EP3294857A1 - Method for the continuous elution of a product from chromatography columns - Google Patents

Method for the continuous elution of a product from chromatography columns

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Publication number
EP3294857A1
EP3294857A1 EP16723316.2A EP16723316A EP3294857A1 EP 3294857 A1 EP3294857 A1 EP 3294857A1 EP 16723316 A EP16723316 A EP 16723316A EP 3294857 A1 EP3294857 A1 EP 3294857A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
product
time
protein
column
chromatography columns
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16723316.2A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Peter Schwan
Kerstin Baumarth
Martin Lobedann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
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    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
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    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D15/424—Elution mode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns

Definitions

  • the invention relates to a process for the continuous elution of a product of chromatography columns.
  • proteins are batch-processed in biotechnological production, meaning that the individual production cycles are handled batchwise and discontinuously, with the product being removed as a whole after completion of a production cycle then separately start a new product cycle or batch.
  • SIP sterilization-in-place
  • the loss of use of the reactors due to the provisioning procedures may be on the order of the reactor availability, in particular in the case of short periods of use and frequent product changes.
  • the regulatory requirements in the downstream area are low-germ litigation. Therefore, a sterile procedure in the case of batch operation is not required.
  • the purification of the protein is operated over a longer period of time as possible without purification steps. This is preferably done without sterilization steps during cleaning. However, the risk of contamination is many times higher than in a pure batch mode.
  • WO2012 / 078677 describes a method and a plant for the continuous preparation of biopharmaceutical products by chromatography and their integration in a production plant, in particular in a one-way plant. Although WO2012 / 078677 provides approaches for the continuous production of biopharmaceutical and biological products, the disclosed solution is not sufficient in practice. WO2012 / 078677 also does not disclose the continuous elution of product. US 2014/0255994 A1 discloses an integrated continuous process for the production of therapeutic proteins. However, US 2014/0255994 Al does not disclose the feature that can be eluted continuously in such a process.
  • EP 2 182 990 A1 discloses a method for sterilizing chromatography columns by using hot steam.
  • a continuous process or continuous elution means any process for carrying out at least two process steps in series, in which the output stream of an upstream step is conveyed into a downstream step.
  • the downstream step begins processing the product stream before the upstream step is completed.
  • a portion of the product stream is always carried in the production facility and is referred to as a "continuous product stream.”
  • continuous transport or transfer of a product stream from an upstream unit to a downstream unit means that the downstream unit is already operating the upstream unit out of service ie, two successive units simultaneously process the product stream that flows through them.
  • front chromatography column in the context of the invention means a chromatography column which is in a first position in a serial connection during loading and is loaded directly with product stream.
  • recovery chromatography column in the context of the invention means a chromatography column which is in a serial connection during the loading in the second position behind the front chromatography columns and is loaded with the product stream from the front chromatography columns.
  • the "loading time t ⁇ " in the context of the invention means the time in which a chromatography column is located as the "front chromatography column in the loading zone.
  • the "switch time ts" means that periodically after a constant switch time ts, the front chromatography columns n emerge from the loading zone and a recovery chromatography column enters the loading zone from the recovery zone.
  • the "elution time ⁇ " in the context of the invention means the time in which the product is eluted by an elution buffer from a chromatography column into the product outlet.
  • total running time to in the context of the invention means the time for which the method according to the invention is operated altogether without pause.
  • germ-reduced in the context of the invention means a state of reduced germ count, ie a number of microorganisms per unit area or volume unit of almost zero, which can be achieved by a suitable germ reduction method, this germ reduction method can be selected from gamma irradiation, beta Irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment and steam-in-place (SIP) treatment.
  • dispenser article in the context of the invention means that the relevant product-contacted parts, in particular equipment, containers, filters and in the context of the invention, the term also includes reusable articles, such as steel, which are used only once in the process according to the invention are used and then no longer used in the process. These reusable articles, eg made of steel, are then also referred to as “disposable articles” in the context of the invention. Such used disposable articles can then also be referred to as “disposable” or “single-use” articles in the process according to the invention ("SU technology”) .This further improves the germ-reduced state of the process according to the invention and of the modular system.
  • product stream in the context of the invention means the cell-free fluid from a heterogeneous cell culture-fluid mixture containing the product, as well as the result of any other method steps of the method according to the invention, ie the product stream after filtration, after chromatography, after virus depletion Ultrafiltration, after diafiltration, or after further steps of the process according to the invention, wherein these product streams can then have different concentrations and degrees of purity
  • virus depletion means within the scope of the invention a reduction in the concentration of active viruses per unit volume of the fluid to be treated for complete inactivation and / or removal of the viruses contained in the fluid to be treated.
  • bubble trap in the context of the invention means a device for collecting gas bubbles, wherein the relevant fluid is degassed.
  • module means within the scope of the invention that the individual steps of the method according to the invention can be carried out in separate, interconnected modules, wherein the modules are preconfigured and germ-reduced and can be connected together in different combinations.
  • module plant in the context of the invention means a series of interconnected modules ("units") for carrying out at least two downstream and / or upstream steps in which a fluid ("product stream") can be conveyed
  • the units are suitable for carrying out one step continuously and can be operated with a continuous fluid flow (“product flow”).
  • product flow continuous fluid flow
  • Plant is produced and / or processed, is not exposed to the room environment.
  • a feedbatch culture may also be provided,
  • a biological product such as a protein, for example, a therapeutic protein.
  • the nutrient solution is also an ideal growth medium for microorganisms, such as bacteria and spores, resulting in a problem with regard to the unwanted growth of such microorganisms.
  • This undesirable growth of microorganisms becomes a problem, especially with longer maturities, because the nutrient solution becomes more and more contaminated with increasing runtime of the process, up to an exponential growth of microorganisms and thus total loss of the relevant batch of biological product produced.
  • the first chromatographic step with a Prot-A column is followed by virus inactivation by acidic pH ⁇ 4 or alkaline pH> 9.
  • This step is time-critical, ie for virus inactivation may not be below a certain time, usually ⁇ 2h. However, if the residence time is too long, eg 4 hours, the antibody will be destroyed.
  • the continuous virus inactivation in combination with an upstream chromatography step presents a particular challenge since the elution of the antibody is always carried out batchwise in discrete time steps with fluctuations in concentration and pH.
  • the invention achieves this object by providing a process for the continuous elution of a biopharmaceutical, biological, macromolecular product from more than one chromatography column, comprising the steps:
  • n is between 1 and 5
  • each front chromatographic column has a total loading time of L n , characterized in that periodically after a constant switch time ts of L n - L n - 1, the front chromatography columns n emerge from the loading zone and a recovery chromatography column enters the loading zone from the recovery zone,
  • step (c) washing the product-loaded column from step (b) with at least one wash buffer
  • step (d) eluting the product from the washed column of step (c) with an elution time tE that is> 80% of the switch time ts, and
  • the technical advantage of such continuous elution is that in the manufacture of sensitive biopharmaceutical, biological, macromolecular products, e.g. monoclonal antibodies, the residence times of the product are minimized in the respective process step.
  • a first chromatographic step follows with e.g. a protein A column
  • a virus inactivation by acidic pH ⁇ 4 or alkaline pH> 9 follows. This step is time critical, i. for virus inactivation may be a certain time, usually not ⁇ 2h. If the residence time is too long, e.g. 4 hours, however, the antibody is destroyed.
  • the eluted product is mixed by a homogenization step (e), preferably by a recycle loop with a recycle vessel, or by a recycle loop without a recycle vessel, or by a single-use static mixer.
  • the method further comprises the step (f) regeneration of the eluted column from step (d).
  • the front chromatographic columns and recovery chromatography columns used in the method of the invention may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions, or van der Waals forces alone.
  • the front chromatography columns and the recovery chromatography columns bind product by affinity principle, via ionic interactions, via metal chelate bonding, via hydrophobic interactions, or via van der Waals forces, with the front chromatography columns and the recovery chromatography columns on binding according to the affinity principle comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and a recombinant protein different from protein A, protein G, protein L, IgM and IgG, which has an affinity for the product has.
  • the biopharmaceutical, biological macromolecular product comprises a protein, peptide or DNA or RNA, wherein the protein or peptide is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant proteins and protein vaccines, and wherein the DNA or RNA is part a DNA and / or RNA drug or vaccine.
  • the pH of the eluted product from step (d) is additionally adjusted by a pH adjusting agent, preferably before the homogenization step (e), or during the homogenization step (e).
  • the homogenized product from step (e) is preferably passed through a defined residence time range, preferably a coiled-flow inverter (CFI).
  • CFI coiled-flow inverter
  • the total runtime to of the process is preferably at least 4 hours, preferably at least 8 hours, preferably at least 12 hours, preferably at least 24 hours, further preferably at least 48 hours, further preferably at least 7 days, further preferably at least 4 weeks, and particularly preferably at least 8 weeks on.
  • Such a long running time of several weeks in a preferred continuous mode of operation can be made possible in particular by a closed, modular and, above all, preferably germ-reduced mode of operation of the method.
  • the steps (a) to (d), preferably the steps (a) to (f), are preferably carried out in a germ-reduced manner, wherein preferably all the product-contacted elements used, In particular, the front chromatography columns and the recovery chromatography columns are germ reduced by a suitable germ reduction method.
  • Such suitable germ reduction methods may be selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (0 3 ), hydrogen peroxide treatment (H2O2) and steam-in-place (SIP). Treatment.
  • all liquids, gases and solids used in the process are germ-reduced, wherein the germ reduction is preferably carried out by filtration through a filter having a pore size of preferably ⁇ 0.45 ⁇ , and, preferably, during the process no in-process sterilization is performed.
  • a degassing of all fluids is carried out, which come on the chromatography, wherein said degassing preferably by at least one bubble trap and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane via vacuum and / or by treatment with Ultrasound and / or by bubbling with helium.
  • FIG. 1 Schematic structure of the input currents and the output currents in a continuous chromatographic system with 12 columns.
  • the input currents are configured as in example 1.
  • the columns move from left to right, ie from the first load in the recovery zone to the CIP and equilibration. It also shows that individual process steps such as regeneration and equilibration can not be continuous.
  • FIG. 2 UV absorption at 280 nm of the elution peaks during 15 cycles from Example 1.
  • the UV signal is representative of the concentration of the proteins in the elution.
  • the elution flow is constant, but the protein concentration is periodic.
  • FIG. 3 pH value of the elution peaks during 15 cycles from example 1.
  • the elution stream is constant, but the pH fluctuates periodically since the buffer of the linen 3 must first be displaced.
  • Figure 4 The principle of continuous elution followed by continuous virus inactivation.
  • the fluctuating continuous elution stream is mixed by a homogenization loop and then fed continuously to the residence time section.
  • a monoclonal antibody IgG1 was used.
  • the fermenter broth was prepared by a fed-batch process.
  • the feed concentration corresponded to 0.8-1.5 g / L.
  • a chromatography system a tarpon system was used. It was 12
  • the Tarpon system had 8 inputs. The assignment of the inputs was as follows:
  • Input 1 Connection of the output of the front pillars
  • Input 2 Feed fermenter broth
  • Entrance 7 Cleaning in Place (CIP)
  • Input 8 equilibration buffer or wash 3 buffer
  • the outputs of the chromatography system were as follows.
  • Output 6 Output of the front columns connected to input 1 Inputs 2-6 were each supplied with the respective solutions / buffers via separate piston pumps.
  • the buffer systems were composed as follows:
  • Elution buffer 10 mM Na-acetate, 50 mM NaCl, pH 5
  • Regeneration buffer 50 mM Na Actat, 500 mM NaCl, pH 2.7
  • this pillar was washed within a switch time with 10 SV in the wash 1. Thereafter, the column was also washed with 10 SV in the wash 2 within a switch time. The laundry 3 then reduced within a half switch time with 5 SV the salt load on the washed column.
  • the washed column was then eluted in exactly one switch time with 4.5 SV, thereby realizing a continuous elution stream at ⁇ 4.2 mL / min throughout the process.
  • the regeneration, CIP and equilibration of the column took place then each within half a switch time with a task volume of 5, 3 and 5 SV.
  • the continuous elution stream was fed to a homogenization loop at a flow rate of 4.2 mL / min.
  • the pH value in the elution varied from 3.1 to 6.6 as shown schematically in FIG.
  • a pH ⁇ 4 was required to achieve effective virus inactivation.
  • the strong pH fluctuations were attenuated by the homogenization to a maximum pH value of 3.9 as shown in FIG.
  • the homogenization loop consisted of a tube with an inside diameter of 6.4 mm and a volume of 30 ml.
  • a peristaltic pump pumped the contents at a flow rate of 380 mL / min. The risk of a short-circuit flow was minimized by the fact that the flow direction was opposite to the direction from input to output.
  • the homogenized product flowed at the same flow rate as the elution from the homogenization loop. This was now passed into the residence time loop.
  • the residence time loop was a coiled-flow inverter (CFI) with a narrow residence time distribution comparable to that of an ideal plug flow.
  • the minimum residence time in the CFI was 60 min.
  • the structure of the CFI is described in Klutz et al. (Klutz, S., Kurt, SK, Lobedann, M., Kockmann, N., 2015) and in "Narrow Residence Time Distribution in Tubular Reactor Concept for Reynolds Number Ranks of 10-100, Chem. Eng. Res. Des. 95, 22-33 ".
  • the technical data are listed in Table 1.
  • Hose holdup volume 322 mL The work leading to this notification has been funded under the grant agreement "Bio.NRW: MoBiDiK - Modular Bioproduction - Disposable and Continuous" under the European Regional Development Fund (ERDF).
  • ERDF European Regional Development Fund

Abstract

The invention relates to a method for the continuous elution of a biopharmaceutical, biological, macromolecular product from more than one chromatography column, comprising the following steps: (a) providing a product flow via an inlet, (b) simultaneously loading n front chromatography columns with the product flow in a loading zone with a loading time tB, wherein an output flow of the n front chromatography columns is simultaneously distributed to at least n-1 recovery chromatography columns in a recovery zone, wherein n lies between 1 and 5, and wherein the n front chromatography columns have a loading time tB of different length between 0 and L1, between L1 and L2, and up to between Ln-1 and Ln at a given time, wherein each front chromatography column has a total loading time of Ln, characterized in that, periodically after a constant switch time tS of Ln – Ln- 1, the front chromatography columns n leave the loading zone and a recovery chromatography column from the recovery zone enters the loading zone, (c) washing the column from step (b) loaded with product with at least one washing buffer, (d) eluting the product from the washed column from step (c) with an elution time tE that is ≥ 80% of the switch time tS, wherein at least one chromatography column is in the elution step (d) continuously over 80% of the total run time tG.

Description

Verfahren zur kontinuierlichen Elution eines Produktes von Chromatographiesäulen  Process for the continuous elution of a product of chromatography columns
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Elution eines Produktes von Chromatographiesäulen. The invention relates to a process for the continuous elution of a product of chromatography columns.
Gewöhnlich werden Proteine in der biotechnologischen Herstellung im Batch aufgereinigt (englisch batch:„Stapel"). Das bedeutet, dass die einzelnen Produktionszyklen chargenweise, diskontinuierlich gehandhabt werden, wobei nach dem Abschluss eines Produktionszyklus das Produkt als Ganzes entnommen wird. Für eine erneute Produktion muss dann separat ein neuer Produktzyklus bzw. Batch gestartet werden. Normally, proteins are batch-processed in biotechnological production, meaning that the individual production cycles are handled batchwise and discontinuously, with the product being removed as a whole after completion of a production cycle then separately start a new product cycle or batch.
In den letzten Jahren hat sich nun mehr und mehr gezeigt, dass eine kontinuierliche Verfahrensweise auch in der biotechnologischen Herstellung gefahren werden kann, wobei das Verfahren im Gegensatz zum Batch- Verfahren ohne Unterbrechungen laufen kann. In recent years it has become more and more evident that a continuous procedure can also be used in biotechnological production, whereby the process can run without interruptions, in contrast to the batch process.
Die stark regulierte pharmazeutische Produktion erfordert einen großen zeitlichen, technischen und personellen Aufwand für die Bereitstellung gereinigter und sterilisierter Bioreaktoren und Gewährleistung eines keimfreien Produkts. Um Kreuzkontaminationen bei einem Produktwechsel in einer Multi-Purpose- Anlage oder zwischen zwei Produktchargen sicher zu vermeiden, wird außer der Reinigung eine sehr aufwändige Reinigungsvalidierung benötigt, welche bei einer Prozessadaption ggf. wiederholt werden muss. Highly regulated pharmaceutical production requires a great deal of time, technical and human resources to provide purified and sterilized bioreactors and ensure a germ-free product. In order to reliably avoid cross-contamination during a product change in a multi-purpose system or between two product batches, a very elaborate cleaning validation is required in addition to cleaning, which may need to be repeated during a process adaptation.
Dies gilt sowohl für das Upstream-Processing (USP), d.h. die Herstellung biologischer Produkte in Fermentern als auch für das Downstream-Processing (DSP), d. h. die Aufreinigung der Fermentationsprodukte. This applies to both upstream processing (USP), i. the production of biological products in fermenters as well as for downstream processing (DSP), d. H. the purification of the fermentation products.
Gerade bei der Fermentation ist eine keimfreie Umgebung für eine erfolgreiche Kultivierung essentiell. Zur Sterilisation von Batch- oder Fedbatch-Fermentern kommt in der Regel die SIP-Technik zum Einsatz (SIP = sterilization-in-place).  Especially in fermentation, a germ-free environment is essential for successful cultivation. For the sterilization of batch or fed-batch fermenters, the SIP technique is usually used (SIP = sterilization-in-place).
Der durch die Bereitstellungsprozeduren bedingte Nutzungsausfall der Reaktoren kann insbesondere bei kurzen Nutzungsperioden und häufigem Produktwechsel in der Größenordnung der Reaktorverfügbarkeit liegen. Betroffen sind im USP der biotechnologischen Produktion z. B. die Prozessschritte der Medienherstellung und Fermentation und im DSP das Solubilisieren, Einfrieren, Auftauen, pH-Adjustieren, Produkttrennung wie z. B. durch Chromatographie, Fällen, oder Kristallisieren, das Umpuffern und die Virusinaktivierung. Die regulatorischen Anforderungen sind dabei im Downstream-Bereich eine keimarme Prozessführung. Daher ist eine sterile Fahrweise im Falle des Batch-Betriebes nicht gefordert. In einem kontinuierlichen Verfahren jedoch wird die Reinigung des Proteins über einen längeren Zeitraum möglichst ohne Reinigungsschritte betrieben. Dies geschieht bevorzugt ohne Sterilisationsschritte während der Reinigung. Dabei ist aber das Verkeimungsrisiko um ein Vielfaches höher als bei einem reinen Batchbetrieb. The loss of use of the reactors due to the provisioning procedures may be on the order of the reactor availability, in particular in the case of short periods of use and frequent product changes. Affected in the USP of biotechnological production z. B. the process steps of media production and fermentation and DSP solubilization, freezing, thawing, pH adjustment, product separation such. By chromatography, precipitation, or crystallization, rebuffering, and virus inactivation. The regulatory requirements in the downstream area are low-germ litigation. Therefore, a sterile procedure in the case of batch operation is not required. In a continuous process, however, the purification of the protein is operated over a longer period of time as possible without purification steps. This is preferably done without sterilization steps during cleaning. However, the risk of contamination is many times higher than in a pure batch mode.
WO2012/078677 beschreibt ein Verfahren und eine Anlage zur kontinuierlichen Aufbereitung von biopharmazeutischen Produkten durch Chromatographie und deren Integration in einer Produktionsanlage insbesondere in einer Einweg- Anlage. Obwohl WO2012/078677 Ansätze zur kontinuierlichen Produktion von biopharmazeutischen und biologischen Produkten liefert, reicht die offenbarte Lösung in der Praxis nicht aus. WO2012/078677 offenbart auch nicht die kontinuierliche Elution von Produkt. US 2014/0255994 AI offenbart ein integriertes kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Proteinen. US 2014/0255994 AI offenbart allerdings nicht das Merkmal, dass in so einem Verfahren kontinuierlich eluiert werden kann. WO2012 / 078677 describes a method and a plant for the continuous preparation of biopharmaceutical products by chromatography and their integration in a production plant, in particular in a one-way plant. Although WO2012 / 078677 provides approaches for the continuous production of biopharmaceutical and biological products, the disclosed solution is not sufficient in practice. WO2012 / 078677 also does not disclose the continuous elution of product. US 2014/0255994 A1 discloses an integrated continuous process for the production of therapeutic proteins. However, US 2014/0255994 Al does not disclose the feature that can be eluted continuously in such a process.
EP 2 182 990 AI offenbart ein Verfahren zur Sterilisation von Chromatographiesäulen durch Verwendung von heißem Wasserdampf. EP 2 182 990 A1 discloses a method for sterilizing chromatography columns by using hot steam.
Zunächst seien einige Begriffe näher definiert. First, some terms are defined in more detail.
Ein kontinuierliches Verfahren, bzw. kontinuierliche Elution meint im Rahmen der Erfindung jeden Prozess zur Durchführung von mindestens zwei Prozessschritten in Serie, in dem der Ausgangsstrom eines vorgeschalteten Schrittes in einen nachgeschalteten Schritt befördert wird. Der nachgeschaltete Schritt beginnt die Bearbeitung des Produktstroms, bevor der vorgeschaltete Schritt abgeschlossen ist. Üblicherweise wird in einem kontinuierlichen Verfahren immer ein Teil des Produktstroms in der Produktionsanlage befördert und wird als „kontinuierlicher Produktstrom" bezeichnet. Entsprechend bedeutet eine kontinuierliche Beförderung oder Transfer eines Produktstroms von einer vorgeschalteten Unit in eine nachgeschaltete Unit, dass die nachgeschaltete Unit bereits arbeitet, bevor die vorgeschaltete Unit außer Betrieb genommen wird, d.h. dass zwei nacheinander geschaltete Units den Produktstrom gleichzeitig prozessieren, der sie durchfließt. In the context of the invention, a continuous process or continuous elution means any process for carrying out at least two process steps in series, in which the output stream of an upstream step is conveyed into a downstream step. The downstream step begins processing the product stream before the upstream step is completed. Typically, in a continuous process, a portion of the product stream is always carried in the production facility and is referred to as a "continuous product stream." Accordingly, continuous transport or transfer of a product stream from an upstream unit to a downstream unit means that the downstream unit is already operating the upstream unit out of service ie, two successive units simultaneously process the product stream that flows through them.
Der Begriff „Front-Chromatographiesäule" bedeutet im Rahmen der Erfindung eine Chromatographiesäule, die in einer seriellen Verschaltung während der Beladung in der ersten Position steht, und direkt mit Produktstrom beladen wird. The term "front chromatography column" in the context of the invention means a chromatography column which is in a first position in a serial connection during loading and is loaded directly with product stream.
Der Begriff „Recovery-Chromatographiesäule" bedeutet im Rahmen der Erfindung eine Chromatographiesäule, die in einer seriellen Verschaltung während der Beladung in der zweiten Position hinter den Front-Chromatographiesäulen steht und mit dem Produktstrom aus den Front-Chromatographiesäulen beladen wird. The term "recovery chromatography column" in the context of the invention means a chromatography column which is in a serial connection during the loading in the second position behind the front chromatography columns and is loaded with the product stream from the front chromatography columns.
Die „Beladungszeit tß" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Zeit, in der sich eine Chromatographiesäule als„Front-Chromatographiesäule in der Beladungszone befindet. The "loading time tβ" in the context of the invention means the time in which a chromatography column is located as the "front chromatography column in the loading zone.
Die „Switch Zeit ts" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass periodisch nach einer konstanten Switch Zeit ts die Front-Chromatographiesäulen n aus der Beladungszone heraustritt und eine Recovery-Chromatographiesäule aus der Recoveryzone in die Beladungszone eintritt. In the context of the invention, the "switch time ts" means that periodically after a constant switch time ts, the front chromatography columns n emerge from the loading zone and a recovery chromatography column enters the loading zone from the recovery zone.
Die„Elutionszeit ΪΕ" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Zeit, in der das Produkt durch einen Elutionspuffer von einer Chromatographiesäule in den Produktausgang eluiert wird. The "elution time ΪΕ" in the context of the invention means the time in which the product is eluted by an elution buffer from a chromatography column into the product outlet.
Die „Gesamtlaufzeit to" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Zeit, für welche das erfindungsgemäße Verfahren insgesamt ohne Pause betrieben wird. The "total running time to" in the context of the invention means the time for which the method according to the invention is operated altogether without pause.
Der Begriff „keimreduziert" meint im Rahmen der Erfindung einen Zustand reduzierter Keimzahl, also einer Zahl an Mikroorganismen pro Flächen- oder Volumeneinheit von nahezu Null, der durch eine geeignete Keimreduktionsmethode erreichbar ist, wobei diese Keimreduktionsmethode ausgewählt sein kann aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)-Behandlung und„steam-in-place" (SIP)-Behandlung. The term "germ-reduced" in the context of the invention means a state of reduced germ count, ie a number of microorganisms per unit area or volume unit of almost zero, which can be achieved by a suitable germ reduction method, this germ reduction method can be selected from gamma irradiation, beta Irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment and steam-in-place (SIP) treatment.
Der Begriff „Einwegartikel" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die betreffenden produkt-berührten Teile, insbesondere Apparaturen, Behältern, Filter und Verbindungselemente, zum einmaligen Gebrauch mit anschließendem Wegwerfen geeignet sind (Englisch„disposable"), wobei diese Behälter sowohl aus Kunststoff als auch aus Metall sein können. Im Rahmen der Erfindung umfasst der Begriff auch Mehrwegartikel, etwa aus Stahl, die im erfindungsgemäßen Verfahren nur einmal verwendet werden und dann im Verfahren nicht mehr zum Einsatz kommen. Diese Mehrwegartikel, z.B. aus Stahl, werden dann im Rahmen der Erfindung auch „als Einwegartikel benutzte" Gegenstände bezeichnet. Solche eingesetzten Einwegartikel können dann im erfindungsgemäßen Verfahren auch als„disposabel" bzw.„Single-Use"- Artikel bezeichnet werden („SU Technologie"). Dadurch wird der keimreduzierte Zustand des erfindungsgemäßen Verfahrens und modularer Anlage noch weiter verbessert. The term "disposable article" in the context of the invention means that the relevant product-contacted parts, in particular equipment, containers, filters and In the context of the invention, the term also includes reusable articles, such as steel, which are used only once in the process according to the invention are used and then no longer used in the process.These reusable articles, eg made of steel, are then also referred to as "disposable articles" in the context of the invention. Such used disposable articles can then also be referred to as "disposable" or "single-use" articles in the process according to the invention ("SU technology") .This further improves the germ-reduced state of the process according to the invention and of the modular system.
Der Begriff„Produktstrom" meint im Rahmen der Erfindung das zellfreie Fluid aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, welche das Produkt enthält, sowie das Ergebnis jeder anderen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, also den Produktstrom nach Filtration, nach Chromatographie, nach Virenabreicherung, nach Ultrafiltration, nach Diafiltration, oder nach weiteren Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei diese Produktströme dann unterschiedliche Konzentrationen und Reinheitsgrade aufweisen können. Der Begriff„Virenabreicherung" meint im Rahmen der Erfindung eine Verringerung der Konzentration an aktiven Viren pro Volumeneinheit des zu behandelnden Fluids, bis hin zur vollständigen Inaktivierung und/oder Entfernung, der in dem zu behandelnden Fluid enthaltenen Viren. Der Begriff „Bubble-Trap" meint im Rahmen der Erfindung eine Vorrichtung zum Auffangen von Gasblasen, wobei dabei das betreffende Fluid entgast wird. The term "product stream" in the context of the invention means the cell-free fluid from a heterogeneous cell culture-fluid mixture containing the product, as well as the result of any other method steps of the method according to the invention, ie the product stream after filtration, after chromatography, after virus depletion Ultrafiltration, after diafiltration, or after further steps of the process according to the invention, wherein these product streams can then have different concentrations and degrees of purity The term "virus depletion" means within the scope of the invention a reduction in the concentration of active viruses per unit volume of the fluid to be treated for complete inactivation and / or removal of the viruses contained in the fluid to be treated. The term "bubble trap" in the context of the invention means a device for collecting gas bubbles, wherein the relevant fluid is degassed.
Der Begriff„modular" meint im Rahmen der Erfindung, dass die einzelnen Schritte des erfindungsgemäße Verfahrens in separaten, miteinander verbundenen Modulen durchgeführt werden können, wobei die Module vorkonfiguriert und keimreduziert sind und geschlossen, in unterschiedlichen Kombinationen miteinander verschaltet werden können. Der Begriff „modulare Anlage" meint im Rahmen der Erfindung eine Serie von miteinander verbundenen Modulen („Units") zur Durchführung von mindestens zwei Downstream- und / oder Upstream-Schritten, in denen ein Fluid („Produktstrom") befördert werden kann. Erfindungsgemäß sind die Units zur kontinuierlichen Durchführung eines Schrittes geeignet und können mit einem kontinuierlichen Fluidstrom („Produktstrom") betrieben werden. Die einzelnen Module der„modularen Anlage" können dabei in jeder Kombination miteinander verschaltet werden. The term "modular" means within the scope of the invention that the individual steps of the method according to the invention can be carried out in separate, interconnected modules, wherein the modules are preconfigured and germ-reduced and can be connected together in different combinations. The term "modular plant" in the context of the invention means a series of interconnected modules ("units") for carrying out at least two downstream and / or upstream steps in which a fluid ("product stream") can be conveyed For example, the units are suitable for carrying out one step continuously and can be operated with a continuous fluid flow ("product flow"). The individual modules of the "modular system" can be interconnected in any combination.
Der Begriff „geschlossen" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Fahrweise des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen modularen Anlage, welche so gefahren werden, dass das Produkt, welches mit diesem Verfahren und dieser modularenThe term "closed" means in the context of the invention, the driving style of the method according to the invention and the modular system according to the invention, which are driven so that the product, which with this method and this modular
Anlage produziert und/oder aufbereitet wird, nicht an die Raumumgebung exponiert wird.Plant is produced and / or processed, is not exposed to the room environment.
In das erfindungsgemäße geschlossene Verfahren und die entsprechende erfindungsgemäße geschlossene modulare Anlage können von außen Materialien, Gegenstände, Puffer und dergleichen zugegeben werden, wobei aber diese Zugabe in einer solchen Weise erfolgt, dass eine Exposition des produzierten und/oder aufbereitetenIn the closed process according to the invention and the corresponding closed modular plant according to the invention, materials, objects, buffers and the like can be added externally, but this addition takes place in such a way that an exposure of the produced and / or processed
Produktes an die Raumumgebung vermieden wird. Product to the room environment is avoided.
Die im Stand der Technik bekannten, üblichen Verfahren weisen eine Reihe von Nachteilen auf, welche im Folgenden behandelt werden. The conventional processes known in the art have a number of disadvantages, which will be dealt with below.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von biopharmazeutischen und biologischen Produkten umfassen üblicherweise folgende Produktionsschritte, die miteinander verschaltet werden: Known methods for the production of biopharmaceutical and biological products usually comprise the following production steps, which are interconnected:
1. Perfusionskultur  1. perfusion culture
2. Zellrückhaltesystem, alternativ zu Schritt 1 und 2 kann auch eine Feedbatchkultur vorgesehen sein,  2. cell restraint system, alternatively to step 1 and 2, a feedbatch culture may also be provided,
3. Zellabtrennung 3. cell separation
4. Puffer- bzw. Medienaustausch bevorzugt mit Konzentrierung  4. Buffer or media exchange preferably with concentration
5. BioBurden-Reduzierung bevorzugt durch Sterilfiltration  5. BioBurden reduction preferably by sterile filtration
6. Capture Chromatographie  6. Capture chromatography
Üblicherweise werden weitere Schritte zur weiteren Reinigung des Produktstroms durchgeführt, insbesondere: 7. Virusinaktivierung Usually, further steps are carried out for further purification of the product stream, in particular: 7. Virus inactivation
8. Neutralisation, und  8. Neutralization, and
9. Optional eine weitere Tiefenfiltration, BioBurden-Reduzierung (Sterilfiltration).  9. Optional further depth filtration, BioBurden reduction (sterile filtration).
Angesichts der hohen Qualitätsstandards bei der Herstellung von Biopharmazeutika folgen üblicherweise darüber hinaus folgende Schritte: In view of the high quality standards in the production of biopharmaceuticals, the following steps usually follow:
10. Chromatographische Zwischen- und Feinreinigung  10. Chromatographic intermediate and fine cleaning
11. BioBurden Reduzierung z. B. Sterilfiltration  11. BioBurden reduction z. B. Sterile filtration
12. Virenfiltration  12. Virus filtration
13. Pufferaustausch und bevorzugt Konzentrierung, und  13. buffer exchange and preferably concentration, and
14. Sterilfiltration.  14. Sterile filtration.
Bei der oben beschriebenen Herstellung stellen Zellen in einem Fermenter mit Nährstofflösung ein biologisches Produkt her, etwa ein Protein, beispielsweise ein therapeutisches Protein. Die Nährstofflösung ist dabei auch ein ideales Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wie Bakterien und Sporen, woraus sich ein Problem hinsichtlich des ungewünschten Wachstums solcher Mikroorganismen ergibt. Dieses ungewünschte Wachstum von Mikroorganismen wird besonders bei längeren Laufzeiten ein Problem, weil die Nährstofflösung mit ansteigender Laufzeit des Verfahrens mehr und mehr kontaminiert wird, bis hin zu einem exponentiellen Wachstum von Mikroorganismen und damit Totalverlust der betreffenden Charge an hergestelltem biologischen Produkt. In the preparation described above, cells in a fermentor with nutrient solution produce a biological product, such as a protein, for example, a therapeutic protein. The nutrient solution is also an ideal growth medium for microorganisms, such as bacteria and spores, resulting in a problem with regard to the unwanted growth of such microorganisms. This undesirable growth of microorganisms becomes a problem, especially with longer maturities, because the nutrient solution becomes more and more contaminated with increasing runtime of the process, up to an exponential growth of microorganisms and thus total loss of the relevant batch of biological product produced.
Um der Forderung an ein schnelles und flexibles Neubeschicken der Produktionsanlage unter Wahrung maximaler Sauberkeit und Keimfreiheit gerecht zu werden, erfreuen sich auf dem Markt Konzepte für eine kontinuierliche Produktion bevorzugt mit Einwegtechnologie eines ständig wachsenden Interesses. In order to meet the demand for a fast and flexible new shipment of the production plant while maintaining maximum cleanliness and sterility, the market enjoys concepts for continuous production, preferably with disposable technology of ever increasing interest.
Für längere Laufzeiten eines solchen Verfahrens von mehreren Stunden über Tage bis Wochen reichen aber gewöhnliche Maßnahmen zur Sanitisierung nicht, etwa die üblichen „Clean-in-Place" (CIP)-Maßnahmen, wie z.B. Sanitisierung durch IM NaOH. Bei Laufzeiten ab mehreren Stunden haben solche gewöhnlichen Verfahren und Anlagen daher den Nachteil, dass sie hinsichtlich möglicher Kontamination und/oder möglichen Keimwachstums sehr anfällig sind. For longer periods of such a procedure from several hours over days to weeks, however, usual measures for sanitizing are not sufficient, for example the usual "clean-in-place" (CIP) measures, such as sanitation by IM NaOH Such conventional methods and equipment therefore have the disadvantage that they are very vulnerable to possible contamination and / or possible germ growth.
In der Regel folgt z.B. in der Herstellung von monoklonalen Antikörpern dem ersten Chromatgraphieschritt mit einer Prot-A Säule eine Vireninaktivierung durch sauren pH <4 oder alkalischen pH >9. Dieser Schritt ist zeitkritisch, d.h. zur Vireninaktivierung darf eine gewisse Zeit, in der Regel <2h nicht unterschritten werden. Bei einer zu langen Verweilzeit, z.B. 4 Stunden, wird jedoch der Antikörper zerstört. Es bestand daher ein Bedarf an einem Verfahren zur kontinuierlichen Reinigung eines Produktes aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, welches durch seine weitgehende Keimarmut eine kontinuierliche Fahrweise von bis zu mehreren Wochen ermöglicht. Dabei stellt die kontinuierliche Vireninaktivierung in Kopplung mit einem vorgelagerten Chromatographieschritt eine besondere Herausforderung dar, da die Elution des Antikörpers immer absatzweise in diskreten Zeitschritten mit Flukuationen in Konzentration und pH Wert erfolgt. As a rule, for example, in the production of monoclonal antibodies, the first chromatographic step with a Prot-A column is followed by virus inactivation by acidic pH <4 or alkaline pH> 9. This step is time-critical, ie for virus inactivation may not be below a certain time, usually <2h. However, if the residence time is too long, eg 4 hours, the antibody will be destroyed. There was therefore a need for a process for the continuous purification of a product from a heterogeneous cell culture-fluid mixture, which allows a continuous driving of up to several weeks due to its extensive germ reduction. The continuous virus inactivation in combination with an upstream chromatography step presents a particular challenge since the elution of the antibody is always carried out batchwise in discrete time steps with fluctuations in concentration and pH.
Es war daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine entsprechende Anlage zu entwickeln, mit dem ein Produkt, etwa ein Protein, kontinuierlich über einen Zeitraum von mehreren Stunden bis hin zu mehreren Wochen aus Produktstrom eluiert werden kann. Der kontinuierliche Elutionsstrom wird dann kontinuierlich von Viren abgereichert. It was therefore the object of the present invention to develop a method and a corresponding system with which a product, for example a protein, can be eluted continuously from the product stream over a period of several hours to several weeks. The continuous elution stream is then continuously depleted of viruses.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellen eines Verfahrens zur kontinuierlichen Elution eines biopharmazeutischen, biologischen, makromolekularen Produktes von mehr als einer Chromatographiesäule, umfassend die Schritte: The invention achieves this object by providing a process for the continuous elution of a biopharmaceutical, biological, macromolecular product from more than one chromatography column, comprising the steps:
(a) Bereitstellen eines Produktstromes über einen Inlet, (a) providing a product stream via an inlet,
(b) gleichzeitiges Beladen von n Front-Chromatographiesäulen mit dem Produktstrom in einer Beladungszone mit einer Beladungszeit iß, wobei ein Ausgangsstrom der n Front- Chromatographiesäulen auf mindestens n-1 Recovery-Chromatographiesäulen in einer Recoveryzone gleichzeitig verteilt wird,  (b) simultaneously loading n front chromatographic columns with the product stream in a loading zone having a loading time, wherein an output stream of n front chromatography columns is simultaneously distributed on at least n-1 recovery chromatography columns in a recovery zone,
wobei n zwischen 1 und 5 liegt, und where n is between 1 and 5, and
wobei die n Front-Chromatographiesäulen zu einem gegebenen Zeitpunkt eine unterschiedlich lange Beladungszeit tß zwischen 0 und Li, zwischen Li und L2, und bis zu zwischen Ln-1 und Ln aufweisen, wherein the front-n chromatographic columns at any given time a different long loading time TSS between 0 and Li, between Li and L 2, and to have to between Ln-1 and Ln,
wobei jede Front-Chromatographiesäule eine gesamte Beladungszeit von Ln aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass periodisch nach einer konstanten Switch Zeit ts von Ln - Ln- l , die Front-Chromatographiesäulen n aus der Beladungszone heraustritt und eine Recovery-Chromatographiesäule aus der Recoveryzone in die Beladungszone eintritt,wherein each front chromatographic column has a total loading time of L n , characterized in that periodically after a constant switch time ts of L n - L n - 1, the front chromatography columns n emerge from the loading zone and a recovery chromatography column enters the loading zone from the recovery zone,
(c) Waschen der mit Produkt beladenen Säule aus Schritt (b) mit mindestens einem Waschpuffer, (c) washing the product-loaded column from step (b) with at least one wash buffer,
(d) Elution des Produktes von der gewaschenen Säule aus Schritt (c) mit einer Elutionszeit tE, die > 80% der Switch-Zeit ts ist, und  (d) eluting the product from the washed column of step (c) with an elution time tE that is> 80% of the switch time ts, and
dass sich über 80% der Gesamtlaufzeit to kontinuierlich mindestens eine Chromatographiesäule im Elutionsschritt (d) befindet. that over 80% of the total run time to continuously at least one chromatography column in the elution step (d) is located.
Der technische Vorteil einer solchen kontinuierlichen Elution ist, dass in der Herstellung von sensitiven biopharmazeutischen, biologischen, makromolekularen Produkten, z.B. monoklonalen Antikörpern, die Verweilzeiten des Produktes in dem jeweiligen Verfahrensschritt minimiert werden. Denn üblicherweise folgt einem ersten Chromatgraphieschritt mit z.B. einer Protein-A Säule eine Vireninaktivierung durch sauren pH <4 oder alkalischen pH >9 folgt. Dieser Schritt ist zeitkritisch, d.h. zur Vireninaktivierung darf eine gewisse Zeit, in der Regel <2h nicht unterschritten werden. Bei einer zu langen Verweilzeit, z.B. 4 Stunden, wird jedoch der Antikörper zerstört. Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahrens nach dem Elutionsschritt (d) das eluierte Produkt durch einen Homogenisierungsschritt (e) vermischt, bevorzugt durch eine Rezyklierungsschleife mit einem Rezyklierungsbehälter, oder durch eine Rezyklierungsschleife ohne einen Rezyklierungsbehälter, oder durch einen single-use statischen Mischer. The technical advantage of such continuous elution is that in the manufacture of sensitive biopharmaceutical, biological, macromolecular products, e.g. monoclonal antibodies, the residence times of the product are minimized in the respective process step. Because usually a first chromatographic step follows with e.g. a protein A column, a virus inactivation by acidic pH <4 or alkaline pH> 9 follows. This step is time critical, i. for virus inactivation may be a certain time, usually not <2h. If the residence time is too long, e.g. 4 hours, however, the antibody is destroyed. Preferably, in the process according to the invention after the elution step (d), the eluted product is mixed by a homogenization step (e), preferably by a recycle loop with a recycle vessel, or by a recycle loop without a recycle vessel, or by a single-use static mixer.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt (f) Regeneration der eluierten Säule aus Schritt (d). In a further embodiment of the method according to the invention, the method further comprises the step (f) regeneration of the eluted column from step (d).
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Front-Chromatographiesäulen und Recovery-Chromatographiesäulen können jedes geeignete Bindungsprinzip aufweisen, etwa Affmiät des Produktes zu einem Liganden, ionische Wechselwirkungen, Metalchelat- Bindung, hydrophobe Interaktionen oder reine van-der-Waals-Kräfte. Bevorzugt binden die Front-Chromatographiesäulen und die Recovery- Chromatographiesäulen Produkt nach dem Affinitätsprinzip, über ionische Wechselwirkungen, über Metalchelat-Bindung, über hydrophobe Interaktionen oder über van-der-Waals-Kräfte, wobei die Front-Chromatographiesäulen und die Recovery- Chromatographiesäulen bei Bindung nach dem Affinitätsprinzip einen Ligand umfassen, der bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und einem von Protein A, Protein G, Protein L, IgM und IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat. Bevorzugt umfasst das biopharmazeutische, biologische makromolekulare Produkt ein Protein, Peptid oder eine DNA oder RNA, wobei das Protein oder Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Protein-Impfstoffen, und wobei die DNA oder RNA Teil eines DNA- und/oder RNA- Wirkstoffes oder -Impfstoffes ist. The front chromatographic columns and recovery chromatography columns used in the method of the invention may have any suitable binding principle, such as affinity of the product for a ligand, ionic interactions, metal chelate bonding, hydrophobic interactions, or van der Waals forces alone. Preferably, the front chromatography columns and the recovery chromatography columns bind product by affinity principle, via ionic interactions, via metal chelate bonding, via hydrophobic interactions, or via van der Waals forces, with the front chromatography columns and the recovery chromatography columns on binding according to the affinity principle comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and a recombinant protein different from protein A, protein G, protein L, IgM and IgG, which has an affinity for the product has. Preferably, the biopharmaceutical, biological macromolecular product comprises a protein, peptide or DNA or RNA, wherein the protein or peptide is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant proteins and protein vaccines, and wherein the DNA or RNA is part a DNA and / or RNA drug or vaccine.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pH Wert des eluierten Produktes aus Schritt (d) zusätzlich durch ein pH- Stellmittel eingestellt, bevorzugt vor dem Homogenisierungsschritt (e), oder während des Homogenisierungsschrittes (e). In a further embodiment of the method according to the invention, the pH of the eluted product from step (d) is additionally adjusted by a pH adjusting agent, preferably before the homogenization step (e), or during the homogenization step (e).
Bevorzugt wird das homogenisierte Produkt aus Schritt (e) durch eine definierte Verweilzeitstrecke, bevorzugt einen Coiled-Flow Inverter (CFI), geleitet. The homogenized product from step (e) is preferably passed through a defined residence time range, preferably a coiled-flow inverter (CFI).
Bevorzugt beträgt die Gesamtlaufzeit to des Verfahrens mindestens 4 Stunden, bevorzugt mindestens 8 Stunden, bevorzugt mindestens 12 Stunden, bevorzugt mindestens 24 Stunden, weiterhin bevorzugt mindestens 48 Stunden, weiterhin bevorzugt mindestens 7 Tagen, weiterhin bevorzugt mindestens 4 Wochen, und besonders bevorzugt mindestens 8 Wochen auf. Eine derart lange Laufzeit von mehreren Wochen in bevorzugt kontinuierlicher Fahrweise kann insbesondere durch eine geschlossene, modulare und vor allem bevorzugt keimreduzierte Fahrweise des Verfahrens ermöglicht werden. The total runtime to of the process is preferably at least 4 hours, preferably at least 8 hours, preferably at least 12 hours, preferably at least 24 hours, further preferably at least 48 hours, further preferably at least 7 days, further preferably at least 4 weeks, and particularly preferably at least 8 weeks on. Such a long running time of several weeks in a preferred continuous mode of operation can be made possible in particular by a closed, modular and, above all, preferably germ-reduced mode of operation of the method.
Bevorzugt werden die Schritte (a) bis (d), bevorzugt die Schritte (a) bis (f) keimreduziert durchgeführt, wobei bevorzugt alle eingesetzten, produkt-berührten Elemente, insbesondere die Front-Chromatographiesäulen und die Recovery-Chromatographiesäulen, durch eine geeignete Keimreduktionsmethode keimreduziert sind. The steps (a) to (d), preferably the steps (a) to (f), are preferably carried out in a germ-reduced manner, wherein preferably all the product-contacted elements used, In particular, the front chromatography columns and the recovery chromatography columns are germ reduced by a suitable germ reduction method.
Derartige geeignete Keimreduktionsmethoden können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO) Behandlung, Ozon-Behandlung (03), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und Steam- in-place (SIP) Behandlung. Such suitable germ reduction methods may be selected from the group consisting of gamma irradiation, beta irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (0 3 ), hydrogen peroxide treatment (H2O2) and steam-in-place (SIP). Treatment.
Bevorzugt sind alle in dem Verfahren verwendeten Flüssigkeiten, Gase und Feststoffe keimreduziert, wobei die Keimreduktion bevorzugt durch eine Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von bevorzugt < 0,45 μιη erfolgt, und, bevorzugt während des Verfahrens keine Inprocess-Sterilisierung durchgeführt wird. Preferably, all liquids, gases and solids used in the process are germ-reduced, wherein the germ reduction is preferably carried out by filtration through a filter having a pore size of preferably <0.45 μιη, and, preferably, during the process no in-process sterilization is performed.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird vor Schritt (b) ein Entgasen aller Fluide durchgeführt, welche auf die Chromatographiesäule kommen, wobei dass Entgasen vorzugsweise durch mindestens eine Bubble-Trap und/oder durch mindestens eine hydrophobe Mikrofiltrationsmembran über Vakuum und/oder durch Behandeln mit Ultraschall und/oder durch Durchperlen mit Helium erfolgt. Die vorliegende Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen wird in Verbindung mit den nachfolgenden Zeichnungen und Beispielen erläutert, ohne hierauf beschränkt zu sein. Die Ausführungsformen können beliebig miteinander kombiniert werden, sofern sich nicht eindeutig das Gegenteil aus dem Kontext ergibt. In a further embodiment of the invention, prior to step (b) a degassing of all fluids is carried out, which come on the chromatography, wherein said degassing preferably by at least one bubble trap and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane via vacuum and / or by treatment with Ultrasound and / or by bubbling with helium. The present invention, including preferred embodiments thereof, is illustrated in conjunction with the following drawings and examples, without being limited thereto. The embodiments can be combined as desired, unless clearly the opposite results from the context.
Es zeigen: Show it:
Figur 1: Schematischer Aufbau der Eingangsströme und der Ausgangsströme in einer kontinuierlichen Chromatographieanlage mit 12 Säulen. Die Eingangsströme sind dabei wie in Beispiel 1 konfiguiert. Im Chromatographiezyklus bewegen sich die Säulen von links nach rechts, d.h. von der ersten Beladung in der Recoveryzone bis zum CIP und Equilibrieren. Zudem wird dargestellt, dass einzelne Prozessschritte wie z.B. Regeneration und Equilibrierung nicht kontinuierlich sein können. Figur 2: UV- Absorption bei 280nm der Elutionspeaks während 15 Zyklen aus Beispiel 1. Das UV Signal ist dabei repräsentative für die Konzentration der Proteine in der Elution. Der Elutionsstrom ist konstant, die Proteinkonzentration ist jedoch periodisch. Figur 3: pH Wert der Elutionspeaks während 15 Zyklen aus Beispiel 1. Der Elutionsstrom ist konstant, der pH Wert schwant jedoch periodisch, da der Puffer der Wäsche 3 zunächst verdrängt werden muss. Figure 1: Schematic structure of the input currents and the output currents in a continuous chromatographic system with 12 columns. The input currents are configured as in example 1. In the chromatography cycle, the columns move from left to right, ie from the first load in the recovery zone to the CIP and equilibration. It also shows that individual process steps such as regeneration and equilibration can not be continuous. FIG. 2: UV absorption at 280 nm of the elution peaks during 15 cycles from Example 1. The UV signal is representative of the concentration of the proteins in the elution. The elution flow is constant, but the protein concentration is periodic. FIG. 3: pH value of the elution peaks during 15 cycles from example 1. The elution stream is constant, but the pH fluctuates periodically since the buffer of the linen 3 must first be displaced.
Figur 4: Das Prinzip der kontinuierlichen Elution mit anschließender kontinuierlicher Virusinaktivierung. Dabei wird der fluktuieren kontinuierliche Elutionsstrom durch eine Homogenisierungsschleife vermischt und dann kontinuierlich der Verweilzeitstrecke zugeführt. Figure 4: The principle of continuous elution followed by continuous virus inactivation. In this case, the fluctuating continuous elution stream is mixed by a homogenization loop and then fed continuously to the residence time section.
1 Kontinuierlicher Elutionsstrom mit pH Fluktuation 1 Continuous elution stream with pH fluctuation
2 Homogenisierungsschleife  2 homogenization loop
3 CFI (Cold-Flow-Inverter) Verweilzeitstrecke  3 CFI (Cold-Flow-Inverter) residence time range
Beispiel 1 example 1
Im Beispiel 1 wurde ein monoklonaler Antikörper IgGl verwendet. Die Fermenterbrühe wurde über ein Fed-batch Verfahren hergestellt. Die Feedkonzentration entsprach 0,8-1,5 g/L. Als Chromatographie System wurde ein Tarpon System verwendet. Dabei wurden 12In example 1, a monoclonal antibody IgG1 was used. The fermenter broth was prepared by a fed-batch process. The feed concentration corresponded to 0.8-1.5 g / L. As a chromatography system, a tarpon system was used. It was 12
Säulen mit einem Innendurchmesser von 16mm eingesetzt. Die Säulen wurden mit demColumns with an inner diameter of 16mm inserted. The columns were with the
Protein A Harz MabselectSure der Firma GE gepackt. Dabei wurden die Säulen gemäßProtein A resin MabselectSure from GE packed. The columns were according to
Herstellerangaben zu einer Länge von 8 cm mit einem Volumen von 16.1 mL gepackt. Das Tarpon System hatte 8 Eingänge. Die Belegung der Eingänge war wie folgt: Manufacturer's instructions packed to a length of 8 cm with a volume of 16.1 mL. The Tarpon system had 8 inputs. The assignment of the inputs was as follows:
Eingang 1 : Verbindung des Ausgangs der Frontsäulen  Input 1: Connection of the output of the front pillars
Eingang 2: Feed Fermenterbrühe  Input 2: Feed fermenter broth
Eingang3 : Puffer Wäsche 1  Input 3: buffer laundry 1
Eingang 4: Puffer Wäsche 2  Input 4: buffer wash 2
Eingang 5 : Elutionspuffer Input 5: elution buffer
Eingang 6: Regenerationspuffer  Input 6: regeneration buffer
Eingang 7: Cleaning in Place (CIP)  Entrance 7: Cleaning in Place (CIP)
Eingang 8: Equilibrierungspuffer bzw. Wäsche 3 Puffer Die Ausgänge des Chromatographiesystems waren wie folgt. Input 8: equilibration buffer or wash 3 buffer The outputs of the chromatography system were as follows.
Ausgang 1 : Abfallstrom Output 1: waste stream
Ausgang 2: geschlossen Output 2: closed
Ausgang 3 : Elution Exit 3: elution
Ausgang 4: Abfall der Wäsche  Exit 4: waste of laundry
Ausgang 5 : Abfall des Flowthroughs aus der Recovery Zone  Output 5: Waste of Flowthrough from the Recovery Zone
Ausgang 6: Ausgang der Frontsäulen verbunden mit Eingang 1 Die Eingänge 2-6 wurden jeweils über separate Kolbenpumpen mit den jeweiligen Lösungen / Puffern versorgt. Output 6: Output of the front columns connected to input 1 Inputs 2-6 were each supplied with the respective solutions / buffers via separate piston pumps.
Die Puffersysteme waren wie folgt zusammengesetzt:  The buffer systems were composed as follows:
Wäsche 1 : 50mM Tris, 2.5M NaCl pH7 Wash 1: 50mM Tris, 2.5M NaCl pH7
Wäsche 2: 50mM NaAc, IM NaCl, pH5 Wash 2: 50mM NaAc, IM NaCl, pH5
Elutionspuffer: 1 OOmM NaAcetat, 50 mM NaCl, pH 5 Elution buffer: 10 mM Na-acetate, 50 mM NaCl, pH 5
Regenerationspuffer: 50mM Na Actat, 500 mM NaCl, pH 2.7  Regeneration buffer: 50 mM Na Actat, 500 mM NaCl, pH 2.7
Wäsche 3 /Equibrierungspuffer: 50mM Tris / 50 mM NaCl pH 7 Wash 3 / Equibration buffer: 50 mM Tris / 50 mM NaCl pH 7
CIP: 0.5M NaOH Jede Frontsäule wurde in der Beladungszone mit 32.25 Säulenvolumina (SV) mit einer Feedrate von 30 mL / min beladen. Dabei waren immer drei Säulen gleichzeitig in der Beladungszone während sich jeweils 4 Recovery Säulen in der Recoveryzone befanden, die ungebundenen IgG aus der Beladungszone auffangen konnten. Die Switch Zeit betrug 17,29 min. CIP: 0.5M NaOH Each front column was loaded in the loading zone with 32.25 column volumes (SV) with a feed rate of 30 mL / min. There were always three columns at the same time in the loading zone, while there were 4 recovery columns each in the recovery zone, which could collect unbound IgG from the loading zone. The switch time was 17.29 min.
Nachdem eine Frontsäule für 3 Switchzeiten beladen wurde, wurde diese Säule innerhalb von einer Switch Zeit mit 10 SV in der Wäsche 1 gewaschen. Danach wurde die Säule ebenfalls mit 10 SV in der Wäsche 2 innerhalb einer Switch Zeit gewaschen. Die Wäsche 3 reduzierte danach innerhalb einer halben Switch Zeit mit 5 SV die Salzfracht auf der gewaschenen Säule. After a front pillar was loaded for 3 switch times, this pillar was washed within a switch time with 10 SV in the wash 1. Thereafter, the column was also washed with 10 SV in the wash 2 within a switch time. The laundry 3 then reduced within a half switch time with 5 SV the salt load on the washed column.
Die gewaschene Säule wurde daraufhin in genau einer Switch Zeit mit 4.5 SV eluiert, wodurch während des gesamten Prozesses ein kontinuierlicher Elutionsstrom mit ~4.2 mL/min realisiert wurde. Die Regeneration, CIP und Equilibrierung der Säule erfolgte dann jeweils innerhalb einer halben Switch Zeit mit einem Aufgabevolumen von 5, 3 und 5 SV. The washed column was then eluted in exactly one switch time with 4.5 SV, thereby realizing a continuous elution stream at ~ 4.2 mL / min throughout the process. The regeneration, CIP and equilibration of the column took place then each within half a switch time with a task volume of 5, 3 and 5 SV.
Der kontinuierliche Elutionsstrom wurde mit einer Flussrate von 4,2 mL/min einer Homogenisierungsschleife zugeführt. Der pH Wert in der Elution schwankte dabei von 3.1 bis 6,6 wie in Figur 4 schematisiert. Für die Vireninaktivierung war ein pH Wert < 4 erforderlich um eine effektive Vireninaktivierung zu erreichen. Die starken pH Schwankungen wurden durch die Homogenisierung auf einen maximalen pH Wert von 3.9 gedämpft wie in Figur 4 dargestellt. Die Homogenisierungsschleife bestand aus einem Schlauch mit einem Innendurchmesser von 6.4mm und einem Volumen von 30ml. Dabei pumpte eine Schlauchpumpe den Inhalt mit einer Flussrate von 380 mL/min um. Das Risiko einer Kurzschlussströmung wurde dadurch minimiert, dass die Strömungsrichtung entgegen der Richtung von Eingang nach Ausgang verlief. Das homogenisierte Produkte strömte mit der gleichen Flussrate wie die Elution aus der Homogenisierungsschleife. Dieses wurde nun in die Verweilzeitschleife geleitet. Die Verweilzeitschleife war ein Coiled-Flow Inverter (CFI) mit einer engen Verweilzeitverteilung, die vergleichbar mit der einer idealen Pfropfenströmung ist. Die minimale Verweilzeit im CFI betrug 60 min. Der Aufbau des CFI ist in Klutz et al. (Klutz, S., Kurt, S.K., Lobedann, M., Kockmann, N., 2015) und in "Narrow residence time distribution in tubulär reactor concept for Reynolds number ränge of 10-100, Chem. Eng. Res. Des. 95, 22-33" beschrieben. Die technischen Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt. The continuous elution stream was fed to a homogenization loop at a flow rate of 4.2 mL / min. The pH value in the elution varied from 3.1 to 6.6 as shown schematically in FIG. For virus inactivation, a pH <4 was required to achieve effective virus inactivation. The strong pH fluctuations were attenuated by the homogenization to a maximum pH value of 3.9 as shown in FIG. The homogenization loop consisted of a tube with an inside diameter of 6.4 mm and a volume of 30 ml. A peristaltic pump pumped the contents at a flow rate of 380 mL / min. The risk of a short-circuit flow was minimized by the fact that the flow direction was opposite to the direction from input to output. The homogenized product flowed at the same flow rate as the elution from the homogenization loop. This was now passed into the residence time loop. The residence time loop was a coiled-flow inverter (CFI) with a narrow residence time distribution comparable to that of an ideal plug flow. The minimum residence time in the CFI was 60 min. The structure of the CFI is described in Klutz et al. (Klutz, S., Kurt, SK, Lobedann, M., Kockmann, N., 2015) and in "Narrow Residence Time Distribution in Tubular Reactor Concept for Reynolds Number Ranks of 10-100, Chem. Eng. Res. Des. 95, 22-33 ". The technical data are listed in Table 1.
Tabelle 1: Design Parameter des CFI Reaktors für kontinuierlich gefahrene Vireninaktivierung Table 1: Design parameters of the CFI reactor for continuous virus inactivation
Design-Variable Wert Einheit Design variable value unit
Schlauchinnendurchmesser 3,2 mmInner tube diameter 3.2 mm
S chlauchwandstärke 1,6 mmShallow wall thickness 1.6 mm
Durchmesser Rahmen (Coil) 63 mmDiameter frame (coil) 63 mm
Schlauchabstand in Windung (minimum) 6,4 mmHose distance in turns (minimum) 6.4 mm
Anzahl der Windung pro gerader Rahmenseite 9 -Number of turns per straight frame side 9 -
Anzahl der geraden Rahmenseiten 20 -Number of straight frame sides 20 -
Zahl der 90°-Rnicke 19 -Number of 90 ° bend 19 -
Volumetrische Flussrate 4.2 mL min"1 Volumetric flow rate 4.2 mL min "1
Schlauchlänge (Sanipure® tube) 40 mHose length (Sanipure ® tube) 40 m
Schlauch Holdup volumen 322 mL Die Arbeiten, die zu dieser Anmeldung geführt haben, wurden gemäß der Finanzhilfevereinbarung „Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich" im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) gefördert. Hose holdup volume 322 mL The work leading to this notification has been funded under the grant agreement "Bio.NRW: MoBiDiK - Modular Bioproduction - Disposable and Continuous" under the European Regional Development Fund (ERDF).

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur kontinuierlichen Elution eines biopharmazeutischen, biologischen, makromolekularen Produktes von mehr als einer Chromatographiesäule, umfassend die Schritte: A process for the continuous elution of a biopharmaceutical biological macromolecular product from more than one chromatography column comprising the steps of:
(a) Bereitstellen eines Produktstromes über einen Inlet,  (a) providing a product stream via an inlet,
(b) gleichzeitiges Beladen von n Front-Chromatographiesäulen mit dem Produktstrom in einer Beladungszone mit einer Beladungszeit iß, wobei ein Ausgangsstrom der n Front- Chromatographiesäulen auf mindestens n-1 Recovery-Chromatographiesäulen in einer Recoveryzone gleichzeitig verteilt wird,  (b) simultaneously loading n front chromatographic columns with the product stream in a loading zone having a loading time, wherein an output stream of n front chromatography columns is simultaneously distributed on at least n-1 recovery chromatography columns in a recovery zone,
wobei n zwischen 1 und 5 liegt, und where n is between 1 and 5, and
wobei die n Front-Chromatographiesäulen zu einem gegebenen Zeitpunkt eine unterschiedlich lange Beladungszeit tß zwischen 0 und Li, zwischen Li und L2, und bis zu zwischen Ln-1 und Ln aufweisen, wherein the front-n chromatographic columns at any given time a different long loading time TSS between 0 and Li, between Li and L 2, and to have to between Ln-1 and Ln,
wobei jede Front-Chromatographiesäule eine gesamte Beladungszeit von Ln aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass periodisch nach einer konstanten Switch Zeit ts von Ln - Ln-wherein each front chromatography column has a total loading time of L n , characterized in that periodically after a constant switch time ts of L n - L n -
1. die Front-Chromatographiesäulen n aus der Beladungszone heraustritt und eine Recovery-Chromatographiesäule aus der Recoveryzone in die Beladungszone eintritt,1. the front chromatography columns n emerge from the loading zone and a recovery chromatography column enters the loading zone from the recovery zone,
(c) Waschen der mit Produkt beladenen Säule aus Schritt (b) mit mindestens einem Waschpuffer, (c) washing the product-loaded column from step (b) with at least one wash buffer,
(d) Elution des Produktes von der gewaschenen Säule aus Schritt (c) mit einer Elutionszeit tE, die > 80% der Switch-Zeit ts ist, und  (d) eluting the product from the washed column of step (c) with an elution time tE that is> 80% of the switch time ts, and
dass sich über 80% der Gesamtlaufzeit to kontinuierlich mindestens eine Chromatographiesäule im Elutionsschritt (d) befindet. that over 80% of the total run time to continuously at least one chromatography column in the elution step (d) is located.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Elutionsschritt (d) das eluierte Produkt durch einen Homogenisierungsschritt (e) vermischt wird, bevorzugt durch eine Rezyklierungsschleife mit einem Rezyklierungsbehälter, oder durch eine Rezyklierungsschleife ohne einen Rezyklierungsbehälter, oder durch einen single-use statischen Mischer. 2. The method according to claim 1, characterized in that after the elution step (d) the eluted product is mixed by a homogenization step (e), preferably by a recycle loop with a recycle container, or by a recycle loop without a recycle container, or by a single- use static mixer.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin den Schritt 3. The method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the method further comprises the step
(f) Regeneration der eluierten Säule aus Schritt (d) umfasst. (f) regeneration of the eluted column from step (d) includes.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Front- Chromatographiesäulen und die Recovery-Chromatographiesäulen Produkt nach dem Affinitätsprinzip, über ionische Wechselwirkungen, über Metalchelat-Bindung, über hydrophobe Interaktionen oder über van-der-Waals-Kräfte binden, wobei die Front- Chromatographiesäulen und die Recovery-Chromatographiesäulen bei Bindung nach dem Affinitätsprinzip einen Ligand umfassen, der bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, IgM, IgG und einem von Protein A, Protein G, Protein L, IgM und IgG unterschiedlichen rekombinanten Protein, welches eine Affinität für das Produkt hat. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the front chromatography columns and the recovery chromatography columns product by the affinity principle, via ionic interactions, via metal chelate bond, via hydrophobic interactions or via van der Waals forces when the affinity principle of the front chromatography columns and the recovery chromatography columns comprise a ligand which is preferably selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, IgM, IgG and one of protein A, protein G. , Protein L, IgM and IgG different recombinant protein, which has an affinity for the product.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das biopharmazeutische, biologische makromolekulare Produkt ein Protein, Peptid ist oder eine DNA oder RNA umfasst, wobei das Protein oder Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Protein-Impfstoffen, und wobei die DNA oder RNA Teil eines DNA- und/oder RNA- Wirkstoffes oder -Impfstoffes ist. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the biopharmaceutical, biological macromolecular product is a protein, peptide or comprises a DNA or RNA, wherein the protein or peptide is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies , recombinant proteins and protein vaccines, and wherein the DNA or RNA is part of a DNA and / or RNA drug or vaccine.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH Wert des eluierten Produktes aus Schritt (d) zusätzlich durch ein pH- Stellmittel eingestellt wird, bevorzugt vor dem Homogenisierungsschritt (e), oder während des Homogenisierungsschrittes (e). 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the pH value of the eluted product from step (d) is additionally adjusted by a pH adjusting agent, preferably before the homogenization step (e), or during the homogenization step (e) ,
7. Verfahren nach 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass das homogenisierte Produkt aus Schritt (e) durch eine definierte Verweilzeitstrecke, bevorzugt einen Coiled-Flow Inverter (CFI), geleitet wird. 7. The method according to 1 to 6, characterized in that the homogenized product from step (e) through a defined residence time, preferably a coiled-flow inverter (CFI), is passed.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtlaufzeit to des Verfahrens mindestens 4 Stunden, bevorzugt mindestens 8 Stunden, bevorzugt mindestens 12 Stunden, bevorzugt mindestens 24 Stunden, weiterhin bevorzugt mindestens 48 Stunden, weiterhin bevorzugt mindestens 7 Tage, weiterhin bevorzugt mindestens 4 Wochen, und besonders bevorzugt mindestens 8 Wochen beträgt. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the total running time to the method at least 4 hours, preferably at least 8 hours, preferably at least 12 hours, preferably at least 24 hours, more preferably at least 48 hours, further preferably at least 7 days , furthermore preferably at least 4 weeks, and more preferably at least 8 weeks.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (d), bevorzugt die Schritte (a) bis (f) keimreduziert durchgeführt werden, wobei bevorzugt alle eingesetzten, produkt-berührten Elemente, insbesondere die Front- Chromatographiesäulen und die Recovery-Chromatographiesäulen, durch eine geeignete Keimreduktionsmethode keimreduziert sind. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the steps (a) to (d), preferably the steps (a) to (f) are performed germ-reduced, wherein preferably all used, product-contacted elements, in particular the front chromatography columns and the recovery chromatography columns are germ reduced by a suitable germ reduction method.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die geeignete Keimreduktionsmethode ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma- Bestrahlung, Beta-Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO) Behandlung, Ozon- Behandlung (03), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und Steam-in-place (SIP) Behandlung. 10. The method according to claim 9, characterized in that the suitable germ reduction method is selected from the group consisting of gamma irradiation, beta-irradiation, autoclaving, ethylene oxide (ETO) treatment, ozone treatment (0 3 ), hydrogen peroxide treatment (H2O2 ) and Steam-in-place (SIP) treatment.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass alle in dem Verfahren verwendeten Flüssigkeiten, Gase und Feststoffe keimreduziert sind, wobei die Keimreduktion bevorzugt durch eine Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von bevorzugt < 0,45 μιη erfolgt, und, dass bevorzugt während des Verfahrens keine Inprocess-Sterilisierung durchgeführt wird. 11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that all liquids, gases and solids used in the process are germ-reduced, wherein the germ reduction is preferably carried out by a filtration through a filter having a pore size of preferably <0.45 μιη, and that preferably no in-process sterilization is performed during the process.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (b) ein Entgasen aller Fluide durchgeführt wird, welche auf die Chromatographiesäule kommen, wobei dass Entgasen vorzugsweise durch mindestens eine Bubble-Trap und/oder durch mindestens eine hydrophobe Mikrofiltrationsmembran über Vakuum und/oder durch Behandeln mit Ultraschall und/oder durch Durchperlen mit Helium erfolgt. 12. The method according to claim 1 to 11, characterized in that prior to step (b), a degassing of all fluids is carried out, which come on the chromatography column, wherein that degassing preferably by at least one bubble trap and / or by at least one hydrophobic microfiltration membrane over Vacuum and / or by treatment with ultrasound and / or by bubbling with helium.
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WO (1) WO2016180797A1 (en)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10724029B2 (en) 2012-03-15 2020-07-28 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10785574B2 (en) 2017-12-14 2020-09-22 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US10975368B2 (en) 2014-01-08 2021-04-13 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11007457B2 (en) 2012-03-15 2021-05-18 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201908612D0 (en) * 2019-06-17 2019-07-31 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A method for separating biomolecules
GB202003835D0 (en) * 2020-03-17 2020-04-29 Johnson Matthey Plc Chromatographic method for separating platinum group metals
EP4164780A1 (en) 2020-06-16 2023-04-19 Boehringer Ingelheim International GmbH A method of providing a homogeneous feed stream within a plug flow reactor
CN114660189A (en) * 2020-12-24 2022-06-24 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司 Method for detecting ethyl maltol in edible oil

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4434051A (en) * 1982-06-07 1984-02-28 Uop Inc. Multiple valve apparatus for simulated moving bed adsorption processes
DE19711173A1 (en) * 1997-03-18 1998-09-24 Sartorius Gmbh Process and plant for adsorptive material separation
US7108789B2 (en) * 2002-07-29 2006-09-19 Calgon Carbon Corporation High performance continuous reaction/separation process using a continuous liquid-solid contactor
US20060246537A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-02 Jenkins Lauri L Multi-step process for the manufacture of therapeutic protein
EP1716900A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-02 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Method and device for chromatographic purification
US7544293B2 (en) * 2005-09-26 2009-06-09 Semba Inc. Valve and process for interrupted continuous flow chromatography
EP1775001A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-18 Xendo Holding B.V. Device for chromatographic separations
FR2898283B1 (en) * 2006-03-08 2011-07-15 Novasep METHOD AND DEVICE FOR SEPARATING FRACTIONS FROM A MIXTURE
CN101687119B (en) * 2007-06-15 2013-06-12 通用电气健康护理生物科学股份公司 Chromatography method
GB2452301A (en) 2007-08-30 2009-03-04 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Sterilization Method
CA2748348A1 (en) * 2009-01-06 2010-07-15 Chromacon Ag Multifraction purification processes and devices for such processes
KR101152036B1 (en) * 2010-04-27 2012-06-08 (주)셀트리온 A method to improve the sorbent efficiency of protein A chromatography using switching column with continuous feeding
EP2591349B1 (en) * 2010-07-07 2016-06-08 GE Healthcare Bio-Sciences AB Fluid mixing in a disposable fluid processing system
CN103221105B (en) * 2010-12-03 2015-11-25 通用电气健康护理生物科学股份公司 The system of biopolymer chromatography and technique
US20130260419A1 (en) * 2010-12-06 2013-10-03 Thomas C. Ransohoff Continuous processing methods for biological products
WO2013083482A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 Chromacon Ag Chromatographic method for the separation of fatty acid mixtures
EP2656892A1 (en) * 2012-04-23 2013-10-30 Merck Patent GmbH Chromatography method
EP2682168A1 (en) * 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
EP2772289B1 (en) * 2013-03-01 2015-05-06 ChromaCon AG Chromatographic process for enrichment and isolation
WO2014137903A2 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Genzyme Corporation Integrated continuous manufacturing of therapeutic protein drug substances
US10099156B2 (en) * 2013-04-08 2018-10-16 Chromacon Ag Chromatographic purification method

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11007457B2 (en) 2012-03-15 2021-05-18 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10724029B2 (en) 2012-03-15 2020-07-28 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US10975368B2 (en) 2014-01-08 2021-04-13 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US10785574B2 (en) 2017-12-14 2020-09-22 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller

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Publication number Publication date
CA2985679A1 (en) 2016-11-17
JP6676073B2 (en) 2020-04-08
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