EP3083699A1 - Method for immobilizing and drying enzymes - Google Patents

Method for immobilizing and drying enzymes

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EP3083699A1
EP3083699A1 EP14808645.7A EP14808645A EP3083699A1 EP 3083699 A1 EP3083699 A1 EP 3083699A1 EP 14808645 A EP14808645 A EP 14808645A EP 3083699 A1 EP3083699 A1 EP 3083699A1
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EP
European Patent Office
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dryer
protein
carrier
drying
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14808645.7A
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Steffen Maurer
Robert Bayer
Michael Budde
Michael Kerber
Farzad FARIVAR-MEMAR
Jürgen Däuwel
Thomas Berg
Sascha ROLLIE
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N11/02Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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    • C12Y301/01Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Definitions

  • CALB-derived lipases are lipases that have at least one, preferably two or more, amino acid changes, such as insertions, deletions or substitutions, to the CALB polypeptide sequence.
  • Suitable carriers are various organic or inorganic materials such as silica gel, activated carbon or polymer carrier.
  • macroporous crosslinked polymers having a particle size of 100 to 1000 ⁇ m and an average pore radius of 10 to 20 nm are suitable.
  • macroporous crosslinked acrylate polymers such as, for example, poly (meth) acrylates which are crosslinked with divinylbenzene, which may comprise, for example, acrylic acid, acrylic acid esters, methacrylic acid and methacrylic acid esters.
  • Such polymers are sold, for example, by the company Lanxess under the name Lewatit® VP OC 1600 or by the company DOW under the name Amberlite® XAD-7.
  • TBU Total volatilestrogenicity
  • US [%] [g / L] protein
  • the infra-red balance was used in a triple measurement to determine the mean dry content of the sample taken from the filled big-bag.
  • the measurements gave the following result (infrared balance, end point: 30 sec. Balance standstill, triple measurement: 5.3 g / 9.3 g / 4.6 g):
  • the mean dry content of the bottled product is 99.1 1%. This in turn corresponds to a residual moisture content of 0.89%.

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Abstract

Disclosed is a method for immobilizing proteins on a carrier, characterized in that the protein is incubated with the carrier in an aqueous phase in a discontinuous contact vacuum mixer dryer and in that the immobilized protein is then immediately dried, if necessary following an optional washing step, in the same contact vacuum mixer dryer.

Description

Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Enzymen  Process for the immobilization and drying of enzymes
Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, insbesondere von Lipasen. DESCRIPTION OF THE INVENTION The invention relates to an improved process for the immobilization and drying of proteins, in particular of enzymes, in particular of lipases.
Stand der Technik EP382767 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipasen. Dabei wird eine wässrige Lösung einer gegebenen Lipase durch Rotation mit einem Harz (beispielsweise Lewatit ® ) bei festem pH bei Raumtemperatur vermischt. Dann wurde das Harz mit immobilisierter Lipase durch Filtration gesammelt, gefolgt von Waschen mit Wasser und Trocknen im Vakuum. Die Immobilisierung von Enzymen ist generell mit Verlust an Enzym infolge des Nichtbindens an den Träger bzw. durch Desorption („Ausbluten") von bereits gebundenem Enzym begleitet. Weiterhin erfährt das immobilisierte Enzym durch die Verfahrensschritte der Immobilisierung häufig einen Verlust an Enzymaktivität, was gerade im technischen Maßstab zu signifikanten Ausbeuteverlusten und damit erhöhten Kosten führt. Prior Art EP382767 describes a process for the immobilization of lipases. In this case, an aqueous solution of a given lipase is mixed by rotation with a resin (for example Lewatit®) at a fixed pH at room temperature. Then, the immobilized lipase resin was collected by filtration, followed by washing with water and drying in vacuo. The immobilization of enzymes is generally accompanied by loss of enzyme due to unbonding to the carrier or by desorption ("bleeding") of already bound enzyme Furthermore, the immobilized enzyme often undergoes a loss of enzyme activity due to the immobilization steps, which is precisely the case technical scale leads to significant yield losses and thus increased costs.
Beschreibung der Erfindung Description of the invention
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren aufzufinden, das es gestattet, eine effiziente Immobilisierung des Proteins an den Träger zu erreichen, was bedeutet, dass mög- liehst die gesamte Menge des vorhandenen Enzyms am Träger permanent gebunden wird und verbleibt und dass im Falle eines enzymatisch aktiven Proteins nach Immobilisierung möglichst die gleiche hohe enzymatische Aktivität erhalten wird t wie vor Immobilisierung. The invention therefore an object of the invention to provide a method that allows to achieve efficient immobilization of the protein to the carrier, which means that as possible lent the entire amount of the enzyme present on the carrier is permanently bound and remains and that im In the case of an enzymatically active protein after immobilization, the same high enzymatic activity as possible is obtained as before immobilization.
Gefunden wurde ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird Es wurde nun gefunden, dass das eingangs definierte Verfahren zu besonders vorteilhaften Ergebnissen führt, da die gesamten Schritte der Immobilisierung wie effizientes Inkubieren von Protein mit Träger, ggf. Waschen des immobilisierten Proteins und Trocknen des immobilisierten Proteins zu einem stabilen, gut lager- und transportfähigen Produkt in einem einzigen Apparat durchzuführen sind. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut im technischen Maßstab, wenn immobilisiertes Protein im dreistelligen Kilogramm- bis hin zu Tonnenmaßstab hergestellt werden soll. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können eine Vielzahl von Proteinen immobilisiert werden. Besonders geeignet ist es für die Immobilisierung von Enzymen, wie Oxidoreduktasen Hydrola- sen, Isomerasen und Transferasen. A process has been found for the immobilization of proteins on a carrier, characterized in that the incubation of the protein with the carrier takes place in an aqueous phase in a discontinuous contact vacuum mixer dryer and immediately thereafter optionally after an optional washing step, the drying of the immobilized protein in It has now been found that the method defined at the outset leads to particularly advantageous results, since the entire steps of immobilization, such as efficient incubation of protein with carrier, optionally washing of the immobilized protein and drying of the immobilized protein to a stable , good storage and transportable product in a single apparatus are to be carried out. This method is particularly well suited on an industrial scale when immobilized protein is to be produced in the three-digit kilogram to the ton scale. With the method according to the invention a multiplicity of proteins can be immobilized. It is particularly suitable for the immobilization of enzymes, such as oxidoreductases, hydrolases, isomerases and transferases.
Besonders gut geeignet ist es für die Immobilisierung von Hydrolasen, insbesondere von Lipa- sen. It is particularly suitable for the immobilization of hydrolases, in particular of lipases.
Innerhalb der Lipasen lassen sich besonders gut diejenigen Lipasen aus Candida antarctica immobilisieren, insbesondere die Candida Antarctica Lipase B (CALB) oder solche Enzyme, die davon strukturell abgeleitet sind. Solche strukturell von CALB abgeleitete Lipasen sind Lipasen, die mindestens eine, bevorzugt zwei oder mehrere Aminosäureveränderungen, wie Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, gegenüber der CALB Polypeptidsequenz aufweisen. Within the lipases, it is particularly possible to immobilize those lipases from Candida antarctica, in particular the Candida antarctica lipase B (CALB) or those enzymes which are structurally derived therefrom. Such structurally CALB-derived lipases are lipases that have at least one, preferably two or more, amino acid changes, such as insertions, deletions or substitutions, to the CALB polypeptide sequence.
Beispiele für solche von CALB strukturell abgeleitete Lipasen sind in der WO 2009/080676 beschrieben („CALB-Muteine"), wobei auf die WO2009/080676 hinsichtlich des Offenbarungsgehal- tes der CALB-Muteine ausdrücklich Bezug genommen wird. Examples of such lipases which are structurally derived from CALB are described in WO 2009/080676 ("CALB muteins"), reference being made expressly to WO2009 / 080676 with regard to the disclosure of the CALB muteins.
Die zu immobilisierenden Enzyme können aus dem ursprünglichen Organismus durch bekannte Verfahren isoliert oder auch durch rekombinante DNA-Techniken in geeigneten Wirtsorganismen wie Bacillus, E.coli, Pichia, Chrysosporium, Aspergillus, Saccharomyces hergestellt werden. The enzymes to be immobilized can be isolated from the original organism by known methods or also prepared by recombinant DNA techniques in suitable host organisms such as Bacillus, E. coli, Pichia, Chrysosporium, Aspergillus, Saccharomyces.
Als Träger sind verschiedene organische oder anorganische Materialien wie Kieselgel, Aktivkohle oder Polymerträger geeignet. Als polymerer Träger sind makroporöse vernetzte Polymere mit einer Teilchengröße von 100 bis 1000 um und einem mittleren Porenradius von 10-20 nm geeignet. Besonders geeignet sind makroporöse vernetzte Acrylat-Polymere wie z.B. Po- ly(meth)acrylate, die mit Divinylbenzol vernetzt sind, welche beispielsweise Acrylsäure, Acrylsäu- reester, Methacrylsäure und Methacrylsäureester enthalten können. Solche Polymere werden z.B. von der Firma Lanxess unter der Bezeichnung Lewatit® VP OC 1600 oder von der Firma DOW unter der Bezeichnung Amberlite ® XAD-7 vertrieben.. Geeignete diskontinuierliche Kontakt-Vakuummischertrockner sind dem Fachmann aus der Literatur (z.B. Friedrich Kneule,„Das Trocknen", Sauerländer AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941 -0429-3 bekannt). Besonders vorteilhaft ist die Verwendung eines Vakuum-Taumel- oder Doppelkonus- trockners. Gut geeignet sind Taumeltrockner mit einem Innenvolumen von größer als 10 Litern, bevorzugt größer als 100 Litern, bevorzugt größer als ein Kubikmeter. Suitable carriers are various organic or inorganic materials such as silica gel, activated carbon or polymer carrier. As the polymeric support, macroporous crosslinked polymers having a particle size of 100 to 1000 μm and an average pore radius of 10 to 20 nm are suitable. Particularly suitable are macroporous crosslinked acrylate polymers, such as, for example, poly (meth) acrylates which are crosslinked with divinylbenzene, which may comprise, for example, acrylic acid, acrylic acid esters, methacrylic acid and methacrylic acid esters. Such polymers are sold, for example, by the company Lanxess under the name Lewatit® VP OC 1600 or by the company DOW under the name Amberlite® XAD-7. Suitable discontinuous contact vacuum mixer dryers are known to the person skilled in the art from the literature (eg Friedrich Kneule, Das Drying ", Sauerland AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941 -0429-3.) Particularly advantageous is the use of a vacuum tumble or double cone dryer. Taumeltrockner are well suited with an inner volume of greater than 10 liters, preferably greater than 100 liters, preferably greater than one cubic meter.
Die Inkubation des zu immobilisierenden Proteins mit dem Träger geschieht in einer wässrigen, in der Regel durch Puffer auf einen bestimmten pH-Wert eingestellten Phase. The incubation of the protein to be immobilized with the carrier takes place in an aqueous phase, which is generally adjusted by buffer to a specific pH.
Der pH-Wert hängt von der Natur des zu immobilisierenden Enzyms ab, hauptsächlich vom isol- elektischen Punkt des Enzyms. Als vorteilhaft hat sich ein pH-Bereich von 3 bis zu 1 1 , insbesondere von 4 bis 8 herausgestellt. The pH value depends on the nature of the enzyme to be immobilized, mainly the isolelectic point of the enzyme. It has proven to be advantageous to have a pH range of from 3 to 1, in particular from 4 to 8.
Für CALB Lipasen wird ein pH-Bereich von 4,8 - 5,2 empfohlen. For CALB lipases, a pH range of 4.8 - 5.2 is recommended.
Als Puffer für die wässrige Phase geeignet sind beispielsweise Phosphat- und Acetatpuffer. Die Inkubation erfolgt in der Regel bei einer Temperatur zwischen 0°C und 40°C, insbesondere zwischen 4°C und 30°C. Wenn das zu immobilisierende Enzym besonders temperaturtolerant ist, können auch Temperaturen oberhalb von 50°C in Betracht kommen. Suitable buffers for the aqueous phase are, for example, phosphate and acetate buffers. The incubation is usually carried out at a temperature between 0 ° C and 40 ° C, in particular between 4 ° C and 30 ° C. If the enzyme to be immobilized is particularly temperature-tolerant, temperatures above 50 ° C. may also be considered.
Nach der Inkubation wird die Enzym-haltige Ausgangslösung vom immobilisierten Enzym ge- trennt. Dies geschieht am einfachsten durch Filtration über eine Siebplatte, die im Taumeltrockner angebracht wird. Anschließend kann das immobilisierte Enzym gewünschtenfalls in einem Waschschritte noch gereinigt werden. Solche Waschschritte erfolgen ebenfalls durch Mischen des immobilisierten Enzyms mit der Waschlösung, in der Regel Wasser, und anschliessendes Trennen vom immobilisierten Enzym über eine integrierte Filtrationseinrichtung. After incubation, the enzyme-containing starting solution is separated from the immobilized enzyme. This is most easily done by filtration through a sieve plate mounted in the tumble dryer. If desired, the immobilized enzyme can then be further purified in a washing step. Such washing steps are also carried out by mixing the immobilized enzyme with the washing solution, usually water, and then separating the immobilized enzyme via an integrated filtration device.
Die anschließende Trocknung des immobilisierten Enzymes erfolgt ebenfalls ohne weiteres Umfüllen in dem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner, wobei ein Unterdruck im Trockner von kleiner als 1013 mbar, bevorzugt kleiner als 100 mbar eingestellt wird. Die Manteltemperatur wird auf kleiner 100°C, bevorzugt kleiner65°C eingestellt, wobei darauf geachtet wird, dass die Produkttemperatur einen Wert von 50°C, bevorzugt einen Wert von 40°C nicht überschreitet.. The subsequent drying of the immobilized enzyme also takes place without further transfer in the discontinuous contact vacuum mixer dryer, wherein a negative pressure in the dryer of less than 1013 mbar, preferably less than 100 mbar is set. The jacket temperature is set to less than 100 ° C., preferably less than 65 ° C., care being taken that the product temperature does not exceed a value of 50 ° C., preferably a value of 40 ° C.
Es empfiehlt sich in der Regel nicht, die Temperatur des zu trocknenden immbobilisierten En- zyms auf über 50°C einzustellen, um eine thermische Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden. In Fällen von besonders temperaturunempfindlichen Enzymen kann jedoch auch bei über 50°C getrocknet werden. Die Trocknungszeit beträgt unter den oben angegebenen Bedingungen üblicherweise zwischen 10 und 30 Stunden, bevorzugt zwischen 15 und 20 Stunden. Angestrebt wird in der Regel ein immobilisiertes Produkt mit einer Restfeuchte von weniger als 5%, bevorzugt weniger als 2% und besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1 ,5 % Wasser. As a rule, it is not recommended to set the temperature of the immobilized enzyme to be dried above 50 ° C in order to avoid thermal inactivation of the enzyme. In cases of particularly temperature-insensitive enzymes, however, can be dried at over 50 ° C. The drying time under the conditions given above is usually between 10 and 30 hours, preferably between 15 and 20 hours. The aim is generally an immobilized product having a residual moisture content of less than 5%, preferably less than 2% and more preferably between 0.5 and 1.5% water.
Wenn das Produkt zu sehr getrocknet wird kann es zu statischer Aufladung kommen, was die Handhabbarkeit teilweise erschwert. If the product is dried too much, static charge may occur, which may make handling somewhat difficult.
Ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt ist bei Raumtemperatur gut lagerfähig, ohne dass es zu nennenswerten Aktivitätsverlusten kommt. Weiterhin ist es gut handhabbar, d.h. es lässt sich gut ein- und umfüllen. Im Einzelnen ist das neue Verfahren in dem folgenden Beispiel beschrieben. A product prepared by the process according to the invention is readily storable at room temperature without significant loss of activity. Furthermore, it is easy to handle, i. it is easy to transfer and transfer. More specifically, the new method is described in the following example.
Beispiel: Example:
Immobilisierung von CALB auf Lewatit® im 500 kg Maßstab Immobilization of CALB on Lewatit® in 500 kg scale
Der für dieses Verfahren eingesetzte Taumeltrockner T0055 besitzt folgende technische Daten:The tumble dryer T0055 used for this process has the following technical data:
• Volumen: 6,3 m3 • Volume: 6.3 m 3
• Heizfläche: 17 m2 1. Eingesetzte Rohstoffe • Heating surface: 17 m 2 1. Raw materials used
Für die Versuchsdurchführung werden folgende Komponenten benötigt:  The following components are required for the experiment:
• Lewatit® VP OC 1600 feucht (Fa. Lanxess) [544 kg] • Lewatit® VP OC 1600 damp (Lanxess) [544 kg]
• Lipase Ultrafiltrat CALB-2012-01 [21 kg Protein]  • Lipase ultrafiltrate CALB-2012-01 [21 kg protein]
• VE-Wasser (für 3 Waschgänge) [3 x 2000L]  • DI water (for 3 washes) [3 x 2000L]
· N2- Strippgas [5-20 Nm3/h] · N 2 - stripping gas [5-20 Nm 3 / h]
Laut Vorschrift sollen insgesamt 544 kg des feuchten Lewatit eingefüllt werden. Diese 544 kg des feuchten Lewatit entsprechen etwa 233 kg trockenem Lewatit. Für die Lipase ergibt sich eine spezifische Aktivität von 460 TBU/mg Protein und eine Reinheit von 61 %. Für die Immobilisierung wird die gesamte Menge von 21 kg Enzym verwendet. 2. Versuchsdurchführung According to regulations, a total of 544 kg of wet Lewatit should be filled. These 544 kg of wet Lewatit correspond to about 233 kg of dry Lewatit. The lipase has a specific activity of 460 TBU / mg protein and a purity of 61%. For immobilization, the entire amount of 21 kg of enzyme is used. 2. Experimental procedure
Beschickung des Taumeltrockners mit Lewatit ® und erster Waschvorgang  Charging the tumble dryer with Lewatit ® and first wash
· um 8.15 Uhr wurde damit begonnen, die Lewatit- Fässer zu wiegen und anschließend über einen Trichter in den Taumeltrockner zu geben · At 8:15 am, the Lewatit barrels were weighed and then placed in the tumble dryer via a funnel
• insgesamt wurden 544,1 kg feuchtes Lewatit VP OC 1600 in den Trockner gegeben es wurde eine Mischprobe aus allen Fässern zusammengestellt  • In total, 544.1 kg of wet Lewatit VP OC 1600 were added to the dryer. A mixed sample of all barrels was put together
• anschließend wurden über einen Schlauch 2000 L VE-Wasser (über Wasseruhr)mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 80 -90 l/min ebenfalls über den Trichter in den Trockner gegeben  • 2000 L of demineralised water (via water meter) were then fed via a hose into the dryer through the hopper at a flow rate of 80 - 90 l / min
— > der Trichter wurde dabei von Lewatitresten befreit  -> The funnel was freed from Lewatitresten
• der Befüllvorgang war um 8.55 Uhr beendet  • the filling process was finished at 8:55
• beim Blick in den Trockner konnte man erkennen, dass sich das Wasser leicht milchig ver- färbt hatte und das sich etwas eiweißartiger Schaum auf der Oberfläche gebildet hatte • Looking into the dryer, one could see that the water had turned slightly milky and that some proteinaceous foam had formed on the surface
• nun wurde das Siebpassstück (160 μηη) auf dem Mannlochdeckel angebracht (9.20 Uhr)• now the sieve fitting (160 μηη) was placed on the manhole cover (9.20 o'clock)
• anschließend wurde der Trockner zur Dichtheitsprüfung auf 78,6 mbar evakuiert • then the dryer was evacuated to 78.6 mbar for leak testing
• danach wurde wieder auf Normaldruck (1020 mbar) entspannt (9.30 Uhr)  • after that, the pressure was restored to normal pressure (1020 mbar) (9.30 am)
• dann wurde 2 Stunden, bei Normaldruck, Raumtemperatur und 0,33 upm gemischt (dazu wurde der Antriebsmotor am Taumeltrockner auf 5,5 Hz eingestellt, was 0,33 upm entspricht • then mixed for 2 hours at atmospheric pressure, room temperature and 0.33 rpm (for this, the drive motor on the tumble dryer was set to 5.5 Hz, which corresponds to 0.33 rpm
— > manuell nachgemessen: 1 U /2,43 Min = 0,41 upm) -> manually measured: 1 U / 2.43 min = 0.41 rpm)
— > das Heizbad stand dabei auf voller Kühlung  -> the heating bath stood on full cooling
• nach Ablauf der 2 Stunden (1 1 .26 Uhr) wurde der T0055 mit dem Deckel nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert — > dabei wurde mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert  • at the end of the 2 hours (1 1 .26 o'clock) the T0055 was positioned with the lid downwards and the washing water was filtered through the built-in 160 μηη sieve in IBCTs -> it was filtered with an overpressure of 100-200 mbar
— > der Überdruck wurde durch das Zuleiten von Stickstoff erzeugt  -> The overpressure was generated by the supply of nitrogen
• nach 20 L, 1000 L und 1700 L wurde jeweils eine Probe genommen  • after 20 L, 1000 L and 1700 L, one sample each was taken
— > rein optisch wies die erste Probe eine leichte Trübung auf, allerdings setzte sich am  -> purely optically, the first sample showed a slight haze, but sat down on
Boden nichts ab  Ground nothing
— > die zweite und die dritte Probe waren klar; gegen das Licht waren einzelne kleine  -> the second and the third sample were clear; against the light were small ones
Schwebeteilchen erkennbar  Suspended particles recognizable
• insgesamt wurden 1700 L Wasser abgelassen (1 1 .30 Uhr - 12.25 Uhr)  • a total of 1700 liters of water were drained (1 1:30 am - 12:25 pm)
• die IBCTs wurden nun 2 Stunden ruhen gelassen  • The IBCTs have now been rested for 2 hours
• anschließend wurde kontrolliert, ob sich am Boden Schwebeteilchen abgesetzt hatten; dies war jedoch nicht der Fall  • then it was checked whether floating particles had settled on the ground; But this was not the case
• die mit Waschwasser gefüllten IBCTs wurden gewogen IBC 1 : 1003 kg Netto • The IBCTs filled with wash water were weighed IBC 1: 1003 kg net
IBC 2: 717 kg Netto  IBC 2: 717 kg net
dann wurde das Wasser ins bbA abgelassen Zweiter Waschvorgang  then the water was drained into the bbA Second wash
• das Mannloch wurde wieder nach oben positioniert  • the manhole was positioned up again
• anschließend wurden 2000 L Wasser (2000 kg), welche sich bereits in zwei 1000 L IBCTs befanden, mit 800 - 700 mbar abs. eingesaugt (12.40 Uhr - 13.22 Uhr)  • Subsequently, 2000 L of water (2000 kg), which were already in two 1000 L IBCTs, were packed with 800-700 mbar abs. sucked in (12:40 - 13:22 clock)
• pro Container dauerte der Befüllvorgang etwa 20 Minuten  • The filling process took about 20 minutes per container
· anschließend wurde im Taumeltrockner 2 Stunden bei 0,33 upm (5,5 Hz), Raumtemperatur und Normaldruck gemischt  Thereafter, the tumbling dryer was mixed for 2 hours at 0.33 rpm (5.5 Hz), room temperature and normal pressure
• nach Ablauf der 2 Stunden wurde das Mannloch nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert  • at the end of the 2 hours, the manhole was positioned downwards and the wash water was filtered through the built-in 160 μηη sieve in IBCTs
— > hierbei wurde wieder mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert  -> This was filtered again with an overpressure of 100-200 mbar
· nach 50 L, 1000 L und 2000 L wurde jeweils eine Probe genommen  After 50 L, 1000 L and 2000 L one sample each was taken
• insgesamt wurden etwa 2050 L Wasser abgelassen  • a total of about 2050 liters of water were drained
• die Filtration dauerte pro Container (d.h. pro 1000 L) etwa 30 Minuten  Filtration took about 30 minutes per container (i.e., per 1000 L)
• die mit Waschwasser gefüllten IBC's wurden anschließend gewogen • The IBC 's filled with wash water were then weighed
IBC 1 : 1002 kg Netto  IBC 1: 1002 kg net
IBC 2: 1043 kg Netto  IBC 2: 1043 kg net
• danach wurde das Waschwasser ins bbA abgelassen  • then the wash water was drained into the bbA
• anschließend wurde eine Probe des gewaschenen Lewatits gezogen  • then a sample of the washed Lewatit was pulled
— > hierbei fiel auf, das der Filterkuchen nach dem Stoppen der Drehung des Trockners leicht schräg an der Innenwand stand  -> it was noticeable that the filter cake was slightly inclined to the inner wall after stopping the rotation of the dryer
· der Taumeltrockner wurde über Nacht jede Stunde einmal gedreht, um die Bildung von Brocken zu vermeiden  The tumble dryer was rotated once every hour once an hour to avoid the formation of chunks
Lipasezugabe und Immobilisierung Lipase addition and immobilization
• die gekühlt gelieferten Lipase- Fässer wurden zunächst noch einmal gewogen  • The cooled lipase casks were weighed once more
-> 1749,6 kg Lipase Netto  -> 1749.6 kg lipase net
• anschließend wurde aus jedem Fass eine 2 L Probe gezogen (9.30 Uhr - 9.50 Uhr) • then a 2 L sample was drawn from each barrel (9.30 am - 9.50 am)
• die insgesamt 9 Fässer (je 200 L) mit der Lipase CALB-2012-01 wurden in den Taumeltrockner gefüllt • The 9 barrels (200 L each) with Lipase CALB-2012-01 were filled into the tumble dryer
• dazu wurde der Inhalt von je 3 Fässern in den Trockner eingesaugt  • The contents of 3 drums each were sucked into the dryer
· hierzu wurde ein Unterdruck von 300 mbar angelegt  · For this purpose, a negative pressure of 300 mbar was applied
• zuerst wurden die Gebinde 7,8,9 eingefüllt (10.19 Uhr - 10.32 Uhr) • im Fass blieb nur eine sehr geringe Menge Enzymlösung zurück • first the containers were filled in 7,8,9 (10.19 o'clock - 10.32 o'clock) • In the barrel, only a very small amount of enzyme solution remained
— > nach Zugabe des Inhalts von je 3 Fässern wurde der Trockner jeweils 10 Minuten bei 0,33 upm gedreht  -> After adding the contents of 3 barrels each, the dryer was rotated for 10 minutes at 0.33 rpm
• Anschließend folgte das Einsaugen des Inhalts der Gebinde 3,2,1 (1 1.06 Uhr - 1 1 .23 Uhr) und das 10 minütige Drehen bei 0,33 upm  • Then the contents of the containers 3, 2, 1 (1 1:06 am - 1 1 .23 o'clock) were sucked in and the 10-minute rotation at 0.33 rpm
• zuletzt wurde der Inhalt der Gebinde 6,5,4 eingesaugt (1 1 .52 Uhr - 12.07 Uhr)  • last the contents of the containers 6,5,4 were sucked in (1 1 .52 o'clock - 12.07 o'clock)
• von 12.20 Uhr bis 13.00 Uhr wurde mit 200 mbar abs. und 0,33 upm gedreht  • from 12:20 to 13:00 was with 200 mbar abs. and rotated 0.33 rpm
• um 13.00 Uhr wurde der Taumeltrockner bis auf 900 mbar abs. entgast  • at 1 pm, the tumble dryer was lowered to 900 mbar abs. degassed
• anschließend wurde bis 13.15 Uhr bei 100 - 200 mbar Unterdruck weiter gemischt  • then the mixture was further mixed until 1.15 pm at 100 - 200 mbar vacuum
— > die Innentemperatur lag hier bei 20°C; aus diesem Grund wurde die Kühlung, welche auf -> the internal temperature was 20 ° C; for this reason, the cooling was done on
24°C eingestellt war, abgestellt 24 ° C was set, turned off
• danach wurde im Trockner ein leichter Überdruck von 100 - 200 mbar angelegt  • Then a slight overpressure of 100 - 200 mbar was applied in the dryer
• unter diesen Bedingungen wurde der Trockner 15 Stunden lang mit 0,33 upm bewegt • Under these conditions, the dryer was run at 0.33 rpm for 15 hours
• dabei wurden jede Stunde Druck und die Temperatur notiert • every hour pressure and temperature were noted
· nach Ablauf der ersten 3 Stunden (15.15 Uhr) wurde die erste Probe (250 ml) vom Überstand des Immobilisats genommen und im Kühlschrank bei 8-14°C aufbewahrt · At the end of the first 3 hours (15.15), the first sample (250 ml) was taken from the supernatant of the immobilizate and stored in a refrigerator at 8-14 ° C
• insgesamt wurden Proben nach 3, 5, 7, 9, 12 und 15 Stunden Immobilisierung gezogen • total samples were taken after 3, 5, 7, 9, 12 and 15 hours of immobilization
• nach Ablauf der 15 Stunden wurde der Trockner abgestellt und nur jede Stunde einmal (1 Umdrehung) gedreht (bis nächsten Tag, 7.00 Uhr) • at the end of the 15 hours the dryer was switched off and only turned once every hour (1 turn) (until next day, 7:00 am)
Filtration der Enzym-Lewatit-Lösung nach der Immobilisierung Filtration of the enzyme-Lewatit solution after immobilization
• um 7.00 Uhr wurde der Taumeltrockner nochmals gedreht und mit dem Mannlochdeckel nach unten positioniert  • At 7:00 am the tumble dryer was turned again and positioned with the manhole cover down
• nun wurde ein Überdruck von etwa 100 mbar im Trockner angelegt  • now an overpressure of about 100 mbar was applied in the dryer
· anschließend wurde die Mutterlauge über das 160 μηη Sieb in IBCTs ablaufen gelassen (7.10 Uhr - 8.20 Uhr) · Then the mother liquor was drained through the 160 μηη sieve in IBCTs (7.10 o'clock - 8.20 o'clock)
• eine erste Probe wurde nach etwa 300 L in einer Glasflasche gezogen  • a first sample was drawn after about 300 L in a glass bottle
—►hierbei fiel auf, dass die Probe trüber und nicht mehr ganz so dunkelgrün wie am Vortag war und zudem schäumte  Hereby it was noticeable that the sample was cloudier and not quite as dark green as the day before and also foamed
— >die Probe war also optische heller und trüber als die des Vortages, zudem roch sie nun anders (nach Buttersäure)  -> The sample was so visually lighter and cloudier than the previous day, also it smelled different now (after butyric acid)
• die zweite Probe wurde nach etwa 900 L ebenfalls wieder in eine Glasflasche entnommen • The second sample was also removed after about 900 L into a glass bottle
• da die Mutterlauge beim Abfüllen in den IBC so stark schäumte, konnte der erste IBC nur mit 900 L Mutterlauge befüllt werden • Since the mother liquor foamed so much when it was filled into the IBC, the first IBC could only be filled with 900 L mother liquor
· nachdem der zweite IBC ebenfalls mit etwa 700 L Mutterlauge gefüllt war, wurde erstmals Stickstoff mit ausgeblasen • aus diesem Grund wurden die Hähne geschlossen und 10 Minuten gewartet, um der Mutterlauge Zeit zu geben, sich unten abzusetzen · After the second IBC was also filled with about 700 L of mother liquor, nitrogen was blown out for the first time • For this reason, the taps were closed and waited 10 minutes to allow the mother liquor to settle down
• anschließend wurde der Rest der Mutterlauge in den IBC gegeben  • then the remainder of the mother liquor was added to the IBC
• dabei wurde eine dritte Probe in eine Glasflasche gezogen  • a third sample was drawn into a glass bottle
· insgesamt war der zweite IBC am Ende mit 750 L Mutterlauge gefüllt  · Overall, the second IBC was filled with 750 L of mother liquor at the end
• zum Schluss wurden die beiden IBC's gewogen • Finally, the two IBC's were weighed
-> IBC 1 + 2 = 1683 kg Netto  -> IBC 1 + 2 = 1683 kg net
Waschen der immobilisierten Lipase Washing the immobilized lipase
· nach dem Ablassen der Mutterlauge wurde der Taumeltrockner zunächst einmal gedreht und mit dem Schieber nach oben positioniert  · After draining the mother liquor, the tumble dryer was first turned and positioned with the slider upwards
• über den Schieber wurde anschließend eine Probe des feuchten, ungewaschenen Immobi- lisats entnommen  • A sample of the damp, unwashed property was then removed via the slide
— > das Immobilisat hatte sich wieder seitlich am Trockner abgesetzt  -> The Immobilisat had settled again on the side of the dryer
— > das Immobilisat hatte einen leichten Grünstich  -> the Immobilisat had a slight green cast
• anschließend wurde der Trockner wieder so gedreht, dass sich der Mannlochdeckel oben befand  • then the dryer was turned again so that the manhole cover was up
• im Trockner wurde ein Unterdruck von etwa 300 mbar angelegt  • In the dryer, a vacuum of about 300 mbar was applied
• dann wurden 2000 L VE-Wasser (abgefüllt in 2 IBC) in den Taumeltrockner eingesaugt (8.55 Uhr - 9.30 Uhr)  • then 2000 L of demineralised water (filled in 2 IBCs) were sucked into the tumble dryer (8.55 am - 9.30 am)
• anschließend folgte 2 Stunden mischen bei 0,33 upm, Raumtemperatur und Normaldruck Followed by 2 hours mixing at 0.33 rpm, room temperature and normal pressure
• nach Ablauf der 2 Stunden wurde der Mannlochdeckel nach unten positioniert • after the 2 hours, the manhole cover was positioned downwards
• im Trockner wurde ein Überdruck von 400 -580 mbar angelegt und das Waschwasser in IBC's abgelassen (1 1.45 Uhr - 13.15 Uhr) • In the dryer, an overpressure of 400-580 mbar was applied and the washing water in IBC ' s drained (1 1.45 pm - 1.15 pm)
· nach 50 L wurde die erste, nach 1000 L die zweite und nach 1825 L die dritte Probe genommen  · After 50 l the first, after 1000 l the second and after 1825 l the third sample was taken
— > alle Proben waren leicht grünlich trüb; es setzte sich jedoch kein Bodensatz ab — > man konnte aber keinen großen Unterschied zwischen den Proben erkennen  -> all samples were slightly greenish cloudy; but no sediment settled down -> but you could not see a big difference between the samples
• ab etwa 1750 L abgelassenem Waschwasser wurde erstmals N2 mit ausgeblasen • From about 1750 L drained wash water N 2 was first blown with
· ab etwa 1850 L abgelassenem Waschwasser wurde ein dritter IBC nach draußen gestellt und die Leitung nach draußen gelegt, da sehr große Mengen an Stickstoff mit ausgeblasen wurden  · From about 1850 L of drained washing water, a third IBC was put outside and the line was put outside, as very large amounts of nitrogen were blown out with it
• nun wurde ein Überdruck von 900 mbar auf den Trockner gelegt, um wirklich das gesamte Wasser heraus zu filtrieren  • now an overpressure of 900 mbar was placed on the dryer to really filter out all the water
· unter diesem Druck wurde 15 Minuten lang trocken geblasen (zum Ende hin kam nur noch Stickstoff aus der Leitung und vereinzelte Tropfen vom Waschwasser) • anschließend wurden die IBCTs gewogen · Under this pressure was blown dry for 15 minutes (towards the end came only nitrogen from the line and a few drops of washing water) • then the IBCTs were weighed
-> IBC 1 + 2 = 1921 kg Netto  -> IBC 1 + 2 = 1921 kg net
• danach wurde über das Mannloch eine 1 L Probe vom Feststoff gezogen  • then a 1 L sample of the solid was pulled over the manhole
— > auch diese Probe war ganz leicht grünlich (jedoch nicht so stark wie die zuvor gezogene Feststoffprobe)  -> also this sample was very slightly greenish (but not as strong as the previously drawn solid sample)
Vakuumtrocknung vacuum drying
• der Taumeltrockner wurde zunächst unter Drehen (Rotation) mit 0,33 upm evakuiert • The tumble dryer was first evacuated while rotating at 0.33 rpm
• anschließend wurde die Drehung (Rotation) stufenweise auf 2,4 upm erhöht (1/ 1 ,5/ 2,0/ 2,4 upm) • then the rotation was gradually increased to 2.4 rpm (1/1, 5 / 2.0 / 2.4 rpm)
— > von außen betrachtet lief der Trockner sehr ruhig, was wiederum auf ein gleichmäßiges Abrutschen (Abgleiten) des Immobilisats von der Trocknerwand hindeutet (zu diesem Zeitpunkt haben sich also noch keine größeren Brocken gebildet)  -> viewed from the outside, the dryer ran very quietly, which in turn indicates a steady slipping (slipping) of the immobilizate from the dryer wall (at that time, therefore, no larger chunks have formed)
• um 14.20 Uhr wurde die Beheizung auf 50°C gestellt  • at 2.20 pm the heating was set to 50 ° C
· um 17.30 Uhr wurde er wieder geschlossen und stattdessen der Stripp- Stickstoff auf  · At 5.30 pm it was closed again and the stripping nitrogen was switched on instead
25 m3/h eingeregelt Regulated 25 m 3 / h
• um 2.15 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um die erste Probe ziehen zu können • at 2:15 am, the cooling was stopped to pull the first sample
• nach einer Kühlzeit von 2 h wurde um 4.15 Uhr die erste Probe des Immobilisats gezogen — > die Innentemperatur war von 39,3°C auf 23°C gesunken • After a cooling time of 2 h, the first sample of the immobilizate was drawn at 4.15 o'clock -> the internal temperature had dropped from 39.3 ° C to 23 ° C
· die Probe wurde zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gegeben  · The sample was given to the in-house laboratory to determine residual moisture
-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 35,76%  -> Residual moisture determination at 105 ° C / 60 minutes: 35.76%
• um 8.25 Uhr wurde der Trockner mit dem Schieber nach unten positioniert und 5 Minuten zwecks Temperaturmessung so stehen gelassen  • At 8:25 pm, the dryer was positioned with the slider down and allowed to stand for 5 minutes for temperature measurement
— > die Innentemperatur hat einen Temperaturunterschied von 5°C, abhängig davon, ob sich der Taumeltrockner dreht, oder ob der Messfühler in den Feststoff eingetaucht ist -> The internal temperature has a temperature difference of 5 ° C, depending on whether the tumble dryer is rotating or if the sensor is submerged in the solid
• um 13.45 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um eine zweite Probe ziehen zu können• At 1:45 pm, the cooling was stopped in order to be able to draw a second sample
• nach einer Kühlzeit von 30 Minuten wurde dann die Probe gezogen • after a cooling time of 30 minutes, the sample was drawn
— > hierbei fiel auf, dass sich zwischen den weißen Kugeln des Immobilisats auch kleinere, dunkle (braune) Teilchen befanden  -> it was noticeable that there were also smaller, darker (brown) particles between the white spheres of the immobilizate
· im betriebseigenen Labor wurde dann die Restfeuchte bestimmt  · In the company's own laboratory, the residual moisture was determined
-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 9,72%  -> Residual moisture determination at 105 ° C / 60 minutes: 9.72%
• Probe anschließend im Kühlschrank aufbewahrt  • Store the sample in the refrigerator
• um 17.28 Uhr stieg die Innentemperatur auf 46°C— > Bad auf 50°C genommen  • at 17:28, the internal temperature rose to 46 ° C-> bath taken to 50 ° C
• um 17.47 Uhr war die Innentemperatur wieder auf 45, 5°C gesunken— > Bad auf 53°C ge- nommen  • at 17.47 o'clock the indoor temperature had fallen back to 45. 5 ° C-> bath to 53 ° C
• ab 18.00 Uhr wurde begonnen zu kühlen • von 19.00 Uhr - 19.20 Uhr wurde die Probe genommen und zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gebracht • From 18.00 clock was started to cool • From 7:00 pm to 7:20 pm, the sample was taken and taken to the in-house laboratory for residual moisture determination
— > Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 1 ,4%  -> Residual moisture determination at 105 ° C / 60 minutes: 1, 4%
• da die Restfeuchte unter dem Sollwert von 3% lag, wurde die Trocknung beendet  • since the residual moisture was below the setpoint of 3%, drying was stopped
· um 20.30 Uhr wurde das Vakuum aufgehoben  · At 20.30 the vacuum was released
— > dabei stieg die Temperatur von 25°C auf 31 ,7°C  -> while the temperature rose from 25 ° C to 31, 7 ° C.
• um 20.50 Uhr wurde der Antrieb bei einer Innentemperatur von 25,8°C abgeschaltet • At 20.50 the drive was switched off at an internal temperature of 25.8 ° C
• ab diesem Zeitpunkt wurde der Trockner alle 2 Stunden einmal gedreht Abfüllung • From this point on, the dryer was turned once every 2 hours
der Trockner wurde mit dem Schieber nach unten positioniert  The dryer was positioned with the slider down
anschließend wurde der Siebeinsatz wieder ausgebaut  then the sieve insert was removed again
— > leichter Produktrückstand am Sieb  -> slight product residue on the sieve
Mannlochdeckel für Abfüllvorgang ein Stück offen stehen lassen  Manhole cover left for filling a piece open
· Nibbler/ Passstück montiert  · Nibbler / fitting piece mounted
anschließend mit etwa 2,4 m3/h N2 inertisiert then inertized with about 2.4 m 3 / h N 2
Big-Bag Nr. 67291 120 an die Abfülleinrichtung gehängt und mit N2 aufgeblasen und geerdet Abluft an Abfülleinrichtung halb geöffnet Big Bag No. 67291 120 hung on the filling device and inflated with N 2 and grounded exhaust air at filling device half open
mithilfe eines Handhahnes Produkt zuerst vorsichtig ablaufen lassen; später etwa auf halbe Stellung gedreht  use a manual tap to let the product run gently; later turned to half position
— > das Immobilisat ist ohne Probleme in den aufgehängten Big-Bag gerieselt, ohne dabei an der Folie oder im Trockner selbst hängen zu bleiben  -> The Immobilisat is easily drizzled in the suspended Big-Bag, without hanging on the film or in the dryer itself
— > der Big-Bag hatte sich auch nur einmal ganz kurz aufgeblasen, als für einen kurzen Moment etwas mehr Produkt kam  -> The Big-Bag had inflated only once briefly, when for a short moment a little more product came
· anschließend wurden die Reste, die sich noch im Taumeltrockner befanden, abgeklopft — > insgesamt blieben keine großen Rückstände im Taumeltrockner (nur 3 etwa DIN A3 große Stellen, an denen sich eine vielleicht 2mm dicke Schicht gebildet hatte; sonst war die  · Then the remains, which were still in the tumble dryer, knocked off -> all in all no large residues remained in the tumble dryer (only 3 about DIN A3 large places, where a perhaps 2mm thick layer had formed, otherwise the
Trocknerinnenwand nur von einer ganz feinen Staubschicht belegt)  Dryer inner wall only covered by a very fine layer of dust)
· aus dem Big-Bag wurde noch eine 1 L Probe in einer Plastikflasche gezogen  · From the big-bag, another 1 L sample was drawn in a plastic bottle
• zuletzt wurde der Big-Bag noch gewogen und anschließend trocken gelagert  • Last, the Big-Bag was weighed and then stored dry
— > Tara: 25 kg  -> Tare: 25 kg
-> Brutto: 271 kg  -> gross: 271 kg
• der Abfüllvorgang selbst dauerte nur etwa 5 Minuten (mitsamt der Vorbereitung waren es etwa 20 Minuten) 3. Analysenergebnisse • The filling itself took only about 5 minutes (together with the preparation it took about 20 minutes) 3. Analysis results
Es wurde eine theoretische absolute Aktivität von 9.460.000.000 TBU beim Start berechnet  A theoretical absolute activity of 9,460,000,000 TBU at startup was calculated
Messwerte Aktivität / Gesamtprotein im Verlauf der Immobilisierung: Measured values of activity / total protein in the course of immobilization:
Probe VoluGesamtRestakGesamtGemenaktivität tivität im protein samtaktivität [TBU] US [%] [g/L] protein [TBU/m abs.rechn. vom CooPlus [%] L] Start/BGG CooPlu wert s  Total volatilestrogenicity [TBU] US [%] [g / L] protein [TBU / m abs. Calc. from CooPlus [%] L] Start / BGG CooPlu worth s
/BGG / BGG
Mischprobe Konzentrat 5390 9.270.800.000 8,63 Mixed sample Concentrate 5390 9,270,800,000 8.63
aus Fässern CALB-2012- 01 from barrels CALB-2012- 01
gemischt entspr. der mixed accordingly
jew. Massen jew. masses
(kg netto) der Fässer  (kg net) of the barrels
Uberstand nach 3h Immo2215 4.474.300.000 48  Supernatant after 3h Immo2215 4,474.3 million 48
bilisierung, nativ balancing, native
Uberstand nach 3h Immo2225 4.494.500.000 48 3,47 40,16 bilisierung, filtriert (PVDF  Supernatant after 3 hours Immo2225 4,494,500,000 48 3,47 40,16 bilation, filtered (PVDF
0,2μιη) 0,2μιη)
Uberstand nach 5h Immo1730 2.975.600.000 32  Supernatant after 5h Immo1730 2,975,600,000 32
bilisierung, nativ balancing, native
Uberstand nach 5h Immo1760 3.027.200.000 33 3,13 36,23 bilisierung, filtriert (PVDF  Supernatant after 5 hours Immo1760 3.027.200.000 33 3.13 36.23 stabilization, filtered (PVDF
0,2μιη) 0,2μιη)
Uberstand nach 7h Immo1220 2.098.400.000 23  Supervision after 7h Immo1220 2,098,400,000 23
bilisierung, nativ balancing, native
Überstand nach 7h Immobilisierung, filtriert (PVDF 1090 1 .874.800.000 20 1 ,79 20,68 0,2μιη)  Supernatant after 7h immobilization, filtered (PVDF 1090 1 .874.800.000 20 1, 79 20.68 0.2μιη)
Uberstand nach 9h Immo820 1 .410.400.000 15  Supernatant after 9h Immo820 1 .410.400.000 15
bilisierung, nativ balancing, native
Uberstand nach 9h Immo744 1 .279.680.000 14 1 ,45 16,85 bilisierung, filtriert (PVDF 0,2μπΊ) Supernatant after 9 h Immo744 1 .279.680.000 14 1, 45 16.88 precipitation, filtered (PVDF 0,2μπΊ)
Uberstand nach 12h Im502 863.440.000 9,3  Supernatant after 12h Im502 863.440.000 9.3
mobilisierung, nativ mobilization, native
Uberstand nach 12h Im460 791 .200.000 8,5 0,85 9,88 mobilisierung, filtriert  Supernatant after 12 h Im460 791 .200,000 8.5 0.85 9.88 mobilization, filtered
(PVDF 0,2μιτι) (PVDF 0,2μιτι)
Überstand nach 15h Im443 761 .960.000 8,2  Supernatant after 15h Im443 761 .960.000 8.2
mobilisierung, nativ mobilization, native
Uberstand nach 15h Im425 731 .000.000 7,9 0,92 10,69 mobilisierung, filtriert  Supernatant after 15 h Im425 731,000,000 7,9 0,92 10,69 mobilization, filtered
(PVDF 0,2μιτι) (PVDF 0,2μιτι)
Uberstand nach Ende 204 41 1 .070.000 4,3  Supernatant after the end 204 41 1 .070.000 4.3
Immobilisierung, nativ Immobilization, native
Uberstand nach Ende 174 351 .480.000 3,7 0,43 4,97 Immobilisierung, filtriert  Supernatant after end 174 351 .480,000 3,7 0,43 4,97 Immobilization, filtered
(PVDF 0,2μιτι) (PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 20,4  Wash water 3 after Im- 20.4
mob., Probe 1 nativ mob., sample 1 natively
Waschwasser 3 nach Im- 17,1 0,06  Washing water 3 after Im 17,16 .06
mob., Probe 1 filtriert mob., sample 1 filtered
(PVDF 0,2μιτι) (PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 35,8  Wash water 3 after Im- 35.8
mob., Probe 2 nativ mob., sample 2 natively
Waschwasser 3 nach Im- 19,5 0,06  Wash water 3 after Im 19.5 0.06
mob., Probe 2 filtriert mob., sample 2 filtered
(PVDF 0,2μιτι) (PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 28,0  Wash water 3 after Im- 28.0
mob., Probe 3 nativ mob., sample 3 natively
Waschwasser 3 nach Im- 33,4 0,07  Wash water 3 after Im- 33.4 0.07
mob., Probe 3 filtriert mob., sample 3 filtered
(PVDF 0,2μm) (PVDF 0.2μm)
Es wurde eine Immobilisierungseffizienz von 96,3% erreicht. Restfeuchtebestimmung im Verlauf der Vakuumtrocknung 0 53,1 - 74,2 An immobilization efficiency of 96.3% was achieved. Residual moisture determination in the course of vacuum drying 0 53.1 - 74.2
12 35,76  12 35.76
18 9,72  18 9.72
22 1 ,40  22 1, 40
Restfeuchte des abgefüllten Produktes Residual moisture of the bottled product
Mithilfe der Infrarotwaage wurde in einer Dreifachmessung der mittlere Trockengehalt der Probe, die aus dem abgefüllten Big-Bag entnommen wurde, bestimmt. Die Messungen ergaben folgendes Ergebnis (Infrarotwaage, Endpunkt: 30 sec. Waagenstillstand, Dreifachmessung: 5,3g /9,3g /4,6g):  The infra-red balance was used in a triple measurement to determine the mean dry content of the sample taken from the filled big-bag. The measurements gave the following result (infrared balance, end point: 30 sec. Balance standstill, triple measurement: 5.3 g / 9.3 g / 4.6 g):
Der mittlere Trockengehalt des abgefüllten Produktes liegt bei 99,1 1 %. Dies wiederum entspricht einer Restfeuchte von 0,89%. The mean dry content of the bottled product is 99.1 1%. This in turn corresponds to a residual moisture content of 0.89%.

Claims

Patentansprüche claims
1 . Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskon- tinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird. 1 . A process for the immobilization of proteins on a carrier, characterized in that the incubation of the protein with the carrier takes place in an aqueous phase in a discontinuous contact vacuum mixer dryer and immediately thereafter, optionally after an optional washing step, the drying of the immobilized protein in the same Contact vacuum mixer dryer is performed.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Kontakt- Vakuummischertrockner ein Taumeltrockner mit einem Innenvolumen von mehr als 100 L verwendet wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that a tumble dryer with an internal volume of more than 100 L is used as a contact vacuum mixer dryer.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Protein ein Enzym eingesetzt wird. 3. The method according to claim 1, characterized in that an enzyme is used as the protein.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine Lipase eingesetzt wird. 4. The method according to claim 1, characterized in that a lipase is used as the enzyme.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Lipase Candida antarctica Lipase B (CALB) oder eine davon strukturell abgeleitete Lipase verwendet wird. 5. The method according to claim 4, characterized in that is used as lipase Candida antarctica lipase B (CALB) or a structurally derived lipase thereof.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Träger ein Material mit hydrophober Oberfläche verwendet wird. 6. The method according to claim 1, characterized in that a material having a hydrophobic surface is used as the carrier.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als polymerer Träger ein ver- netztes Poly(meth)acrylat-haltiges Harz verwendet wird. 7. The method according to claim 1, characterized in that a crosslinked poly (meth) acrylate-containing resin is used as the polymeric support.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als polymerer Träger ein mit Divinylbenzol vernetztes, makroporöses Poly(meth)acrylatharz in sphärischer Perlenform eingesetzt wird, dessen Partikel zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80% der Masse, eine Größe von 50 μηη bis 2000 μηη aufweisen. 8. The method according to claim 7, characterized in that is used as a polymeric support crosslinked with divinylbenzene, macroporous poly (meth) acrylate resin in spherical bead form whose particles at least 60%, preferably at least 80% of the mass, a size of 50 μηη have up to 2000 μηη.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszeit des Proteins mit dem Träger 2-30 Stunden beträgt. 9. The method according to claim 1, characterized in that the incubation time of the protein with the carrier is 2-30 hours.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger bei einer Temperatur von 0 bis 40°C durchgeführt wird. 10. The method according to claim 1, characterized in that the incubation of the protein with the carrier is carried out at a temperature of 0 to 40 ° C.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknungstemperatur des immobilisierten Enzyms 30-60°C beträgt 1 1. A method according to claim 1, characterized in that the drying temperature of the immobilized enzyme is 30-60 ° C.
12. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung unter reduziertem Druck erfolgt. 12. The method according to claim 1, characterized in that the drying is carried out under reduced pressure.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung in einem Bereich von 5 bis 800 mbar durchgeführt wird. 13. The method according to claim 12, characterized in that the drying is carried out in a range of 5 to 800 mbar.
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