieschritten in (c) und/oder nach der Vireninaktivierung in Schritt (d) ein oder mehrere weitere Schritte zur Einstellung des pH- Wertes und/oder zur Einstellung der Leitfähigkeit und/oder Filtrations- und/oder Konzentrationsschritte und/oder ein Pufferaustausch. Dadurch wird eine an die Bedingungen anpassbare Fahrweise des Prozesses ermöglicht. In a further embodiment of the method according to the invention, one or more further steps for adjusting the pH and / or for adjusting the conductivity and / or filtration take place between the at least two chromatographic steps in (c) and / or after the virus inactivation in step (d) - and / or concentration steps and / or a buffer exchange. This allows a process-customizable driving style of the process.
Die mindestens eine Virenabreicherung des Schrittes d) kann insbesondere durch Einstellen des pH- Werts des partikel-freien Fluides erfolgen, bevorzugt auf einen pH- Wert von < 4,0. Einstellen des pH- Wertes des zu inaktivierenden partikel-freien Fluids auf < 4,0 kann beispielsweise durch Zugabe von HCl-Lösung erfolgen. Die Zugabe erfolgt typischerweise im Vorfeld der Vorrichtung zur Virusabreicherung. Üblicherweise wird der pH-Wert auf >4 mit einer Base beispielsweise Natriumhydroxid-Lösung (NaOH) eingestellt, um die Virusabreicherung zu beenden. The at least one virus removal of step d) can be carried out in particular by adjusting the pH of the particle-free fluid, preferably to a pH of <4.0. Adjustment of the pH of the particle-free fluid to be inactivated to <4.0 can be effected, for example, by addition of HCl solution. The addition is typically in advance of the virus depletion device. Typically, the pH is adjusted to> 4 with a base, for example, sodium hydroxide solution (NaOH) to terminate the virus depletion.
Die mindestens eine Virenabreicherung des Schrittes d) kann aber auch durch eine solvent- detergent Schritt erfolgen, bei dem eine Virenabreicherung durch Lösungsmittel- / Detergenz erzielt wird. In einer weiteren Ausfuhrungsform kann die Virenabreicherung auch durch UV- Behandlung und/oder durch thermische Behandlung erzielt werden. However, the at least one virus removal of step d) can also be effected by a solvent-detergent step in which virus depletion by solvent / detergent is achieved. In a further embodiment, the virus removal can also be achieved by UV treatment and / or by thermal treatment.
Die mindestens eine Virenabreicherung des Schrittes d) kann insbesondere in einer Verweilstrecke erfolgen, in die ein segmentierter Produktstrom eingebracht werden kann. The at least one virus removal of step d) can be carried out in particular in a residence zone into which a segmented product stream can be introduced.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle in den Schritten (a) bis (e) eingesetzten, produkt-berührten Elemente durch eine geeignete Keimreduktionsmethode keimreduziert. In a further embodiment of the process according to the invention, all product-contacted elements used in steps (a) to (e) are germ-reduced by a suitable germ reduction method.
Bevorzugt kann die Keimreduktionsmethode ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)- Behandlung, Ozon-Behandlung (O3), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und Steam- in-place (SIP) Behandlung. Preferably, the germ reduction method may be selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
Entsprechend sind bevorzugt auch die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Gegenstände und Elemente der Module, die mit Produktstrom in Kontakt treten, keimreduzierbar und/oder sterilisierbar, bevorzugt autoklavierbar, gamma-bestrahlbar, mit Ethylenoxid (ETO) begasbar, mit Ozon (O3) behandelbar, mit Wasserstoffperoxid (H2O2) behandelbar oder mit einer Steam-in-place (SIP)-Behandlung behandelbar, was einen keimreduzierten oder sogar aseptischen Betrieb des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht. Accordingly, the articles and elements of the modules used in the process according to the invention, which come into contact with the product stream, are preferably germ-reducible and / or sterilizable, preferably autoclavable, gamma-irradiated, gassable with ethylene oxide (ETO), treatable with ozone (O 3), can be treated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or treated with a steam-in-place (SIP) treatment, which enables a germ-reduced or even aseptic operation of the method according to the invention.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle ab Filtrationsschritt (b) verwendeten produktberührten Elemente Einwegartikel oder werden als Einwegartikel benutzt. Solche eingesetzten Einwegartikel können dann im erfindungsgemäßen Verfahren auch als„disposabel" bzw.„Single-Use"- Artikel bezeichnet werden („SU Technologie"). Dadurch wird der keimreduzierte Zustand des Verfahrens verbessert. In a further embodiment of the process according to the invention, all product-contacting elements used starting from filtration step (b) are disposable articles or are used as disposable articles. Such used disposable articles can then also be referred to as "disposable" or "single-use" articles in the process according to the invention ("SU technology"). As a result, the germ-reduced state of the process is improved.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden alle Eingangsfluide durch einen Keimreduktionsfilter filtriert, wie etwa einen Sartoguard NF Filter der Firma Sartorius. Dabei können bevorzugt alle Ausgänge durch eine Keimbarriere geschützt sein, die ein Rückwachstum von Mikroorganismen verhindern. Beispielsweise kann auch hier ein Sartoguard NF Filter der Firma Sartorius als Keimbarriere verwendet werden. Eine zusätzliche Sicherheit der Keimbarriere 11 kann durch eine Wechselschaltung von Filtern und/oder Abfallleitung erzielt werden. Eine weitere Maßnahme zur Gewährleistung der keimreduzierten Bedingungen kann durch eine periodische Sanitisierung der Abfallleitung vorzugsweise nach der Filtration mit z.B. NaOH Lösung erreicht werden. Weitere Verfahren wären UV Bestrahlung und Hitzebehandlung. Die modularen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in einer weiteren Ausfuhrungsform bevorzugt in Modulen durchgeführt, wobei die Module miteinander verbunden sind. In a further embodiment of the method according to the invention, all input fluids are filtered through a germ reduction filter, such as a Sartorius Sartoguard NF filter. In this case, all exits may preferably be protected by a germ barrier which prevents a re-growth of microorganisms. For example, a Sartorius NF filter from Sartorius can also be used as a germ barrier here. An additional security of the germ barrier 11 can be achieved by a changeover of filters and / or waste line. Another measure to ensure the germ-reduced conditions can be achieved by a periodic sanitization of the waste line, preferably after filtration with eg NaOH solution. Other methods would be UV irradiation and heat treatment. The modular method steps of the method according to the invention are preferably carried out in modules in a further embodiment, wherein the modules are interconnected.
Dabei können bevorzugt die Module durch Verschweißen oder durch aseptische Konnektoren miteinander verbunden sein. Zum Verschweißen der Module kann z.B. das Gerät„TC Weider" der Firma Sartorius verwendet werden.  In this case, the modules may preferably be connected to one another by welding or by aseptic connectors. For welding the modules, e.g. the device "TC Weider" of the company Sartorius can be used.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Schritten (a) bis (e) alle verwendeten Flüssigkeiten, Gase und Feststoffe keimreduziert. Dabei erfolgt die Keimreduktion bevorzugt durch eine Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von bevorzugt < 0,45 μm. Dabei wird bevorzugt während des Verfahrens keine Inprocess-Sterilisierung durchgeführt. In anderen Ausführungsformen kann auch die Keimreduktion durch eine Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von bevorzugt < 0,20 μm durchgeführt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor dem Chromatographie-Schritt (c) ein Entgasen aller Fluide durchgeführt, welche auf die wenigstens zwei Chromatographiesäulen kommen, wobei das Entgasen vorzugsweise durch mindestens eine Bubble-Trap und/oder durch mindestens eine hydrophobe Mikrofittrationsmembran über Vakuum und/oder durch Behandeln mit Ultraschall und/oder durch Durchperlen mit einem schlecht löslichen Gas, wie z.B. Helium erfolgt. In a further embodiment of the method according to the invention, all the liquids, gases and solids used are germ-reduced in steps (a) to (e). The germ reduction preferably takes place by filtration through a filter having a pore size of preferably <0.45 μm. In this case, preferably no in-process sterilization is carried out during the process. In other embodiments, the seed reduction may also be performed by filtration through a filter having a pore size of preferably <0.20 μm. In a further preferred embodiment of the method according to the invention, a degassing of all fluids is carried out before the chromatography step (c), which come to the at least two chromatography columns, the degassing preferably by at least one bubble trap and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane Vacuum and / or by treatment with ultrasound and / or by bubbling with a poorly soluble gas, such as Helium takes place.
Dabei ist die Nutzung einer hydrophoben Mikrofiltrationsmembran über Vakuum für die Einhaltung der Keimfreiheit in der kontinuierlichen Führung des erfindungs gemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Anlage bevorzugt, da diese sich als besonders vorteilhaft im Vergleich zur Bubble-Trap erwiesen hat. Die verwendete hydrophobe Mikrofiltrationsmembran kann insbesondere ein MicroModule der Firma Membrana seia In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das partikel-freie Fluid aus Schritt a) mindestens einer Ultrafiltration gegen einen mikrobizid-haltigen Puffer unterzogen. Durch die Ultrafiltration werden die in dem Fluid enthaltenden Nährstoffe gegen einen mikrobizid-haltigen Puffer ausgetauscht, wodurch Mikroorganismen / Keimen die Wachstumsgrundlage in dem Fluid entzogen werden soll. Dadurch wird die Keimreduktion des Verfahrens zusätzlich verbessert. It is the use of a hydrophobic microfiltration membrane over vacuum for maintaining the sterility in the continuous leadership of the Invention according Process and the system according to the invention preferred, since this has proven to be particularly advantageous compared to the bubble trap. The hydrophobic microfiltration membrane used can in particular be a MicroModule from Membrana seia. In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the particle-free fluid from step a) is subjected to at least one ultrafiltration against a buffer containing microbicide. By ultrafiltration, the nutrients contained in the fluid are exchanged for a microbicide-containing buffer, which microorganisms / germs should be removed from the growth base in the fluid. This further improves the germ reduction of the process.
Das dabei verwendete Mikrobizid, oder ein oder mehrere Mikrobizide können bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Benzoesäure, Sorbinsäure, para- Hydroxybenzoesäure-Ester, Sulfite, Disulfite, Azide, Orthophenylphenol, Nisin, Natamycin, Hexamethylentetramin, Dimethyldicarbonat, Nitrite, Nitrate, Essigsäure, Ascorbinsäure, Isoascorbinsäure, L-Milchsäure, Propionsäure, Borsäure und Lysozym. The microbicide used here, or one or more microbicides may preferably be selected from the group consisting of imidazole, benzoic acid, sorbic acid, para-hydroxybenzoic acid esters, sulfites, disulfites, azides, orthophenylphenol, nisin, natamycin, hexamethylenetetramine, dimethyldicarbonate, nitrites, nitrates , Acetic acid, ascorbic acid, isoascorbic acid, L-lactic acid, propionic acid, boric acid and lysozyme.
Die in dem mikrobizid-haltigen Puffer enthalten Mikrobizide können weiterhin sein ein oder mehrere Mikrobizide aus der Gruppe bestehend aus: The microbicides contained in the microbicide-containing buffer may further be one or more microbicides selected from the group consisting of:
E210 bis E213 Benzoesäure und ihre Salze, 0,05-0,1% in Lösungsmittel in saurem Milieu, 2-3gkg in LM; E210 to E213 benzoic acid and its salts, 0.05-0.1% in solvent in acidic medium, 2-3gkg in LM;
E200 bis E203: Sorbinsäure und ihre Salze, 300-2000 mgkg;  E200 to E203: sorbic acid and its salts, 300-2000 mgkg;
E214 bis E219: PHB Ester (para-Hydroxybenzoesäure-Ester, Parabene), Butyl- und Propylparaben  E214 to E219: PHB esters (para-hydroxybenzoic acid esters, parabens), butyl and propyl paraben
E220 bis E228: Sulfite und Disulfite,  E220 to E228: sulfites and disulfites,
E231 und E232: Orthophenylphenol, 12 mg kg;  E231 and E232: orthophenylphenol, 12 mg kg;
E234: Nisin,  E234: Nisin,
E235: Natamycin,  E235: natamycin,
E239: Hexamethylentetramin, 25mg/kg; E239: hexamethylenetetramine, 25 mg / kg;
E242: Dimethyldicarbonat;  E242: dimethyl dicarbonate;
E249-E252: Nitrite und Nitrate, 300 mg/kg;  E249-E252: nitrites and nitrates, 300 mg / kg;
E260: Essigsäure, 0,5-3%; E300-E302: Ascoi insäure, 300 mg kg; E260: acetic acid, 0.5-3%; E300-E302: Ascoic acid, 300 mg kg;
E315-E316: Isoascorbinsäure, 1500 mgkg; E315-E316: isoascorbic acid, 1500 mgkg;
E261-E263: Azetat; E261-E263: acetate;
E270 L-Milchsäure; E270 L-lactic acid;
E280 bis E283: Propionsäure und ihre Salze, 1-3 g/kg; E280 to E283: propionic acid and its salts, 1-3 g / kg;
E284 und E285: Borsäure, max. 4g kg; E284 and E285: boric acid, max. 4g kg;
El 105 Lysozym; und El 105 lysozyme; and
Azide. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das biopharmazeutische, biologischen makromolekulare Produkt ein Protein oder Peptid, dass ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Impfstoffen, bevorzugt DNA- und RNA- Impfstoffen. Azides. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the biopharmaceutical, biological macromolecular product is a protein or peptide selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant proteins and vaccines, preferably DNA and RNA vaccines.
Die in Schritt c) verwendeten die Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber können jedes geeignete Bindungsprinzip aufweisen, etwa Affiniät des Produktes zu einem Liganden, ionische Wechselwirkungen, Metalchelat-Bindung, hydrophobe Interaktionen oder reine van-der-Waals-Kräfte. Beispielsweise kann der erster Chromatographieschritt der wenigstens zwei Chromatographieschritte eine Affinitätschromatographie sein (z.B. ein Ligand mit Affinität zum Produkt, wie z.B. Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und ein von Protein A, Protein G und Protein L, IgM, IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat). Danach folgt dann ein weiterer (zweiter) Chromatographieschritt, etwa eine Chromatographie über ionische Wechselwirkungen. The chromatography columns and / or membrane adsorbers used in step c) may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions or pure van der Waals forces. For example, the first chromatographic step of the at least two chromatography steps may be affinity chromatography (eg, a ligand having affinity for the product, such as protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, IgG different recombinant protein which has an affinity for the product). This is followed by another (second) chromatography step, such as chromatography on ionic interactions.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist hier flexibel und kann in Schritt c) je nach zu erzielendem Reinheitsgrad und Konzentration des Produktes jedes geeignete Chromatographieprinzip in jeder Reihenfolge umfassen.  The process according to the invention is flexible here and can comprise in step c), depending on the degree of purity and concentration of the product to be achieved, any suitable chromatography principle in any order.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die wenigstens zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber des Schrittes (c) einen Ligand, der bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und einem von Protein A, Protein G und Protein L, IgM, und IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat. In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers of step (c) comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G and protein L, IgM, and IgG different recombinant protein, which has an affinity for the product.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Verfahren der Schritte (a) bis (e) eine Laufzeit von mindestens 4 Stunden auf) bevorzugt von mindestens 8 Stunden, bevorzugt von mindestens 12 Stunden, bevorzugt von mindestens 24 Stunden, weiterhin bevorzugt von mindestens 48 Stunden, weiterhin bevorzugt von mindestens 7 Tagen, weiterhin bevorzugt von mindestens 4 Wochen, und besonders bevorzugt von mindestens 8 Wochen auf Eine derart lange Laufzeit von mehreren Wochen kontinuierlicher Fahrweise wird nur ermöglicht durch die geschlossene, modulare und vor allem keimreduzierte Fahrweise des Prozesses. In a preferred embodiment of the process according to the invention, the process of steps (a) to (e) has a duration of at least 4 hours), preferably of at least 8 hours, preferably of at least 12 hours, preferably of at least 24 hours, more preferably of at least 48 Hours, more preferably of at least 7 days, more preferably of at least 4 weeks, and particularly preferably of at least 8 weeks to such a long duration of several weeks of continuous driving is only possible by the closed, modular and above all germ-reduced driving style of the process.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen den Schritten a) bis e) und/oder danach mindestens ein Filtrationsschritt umfassend mindestens einen Filter durchgeführt. In a preferred embodiment of the method according to the invention, at least one filtration step comprising at least one filter is carried out between steps a) to e) and / or thereafter.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Filter automatisch unter keimreduzierten Bedingungen gewechselt, wobei bevorzugt der automatische Filterwechsel die folgenden Schritte umfasst: In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the filter is automatically changed under germ-reduced conditions, the automatic filter change preferably comprising the following steps:
(i) Umschalten des Flussweges auf einen neuen Filter bei Überschreiten eines Schwellenwertes am Drucksensor auf der Unfiltratseite unter Verschließen des Flussweges, wobei das Produkt im verbrauchten Filter bevorzugt durch ein Gas oder eine Flüssigkeit in die Filtratseite gedrückt wird, (i) switching the flow path to a new filter when a threshold value is exceeded at the pressure sensor on the non-filtrate side, closing the flow path, wherein the product in the spent filter is preferably forced into the filtrate side by a gas or a liquid,
oder bei Überschreiten einer maximalen Zeit des verbrauchten Filters im Flussweg, oder bei Überschreiten eines maximalen Volumens an Fittrat durch den verbrauchten Filter,  or if a maximum time of the spent filter in the flow path is exceeded, or if a maximum volume of Fittrat through the spent filter is exceeded,
(ii) Entlüften des neuen Filters über eine Luftfilter mit einer Porengröße von bevorzugt <= 0,25 μm am Entlüftungsventil des neuen Filters, bevorzugt unter Beförderung von Produkt in den neuen Filter durch eine Feedpumpe, oder in einen keimreduziert angeschlossenen, geschlossenen Bag, (iii) Detektion der Beendigung der Entlüftung des neuen Filters auf der Unfiltratseite durch den Drucksensor oder einen Füllstandssensor oder eine Waage oder einen Flüssigkeitsdetektor, (ii) venting the new filter via an air filter having a pore size of preferably <= 0.25 μm at the venting valve of the new filter, preferably with transport of product into the new filter by a feed pump, or into a germ-reduced connected closed bag, (iii) detecting the completion of the venting of the new filter on the non-filtrate side by the pressure sensor or a level sensor or a balance or a liquid detector,
(iv) Öffnen des Filtratausgangs und Verschluss des Flussweges zwischen Entlüftungsventil und Luftfilter durch ein Ventil, und  (iv) opening the filtrate outlet and closing the flow path between the venting valve and air filter through a valve, and
(v) Austausch des alten Filters gegen einen neuen Filter.  (v) Replacing the old filter with a new filter.
Die gleichzeitige oder nachgeschaltete Förderung von Produkt in den neuen Filter kann z.B. durch eine Feedpumpe erfolgen. Das bedeutet, dass in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, der Filterwechsel (Umschalten von einem verbrauchten auf ein neues Filterelement) automatisch erfolgen kann. Als problematisch erweist sich hierbei die Filterentlüftung, die aber erforderlich ist, und die bei den zur Zeit erhältlichen Filtern manuell durchgeführt weiden muss. Zunächst wird der Filter einer Keimreduktionsmethode durch ggf. ETO. Autoklavieren oder Gammabestrahlung unterworfen und dann mit dem Prozess verbunden. Danach kann der Filter auf der Unfiltratseite befüllt werden, während das Entlüftungsventil offen ist, welches nach dem erfolgreichen Entlüften geschlossen werden muss, damit die eigentliche Filtration durchgeführt werden kann. In einem Batch-Prozess ist eine stark keimreduzierte Handhabung auf der Unfiltratseite nicht erforderlich, da es in den kurzen Zeiträumen nur auf möglichst keimfreies Filtrat ankommt. In einem kontinuierlichen Prozess ist jedoch auch die möglichst keimfreie Führung der Unfiltratseite erforderlich, um eine Verkeimung des Prozesses zu verhindern. Im Stand der Technik muss das Entlüftungsventil durch eine Drehbewegung nach dem Befüllen des Filters manuell geschlossen werden, damit die eigentliche Filtration durchgeführt werden kann. Diese Drehbewegung ist nur sehr aufwendig zu automatisieren, da dabei auch noch eine axiale Verschiebung des Drehkörpers notwendig ist Durch das axiale Verschieben des Drehkörpers samt der darauf angebrachten Dichtungen wird die Grenze verschoben. In Kombination mit einer vorher durchgeführten Keimreduktion ergibt sich das Problem, dass beim Keimreduzieren mit geschlossenem Entlüftungsventil die Keimgrenze bei öffnen des Entlüftungsventils verschoben wird. Dabei wird ein keimbehafteter Bereich in den keimreduzierten Bereich eingebracht, und die Keimreduktion damit aufgehoben. Ein Keimreduzieren mit geöffnetem Filterventil ist nicht zu empfehlen, da die offene Position keine feste Position hat, und es dadurch leicht zu einer Beschädigung des Ventils kommen kann. Außerdem ist die offene Position meist wackelig, so dass es durch das normale Handling des Filters zu einer Verschiebung der Keimgrenze kommen kann. The simultaneous or downstream promotion of product in the new filter can be done for example by a feed pump. This means that in a further embodiment of the method according to the invention, the filter change (switching from a used to a new filter element) can take place automatically. The filter venting proves to be problematic here, but this is required and must be performed manually in the filters currently available. First, the filter of a germ reduction method by possibly ETO. Subjected to autoclaving or gamma irradiation and then connected to the process. Thereafter, the filter can be filled on the unfiltrate side, while the vent valve is open, which must be closed after successful venting, so that the actual filtration can be performed. In a batch process, a strong germ-reduced handling on the unfiltrate side is not required because it arrives in the short periods only germ-free as possible filtrate. In a continuous process, however, the germ-free as possible management of Unfiltratseite is required to prevent bacterial contamination of the process. In the prior art, the vent valve must be manually closed by a rotary motion after filling the filter, so that the actual filtration can be performed. This rotational movement is only very complicated to automate, since it also requires an axial displacement of the rotary body by the axial displacement of the rotary body together with the seals mounted thereon, the limit is shifted. In combination with a previously carried out germ reduction results in the problem that is displaced during germ reduction with closed vent valve, the microbial limit when opening the vent valve. In this case, a germ-afflicted area is introduced into the germ-reduced area, and the germ reduction is thereby eliminated. Germinating with the filter valve open is not recommended because the open position has no fixed position, which can easily damage the valve. In addition, the open position is usually shaky, so that the normal handling of the filter can lead to a shift in the microbial limit.
Für die automatische Filterentlüftung ist es vorteilhaft, die Drehbewegung des Entlüftungsventils während der Inbetriebnahme zu vermieden, damit die Entlüftung nur durch einfache Maßnahmen durchgeführt werden kann. Das Entlüftungsventil kann nun so modifiziert weiden, dass es auch im geschlossenen Zustand durchgängig ist, jedoch weiterhin zuverlässig zur Umwelt hin abdichtet Das Ventil befindet sich dadurch im sicheren Zustand "geschlossen", was durch einen festen Sitz charakterisiert ist. Der Zustand "offen" ist meist nicht eindeutig definiert, da der Ventilkörper in der Führung stark wackelt und ein Verschieben der Grenze ermöglicht. An der Tülle des Drehkörpers wird ein Schlauch angebracht, der in einem hydrophoben <=0,2 μm Luftfilter endet. Diese Anordnung wird nun vorzugsweise durch ETO, Gammabestrahlung, Autoklavieren, oder Ozon ((^Behandlung oder durch Wasserstoffperoxid (H2O2)-Behandlung keimreduziert. Somit ist die gesamte Unfiltratseite bis zum Luftfilter am Entlüftungsventil keimreduziert bzw. keimarm. Zwischen Entlüftungsventil und Luftfilter wird der Schlauch in ein Schlauchquetschventil eingelegt, welches den Schlauch zuverlässig zu quetschen vermag. Die Entlüftung kann so vollautomatisch und keimarmst erfolgen. Der Filter wird befüllt, bis Flüssigkeit durch das Entlüftungsventil und den Schlauch in den Luftfilter eintritt Der hydrophobe Entlüftungsfilter blockiert die Flüssigkeit. Gleichzeitig blockiert die Prozessanlage durch ein Ventil auf der Filtratseite den Produktionsstrom, so dass es zu einem Druckanstieg vor dem Filter kommt. Dieser wird über einen geeigneten Sensor detektiert. Ist ein bestimmter Schwellenwert des Drucks überschritten, wird das Quetschventil des Entlüftungsschlauches geschlossen, und das Ventil auf der Filtratseite geöffnet. In dieser Vorgehensweise kann mit einem modifizierten Entlüftungsventil der Filter automatisch ohne manuellen Eingriff modifiziert werden. For the automatic filter ventilation, it is advantageous to avoid the rotational movement of the vent valve during commissioning, so that the venting can be performed only by simple measures. The vent valve can now be modified so that it is continuous even in the closed state, but still reliable seals to the environment The valve is thus in the safe state "closed", which is characterized by a tight fit. The state "open" is usually not clearly defined, since the valve body in the guide shakes strong and allows a shift of the limit. On the spout of the rotating body, a hose is attached, which ends in a hydrophobic <= 0.2 micron air filter. This arrangement is now preferably germ-reduced by ETO, gamma irradiation, autoclaving, or ozone treatment, or by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) treatment Thus, the entire unfiltrate side to the air filter on the vent valve is germ-reduced or germ-free between the vent valve and the air filter the hose is inserted into a pinch valve, which is able to squeeze the hose reliably.The venting can thus be fully automatic and low in germination.The filter is filled until liquid enters the air filter through the vent valve and the hose The hydrophobic vent filter blocks the liquid the process plant blocks the flow of production through a valve on the filtrate side, causing the pressure in front of the filter to rise, which is detected by a suitable sensor closed and opened the valve on the filtrate side. In this procedure, the filter can be automatically modified without manual intervention with a modified vent valve.
Dieser automatische Filterwechsel ist in Figur 2 beispielhaft gezeigt, wo schematisch das Arbeitsprinzip des Filtrationsschrittes des Verfahrens und der Anlage unter Ersetzen eines verbrauchten Filters 17 durch Einschweißen eines neuen Filters 16 veranschaulicht wird. Das fertig gereinigte biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produkte aus der heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung kann am Schhiss des Verfahrens durch eine finale Filtration, bevorzugt durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2μm ein letztes Mal gefiltert werden. Die finale Filtration kann beispielsweise über gammabestrahlte Sartopore 2 apsulen (Midicap size 7, 0,05m2) in ein gammabestrahkes 5L GE ReadCircuit Bag erfolgen. Wenn der Füllstand des finalen Bags ausreichend ist, dann kann dieses Bag abgeschweißt werden und ein neues Bag an den Prozess angeschweißt werden. Die Erfindung löst diese Aufgabe weiterhin durch Bereitstellen einer modularen Anlage zur kontinuierlichen, keimreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, umfassend folgende Module: (a) mindestens ein Filtrationsmodul, This automatic filter change is shown by way of example in FIG. 2, where the working principle of the filtration step of the method and the installation is schematically illustrated by replacing a worn-out filter 17 by welding in a new filter 16. The ready-cleaned biopharmaceutical, biological macromolecular products from the heterogeneous cell culture fluid mixture can be filtered one final time at the end of the process by a final filtration, preferably through a filter with a pore size of 0.2 μm. The final filtration can be gamma-irradiated, for example Sartopore 2 apsulen (Midicap size 7, 0.05m 2 ) are made into a gammabestrahkes 5L GE ReadCircuit Bag. If the fill level of the final bag is sufficient then this bag can be welded off and a new bag welded to the process. The invention further achieves this object by providing a modular system for the continuous, germ-reduced production and / or processing of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture fluid mixture comprising the following modules: (a) at least one filtration module,
(b) mindestens ein Chromatographiemodul, umfassend mindestens jeweils zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorbern,  (b) at least one chromatography module comprising at least two chromatography columns and / or membrane adsorbers,
(c) mindestens ein Ultrafiltrationsmodul und/oder mindestens ein Diafiltrationsmodul und/oder mindestens ein Dialysemodul, und  (c) at least one ultrafiltration module and / or at least one diafiltration module and / or at least one dialysis module, and
(d) mindestens ein Modul zur kontinuierlichen Virenabreicherung,  (d) at least one module for continuous virus depletion,
dadurch gekennzeichnet, dass die modulare Anlage geschlossen und keimreduziert ist.  characterized in that the modular system is closed and germ-reduced.
Das mindestens eine Chromatographiemodul, kann aber auch mehr als zwei Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorbern umfassen, z.B. drei oder vier Chromatographiesäulen und/oder Membranadsorber. The at least one chromatography module, but may also comprise more than two chromatography columns and / or membrane adsorbers, e.g. three or four chromatography columns and / or membrane adsorbers.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen modularen Anlage sind alle in den Modulen (a) bis (d) eingesetzten und mit produktberührten Elemente durch eine Keimreduktionsmethode keimreduziert, wobei die Keimreduktionsmethode bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)-Behandlung, Ozon-Behandlung (O3), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und steam-in-place (SIP) Behandlung. Bevorzugt sind die modular Anlage selber, sowie die Elemente der Module, die mit Produktstrom in Kontakt treten, keimreduzierbar und/oder sterilisierbar, bevorzugt autoklavierbar, gamma-bestrahlbar, mit Ethylenoxid (ETO) begasbar, mit Ozon (O3) behandelbar, mit Wasserstoffperoxid (H2O2) behandelbar oder mit einer Steam-in-place (SIP)-Behandlung behandelbar, was einen keimarmen oder sogar aseptischen Betrieb der erfindungsgemäßen modularen Anlage ermöglicht. In a further embodiment of the modular system according to the invention, all of the modules (a) to (d) used and germinated with product contact elements by a germ reduction method, wherein the germ reduction method is preferably selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving , Ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment. Preferably, the modular system itself, as well as the elements of the modules that come into contact with product flow, germ-reducible and / or sterilizable, preferably autoclavable, gamma-irradiated, gassed with ethylene oxide (ETO), treatable with ozone (O3), with hydrogen peroxide ( H 2 O 2 ) treatable or with a steam-in-place (SIP) treatment treatable, which allows a germ-free or even aseptic operation of the modular system according to the invention.
In einer weiteren Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen modularen Anlage sind alle in den Modulen (a) bis (d) verwendeten produktberührten Gegenstände Einwegartikel oder werden als Einwegartikel benutzt. Dabei sind die Module bevorzugt durch Verschweißen oder durch aseptische Konnektoren miteinander verbunden. Beispielsweise sind aseptische „ReadyMate"-Konnektoren der Firma GE bevorzugt in der erfindungsgemäßen modularen Anlage verwendete aseptische Konnektoren. In a further embodiment of the modular system according to the invention, all product-contacting objects used in the modules (a) to (d) are disposable articles or are used as disposable articles. The modules are preferably connected to one another by welding or by aseptic connectors. For example, aseptic "ReadyMate" connectors from GE are preferably aseptic connectors used in the modular system according to the invention.
Bevorzugt werden fertig einsetzbare Einwegartikel („Disposables",„ready-to-use") als gammabestrahlte Elemente verwendet. Prefabricated disposable articles ("disposables", "ready-to-use") are preferably used as gamma-irradiated elements.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen modularen Anlage gehen alle Eingangsfluide durch einen Keimreduktionsfilter, wobei bevorzugt alle Ausgänge durch eine Keimbarriere geschützt sind, die ein Rückwachstum verhindern. In a preferred embodiment of the modular system according to the invention, all input fluids pass through a germ reduction filter, wherein preferably all exits are protected by a germ barrier which prevents regress growth.
Das fertig gereinigte biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produkte aus der heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung kann am Ende der modularen Anlage durch eine finale Filtration, bevorzugt durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2μm ein letztes Mal gefiltert weiden. Die finale Filtration kann beispielsweise über gammabestrahlte Sartopore 2 Kapsulen (Midicap size 7, 0,05m2) in ein gammabestrahltes 5L GE ReadCircuit Bag erfolgen. Wenn der Füllstand des finalen Bags ausreichend ist, dann kann dieses Bag abgeschweißt werden und ein neues Bag an den Prozess angeschweißt werden. The final purified biopharmaceutical biological macromolecular products from the heterogeneous cell culture fluid mixture may be filtered one final time at the end of the modular unit by a final filtration, preferably through a filter having a pore size of 0.2 μm. Final filtration can be done, for example, via gamma-irradiated Sartopore 2 capsules (Midicap size 7, 0.05m 2 ) into a gamma-irradiated 5L GE ReadCircuit Bag. If the fill level of the final bag is sufficient then this bag can be welded off and a new bag welded to the process.
Die vorliegende Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen wird in Verbindung mit den nachfolgenden Zeichnungen und dem Beispiel erläutert, ohne hierauf beschränkt zu sein. Die Ausführungsformen können beliebig miteinander kombiniert werden, sofern sich nicht eindeutig das Gegenteil aus dem Kontext ergibt. The present invention, including preferred embodiments thereof, is illustrated in conjunction with the following drawings and example, but is not limited thereto. The embodiments can be combined as desired, unless clearly the opposite results from the context.
Es zeigen: FIG. 1 zeigt schematisch ein Verfahrensschema einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Zahlen in Klammern sind Verweise auf die Massenbilanz, wie in Beispiel 1 und Tabelle 1 aufgeführt. Fig. 2 zeigt schematisch das Arbeitsprinzip des Filtrationsschrittes des Verfahrens und der Anlage unter Ersetzen eines verbrauchten Filters 17 durch Einschweißen eines neuen Filters 16. Show it: FIG. 1 shows schematically a process diagram of an embodiment of the method according to the invention. The numbers in parentheses are references to the mass balance as listed in Example 1 and Table 1. FIG. 2 schematically shows the operating principle of the filtration step of the method and the installation with replacement of a spent filter 17 by welding a new filter 16.
Fig. 3 zeigt exemplarisch die zwei Verfahrensschritte Vireninaktivierung und Neutralisierung - zwei Units die modular aufgebaut sind, wobei die pH Sonden pH0501 und pH0502 autoklaviert werden und der Rest jeweils gammabestrahh wird. Die pH Sonden pH0501 und pH0502 werden dann in ein Assembly eingeschweißt. Die Bags sind über aseptische GE ReadyMate® Konnektoren angeschlossen. Die Verbindung zu Prot-A und der Filtrationseinheit ist zunächst zugeschweißt und wird dann an die jeweiligen Einheiten angeschweißt. FIG. 3 shows, by way of example, the two method steps of virus inactivation and neutralization - two units which are of modular construction, wherein the pH probes pH0501 and pH0502 are autoclaved and the remainder are each gamma-negative. The pH probes pH0501 and pH0502 are then welded into an assembly. The bags are connected via aseptic GE ReadyMate ® connectors. The connection to Prot-A and the filtration unit is first welded shut and then welded to the respective units.
Fig. 4 zeigt exemplarisch den modularen Aufbau der Anlage, wobei alle Eingangsströme und Ausgangsströme über eine Keimbarriere 10, 13 mit der Umgebung verbunden sind. Die exemplarische modulare Anlage 1 besteht aus drei Filtrationsmodulen 2 mit jeweils zwei wechselseitig betriebenen Filtern 13, zwei Chromatographiemodule 3 mit zwei Chromatographiesäulen 4 bzw. zwei Membranadsorber 5 ein Virenabreicherungschritt z.B. Vireninaktivierung 9, einem Ultrafiltrationsmodul 6 und einem Diafiltrationsmodul 7. Die Puffer werden über einen hydrophoben Filter 15 oder Bubble-trap 14 von Gasblasen befreit. 4 shows, by way of example, the modular structure of the installation, wherein all the input flows and output flows are connected to the environment via a germ barrier 10, 13. The exemplary modular plant 1 consists of three filtration modules 2 each having two mutually operated filters 13, two chromatography modules 3 with two chromatography columns 4 and two membrane adsorbers 5 a virus removal step e.g. Virus inactivation 9, an ultrafiltration module 6 and a diafiltration module 7. The buffers are freed of gas bubbles via a hydrophobic filter 15 or bubble trap 14.
Tabelle 1 zeigt die gemitteken Flussraten und Antikörper-Konzentrationen der in Figur 1 dargestellten Positionen. Table 1 shows the mean flow rates and antibody concentrations of the positions shown in FIG.
Beispiel 1 example 1
Um ein Protein kontinuierlich und keimreduziert aus einer heterogenen Zellkultur-Fhiid- Mischung zu reinigen, wurde eine Miniplant mit folgenden Modulen und zugehörigen Verfahrensschritten aufgebaut: Wenn nicht anders vermerkt wurden im Prozess MasterFlex-Schlauchpumpen mit einem EasyLoad-II Pumpenkopf verwendet. Als Schläuche wurden Masterflex LS 16 bzw. Cflex oder Sanipure verwendet. Alle eingesetzten produktberührten Bauteile wurden mit 25kGy Gamma-bestrahlt. In Ausnahmen, wenn Gammabestrahhing materialtechnisch nicht zulässig war, wurden Komponenten bei 121°C für 20min autoklaviert. Teilassemblies mit pH-Sonden oder Virenfilter. Wenn möglich wurden fertig einsetzbare Einwegartikel („Disposables", „ready-to-use") als gammabestrahlte Module verwendet. Dies war ausnahmslos bei allen Beuteln („Bags") der Fall. Diese Bags wurden in der Regel mit ReadyMate® Konnektoren der Firma General Electric (GE) an die Module verbunden. Zwischen jedem Modul wurde eine Single-Use gammabestrahlte Bag (ReadyCircuit IL, GE) als Ausgleichsbehälter zwischen dem Ausgangsstrom des Moduls n-1 und dem Eingangsstrom des Moduls n platziert. In der Regel existierte zu dem Zeitpunkt in jedem Modul ein Eingangs- und ein Ausgangsstrom. Wo eine Entlüftung der Produktflüssigkeit vorteilhaft war, wurden die Behälter über einen hydrophoben 0,2 μm Filter von der Umgebung abgeschlossen. A. Upstream i) Perfusions Reaktor In order to purify a protein continuously and germ-reduced from a heterogeneous cell culture mixture, a miniplant was constructed with the following modules and associated process steps: Unless otherwise stated, MasterFlex peristaltic pumps with an EasyLoad-II pump head were used in the process. The hoses used were Masterflex LS 16 or Cflex or Sanipure. All product wetted components used were gamma-irradiated with 25kGy. In exceptional cases, when gamma-ray suspending was not permitted in terms of materials, components were autoclaved at 121 ° C for 20 minutes. Subassemblies with pH probes or virus filters. Wherever possible, disposable disposables ("disposables", "ready-to-use") have been used as gamma-irradiated modules. This was, without exception, in all bags ( "Bags") the case. These bags were connected to the modules usually with Ready Mate ® connectors General Electric (GE). Between each module is a single-use has been gamma irradiated Bag (Ready Circuit IL, GE) placed as a surge tank between the output current of the module n-1 and the input current of the module n In the rule, there was an input and an output current in each module at the time Where venting of the product liquid was beneficial, the containers were placed over one hydrophobic 0.2 μm filter completed from the environment A. Upstream i) Perfusion Reactor
Zur kontinuierlichen Herstellung eines monoklonalen Antikörpers IgG wurde ein 10 L Perfusionsreaktor verwendet. Die viable Zelldichte betrug im stationären Zustand 60-70 Mio Zellen / mL. Der Titer betrug ~115 mg/L . Die Produktion wurde mit zwei parallelen Perfusionsreaktoren für 28 Tage betrieben. ii) Zellrückhaltesystem System For the continuous production of a monoclonal antibody IgG, a 10 L perfusion reactor was used. The viable cell density in the stationary state was 60-70 million cells / mL. The titer was ~ 115 mg / L. The production was operated with two parallel perfusion reactors for 28 days. ii) cell retention system
Das Produkt wurde kontinuierlich über einen Schrägplattenabscheider (Settier) abgeführt, durch den ein Großteil der Zellen zurückgehalten wurde. B. Downstream DSP-1 i) Zell-Klärfütration The product was continuously removed via a slash plate separator which retained a majority of the cells. B. Downstream DSP-1 i) Cell Purification
Die Klärfiltration erfolgte über parallel betriebene Sartoguard NF 0,2μm Filter (T-style, MaxiCap, 0,65m2). Fig. 2 zeigt wie hier ein geschlossener keimarmer Prozess realisiert wurde. Sowohl die Filter wie auch das Schlauchassembly wurden gammabestrahlt. Die Eingangs- und Ausgangsleitungen wurden über aseptische Konnektoren mit gammabestrahlten Bags (GE ReadyCircuit 1 L) verbunden, die als Ausgleichsvolumina für schwankende Flussraten dienten. Zum Entlüften waren die Filter dabei an hydrophobe 0,2μm Luftfilter gekoppelt wodurch das Modul im Sinne der Erfindung geschlossen war (Fig.2). Der Luftfilter war entweder ein Emflon II der Pall Corp. oder eine Midisart2000 der Firma Sartorius Stedim. Die Entlüftungsventile waren dabei in der Art modifiziert, dass sie auch im geschlossenen Zustand durchgängig waren, dabei aber immer noch zuverlässig zur Umwelt hin abdichteten. Hierzu wurde am Sartoguard NF der innere Dichtungsring des Entlüftungsventils entfernt und das Ventil vor der Gammabestrahlung geschlossen. Dieses Ventil wurde gegen öffnen zusätzlich gesichert. Das Ventil befand sich dadurch im sicheren Zustand "geschlossen", was durch einen festen Sitz charakterisiert war. Das Entlüftungsventil war mit dem Luftfilter über einen Schlauch verbunden. Zwischen Entlüftungsventil und Luftfilter war der Schlauch in ein Schlauchquetschventil eingelegt. Der Filter wurde befällt, bis Flüssigkeit durch das Entlüftungsventil und den Schlauch in den Luftfilter eintrat. Der hydrophobe Entlüftungsfilter blockierte dann die Flüssigkeit Gleichzeitig blockierte die Prozessanlage durch ein Ventil auf der Filtratseite den Produktionsstrom, so dass es zu einem Druckanstieg vor dem Filter kam. Dieser Druckanstieg wurde über einen Pendotech- Drucksensor detektiert. War ein Schwellenwert von 0,5 bar überschritten, wurde das Quetschventil des Entlüftungsschlauches geschlossen, und das Ventil auf der Filtratseite geöffnet. Clarification was carried out using Sartoguard NF 0.2μm filters (T-style, MaxiCap, 0.65m 2 ) operated in parallel. Fig. 2 shows how a closed germ-free process was realized here. Both the filters and the hose assembly were gamma irradiated. The input and output lines were connected via aseptic connectors to gamma-irradiated bags (GE ReadyCircuit 1 L), which served as equalization volumes for fluctuating flow rates. To deaerate the filters were coupled to hydrophobic 0.2 micron air filter whereby the module was closed in the context of the invention (Figure 2). The air filter was either an Emflon II from Pall Corp. or a Midisart2000 of the company Sartorius Stedim. The vent valves were modified in such a way that they were consistent even when closed, but still reliably sealed to the environment. For this purpose, on the Sartoguard NF the inner sealing ring of the vent valve was removed and the valve was closed before the gamma irradiation. This valve was additionally secured against opening. As a result, the valve was in a safe condition "closed", which was characterized by a tight fit. The vent valve was connected to the air filter via a hose. Between the vent valve and the air filter, the hose was inserted into a pinch valve. The filter was infested until liquid entered the air filter through the vent valve and hose. The hydrophobic vent filter then blocked the liquid. At the same time, the process plant blocked the flow of production through a valve on the filtrate side, causing the pressure in front of the filter to rise. This pressure increase was detected by a Pendotech pressure sensor. If a threshold of 0.5 bar was exceeded, the breather valve pinch valve was closed and the valve on the filtrate side opened.
ii) Konzentration und Umpufferung ii) Concentration and rebuffering
Das Filtrat aus der i) Zell-Klärfiltration wurde zunächst über eine Ultrafiltrations- Hohlfaser-Membran (GE Healthcare ReadytoProcess, 0,2m2, gammabestrahlt) kontinuierlich um den Faktor 10 aufkonzentriert. Als Kreislaufpumpe diente eine disposable QuattroFlow 1200 SU Pumpe, dessen Pumpenkopf vor der Gammabestrahlung in das Schlauchassembly eingebunden wurde. Die Medienbestandteile des konzentrierten Produkts wurde dann mit einem 50mM Imidazol/NaCl Puffer über eine Gambro Revaclear300 Dialysemembran ausgetauscht. Das Modul wird vom Hersteller steril verpackt geliefert und wurde unter einer Sterilbank mit dem gammabestrahtten Schlauchassembly verbunden. Das Permeat aus der Aufkonzentrierung und der medienbehaftete Abfallstrom wurden in einen gammabes trahlten 200L Sartorius Flexboy geleitet. Das Auswechseln des Flexboys wurde durch Umschweißen mit einem Sartorius Schweißgerät durchgeführt. The filtrate from i) cell clarification filtration was first passed through an ultrafiltration hollow fiber membrane (GE Healthcare Ready to Process, 0.2m 2 , gamma irradiated). continuously concentrated by a factor of 10. The circulation pump was a disposable QuattroFlow 1200 SU pump whose pump head was integrated into the hose assembly before the gamma radiation. The media components of the concentrated product were then exchanged with a 50 mM imidazole / NaCl buffer over a Gambro Revaclear 300 dialysis membrane. The module is supplied sterile packaged by the manufacturer and connected to the gamma-braided tubing assembly under a sterile bench. The permeate from the concentration and the media-laden waste stream were passed into a gamma-irradiated 200L Sartorius Flexboy. The replacement of the Flexboys was carried out by welding with a Sartorius welding machine.
0,2μm Filtration 0.2μm filtration
Das Produkt wurde vor der Abfüllung kontinuierlich mit gammabestrahlten Sartoguard NF Filtern (MaxiCap Size 8) im Wechselbetrieb in ein 200L Flexboy filtriert. Aufbau und Betrieb war Analog zu B. Downstream DSP-1 i) Zell Klärfiltration.  The product was continuously filtered with gamma-irradiated Sartoguard NF filters (MaxiCap Size 8) in a 200L Flexboy before filling. Construction and operation was analogous to B. Downstream DSP-1 i) cell clarification filtration.
C. Downstream DSP-II C. Downstream DSP-II
0,2μm Filtration 0.2μm filtration
Nach der Lagerung wurde das Produkt aus dem DSP-I nochmals filtriert, um die nachgeschalteten Chromatographiesäulen vor Partikel zu schützen.  After storage, the product from the DSP-I was filtered again to protect the downstream chromatography columns from particles.
1. Capture Chromatography 1. Capture Chromatography
Mabselect Sure (GE) wurde als Prot-A Harz zum Isolieren des IgG benutzt. Dabei wurde der IgG bis zu Faktor 10 aufkonzentriert und der größte Teil der Kontaminanten entfernt. Eine kontinuierliche BioSMB-Anlage der Firma Tarpon Biosystems, Inc. wurde benutzt mit 12 Säulen (ID 16 mm, L 80 mm), wobei 8 Säulen in der Ladezone waren (2 Säulen in Serie und 4 parallele Serien). Der gesamte Flussweg inklusive der Säulen wurde durch Sanitisierung oder gamma-Bestrahlung keimarm gemacht. Die Beladung pro Zyklus betrug 32 Säulenvolumina pro Säule. Als Puffer wurden Acetat Puffer mit unterschiedlichen Molarität, pH und Leitfähigkeiten eingesetzt. Sämtliche Puffer wurden über einen gammabestrahhen oder autoklavierten 0,2μm Filter in ein gammabestrahltes Bag filtriert. Die Ausgangsschläuche der Pufferbags wurden an die Eingänge der BioSMB-Anlage geschweißt. Diese hatte an Ihren Eingängen jeweils eine gammabestrahlte Entgaser Membran (Liquicell Micro Module, Membrana). In gleicherweise wurde die Produktleitung über einen solchen Entgaser an den Eingang der BioSMB-Anlage angeschweißt. Über eine Vakuumpumpe mit 50mbar wurden dann alle Eingangsströme entgast. 1. Virus-Inaktivierung und Neutralisierung Mabselect Sure (GE) was used as Prot-A resin to isolate the IgG. The IgG was concentrated up to a factor of 10 and most of the contaminants were removed. A continuous BioSMB plant from Tarpon Biosystems, Inc. was used with 12 columns (ID 16 mm, L 80 mm) with 8 columns in the loading zone (2 columns in series and 4 parallel series). The entire flow path, including the columns, was rendered germ-free by sanitization or gamma irradiation. The loading per cycle was 32 column volumes per column. As buffer were acetate buffer with different Molarity, pH and conductivities used. All buffers were filtered through a gamma-beam or autoclaved 0.2μm filter into a gamma-irradiated bag. The outlet hoses of the buffer bags were welded to the inputs of the BioSMB plant. This had at each of its inputs a gamma-irradiated degassing membrane (Liquicell Micro Module, Membrana). Likewise, the product line was welded to the entrance of the BioSMB plant via such a degasser. All input streams were then degassed via a 50mbar vacuum pump. 1. Virus inactivation and neutralization
Das Virus-Inaktivierung und Neutralisierung bestand aus drei Modulen und befand sich zwischen der Capture Chromatography und einer 0,2μm Filtration: (a) eine Homogenisierungsschleife mit einer Schlauchpumpe M0502 (b) einer Verweilzeitschleife schematisch als gewickelter Schlauch dargestellt (c) einem Neutralisierungsbag in dem der pH auf 7,5 eingestellt werden konnte. Die Module wurden entsprechend der Schweißstellen in Fig.3 einzeln vorgefertigt und gammabestrahlt, wobei die Enden jeweils zugeschweißt wurden.  Virus inactivation and neutralization consisted of three modules and was between capture chromatography and a 0.2μm filtration: (a) a homogenization loop with a peristaltic loop M0502 (b) tube schematically shown as a coiled tubing (c) a neutralization bag in the the pH could be adjusted to 7.5. The modules were individually prefabricated and gamma-irradiated according to the welds in Figure 3, the ends were respectively welded shut.
Leitungsabschnitt mit pH Sonden, hier pH0501 und pH0502, wurden autoklaviert. pH Sonden Abschnitte wurden dann in Assemblies eingeschweißt. Line section with pH probes, here pH0501 and pH0502, were autoclaved. pH probe sections were then sealed in assemblies.
Bags wurden wie gezeigt über aseptische GE ReadyMate® Konnektoren angeschlossen. Die Verbindungen zur Protein A Ehiat-Leitung und Filtrationsmodul waren zunächst zugeschweißt und wurden dann an die jeweiligen Module angeschweißt. Bags were shown connected via aseptic GE Ready Mate ® connectors. The connections to the protein A Ehiat line and filtration module were initially sealed and then welded to the respective modules.
0,2μm Filtration 0.2μm filtration
Proteine konnten nach einem pH-Shift präzipitieren, wobei das präzipitierte Protein abfiltriert wurde.  Proteins were able to precipitate after a pH shift, whereby the precipitated protein was filtered off.
Chromatographie Intermediat und Polish Chromatography Intermediate and Polish
Das Produkt aus der obigen 0,2μm Filtration wurde über zwei Chromatographieschritte durch zunächst vier sequentiell (4-PCC) betriebenen 2,5ml Capto Adhere (2,5ml GE) und dann zwei wechselseitig betriebenen 20ml Anionentauscher (Pall Hypercel StarAX) aufgereinigt. Dabei wurden ProtA Leachables, DNA, HCP und Aggregate abgereinigt. Die zwei Chromatographieschritte wurden über ein gammabestrahles Bag (GE ReadyCircuit® 1 L) miteinander verbunden, in dem durch Zufuhr von Wasser die Leitfähigkeit entsprechend der Anforderung des Anionentauscher auf 7,5mS/cm eingestellt wurden. Der gesamte Flussweg inklusive der Säulen wurde sanitisiert oder gammabestrahlt. Die Beladung pro Zyklus betrug 50 Säulenvolumina pro Säule. Als Puffer wurden Acetat Puffer mit unterschiedlichen Molarität, pH und Leitfähigkeiten eingesetzt. Sämtliche Puffer wurden über einen gammabestrahhen oder autoklavierten 0,2μm Filter in ein gammabestrahltes Bag filtriert. Die Ausgangsschläuche der Pufferbags wurden an die Eingänge der BIO- geschweißt. Diese hatte an Ihren Eingängen jeweils eine gammabestrahlte Entgasungsmembran (Liquicell Micro Module, Membrana), In gleicherweise wurde die Produktleitung der obigen 0,2 μm Filtration über einen solchen Entgaser an den Eingang der BioSMB-Anlage angeschweißt. Über eine Vakuumpumpe mit 50mbar wurden dann alle Eingangsströme entgast. Der Abfallstrom wurde in einen gammabestrahhen 200L Sartorius Flexboy geleitet. Das Auswechseln des Flexboys wurde durch Umschweißen mit einem Sartorius Schweißgerät durchgeführt. The product from the above 0.2μm filtration was passed through two chromatographic steps by first using four sequentially (4-PCC) 2.5ml Capto Adhere (2.5ml GE) and then two 20ml alternating anion exchangers (Pall Hypercel StarAX). purified. ProtA leachables, DNA, HCP and aggregates were purified. The two chromatography steps were a gammabestrahles Bag (GE Circuit Ready ® 1 L) connected with each other, in which the conductivity were adjusted according to the requirement of the anion exchanger on 7,5mS / cm by adding water. The entire river route including the columns was sanitized or gamma-irradiated. The loading per cycle was 50 column volumes per column. As buffer acetate buffer with different molarity, pH and conductivities were used. All buffers were filtered through a gamma-beam or autoclaved 0.2μm filter into a gamma-irradiated bag. The outlet hoses of the buffer bags were welded to the inputs of the BIO. In each case, the product line of the above 0.2 micron filtration was welded via such a degasifier to the entrance of the BioSMB plant at their entrances each a gamma irradiated degassing membrane (Liquicell Micro Module, Membrana). All input streams were then degassed via a 50mbar vacuum pump. The waste stream was directed into a Gartabestrahhen 200L Sartorius Flexboy. The replacement of the Flexboys was carried out by welding with a Sartorius welding machine.
Der Produkt ström wurde wiederum in einem gammabestrahhen Produktbag (GE ReadyCircuit 1 L) aufgefangen. The product Ström was collected again in a gamma-ray product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
Vorfiltration Pre-filtration
Aus dem Produktbag der Polish Chromatographie wurde die Produktlösung zunächst über eine 0,1 μm Kapsule (Sartopore2, MidiCap size 9, 0,2m2) vorfiltriert. Durchführung und Aufbau waren analog zu der B. Downstream DSP-1 i) Zell Klärfiltration. The product solution was first prefiltered from the product bag of the Polish Chromatography via a 0.1 μm capsule (Sartopore2, MidiCap size 9, 0.2 m 2 ). Implementation and setup were analogous to the B. Downstream DSP-1 i) cell clarification filtration.
Virus Filtration Virus filtration
Die Ausgangsleitung aus der Vorfiltration wurde direkt über eine Schlauchpumpe mit dem Eingang der Virusfiltration aus C. Downstream DSP-II über Verschweißen verbunden. Ansonsten war der Aufbau und Betrieb der Virusfiltration aus C. Downstream DSP-II analog zu C. Downstream DSP-II 0,2μm Filtration. Jedoch wurde als Virusfilter ein Virosart CPV Filter (MidiCap size 9, 0,2m2) verwendet, der gemäß der Herstellervorschrift eingespült und autoklaviert wurde. Wiederum wurden die Filter in das Assembly eingeschweißt. Der Produktstrom wurde wiederum in ein gammabestrahles Produktbag (GE ReadyCircuit 1 L) gepumpt. The output line from the prefiltration was connected directly via a peristaltic pump to the input of virus filtration from C. Downstream DSP-II via welding. Otherwise, the setup and operation of virus filtration from C. Downstream DSP-II was analogous to C. Downstream DSP-II 0.2μm filtration. However, the virus filter used was a Virosart CPV filter (MidiCap size 9, 0.2 m 2 ), which was rinsed and autoclaved according to the manufacturer's instructions. Again, the filters were in the assembly shrink wrapped. The product stream was pumped again into a gamma-irradiated product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
Finale Konzentrierung und Umpufferung Final concentration and rebuffering
Die finale Konzentration und Umpufferung war analog zu der obigen B. DSP-I ii) Konzentration und Umpufferung aufgebaut und unterschied sich nur dadurch, dass eine autoklavierte UV-Zelle zur Überwachung der Produktkonzentration in die Konzentrationsschleife eingebunden war. Die Umpufferung erfolgte ebenfalls analog zu der obigen B. DSP-I ii) Konzentration und Umpufferung, wobei hier ein 50mM Phosphatpuffer pH 7,5 eingesetzt wurden. Der Produktstrom wurde wiederum in ein gammabestrahles Produktbag (GE ReadyCircuit 1 L) gepumpt. The final concentration and rebuffering was analogous to the above B. DSP-I ii) concentration and rebuffering and differed only in that an autoclaved UV cell was involved in monitoring the product concentration in the concentration loop. The rebuffering was also carried out analogously to the above B. DSP-I ii) concentration and rebuffering, here a 50mM phosphate buffer pH 7.5 were used. The product stream was pumped again into a gamma-irradiated product bag (GE ReadyCircuit 1 L).
0,2μm Filtration 0.2μm filtration
Die finale Filtration erfolgte wie oben in B. DSP-1 i) über gammabestrahlte Sartopore 2 Kapsulen (Midicap size 7, 0,05m2) in ein gammabestrahltes 5L GE ReadCircuit Bag. Wenn der Füllstand des finalen Bags ausreichend war, wurde dieses Bag abgeschweißt und ein neues Bag an den Prozess angeschweißt. Final filtration was as above in B. DSP-1 i) via gamma-irradiated Sartopore 2 capsules (Midicap size 7, 0.05m 2 ) into a gamma-irradiated 5L GE ReadCircuit Bag. When the fill level of the final bag was sufficient, this bag was welded off and a new bag was welded to the process.
Eine regelmäßig gefahrene Laufzeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie in Beispiel 1 beispielhaft beschrieben, war 3 Tage ohne Keimwachstum, wobei die Chromatographiesäulen durch eine 40 % Isopropanol + 0.5 M NaOH sanitisiert wurden. Bei Laufzeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens von über 3 Tage wurden die Chromatographiesäulen gamma -bestrahlt. Die gemittehen Flussraten und Antikörperkonzentrationen der in Figur 1 dargestellten Positionen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. A regularly run time of the method according to the invention, as described by way of example in Example 1, was 3 days without germ growth, wherein the chromatography columns were sanitized by a 40% isopropanol + 0.5 M NaOH. At run times of the inventive method of more than 3 days, the chromatography columns were gamma-irradiated. The average flow rates and antibody concentrations of the positions shown in FIG. 1 are summarized in Table 1.
Die Arbeiten, die zu dieser Anmeldung geführt haben, wurden gemäß der Finanzhilfevereinbarung „Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich" im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) gefördert The work leading to this notification has been funded under the grant agreement "Bio.NRW: MoBiDiK - Modular Bioproduction - Disposable and Continuous" under the European Regional Development Fund (ERDF)

Claims

Patentansprflche Patentansprflche
1. Verfahren zur kontinuierlichen, keimreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, umfassend die Schritte: A process for the continuous, germ-reduced production and / or processing of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture fluid mixture, comprising the steps:
(a) Bereitstellen eines partikel-freien Fluids aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid- Mischung, welche das Produkt enthält, in Form eines Produktstroms, (a) providing a particle-free fluid from a heterogeneous cell culture fluid mixture containing the product in the form of a product stream,
(b) mindestens eine Filtration, wobei ein Filtrat erhalten wird,  (b) at least one filtration, whereby a filtrate is obtained,
(c) wenigstens zwei Chromatographieschritte zur Reinigung des Produktes,  (c) at least two chromatographic steps to purify the product,
(d) mindestens eine Virenabreicherung, (d) at least one virus depletion,
(e) mindestens eine Ultrafiltration und/oder mindestens eine Diafihration des Produktstroms (26) der Schritte (b), (c), und/oder (d), dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Chromatographieschritte aus (c) eine Reinigung über wenigstens jeweils zwei Chromatographiesäulen (4) und/oder Membranadsorber (5) umfasst und,  (e) at least one ultrafiltration and / or at least one diafiltration of the product stream (26) of steps (b), (c), and / or (d), characterized in that the at least two chromatographic steps of (c) comprise a purification over at least in each case comprises two chromatography columns (4) and / or membrane adsorbers (5) and
dass das Verfahren geschlossen und modular durchgeführt wird. that the process is closed and modular.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den wenigstens zwei Chromatographieschritten in (c) und/oder nach der Vireninaktivierung in Schritt (d) ein oder mehrere weitere Schritte zur Einstellung des pH-Wertes und/oder der Leitfähigkeit und/oder Filtrations- und/oder Konzentrationsschritte und/oder ein Pufferaustausch erfolgen. 2. The method according to claim 1, characterized in that between the at least two chromatographic steps in (c) and / or after the virus inactivation in step (d) one or more further steps for adjusting the pH and / or conductivity and / or Filtration and / or concentration steps and / or a buffer exchange take place.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass alle in den Schritten (a) bis (e) eingesetzten, produkt-berührten Elemente durch eine geeignete Keimreduktionsmethode keimreduziert sind, wobei die Keimreduktionsmethode bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)-Behandlung, Ozon-Behandlung (O3), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und Steam-in-place (SIP) Behandlung. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that all in the steps (a) to (e) used, product-contacted elements are germ-reduced by a suitable germ reduction method, wherein the germ reduction method is preferably selected from the group consisting of gamma Irradiation, beta-irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass alle ab Schritt (b) verwendeten produktberührten Elemente Einwegartikel sind oder als Einwegartikel benutzt werden. 4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that all the product-contacting elements used from step (b) are disposable articles or used as disposable articles.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass alle Eingangsfluide durch einen Keimreduktionsfilter (10) filtriert werden und, dass bevorzugt alle Ausgänge durch eine Keimbarriere (11) geschützt sind, die ein Rückwachstum verhindern. 5. The method of claim 1 to 4, characterized in that all input fluids through a germ reduction filter (10) are filtered and that preferably all the outputs are protected by a germ barrier (11), which prevent re-growth.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die modularen Verfahrensschritte in Modulen durchgeführt werden, wobei die Module miteinander verbunden sind, wobei die Module bevorzugt durch Verschweißen oder durch aseptische Konnektoren (12) miteinander verbunden sind. 6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the modular method steps are performed in modules, wherein the modules are interconnected, wherein the modules are preferably connected to each other by welding or by aseptic connectors (12).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in den Schritten (a) bis (e) alle verwendeten Flüssigkeiten, Gase und Feststoffe keimreduziert sind, wobei die Keimreduktion bevorzugt durch eine Filtration durch einen Filter (13) mit einer Porengröße von bevorzugt < 0,45 μm erfolgt, und, dass bevorzugt während des Verfahrens keine Inprocess-Sterilisierung durchgeführt wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that in steps (a) to (e), all liquids, gases and solids used are germ-reduced, wherein the germ reduction preferably by a filtration through a filter (13) with a Pore size of preferably <0.45 microns, and that preferably during the process no in-process sterilization is performed.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (c) ein Entgasen aller Fluide durchgeführt wird, welche auf die wenigstens zwei Chromatographiesäulen (4) kommen, wobei dass Entgasen vorzugsweise durch mindestens eine Bubble-Trap (14) und/oder durch mindestens eine hydrophobe Mikrofiltrationsmembran (15) über Vakuum und/oder durch Behandeln mit Ultraschall und/oder durch Durchperlen mit Helium erfolgt. 8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that prior to step (c), a degassing of all fluids is performed, which come to the at least two chromatography columns (4), wherein that degassing preferably by at least one bubble trap (14) and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane (15) via vacuum and / or by treatment with ultrasound and / or by bubbling with helium.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das partikel-freie Fluid aus Schritt a) mindestens einer Ultrafiltration gegen einen mikrobizid-haltigen Puffer unterzogen wird, wobei das Mikrobizid bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Benzoesäure, Sorbinsäure, para-Hydroxybenzoesäure-Ester, Sulfite, Disulfite, Azide, Orthophenylphenol, Nisin, Natamycin, Hexamethylentetramin, Dimethyldicarbonat, Nitrite, Nitrate, Essigsäure, Ascorbinsäure, Isoascorbinsäure, L- Milchsäure, Propionsäure, Borsäure und Lysozym. 9. The method of claim 1 to 8, characterized in that the particle-free fluid from step a) is subjected to at least one ultrafiltration against a microbicide-containing buffer, wherein the microbicide is preferably selected from the group consisting of imidazole, benzoic acid, sorbic acid , para-hydroxybenzoic acid esters, sulfites, disulfites, azides, orthophenylphenol, nisin, natamycin, hexamethylenetetramine, dimethyldicarbonate, nitrites, nitrates, acetic acid, ascorbic acid, isoascorbic acid, L-lactic acid, propionic acid, boric acid and lysozyme.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das biopharmazeutische, biologische makromolekulare Produkt ein Protein, Peptid ist oder eine DNA oder RNA umfasst, wobei das Protein oder Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Protein-Impfstoffen, und wobei die DNA oder RNA Teil eines DNA- und/oder RNA-Impfstoffes ist. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the biopharmaceutical, biological macromolecular product is a protein, peptide or comprises a DNA or RNA, wherein the protein or peptide is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies , recombinant proteins and protein vaccines, and wherein the DNA or RNA is part of a DNA and / or RNA vaccine.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Chromatographiesäulen (4) und/oder Membranadsorber (5) des Schrittes11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the at least two chromatography columns (4) and / or membrane adsorber (5) of the step
(c) Produkt nach dem Affinitätsprinzip, über ionische Wechselwirkungen, über Metalchelat-Bindung, über hydrophobe Interaktionen oder über van-der-Waals-Kräfie binden, wobei die wenigstens zwei Chromatographiesäulen (4) und/oder Membranadsorber (5) bei Bindung nach dem Affinitätsprinzip einen Ligand umfassen, der bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und einem von Protein A, Protein G, Protein L, IgM und IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat. (c) binding the product according to the affinity principle, via ionic interactions, via metal chelate binding, via hydrophobic interactions or via van der Waals Kräfie, wherein the at least two chromatography columns (4) and / or membrane adsorber (5) when bound to the Affinity principle comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and a protein A, protein G, protein L, IgM and IgG different recombinant protein, which has an affinity for the Product has.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren der Schritte (a) bis (e) eine Laufzeit von mindestens 4 Stunden, bevorzugt von mindestens 8 Stunden, bevorzugt von mindestens 12 Stunden, bevorzugt von mindestens 24 Stunden, weiterhin bevorzugt von mindestens 48 Stunden, weiterhin bevorzugt von mindestens 7 Tagen, weiterhin bevorzugt von mindestens 4 Wochen, und besonders bevorzugt von mindestens 8 Wochen aufweist. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the method of steps (a) to (e) a running time of at least 4 hours, preferably of at least 8 hours, preferably of at least 12 hours, preferably of at least 24 hours , furthermore preferably of at least 48 hours, more preferably of at least 7 days, further preferably of at least 4 weeks, and particularly preferably of at least 8 weeks.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten a) bis e) und/oder danach mindestens ein Filtrationsschritt umfassend mindestens einen Filter (13) durchgeführt wird. 13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that between the steps a) to e) and / or thereafter at least one filtration step comprising at least one filter (13) is performed.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter (13) automatisch unter keimreduzierten Bedingungen gewechselt wird, wobei bevorzugt der automatische Filterwechsel die folgenden Schritte umfasst: Umschaken des Flussweges auf einen neuen Filter (16) bei Überschreiten eines Schwellenwertes an einem Drucksensor (18) auf der Unfiltratseite unter Verschließen des Flussweges, wobei das Produkt im verbrauchten Filter (17) bevorzugt durch ein Gas oder eine Flüssigkeit in die Fihratseite gedrückt wird, oder bei Überschreiten einer maximalen Zeit des verbrauchten Filters (17) im Flussweg, oder bei Überschreiten eines maximalen Volumens an Fihrat durch den verbrauchten Filter (17), 14. The method according to claim 13, characterized in that the filter (13) is automatically changed under germ-reduced conditions, wherein preferably the automatic filter change comprises the following steps: Shifting the flow path to a new filter (16) when a threshold value is exceeded at a pressure sensor (18) on the non-filtrate side, closing the flow path, wherein the product in the spent filter (17) is pressed into the filtrate side preferably by a gas or a liquid, or if a maximum time of the spent filter (17) in the flow path is exceeded, or if a maximum volume of Fihrat is exceeded by the spent filter (17),
Entlüften des neuen Filters (16) über einen Luftfilter (19) mit einer Porengröße von bevorzugt <= 0,25 μm am Entlüftungsventil (20) des neuen Filters (16), bevorzugt unter Beförderung von Produkt in den neuen Filter (16) durch eine Feedpumpe (21), oder in einen keimreduziert angeschlossenen, geschlossenen Bag (29),  Venting the new filter (16) via an air filter (19) with a pore size of preferably <= 0.25 microns at the vent valve (20) of the new filter (16), preferably with transport of product into the new filter (16) by a Feed pump (21), or in a germ-reduced connected, closed bag (29),
Detektion der Beendigung der Entlüftung des neuen Filters (16) auf der Unfiltratseite durch den Drucksensor (18) oder einen Füllstandssensor (22) oder eine Waage (23) oder einen Flüssigkeitsdetektor (28),  Detection of the completion of the venting of the new filter (16) on the non-filtrate side by the pressure sensor (18) or a filling level sensor (22) or a balance (23) or a liquid detector (28),
öffnen des Filtratausgangs und Verschluss des Flussweges zwischen Entlüftungsventil (20) und Luftfilter (19) durch ein Ventil (24), und Austausch des verbrauchten Filters (17) gegen einen neuen Filter (16).  opening the filtrate outlet and closing the flow path between vent valve (20) and air filter (19) through a valve (24), and replacing the spent filter (17) with a new filter (16).
15. Modulare Anlage (1) zur kontinuierlichen, keimreduzierten Produktion und/oder Aufbereitung eines biopharmazeutischen, biologischen makromolekularen Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fhiid-Mischung, umfassend folgende Module: 15. Modular plant (1) for the continuous, germ-reduced production and / or processing of a biopharmaceutical, biological macromolecular product from a heterogeneous cell culture-Fhiid mixture comprising the following modules:
(a) mindestens ein Filtrationsmodul (2), (a) at least one filtration module (2),
(b) mindestens ein Chromatographiemodul (3), umfassend mindestens jeweils zwei Chromatographiesäulen (4) und/oder Membranadsorber (5), (b) at least one chromatography module (3) comprising at least two chromatography columns (4) and / or membrane adsorbers (5),
(c) mindestens ein Ultrafiltrationsmodul (6) und/oder mindestens ein Diafiltrationsmodul (7) und/oder mindestens ein Dialysemodul (8), und  (c) at least one ultrafiltration module (6) and / or at least one diafiltration module (7) and / or at least one dialysis module (8), and
(d) mindestens ein Modul zur kontinuierlichen Virenabreicherung (9), dadurch gekennzeichnet, dass die modulare Anlage (1) geschlossen und keimreduziert ist. (D) at least one module for continuous virus depletion (9), characterized in that the modular system (1) is closed and germ-reduced.
16. Modulare Anlage (1) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass alle in den Modulen (a) bis (d) eingesetzten und mit produktberührten Elemente durch eine Keimreduktionsmethode keimreduziert sind, wobei die Keimreduktionsmethode bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)-Behandlung, Ozon-Behandlung (O3), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und steam-in-place (SIP) Behandlung. 16. Modular plant (1) according to claim 15, characterized in that all in the modules (a) to (d) used and germinated with product contact elements by a germ reduction method, wherein the germ reduction method is preferably selected from the group consisting of gamma Irradiation, beta-irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (O3), hydrogen peroxide treatment (H 2 O 2 ) and steam-in-place (SIP) treatment.
17. Modulare Anlage nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass alle in den Modulen (a) bis (d) verwendeten produktberührten Elemente Einwegartikel sind oder als Einwegartikel benutzt werden und, dass die Module bevorzugt durch Verschweißen oder durch aseptische Konnektoren miteinander verbunden sind. 17. Modular system according to claim 15 or 16, characterized in that all the product-contacting elements used in the modules (a) to (d) are disposable articles or used as disposable articles and that the modules are preferably interconnected by welding or by aseptic connectors ,
18. Modulare Anlage nach Anspruch 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass alle Eingangsfluide durch einen Keimreduktionsfilter (10) gehen und, dass bevorzugt alle Ausgänge durch eine Keimbarriere (11) geschützt sind, die ein Rückwachstum von Mikroorganismen verhindern. 18. Modular system according to claim 15 to 17, characterized in that all input fluids pass through a germ reduction filter (10) and that preferably all exits are protected by a germ barrier (11), which prevent re-growth of microorganisms.
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