EP3097209A1 - Nouvelle méthode de dépistage du cancer de la prostate - Google Patents

Nouvelle méthode de dépistage du cancer de la prostate

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Publication number
EP3097209A1
EP3097209A1 EP15704352.2A EP15704352A EP3097209A1 EP 3097209 A1 EP3097209 A1 EP 3097209A1 EP 15704352 A EP15704352 A EP 15704352A EP 3097209 A1 EP3097209 A1 EP 3097209A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
rm6p
gene
expression
prostate
subject
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15704352.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marcel Garcia
Ophélie VAILLANT
Xavier REBILLARD
Catherine MAZEROLLES
Magali Gary-Bobo
Alain Morere
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Languedoc Mutualite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3097209A1 publication Critical patent/EP3097209A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a new method of diagnosis or screening for prostate cancer.
  • Prostate cancer is the most common cancer in France and is the fourth leading cause of death in the population.
  • PSA prostate specific antigen
  • Prostate Specifies Antigen has been widespread and 70% of men over 50 years of age perform at least one PSA assay. a period of 3 years (2012 figures from the National Fund for the Health Insurance of Employees).
  • a prostate cancer lesion is histologically reflected by the loss of basal cells.
  • basal cell markers p63, CK 903, CK 5/6
  • p63, CK 903, CK 5/6 antibodies against basal cell markers
  • CK 903, CK 5/6 antibodies against basal cell markers
  • their specificity and sensitivity are limited, and non-cancerous lesions (adenosis, atypical adenomatous hyperplasia, atrophy or post atrophic hyperplasia) may present a discontinuity of basal cells, which makes interpretation difficult 5 ' 6 .
  • AMACR ® As examples of markers of prostate cancer cells other than PSA considered to date for diagnosis, mention may be made AMACR ® , GSTP1 Methyl ® and TMPRSS2-ETS ® .
  • AMACR ® (P504S) is the trade name of an antibody specific for the " ⁇ -methylacyl CoA Racemase" tissue protein that is over-expressed in prostate cancer 7 . This antibody has been developed to analyze the expression profile in prostate biopsies.
  • markers AMACR ®, methylated GSTP1 ®, TMPRSS2-ETS ®
  • AMACR ® methylated GSTP1 ®
  • TMPRSS2-ETS ® methylated GSTP1 ®
  • TMPRSS2-ETS ® methylated GSTP1 ®
  • TMPRSS2-ETS ® methylated GSTP1 ®
  • TMPRSS2-ETS ® methylated GSTP1 ®
  • prostate cancer The diagnosis of prostate cancer is currently made by pathological examination of a series of prostate biopsies (10 to 12 cores 17 mm long obtained by an 18 gauge needle). The samples are regularly distributed under ultrasound control on the prostate volume for mapping. Prostate cancer is heterogeneous and cancerous foci can emerge in either prostate lobe or both. The diagnosis of prostate cancer depends on the quality of the sample and how it is performed. In addition, despite histological observation and analysis of basal cell markers, some non-cancerous tissue lesions may mimic a cancer diagnosis or conversely, a cancerous lesion may escape diagnosis, requiring the addition of Tissue markers specific for prostate cancer cells.
  • One of the aims of the present invention is therefore to propose a method of diagnosing prostate cancer that does not have the drawbacks of those proposed to date.
  • Another object of the invention is to provide a specific method of diagnosis of prostate cancer.
  • Another object of the present invention is to diagnose prostate cancer when the latter is at an early stage. Another object of the invention is to diagnose a small prostate cancer.
  • the present invention results from the surprising and unexpected discovery of tissue-level overexpression of the cation-independent mannose 6-phosphate receptor (hereinafter referred to as RM6P-CI) in prostate cancer epithelial cells relative to healthy prostate cells.
  • RM6P-CI tissue-level overexpression of the cation-independent mannose 6-phosphate receptor
  • RM6P-CI is overexpressed in a large majority of prostate cancer tissue but that it is not in healthy prostate tissue.
  • RM6P-CI is a ubiquitous 300 kDa receptor present on the cell surface. It is involved in many biological functions and mainly in the addressing of enzymes to the lysosome 9 . These lysosomal enzymes have mannose 6-phosphate residues (M6P) allowing them to be recognized and then internalized by the RM6P-CI.
  • M6P mannose 6-phosphate residues
  • RM6P-CI is also called Insulin Growth Factor 2 receptor (IGF2) since it has a TIGF2 binding site and is involved in the degradation of this mitogen 4 .
  • IGF2R Insulin Growth Factor 2 receptor
  • IGF2R have the same nucleotide sequence and are in fact the same gene (gene identified by the number” 3482 "as of January 15, 2015).
  • the genomic sequence of RM6P-CI (or IGF2R) is located on chromosome 6 and is described under accession number NCBI, NG_011785.1.
  • the corresponding mRNA sequence is described under accession number NCBI, NM_000876.2 and the protein sequence under accession number NP_000867.2.
  • RM6P-CI has been characterized as a tumor suppressor gene.
  • the RM6P-CI receptor In liver, breast, lung, ovarian or even adenocortical tumors, the RM6P-CI receptor exhibits a loss of heterozygosity and numerous somatic mutations 10 ' 11 ' 12 . Post-transcriptional and post-translational modifications result in decreased expression of the receptor RM6P-CI in these cancers, except for breast cancer where its concentration is unchanged between healthy and cancerous tissues 13.
  • the role of tumor suppressor for the RM6P-CI gene has been proposed through overexpression induction 14 or conversely inhibition of the expression of RM6P-IC 15 .
  • overexpression of RM6P-CI decreases the ability of cells to induce tumors and decreases the rate of tumor growth.
  • inhibition of RM6P-CI increases cell growth and decreases the apoptotic index.
  • the inventors overcame a technical prejudice by showing that the RM6P-CI gene is a relevant marker in the screening or diagnosis of prostate cancer.
  • RM6P-CI a new marker of the invention
  • the present invention relates to a method for in vitro diagnosis of prostate cancer in a subject characterized in that it comprises a step of measuring the level of expression of the RM6P-CI gene in a prostate tissue sample of said subject the determination of overexpression of said RM6P-CI gene being indicative of the presence of prostate cancer in said subject.
  • the "diagnostic method” of the invention may also be called “diagnostic method”.
  • the method of the invention is implemented for the diagnosis, prognosis and / or evaluation of the evolution of a cancer.
  • overexpression of the RM6P-CI gene in prostate tissue indicative of prostatic cancer in a subject, overexpression of the RM6P-CI gene in prostate tissue indicative of prostatic cancer.
  • diagnosis means the determination of a condition of a person affected by a given pathology, and "prognosis” the evaluation of the degree of severity and the subsequent course of a pathology.
  • overexpression of the RM6P-CI gene means an expression of the RM6P-CI gene at the level of the prostatic tissue which is at least three times greater than the expression of this gene at the level of a non-cancerous prostate tissue.
  • prostate tissue sample is a prostate cancer tissue sample, in other words, the subject to which said sample belongs has prostate cancer.
  • This overexpression will be at least three times greater, but may for example be ten, twenty or even a hundred times greater than the expression of the gene of the
  • RM6P-CI in a "normal", that is, non-cancerous, prostate tissue.
  • the subject of the present invention is a method for the in vitro diagnosis of prostate cancer in a subject characterized in that it comprises the following steps:
  • a higher expression level means for example a protein expression (measured by various techniques such as Western blots, ELIS A, biosensors, receptor-specific ligands or any method of quantifying a protein or a receptor) to a minimum 3 times higher than that of a reference biological sample corresponding, for example, to healthy prostate tissue.
  • a protein expression measured by various techniques such as Western blots, ELIS A, biosensors, receptor-specific ligands or any method of quantifying a protein or a receptor
  • a reference biological sample corresponding, for example, to healthy prostate tissue.
  • it is also possible to evaluate the overexpression of the RM6P-CI gene in a prostatic tissue by evaluating the percentage of the cells of said prostate tissue which are stained by an immunohistological test.
  • the presence of a 3-fold increase in immunohistochemical staining in more than 10% of the epithelial cells is indicative of prostate cancer tissue.
  • the "subject" within the meaning of the present invention refers to a vertebrate individual, in particular a mammal, more particularly a man.
  • prostatic tissue sample means all or part of the prostate taken from a subject or a patient.
  • the prostatic tissue comprises prostate cells, said cells possibly being cancerous cells or healthy cells.
  • the prostate tissue sample taken from the subject or the patient is derived from a prostate biopsy.
  • the “reference biological sample” is obtained from human cell cultures or tissue samples.
  • the biological reference sample designates a biological sample as defined above derived from:
  • the invention allows the monitoring and monitoring of a patient suffering from prostate cancer and undergoing anticancer treatment.
  • the method according to the invention is further characterized in that the step of measuring the level of expression of the RM6P-CI gene is a step of measuring, in a prostate tissue sample, the level of expression:
  • transcription products in particular mRNA and / or
  • Overexpression of the transcription products, in particular the mRNA, and / or overexpression of the translation products, in particular the RM6P-CI protein, is then indicative of prostate cancer, said overexpression being as defined above ( increase by a factor of at least three of the expression level of the transcription and / or translation products).
  • Measurement of the level of expression of the RM6P-CI target gene can be achieved by any technique known to those skilled in the art.
  • the level of expression of the RM6P-CI gene at the nucleic and / or protein level is advantageously measured, for example by measuring the amount of transcribed mRNA and / or measuring the amount of mRNA. of RM6P-CI protein using at least one specific method for measuring the level of expression of RM6P-CI.
  • RNA chip any appropriate technique for quantifying mRNA, such as an RNA chip, methods LCR (“Ligase Chain Reaction”), TMA (“Transcription Mediated Amplification”), PCE (“enzyme amplified immunoassay”) and DNA (“branched DNA signal amplification”) etc.
  • the overexpression of the RM6P-CI gene is determined when the expression of said RM6P-CI gene is at least three times greater than that of said gene in a non-cancerous prostate tissue.
  • the step of measuring the level of expression of the translation products of the RM6P-CI gene, in particular the RM6P-CI protein is by immunohistochemically labeling said RM6P-CI translation products in said prostate tissue sample of said subject.
  • the analysis of the immunohistochemical staining of the translation products is evaluated by staining the cells of the prostate tissue sample, staining of more than 10% of said cells being indicative of overexpression of said translation products of said gene.
  • RM6P-CI on cytological material or on tissue sections.
  • this step is done on a chip.
  • said chip is a chip of the "Multi Array Fabric” type.
  • microchips in diagnostics allows, on a miniaturized format, the size of a glass slide, the analysis and visualization of molecular targets in a large number of tissue samples simultaneously, at the DNA level, RNA or protein.
  • a chip makes it possible to obtain immunohistochemical (IHC) expression profiles from archived fixed tissues, included in paraffin but also from fresh or frozen tissues.
  • IHC immunohistochemical
  • the step of measuring the level of expression of the RM6P-CI protein in a prostate tissue sample is done using the polyclonal IgY 415 antibody.
  • This IgY 415 antibody was established in hen 18 and previously described for immunohistochemical analysis 19 .
  • the subject of the invention is also an RM6P-CI specific antibody for use in an in vitro method for diagnosing prostate cancer in a subject, said antibody making it possible to measure the level of expression of the prostate cancer gene.
  • RM6P-CI in a prostate tissue sample of said subject determining overexpression of said RM6P-CI gene being indicative of the presence of prostatic cancer in said subject.
  • the expression of the RM6P-CI gene may for example also be detected by ligand binding.
  • the specific binding of mannose 6-phosphate analogs to RM6P-CI receptors can be quantified 9 .
  • this RM6P-CI receptor is a multifunctional protein because it is also the specific receptor for IGF2 (Insulin-like Growth Factor 2) 4 .
  • IGF2 Insulin-like Growth Factor 2
  • the expression of the RM6P-CI gene can still be detected by biosensors either on prostatic tissues taken by biopsies or directly in situ on prostatic tissues of the subject.
  • these biosensors may be, for example, made of optical fibers introduced into the prostate by techniques known to those skilled in the art. It is also possible, for in situ detection, to inject intravenously, in the subject to be diagnosed, nanoparticles. Once injected, these nanoparticles will accumulate preferentially in the cancerous tissue.
  • the subject of the present invention is also a method for the in vivo diagnosis of a prostate cancer in a subject, characterized in that it comprises a step of measuring the level of expression of the mannose 6-phosphate cation receptor independent gene ( RM6P-CI gene) in the prostate tissue of said subject, determining overexpression of said RM6P-CI gene in said prostate tissue indicative of the presence of prostate cancer in said subject.
  • RM6P-CI gene mannose 6-phosphate cation receptor independent gene
  • the step of measuring the level of expression of the RM6P-CI gene in the prostatic tissue will be, for example, a step of measuring the level of expression of the translation products, in particular the RM6P-1 protein. CI in said tissue.
  • the subject of the invention is also an RM6P-CI-specific antibody for use in an in vivo diagnostic method for prostate cancer in a subject, said antibody making it possible to measure the level of expression of the prostate cancer gene.
  • RM6P-CI in the prostate tissue of said subject determining overexpression of said RM6P-CI gene being indicative of the presence of prostatic cancer in said subject.
  • kits comprising at least one reagent specific for the product of the expression of the RM6P-CI gene, preferably chosen from:
  • nucleic sequence capable of specifically hybridizing with a fragment of the mRNA encoding RM6P-CI
  • the present invention further relates to a method for therapeutic treatment of prostate cancer in a subject, characterized in that it comprises:
  • A) a method for in vitro or in vivo diagnosis of prostate cancer in a subject comprising a step of measuring the level of expression of the RM6P-CI gene, the determination of an overexpression of said RM6P-CI gene being indicative of the presence of prostate cancer in said subject,
  • step B) is a conventional treatment step for prostate cancer.
  • step B) is a conventional treatment step for prostate cancer.
  • radiotherapy such as external beam radiotherapy and brachytherapy
  • hormone therapy hormone therapy
  • step B The choice of the therapeutic strategy implemented in step B) depends, among other things, on the characteristics of the cancer as diagnosed in step A).
  • FIGS. 1 and 2 The invention will be better understood in the light of the following nonlimiting and purely illustrative examples, and FIGS. 1 and 2.
  • Figure 1 illustrates the expression patterns of the RM6P-CI receptor in various prostate cancer tissues (Fig. 1a) and in healthy prostatic tissues (Fig. 1b). The scale indicated represents 500 ⁇ .
  • Figure 2 shows two types of immunohistochemical markings of the RM6P-CI gene.
  • the indicated scale represents 100 ⁇ .
  • Figures 2a and 2b illustrate the overexpression of RM6P-CI in cancerous prostate tissue because of their labeling (coloring symbolized by solid arrows) using the anti-RM6P-CI IgY 415 antibody.
  • the cell nuclei are reported by hollow arrows.
  • Figures 2c and 2d illustrate healthy prostate tissue.
  • Figures 2e and 2f illustrate the immunohistochemical analysis of two parts of the same sample in the absence (Fig. 2e) or in the presence (Fig. 2f) of an excess of purified RM6P-CI to block immunostaining.
  • the biopsies are performed routinely and finalize the diagnosis as soon as digital rectal examination is suspect or the total PSA level is higher than 4.
  • the urologist first performs an endorectal ultrasound to locate the location where the biopsy will be performed, which is then performed as a series of 10 to 12 (or more if necessary) samples using a needle with automatic release.
  • the duration of the sampling is very short (5-15 minutes) and the examination is painless. Complications that occur after a biopsy are rare and antibiotic treatment is performed to prevent possible infection.
  • the pathologist then examines the biopsies by histopathological examination in order to establish or not the presence of cancer cells and / or by immunohistochemical examination to study the expression of the desired RM6P-CI marker.
  • anti-RM6P-CI IgY 415" or more simply “IgY 415" in what follows, is used to measure the levels of expression of RM6P-CI in human prostate tissues.
  • RM6P-CI is specifically directed against the human RM6P-CI 18 receptor.
  • the specificity of this antibody for the RM6P-CI receptor has been previously demonstrated by immunohistochemical studies in breast cancers 19 .
  • Prostatic tissue expression analysis was performed by immunohistochemical staining of RM6P-CI on eight TMA slides from the pathology department ofière University Hospital (Dr. Catherine Mazerolles). Each of these slides has 16 prostate cancerous or healthy specimens belonging to 8 different patients (2 samples per patient).
  • the tissues are dewaxed, rehydrated and then treated with pronase at 0.1% in phosphate saline (PBS) for 10 min at 37 ° C. Between each step the samples are washed with a solution of PBS-Tween 20 0.1%. Endogenous peroxidases are blocked by a solution of hydrogen peroxide 1% for 15 minutes. The slides are then incubated for 30 minutes at 37 ° C. with a solution of PBS + Gamma Globulin Bovine (BGG) 0.5% + goat serum diluted 1/40 to saturate non-specific sites. The primary IgY 415 antibody is diluted to 1/1800 in PBS + 0.5% BGG solution and incubated on tissues overnight at 4 ° C.
  • PBS phosphate saline
  • IgY 415 antibodies bound specifically to RM6P-CI are revealed using a polyclonal anti-chicken secondary antibody made in rabbits and coupled to peroxidase
  • the cell nuclei are thus stained in blue / violet by hematoxylin and are symbolized in FIG. 2 by hollow arrows.
  • the overexpression of the RM6P-CI is indicated by the brown coloring and is symbolized in Figure 2 by solid arrows.
  • the slides were scanned with Nanozoomer-XR (Hamamatsu) and the immunohistochemical staining of RM6P-CI was analyzed.
  • results are expressed as a function of the percentage of stained cells and the type of staining (perinuclear or dispersed in the cytoplasm),
  • the tissue analyzed is considered positive (the cancerous tissue) if more than 10% of the cells are stained brown.
  • Non-cancer samples include 39 normal and 2 benign hypertrophic tissues.
  • Each sample was both analyzed by a pathologis to determine the Gleason scores corresponding to the severity of the cancer and immunostained using an anti-M6PR antibody (IgY 145 antibody).
  • the cell nuclei were stained with hematoxylin.
  • Figure 1 illustrates the expression patterns of the RM6P-CI receptor in three different prostate cancers (Fig 1a) and in three healthy prostate tissues (Fig 1b).
  • the difference in immunohistochemical staining of RM6P-CI between healthy and cancerous tissues is very important at this magnification. In healthy tissues, only the labeling of nuclei with hematoxylin is visible.
  • Figure 2 shows at a high magnification the characteristics of immunohistochemical staining by the anti-RM6P-CI antibody.
  • Prostate cancerous tissues are differentially labeled since staining of prostate cancer tissues indicated two strong types of labeling (two expression patterns) considered positive (Fig 2a and 2b).
  • the first type of staining observed in 23% of the samples, is granular and perinuclear. This coloration is the vector (Fig. 2a) and is generally observed in normal tissues rich in RM6P The '14' l3.
  • the second type of staining observed in 61% of the samples, is also granular but more diffused in the cytoplasm of the cell (Fig. 2b).
  • Table 1 below shows the percentage of labeled cells in cancerous and healthy prostate tissues.
  • labeled cells As a reminder, a higher level of 10% of labeled cells was set by the inventors as an indicator of prostate cancer tissue.
  • the labeled cells are also designated by "labeled RM6P-CI cells” or "colored RM6P-CI cells”.
  • prostate cancer samples Of 126 prostate cancer samples, a total of 106 samples - 84% prostate cancer samples - have more than 10% of labeled cells. Of 31% prostate cancer samples, more than 60% of the cells are labeled. In contrast, of the 41 healthy samples, less than 3% of the cells are labeled.
  • Table 2 shows the overexpression of the RM6P-CI receptor (% RM6P-CI positive) in 126 prostate cancer samples according to Gleason grade.
  • % RM6P-CI positive indicates that the percentage of samples having a labeled cell level for the RM6P-CI is greater than 10%.
  • the gravity and the risk of progression of prostate cancers are estimated thanks to the Gleason grade, also called Gleason score (score ranging from 2 to 10), taking into account the change in the morphology of the prostatic glands towards an increasing lack of differentiation.
  • Gleason grade also called Gleason score (score ranging from 2 to 10)
  • RM6P-CI Immunohistochemical staining of RM6P-CI according to Gleason scores indicates that RM6P-CI is overexpressed (positive staining) for both low grade cancer (such as Grade 4) and high cancer grades
  • Prostate cancer tissue samples provided by Dr. Xavier Rébillard (Clinique Beausoleil, Montpellier), were fixed with 4% paraformaldehyde, paraffin-embedded and cut with Leica microtome (Leica Biosystems) in 5 ⁇ thick sections. Two consecutive sections of the same sample were used. The labeling protocol remains identical but the IgY 415 antibody (1/1000) is incubated beforehand for 90 min at 37 ° C. with a solution of highly concentrated RM6P-Cl (1.24 mg / ml) in PBS or with a solution of PBS containing 1.24 mg / ml of bovine gamma globulin (control).
  • Biopsies are derived from prostatectomies performed for the treatment of advanced cancers.
  • the tissue removed is frozen at -80 ° C. and then fixed by incubation for 20 seconds in methanol at a temperature of -20 ° C.
  • the frozen sections of 6 ⁇ are prepared and incubated for 30 min at room temperature with the antibodies (dilution 1/300) in the phosphate buffer.
  • the level of expression of the RM6P-CI was measured using a computerized image analyzer (SAMBA, Alcatel Grenoble France) according to the method described in Berthe 19 .
  • Non-specific staining is evaluated using an identical concentration of IgY antibody from a non-immunized animal (negative control).
  • Table 3 describes the level of expression of RM6P-CI in frozen sections of 5 samples according to the determination of the "QIC score" with the RM6P IgY 415 antibody or the control antibody (non-specific).
  • immunohistochemical staining is 3.4 to 5 times higher than that of normal tissues.
  • the cancer marking obtained with the anti-RM6P-CI antibody is specific because it is 4.75 to 6 times higher than that obtained for the same concentration of a non-specific IgY antibody.
  • the immunohistochemistry assay can therefore be performed on freezing sections of the prostatic tissue.
  • This type of cut advantageously makes it possible to establish a rapid diagnosis (early) after the sampling by the clinician.
  • an "extemporaneous" diagnosis is thus available immediately after the removal of prostate tissue from a subject to be diagnosed.
  • RM6P-CI has previously been observed in isolated cancer cell lines in culture, including in a prostate cancer line 16 . It has been shown in Huang et al. 16 that the prostate cancer cell line LNCaP expressed RM6P-CI, while other prostate cancer cell lines PC-3 and DU-145 do not express little or RM6P IT.
  • a cell line is an artificial system subject to culture artifacts, such as the presence of fetal calf serum essential for the survival of the cell line, and therefore the results. obtained with a cell line can not be generalized even more if the results obtained with other comparable cell lines are different.
  • the RM6P-CI was considered a tumor suppressor gene since many studies have described a decrease in the expression of RM6P-CI in several types of cancers.
  • PSA prognostic marker
  • RM6P-CI overexpression of RM6P-CI in cancerous prostate tissue makes it possible to envisage the use of said RM6P-CI as a diagnostic tool for the detection of prostate cancer by anatomopathologists.
  • RM6P-CI RM6P-CI
  • This new marker RM6P-CI screening and diagnosis of prostate cancer according to the invention therefore advantageously to overcome the deficiencies and limitations of current diagnostic tools.
  • the present invention provides a specific marker for prostate tumor cells since RM6P-CI is overexpressed only in prostate cancer cells (and not in healthy prostate tissue).
  • the present invention further provides a novel cancer cell marker that can be measured on prostatic tissue in situ in the patient by methods using optical fiber or nanoparticle biosensors.
  • the method of the invention may further comprise, in addition to measuring the level of expression of the RM6P-CI gene, measuring the level of expression of one or more immunohistochemical markers known to date.
  • immunohistochemical markers mention may be made of markers of basal type cells (also called "basal type markers"), chosen in particular from p63, CK 903 or CK 5/6, or other cell markers. cancerous, especially selected from AMACR ® , GST1 methylated ® or TMPRSS2-ETS ® .

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Abstract

La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'un cancer prostatique chez un sujet caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mesure du niveau d'expression du gène du récepteur mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.

Description

Nouvelle méthode de dépistage du cancer de la prostate
La présente invention a pour objet une nouvelle méthode de diagnostic ou de dépistage du cancer de la prostate.
Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent en France et représente la quatrième cause de mortalité dans la population. Dans les faits, le dépistage individuel par dosage du taux d'antigène prostatique spécifique (« PSA » : « Prostate Spécifie Antigen ») s'est largement répandu et 70% des hommes de plus de 50 ans réalisent au moins un dosage de PSA sur une période de 3 ans (chiffres 2012 provenant de la Caisse Nationale de l'Assurance Maladie des Travailleurs Salariés).
Soixante-dix mille nouveaux cas de cancer de la prostate sont diagnostiqués chaque année en France.
Cependant deux grandes études randomisées, l'une américaine (« PLC03 » : « Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian Cancer Screening Trial), l'autre européenne (« ERSPC », « European Randomized Study of Screening for Prostate Cancer ») ont apporté des résultats contradictoires quant à l'utilité et le bénéfice du dépistage par dosage de PSA 1 ' 2 ' 3. Le rapport d'orientation sur le cancer de la prostate publié en février 2012 par la Haute Autorité de Santé, et une publication dans le Bulletin du Cancer mettent en évidence le caractère imparfait du dosage de PSA, du toucher rectal et « l'absence à ce jour de marqueur et d'examen de dépistage ou de diagnostic permettant d'identifier précocement les formes de cancer de la prostate ». Ils soulignent également «l'importance de la recherche sur des tests de dépistage performants et des marqueurs permettant de distinguer les formes agressives des formes indolentes».
Une lésion cancéreuse prostatique se traduit histologiquement par la perte de cellules basales. Actuellement, des anticorps dirigés contre des marqueurs de cellules basales (p63, CK 903, CK 5/6) sont utilisés en clinique afin de réaliser le diagnostic. Cependant leur spécificité et leur sensibilité restent limitées, et des lésions de type non cancéreux (adénoses, hyperplasie adénomateuse atypique, atrophie ou hyperplasie post atrophique) peuvent présenter une discontinuité des cellules basales, ce qui rend l'interprétation difficile5'6.
A titre d'exemples de marqueurs de cellules cancéreuses prostatiques autres que le PSA envisagés à ce jour pour le diagnostic, on pourra citer AMACR®, GSTP1 méthylé® et TMPRSS2-ETS®. L'AMACR® (P504S) est le nom commercial d'un anticorps spécifique de la protéine tissulaire « a-méthylacyl CoA Racemase » qui est hyper-exprimée dans les cancers de la prostate7. Cet anticorps a ainsi été développé afin d'analyser le profil d'expression dans les biopsies prostatiques.
Cependant lesdits marqueurs (AMACR®, GSTP1 méthylé®, TMPRSS2-ETS®) présentent des limites car ils sont également surexprimés dans les hyperplasies prostatiques bénignes . D'autre part, certains cancers de la prostate ne sont pas diagnostiqués par ces marqueurs. Ainsi, aucun consensus n'a été trouvé à ce jour pour leur utilisation clinique.
Le diagnostic du cancer de la prostate est réalisé actuellement par l'examen anatomopathologique d'une série de biopsies de la prostate (10 à 12 carottes de 17 mm de long obtenues par une aiguille de 18 gauge). Les prélèvements sont répartis régulièrement sous contrôle échographique sur le volume prostatique pour réaliser une cartographie. Le cancer de la prostate est hétérogène et des foyers cancéreux peuvent émerger dans l'un ou l'autre lobe prostatique ou les deux. Le diagnostic de cancer de la prostate est dépendant de la qualité du prélèvement et des modalités de sa réalisation. De plus, malgré l'observation histologique et l'analyse des marqueurs de cellules basales, certaines lésions tissulaires non cancéreuses peuvent mimer un diagnostic de cancer ou à l'inverse, une lésion cancéreuse peut échapper au diagnostic, ce qui nécessite l'addition de marqueurs tissulaires spécifiques des cellules cancéreuses prostatiques.
Il est donc d'un grand intérêt de pouvoir disposer de nouveaux outils spécifiques pour faciliter le diagnostic, l'estimation de l'agressivité tumorale et des risques individuels de progression pour orienter le choix de prise en charge du patient et éviter de laisser évoluer des lésions cancéreuses.
L'un des buts de la présente invention est donc de proposer une méthode de diagnostic du cancer de la prostate ne présentant pas les inconvénients de celles proposées à ce jour.
Un autre but de l'invention est de proposer une méthode de diagnostic spécifique du cancer de la prostate.
Un autre but de la présente invention est de diagnostiquer un cancer de la prostate lorsque ce dernier se trouve à un stade précoce. Un autre but de l'invention est de diagnostiquer un cancer de la prostate de petite taille.
La présente invention résulte de la découverte surprenante et inattendue de la surexpression au niveau tissulaire du récepteur mannose 6-phosphate cation- indépendant (dénommé ci-après RM6P-CI) dans les cellules épithéliales cancéreuses de la prostate par rapport aux cellules prostatiques saines.
En effet, contre toute attente, les Inventeurs ont démontré que le RM6P-CI est surexprimé dans une large majorité des tissus prostatiques cancéreux mais qu'il ne l'est pas dans les tissus prostatiques sains.
Cette découverte inattendue permet d'envisager l'intérêt du RM6P-CI en tant que marqueur spécifique en vue d'une utilisation diagnostique.
Le RM6P-CI est un récepteur ubiquitaire de 300 kDa présent à la surface des cellules. Il est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques et principalement dans l'adressage des enzymes vers le lysosome9. Ces enzymes lysosomales disposent de résidus mannose 6-phosphate (M6P) leur permettant d'être reconnues puis internalisées par le RM6P-CI.
Le RM6P-CI est aussi appelé récepteur à l'Insuline Growth Factor 2 (IGF2) puisqu'il dispose d'un site de liaison à TIGF2 et est impliqué dans la dégradation de ce mitogène4. Ainsi, le RM6P-CI ou TIGF2R, encore appelés ci-après « gène du RM6P-CI », « récepteur RM6P-CI », ou « gène de l'IGF2R » ou « récepteur
IGF2R », présentent la même séquence nucléotidique et sont en réalité le même gène (gène identifié par le numéro « 3482 » au 15 Janvier 2015). La séquence génomique du RM6P-CI (ou IGF2R) est située sur le chromosome 6 et est décrite sous le numéro d'accès NCBI, NG_011785.1. La séquence ARNm correspondante est décrite sous le numéro d'accès NCBI, NM_000876.2 et la séquence protéique sous le numéro d'accès NP_000867.2.
Lors de la carcinogenèse, le profil d'expression de nombreux gènes et protéines se trouve modifié. Dans de précédentes études réalisées sur de multiples cancers, le RM6P-CI a été caractérisé comme un gène suppresseur de tumeur.
Dans les cancers du foie, du sein, du poumon, des ovaires ou encore les tumeurs adéno-corticales, le récepteur RM6P-CI présente une perte d'hétérozygotie et de nombreuses mutations somatiques10'11'12. Les modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles entraînent une diminution de l'expression du récepteur RM6P-CI dans ces cancers, excepté pour le cancer du sein où sa concentration est inchangée entre tissus sains et cancéreux 13. Dans certaines cellules cancéreuses, le rôle de suppresseur de tumeur pour le gène RM6P-CI a été proposé grâce à des expériences d'induction de surexpression14 ou à l'inverse d'inhibition de l'expression du RM6P-CI15. Dans le premier cas, la surexpression du RM6P-CI diminue la capacité des cellules à induire des tumeurs et diminue le taux de croissance tumorale. A l'inverse, l'inhibition du RM6P-CI augmente la croissance cellulaire et diminue l'index apoptotique.
Il a été montré par Huang et al.16 la présence d'auto-anticorps anti-RM6P-CI chez 7 malades atteints de cancer prostatique sur 23. Cependant, ce résultat n'a pas orienté l'homme de l'art vers la recherche d'une surexpression du RM6P-CI provenant du tissu cancéreux pour deux raisons: d'une part, comme décrit précédemment le RM6P-CI était considéré comme un gène suppresseur de tumeur, dont l'expression se trouvait donc diminuée dans les cancers, et d'autre part il était clairement publié dans l'art antérieur que le meilleur marqueur circulant pronostique, le PSA, était produit par les cellules prostatiques saines et plus faiblement par les cellules cancéreuses17.
Après de nombreux travaux, les Inventeurs ont surmonté un préjugé technique en montrant que le gène RM6P-CI constitue un marqueur pertinent dans le dépistage ou diagnostic du cancer prostatique.
L'utilisation du nouveau marqueur de l'invention, à savoir le RM6P-CI, est spécifique du cancer de la prostate et présente de ce fait un grand intérêt pour le diagnostic dudit cancer.
La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'un cancer prostatique chez un sujet caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.
La « méthode de diagnostic » de l'invention peut encore être dénommée « procédé de diagnostic ».
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention est mise en œuvre pour le diagnostic, le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'un cancer prostatique chez un sujet, une surexpression du gène du RM6P-CI dans le tissu prostatique étant indicative du cancer prostatique.
On entend par « diagnostic » la détermination d'une affection d'une personne atteinte par une pathologie donnée, et par « pronostic » l'évaluation du degré de gravité et de l'évolution ultérieure d'une pathologie.
On entend par « surexpression du gène du RM6P-CI », une expression du gène du RM6P-CI au niveau du tissu prostatique qui est au moins trois fois supérieure à l'expression de ce gène au niveau d'un tissu prostatique non cancéreux.
Dans ce cas, lorsque l'expression du gène du RM6P-CI est augmentée d'un facteur d'au moins 3 dans un échantillon de tissu prostatique, alors on pourra conclure que ledit échantillon de tissu prostatique est un échantillon de tissu prostatique cancéreux, autrement dit, le sujet auquel appartient ledit échantillon est atteint d'un cancer de la prostate.
Cette surexpression sera au moins trois fois supérieure, mais pourra par exemple être dix, vingt ou même cent fois supérieure par rapport à l'expression du gène du
RM6P-CI dans un tissu prostatique « normal », c'est-à-dire non cancéreux.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'un cancer prostatique chez un sujet caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
(i) de mesure quantitative du niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet ;
(ii) de comparaison dudit niveau d'expression dudit sujet avec le niveau d'expression du gène du RM6P-CI d'un échantillon biologique de référence.
Lorsque le niveau d'expression du RM6P-CI est plus élevé quantitativement d'un facteur d'au moins 3 dans l'échantillon de tissu prostatique du sujet à diagnostiquer que dans l'échantillon biologique de référence, on peut conclure à un cancer de la prostate.
Un niveau d'expression plus élevé signifie par exemple une expression protéique (mesurée par diverses techniques telles que le Western blots, ELIS A, biocapteurs, ligands spécifiques du récepteur ou toute méthode de quantification d'une protéine ou d'un récepteur) au minimum 3 fois supérieure à celle un échantillon biologique de référence correspondant par exemple à du tissu prostatique sain. Outre l'évaluation quantitative telle que ci-dessus décrite, il est également possible d'évaluer la surexpression du gène du RM6P-CI dans un tissu prostatique par évaluation du pourcentage des cellules dudit tissu prostatique qui sont colorées par un test immunohistologique. Ainsi, dans un prélèvement de tissu prostatique, la présence d'une augmentation de 3 fois du marquage immunohistochimique dans plus de 10% des cellules épithéliales est indicative d'un tissu prostatique cancéreux.
Le « sujet » au sens de la présente invention désigne un individu vertébré, en particulier un mammifère, plus particulièrement un homme.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon de tissu prostatique », tout ou partie de la prostate prélevée chez un sujet ou un patient. Le tissu prostatique comprend des cellules prostatiques, lesdites cellules pouvant être des cellules cancéreuses ou des cellules saines.
On dispose de cet échantillon de tissu prostatique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon de tissu prostatique prélevé chez le sujet ou le patient est issu d'une biopsie prostatique.
L' « échantillon biologique de référence » est obtenu à partir de cultures cellulaires humaines ou de prélèvements tissulaires. L'échantillon biologique de référence désigne au sens de la présente invention un échantillon biologique comme défini ci- dessus issu :
- d'une lignée cellulaire humaine (normale ou cancéreuse) en culture dont l'expression du gène RM6P-CI est connue pour être faible,
- d'un sujet sain, à savoir ne présentant pas de cancer prostatique,
- d'un sujet en rémission du cancer prostatique,
- d'un sujet dont le diagnostic de cancer est à établir par des biopsies multiples et dont une ou plusieurs de ces biopsies présente(nt) une expression faible du gène RM6P-CI, ou
- d'un sujet dont l'expression du gène RM6P-CI est connue et associée à un stade clinique particulier.
Dans ce dernier cas, l'invention permet le suivi et le monitoring d'un patient souffrant de cancer prostatique et subissant un traitement anticancéreux. La méthode selon l'invention est encore caractérisée en ce que l'étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI est une étape de mesure, dans un échantillon de tissu prostatique, du niveau d'expression :
- des produits de transcription, en particulier l'ARNm et/ou
- des produits de traduction, en particulier la protéine RM6P-CI.
Une surexpression des produits de transcription, en particulier l'ARNm, et/ou une surexpression des produits de traduction, en particulier la protéine RM6P-CI, est alors indicative d'un cancer de la prostate, ladite surexpression étant telle que définie précédemment (augmentation d'un facteur d'au moins trois du niveau d'expression des produits de transcription et/ou de traduction).
La mesure du niveau d'expression du gène cible du RM6P-CI peut être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, on mesure avantageusement le niveau d'expression du gène du RM6P-CI au niveau nucléique et/ou protéique, par exemple en mesurant la quantité d'ARNm transcrit et/ou en mesurant la quantité de protéine RM6P-CI à l'aide d'au moins une méthode spécifique de mesure du niveau d'expression du RM6P-CI.
Les techniques permettant de détecter l'expression du gène du RM6P-CI au niveau nucléique sont bien connues de l'homme du métier. La détection peut notamment être réalisée par RT-PCR quantitative en temps réel, une technique microfluidique, une puce à ADN, le séquençage à haut débit des ARNm, ou toute technique appropriée de quantification de l'ARNm, telle que puce à ARN, méthodes LCR (« Ligase Chain Reaction »), TMA (« Transcription Mediated Amplification »), PCE (« enzyme amplified immunoassay ») et ADNb (« branched DNA signal amplification ») etc.
Les techniques permettant de détecter l'expression du gène du RM6P-CI au niveau protéique sont également bien connues de l'homme du métier et peuvent notamment inclure la cytométrie en flux, l'immunohistochimie semi-quantitative, l'immunocytochimie quantitative, l'ELISA cellulaire, le test protéique Taqman(R) (Taqman(R) Protein Assay, Applied Biosystems), des puces à protéines ou anticorps couplés ou non à la spectrométrie de masse, la liaison de ligands, la détection sur biocapteurs, la détection par fibres optiques, etc. Selon l'invention, dans la méthode de diagnostic in vitro telle que définie ci- dessus, la surexpression du gène du RM6P-CI, et en particulier la surexpression des produits de transcription et/ou des produits de traduction du gène du RM6P-CI, est déterminée (établie) lorsque l'expression dudit gène du RM6P-CI est au moins trois fois supérieure à celle dudit gène dans un tissu prostatique non cancéreux.
Selon l'invention, dans la méthode de diagnostic in vitro telle que définie ci- dessus, l'étape de mesure du niveau d'expression des produits de traduction du gène du RM6P-CI, en particulier la protéine RM6P-CI, se fait par analyse du marquage immunohistochimique desdits produits de traduction du RM6P-CI dans ledit échantillon de tissu prostatique dudit sujet.
Plus particulièrement, l'analyse du marquage immunohistochimique des produits de traduction est évaluée par coloration des cellules de l'échantillon de tissu prostatique, une coloration de plus de 10% desdites cellules étant indicative d'une surexpression desdits produits de traduction dudit gène.
Le marquage immunohistochimique permet la détection spécifique du gène du
RM6P-CI sur du matériel cytologique ou sur des coupes tissulaires. Typiquement, cette étape s'effectue sur une puce. Préférentiellement, ladite puce est une puce de type « Tissu Multi Array ».
L'utilisation de puce en diagnostic permet, sur un format miniaturisé, de la taille d'une lame de verre, l'analyse et la visualisation de cibles moléculaires dans un grand nombre d'échantillons tissulaires simultanément, au niveau de l'ADN, de l'ARN ou de la protéine. Typiquement, l'utilisation d'une puce permet d'obtenir des profils d'expression par immunohistochimie (IHC) à partir de tissus archivés fixés, inclus en paraffine mais également à partir de tissus frais ou congelés. L'utilisation d'une telle puce tombe dans les compétences normales de l'homme du métier.
Plus particulièrement, l'étape de mesure du niveau d'expression de la protéine RM6P-CI, dans un échantillon de tissu prostatique, se fait à l'aide de l'anticorps polyclonal IgY 415.
Cet anticorps IgY 415 a été établi chez la poule 18 et préalablement décrit pour l'analyse immunohistochimique19.
L'invention a encore pour objet un anticorps spécifique du RM6P-CI pour son utilisation dans une méthode de diagnostic in vitro du cancer prostatique chez un sujet, ledit anticorps permettant de mesurer le niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.
Ainsi qu'évoqué précédemment, l'expression du gène du RM6P-CI pourra par exemple être également détectée par la liaison de ligands. Par exemple, la liaison spécifique d'analogues du mannose 6-phosphate sur les récepteurs RM6P-CI peut être quantifiée9. Par ailleurs, ce récepteur RM6P-CI est une protéine multifonctionnelle car il est aussi le récepteur spécifique de l'IGF2 (Insulin-like Growth Factor 2)4. La liaison de TIGF2 sur son site spécifique de très grande affinité constitue un moyen efficace de quantifier l'expression de ce récepteur RM6P-CI dans le tissu prostatique.
L'expression du gène du RM6P-CI peut encore être détectée par des biocapteurs soit sur des tissus prostatiques prélevés par biopsies, soit directement in situ sur des tissus prostatiques du sujet.
Pour une détection in situ, ces biocapteurs peuvent être, à titre d'exemple, constitués de fibres optiques introduites dans la prostate par des techniques connues de l'homme de l'art. Il est également possible, pour une détection in situ, d'injecter par voie intraveineuse, chez le sujet à diagnostiquer, des nanoparticules. Une fois injectées, ces nanoparticules s'accumuleront préférentiellement dans le tissu cancéreux.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vivo d'un cancer prostatique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mesure du niveau d'expression du gène du récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (gène du RM6P-CI) dans le tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI dans ledit tissu de la prostate étant indicative de la présence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet.
Dans une telle méthode de diagnostic, l'étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans le tissu prostatique sera par exemple une étape de mesure du niveau d'expression des produits de traduction, en particulier la protéine RM6P- CI dans ledit tissu.
L'invention a encore pour objet un anticorps spécifique du RM6P-CI pour son utilisation dans une méthode de diagnostic in vivo du cancer prostatique chez un sujet, ledit anticorps permettant de mesurer le niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans le tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.
Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène du RM6P-CI, choisi de préférence parmi :
un anticorps monoclonal ou polyclonal ;
un ligand, naturel ou synthétique du RM6P-CI;
tout autre type de molécules ou macro-molécules capables d'interagir de manière spécifique avec la protéine RM6P-CI ;
une séquence nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour RM6P-CI,
pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'un cancer prostatique chez un sujet.
La présente invention a encore pour objet une méthode de traitement thérapeutique du cancer prostatique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- A) une méthode de diagnostic in vitro ou in vivo du cancer prostatique chez un sujet comprenant une étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet,
- B) le traitement du cancer ainsi diagnostiqué.
Typiquement, l'étape B) est une étape classique de traitement du cancer de la prostate. On peut citer à titre d'exemple:
la chirurgie,
la radiothérapie (telle que la radiothérapie externe et la curiethérapie), l'hormonothérapie,
la chimiothérapie,
- le traitement par ultrasons focalisés de haute intensité,
la cryothérapie,
la prostatectomie,
la thérapie photodynamique. Le choix de la stratégie thérapeutique mise en œuvre dans l'étape B) dépend, entre autre, des caractéristiques du cancer telles que diagnostiquées en étape A).
Les praticiens pourront également considérer d'autres critères tels que :
la taille de la tumeur,
- l'atteinte ou non des ganglions lymphatiques voisins par des cellules cancéreuses, et/ou
la présence ou non de métastases dans d'autres parties du corps, la présence de récepteurs des androgènes ou d'autres biomarqueurs (PS A,
AMACR®, etc.).
L'invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs et purement illustratifs suivants, et des figures 1 et 2.
La figure 1 illustre les profils d'expression du récepteur RM6P-CI dans différents tissus prostatiques cancéreux (Fig. la) et dans des tissus prostatiques sains (Fig. lb). L'échelle indiquée représente 500 μιη.
La figure 2 montre deux types de marquages immunohistochimiques du gène du RM6P-CI. L'échelle indiquée représente 100 μιη.
Les figures 2a et 2b illustrent la surexpression du RM6P-CI dans les tissus prostatiques cancéreux du fait de leur marquage (coloration symbolisée par des flèches pleines) à l'aide de l'anticorps anti-RM6P-CI IgY 415. Les noyaux cellulaires sont signalés par des flèches creuses.
Les figures 2c et 2d illustrent des tissus prostatiques sains.
Les figures 2e et 2f illustrent l'analyse immunohistochimique de deux parties du même échantillon en l'absence (Fig. 2e) ou en présence (Fig. 2f) d'un excès du RM6P-CI purifié afin de bloquer l'immunomarquage.
Exemple 1 : Etude de l'expression tissulaire du RM6P-CI par méthode immunohistochimique dans des échantillons inclus en paraffine,
Cet exemple décrit de manière détaillée la technique de marquage immunohistochimique du RM6P-CI sur des lames "Tissu Multi Array" (TMA) de tissus prostatiques cancéreux ou sains. En effet, le caractère tissulaire du nouveau marqueur RM6P-CI de l'invention nécessite une analyse par immunomarquage de biopsies prostatiques selon le même protocole que celui utilisé sur les lames TMA.
Les biopsies sont réalisées en routine et finalisent le diagnostic dès lors que le toucher rectal est suspect ou que le taux de PSA total est supérieur à 4.
L'urologue réalise au préalable une échographie endorectale afin de localiser l'endroit ou va être effectuée la biopsie qui est ensuite réalisée sous forme d'une série de 10 à 12 (ou davantage si nécessaire) prélèvements à l'aide d'une aiguille à déclenchement automatique.
La durée du prélèvement est très courte (5-15 minutes) et l'examen peu douloureux. Les complications survenant après une biopsie sont rares et un traitement antibiotique est réalisé en prévention d'une éventuelle infection.
L'anatomopathologiste examine ensuite les biopsies par examen histopathologique afin d'établir ou non la présence de cellules cancéreuses et/ou par examen immunohistochimique afin d'étudier l'expression du marqueur RM6P-CI recherché.
1. Protocole du marquage
L'anticorps polyclonal dénommé « anti-RM6P-CI IgY 415 » ou plus simplement « IgY 415 » dans ce qui suit, est utilisé afin de mesurer les niveaux d'expression du RM6P-CI dans les tissus prostatiques humains.
Cet anticorps de haute affinité, purifié à partir d'œufs de poule immunisée avec le
RM6P-CI, est dirigé spécifiquement contre le récepteur humain RM6P-CI 18. La spécificité de cet anticorps pour le récepteur RM6P-CI a été préalablement démontrée par les études immunohistochimiques dans les cancers du sein19.
L'analyse de l'expression tissulaire prostatique a été réalisée par marquage immunohistochimique du RM6P-CI sur huit lames TMA provenant du service de pathologie du CHU de Toulouse (Dr Catherine Mazerolles). Chacune de ces lames comporte 16 échantillons prostatiques cancéreux ou sains appartenant à 8 patients différents (2 échantillons par patient).
Les tissus sont déparaffinés, réhydratés puis traités par la pronase à 0,1% dans une solution saline de phosphate (PBS) durant 10 mn à 37°C. Entre chaque étape les échantillons sont lavés à l'aide d'une solution de PBS-Tween 20 à 0,1%. Les peroxydases endogènes sont bloquées grâce à une solution d'eau oxygénée 1% durant 15 mn. Les lames sont ensuite incubées 30 mn à 37°C avec une solution de PBS + Gamma Globuline Bovine (BGG) 0,5% + sérum de chèvre dilué à 1/40 afin de saturer les sites aspécifiques. L'anticorps primaire IgY 415 est dilué à 1/1800 dans une solution de PBS + 0,5 % BGG et incubé sur les tissus durant une nuit à 4°C.
Les anticorps IgY 415 fixés spécifiquement au RM6P-CI sont révélés à l'aide d'un anticorps secondaire polyclonal anti-poule fait chez le lapin et couplé à la peroxydase
(Sigma). L'anticorps secondaire dilué à 1/300 est incubé durant 30 mn à température ambiante. Enfin, un substrat de la peroxydase, le tétrachlorure de 3,3' di- aminobenzidine (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France), est incubé durant 20 mn et sa précipitation aboutit à un précipité brun/marron. Les échantillons sont contre- colorés par l'hématoxyline puis déshydratés à nouveau.
Les noyaux cellulaires sont ainsi colorés en bleu/violet par l'hématoxyline et sont symbolisés dans la figure 2 par des flèches creuses. La surexpression du RM6P-CI est indiquée par la coloration marron et est symbolisée dans la figure 2 par des flèches pleines.
2. Quantification de l'immunomarquage
Les lames ont été scannées au Nanozoomer-XR (Hamamatsu) et le marquage immunohistochimique du RM6P-CI a été analysé.
Les résultats sont exprimés en fonction du pourcentage de cellules colorées et du type de coloration (périnucléaire ou dispersée dans le cytoplasme),
Le tissu analysé est considéré comme positif (Le. tissu cancéreux) si plus de 10% des cellules sont colorées en marron.
Toutes les coupes de tissu sont analysées et quantifiées par deux pathologistes différents.
3. Résultats de l'analyse du marquage immunohistochimique du RM6P-CI
Au total une collection de 167 échantillons de prostate humaine recueillis par prostatectomie et fixés en paraffine a été sélectionnée par un anatomopathologiste. Parmi ceux-ci, 126 échantillons étaient clairement identifiés comme tissus cancéreux et 41 étaient identifiés comme tissus non cancéreux sur la base de leur analyse histologique. Les échantillons non cancéreux comprennent 39 tissus prostatiques normaux et 2 hypertrophies bénignes.
Chaque échantillon a été à la fois analysé par un pathologis te pour déterminer les scores de Gleason correspondant à la gravité du cancer et immunocoloré en utilisant un anticorps anti-M6PR (anticorps IgY 145). Les noyaux cellulaires ont été colorés par l'hématoxyline.
La Figure 1 illustre les profils d'expression du récepteur RM6P-CI dans trois cancers de la prostate différents (Fig. la) et dans trois tissus prostatiques sains (Fig. lb). La différence de marquage immunohistochimique du RM6P-CI entre les tissus sains et cancéreux est très importante à ce grossissement. Dans les tissus sains, seul le marquage des noyaux par l'hématoxyline est visible.
La Figure 2 montre à un fort grossissement les caractéristiques du marquage immunohistochimique par l'anticorps anti-RM6P-CI. Les tissus prostatiques cancéreux sont marqués de manière différente puisque la coloration des tissus de cancer de la prostate a indiqué deux types de marquage forts (deux profils d'expression) considérés comme positifs (Fig. 2a et 2b).
Le premier type de coloration, observé dans 23% des échantillons, est granulaire et périnucléaire. Cette coloration est la plus classique (Fig. 2a) et est généralement observée dans les tissus normaux riches en RM6PL'' 14' l3.
Le deuxième type de coloration, observé dans 61% des échantillons, est également granulaire mais plus diffusé dans le cytoplasme de la cellule (Fig. 2b).
Ces deux types de marquages indiquent une surexpression des RM6P-CI.
En revanche, Ses cellules épithéliales ne sont pas colorées dans Ses tissus prostatiques normaux, ce qui suggère que la surexpression est spécifique des cellules malignes (Fig. 2c, 2d).
En conclusion des figures 1 et 2, on note de manière surprenante que les cellules épithéliales des tissus prostatiques sains ne sont pas marquées par l'anticorps, ces tissus expriment donc peu le RM6P-CI, tandis que les tissus prostatiques cancéreux surexpriment le récepteur RM6P-CI.
Le tableau 1 ci-dessous indique le pourcentage de cellules marquées dans des tissus prostatiques cancéreux et sains.
Tableau 1 % de cellules R6MP-CI Tissu prostatique Tissu prostatique marquées cancéreux (126) (%) non cancéreux (41) %
0 - 3 % 0 (0) 41 (100)
3 - 10 % 20 (16) 0 (0)
10 - 30 % 28 (22) 0 (0)
30 - 60 % 39 (31) 0 (0)
60 - 100 % 39 (31) 0 (0)
Pour rappel, un taux supérieur de 10% de cellules marquées a été fixé par les Inventeurs comme indicateur d'un tissu prostatique cancéreux, Les cellules marquées sont encore désignées par « cellules RM6P-CI marquées » ou « cellules RM6P-CI colorées »,
Sur 126 échantillons prostatiques cancéreux, 106 échantillons au total - soit 84% d'échantillons prostatiques cancéreux - présentent plus de 10% de cellules marquées. Sur 31 % d'échantillons prostatiques cancéreux, plus de 60% des cellules sont marquées. En contraste, sur l'ensemble des 41 échantillons sains, moins de 3% des cellules sont marquées.
Le tableau 2 ci-dessous indique la surexpression du récepteur RM6P-CI (% RM6P-CI positif) dans 126 échantillons prostatiques cancéreux en fonction du grade de Gleason. Le terme « % RM6P-CI positif » indique que le pourcentage d'échantillons possédant un taux de cellules marquées pour le RM6P-CI est supérieur à 10%.
La gravité et le risque d'évolution des cancers de la prostate sont estimés notamment grâce au grade de Gleason encore appelé score de Gleason (Score allant de 2 à 10) prenant en compte la modification de la morphologie des glandes prostatiques vers une indifférenciation croissante.
Tableau 2 Grade de Gleason (nombre d'échantillons) % RM6P-CI positif
Grade 4 (2) 100
Grade 5 (8) 75
Grade 6 (30) 90
Grade 7 (56) 80
Grade 8 (23) 83
Grade 9 (6) 100
Grade 10 (1) 100
Total : 126 échantillons 84%
L'analyse du marquage immunohistochimique du RM6P-CI selon les scores de Gleason indique que le RM6P-CI est surexprimé (coloration positive) aussi bien pour des faibles grades de cancer (tel que le grade 4) que pour des forts grades de cancer
(tel que le grade 10).
En conclusion, l'analyse immunohistochimique de 126 cancers de la prostate montre une surexpression du RM6P-CI dans 84 % des cas alors que la surexpression de ce récepteur est non détectable dans 41 biopsies prostatiques saines ou hyperplasiques bénignes.
Ces résultats permettent d'envisager le RM6P-CI pour son utilisation comme biomarqueur dans le diagnostic d'un cancer prostatique chez un sujet.
4. Spécificité de l'immunomarquage
Afin de valider la spécificité de l'immunomarquage et les résultats obtenus, une expérience de réversion du marquage immunohistochimique a été réalisée par saturation préalable de l'anticorps IgY 415 par un excès d'antigène RM6P-CI.
Des échantillons de tissus prostatiques cancéreux, fournis par le Dr Xavier Rébillard (Clinique Beausoleil, Montpellier), ont été fixés par du paraformaldéhyde 4%, inclus en paraffine et coupés au microtome Leica (Leica Biosystems) en sections de 5 μιη d'épaisseur. Deux sections consécutives d'un même échantillon ont été utilisées. Le protocole de marquage reste identique mais l'anticorps IgY 415 (1/1000) est incubé au préalable pendant 90 mn à 37°C avec une solution de RM6P-CI fortement concentrée (1,24 mg/ml) dans du PBS ou avec une solution de PBS contenant 1,24 mg/ml de gamma- globuline bovine (témoin). L'analyse des deux conditions a permis de valider la spécificité du marquage RM6P-CI car la saturation de l'anticorps IgY 415 avec un excès de récepteur RM6P- CI a bloqué la coloration immunohistochimique (Fig. 2f) observée sur la lame témoin (Fig. 2e).
Exemple 2 : Marquage immunohistochimique des RM6P-CI par immunohistochimie de biopsies cancéreuses congelées et de tissu normal congelé.
Les biopsies sont issues de prostatectomies réalisées pour le traitement de cancers avancés. Le tissu prélevé est congelé à -80°C puis fixé par incubation pendant 20 secondes dans le méthanol à une température de -20°C. Les sections congelées de 6 μιη sont réalisées et incubées pendant 30 min à température ambiante avec les anticorps (dilution 1/300) dans le tampon phosphate.
Le niveau d'expression du RM6P-CI a été mesuré à l'aide d'un analyseur d'image informatisé (SAMBA, Alcatel Grenoble France) selon la méthode décrite dans Berthe19.
Les résultats sont exprimés en « valeurs arbitraires » obtenues par la formule du « QIC score » (« Quantitative Immuno Cytochemical score ») = (Pourcentage de surface colorée des cellules épithéliales) X (Moyenne de l'intensité de coloration) X 10.
Le marquage spécifique est obtenu en utilisant l'anticorps IgY 415 (dilution 1/1000).
Le marquage non spécifique est évalué en utilisant une concentration identique d'un anticorps IgY provenant d'un animal non immunisé (témoin négatif).
Le tableau 3 ci-dessous décrit le niveau d'expression du RM6P-CI dans des coupes congelées de 5 prélèvements selon la détermination du « QIC score » avec l'anticorps RM6P IgY 415 ou l'anticorps témoin (non spécifique).
Tableau 3 :
Dosage du niveau d'expression du RM6P-CI sur des coupes à congélation provenant de trois prélèvements de cancers de la prostate et de deux prélèvements de tissus prostatiques normaux par la méthode du « QIC score ». Cancers Anticorps anti RM6P-CI Anticorps non spécifique prostatiques QIC Score QIC Score
(moyenne + écart-type) (moyenne + écart-type)
Patient 1 95 + 15 20 + 4
Patient 2 85 + 10 17 + 5
Patient 3 110 + 10 18 + 5
Tissu normal 1 22 + 5 19 + 6
Tissu normal 2 22 + 5 22 + 4
Ces résultats montrent une expression quantifiable et intense dans les cellules cancéreuses.
Dans les tissus cancéreux, le marquage immunohistochimique est de 3,4 à 5 fois plus élevé que celui des tissus normaux. Le marquage des cancers obtenu avec l'anticorps anti RM6P-CI est spécifique car il est de 4,75 à 6 fois plus élevé que celui obtenu pour la même concentration d'un anticorps IgY non spécifique.
Le dosage par immunohistochimie peut donc être réalisé sur des coupes à congélation du tissu prostatique. Ce type de coupe permet avantageusement d'établir un diagnostic rapide (précoce) après le prélèvement par le clinicien. On dispose ainsi selon l'invention d'un diagnostic « extemporané », ayant lieu immédiatement après le prélèvement de tissu prostatique d'un sujet à diagnostiquer.
CONCLUSION
L'expression du RM6P-CI a précédemment été observée dans des lignées de cellules cancéreuses isolées en culture, y compris dans une lignée cancéreuse prostatique16. Il a ainsi été montré dans Huang et al.16 que la lignée cellulaire cancéreuse prostatique LNCaP exprime RM6P-CI, tandis que les autres lignées cellulaires prostatiques cancéreuses PC-3 et DU- 145 n'expriment pas ou très peu RM6P-CI.
Cependant, le marquage sur une lignée cellulaire prostatique cancéreuse isolée ne peut en aucun cas laisser présager une surexpression du RM6P-CI dans l'ensemble des tissus prostatiques cancéreux. En effet, une lignée cellulaire est un système artificiel soumis à des artéfacts de culture, comme par exemple la présence de sérum de veau fœtal indispensable à la survie de la lignée cellulaire, et donc les résultats obtenus avec une lignée cellulaire ne peuvent pas être généralisés d'autant plus si les résultats obtenus avec d'autres lignées cellulaires comparables sont différents.
Par ailleurs, ainsi que décrit précédemment, le RM6P-CI était considéré comme un gène suppresseur de tumeur puisque de nombreux travaux ont décrit une diminution de l'expression du RM6P-CI dans plusieurs types de cancers.
Pour finir, l'homme de l'art savait aussi que le meilleur marqueur circulant pronostique, le PSA, était produit essentiellement par les cellules prostatiques saines.
Ainsi, de par l'enseignement de l'état de la technique, aucune analyse de l'expression du RM6P-CI et comparaison du tissu d'une prostate « saine » et d'une prostate « cancéreuse » n'ont été réalisées jusqu'à ce jour.
Les résultats de la surexpression du RM6P-CI dans les tissus prostatiques cancéreux sont donc très inattendus puisqu'ils vont à l'encontre des connaissances de l'art antérieur et permettent de vaincre un préjugé technique.
La surexpression du RM6P-CI dans les tissus prostatiques cancéreux permet d'envisager l'utilisation dudit RM6P-CI comme outil de diagnostic pour le dépistage des cancers de la prostate par les anatomopathologistes.
L'absence de surexpression du RM6P-CI par les tissus prostatiques sains exclut avantageusement les problèmes récurrents de faux positifs et de sur-diagnostics observés avec d'autres marqueurs potentiels (comme par exemple AMACR) .
Ce nouveau marqueur RM6P-CI de dépistage et de diagnostic du cancer de la prostate selon l'invention permet donc avantageusement de pallier les déficiences et les limites des outils de diagnostic actuels.
La présente invention propose un marqueur spécifique des cellules tumorales prostatiques puisque le RM6P-CI est surexprimé uniquement dans les cellules cancéreuses des tissus prostatiques (et non dans les tissus prostatiques sains).
La présente invention propose encore un nouveau marqueur des cellules cancéreuses qui peut être mesuré sur le tissu prostatique in situ chez le patient par des méthodes utilisant des biocapteurs de type fibres optiques ou nanoparticules. Afin de compléter le diagnostic anatomopathologique, la méthode de l'invention pourra encore comprendre, outre la mesure du niveau d'expression du gène RM6P- CI, la mesure du niveau d'expression d'un ou plusieurs marqueurs immunohistochimiques connus à ce jour. A titre d'exemple de marqueurs immunohistochimiques, on pourra citer des marqueurs de cellules de type basales (encore appelé « marqueur de type basai »), notamment choisis parmi p63, CK 903 ou CK 5/6, ou d'autres marqueurs de cellules cancéreuses, notamment choisis parmi AMACR®, GST1 méthylé® ou TMPRSS2- ETS®.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro d'un cancer prostatique chez un sujet caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mesure du niveau d'expression du gène du récepteur mannose 6-phosphate cation indépendant (gène du RM6P-CI) dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI est une étape de mesure du niveau d'expression des produits de transcription, en particulier l'ARNm.
3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape de mesure du niveau d'expression du gène du RM6P-CI est une étape de mesure du niveau d'expression des produits de traduction, en particulier la protéine RM6P-CI.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la surexpression du gène du RM6P-CI est déterminée lorsque l'expression du gène du RM6P-CI est au moins trois fois supérieure à celle dudit gène dans un tissu prostatique non cancéreux.
5. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'étape de mesure du niveau d'expression des produits de traduction du gène du RM6P-CI se fait par analyse du marquage immunohistochimique des produits de traduction du RM6P-CI dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'analyse du marquage immunohistochimique des produits de traduction est évaluée par coloration des cellules de l'échantillon de tissu prostatique, une coloration de plus de 10% desdites cellules étant indicative d'une surexpression des produits de traduction du gène du RM6P-CI.
7. Méthode selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que ladite étape de mesure du niveau d'expression des produits de traduction du RM6P-CI se fait à l'aide de l'anticorps polyclonal IgY 415.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mesure, chez ledit sujet, du niveau d'expression d'un marqueur de cellules de type basales, notamment choisi parmi p63, CK 903 ou CK 5/6, ou d'un marqueur de cellules cancéreuses, notamment choisi parmi AMACR®, GST1 méthylé® ou TMPRSS2-ETS®.
9. Anticorps spécifique du récepteur mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) pour son utilisation dans une méthode de diagnostic in vitro d'un cancer prostatique chez un sujet, ledit anticorps permettant de mesurer le niveau d'expression du gène du RM6P-CI dans un échantillon de tissu prostatique dudit sujet, la détermination d'une surexpression dudit gène du RM6P-CI étant indicative de la présence d'un cancer prostatique chez ledit sujet.
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