WO2015091046A1 - Verfahren zur immobilisierung und trocknung von enzymen - Google Patents

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WO2015091046A1
WO2015091046A1 PCT/EP2014/076844 EP2014076844W WO2015091046A1 WO 2015091046 A1 WO2015091046 A1 WO 2015091046A1 EP 2014076844 W EP2014076844 W EP 2014076844W WO 2015091046 A1 WO2015091046 A1 WO 2015091046A1
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protein
carrier
drying
enzyme
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Steffen Maurer
Robert Bayer
Michael Budde
Michael Kerber
Farzad FARIVAR-MEMAR
Jürgen Däuwel
Thomas Berg
Sascha ROLLIE
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Basf Se
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Definitions

  • the invention relates to an improved process for the immobilization and drying of proteins, in particular of enzymes, in particular of lipases.
  • Prior Art EP382767 describes a process for the immobilization of lipases.
  • an aqueous solution of a given lipase is mixed by rotation with a resin (for example Lewatit®) at a fixed pH at room temperature.
  • a resin for example Lewatit®
  • the immobilized lipase resin was collected by filtration, followed by washing with water and drying in vacuo.
  • the immobilization of enzymes is generally accompanied by loss of enzyme due to unbonding to the carrier or by desorption ("bleeding") of already bound enzyme
  • the immobilized enzyme often undergoes a loss of enzyme activity due to the immobilization steps, which is precisely the case technical scale leads to significant yield losses and thus increased costs.
  • the invention therefore an object of the invention to provide a method that allows to achieve efficient immobilization of the protein to the carrier, which means that as possible lent the entire amount of the enzyme present on the carrier is permanently bound and remains and that im In the case of an enzymatically active protein after immobilization, the same high enzymatic activity as possible is obtained as before immobilization.
  • a process has been found for the immobilization of proteins on a carrier, characterized in that the incubation of the protein with the carrier takes place in an aqueous phase in a discontinuous contact vacuum mixer dryer and immediately thereafter optionally after an optional washing step, the drying of the immobilized protein in It has now been found that the method defined at the outset leads to particularly advantageous results, since the entire steps of immobilization, such as efficient incubation of protein with carrier, optionally washing of the immobilized protein and drying of the immobilized protein to a stable , good storage and transportable product in a single apparatus are to be carried out.
  • This method is particularly well suited on an industrial scale when immobilized protein is to be produced in the three-digit kilogram to the ton scale. With the method according to the invention a multiplicity of proteins can be immobilized. It is particularly suitable for the immobilization of enzymes, such as oxidoreductases, hydrolases, isomerases and transferases.
  • hydrolases in particular of lipases.
  • CALB-derived lipases are lipases that have at least one, preferably two or more, amino acid changes, such as insertions, deletions or substitutions, to the CALB polypeptide sequence.
  • lipases which are structurally derived from CALB are described in WO 2009/080676 ("CALB muteins"), reference being made expressly to WO2009 / 080676 with regard to the disclosure of the CALB muteins.
  • the enzymes to be immobilized can be isolated from the original organism by known methods or also prepared by recombinant DNA techniques in suitable host organisms such as Bacillus, E. coli, Pichia, Chrysosporium, Aspergillus, Saccharomyces.
  • Suitable carriers are various organic or inorganic materials such as silica gel, activated carbon or polymer carrier.
  • macroporous crosslinked polymers having a particle size of 100 to 1000 ⁇ m and an average pore radius of 10 to 20 nm are suitable.
  • macroporous crosslinked acrylate polymers such as, for example, poly (meth) acrylates which are crosslinked with divinylbenzene, which may comprise, for example, acrylic acid, acrylic acid esters, methacrylic acid and methacrylic acid esters.
  • Such polymers are sold, for example, by the company Lanxess under the name Lewatit® VP OC 1600 or by the company DOW under the name Amberlite® XAD-7.
  • Suitable discontinuous contact vacuum mixer dryers are known to the person skilled in the art from the literature (eg Friedrich Kneule, Das Drying ", Sauerland AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941 -0429-3.) Particularly advantageous is the use of a vacuum tumble or double cone dryer.
  • Taumeltrockner are well suited with an inner volume of greater than 10 liters, preferably greater than 100 liters, preferably greater than one cubic meter.
  • the incubation of the protein to be immobilized with the carrier takes place in an aqueous phase, which is generally adjusted by buffer to a specific pH.
  • the enzyme-containing starting solution is separated from the immobilized enzyme. This is most easily done by filtration through a sieve plate mounted in the tumble dryer. If desired, the immobilized enzyme can then be further purified in a washing step. Such washing steps are also carried out by mixing the immobilized enzyme with the washing solution, usually water, and then separating the immobilized enzyme via an integrated filtration device.
  • the subsequent drying of the immobilized enzyme also takes place without further transfer in the discontinuous contact vacuum mixer dryer, wherein a negative pressure in the dryer of less than 1013 mbar, preferably less than 100 mbar is set.
  • the jacket temperature is set to less than 100 ° C., preferably less than 65 ° C., care being taken that the product temperature does not exceed a value of 50 ° C., preferably a value of 40 ° C.
  • the temperature of the immobilized enzyme it is not recommended to set the temperature of the immobilized enzyme to be dried above 50 ° C in order to avoid thermal inactivation of the enzyme. In cases of particularly temperature-insensitive enzymes, however, can be dried at over 50 ° C.
  • the drying time under the conditions given above is usually between 10 and 30 hours, preferably between 15 and 20 hours.
  • the aim is generally an immobilized product having a residual moisture content of less than 5%, preferably less than 2% and more preferably between 0.5 and 1.5% water.
  • a product prepared by the process according to the invention is readily storable at room temperature without significant loss of activity. Furthermore, it is easy to handle, i. it is easy to transfer and transfer. More specifically, the new method is described in the following example.
  • the tumble dryer T0055 used for this process has the following technical data:
  • the tumble dryer was rotated once every hour once an hour to avoid the formation of chunks
  • the internal temperature has a temperature difference of 5 ° C, depending on whether the tumble dryer is rotating or if the sensor is submerged in the solid
  • the dryer was positioned with the slider down
  • Big Bag No. 67291 120 hung on the filling device and inflated with N 2 and grounded exhaust air at filling device half open
  • TBU Total volatilestrogenicity
  • US [%] [g / L] protein
  • the infra-red balance was used in a triple measurement to determine the mean dry content of the sample taken from the filled big-bag.
  • the measurements gave the following result (infrared balance, end point: 30 sec. Balance standstill, triple measurement: 5.3 g / 9.3 g / 4.6 g):
  • the mean dry content of the bottled product is 99.1 1%. This in turn corresponds to a residual moisture content of 0.89%.

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Abstract

Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird.

Description

Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Enzymen
Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung und Trocknung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, insbesondere von Lipasen.
Stand der Technik EP382767 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipasen. Dabei wird eine wässrige Lösung einer gegebenen Lipase durch Rotation mit einem Harz (beispielsweise Lewatit ® ) bei festem pH bei Raumtemperatur vermischt. Dann wurde das Harz mit immobilisierter Lipase durch Filtration gesammelt, gefolgt von Waschen mit Wasser und Trocknen im Vakuum. Die Immobilisierung von Enzymen ist generell mit Verlust an Enzym infolge des Nichtbindens an den Träger bzw. durch Desorption („Ausbluten") von bereits gebundenem Enzym begleitet. Weiterhin erfährt das immobilisierte Enzym durch die Verfahrensschritte der Immobilisierung häufig einen Verlust an Enzymaktivität, was gerade im technischen Maßstab zu signifikanten Ausbeuteverlusten und damit erhöhten Kosten führt.
Beschreibung der Erfindung
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren aufzufinden, das es gestattet, eine effiziente Immobilisierung des Proteins an den Träger zu erreichen, was bedeutet, dass mög- liehst die gesamte Menge des vorhandenen Enzyms am Träger permanent gebunden wird und verbleibt und dass im Falle eines enzymatisch aktiven Proteins nach Immobilisierung möglichst die gleiche hohe enzymatische Aktivität erhalten wird t wie vor Immobilisierung.
Gefunden wurde ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird Es wurde nun gefunden, dass das eingangs definierte Verfahren zu besonders vorteilhaften Ergebnissen führt, da die gesamten Schritte der Immobilisierung wie effizientes Inkubieren von Protein mit Träger, ggf. Waschen des immobilisierten Proteins und Trocknen des immobilisierten Proteins zu einem stabilen, gut lager- und transportfähigen Produkt in einem einzigen Apparat durchzuführen sind. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut im technischen Maßstab, wenn immobilisiertes Protein im dreistelligen Kilogramm- bis hin zu Tonnenmaßstab hergestellt werden soll. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können eine Vielzahl von Proteinen immobilisiert werden. Besonders geeignet ist es für die Immobilisierung von Enzymen, wie Oxidoreduktasen Hydrola- sen, Isomerasen und Transferasen.
Besonders gut geeignet ist es für die Immobilisierung von Hydrolasen, insbesondere von Lipa- sen.
Innerhalb der Lipasen lassen sich besonders gut diejenigen Lipasen aus Candida antarctica immobilisieren, insbesondere die Candida Antarctica Lipase B (CALB) oder solche Enzyme, die davon strukturell abgeleitet sind. Solche strukturell von CALB abgeleitete Lipasen sind Lipasen, die mindestens eine, bevorzugt zwei oder mehrere Aminosäureveränderungen, wie Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, gegenüber der CALB Polypeptidsequenz aufweisen.
Beispiele für solche von CALB strukturell abgeleitete Lipasen sind in der WO 2009/080676 beschrieben („CALB-Muteine"), wobei auf die WO2009/080676 hinsichtlich des Offenbarungsgehal- tes der CALB-Muteine ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die zu immobilisierenden Enzyme können aus dem ursprünglichen Organismus durch bekannte Verfahren isoliert oder auch durch rekombinante DNA-Techniken in geeigneten Wirtsorganismen wie Bacillus, E.coli, Pichia, Chrysosporium, Aspergillus, Saccharomyces hergestellt werden.
Als Träger sind verschiedene organische oder anorganische Materialien wie Kieselgel, Aktivkohle oder Polymerträger geeignet. Als polymerer Träger sind makroporöse vernetzte Polymere mit einer Teilchengröße von 100 bis 1000 um und einem mittleren Porenradius von 10-20 nm geeignet. Besonders geeignet sind makroporöse vernetzte Acrylat-Polymere wie z.B. Po- ly(meth)acrylate, die mit Divinylbenzol vernetzt sind, welche beispielsweise Acrylsäure, Acrylsäu- reester, Methacrylsäure und Methacrylsäureester enthalten können. Solche Polymere werden z.B. von der Firma Lanxess unter der Bezeichnung Lewatit® VP OC 1600 oder von der Firma DOW unter der Bezeichnung Amberlite ® XAD-7 vertrieben.. Geeignete diskontinuierliche Kontakt-Vakuummischertrockner sind dem Fachmann aus der Literatur (z.B. Friedrich Kneule,„Das Trocknen", Sauerländer AG, Aarau, 1975, ISBN 3-7941 -0429-3 bekannt). Besonders vorteilhaft ist die Verwendung eines Vakuum-Taumel- oder Doppelkonus- trockners. Gut geeignet sind Taumeltrockner mit einem Innenvolumen von größer als 10 Litern, bevorzugt größer als 100 Litern, bevorzugt größer als ein Kubikmeter.
Die Inkubation des zu immobilisierenden Proteins mit dem Träger geschieht in einer wässrigen, in der Regel durch Puffer auf einen bestimmten pH-Wert eingestellten Phase.
Der pH-Wert hängt von der Natur des zu immobilisierenden Enzyms ab, hauptsächlich vom isol- elektischen Punkt des Enzyms. Als vorteilhaft hat sich ein pH-Bereich von 3 bis zu 1 1 , insbesondere von 4 bis 8 herausgestellt.
Für CALB Lipasen wird ein pH-Bereich von 4,8 - 5,2 empfohlen.
Als Puffer für die wässrige Phase geeignet sind beispielsweise Phosphat- und Acetatpuffer. Die Inkubation erfolgt in der Regel bei einer Temperatur zwischen 0°C und 40°C, insbesondere zwischen 4°C und 30°C. Wenn das zu immobilisierende Enzym besonders temperaturtolerant ist, können auch Temperaturen oberhalb von 50°C in Betracht kommen.
Nach der Inkubation wird die Enzym-haltige Ausgangslösung vom immobilisierten Enzym ge- trennt. Dies geschieht am einfachsten durch Filtration über eine Siebplatte, die im Taumeltrockner angebracht wird. Anschließend kann das immobilisierte Enzym gewünschtenfalls in einem Waschschritte noch gereinigt werden. Solche Waschschritte erfolgen ebenfalls durch Mischen des immobilisierten Enzyms mit der Waschlösung, in der Regel Wasser, und anschliessendes Trennen vom immobilisierten Enzym über eine integrierte Filtrationseinrichtung.
Die anschließende Trocknung des immobilisierten Enzymes erfolgt ebenfalls ohne weiteres Umfüllen in dem diskontinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner, wobei ein Unterdruck im Trockner von kleiner als 1013 mbar, bevorzugt kleiner als 100 mbar eingestellt wird. Die Manteltemperatur wird auf kleiner 100°C, bevorzugt kleiner65°C eingestellt, wobei darauf geachtet wird, dass die Produkttemperatur einen Wert von 50°C, bevorzugt einen Wert von 40°C nicht überschreitet..
Es empfiehlt sich in der Regel nicht, die Temperatur des zu trocknenden immbobilisierten En- zyms auf über 50°C einzustellen, um eine thermische Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden. In Fällen von besonders temperaturunempfindlichen Enzymen kann jedoch auch bei über 50°C getrocknet werden. Die Trocknungszeit beträgt unter den oben angegebenen Bedingungen üblicherweise zwischen 10 und 30 Stunden, bevorzugt zwischen 15 und 20 Stunden. Angestrebt wird in der Regel ein immobilisiertes Produkt mit einer Restfeuchte von weniger als 5%, bevorzugt weniger als 2% und besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1 ,5 % Wasser.
Wenn das Produkt zu sehr getrocknet wird kann es zu statischer Aufladung kommen, was die Handhabbarkeit teilweise erschwert.
Ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Produkt ist bei Raumtemperatur gut lagerfähig, ohne dass es zu nennenswerten Aktivitätsverlusten kommt. Weiterhin ist es gut handhabbar, d.h. es lässt sich gut ein- und umfüllen. Im Einzelnen ist das neue Verfahren in dem folgenden Beispiel beschrieben.
Beispiel:
Immobilisierung von CALB auf Lewatit® im 500 kg Maßstab
Der für dieses Verfahren eingesetzte Taumeltrockner T0055 besitzt folgende technische Daten:
• Volumen: 6,3 m3
• Heizfläche: 17 m2 1. Eingesetzte Rohstoffe
Für die Versuchsdurchführung werden folgende Komponenten benötigt:
• Lewatit® VP OC 1600 feucht (Fa. Lanxess) [544 kg]
• Lipase Ultrafiltrat CALB-2012-01 [21 kg Protein]
• VE-Wasser (für 3 Waschgänge) [3 x 2000L]
· N2- Strippgas [5-20 Nm3/h]
Laut Vorschrift sollen insgesamt 544 kg des feuchten Lewatit eingefüllt werden. Diese 544 kg des feuchten Lewatit entsprechen etwa 233 kg trockenem Lewatit. Für die Lipase ergibt sich eine spezifische Aktivität von 460 TBU/mg Protein und eine Reinheit von 61 %. Für die Immobilisierung wird die gesamte Menge von 21 kg Enzym verwendet. 2. Versuchsdurchführung
Beschickung des Taumeltrockners mit Lewatit ® und erster Waschvorgang
· um 8.15 Uhr wurde damit begonnen, die Lewatit- Fässer zu wiegen und anschließend über einen Trichter in den Taumeltrockner zu geben
• insgesamt wurden 544,1 kg feuchtes Lewatit VP OC 1600 in den Trockner gegeben es wurde eine Mischprobe aus allen Fässern zusammengestellt
• anschließend wurden über einen Schlauch 2000 L VE-Wasser (über Wasseruhr)mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 80 -90 l/min ebenfalls über den Trichter in den Trockner gegeben
— > der Trichter wurde dabei von Lewatitresten befreit
• der Befüllvorgang war um 8.55 Uhr beendet
• beim Blick in den Trockner konnte man erkennen, dass sich das Wasser leicht milchig ver- färbt hatte und das sich etwas eiweißartiger Schaum auf der Oberfläche gebildet hatte
• nun wurde das Siebpassstück (160 μηη) auf dem Mannlochdeckel angebracht (9.20 Uhr)
• anschließend wurde der Trockner zur Dichtheitsprüfung auf 78,6 mbar evakuiert
• danach wurde wieder auf Normaldruck (1020 mbar) entspannt (9.30 Uhr)
• dann wurde 2 Stunden, bei Normaldruck, Raumtemperatur und 0,33 upm gemischt (dazu wurde der Antriebsmotor am Taumeltrockner auf 5,5 Hz eingestellt, was 0,33 upm entspricht
— > manuell nachgemessen: 1 U /2,43 Min = 0,41 upm)
— > das Heizbad stand dabei auf voller Kühlung
• nach Ablauf der 2 Stunden (1 1 .26 Uhr) wurde der T0055 mit dem Deckel nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert — > dabei wurde mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert
— > der Überdruck wurde durch das Zuleiten von Stickstoff erzeugt
• nach 20 L, 1000 L und 1700 L wurde jeweils eine Probe genommen
— > rein optisch wies die erste Probe eine leichte Trübung auf, allerdings setzte sich am
Boden nichts ab
— > die zweite und die dritte Probe waren klar; gegen das Licht waren einzelne kleine
Schwebeteilchen erkennbar
• insgesamt wurden 1700 L Wasser abgelassen (1 1 .30 Uhr - 12.25 Uhr)
• die IBCTs wurden nun 2 Stunden ruhen gelassen
• anschließend wurde kontrolliert, ob sich am Boden Schwebeteilchen abgesetzt hatten; dies war jedoch nicht der Fall
• die mit Waschwasser gefüllten IBCTs wurden gewogen IBC 1 : 1003 kg Netto
IBC 2: 717 kg Netto
dann wurde das Wasser ins bbA abgelassen Zweiter Waschvorgang
• das Mannloch wurde wieder nach oben positioniert
• anschließend wurden 2000 L Wasser (2000 kg), welche sich bereits in zwei 1000 L IBCTs befanden, mit 800 - 700 mbar abs. eingesaugt (12.40 Uhr - 13.22 Uhr)
• pro Container dauerte der Befüllvorgang etwa 20 Minuten
· anschließend wurde im Taumeltrockner 2 Stunden bei 0,33 upm (5,5 Hz), Raumtemperatur und Normaldruck gemischt
• nach Ablauf der 2 Stunden wurde das Mannloch nach unten positioniert und das Waschwasser über das eingebaute 160 μηη Sieb in IBCTs abfiltriert
— > hierbei wurde wieder mit einem Überdruck von 100-200 mbar filtriert
· nach 50 L, 1000 L und 2000 L wurde jeweils eine Probe genommen
• insgesamt wurden etwa 2050 L Wasser abgelassen
• die Filtration dauerte pro Container (d.h. pro 1000 L) etwa 30 Minuten
• die mit Waschwasser gefüllten IBC's wurden anschließend gewogen
IBC 1 : 1002 kg Netto
IBC 2: 1043 kg Netto
• danach wurde das Waschwasser ins bbA abgelassen
• anschließend wurde eine Probe des gewaschenen Lewatits gezogen
— > hierbei fiel auf, das der Filterkuchen nach dem Stoppen der Drehung des Trockners leicht schräg an der Innenwand stand
· der Taumeltrockner wurde über Nacht jede Stunde einmal gedreht, um die Bildung von Brocken zu vermeiden
Lipasezugabe und Immobilisierung
• die gekühlt gelieferten Lipase- Fässer wurden zunächst noch einmal gewogen
-> 1749,6 kg Lipase Netto
• anschließend wurde aus jedem Fass eine 2 L Probe gezogen (9.30 Uhr - 9.50 Uhr)
• die insgesamt 9 Fässer (je 200 L) mit der Lipase CALB-2012-01 wurden in den Taumeltrockner gefüllt
• dazu wurde der Inhalt von je 3 Fässern in den Trockner eingesaugt
· hierzu wurde ein Unterdruck von 300 mbar angelegt
• zuerst wurden die Gebinde 7,8,9 eingefüllt (10.19 Uhr - 10.32 Uhr) • im Fass blieb nur eine sehr geringe Menge Enzymlösung zurück
— > nach Zugabe des Inhalts von je 3 Fässern wurde der Trockner jeweils 10 Minuten bei 0,33 upm gedreht
• Anschließend folgte das Einsaugen des Inhalts der Gebinde 3,2,1 (1 1.06 Uhr - 1 1 .23 Uhr) und das 10 minütige Drehen bei 0,33 upm
• zuletzt wurde der Inhalt der Gebinde 6,5,4 eingesaugt (1 1 .52 Uhr - 12.07 Uhr)
• von 12.20 Uhr bis 13.00 Uhr wurde mit 200 mbar abs. und 0,33 upm gedreht
• um 13.00 Uhr wurde der Taumeltrockner bis auf 900 mbar abs. entgast
• anschließend wurde bis 13.15 Uhr bei 100 - 200 mbar Unterdruck weiter gemischt
— > die Innentemperatur lag hier bei 20°C; aus diesem Grund wurde die Kühlung, welche auf
24°C eingestellt war, abgestellt
• danach wurde im Trockner ein leichter Überdruck von 100 - 200 mbar angelegt
• unter diesen Bedingungen wurde der Trockner 15 Stunden lang mit 0,33 upm bewegt
• dabei wurden jede Stunde Druck und die Temperatur notiert
· nach Ablauf der ersten 3 Stunden (15.15 Uhr) wurde die erste Probe (250 ml) vom Überstand des Immobilisats genommen und im Kühlschrank bei 8-14°C aufbewahrt
• insgesamt wurden Proben nach 3, 5, 7, 9, 12 und 15 Stunden Immobilisierung gezogen
• nach Ablauf der 15 Stunden wurde der Trockner abgestellt und nur jede Stunde einmal (1 Umdrehung) gedreht (bis nächsten Tag, 7.00 Uhr)
Filtration der Enzym-Lewatit-Lösung nach der Immobilisierung
• um 7.00 Uhr wurde der Taumeltrockner nochmals gedreht und mit dem Mannlochdeckel nach unten positioniert
• nun wurde ein Überdruck von etwa 100 mbar im Trockner angelegt
· anschließend wurde die Mutterlauge über das 160 μηη Sieb in IBCTs ablaufen gelassen (7.10 Uhr - 8.20 Uhr)
• eine erste Probe wurde nach etwa 300 L in einer Glasflasche gezogen
—►hierbei fiel auf, dass die Probe trüber und nicht mehr ganz so dunkelgrün wie am Vortag war und zudem schäumte
— >die Probe war also optische heller und trüber als die des Vortages, zudem roch sie nun anders (nach Buttersäure)
• die zweite Probe wurde nach etwa 900 L ebenfalls wieder in eine Glasflasche entnommen
• da die Mutterlauge beim Abfüllen in den IBC so stark schäumte, konnte der erste IBC nur mit 900 L Mutterlauge befüllt werden
· nachdem der zweite IBC ebenfalls mit etwa 700 L Mutterlauge gefüllt war, wurde erstmals Stickstoff mit ausgeblasen • aus diesem Grund wurden die Hähne geschlossen und 10 Minuten gewartet, um der Mutterlauge Zeit zu geben, sich unten abzusetzen
• anschließend wurde der Rest der Mutterlauge in den IBC gegeben
• dabei wurde eine dritte Probe in eine Glasflasche gezogen
· insgesamt war der zweite IBC am Ende mit 750 L Mutterlauge gefüllt
• zum Schluss wurden die beiden IBC's gewogen
-> IBC 1 + 2 = 1683 kg Netto
Waschen der immobilisierten Lipase
· nach dem Ablassen der Mutterlauge wurde der Taumeltrockner zunächst einmal gedreht und mit dem Schieber nach oben positioniert
• über den Schieber wurde anschließend eine Probe des feuchten, ungewaschenen Immobi- lisats entnommen
— > das Immobilisat hatte sich wieder seitlich am Trockner abgesetzt
— > das Immobilisat hatte einen leichten Grünstich
• anschließend wurde der Trockner wieder so gedreht, dass sich der Mannlochdeckel oben befand
• im Trockner wurde ein Unterdruck von etwa 300 mbar angelegt
• dann wurden 2000 L VE-Wasser (abgefüllt in 2 IBC) in den Taumeltrockner eingesaugt (8.55 Uhr - 9.30 Uhr)
• anschließend folgte 2 Stunden mischen bei 0,33 upm, Raumtemperatur und Normaldruck
• nach Ablauf der 2 Stunden wurde der Mannlochdeckel nach unten positioniert
• im Trockner wurde ein Überdruck von 400 -580 mbar angelegt und das Waschwasser in IBC's abgelassen (1 1.45 Uhr - 13.15 Uhr)
· nach 50 L wurde die erste, nach 1000 L die zweite und nach 1825 L die dritte Probe genommen
— > alle Proben waren leicht grünlich trüb; es setzte sich jedoch kein Bodensatz ab — > man konnte aber keinen großen Unterschied zwischen den Proben erkennen
• ab etwa 1750 L abgelassenem Waschwasser wurde erstmals N2 mit ausgeblasen
· ab etwa 1850 L abgelassenem Waschwasser wurde ein dritter IBC nach draußen gestellt und die Leitung nach draußen gelegt, da sehr große Mengen an Stickstoff mit ausgeblasen wurden
• nun wurde ein Überdruck von 900 mbar auf den Trockner gelegt, um wirklich das gesamte Wasser heraus zu filtrieren
· unter diesem Druck wurde 15 Minuten lang trocken geblasen (zum Ende hin kam nur noch Stickstoff aus der Leitung und vereinzelte Tropfen vom Waschwasser) • anschließend wurden die IBCTs gewogen
-> IBC 1 + 2 = 1921 kg Netto
• danach wurde über das Mannloch eine 1 L Probe vom Feststoff gezogen
— > auch diese Probe war ganz leicht grünlich (jedoch nicht so stark wie die zuvor gezogene Feststoffprobe)
Vakuumtrocknung
• der Taumeltrockner wurde zunächst unter Drehen (Rotation) mit 0,33 upm evakuiert
• anschließend wurde die Drehung (Rotation) stufenweise auf 2,4 upm erhöht (1/ 1 ,5/ 2,0/ 2,4 upm)
— > von außen betrachtet lief der Trockner sehr ruhig, was wiederum auf ein gleichmäßiges Abrutschen (Abgleiten) des Immobilisats von der Trocknerwand hindeutet (zu diesem Zeitpunkt haben sich also noch keine größeren Brocken gebildet)
• um 14.20 Uhr wurde die Beheizung auf 50°C gestellt
· um 17.30 Uhr wurde er wieder geschlossen und stattdessen der Stripp- Stickstoff auf
25 m3/h eingeregelt
• um 2.15 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um die erste Probe ziehen zu können
• nach einer Kühlzeit von 2 h wurde um 4.15 Uhr die erste Probe des Immobilisats gezogen — > die Innentemperatur war von 39,3°C auf 23°C gesunken
· die Probe wurde zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gegeben
-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 35,76%
• um 8.25 Uhr wurde der Trockner mit dem Schieber nach unten positioniert und 5 Minuten zwecks Temperaturmessung so stehen gelassen
— > die Innentemperatur hat einen Temperaturunterschied von 5°C, abhängig davon, ob sich der Taumeltrockner dreht, oder ob der Messfühler in den Feststoff eingetaucht ist
• um 13.45 Uhr wurde die Kühlung eingestellt, um eine zweite Probe ziehen zu können
• nach einer Kühlzeit von 30 Minuten wurde dann die Probe gezogen
— > hierbei fiel auf, dass sich zwischen den weißen Kugeln des Immobilisats auch kleinere, dunkle (braune) Teilchen befanden
· im betriebseigenen Labor wurde dann die Restfeuchte bestimmt
-> Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 9,72%
• Probe anschließend im Kühlschrank aufbewahrt
• um 17.28 Uhr stieg die Innentemperatur auf 46°C— > Bad auf 50°C genommen
• um 17.47 Uhr war die Innentemperatur wieder auf 45, 5°C gesunken— > Bad auf 53°C ge- nommen
• ab 18.00 Uhr wurde begonnen zu kühlen • von 19.00 Uhr - 19.20 Uhr wurde die Probe genommen und zur Restfeuchtebestimmung ins betriebseigene Labor gebracht
— > Restfeuchtebestimmung bei 105°C /60 Minuten: 1 ,4%
• da die Restfeuchte unter dem Sollwert von 3% lag, wurde die Trocknung beendet
· um 20.30 Uhr wurde das Vakuum aufgehoben
— > dabei stieg die Temperatur von 25°C auf 31 ,7°C
• um 20.50 Uhr wurde der Antrieb bei einer Innentemperatur von 25,8°C abgeschaltet
• ab diesem Zeitpunkt wurde der Trockner alle 2 Stunden einmal gedreht Abfüllung
der Trockner wurde mit dem Schieber nach unten positioniert
anschließend wurde der Siebeinsatz wieder ausgebaut
— > leichter Produktrückstand am Sieb
Mannlochdeckel für Abfüllvorgang ein Stück offen stehen lassen
· Nibbler/ Passstück montiert
anschließend mit etwa 2,4 m3/h N2 inertisiert
Big-Bag Nr. 67291 120 an die Abfülleinrichtung gehängt und mit N2 aufgeblasen und geerdet Abluft an Abfülleinrichtung halb geöffnet
mithilfe eines Handhahnes Produkt zuerst vorsichtig ablaufen lassen; später etwa auf halbe Stellung gedreht
— > das Immobilisat ist ohne Probleme in den aufgehängten Big-Bag gerieselt, ohne dabei an der Folie oder im Trockner selbst hängen zu bleiben
— > der Big-Bag hatte sich auch nur einmal ganz kurz aufgeblasen, als für einen kurzen Moment etwas mehr Produkt kam
· anschließend wurden die Reste, die sich noch im Taumeltrockner befanden, abgeklopft — > insgesamt blieben keine großen Rückstände im Taumeltrockner (nur 3 etwa DIN A3 große Stellen, an denen sich eine vielleicht 2mm dicke Schicht gebildet hatte; sonst war die
Trocknerinnenwand nur von einer ganz feinen Staubschicht belegt)
· aus dem Big-Bag wurde noch eine 1 L Probe in einer Plastikflasche gezogen
• zuletzt wurde der Big-Bag noch gewogen und anschließend trocken gelagert
— > Tara: 25 kg
-> Brutto: 271 kg
• der Abfüllvorgang selbst dauerte nur etwa 5 Minuten (mitsamt der Vorbereitung waren es etwa 20 Minuten) 3. Analysenergebnisse
Es wurde eine theoretische absolute Aktivität von 9.460.000.000 TBU beim Start berechnet
Messwerte Aktivität / Gesamtprotein im Verlauf der Immobilisierung:
Probe VoluGesamtRestakGesamtGemenaktivität tivität im protein samtaktivität [TBU] US [%] [g/L] protein [TBU/m abs.rechn. vom CooPlus [%] L] Start/BGG CooPlu wert s
/BGG
Mischprobe Konzentrat 5390 9.270.800.000 8,63
aus Fässern CALB-2012- 01
gemischt entspr. der
jew. Massen
(kg netto) der Fässer
Uberstand nach 3h Immo2215 4.474.300.000 48
bilisierung, nativ
Uberstand nach 3h Immo2225 4.494.500.000 48 3,47 40,16 bilisierung, filtriert (PVDF
0,2μιη)
Uberstand nach 5h Immo1730 2.975.600.000 32
bilisierung, nativ
Uberstand nach 5h Immo1760 3.027.200.000 33 3,13 36,23 bilisierung, filtriert (PVDF
0,2μιη)
Uberstand nach 7h Immo1220 2.098.400.000 23
bilisierung, nativ
Überstand nach 7h Immobilisierung, filtriert (PVDF 1090 1 .874.800.000 20 1 ,79 20,68 0,2μιη)
Uberstand nach 9h Immo820 1 .410.400.000 15
bilisierung, nativ
Uberstand nach 9h Immo744 1 .279.680.000 14 1 ,45 16,85 bilisierung, filtriert (PVDF 0,2μπΊ)
Uberstand nach 12h Im502 863.440.000 9,3
mobilisierung, nativ
Uberstand nach 12h Im460 791 .200.000 8,5 0,85 9,88 mobilisierung, filtriert
(PVDF 0,2μιτι)
Überstand nach 15h Im443 761 .960.000 8,2
mobilisierung, nativ
Uberstand nach 15h Im425 731 .000.000 7,9 0,92 10,69 mobilisierung, filtriert
(PVDF 0,2μιτι)
Uberstand nach Ende 204 41 1 .070.000 4,3
Immobilisierung, nativ
Uberstand nach Ende 174 351 .480.000 3,7 0,43 4,97 Immobilisierung, filtriert
(PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 20,4
mob., Probe 1 nativ
Waschwasser 3 nach Im- 17,1 0,06
mob., Probe 1 filtriert
(PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 35,8
mob., Probe 2 nativ
Waschwasser 3 nach Im- 19,5 0,06
mob., Probe 2 filtriert
(PVDF 0,2μιτι)
Waschwasser 3 nach Im- 28,0
mob., Probe 3 nativ
Waschwasser 3 nach Im- 33,4 0,07
mob., Probe 3 filtriert
(PVDF 0,2μm)
Es wurde eine Immobilisierungseffizienz von 96,3% erreicht. Restfeuchtebestimmung im Verlauf der Vakuumtrocknung
Figure imgf000013_0001
0 53,1 - 74,2
12 35,76
18 9,72
22 1 ,40
Restfeuchte des abgefüllten Produktes
Mithilfe der Infrarotwaage wurde in einer Dreifachmessung der mittlere Trockengehalt der Probe, die aus dem abgefüllten Big-Bag entnommen wurde, bestimmt. Die Messungen ergaben folgendes Ergebnis (Infrarotwaage, Endpunkt: 30 sec. Waagenstillstand, Dreifachmessung: 5,3g /9,3g /4,6g):
Der mittlere Trockengehalt des abgefüllten Produktes liegt bei 99,1 1 %. Dies wiederum entspricht einer Restfeuchte von 0,89%.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger in einer wässrigen Phase in einem diskon- tinuierlichen Kontakt-Vakuummischertrockner erfolgt und daran unmittelbar anschließend ggf. nach einem optionalen Waschschritt die Trocknung des immobilisierten Proteins in demselben Kontakt-Vakuummischertrockner durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Kontakt- Vakuummischertrockner ein Taumeltrockner mit einem Innenvolumen von mehr als 100 L verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Protein ein Enzym eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine Lipase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Lipase Candida antarctica Lipase B (CALB) oder eine davon strukturell abgeleitete Lipase verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Träger ein Material mit hydrophober Oberfläche verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als polymerer Träger ein ver- netztes Poly(meth)acrylat-haltiges Harz verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als polymerer Träger ein mit Divinylbenzol vernetztes, makroporöses Poly(meth)acrylatharz in sphärischer Perlenform eingesetzt wird, dessen Partikel zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80% der Masse, eine Größe von 50 μηη bis 2000 μηη aufweisen.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszeit des Proteins mit dem Träger 2-30 Stunden beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation des Proteins mit dem Träger bei einer Temperatur von 0 bis 40°C durchgeführt wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknungstemperatur des immobilisierten Enzyms 30-60°C beträgt
12. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung unter reduziertem Druck erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung in einem Bereich von 5 bis 800 mbar durchgeführt wird.
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