DD297663A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOLOGICAL MATERIALS IN CELL CULTURES AND DEVICES - Google Patents
PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOLOGICAL MATERIALS IN CELL CULTURES AND DEVICES Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Materialien in Zellkulturen in einer kontinuierlichen Fermentationsweise und einer Vorrichtung zur Durchfuehrung dieses Verfahrens. Das Verfahren erlaubt es, eine kontinuierliche Fermentation auch dann durchzufuehren, wenn der herzustellende Wirkstoff erst nach einer geeigneten Induktion der Zellkultur freigesetzt wird, und auch wenn dies zu einer Zerstoerung der induzierten Zellen fuehrt. Unter Induktion wird verstanden die Behandlung mit einem chemischen Agenz oder mit physikalischen Einfluszgroeszen oder die Infizierung der Zellen z. B. mit einem Virus, oder Kombinationen davon.The invention relates to a method for the production of biological materials in cell cultures in a continuous fermentation manner and a device for carrying out this method. The process makes it possible to carry out a continuous fermentation even if the active substance to be produced is released only after a suitable induction of the cell culture, and even if this leads to a destruction of the induced cells. By induction is meant the treatment with a chemical agent or with physical Einfluszgroeszen or infection of the cells z. With a virus, or combinations thereof.
Description
Bisher konnten biologische Materialien, wie Wirkstoff, Protein, Enzyme etc., die durch Induktion von Kulturen herzustellen sind, nur mit absatzweisen Produktionsverfahren hergestellt werden. Dies bedeutet, daß die Zellen in einem Kulturgefäß wie z. B. einem Fermenter angezogen werden und nach Erreichen eines bestimmten Zustandes die Induktion gesetzt wird. Nach einer vom Wirkstoff abhängigen Zeitspanne - in der Regel einige Tage- kann die Ernte erfolgen. Danach ist der Fermenter abzubrechen, zu reinigen und neu vorzubereiten für die nächste Fermentation. Bevor die nächste Induktion stattfinden kann, muß in einer Wachstumsphase erst wieder die Zellmasse aufgebaut werden. Der Nachteil dieses Verfahrens ist eine geringe Raum-Zeit-Ausbeute bedingt dadurch, daß der gesamte Zyklus Fermentervorbereitung, Wachstumsphase, Wirkphase der Induktion und Fermenterreinigung für jede einzelne Ernte erforderlich ist und daß nur geringe Zellkonzentrationen erreicht werden. Hinzu kommt, daß für große Produktmengen großvolumige Fermenter einzusetzen sind, so daß eine Kontamination den Verlust von großen Mengen an Nährlösung bewirkt.So far, biological materials such as drug, protein, enzymes, etc., which are to be produced by induction of cultures, could be produced only by batch production methods. This means that the cells in a culture vessel such as. B. are attracted to a fermenter and after reaching a certain state, the induction is set. After a period of time dependent on the active substance - usually a few days - the harvest can take place. Thereafter, the fermenter is to be stopped, cleaned and re-prepared for the next fermentation. Before the next induction can take place, the cell mass has to be rebuilt in a growth phase. The disadvantage of this method is a low space-time yield due to the fact that the entire cycle fermenter preparation, growth phase, active phase of induction and fermenter purification for each crop is required and that only low cell concentrations are achieved. In addition, large-volume fermenters are to be used for large quantities of product, so that contamination causes the loss of large amounts of nutrient solution.
Diese Nachteile bestehen nicht bei einem kontinuierlichen Produktionsverfahren. Nach der einmaligen Fermentervorbereitung und Wachstumsphase kann der Fermentationsprozeß langfristig ohne Unterbrechung laufen und es wird eine wesentlich höhere Zellkonzentration erreicht. Dadurch steigt die Raum-Zeit-Ausbeute was die Reduktion der Volumen der Fermentergefäße erlaubt. Entsprechend sinken die Materialverluste im Falle einer Kontamination. Solche Verfahren wurden bisher erfolgreich eingesetzt für die Herstellung von Wirkstoffen aus Zellkulturen, wobei die Zellen den Wirkstoff oder Vorstufen davon synthetisieren und in die Nährlösung abgeben, ohne daß eine Induktion erforderlich ist. Beispiele sind Zellkulturen von Bowes Melanoma Zellen (Produkt: Tissue Plasminogen Activator), Hybridoma Zellen (Produkt: Monoclonale Antikörper) oder Zellen mit neukombinierter Nukleinsäure (Produkt: z. B. Faktor VIII). Ein weiterer Vorteil der kontinuierlichen Kultur ist die bessere Qualität des Produktes, da sich hier im Gegensatz zur absatzweisen Produktion konstante Kulturbedingungen einstellen lassen z. B. bezüglich Zelldichte, Konzentration der Nährstoffe und Konzentration von Abbauprodukten und unerwünschten Beiprodukten wie Proteasen. Wegen de: geringeren Verweilzeit des Produktes in der Nährlösung ist zudem auch der Abbau des Produktes durch z. B. Proteasen oder anderen chemischen Wechselwirkungen in der Nährlösung reduziert. Mit dem Verfahren der Erfindung wird eine kontinuierliche Produktion nun auch bei Produktionsverfahren möglich, die eine Induktion der Kultur erfordernThese disadvantages do not exist in a continuous production process. After the one-time fermenter preparation and growth phase, the fermentation process can run for a long time without interruption and a significantly higher cell concentration is achieved. This increases the space-time yield which allows the reduction of the volume of the fermenter vessels. Accordingly, the material losses decrease in the event of contamination. Such methods have hitherto been used successfully for the production of active substances from cell cultures, wherein the cells synthesize the active ingredient or precursors thereof and deliver them into the nutrient solution without the need for induction. Examples are cell cultures of Bowes melanoma cells (product: tissue plasminogen activator), hybridoma cells (product: monoclonal antibodies) or cells with recombined nucleic acid (product: eg factor VIII). Another advantage of the continuous culture is the better quality of the product, since in contrast to the batch production constant culture conditions can be set z. As regards cell density, concentration of nutrients and concentration of degradation products and unwanted by-products such as proteases. Because de: lower residence time of the product in the nutrient solution also the degradation of the product by z. As proteases or other chemical interactions in the nutrient solution. With the method of the invention, continuous production is now also possible in production processes which require induction of the culture
Unterschiedliche Arten der Induktion lassen sich mit der Erfindung realisieren: Different types of induction can be realized with the invention:
1. Induktion durch Infektion mit einem anderen Organismus1. Induction by infection with another organism
Beispiel für einen anderen Organismus sind Viren. Zur Herstellung von Virus und viralem Antigen wird die Induktion der Kultur durchgeführt durch Infektion mit dem Virus. Statt eines natürlichen Virus kann auch ein Virus verwendet werden, der mit Hilfe von gentechnischen Methoden so verändert wurde, daß die infizierten Zellen ein rekombinantes Protein exprimieren. Von besonderem Interesse sind hier Kulturen von Insektenzellen und ein Virusexpressionssystem wie z.B. das Baculovirus-Expressionssystem. Diese Expressionssysteme zeichnen sich dadurch aus, daß die Viren nicht infektiös sind für Menschen und somit eine große Sicherheit bei der Anwendung von in diesen Systemen exprimierten rekombinanten Proteinen am Menschen besteht. Außerdem ist gezeigt worden, daß mit diesen Systemen hohe Produktkonzentrationen in der Nährlösung erreicht werden können, wassich sowohl auf dieökonomie wie auch-wegen der einfacheren Reinigung bei höheren Konzentrationenauf die Produktqualität positiv auswirkt. Bisher sind jedoch nur absatzweise Produktionsverfahren eingesetzt worden, die die oben beschriebenen Nachteile haben.Example of another organism are viruses. For the production of virus and viral antigen, the induction of the culture is carried out by infection with the virus. Instead of a natural virus, it is also possible to use a virus which has been modified with the aid of genetic engineering methods in such a way that the infected cells express a recombinant protein. Of particular interest here are cultures of insect cells and a virus expression system such as e.g. the baculovirus expression system. These expression systems are characterized by the fact that the viruses are not infectious for humans and thus there is great certainty in the application of human recombinant proteins expressed in these systems. In addition, it has been shown that with these systems high product concentrations in the nutrient solution can be achieved, which has a positive effect on product quality both for economy and ease of purification at higher concentrations. So far, however, only batch production methods have been used which have the disadvantages described above.
2. Induktion durch vorübergehende oder permanente Veränderung der chemischen Bedingungen2. Induction by temporary or permanent change in chemical conditions
Hier wird die Induktion erzielt, indem das chemische Milieu, in dem sich die Zeilen befinden, geändert wird. In der Regel wird diese Veränderung durch Zugabe von Substanzen erreicht. Beispiel für einen solchen Prozeß ist die Produktion von Lymphokinen wie IL-2 mit tierischen Zellkulturen. Hier wird die Induktion erreicht, indem Phorbolester der Nährlösung zugegeben wird. Eine vorübergehende Änderung läßt sich erzielen, wenn die Milieuänderung rückgängig gemacht werden kann, z. B. in dem die zugegebenen Substanzen durch Fällung oder Inaktivierung oder Abzug z. B. über Membransysteme entfernt werden.Here induction is achieved by changing the chemical environment in which the lines are located. As a rule, this change is achieved by adding substances. An example of such a process is the production of lymphokines such as IL-2 with animal cell cultures. Here induction is achieved by adding phorbol ester to the nutrient solution. A temporary change can be achieved if the change in the environment can be reversed, eg. B. in which the added substances by precipitation or inactivation or deduction z. B. be removed via membrane systems.
3. Induktion durch vorübergehende oder permanente Veränderung der physikalischen Bedingungen3. Induction by temporary or permanent change in physical conditions
Verändert werden können die physikochemischen Bedingungen der Nährlösung wie z. B. pH, pOj, Redoxpotential, Viskosität als auch physikalische Bedingungen wie Temperatur, Einwirkung von Licht und anderer Strahlung, Einwirkung von elektrischen Strömen und Magnetfedern, und anderes mehr. Als Beispiel sei die Herstellung von Heat-Shock-Proteinen genannt, wofür die Zellen vorübergehend einer höheren Temperatur ausgesetzt werden.Can be changed, the physicochemical conditions of the nutrient solution such. PH, pOj, redox potential, viscosity as well as physical conditions such as temperature, exposure to light and other radiation, exposure to electric currents and magnetic springs, and others. An example is the production of heat-shock proteins, for which the cells are temporarily exposed to a higher temperature.
Beschreibung des VerfahrensDescription of the procedure
Die Aufgabe der Erfindung, eine kontinuierliche Kultur in Prozessen, die eine Induktion erfordern, zu ermöglichen, wurde wie folgt gelöst:The object of the invention to enable a continuous culture in processes requiring induction was solved as follows:
A) Wenn die Induktion dauerhaft bestehen darf oder muß:A) If the induction may or must persist permanently:
In einem Bioreaktor A werden Zellen in Suspension in einem Nährmedium kultiviert. Nach Erreichen einer bestimmten Zelldichte in Bioreaktor A wird begonnen, die Suspension in einen zweiten Bioreaktor B kontinuierlich überzuleiten und gleichzeitig frisches Nährmedium in den Bioreaktor A so einzuleiten, daß dessen Füllvolumen im zeitlichen Mittel konstant bleibt. Die Zelldichte und Wachsturnsrate der Zellen im Bioreaktor A kann eingestellt werden durch den Volumenstrom, mit dem Suspension von Bioreaktor A nach Bioreaktor B überführt wird. Die Zellen werdon in dem Bioreaktor B ina jziert. Zur Optimierung der Wachstums- und Produktbildungsbedingungen kann ein Erhaltungsmedium zusätzlich in den Bioreaktor B kontinuierlich zugegeben werden. Der Inhalt des Bioreaktors B, der aus der verbrauchten Nährlösung, den restlichen Zellen, den Zellfragmenten, dem Induktor und weiteren Stoffen besteht, wird kontinuierlich geerntet. Die mittlere Verweilzeit in dem Bioreaktor B muß im Hinblick auf optimale Produktqualität und Produktausbeute experimentell bestimmt werden. Für Induktoren, die zu einer Lyse der Zellen führen, mag dies z. B. der Zustand sein, bei dem 80% der Zellen lysiert sind. Die Verweilzeit kann durch Wahl des Volumens des Bioreaktors B eingestellt werden.In a bioreactor A cells are cultured in suspension in a nutrient medium. After reaching a certain cell density in bioreactor A, the suspension is transferred continuously into a second bioreactor B and at the same time fresh nutrient medium is introduced into the bioreactor A in such a way that its filling volume remains constant over the time average. The cell density and growth rate of the cells in bioreactor A can be adjusted by the volume flow with which suspension is transferred from bioreactor A to bioreactor B. The cells are incubated in the bioreactor B. In order to optimize the growth and product formation conditions, a maintenance medium can additionally be added continuously to the bioreactor B. The contents of the bioreactor B, which consists of the spent nutrient solution, the remaining cells, the cell fragments, the inducer and other substances, are harvested continuously. The mean residence time in bioreactor B must be determined experimentally for optimum product quality and product yield. For inductors that lead to a lysis of the cells, this may, for. B. be the state in which 80% of the cells are lysed. The residence time can be adjusted by selecting the volume of the bioreactor B.
B) Wenn die Induktion nur vorübergehend sein soll:B) If the induction is only temporary:
Die Induktion sollte dann nicht im Bioreaktor B stattfinden, sondern in der Transferleitung, die von Bioreaktor A nach Bioreaktor B führt, vorgenommen werden und bei Eintritt der Zellen in den Bioreaktor B abgeschlossen sein. Die Dauer der vorübergehenden Induktion kann gesteuert werden durch die Verweilzeit in der Transferleitung, die durch geeignete Versuche ermittelt werden kann und die durch Länge und Form der Leitung sowie durch den Volumenstrom eingestellt werden kann. Ansonsten entspricht das Verfahren dem wie für eine dauerhafte Induktion beschriebenen.The induction should then not take place in the bioreactor B, but be carried out in the transfer line, which leads from bioreactor A to bioreactor B, and be completed when the cells enter the bioreactor B. The duration of the temporary induction can be controlled by the residence time in the transfer line, which can be determined by suitable experiments and which can be adjusted by the length and shape of the line and by the volume flow. Otherwise, the process is as described for permanent induction.
Die Aufreinigung der aus dem Bioreaktor B kontinuierlich entnommenen Ernten erfolgt entweder kontinuierlich oder- nach Sammlung in einem Sammelgefäß - absatzweise. Es werden bekannte Trennverfahren eingesetzt, wie Trennung über Membranen verschiedener Porengröße, Zentrifugen, Säulentrennverfahren u.a. Die Reinigungsprozedur hängt ab von den eingesetzten Zellkulturen und Nährlösungen, den Induktionen, dem Produkt und den Anforderungen an die Reinheit des Produktes. Die Reinigungsprozedur ist unter Umständen für jedes Produkt neu zu bestimmen.The purification of the harvests continuously removed from the bioreactor B takes place either continuously or, after collection in a collecting vessel, batchwise. There are known separation methods used, such as separation on membranes of different pore size, centrifuges, column separation method u.a. The cleaning procedure depends on the cell cultures and nutrient solutions used, the inductions, the product and the requirements of the purity of the product. The cleaning procedure may need to be redefined for each product.
Die Meß- und Regeltechnik für die Bioreaktoren und Pumpen wird nach dem Stand der Technik ausgelegt. Vorzugsweise wird die Steuerung der Gesamtanlage durch einen übergeordneten Leitrechner vorgenommen jedoch können auch individuelle Regler eingesetzt werden.The measuring and control technology for the bioreactors and pumps is designed according to the prior art. Preferably, the control of the entire system is made by a parent control computer, however, individual controllers can be used.
Die Steuerung der Pumpraten für den Transfer von Nährlösung und Zellsuspension zwischen den Vorrats-, Fermenter- und Erntegefäßen erfolgt vorzugsweise durch photometrische Bestimmung der Zelldichte bzw. des Ausmaßes der Lyse der Zellkultur.The control of the pumping rates for the transfer of nutrient solution and cell suspension between the storage, fermentation and harvesting vessels is preferably carried out by photometric determination of the cell density or the extent of lysis of the cell culture.
Die Begasung der Bioreaktoren kann erfolgen durch direktes Einblasen z. B. von Luft, O2, N2 oder CO2 in die Flüssigkeit oder indirekt durch Ausnutzung der Diffusion über die Oberfläche der Flüssigkeit oder durch Membranen (Hohlfasermembranen oder Silikonschlauchmembranen), die in die Flüssigkeit der Bioreaktoren eintauchen oder in einer externen Schleife eingebaut sind. Zur Vermeidung von Kontaminationen vorgeschalteter Systeme durch Inhaltsstoffe der Folgesysteme werden vorzugsweise alle Verbindungen zwischen den Systemen mit Rückwuchsfallen ausgestattet.The fumigation of the bioreactors can be done by direct injection z. Of air, O 2 , N 2 or CO 2 in the liquid or indirectly by utilizing diffusion across the surface of the liquid or through membranes (hollow fiber membranes or silicone tube membranes) immersed in the liquid of the bioreactors or incorporated in an external loop , In order to avoid contamination of upstream systems by ingredients of the sequential systems, preferably all connections between the systems are equipped with recuperation traps.
Die Figur 1) zeigt eine erfindungsgemäß bevorzugte Vorrichtung mit einem Bioreaktor A2, in den gesteuert aus Nährmediumvorratsbehältern 4 über eine Leitung 6, die mit einer Pumpe 8 ausgerüstet ist, Nährmedium in den Bioreaktor A2 eingeführt wird.FIG. 1) shows a preferred apparatus according to the invention with a bioreactor A2 into which nutrient medium is introduced into the bioreactor A2, controlled by nutrient medium reservoirs 4 via a line 6 equipped with a pump 8.
Der Bioreaktor A2 ist hier weiter mit Hohlfasermembranen 58 ausgerüstet, über die Gase zur Regulierung des pH oder ρO2 eingeleitet werden können. Zusätzlich ist der Bioreaktor A2 mit einem Magnetrührer 62 und über eine Leitung 66, die ein Überdruckventil aufweist, mit dem Abluftsicherheitsgefäß 70 verbunden, wobei die Leitung einen Hohlfaserfilter 82 zum Zurückhalten eventuell vorhandener Viren aufweist. Der Bioreaktor A2 ist über eir.e Leitung 10, die mit einem Photometer 12 und einer Rückwuchsfalle ausgerüstet ist, mit dem Bioreaktor B14 verbunden, in den über eine Leitung 18, die mit einer Pumpe 20 und einer Ruckwuchsfalle ausgerüstet ist, aus den Behältern für Erhaltungsmedium 16 Medium zum Bioreaktor B14 zugeführt wird. Weiter ist der Bioreaktor B14 mit einer Hohlfasermembran 60 ausgerüstet, die zur Begasung und mit zur Regulierung des pH und pO2 dient. Zusätzlich weist der Bioreaktor B14 einen Magnetrührer 64 zum Vermischen der Inhaltsstoffe auf. Eine Leitung 68 mit einem Überdruckventil dient zum Druckausgleich und führt in das Abluftsicherheitsgefäß 70 über einen Hohlfaserfilter 84, in dem eventuell vorhandene Viren zurückgehalten werden. Der Bioreaktor B14 ist mit dem ersten Retentatbehälter 26 der ersten Filtrationsanordnung über eine Leitung 22, die mit einem Photometer 24 und einer Rückwuchsfalle ausgerüstet ist, verbunden, der wiederum über eine Leitung 78 mit einem daran vorhandenen Hohlfaserfilter 86 mit dem Abluftsicherheitsgefäß 70 zum Druckausgleich verbunden ist. Retentat aus dem ersten Retentatbehälter 26 wird über die Leitung 36, die mit einer Rückwuchsfalle ausgerüstet ist, abgezogen. Aus dem ersten Retentatbehälter 26 wird über eine Leitung 28, die mit einem Photometer 30 ausgerüstet ist, Suspension in den ersten Filter 32 geleitet, und daraus das Retentat über die Leitung 34 in den ersten Retentatbehälter 26 zurückgeführt und das Filtrat über die Leitung 38, die mit einer Rückwuchsfalle ausgerüstet ist, in den zweiten Retentatbehälter 40 eingeleitet, der wiederum mit einer Druckausgleichsleitung 80 versehen ist, die über einen Hohlfaserfilter 86 in das Abluftsicherheitsgefäß 70 mündet. Weiter ist der zweite Retentatbehälter 40 mit einer Leitung 50 versehen, die eine Rückwuchsfalle enthält und über die Viruskonzentration abgezogen wird. Aus dem zweiten Retentatbehälter 40 wird über eine Leitung 42, die mit einer Pumpe 44 versehen ist, Suspension in die Filtrationsvorrichtung 46 geführt, deren Retentat über die Leitung 48 in den zweiten Retentatbehälter 40 zurückgeführt wird, und deren Filtrat über die Leitung 54, die mit einer Rückflußfalle ausgestattet ist, abgezogen wird. Aus den Waschflüssigkeitsbehältern 76 kann ebenfalls rechnergesteuert über Leitungen 72, die mit Rückflußfallen ausgestattet sind und mit einer Pumpe 74 versehen sind, Waschflüssigkeit in die Retentatbehälter 26,40 zugeleitet werden.The bioreactor A2 here is further equipped with hollow-fiber membranes 58, via which gases for regulating the pH or ρO 2 can be introduced. In addition, the bioreactor A2 is connected to the vent safety vessel 70 with a magnetic stirrer 62 and via a conduit 66 having a pressure relief valve, the conduit having a hollow fiber filter 82 for retaining any viruses present. The bioreactor A2 is connected via eir.e line 10, which is equipped with a photometer 12 and a Rückwuchsfalle, connected to the bioreactor B14, in which via a line 18, which is equipped with a pump 20 and a Rückwuchsfalle, from the containers for Maintenance medium 16 medium to the bioreactor B14 is supplied. Further, the bioreactor B14 is equipped with a hollow fiber membrane 60 which serves for gassing and for regulating the pH and pO 2 . In addition, the bioreactor B14 has a magnetic stirrer 64 for mixing the ingredients. A line 68 with a pressure relief valve is used for pressure equalization and leads into the exhaust air safety vessel 70 via a hollow fiber filter 84, are retained in the possibly existing viruses. The bioreactor B14 is connected to the first retentate tank 26 of the first filtration assembly via a conduit 22 equipped with a photometer 24 and a backscatter trap, which in turn is connected via a conduit 78 with a hollow fiber filter 86 thereon to the vent safety vessel 70 for pressure equalization , Retentate from the first retentate container 26 is withdrawn via the line 36, which is equipped with a Rückwuchsfalle. From the first retentate 26 is fed via a line 28 which is equipped with a photometer 30, suspension in the first filter 32, and returned from the retentate via the line 34 into the first retentate 26 and the filtrate through the line 38, the equipped with a Rückwuchsfalle, introduced into the second retentate 40, which in turn is provided with a pressure equalization line 80, which opens via a hollow fiber filter 86 in the exhaust air safety vessel 70. Further, the second retentate container 40 is provided with a conduit 50 which contains a recusant trap and is withdrawn via the virus concentration. From the second retentate 40 is fed via a line 42 which is provided with a pump 44, suspension in the filtration device 46, the retentate is returned via the line 48 in the second retentate 40, and their filtrate via line 54 with a return trap is fitted, is withdrawn. From the washing liquid containers 76 can also be computer controlled via lines 72 which are equipped with reflux traps and are provided with a pump 74, washing liquid in the retentate 26,40 are fed.
Die Steuerung der Zu- und Ableitungen zu und aus den verschiedenen Teilen der Vorrichtung wird mit Hilfe eines Prozeßrechners 56 durchgeführtThe control of the supply and discharge lines to and from the various parts of the device is performed by means of a process computer 56
Das folgende Beispiel soll die Erfindung weiter erläutern. The following example is intended to further explain the invention.
Herstellung von BHK21 Klon 13 Zellen in kontinuierlicher Suspensionskultur.Preparation of BHK21 Clone 13 Cells in Continuous Suspension Culture.
Die Anzucht derZellen BHK 21 Klon 13 (ECACC Nr.84100501 (zu beziehen durch Flow Laboratories Meckenheim]) kann sowohl in Monolayer- als auch in Rollerflaschen erfolgen. Zur Inokulation müssen im Fermenter mindestes 8 χ 104 Zellen pro ml vorhanden sein, um ein schnelles Anwachsen der Kultur zu gewährleisten. Die Verdopplungszeit der BHK 21 Klon 13 Zellen betrug 24 Stunden. Mit der kontinuierlichen Zellgewinnung konnte nach 3 Tagen begonnen werden, sobald die Zellzahl mindestens 4 x 10s pro ml betrug. Die Mediumzugabe (9,538g/l MEM (minimal ess. media) mit Earl's Spinnersalzen, 2,2g/l NaHCO3,10,0ml/l MEM-Vitaminlösung, 10,0ml/l nicht essentielle Aminosäuren, 10,0%/lfoetales Kälberserum, über Hohlfaserbündel, die direkt an den Bioreaktor angeschlossen sind, steril filtriert) betrug zum Fermentationsbeginn 240 ml pro Tag, das entspricht einer Verdünnung von 1:12,5 und konnte proportional zum Wachstum bis 1500 ml pro Tag gesteigert werden (1:2). Die Regulierung erfolgte überein eingebautes Photometer. Die Zellen wuchsen ohne Mikrocarrier. Das Reaktionsvolumen des Bioreaktors A betrug 41, das Flüssigkeitsvolumen 31. Die Reaktionstemperatur war 37 "C, die Rührgeschwindigkeit 150U/min, der pH-Wert wurde auf 7,0 und der ρO2 auf 45% O2 einer luftkalibrierten Lösung eingestellt. Der Gasgrundstrom betrug hierbei 4,5l/min. Als Vordruck wurden 40mbar N2,20mbar O2 und 30mbar CO2 sowie Luft ohne Regelung eingesetzt. Als Geräte wurden im Beispiel die Folgenden eingesetzt:The culture of cells BHK 21 clone 13 (ECACC No. 84100501 (available from Flow Laboratories Meckenheim)) can be carried out in both monolayer and roller bottles and must be at least 8 × 10 4 cells per ml in the fermenter for inoculation The doubling time of the BHK 21 clone 13 cells was 24 hours and continuous cell harvesting could be started after 3 days as soon as the cell count was at least 4 × 10 s per ml Addition of medium (9.538 g / l MEM (minimal ess media) with Earl's spinner salts, 2.2g / l NaHCO 3 , 10.0ml / l MEM vitamin solution, 10.0ml / l nonessential amino acids, 10.0% / lfoetal calf serum, via hollow fiber bundles attached directly to bioreactor connected, sterile filtered) at the start of fermentation was 240 ml per day, which corresponds to a dilution of 1: 12.5 and could be increased in proportion to the growth to 1500 ml per day (1: 2) n built-in photometer. The cells grew without a microcarrier. The reaction volume of the bioreactor A was 41, the liquid volume was 31. The reaction temperature was 37 ° C., the stirring speed 150 rpm, the pH was adjusted to 7.0 and the ρO 2 to 45% O 2 of an air-calibrated solution In this case, 4.5 l / min was used as the initial pressure 40 mbar N 2 , 20 mbar O 2 and 30 mbar CO 2 as well as air without control.
(Fortsetzung)(Continuation)
Mörsenbroicher Weg 200 D-4000 Düsseldorf 30Mörsenbroicher Weg 200 D-4000 Düsseldorf 30
DerVirusferm^nter wurde mit einer auf BHK Monolayer gezüchteten Kultur, die in 100ml 7,1 χ 107ID Virus enthält, beimpft. Die Infektion der Morolayerkultur war zwei Tage vor der ersten Frischzellenzugabe in den Bioreaktor erfolgt. Der Zellenrasen der Monolayerkultur durfte bis zu diesem Zeitpunkt der Beimpfung des Virusfermenters noch keine Zellysis aufweisen. Die eigentliche Freisetzung der Viren sollte im Fermenter erfolgen und zwar zum Zeitpunkt der Zellzugabe aus dem Zellreaktor (Reaktor A).The virus vaccine was inoculated with a BHK monolayer grown culture containing 7.1 ml of ID 7 ID virus in 100 ml. The infection of the Morolayer culture was done two days before the first fresh cell addition to the bioreactor. The cell lawn of the monolayer culture was not allowed to contain any cell lysates until inoculation with the virus fermenter. The actual release of the virus should take place in the fermenter and indeed at the time of cell addition from the cell reactor (reactor A).
Zur Inokulation aus Bioreaktor A wurden 6 x 10* Zellen/rn! in einnr Durchflußmenge von 50 bis 100ml pro Stunde (je nach Zellwachstum) von Bioreaktor A zu Reaktor B bei 3,0 χ 10abis6,0 χ 10s Zellen pro Stunde in Reaktor B zugegeben. Das Reaktorvolumen des Bioreaktor B war ebenfalls 41, das Flüssigkeitsvolumen 3I, die Temperatur 370C1 die Rührgeschwindigkeit 150 Umdrehungen pro Minute, der pH-Wert wurde auf 7,0, der pO2-Wert auf 40,0% O2 in einer luftkalibrierten Lösung eingestellt. Der Gasgrundstrom betrug 4,Ol pro Minute, als Vordruck wurde 40 mbar N2,20 mbar O2,30 mbar CO2 und Luft ohne Regelung des Vordrucks eingesetzt. Die Mediumzugabe betrug 2I pro Tag und die Zellzugabe durchschnittlich 1,2 x 10'° Zellen pro Tag. Die Virusernte ergab 1,0 χ 107 ID/ml = 2,0 χ 10'°ID/Tag, wobei die Ernte erfolgte, wenn 80% der Zellen zerstört waren. Die Geräteausstattung des Bioreaktors 2 entsprach der des Bioreaktors I, jedoch mit folgenden Besonderheiten:For inoculation from bioreactor A 6 x 10 * cells / rn! in a flow rate of 50 to 100 ml per hour (depending on cell growth) from bioreactor A to reactor B at 3.0 χ 10 a to 6.0 χ 10 s cells per hour in reactor B was added. The reactor volume of the bioreactor B was also 41, the liquid volume 3I, the temperature 37 0 C 1, the stirring speed 150 revolutions per minute, the pH was at 7.0, the pO 2 value to 40.0% O 2 in one adjusted air-calibrated solution. The gas base flow was 4, oil per minute, as a pre-pressure 40 mbar N 2 , 20 mbar O 2 , 30 mbar CO 2 and air was used without control of the form. The medium addition was 2 l per day and the cell addition on average 1.2 x 10 'cells per day. The virus harvest yielded 1.0 χ 10 7 ID / ml = 2.0 χ 10 '° ID / day, harvesting when 80% of the cells were destroyed. The equipment of the bioreactor 2 corresponded to that of the bioreactor I, but with the following features:
Regulierung der Mediumzugabe In Verbindung mit dem Zellzulauf aus dem Reaktor I Die im Reaktor I eingebaute Niveauregulierung öffnete zeitverzögert zwei Magnetventile:Regulation of the medium addition In connection with the cell feed from the reactor I The level control installed in reactor I opened with a time delay two solenoid valves:
für Reaktor Il geöffnet;opened for reactor II;
Öffnungszeit 5 bis 10 Sekunden Abluftentsorgung:Opening time 5 to 10 seconds exhaust air disposal:
Firmencompanies
Porengröße 0,05 pm hydrophob Bestimmung des cytopatischen Effektes zur Ermittlung des Virustiters: Durchfluß-Photometer BCCPore size 0.05 pm hydrophobic Determination of the cytopathic effect for the determination of the virus titer: flow-through photometer BCC
Die Abscheidung von Zellresten erfolgte über Zellfilter mit 0,45nm Porengröße (Akzo MD020 P2 N) in der Filtrationsanordnung 1 und über Virusfilter 50000 NMGG (Akzo V1001) in der Filtrationsanordnung 2. Zahnradpumpen, Niveauregulierung und Magnetventilestammten von der Firma BCC. Als übergeordnete Koordination der Bioreaktoren und Filter wurde der industrielle Leitrechner FLS1 mit angepaßter Software der Firma Münzer und Diehl verwendet. Das Leitrechnersystem kontrollierte durch Dichtebestimmung das Zellwachstum im Bioreaktor A und die Virusvermehrung über den cytopatischen (lytischen) Effekt in Bioreaktor B und steuert den Nährbodenzulauf zu Bioreaktor A und Zellabgabe von Bioreaktor B optimal. Die variabel drehenden Pumpen des Filtrationssystems wurden über den Rechner so gesteuert, daß alles anfallende Material sofort aufgearbeitet wurde.The removal of cell debris was carried out via 0.45 nm pore size cell filters (Akzo MD020 P2 N) in the filtration arrangement 1 and via the virus filter 50000 NMGG (Akzo V1001) in the filtration arrangement 2. Gear pumps, level control and solenoid valves from BCC. As the overall coordination of the bioreactors and filters, the industrial control computer FLS1 with adapted software from Münzer and Diehl was used. The host computer system controlled the cell growth in the bioreactor A and the virus replication via the cytopathic (lytic) effect in bioreactor B by density determination and controls the nutrient feed to bioreactor A and cell delivery of bioreactor B optimally. The variably rotating pumps of the filtration system were controlled by the computer so that all accumulating material was processed immediately.
Claims (2)
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