EP3114487A1 - Nouvelles lectines et applications pour la détection de marqueurs d'états pathologiques - Google Patents

Nouvelles lectines et applications pour la détection de marqueurs d'états pathologiques

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EP3114487A1
EP3114487A1 EP15711300.2A EP15711300A EP3114487A1 EP 3114487 A1 EP3114487 A1 EP 3114487A1 EP 15711300 A EP15711300 A EP 15711300A EP 3114487 A1 EP3114487 A1 EP 3114487A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ter
lectin
lectins
modules
monomeric
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15711300.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Anne Imberty
Aymeric AUDFRAY
Julie ARNAUD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Joseph Fourier Grenoble 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3114487A1 publication Critical patent/EP3114487A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
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    • G01N2333/4724—Lectins
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    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes

Definitions

  • the subject of the invention is new lectins, which can be used, in particular, to specifically detect markers of pathological states.
  • Lectins are proteins of eukaryotic or prokaryotic origin which bind to sugars, mono-, oligo- and polysaccharides, in a generally reversible manner, with high specificity, without modifying them.
  • sugars On the cell surface, sugars are present in glycoconjugates resulting from their binding to proteins or lipids.
  • glycocana is generally used to refer to the sugars of glycoconjugates.
  • Lectins are usually multimeric proteins, by oligomerization or tandem repetition of monomeric units (hereinafter also referred to as "modules"), which gives them a key role in agglutination, affinity for the cell surface. , the recruitment of glycolipids, or the marking of tissues.
  • the peptide chains of each module have C-ter and N ⁇ ter ends and include glycans binding sites.
  • neoiectins new non-natural ectins, hereinafter referred to as neoiectins, using the concept of the natural muitlvalen of lectins and starting from lectins having an architecture of base adapted for the recognition of sugars on the outer surface of the cells.
  • This approach has made it possible to create, from the existing lectins, neoiectins of valence and / or specificity which can be modulated, of great interest for diagnostic applications, in particular in oncology.
  • the invention therefore aims at novel lectins or neoiectins, of high purity with optimized specificity.
  • It also relates to a process for obtaining these neoiectins, based on the molecular engineering of lectins of procaryotic or eukaryotic origin, making it possible to have a large quantity, in a reproducible manner and at a lower cost, compared with the production of directed antibodies. against oligosaccharide epitopes, products of high specificity.
  • the invention also aims to provide novel oligosaccharide markers of high specificity, for the recognition of cells, in particular certain pathological conditions, such as carcinogenesis.
  • Neoiectins can also be applied to identify glycans in other fields of application: characterization of molecules or cells in research laboratory, quality control in pharmaceutical or food production.
  • the lecines constituting the basic architecture for the neolectins of the invention are also referred to hereinafter as "reference lectins".
  • These are muStimeric proteins with a p-propeller type architecture, formed of monomeric modules of about 30 to 80 amino acids, in which the glycans binding sites are located on the same side of the proteins and the C-ends. ⁇ ter and N-ter peptide chains on the other side of the proteins, which gives them very strong binding properties on the cell surface glycans.
  • the invention relates to neolectins of this type, characterized in that they are formed from 4 to 7 monomer modules, one, or several or all of the adjacent modules being interconnected by linkers linking the N-terminal end. a module at the terminal end C of the adjacent module.
  • the invention relates to a monomeric neolectin, formed of a single peptide chain with a free C-ter end and a free N-ter end respectively, and comprising linkers connecting the other C-terminal ends and N ⁇ ter adjacent modules constituting the lectin.
  • the linkers are the same or different, and comprise peptide sequences of sufficient size to connect the C-ter and N-ter ends and advantageously comprise from 2 to 10 amino acids.
  • neolectins of different valences ranging from monovalent to multivalent. More particularly, the invention relates to neolectins as defined above, characterized in that they comprise, with respect to the reference lectin, peptide chains with zero, one or more mutations in the glycane binding site of one or more monomeric modules.
  • the monomeric neolectin of this embodiment is multivalent, having several glycan binding sites, or monovalent having a single glycans binding site,
  • the multivalent or monovalent monomeric neolectin is a recombinant protein including linkers between modules and may also comprise one or more mutations in one or more glycans binding sites of at least 1 module. constituent, relative to the reference lectin.
  • This provision confers on neolectin a specificity which can be modulated or modified as described below in relation to their method of production,
  • the basic architecture of these neoiectins advantageously corresponds to that of eukaryotic or prokaryotic lectins whose crystalfographic structures are known.
  • the lectins RSL (Ralstonia solanaearum lectin), BambBL (Burk ofderia ambifaria lectin), BC2LC ⁇ nt (Burkholderia cenocepacia lectin), HPA (Helix pomaîia lectin), discoidin (Qictyosfeiumium discoideum lectin), CTX -B (lectin of cholera toxin) and other bacterial toxins type B5, AAA (Anguilla angullia lectin) and adenovirus lectin.
  • RSL Radtonia solanaearum lectin
  • BambBL Burk ofderia ambifaria lectin
  • BC2LC ⁇ nt Burkholderia cenocepacia lectin
  • HPA Helix pomaîia lectin
  • discoidin Qictyosfeiumium discoideum lectin
  • the neolectome comprises, on the side comprising the C-ter and N-ter ends of the peptide chains, one or more Lysine-type functional groups. comprising an amino group which can be coupled to labeling molecules such as fluorophores and biotin or which can be activated to fix the lectin on a surface, for example Elisa plate, gold chip, glass chip.
  • the invention also relates to a process for obtaining neeolectins defined above.
  • This method is characterized in that it comprises, additionally, in a reference lectin as defined cklessus, linker sequences connecting the ends Oter and N-ter adjacent monomer units, at least two adjacent modules retaining their respective ends G ⁇ ter and N-ter fibers.
  • a multivalent monomeric neolectin consisting of a single peptic chain is obtained when all the C ter and N ter ends have been interconnected except for a site formed by two adjacent units with their C ter ends. and N-ter, respectively, free.
  • the linkers are introduced by protein engineering by inserting a nucleic acid sequence between the sequences encoding the peptide chains of the constituent modules of the reference lectin.
  • the step of passing a multivalent multivalent lectin to a monovalent monomeric lectin is advantageously coupled to a step of invalidating at least one site for fixing the peptide chains to the glycans, which makes it possible to modify the affinity of the lectin .
  • the invalidation step is carried out by point mutagenesis in the peptide chain by modifying the coding nucleic sequence for one or more of the amino acids involved in the sugar binding as identified by cristaflographfque analysis and replacing it with the coding sequence of the desired amino acids.
  • the structural data acquired for the targeted fectins provide a fine knowledge of their oligosaccharide binding sites.
  • the amino acids involved in the binding to sugars can be very precisely targeted.
  • site-directed mutagenesis it is therefore easy to replace the acid or acids important for sugar fixation with another that will not interact.
  • neolectin By disabling all binding sites for glycans, with the exception of one, monovalent, monomeric neolectin is obtained which can be manipulated by its conventional protein engineering tools. From the knowledge of the crystallographic structure of the protein, a specificity to a molecule of biological interest can then be obtained. If desired, the multivalence of faectin may be restored partially or completely.
  • the directed evolution is done by creating a phage display library of lecîines with a large diversity of amino acids in the slabs forming the recognition site, it is then possible to select the interesting mutants, by exampie on magnetic beads carrying the target epitope, then to characterize their specificity.
  • ELISA S puce àender .. makes it possible to check the specificity of neolectins.
  • Their affinity for the target oligosaccharide epitopes can be measured, for example, by mccocalorimetry of fixation and pfasmonic surface resonance.
  • the monovalent neolectins whose specificity has been modified can be used in the state, after labeling with fluorescent molecules on loops accessible on the far side of the glycannic site. They can also be transformed into multivalent lectins by mutagenesis by modifying each of the previously invalidated sites to give them the new specificity. These multivalent neolectins have a very strong affinity for the glycoconjugates present on the surface of cell membranes. Their marking on the face opposite to the attachment sites makes it possible to use them subsequently for the optimal recognition of the cell surface glycosylation.
  • these neolectins can be used, as a product or drug, in several fields of application involving the recognition of glycosylation epitopes on the cell surface, such as cell and cell labeling. tissue, targeting and vectorization, or inhibition of viral infection for example of HIV. Elias can also be used for the recognition of glycosylation of natural or recombinant proteins with a field of application in research laboratories or in quality control in the production of recombinant proteins such as therapeutic antibodies.
  • glycobiology glycobiology by tectin chips, purification column for glycoconjugates, labeling of modified cells, etc.
  • medical diagnosis identification of glycosylation change associated with certain pathological conditions such as inflammation and cancer
  • biotechnology control of glycosylation of recombinant proteins produced in eukaryotic cells, such as therapeutic antibodies
  • therapeutic applications targeting of active compounds and cellular internalisation, inactivation of entry of some viruses.
  • neolectins for the diagnosis and monitoring of certain cancerous tumors is of great interest for the detection of tumors and their margins, as well as the monitoring of their improvement or their degradation in the case of a treatment,
  • neolectins can also be used on chips to refine and standardize diagnostics. It should be noted that the neolectins of the invention can be compared to antibodies directed against carbohydrate epitopes, but have the advantage of being able to be produced more easily, in larger quantities and therefore at reduced cost. Neolectins will be produced in bacteria or eukaryotic cells by conventional biotechnology techniques. Additional labels or protein domains may be fused with neolectins to help with their production or purification. These domains may be cleaved neolectines or not, depending on the intended applications.
  • FIGS. 1 to 5 show, in FIG. 1, multimeric lectins used according to the invention, having their binding sites of the invention.
  • FIGS. 1 to 5 show, in FIG. 1, multimeric lectins used according to the invention, having their binding sites of the invention.
  • FIGS. 5A to 5C two orthogonal views (58) and a bottom view of the crystallographic structure of an RSL neolectin ⁇ complexed with fucose (5C),
  • a multivalent multimeric reference lectin (2A) consisting of 8 repetitive modules is used, each module being formed of a peptide chain comprising 2 terminal ends, respectively, N-ter and Cter, and having a glycans binding site represented by "0".
  • Linkers are added to connect the C-ter and -ter ends of 2 neighboring modules, except for 2 adjacent C-ter and -ler ends. free, which leads to a monomeric monomeric Sectin (2B), formed of a single peptide chain.
  • RSL neolectin consisting of 3 dimeric units 1-2, 3-4 and 5-6 is used.
  • the units 2; 3 and 4; 5 are linked by a linker of sequence SEQ ID No. 1, selected by SSTVPGD because of its similarity with natural linkers.
  • the nucleotide sequence coding for this peptide is inserted between the sequences coding for the peptide units in order to bind their ends C ⁇ ter and N ⁇ ter together at 2, 3 and 4; 5.
  • the nucleotide sequences encoding the 1-2, 2-3 and 4-5 motifs have previously been modified to show differences between them.
  • This strategy makes it possible to modify the binding sites, and thus to modify the valences at the chosen positions, which leads to different topoiogies.
  • FIG. 3 shows an RSL neolectin consisting of 3 RSL reference link modules linked by the linkers and seen from below and viewed from the side. A representation is also given for an HPA lectin with linkers,
  • FIGS. 4A, 4B and 4C show the sugar recognition site (4A: the respective amino acid contributions of the sugar binding site in terms of binding energy), the invalidation of the Arg site at position 17 (4B) of the initial peptide chain of the RSL module and Iectin with its 3 Arg sites invalidated (4C),
  • Example 3 Crystallographic structure of a neolectin obtained by protesque engineering
  • the protein was constructed from the triple replicafion of an RSL gene with inclusion of binding sequences as described above.
  • the protein was recombinantly produced in E. coli and characterized.
  • the affinity for fucose is identical to that of the reference iectin, and the stoichiometry is indeed 6 fucose sites per protein.
  • Figures 5A and 5B show that neolectin folds well into ⁇ -propeller type architecture, with six intact fucose sites, such as reference iectin.
  • the crystal structure of the neolectin / fucose complex is given in FIG. 5C with a resolution of 1.35 Ang.

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Abstract

Lectïnes muftiménques avec une architecture de type β -propeller, formées de modules monomères d'environ de 30 â 60 acides aminés, dans lesquels les sites de fixation aux glyeanes sont situés d'un même côté des protéines et les extrémités Oter et N-ter des chaînes pepfidiques de l'autre côté des protéines, caractérisées en ce qu'elles sont formées de 4 â 7 modules monomères, un seul, ou plusieurs ou la totalité des modules adjacents étant reliés entre eux par des iinkers liant l'extrémité N-terminafe d'un module â l'extrémité C-terminale du module adjacent,

Description

I
Nouvelles fectines et applications pour la détection de marqueurs d'états pathologiques
L'invention a pour objet des nouvelles lectines, utilisables, notamment, pour détecter spécifiquement des marqueurs d'états pathologiques.
Les lectines sont des protéines, d'origine eucaryote ou procaryote, qui se lient aux sucres, mono-, ollgo- et polysaccharides, de manière généralement réversible, avec une forte spécificité, sans les modifier. Sur la surface des cellules, les sucres sont présents dans des glycoconjugués résultant de leur liaison à des protéines ou à des lipides. Le ternie « glycana » est généralement employé pour désigner les sucres des glycoconjugués.
Las lectines sont habituellement des protéines muitimériques, par oligomérisation ou répétition en tandem de motifs monomériques (également désignés ci-après par le terme « modules »}, ce qui leur confère un rôle clé dans l'agglutination, l'affinité pour la surface cellulaire, le recrutement de glycolipides, ou encore le marquage de tissus.
Les chaînes peptidfques de chaque module présentent des extrémités C-ter et N~ter et comprennent des sites de fixation aux glycanes.
De nombreuses fonctions biologiques, par exemple fa signalisation cellulaire, la migration cellulaire, la reconnaissance immunitaire ou encore l'interaction avec des pathogènes, mettent en jeu des interactions entre protéines et glycanes. La mise à profit de ces interactions se heurte toutefois aux difficultés rencontrées dans la détermination de la structure des sucres impliqués.
Un effort important a été apporté ces dernières années à l'étude de leurs fonctions et des mécanismes de leur association avec des ligands spécifiques. La production de nouvelles lectines par bio-ingénierie reste cependant à œ jour un défi.
Mettant à profit leur expérience dans ce domaine, les inventeurs ont orienté leurs recherches vers la production de nouvelles ectines non-naturelles, appelées ci-après néoiectines, en utilisant 1e concept de la muitlvalen naturelle des lectines et en partant de lectines ayant une architecture de base adaptée pour la reconnaissance de sucres â la surface externe des cellules. Cette démarche a permis de créer, à partir des lectines existantes, des néoiectines de valence et ou de spécificité modulables, de grand intérêt pour des applications de diagnostic, en particulier en cancérologie.
L'invention vise donc de nouvelles lectines ou néoiectines, de grande pureté avec une spécificité optimisée.
Elle vise également un procédé d'obtention de ces néoiectines, basé sur l'ingénierie moléculaire de lectines d'origine procaryote ou eucaryote, permettant de disposer en grande quantité, de manière reproductible et à moindre coût, comparé â la production d'anticorps dirigés contre des épitopes oligosaccharidiques, de produits de grande spécificité.
L'invention a également pour but de fournir de nouveaux marqueurs oligosaccharidiques de grande spécificité, pour la reconnaissance des cellules, en particulier de certains états pathologiques, tels que la cancêrisaîion.
Elle vise également leur application pour la détection spécifique de giycoconjugués, marqueurs d'autres états pathologiques.
Les néoiectines peuvent aussi être appliquées pour identifier des glycanes dans d'autres domaines d'application : caractérfsation de molécules ou de cellules en laboratoire de recherche, contrôle de qualité dans les productions pharmaceutiques ou alimentaires.
Les leciines constituant l'architecture de base pour les néolectines de l'invention sont également désignées ci-après par « lectines de référence ». H s'agît des protéines muStimériques avec une architecture de type p-propeller, formées de modules monomères d'environ 30 à 80 acides aminés, dans lesquels tes sites de fixation aux glycanes sont situés d'un même côté des protéines et les extrémités C~ter et N-ter des chaînes peptidiques de l'autre côté des protéines, ce qui leur confère de très fortes propriétés de fixation sur les glycanes des surfaces cellulaires.
L'invention vise des néolectines de ce type, caractérisées en ce qu'elles sont formées de 4 à 7 modules monomères, un seul, ou plusieurs ou la totalité des modules adjacents étant reliés entre eux par des linkers liant l'extrémité N-terrninale d'un module â l'extrémité C erminale du module adjacent.
Selon ce mode de réalisation, l'invention vise une néolectine monomérique, formée d'une seule chaîne peptidique avec respectivement une extrémité C- ter et une extrémité N-ter libres, et comportant des linkers reliant les autres extrémités C-îer et N~ter des modules adjacents constitutifs de la lectine.
Les linkers sont identiques ou différents, et comprennent des séquences peptidiques de taille suffisante pour relier les extrémités C-ter et N-ter et comportent avantageusement de 2 à 10 acides aminés.
On mesurera que cette disposition fournit des néolectines de différentes valences, allant de la monovalence à la multivalence. Plus particulièrement, l'invention vise des néolectines telles que définies ci- dessus, caractérisées en ce qu'elles comportent, par rapport à la lectine de référence, des chaînes peptidiques avec zéro, une ou plusieurs mutations dans le site de fixation aux glycanes d'un ou plusieurs modules monomériques.
Ces mutations dans les lectines ont pour effet de moduler la spécificité en invalidant, comme souhaité, zéro, 1 ou plusieurs sites de fixation aux glycanes.
La néolectine monomérique de ce mode de réalisation est multivalente, possédant plusieurs sites de fixation aux glycanes, ou monovalente possédant un seul site de fixation aux glycanes,
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la néolectine monomérique, multivalente ou monovalente, est une protéine recombinante incluant des linkers entre modules et pouvant également comprendre une ou plusieurs mutations dans un ou plusieurs sites de fixation aux glycanes d'au moins 1 module constitutif, par rapport à la lectine de référence. Cete disposition confère à la néolectine une spécificité donnée, qui peut être modulée ou modifiée comme décrit ci-après an rapport avec leur procédé d'obtention,
Ces néoiectines recombinantes présentent l'avantage d'une grande pureté et reproductlbilité.
L'architecture de base de ces néoiectines correspond avantageusement à celle de lectines eucaryotes ou procaryotes dont les structures cristalfographiques sont connues.
Il s'agit de lect nes multîmériques présentant une proximité spatiale des extrémités N-terminafes et C-terminales de monomères adjacents, appropriées pour être transformées en néoiectines conformément à l'invention. On citera par exemple les lectines RSL (lectîne de Ralstonia solanaœarum), BambBL (lectîne de Burk ofderia ambifaria), BC2LC~nt (lectîne de Burkholderia cenocepacia), HPA (lectîne de Hélix pomaîia), discoïdine (lectîne de QictyosfeÎium discoideum), CTX-B (lectîne de la toxine de choiera) et d'autres toxines bactériennes de type B5, AAA (lectîne d'Anguilla angullia) et la lectîne d'adénovirus.
Les structures cristallographiques de RSL et de HPA, résolues par les inventeurs, sont données sur la figure 1 .
Selon une disposition de l'invention, prise en combinaison avec l'une quelconque des définitions ci-dessus, la néolectfne comprend, du côté comportant les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques, un ou plusieurs groupes fonctionnels de type Lysine comportant un groupement aminé qui peuvent être couplés à des molécules permettant le marquage tels que les fiuorophores et la biotine ou qui peuvent être activés pour fixer la lectîne sur une surface par exemple plaque Elisa, puce d'or, puce de verre.
L'invention vise également un procédé d'obtention des nêolectines définies ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, rajout, dans une lectîne de référence telle que définie cklessus, de séquences linkers reliant les extrémités Oter et N-ter des motifs monomères adjacents, au moins deux modules adjacents conservant leurs extrémités respectives G~ter et N-ter fibres.
Une néolectine monoméri ue multivalente, constituée d'une seule chaîne pepiîdique est obtenue lorsque toutes les extrémités C-ter et N~ter ont été reliées entre elles â l'exception d'un site formé par 2 motifs adjacents avec leurs extrémités C-ter et N-ter, respectivement, libres. Les linkers sont Introduits par Ingénierie protéique en insérant une séquence d'acides nucléiques entre les séquences codant pour les chaînes peptidiques des modules constitutifs de la lectine de référence.
L'étape de passage d'une lectine multîmérique multivalenta â une lectine monomérique monovalente est avantageusement couplée à une étape d'invalidation d'au moins un site de fixation des chaînes peptidiques aux glycanes, ce qui permet de modifier l'affinité de la lectine.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape d'invalidation est réalisée par mutagénèse ponctuelle dans la chaîne peptidique en modifiant la séquence nucléique codante pour un ou plusieurs des acides aminés impliqués dans la liaison au sucre tel qu'identifié par analyse cristaflographfque et en la remplaçant par la séquence codante des acides aminés souhaités.
Les données structurales acquises pour tes fectines ciblées apportent une connaissance fine de leurs sites de fixation aux oligosaccharides. Les acides aminés impliqués dans la liaison aux sucres (liaison hydrogène, contact hydrophobe, interaction électrostatique) peuvent être très précisément ciblés. Par mutagénèse dirigée, il est par conséquent aisé de remplacer le ou les acides importants pour la fixation au sucre par un autre qui n'interagira pas.
Grâce à la mise au point du gène avec dégénérescence contrôlée, il est possible d'invalider sélectivement le ou les site(s) de fixation sur la chaine protéique pour atteindre la valence choisie.
En invalidant tous les sites de fixation pour les glycanes, à l'exception d'un seul, on obtient une nêolectine monovalente et monomérique qui peut être manipulée par Ses outils classiques d'ingénierie protéique. A partir de la connaisance de la structure cristallographique de la protéine, une spécificité envers un giycanne d'intérêt biologique peut alors être obtenu. SI souhaité, la multivalenœ de fa ectine peut être rétablie partiellement ou en totalité.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'évolution dirigée se fait en créant par phage display une librairie de lecîines avec une grande diversité d'acides aminés dans les boudes formant le site de reconnaissance, il est ensuite possible de sélectionner les mutants intéressants, par exampie sur billes magnétiques portant l'épitope cible, puis de caractériser leur spécificité.
Différentes techniques (ELISAS puce à sucre..) permettent de vérifier la spécificité des néolectines. Leur affinité pour les épitopes oligosaccharides cibles peu* être mesurée par exemple par mlcrocalorîmétrie de fixation et résonance pfasmonique de surface.
Les néolectines monovalentes dont la spécificité a été modifiée peuvent être utilisées dans l'état, après marquage par molécules fluorescentes sur les boucles accessibles sur la face éloignée du site à glycanne. Elles peuvent être également transformées en lectines multivalentes par mutagénèse en modifiant chacun des sites précédemment invalidés pour leur attribuer la nouvelle spécificité. Ces néolectines multivalentes ont une affinité très forte pour les glycoconjugués présents à la surface des membrance cellulaires. Leur marquage sur la face opposées aux sites de fixation permet de les utiliser ensuite pour la reconnaissance optimale de la glycosylation de surface ceiiulalre.
En fonction de la valence et de la spécificité, ces néolectines peuvent être utiilisées, en tant que produit ou médicament, dans plusieurs domaines d'application impliquant la reconnaissance d'épitopes de glycosylation à la surface de cellules, comme le marquage de cellules et de tissus, le ciblage et la vectorisation, ou l'inhibition de l'infection virale par exemple de VIH. Elias peuvent être également utfisées pour la reconnaissance de la glycosyiation de protéines naturelles ou recombinantes avec un champ d'application dans les laboratoires de recherche ou dans le contrôle de qualité dans la production de protéines recombinantes telles que les anticorps thérapeutiques.
Ces domaines d'application vont de la recherche en glycobiologie (analyse de glycome par puces à tectîne, colonne de purification pour gfycoconjugués, marquage de cellules modifiées.. ,), au diagnostic médical (identification de changement de glycosyiation associé à certaines états pathologiques tels que l'inflammation et le cancer), à la biotechnologie (contrôle de la glycosyiation de protéines recombinantes produites en cellules eucaryotes, teis que les anticorps thérapeutiques), Jusqu'aux applications thérapeutiques {ciblages de composés actifs et internalisation cellulaire, inactivation de sites d'entrée de certains virus).
L'application des néolectlnes pour le diagnostic et le suivi de certaines tumeurs cancéreuses s'avère de grand intérêt pour la détection des tumeurs et de leurs marges, ainsi que le suivi de leur amélioration ou de leur dégradation dans te cas d'un traitement,
Ces néolectlnes peuvent également être utilisées sur des puces afin d'affiner et de standardiser les diagnostics. II convient de noter que les néolectlnes de l'invention peuvent être comparés aux anticorps dirigés contre des épitopes glucidiques, mais présentent l'avantage de pouvoir être produites plus facilement, en plus grandes quantités et donc à coût réduit. Les néolectlnes seront produites en bactéries ou en cellules eucaryotes par les techniques classiques de biotechnologie- Des étiquettes ou domaines protéiques supplémentaires pourront être fusionnés avec les néolectlnes pour aider à leur production ou s leur purification. Ces domaines pourront être clivés des néolectînes ou non, en fonction des applications envisagées.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et sont illustrés par les Figures 1 à 5, qui représentent tivernent, la Figure 1 , des lectînes multimériques utilisées selon l'invention, présentant leurs sites de fixation du même côté de la protéine les Figures 2Â à 2D, te schéma de production de néolectînes de valence et de spécificité modulables par ingénierie protéique, la Figure 3, des vues de dessous et de côté avec linkers d'une néofectine de SL et de HPA,
les Figures 4Â à 4C, llnactivation d'un site de reconnaissance dans tes chaînes peptidiques de 3 modules de RSL
les Figures 5A à 5C, deux vues orthogonafesiSÂ et 58) et une vue de dessous de la structure cristallographique d'une néolectin© de RSL complexée avec le fucose (5C),
Ê DÎOl§-»JLl™.Schérna de production d'une n
monovalente par transformation d'une lectine de référence
Comme illustré sur les Figures 2Â à 2D, on utilise une lectine de référence multimérique multivalente (2A) formée de 8 modules répétés, chaque module étant formé d'une chaîne peptidique comprenant 2 extrémités terminales, respectivement, N-ter et C~ter et comportant un site de fixation aux glycanes représenté par «0». Des linkers sont ajoutés pour relier les extrémités C-ter et -ter de 2 modules voisins, à l'exception de 2 extrémités adjacentes C-ter et -îer laissées libres, ce qui conduit à une Sectine monomérique muîtivalente (2B), formée d'une seule chaîne peptidique.
Par mutagénèse ponctuelle basée sur fa connaissance structurale de Sa lecti , on obtient une lectine monomérique monovatente (2C). La spécificité de Sa lectine (2C) est modifiée comme souhaité {évolution dirigée par phage display ou mutations ponctuelles basées sur les connaissances structurales) pour obtenir des néolectines de valence et spécificité contrôlées (2D). Exemple 2 ; Obtention de néolectines de SL de valence contrôlée
On utilise une néolectine de RSL formée de 3 motifs dimères 1-2, 3-4 et 5- 6. Les motifs 2 ;3 et 4 ;5 sont reliés par un linker de séquence SEQ ID N°1 ■ SSTVPGD sélectionné en raison de sa similarité avec des linkers naturels. La séquence nucléot dique codant pour ce peptide est insérée entre les séquences codant pour les motifs peptides pour lier entre elles Ses extrémités C~ter et N~ter en 2 ;3 et 4 ;5. Les séquences nucléotldiques codant pour les motifs 1-2, 2-3 et 4-5 ont été auparavant modifiées pour présenter des différences entre elles.
Cette stratégie permet de modifier les sites de liaison, et donc de modifier les valences aux positions choisies, ce qui conduit à différentes topoiogies.
La Figure 3 représente une néolectine de RSL constituée de 3 modules de la lecîine de référence RSL liés par les linkers et vue de dessous et vue de côté. Une représentation est également donnée pour une lectine de HPA avec des linkers,
Par mutagénèse dirigée, une Arginine en position 17 de la chaîne peptidique i l
initiale de 3 modules de RSL» a été remplacée par une Alanine afsn de supprimer le contact avec te glycane.
Les Figures 4A, 4B et 4C montrent le site de reconnaissance du sucre (4A : les contributions respectives des acides aminés du site de fixation au sucre en termes d'énergie de liaison), l'invalidation du site Arg en position 17 (4B) de la chaîne peptidique initiale du module de RSL et la Iectine avec ses 3 sites Arg invalidés (4C), Exemple 3 : Structure cristaiiographique d'une néolectine obtenue par ingénierie protésque,
La protéine a été construite à partir d© la triple réplicafion d'un gêne de RSL avec inclusion de séquences de liaison comme décrit ci-dessus. La protéine a été produite de manière recombinante dans £ coiî et a été caractérisée. L'affinité pour le fucose est identique à celle de la iectine de référence, et la stoech métrie est bien de 6 sites à fucose par protéine.
Les Figures 5A et 5B montrent que la néolectine se replie bien en architecture du type β-propeller, avec six sites à fucose intacts, comme la iectine de référence. Les
deux liaisons peptidiques qui ont été insérées présentent une certaine flexibilité : l'une est visible dans la carte de densité électronique alors que l'autre est plus flexible.
La structure cristaiiographique du complexe néolectine/Fucose est donnée sur la Figure 5C avec une résolution de 1 ,35 Âng.
A partir de cette néolectine monomérique monovalente, il est possible de réintroduire un ou plusieurs sites de fixation.

Claims

Revendications
1 - Lectlnes rnultirnériques avec une architecture de type β - ropeller, formées de modules monomères d'environ de 30 à 60 acides aminés, dans lesquels les sites de fixation aux glycanes sont situés d'un même côté des protéines et les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques de l'autre côté des protéines, caractérisées en ce qu'elles sont formées de 4 à 7 modules monomèresi un seul, ou plusieurs ou la totalité des modules adjacents étant reliés entre eux par des iinkers liant l'extrémité N~ferminaie d'un module à l'extrémité C-terminale du module adjacent.
2 - Lecfines selon la revendication 1 , caractérisées en ce qu'elles
comportent des chaînes peptidiques avec zéro, une ou plusieurs mutations dans ie site de fixation aux glycanes d'un ou plusieurs modules
3 » Lectlnes selon la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont monomériques, formées d'une seule chaîne pepfidique avec respectivement une extrémité C-ter et une extrémité N-ter libres, et comportant des Iinkers reliant les extrémités C-ter et N-ter des modules adjacents constitutifs de la lectine. 4 - Lectlnes selon la revendication 3, caractérisées en ce que les iinkers, identiques ou différentss comprennent des séquences peptidiques de taiife suffisante pour reiier les extrémités C-ter et N-ter et comportent
avantageusement de 2 à 10 acides aminés.
5 - Lectines selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectlnes mulfivalentes, possédant plusieurs sites de fixation aux glycanes, ou monovalentes possédant un seul site de fixation aux glycanes. 8 - Lestées selon la revendication S, caractérisées en ce qu'il s'agit de tectines monomériques, multivafëntes ou monovalentes, comprenant zéro, une ou plusieurs mutations dans un ou plusieurs sites de fixation aux gfycanes d'au moins 1 module constitutif.
7 Lectines selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que leur architecture de base correspond à celle de lectines
euearyotes ou procaryotes.
8 » Lectines seion la revendication 7, caractérisées en ce que leurs séquences peptidsques dérivent des lectines SL {lectine de Raistœia solanaceamm), BarnbBL (lectine de Burk oideria ambifaria), BC2LL-nt (lectlne de Burk oidaria œnoœpada, HPA (lectlne de H&Îsx pomatia), discoïdine {lectine de Diciyosieiium discoideu ), CTX-B (lectine de la toxine de choiera) et d'autres toxines bactériennes de type 85, AAA (lectine ù'Angw'iia anguiila) et la lectine d'adénovirus.
9 - Lectines selon Tune quelconque des revendications 1 à 8, caractérisées en ce qu'elles comprennent du côté comportant les extrémités C-ter et N~ter des chaînes peptidfques, un ou plusieurs groupes fonctionnels lysine présentant un groupement aminé permettant de lier des marqueurs tels que des fluorop ores, la biotine et d'attacher tes lectines sur une surface par exemple plaque Efssa, puce d'or, puce de verre.
10 ~ Procédé d'obtention de lectines définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout dans la lectine utilisée de séquences linkers reliant les extrémités C-ter et N~ter des motifs monomères adjacents, au moins deux modules adjacents conservant leurs extrémités respectives C~ter et -ter libres.
11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par l'obtention de lectines monomériques muitivalentes, constituées d'une seule chaîne peptldique en reliant toutes les extrémités G-ter et N-ter entre elles à l'exception d'un site formé par 2 motifs adjacents avec leurs extrémités oter et N-ters respectivement, libres. 12 ~ Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en que fesdïis linkers sont introduits par des séquences nuciéotidiques insérées entre tes séquences nucléotidiques codant pour les chaînes peptidiques des modules constitutifs de ia Iectine de référence, 13 - Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en que l'étape de passage d'une fectine mulfirnérique muffivatente â une iectine monomérsque monovaiente est couplée à une étape d'invalidation d'au moins un site de fixation des chaînes peptidiques aux gtycanes, ce qui permet ûe modifier l'affinité de la Iectine.
14 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en que l'étape d'invalidation est réalisée au niveau des acides nucléiques codant pour les chaînes peptidiques des modulas répétés de la Iectine et comprend l'insertion dans les séquences codantes des nudéotides permettant de coder pour la ou les mutations souhaitées.
15 -Iectine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation en tant que produit ou médicament pour la reconnaissance d'épitopes de glycosylatson à la surface de cellules, comme le marquage de cellules et de tissus, le ciblage et la valorisation, ou l'inhibition de l'Infection virale, par exemple de ViH.
16 - Lectine selon la revendication 15, pour utilisation en tant que produit ou médicament en glycobiologie pour l'analyse de glycome par puce à Iectine, dans des colonnes de purification pour gfycoconjugués, pour le marquage de cellules modifiées ; en diagnostic, notamment pour l'identification de changements de gl cosylatÊon associés à des états pathologiques, tels que l'inflammation et le cancer ; et en thérapeutique, en particulier pour le ciblage de composés actifs et intemalssatïon cellulaire ou i'Inactivai n de stes d'entrée de virus. i? - Leciïne selon la revendication 16, pour son utilisation en tant que produit ou médicament en biotechnologle pour la caractérisation de la glycosyfation de protéines recombinantes produites en cellules eucaryotes, tels que tes anticorps thérapeutiques.
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