EP3022554A1 - Procédé et kit pour l'identification de composés d'un mélange organique - Google Patents

Procédé et kit pour l'identification de composés d'un mélange organique

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Publication number
EP3022554A1
EP3022554A1 EP14741305.8A EP14741305A EP3022554A1 EP 3022554 A1 EP3022554 A1 EP 3022554A1 EP 14741305 A EP14741305 A EP 14741305A EP 3022554 A1 EP3022554 A1 EP 3022554A1
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EP
European Patent Office
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mixture
chromatogram
column
probes
probe
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14741305.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Daniel Dessort
Jacques Bickert
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TotalEnergies SE
Original Assignee
Total SE
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Filing date
Publication date
Application filed by Total SE filed Critical Total SE
Publication of EP3022554A1 publication Critical patent/EP3022554A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
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    • G—PHYSICS
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    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
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    • G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph
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    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present invention relates to a method of forming a chromatogram collection of a reference mixture of organic compounds.
  • the present invention also relates to a method for identifying compounds of a sample of an organic mixture using a chromatogram collection.
  • the present invention further relates to a kit for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture.
  • the invention belongs to the field of analytical chemistry.
  • a mixture is a combination of two or more substances that do not chemically interact with one another. These substances are closely juxtaposed in the same space to form a product. Each of these substances retains its physical and chemical properties.
  • the analysis of complex mixtures is carried out by separation techniques generally coupled with identification techniques.
  • the most widely used separation technique is chromatography, such as liquid chromatography or gas chromatography. This technique allows separating the constituents of a mixture by virtue of the joint use of two immiscible phases one in the other, one of whose phases is in motion, and in which the solutes to be separated are distributed in a differential manner.
  • the identification by chromatography of the constituents of a complex mixture is not always successful even when a chromatography column is coupled to sophisticated detectors, such as for example a mass spectrometer or emission spectrometer. atomic.
  • the chromatograms obtained are analyzed by a specialist in chromatography techniques. This specialist performs a visual identification of the different chromatographic peaks. It judges the presence or absence of the compound to be identified by the location, the measurement of the surface and / or the height of the chromatographic peak which is a function of the quantity of the product that it represents.
  • the disadvantage of this method is that it is very empirical, subjective, unproductive and requires the intervention of a specialist.
  • Another chromatographic analysis technique that can be used to study the constituents of a complex mixture consists of an automatic identification of the constituents by their retention time generally visualized using, for example, a UV spectrometer (ultraviolet ) in liquid chromatography or using a flame ionization detector in gas chromatography.
  • UV spectrometer ultraviolet
  • a flame ionization detector in gas chromatography.
  • These techniques require calibration of the device with internal or external standard compounds.
  • the disadvantage of this method is that it is valid in a limited period of time, that is to say as long as the aging of the column is not too sensitive. Indeed, as the chromatography column ages, it results in a slow drift of the initial chromatographic characteristics such as a change in the baseline, a change in product retention times, etc. The identification of the constituents of a mixture becomes difficult despite the calibrations performed.
  • Another disadvantage of this method is the high number of calibrations necessary to take account of the aging of the column. These time-consuming calibrations are expensive since
  • the previous method has been improved by the use of retention indices to automatically identify the compounds.
  • This method requires the use of two reference compounds: usually a compound having a lower retention time (compound A) at the retention times of the compounds to be analyzed, the other having a higher retention time (compound D) than the retention time of the compounds of interest.
  • the relative retention time (or retention index) of a compound (compound B) corresponds to the ratio between the difference in the retention time of compound B and the retention time of compound A on the one hand and the difference between the retention time of compound D and the retention time of compound A on the other hand.
  • Compounds A and D are two known and easily identifiable compounds on a chromatogram and are therefore taken as reference. This method of retention indexes is more accurate than the retention time method. However, it does not limit the number of calibrations, nor the monitoring and validation of results by a specialist. Indeed, the retention indices themselves are subject to fluctuations with the aging of the chromatographic column.
  • the object of the present invention is to provide a process for identifying at least one compound of an organic mixture employing at least one separation step by a chromatography column at least partially overcoming the aforementioned drawbacks.
  • the present invention relates to a method of forming a chromatogram collection of a reference mixture, the chromatograms being periodically recorded during the lifetime of a chromatographic column, during the training period.
  • the present invention also relates to a method for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture by comparing the chromatogram of the sample of the mixture to be analyzed with those of the chromatogram collection previously constituted.
  • the invention relates to a kit for implementing the above methods.
  • the present invention advantageously makes it possible to limit or even eliminate the number of calibrations that must be carried out before each chromatographic analysis.
  • the present invention also makes it possible to increase the reliability of the identification of the compounds of a mixture.
  • the validation of the results by a specialist is no longer required in the implementation of the invention.
  • the present invention can easily be adapted to all kinds of organic mixtures.
  • the present invention can be adapted to any chromatographic column separation technique.
  • the method of identifying compounds of an organic mixture according to the invention has the advantage of being automatable.
  • the subject of the present invention is a method for constituting a collection of chromatogram data of a reference mixture R1 of organic compounds comprising at least two M markers and for at least one chromatographic device comprising at least one column.
  • chromatographic system and at least one detection means measuring a physical quantity comprising the following steps:
  • a mixture R2 is formed comprising at least two probes S, each probe S being characterized by a unambiguous signal detectable at a specific value VS probe of the measured physical quantity;
  • step d) the retention time of each of the probes S is identified on the chromatogram of step d) so as to obtain an Eo imprint
  • the invention comprises one or more of the following characteristics, taken alone or in combination: the probe S is a probe labeled with at least one marker group chosen from the group formed by a chromophore which absorbs ultraviolet radiation , a chromophore that absorbs infra-red, by a phosphor or a stable isotope;
  • the chromatography column is chosen from the group formed by an adsorption column, a partition column, an affinity column, an ion exchange column or a size exclusion column, preferably a partition column; ;
  • the measured physical quantity is chosen from a wavelength, a mass-to-charge ratio m / z, an intensity, a voltage, a chemical shift;
  • the measured physical quantity is a mass / charge ratio m / z and the detection means is a mass spectrometer;
  • the recording of the chromatogram of step (d) is carried out by recording all the spectrograms of the mass / charge ratios or by recording certain spectrograms at defined weight / charge ratios.
  • the present invention also relates to a chromatography collection C 0 , Ci, C 2 . . .. This. . .. C n resulting:
  • n being an integer n> 0, a reference RI mixture of organic compounds comprising at least two M markers and a R2 mixture comprising at least two labeled S probes, on a chromatography column and the detection of the components of the R1 + R2 mixture using at least one detection means measuring at least a physical quantity, each probe S being characterized by at least one unambiguous signal detectable at a specific value VS its d e of the measured physical quantity, and
  • each chromatogram Ci with c ⁇ i ⁇ n having an imprint Ei with c o ⁇ i ⁇ n corresponding to the retention times of the probes of the mixture R2.
  • the present invention also relates to a method for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture, the process comprising the following steps: (a1) providing a chromatographic device comprising at least one chromatographic column and at least one detection means measuring a physical quantity, said detection means being coupled to the chromatographic column,
  • step (b1) At least one collection of chromatograms of a reference mixture R1 and an R2 mixture of probes S defined above or obtained by carrying out the process as described above is provided by using a chromatographic column and a detection means identical to those used in step (a1),
  • the invention comprises one or more of the following features, taken alone or in combination:
  • the organic mixture is a crude oil
  • the reference mixture RI comprises at least 2 M-markers chosen from the group formed by saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched comprising from 5 to 50 carbon atoms, the cyclic hydrocarbons, especially aromatic hydrocarbons, comprising from 5 to 50 carbon atoms and mixtures thereof;
  • the mixture R2 comprises at least two S probes labeled with deuterium, each probe S being a hydrocarbon compound comprising at least 5 carbon atoms, preferably 5 to 50 carbon atoms, said compound being saturated, unsaturated, linear, branched or cyclic, especially aromatic, and optionally comprising at least one heteroatom of sulfur, oxygen or nitrogen; -
  • the steps (gl) and (II) are implemented using a computer means, preferably software.
  • the present invention makes it possible to overcome the disadvantages of the methods of the prior art. It advantageously provides a simple, fast, reliable and inexpensive method for analyzing and identifying one or more compounds of an organic mixture, in particular a complex one.
  • the invention makes it possible to dispense with the calibration and / or calibration steps that it is necessary to perform when using a chromatographic column.
  • the present invention may be used on chromatography devices operating with a column having a stationary phase of the same nature as that used to constitute the reference chromatogram collection without the need for each change of device to establish again a collection of chromatograms.
  • the data collection according to the invention is representative of the aging of a stationary phase for a given mixture and for a given type of stationary phase, under close operating conditions (mobile phase, pressure, temperature, flow, etc.).
  • the invention can be implemented for any organic mixture, regardless of the chemical nature of the mixture. It is advantageously usable for any type of stationary phase used in a chromatography column.
  • the present invention improves the reliability of the results of a chromatographic analysis of a complex organic mixture.
  • the analysis of the compounds is carried out by automated comparison of chromatograms with respect to a chromatogram collection obtained from an organic reference mixture. The intervention of a specialist in chromatogram analysis is no longer required
  • the present invention may be automatable, rendering the analysis of complex mixtures possible independently.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the methods described above, the kit comprising at least:
  • a reference mixture R1 comprising at least two M markers chosen from the group formed by saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched comprising from 5 to 50 carbon atoms, the cyclic hydrocarbons, in particular aromatic hydrocarbons comprising from 5 to 50 carbon atoms; , steroids and their mixtures,
  • a mixture R2 comprising at least two S probes labeled with deuterium, each S being a hydrocarbon compound of at least 5 atoms carbon, preferably from 5 to 50 carbon atoms, said compound being saturated, unsaturated, linear, branched, and / or cyclic, in particular aromatic, and optionally comprising at least one heteroatom of sulfur, oxygen or nitrogen.
  • the kit may further comprise a chromatography column.
  • the present invention also relates to a kit for carrying out the method of identifying at least one compound of a sample of an organic mixture as described above, this kit comprising:
  • FIG. 1 represents the main steps of the method of constituting a chromatogram collection according to the invention
  • FIG. 2 represents the main steps of the process for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture according to the invention
  • FIG. 3 represents a chromatogram and signals obtained by implementing the methods according to the invention
  • FIG. 4 represents a chromatogram Co obtained by the implementation of the methods according to the invention.
  • FIG. 5 represents an exemplary spectrogram of the signals of the probes implemented in the method according to the invention.
  • FIG. 6 represents an example of spectrogram of the signals of the markers implemented in the method according to the invention. detailed description
  • the invention applies to the field of analytical chemistry.
  • the object of the present invention is to provide:
  • organic mixture means any mixture comprising at least two organic compounds of natural or synthetic origin. Preferably, these compounds are non-polymeric organic molecules.
  • polymeric organic molecules is meant the molecules that result from the polymerization of a monomer to form a polymer such as, for example, proteins, DNA or RNA.
  • the organic compounds forming the organic mixture according to the invention have a molecular weight less than or equal to 1000 Daltons, preferably a molecular weight ranging from 16 to 1000 Daltons.
  • the organic mixture is a complex organic mixture.
  • complex organic mixture or “complex mixture” means a mixture whose compounds are present in very large numbers and have similar chemical structures and similar physicochemical characteristics.
  • complex organic mixtures may comprise aromatic or non-aromatic hydrocarbons, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), hydrocarbons extracted from a geological formation, molecules of synthetic origin (active principles cosmetics or therapeutics), extracts of plants or animals, metabolites, etc.
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • complex organic mixtures within the meaning of the present application may be:
  • a sample of a blood sample for the presence of a drug in the blood, a toxin, a prohibited substance, a metabolite;
  • crude oil hydrocarbons sampled on the surface (of the soil or of a body of water), extracts of a geological formation, such as, for example, petroleum, bituminous oils, shale gases or oils, etc.
  • crude oil subfraction means a crude oil which has undergone chemical or physical treatment in order to isolate a subset of its constituents. Techniques for obtaining a fraction of a crude oil are well known to those skilled in the art. These techniques are generally implemented by liquid chromatography. For example, a sub-fraction of a crude oil may consist of all the aromatic or saturated compounds of the crude oil.
  • a first object of the present invention relates to a method for forming a chromatogram collection for a reference mixture R1 of organic compounds comprising at least two M markers and for at least one chromatographic device comprising at least one chromatographic column and at least one detection means measuring a physical quantity, said method comprising the following steps:
  • a mixture R2 is formed comprising at least two probes S, each probe S being characterized by a unambiguous signal detectable at a specific value VS probe of the measured physical quantity;
  • step d) the retention time of each of the probes S is identified on the chromatogram of step d) so as to obtain an Eo imprint
  • FIG. 3 and FIG. 4 show the main steps of the process for forming a chromatogram collection for a reference mixture R1 of organic compounds.
  • markers means a compound or a set of compounds that makes it possible to identify characteristics of a mixture.
  • a complex mixture may include compounds that are specific for a geographical origin of a mixture, the age of a mixture, a method of making a mixture. These compounds form the chemical signature of a complex mixture and are used in the present invention as markers M.
  • the marker (s) M are compounds chosen so as to be representative of the type of organic mixture that it is desired to analyze.
  • the markers can be compounds of a mixture that is found in abundance in the mixture or on the contrary that is rarely found in a mixture.
  • mixture within the meaning of the present invention is meant a set of markers as defined above and forming an artificial signature of the mixture to be studied.
  • the reference mixture R1 may comprise all of the known chemical signatures for an organic mixture to be studied.
  • the reference mixture R1 comprises at least two markers M as defined above.
  • the number and variety of markers constituting the reference mixture are adapted according to the complexity of the samples which must then be studied.
  • a mixture comprising at least two labels is used as the reference mixture R1.
  • the reference mixture R1 in particular at least two biomarkers.
  • a crude oil is a complex mixture that can contain thousands of different hydrocarbons, all in varying concentrations.
  • the geological origin, chemical composition or age of a crude oil can be identified by the chemical nature of some of its hydrocarbons. Some hydrocarbons are specific for a given type of deposition environment of the source rock, its geological age and chemical alterations, microbiological, physical and thermal conditions that have affected hydrocarbons during their history. These particular compounds that characterize the origin of a crude oil are called biomarkers.
  • the M markers in particular the biomarkers, can be chosen from saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched comprising from 5 to 100 carbon atoms.
  • the M markers in particular the biomarkers, may be chosen from saturated, linear or branched hydrocarbons comprising from 5 to 100 carbon atoms such as n-, iso- and methyl-alkanes, isoprenoids, diterpenoids, polyprenenoids and mixtures thereof.
  • the M markers in particular the biomarkers, may be chosen from cyclic hydrocarbons, especially aromatic hydrocarbons comprising from 5 to 100 carbon atoms, such as
  • Triterpans tri-, tetra, penta- and hexacyclics, such as oleanane, hopanes and methyl-hopanes, bisnorhopanes, 25-norhopanes, 8,14 secohopanes,
  • steranes such as regular steranes, rearranged steranes, methyl-steranes and iso-steranes, cholestane, diasteranes. These categories generally differ from one another by the stereochemical configuration of certain atoms or groups of atoms,
  • the M markers in particular the biomarkers, can be chosen from unsulfurized aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, naphthalene, phenanthrene, anthracene, chrysene (including the isomers and the compounds derivatives of these basic structures by the addition of groups of atoms such as an alkyl chain, methyl groups), benzohopanes, 8,14 secohopanoids and mixtures thereof.
  • unsulfurized aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, naphthalene, phenanthrene, anthracene, chrysene (including the isomers and the compounds derivatives of these basic structures by the addition of groups of atoms such as an alkyl chain, methyl groups), benzohopanes, 8,14 secohopanoids and mixtures thereof.
  • the M markers in particular the bio-markers, may be chosen from sulfur-containing aromatic hydrocarbons such as thiolane, thiane, thiophene, benzothiophene, dibenzothiophene and naphthobenzothiophenes (including isomers and compounds derived from these structures. base by the addition of grouping of atoms such as an alkyl chain, methyl groups) and mixtures thereof.
  • sulfur-containing aromatic hydrocarbons such as thiolane, thiane, thiophene, benzothiophene, dibenzothiophene and naphthobenzothiophenes (including isomers and compounds derived from these structures. base by the addition of grouping of atoms such as an alkyl chain, methyl groups) and mixtures thereof.
  • the M markers in particular the biomarkers, can be chosen from regular steroids, rearranged steroids and iso-steroids; mono- and tri-aromatic methyl steroids and mixtures thereof.
  • Each of these categories generally differ from one another by the stereochemical configuration of certain atoms or groups of atoms.
  • the M markers in particular the biomarkers, can be chosen from saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched, cyclic hydrocarbons, especially aromatic hydrocarbons, steroids as described above and mixtures thereof.
  • the reference mixture R1 comprises at least one marker chosen from n-, iso- and methylalkanes comprising 5 to 100 carbon atoms, at least one marker chosen from the family of hopanes, at least one marker chosen from triterpanes tri-, tetra, penta- and hexacycliques, the gamma-raceric marker, the oleanane marker, at least one marker chosen from diahopanes, at least one marker selected from regular steranes, at least one marker selected from 8,14 secohopanes, at least one marker selected from diasteranes.
  • the chromatographic device comprises at least one chromatography column and at least one detection means measuring a physical quantity, said detection means being coupled to the chromatography column.
  • chromatography column or “chromatographic column” or “column” within the meaning of the present invention is meant a narrow tube comprising a stationary phase and which can be traversed by at least one mobile phase which moves by gravity or by pressure difference.
  • the invention can be implemented with any stationary phase that may be altered by prolonged use and potentially interact with the injected products.
  • the aging of the stationary phase generally induces a baseline drift and a drift of the elapsed product retention times and indices. These drifts are signs of aging or wear of the stationary phase, therefore of the chromatographic column.
  • the choice of the type of column, the mobile phase, the stationary phase and the operating conditions of the chromatography column and the detection means is carried out according to the nature of the reference mixture R1 or the nature of the sample of the organic mixture to be analyzed. These choices and the optimization of the operating conditions are well known to those skilled in the art.
  • the implementation of the method according to the invention is therefore not limited to a particular type of stationary phase or to a particular mobile phase.
  • the column is suitable for use in gas-liquid chromatography or for use in gas chromatography.
  • the separation of the constituents of the mixture can be carried out by an adsorption column, a partition column, an affinity column, an ion exchange column, a steric exclusion column or a capillary electrophoresis column.
  • the column is an adsorption, affinity, ion exchange or exclusion column.
  • the column is a sharing column.
  • the stationary phase can be liquid or solid. This state depends not only on the nature of the product constituting the stationary phase, but also on the pressure and temperature conditions at which the process of the invention is implemented.
  • the stationary phase may be chemically grafted or not to the column tube.
  • polar or apolar phases generally consisting of silicones or fluorinated polymers.
  • porous polymers for example: squalane, n-heavy alkanes.
  • the mobile phase is a fluid chosen from liquids or gases.
  • the liquid mobile phases mention may be made of pure solvents or a mixture of solvents.
  • the gaseous mobile phases mention may be made of hydrogen, helium, nitrogen, argon or a mixture of these gases.
  • the operating conditions of the chromatography device are chosen to allow a satisfactory resolution of the compounds of the reference mixture and the mixture of the probes. It is usually sought to optimize these conditions so that each compound is eluted individually with preferably a baseline return of the elution chromatogram between each peak.
  • the chromatographic column is suitable for use in gas chromatography, in particular the stationary phase is chosen from the apolar phases and the mobile phase is chosen from helium, nitrogen, argon or hydrogen.
  • the chromatography device implemented in the context of the present invention comprises at least one detection means measuring a physical quantity, said detection means being coupled to the output of the chromatographic column.
  • the detection means comprises at least one detector and at least one recorder, in particular a computer.
  • the recorder provides a plot of the recorded signals, the trace including the chromatographic peaks, each peak possibly corresponding to one or more eluted compound (s).
  • the detection means coupled to the chromatography column thus makes it possible to obtain an elution chromatogram (30).
  • the detector makes it possible to detect at least one signal for a measured physical quantity.
  • the measured physical quantity can be a wavelength, a mass-to-charge ratio (m / z), an intensity, a voltage, a resistance, a chemical shift.
  • the measured physical quantity is a mass-to-charge ratio (m / z).
  • the detector can be chosen from detectors recording simple signals or complex signals.
  • simple signal is meant a single signal for a given molecule that is recorded for a measured physical quantity.
  • the detection means records a single chromatogram and the detection is called simple detection.
  • complex signal is meant a multitude of signals for a given molecule that are simultaneously recorded for a measured physical quantity.
  • the detection means records several chromatograms (one for each physical quantity of the interval) and the detection is called complex detection.
  • TCD thermal conductivity detectors
  • ECD electron capture detectors
  • O-FID oxygen detectors
  • CCD catalytic combustion detectors
  • NPD nitrogen
  • PID photoionization detectors
  • TID Thermo-ionization detectors
  • NEMS Nano Electro Mechanical Systems
  • spectrometers in the wavelength range of the UV spectrum, visible or infra-red (IR),
  • ICP Inductively Coupled Plasma
  • FTIR infrared spectrometry detectors
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the detection means providing complex signals are also capable of recording simple signals.
  • the choice of the detection means is made according to the nature of the sample to be studied, according to the nature of the mobile phase implemented in the chromatography device and according to the type of probe S and its marking. possible.
  • the detection means is chosen from the group formed by refractometers, UV-Visible absorption detectors, infrared absorption detectors, fluorescence spectrometers, light, diode array detectors, electrochemical detectors, differential refractometers, nuclear magnetic resonance (NMR) detectors or mass spectrometers (MS).
  • the detection means is a mass spectrometer.
  • the detection means is chosen from the group formed by flame ionization detectors (FID), thermally conductive detectors (TCD), catalytic combustion detectors (CCD), infra-red spectrometers (FTIR: Fournier transformed infrared), atomic emission spectrometers (AED, ICP), electron capture detectors (ECD), oxygen detectors (O-FID), detectors Catalytic Combustion (CCD), nano electro-mechanical systems (NEMS) detectors, sulfur detectors (FPD, SCD and P-FPD), nitrogen (NPD) or phosphorus detectors, photo-ionization detectors ( PID), mass spectrometers (MS), photoionization detectors (PID) or thermionic detectors (TID).
  • the detection means is a mass spectrometer.
  • the detection means is a mass spectrometer.
  • mass spectrometers that may be used in the context of the invention, there may be mentioned, but not limited to, quadrupole mass spectrometers, magnetic or electrostatic sector mass spectrometers, time-of-flight mass spectrometers. , ion trap mass spectrometers or Fourier transformers.
  • the ionization mode may be by electron impact, chemical ionization, laser radiation, fast or metastable atom bombardment, photoionization or field ionization.
  • the chromatographic device used in the context of the present invention further comprises means for injecting a sample into the column, means for introducing the mobile phase into the column, means for controlling the operating parameters. coupling means between the column and the detection means and any other means necessary for the operation of such a device. - Constitution (11) of the mixture R2
  • the mixture R2 comprises at least two probes S.
  • probe in the present invention, a molecule representative of at least one chemical class of a marker M and characterized by at least one univocal signal (32) with respect to the signals corresponding to the compounds constituting the mixtures R1 and R2, the univocal signal being detectable at a specific value VS its d e of the measured physical quantity.
  • An unambiguous signal (32) is a signal which makes it possible to clearly and unambiguously identify the probe S with respect to the compounds of the mixture RI and R2.
  • the unambiguous signal (32) is easily identifiable because it is detectable at a specific value VS its d e of the measured physical quantity.
  • ESR its d e is the value of the physical magnitude measured by the detector to which only the probe emits a unique signal. This value VS its d e thus makes it possible to record only the signal of the probe.
  • an unambiguous signal of a probe S can be a single absorption line in specific probe S infrared and which is not found on the infrared spectra of the markers M.
  • the specific value VS his d e is here the value of the wavelength at which the absorption peak was seen by infrared.
  • an unambiguous signal (32) of a probe S may be a fragment ion obtained for a given mass-to-charge (m / z) ratio (31) when the probe is ionized and fragmented.
  • This ion-fragment is specific to the probe.
  • the ion-fragments of the markers have mass to charge ratio values (m / z) different from those of the probes (33).
  • the specific value VS its d e is, in this case, the value of the mass-to-charge ratio (m / z) at which the probe-specific fragment ion is observed.
  • each probe S according to the invention is easily identifiable because it is eluted in the form of a peak which is identifiable thanks to the univocal signal (32) recorded by the detection means at a specific value VS its d e of the magnitude measured physics.
  • d4-cholestan gives a mass / charge specific signal m / z 221 when a mass spectrometer is used as a detector.
  • the probe S is a probe labeled with a marker group.
  • the marking of the probe S by a marker group facilitates the production of the unambiguous signal.
  • the marker group may be an isotope, a chromophore that absorbs ultraviolet (UV), a chromophore that absorbs infra-red (IR) or a phosphor.
  • the isotope is generally selected from stable isotopes, such as
  • a phosphor is a molecule or a chemical group capable of emitting light at a given wavelength when that molecule or chemical group is excited.
  • the marking of the probe is a technique well known to those skilled in the art. It consists either in grafting the marker group (for example chemical grafting of a chromophore) on the probe or in synthesizing a probe in which the marker group is incorporated into the probe during the synthesis (for example incorporation of one or more isotopes during the chemical synthesis of the probe).
  • the probe according to the invention is labeled with deuterium and is chosen so as to provide a detectable unambiguous signal at a specific value VS its d e of the measured physical quantity.
  • deuterium-labeled compounds in gas chromatography has many advantages. These compounds do not have the same steric bulk as unlabeled compounds. They therefore have shorter retention times than their proton counterparts, which greatly limits the interference on the chromatogram.
  • a deuterium labeled probe is easily identifiable by mass spectrometry because of its unambiguous signal and retention time that differ from those of a proton probe.
  • the specific value VS its d e is the same for at least two probes of the mixture, these probes being differentiating one from the other by their retention times.
  • the chromatographic peaks of the probes are distributed along the chromatogram.
  • the probes S are hydrocarbon compounds comprising at least 5 carbon atoms, preferably from 5 to 50 atoms. of carbon, said compounds being saturated or unsaturated, linear, branched or cyclic, in particular aromatic, and optionally comprising at least one heteroatom of sulfur, oxygen or nitrogen.
  • the S probes are labeled with at least one stable isotope selected from deuterium (2H), carbon-13 (13 C), oxygen 18 (18 0), sulfur (34 S), nitrogen-15 ( 15 N), preferably deuterium.
  • the probes S are chosen from the group consisting of saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched comprising from 5 to 50 carbon atoms optionally labeled with deuterium, cyclic hydrocarbons optionally labeled with deuterium comprising from 5 to 50 carbon atoms, aromatic hydrocarbons optionally labeled with deuterium comprising from 5 to 50 carbon atoms, steroids optionally labeled with deuterium and mixtures thereof.
  • n-alkanes comprising from 5 to 50 carbon atoms and from 1 to 102 deuterium atoms, in particular an alkane comprising 24 carbon atoms and 50 deuterium atoms (nC24- d50), an alkane comprising 36 carbon atoms and 74 deuterium atoms (nC36-d74).
  • deuterium-labeled unsaturated hydrocarbons mention may be made of d4-cholestene.
  • deuterium-labeled sulfur or non-sulfur aromatic hydrocarbons mention may be made of d-naphthalene, phenanthrene dio, dibenzothiophene-ds and chrysene di 4 .
  • mixtures R1 and R2 are effected by means of introduction well known to those skilled in the art, such as a syringe, an injection valve, etc.
  • the mixture R1 and / or the mixture R2 may undergo at least one preparation step such as filtration, dilution in a solvent, etc.
  • the elution of the compounds of the M markers and the S probes is carried out by the mobile phase in the chromatography column.
  • the means for introducing the mobile phase are well known to those skilled in the art.
  • the chromatogram (14) is recorded which comprises:
  • the peaks and signals of the probes are recorded at least at a specific value VS its d e of the measured physical quantity.
  • the peaks and the marker signals are recorded at least one value of the measured physical magnitude (VS March ners), this value being different from the specific value of the VS e.
  • the value of the physical magnitude measured which are detected signals SV marked markers ors may be fixed or vary within a given range of the physical quantity measured.
  • the specific value VS March ners is different for each marker M RI mixture.
  • the specific value VS markers is the same for at least two markers of the mixture R1.
  • the detection means is a mass spectrometer
  • the measured physical quantity is the mass / charge ratio (m / z).
  • registration markers elution chromatogram is done by recording all of the mass / charge ratios spectrograms, that is, a value VS my U rq ors of the mass / charge ratio ( m / z) which varies from 35 to 550, preferably 50 to 450.
  • the recording of the elution chromatogram of the markers is carried out for defined weight / charge ratios, that is to say the value VS ma r U U eur is set for certain mass / load ratios (m / m). z). Is recorded in this case signals corresponding to specific ion-fragments produced by the ionization and fragmentation of the markers M.
  • these values are chosen from the following group: Family of S marker (m / z) markers
  • the signals of the eluted products are studied.
  • the probes S are identified by their univocal signal.
  • the retention time of each probe S is measured on the elution chromatogram (14).
  • the retention time of each marker M on the elution chromatogram (14) is measured.
  • the retention time of each probe S and each marker M is recorded. This recording can be graphical and / or digital.
  • the retention indices are calculated for each marker M and for each probe S.
  • the retention index of a compound is the ratio between the retention time of the compound and the difference between the retention time of a first reference (probe eluted at the beginning of analysis) and the retention time of one second. reference (probe eluted at the end of the analysis).
  • first reference probe eluted at the beginning of analysis
  • retention time one second. reference
  • the chromatogram Co can be graphical or numerical.
  • the recording of the Co (35) chromatogram is carried out by computer means well known to those skilled in the art.
  • N times are repeated at different times ti with i varying from 0 to n steps b) to g) on the same chromatography device.
  • the impression Ei (15) is determined and the corresponding chromatogram Ci (16) associated with the imprint Ei is recorded.
  • a time ti corresponds to a degree of aging of the column in time at time i.
  • the time ti corresponds to a degree of aging of the column in time.
  • the time period from t 0 to t n represents the time during which the collection of chromatograms C n (17) is constituted, n being the number of simultaneous introductions of the mixture R 1 + R 2.
  • n is an integer greater than 0, preferably between 30 and 100.
  • n ranges from 40 to 50.
  • the simultaneous introduction of the mixtures R 1 + R 2 into the chromatography device can be done according to a determined frequency (for example every week) or randomly.
  • a determined frequency for example every week
  • a chromatographic column is at the end of its life when its resolution is considered insufficient and when the mobile phase is chemically too degraded.
  • steps b) to g) are performed without there having been a change of column, detection means or operating conditions. It is understood that the column can not be strictly identical to the column used at the beginning of the process, since between each time ti and ti + i the chromatographic device has aged and wears.
  • the set of chromatograms Ci with i ranging from 0 to n constitutes the collection of chromatograms Co, Ci, C 2 ... Ci ... C n for a given reference mixture RI, for a mixture of probes R2 and for one given chromatography column, each chromatogram Co, Ci, C 2 ... Ci ... C n being respectively associated with a fingerprint E 0 , E ls E 2 ... Ei ... E n
  • Another subject of the present invention relates to a collection of chromatograms C 0 , C 1 , C 2 . ... Ci. ... C n resulting:
  • n being an integer n> 0, a reference RI mixture of organic compounds comprising to the two markers M and a mixture R2 comprising at least two labeled probes S, on a chromatography column and the detection of the components of the mixture R1 + R2 using at least one detecting means measuring at least one physical quantity, each probe S being characterized by at least one unambiguous signal detectable at a specific value VS its d e of the measured physical quantity, and
  • each chromatogram Ci with c ⁇ i ⁇ n having an imprint Ei with c o ⁇ i ⁇ n corresponding to the retention times of the probes of the mixture R2.
  • Another subject of the present invention relates to a method for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture, the process comprising the following steps:
  • a chromatographic device comprising at least one chromatographic column and at least one detection means measuring a physical quantity, said detection means being coupled to the chromatographic column
  • step (b1) At least one collection of chromatograms of a reference mixture R1 and a mixture R2 of probes S as defined above is provided by means of a chromatographic column and a detection means identical to those implemented in step (a)
  • the term "chromatographic column and identical detection means" is intended to mean a chromatographic column and a detection means consisting of the same elements arranged in the same configuration as those used in the process of forming the chromatogram collection such as than previously defined.
  • the column has the same dimensions and the same stationary phase as that used to implement the chromatography collection method defined above and the detection means is of the same nature as that used during the implementation. the method of forming a chromatogram collection as defined above.
  • the invention is the same, in particular the mobile phase, the temperature, the pressure.
  • the aging of the stationary phases is a physicochemical phenomenon which varies randomly and non-linearly. It can not be predicted and depends on a number of parameters such as the nature of the stationary phase, the nature and quantity of the compounds injected. ..
  • the R2 (1 1) mixture used in the identification process is identical to the R2 mixture used to form the chromatogram collection, ie it consists of the same probes as those used for the chromatogram collection. implementation of the method of forming a chromatogram collection as defined above.
  • the elution (20) of the compounds of the sample of the mixture to be analyzed and the S probes is carried out under the same operating conditions and with the same mobile phase as those used for the elution step of the constitution process.
  • the chromatogram C (21) is recorded which comprises:
  • the peaks and the signals of the probes are recorded at at least one specific value VS its d e of the measured physical quantity.
  • the peaks and the sample components of the signals to be analyzed are stored in at least two values of the measured physical magnitude (VS March ners) markers RI mixture.
  • the identification of the position of each probe S on the chromatogram C is carried out in the same way as that which was implemented during the process of forming a chromatogram collection as defined above. Briefly, thanks to its unambiguous signal, the probe S is identified in the detection signals associated with each elution peak. The retention time of the probe S is identified on the chromatogram C. This operation is repeated so as to identify the position of each probe S on the chromatogram C. The set of retention times of the probes S on the chromatogram constitutes the impression E (22) of chromatogram C.
  • the print E (22) of the chromatogram C is then compared (23) with the chromatographic prints E 0 , E ls E 2 ... Ei ... E n recorded in the chromatograms collection C n (17) of the mixture of reference RI.
  • the comparison step is performed by computer means using software, the main steps of which are as follows:
  • the chromatogram Ci and the associated data, for which D is a minimum, are chosen in the database. 5.
  • the retention indices of the M markers of the chromatogram Ci are used to calculate the expected retention times of the same compounds for the sample analyzed,
  • substantially superimposable is meant in the sense of the present invention to obtain a single image when the chromatograms are superimposed.
  • the retention times of each probe S on the chromatogram C j is then substantially identical to the retention time of the same probe on the chromatogram C.
  • the chromatogram C is then analyzed (25) by comparison with the chromatogram C j and the presence of a compound in the sample of the mixture to be analyzed is or is not identified.
  • the identification of the sample compound (s) of the organic mixture is performed by comparing each peak of the chromatogram of the sample C (or each retention time) with those of the chromatogram C j .
  • the peaks of the chromatogram C j which are superimposable on the peaks of the chromatogram C of the sample indicate the presence of M markers in the sample.
  • the invention described above is implemented to identify at least one compound of a sample of a crude oil, in particular at least one compound of a sample of a subfraction of a crude oil.
  • Another object of the present invention relates to a kit for implementing the method of forming a chromatogram collection as defined above and / or for implementing the method for identifying at least one compound of a sample of a crude oil, this kit comprising at least:
  • a reference mixture RI comprising at least two M markers chosen from the group formed by saturated or unsaturated hydrocarbons, linear or branched comprising from 5 to 50 carbon atoms, and cyclic hydrocarbons, especially aromatic hydrocarbons comprising from 5 to 50 atoms; carbon, steroids and their mixtures,
  • each S being a hydrocarbon compound comprising less 5 carbon atoms, preferably 5 to 50 carbon atoms, said compound being saturated or unsaturated, linear, branched or cyclic, in particular aromatic, and optionally comprising at least one heteroatom of sulfur, oxygen or nitrogen.
  • the kit further comprises at least one chromatography column as defined above.
  • the column is a partition column.
  • kits for carrying out a method for identifying at least one compound of a sample of an organic mixture comprising:
  • n is an integer n> 0, of a reference mixture R1 of organic compounds comprising at least two M markers and of a mixture R2 comprising at least two labeled S probes, on a chromatography column and detecting the components of the mixture R1 + R2 by means of at least one detecting means measuring at least one physical quantity, each probe S being characterized by at least one unambiguous signal detectable at a specific value VS its of magnitude measured physical, and
  • each chromatogram Ci ave c o ⁇ i ⁇ n having a footprint Ei ave c o ⁇ i ⁇ n corresponding to the retention time of the probes of the mixture R2.
  • the invention applies to the field of analytical chemistry. It can be implemented to identify several constituents of a complex organic mixture.
  • the invention advantageously makes it possible to determine the nature, origin and deterioration of a crude oil extracted from a geological formation, to determine the nature of the pollutants in an aquifer, to identify the constituents of a perfume, etc. .
  • the method according to the invention is used to determine the chemical composition of a mixture of hydrocarbons extracted from a geological formation (called crude oil in the rest of the application) by gas chromatography coupled to a mass spectrometer.
  • a crude oil is a complex mixture that can contain thousands of different hydrocarbons, all in varying concentrations.
  • This mixture is chosen such that it contains most of the known biomarkers of crude oils of different geological origin (see Table III).
  • crude oils have very variable compositions (depending on their age, degree of natural weathering, etc.), no oil contains all the known biomarkers. For example, it is rare to find in the same crude oil, gammaceran and oleanane, molecules formed by organisms that have lived in completely different environments. In addition, some molecules appear late in the evolution of life. All of these known biomarkers are rarely present simultaneously in the same crude oil.
  • the reference mixture RI is therefore an artificial signature that contains a set of individual signatures of crude oils.
  • the mixture R1 is a mixture comprising at least one compound belonging to the family 25-norhopanes, at least one compound belonging to the family of terpane tri-, tetra-, penta- and hexa-cyclic, gammacérane, oleanane, at least one compound belonging to the family of diahopanes, at least one compound belonging to the family of steranes, at least one compound belonging to the family of 8,14 secohopanes, and at least one compound belonging to the family of diasteranes.
  • a reference mixture R2 which comprises 3 deuterium labeled probes:
  • the SI and S2 probes are representative of the linear chain saturated hydrocarbon compounds contained in the crude oils and the S3 probe is representative of the saturated cyclic hydrocarbons contained in the crude oils.
  • each probe has been chosen to provide a single signal at a given value of the mass / charge ratio (m / z).
  • each probe S is thus identified on the elution chromatogram and the retention time of each probe S is calculated.
  • A-3 Chromatographic material and operating conditions: The apparatus used is a gas chromatograph (GC)
  • the chromatographic column is a capillary column, 60 meters long and having an internal diameter of 0.25 mm and an apolar phase of 0.1 ⁇ in thickness.
  • the elution chromatogram of the mixture R1 + R2 is recorded by recording the signals of the 3 probes at the values VS its d e equal to m / z 66 and m / z 221 and recording the signals of the biomarkers at equal VS markers m / z 123, m / z 177, m / z 191, m / z 217, m / z 259.
  • each probe S on the elution chromatogram is identified by the study of the recorded mass spectrogram at the value of the mass / charge ratio (m / z) equal to 66 and that recorded at the value of the ratio mass / load (m / z) equal to 221.
  • the retention time of each probe S is calculated and the print Eo is obtained.
  • FIG. 6 illustrates the elution chromatogram of the markers recorded at the value of the mass / charge ratio (m / z) equal to 191 and that recorded at the value of the mass / load ratio (m / z) equal to 217. It is measured then the retention time of each biomarker on its characteristic mass spectrogram. Thus, for the markers belonging to the terpane family, the retention time of each marker is calculated from the elution chromatogram recorded at the value of the mass / charge ratio (m / z) equal to 191. For the markers belonging to the the family of steranes, the retention time of each marker is calculated from the elution chromatogram recorded at the value of the mass / charge ratio (m / z) equal to 217.
  • chromatogram Co comprising the identified position of the three probes S and the biomarkers of the family of terpanes and the family of steranes.
  • the simultaneous introduction of the mixture (R1 + R2) is repeated one week (ti) after the first introduction of the mixture (t 0 ) and under the same operating conditions as those described in Table IV and the signals of the probes are recorded as before. and biomarkers.
  • the chromatogram Ci and its fingerprint E ls are established as described above for the chromatogram Co; that is to say by identifying the position of the probes S1, S2 and S3 by studying the mass spectrogram recorded at the value of the mass / load ratio (m / z) equal to 66 and that recorded at the value the mass / charge ratio (m / z) equal to 221 to obtain the imprint El.
  • the position of the biomarkers of the terpan and steran families is identified by studying the mass chromatogram recorded at the mass / charge ratio (m / z) equal to 191 and that recorded at the mass / charge ratio (m / z) equal to 217 respectively.
  • the introduction of the mixture (R1 and R2) is repeated at least forty times and at a weekly frequency, each introduction being carried out under the same operating conditions as those described in Table IV.
  • a collection of chromatograms of elution of biomarkers is thus obtained, each chromatogram C n being representative of a stage of aging of the stationary phase of the column.
  • the compounds of the crude oil sample are then analyzed.
  • the crude oil sample and the mixture R2 comprising the three deuterium-labeled probes are simultaneously injected into the chromatographic device used to establish the chromatograms of the reference mixture R1:
  • the crude oil sample may optionally undergo a preparation step prior to its mixing with the mixture R2 and its introduction into the chromatography column.
  • Chromatogram C Recording the elution chromatogram (Chromatogram C) sample of crude oil mixture and probes by recording the signals of the probes 3 to the value VS of e equal to m / z 66 and m / z 221 and recording the signals compounds of the crude oil sample at equal VS markers m / z 85, m / z 183, m / z 123, m / z 177, m / z 191, m / z 205, m / z 217 m / z 218, m / z 231, m / z 259, typically.
  • the probes S1 and S2 are identified by their unique signals observable on the mass spectrogram recorded at the value of the weight / mass ratio (m / z) equal to 66.
  • the position of the probe S3 is identified by its unique signal observable on the mass spectrogram recorded at the value of the mass / charge ratio (m / z) equal to 221.
  • the retention time of each probe is measured on its specific mass spectrogram. These retention times of the three probes make it possible to define the imprint E of the crude oil sample. This is compared, by computer means, with the fingerprints E n of the chromatograms C n recorded in the chromatograms collection of the reference mixture RI.
  • the chromatogram C j is identified for which the retention times of the 3 probes of the imprint E j of the time t j are substantially identical to the three retention times of the imprint E.
  • the chromatogram C j is identified which corresponds to a aging stage t; of the column: the chromatogram C j provides the retentions times of the markers belonging to the terpane and stearan family, which makes it possible to precisely calculate the expected location of the peaks of these compounds on chromatogram C of the crude oil to analyze.
  • the geographical origin of the crude oil is determined according to the presence or absence of certain markers.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence de composés organiques. La présente invention concerne également un procédé d'identification de composés d'un échantillon d'un mélange organique mettant en œuvre une collection de chromatogrammes. La présente invention concerne par ailleurs un kit pour identifier au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique. L'invention appartient au domaine de la chimie analytique.

Description

PROCÉDÉ ET KIT POUR L'IDENTIFICATION DE COMPOSÉS D'UN MÉLANGE ORGANIQUE
Domaine de l'invention
La présente invention concerne un procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence de composés organiques.
La présente invention concerne également un procédé d'identification de composés d'un échantillon d'un mélange organique mettant en œuvre une collection de chromatogrammes.
La présente invention concerne par ailleurs un kit pour identifier au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique.
L'invention appartient au domaine de la chimie analytique. Arrière-plan technique
Un mélange est une association d'au moins deux, voire plusieurs, substances qui n'interagissent pas chimiquement entre elles. Ces substances sont étroitement juxtaposées dans un même espace pour former un produit. Chacune de ces substances garde ses propriétés physiques et chimiques.
On distingue les mélanges simples et les mélanges complexes. Dans un mélange simple, les constituants sont facilement identifiables car ils sont peu nombreux. De plus, chaque constituant possède une structure chimique ou un encombrement stérique différent des autres constituants du mélange. Par exemple, l'eau salée est un mélange simple constitué d'eau et de sel. Dans un mélange complexe, les constituants sont difficilement identifiables et/ou séparables car ils sont présents en très grand nombre, (d'une centaine à plusieurs milliers). Par ailleurs, ces constituants peuvent présenter des structures chimiques proches et des caractéristiques physicochimiques semblables. Des mélanges complexes sont par exemple, des huiles brutes (ou pétrole) extraites de formations géologiques, des essences ou des solvants issus d'opérations de raffinage, un parfum ou un extrait d'un végétal, des eaux de pluies contaminées, du vin, etc.
Dans la suite de la présente description, on s'intéresse aux mélanges complexes homogènes, c'est-à-dire présentant une seule et même phase soit liquide soit gazeuse.
L'analyse de mélanges complexes s'effectue par des techniques de séparation généralement couplées à des techniques d'identifications. La technique de séparation la plus utilisée est la chromatographie, notamment la chromatographie en phase liquide ou la chromatographie en phase gazeuse. Cette technique permet de séparer les constituants d'un mélange grâce à l'utilisation conjointe de deux phases non miscibles l'une dans l'autre, dont l'une des phases est en mouvement, et dans lesquelles les solutés à séparer se distribuent de manière différentielle.
Cependant, l'identification par chromatographie des constituants d'un mélange complexe n'est pas toujours couronnée de succès même lorsqu'une colonne de chromatographie est couplée à des détecteurs sophistiqués, tels que par exemple un spectromètre de masse ou un spectromètre d'émission atomique. L'analyse des chromatogrammes obtenus est faite par un spécialiste des techniques de chromatographie. Ce spécialiste effectue une identification visuelle des différents pics chromatographiques. Il juge de la présence ou non du composé à identifier par l'emplacement, la mesure de la surface et/ou de la hauteur du pic chromatographique qui est fonction de la quantité du produit qu'il représente. L'inconvénient de cette méthode est qu'elle est très empirique, subjective, peu productive et nécessite l'intervention d'un spécialiste.
Une autre technique d'analyse chromatographique pouvant être utilisée pour étudier les constituants d'un mélange complexe consiste en une identification automatique des constituants par leur temps de rétention généralement visualisé à l'aide, par exemple, d'un spectromètre UV (ultra- violet) en chromatographie en phase liquide ou bien à l'aide d'un détecteur à ionisation de flamme en chromatographie en phase gazeuse. Ces techniques nécessitent une calibration de l'appareil avec des composés étalons internes ou externes. L'inconvénient de cette méthode est qu'elle est valable dans une période de temps limitée, c'est à dire tant que le vieillissement de la colonne n'est pas trop sensible. En effet, lorsque la colonne de chromatographie vieillit, il en résulte une lente dérive des caractéristiques chromatographiques initiales telles qu'un changement de la ligne de base, un changement des temps de rétention des produits, etc. L'identification des constituants d'un mélange devient difficile en dépit des calibrations effectuées. Un autre inconvénient de cette méthode est le nombre de calibrations élevé nécessaire pour tenir compte du vieillissement de la colonne. Ces calibrations qui sont consommatrices de temps sont coûteuses puisqu'elles nécessitent l'utilisation de composés étalons et une surveillance de la part d'un spécialiste.
La méthode précédente a été améliorée par l'utilisation d'indices de rétention pour identifier automatiquement les composés. Cette méthode nécessite l'utilisation de deux composés de référence : généralement un composé ayant un temps de rétention inférieur (composé A) aux temps de rétention des composés à analyser, l'autre ayant un temps de rétention plus élevé (composé D) que les temps de rétention des composés d'intérêt. Le temps de rétention relatif (ou indice de rétention) d'un composé (composé B) correspond au rapport entre la différence du temps de rétention du composé B et du temps de rétention du composé A d'une part et la différence entre le temps de rétention du composé D et le temps de rétention du composé A d'autre part. Les composés A et D sont deux composés connus et facilement identifiables sur un chromatogramme et sont donc pris comme référence. Cette méthode des indices de rétention est plus précise que la méthode des temps de rétention. Cependant, elle ne limite pas le nombre de calibrations, ni la surveillance et la validation des résultats par un spécialiste. En effet, les indices de rétention sont eux-mêmes sujet à fluctuations avec le vieillissement de la colonne chromatographique.
Le couplage des techniques chromatographiques à des méthodes d'identification spectrométriques a permis un progrès par rapport aux méthodes précédentes. En effet, l'identification d'un composé s'effectue à la fois grâce aux données chromatographiques par l'analyse des temps de rétention ou des indices de rétention et à la fois par les caractéristiques spectroscopiques des composés. Cependant, bien que ces techniques soient de plus en plus précises, de nombreux constituants peuvent avoir des caractéristiques spectroscopiques identiques, entraînant des confusions dans l'identification des constituants d'un mélange complexe.
Il subsiste donc un besoin d'une méthode d'identification de constituants d'un mélange dont la mise en œuvre soit simple, peu coûteuse et qui permette d'identifier avec une grande fiabilité des constituants d'un mélange.
En particulier, il subsiste le besoin d'une méthode permettant de réaliser cette identification quel que soit le degré de vieillissement de la colonne de chromatographie. Il existe également un besoin d'une méthode d'identification de constituants d'un mélange dont l'analyse des résultats soit indépendante de l'opérateur qui met en œuvre cette méthode.
Le but de la présente invention est de fournir un procédé d'identification d'au moins un composé d'un mélange organique mettant en œuvre au moins une étape de séparation par une colonne de chromatographie palliant au moins partiellement les inconvénients précités.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence, les chromatogrammes étant périodiquement enregistrés pendant la durée de vie d'une colonne chromatographique, durant la période d'apprentissage.
La présente invention concerne également un procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique par une comparaison du chromatogramme de l'échantillon du mélange à analyser avec ceux de la collection de chromatogrammes constituée précédemment.
Enfin, l'invention concerne un kit pour la mise en œuvre des procédés précédents. La présente invention permet avantageusement de limiter voire de supprimer le nombre de calibrations qui doivent être effectuées avant chaque analyse chromatographique .
La présente invention permet également d'augmenter la fiabilité de l'identification des composés d'un mélange. La validation des résultats par un spécialiste n'est plus obligatoirement nécessaire dans la mise en œuvre de l'invention.
Enfin, la présente invention peut facilement être adaptée à toutes sortes de mélanges organiques. Avantageusement la présente invention peut être adaptée à toute technique chromatographique de séparation sur colonne.
Le procédé d'identification de composés d'un mélange organique selon l'invention présente l'avantage d'être automatisable.
Résumé de l'invention
A cette fin, la présente invention a pour objet un procédé de constitution d'une collection de données de chromatogrammes d'un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au moins deux marqueurs M et pour au moins un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) On constitue un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S, chaque sonde S étant caractérisée par un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée ;
(b) A un temps t0, on introduit simultanément les mélanges RI et R2, dans la colonne de chromatographie couplée au moyen de détection,
(c) On élue les marqueurs M et les sondes S avec au moins une phase mobile,
(d) On enregistre le chromatogramme d'élution du mélange RI et R2,
(e) On identifie le temps de rétention de chacune des sondes S sur le chromatogramme de l'étape d) de manière à obtenir une empreinte Eo,
(f) On identifie le temps de rétention de chacun des marqueurs M sur le chromatogramme d'élution de l'étape d),
(g) On obtient le chromatogramme Co associé à l'empreinte Eo,
(h) On répète les étapes b) à g) à des temps échelonnés tl s t2 ti tn pendant la durée de vie de la colonne de façon à constituer une collection de chromatogrammes Co, Ci, C2. ... Ci. ...Cn, associés respectivement à une empreinte E0, El s E2. . .. Ei. . ..En pour chaque temps t; avec i variant de 0 à n, n étant un entier n>0.
Suivant des modes de réalisation préférés, l'invention comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prise seule ou en combinaison : - la sonde S est une sonde marquée par au moins un groupement marqueur choisi parmi le groupe formé par un chromophore qui absorbe les ultraviolets, un chromophore qui absorbe les infra-rouges, par un luminophore ou un isotope stable;
- la colonne de chromatographie est choisie parmi le groupe formé, par une colonne d'adsorption, une colonne de partage, une colonne d'affinité, une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'exclusion stérique, de préférence une colonne de partage;
- la grandeur physique mesurée est choisie parmi une longueur d'onde, un rapport masse sur charge m/z, une intensité, une tension, un déplacement chimique;
- la grandeur physique mesurée est un rapport masse sur charge m/z et le moyen de détection est un spectromètre de masse;
- lequel l'enregistrement du chromatogramme de l'étape (d) s'effectue en enregistrant la totalité des spectrogrammes des rapports masses/charges ou en enregistrant certains spectrogrammes à des rapports masses/charges définis.
La présente invention a également pour objet une collection de chromatogramme C0, Ci , C2. . .. Ci. . .. Cn résultant :
- de l'élution simultanée et répétée à des temps t0, tl s t2.... t;....t„, n étant un entier n>0, d'un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au moins deux marqueurs M et d'un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées, sur une colonne de chromatographie et de la détection des composants du mélange R1+R2 à l'aide d'au moins un moyen de détection mesurant au moins une grandeur physique, chaque sonde S étant caractérisée par au moins un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée, et
- de l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs, chaque chromatogramme Ci avec o<i <n comportant une empreinte Ei avec o<i <n correspondant aux temps de rétention des sondes du mélange R2.
La présente invention a aussi pour objet un procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique le procédé comprenant les étapes suivantes : (al) On fournit un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit moyen de détection étant couplé à la colonne chromatographique,
(bl) On fournit au moins une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence RI et d'un mélange R2 de sondes S définie ci-dessus ou obtenue par la mise en œuvre du procédé tel que décrit ci-dessus à l'aide d'une colonne chromatographique et d'un moyen de détection identiques à ceux mis en œuvre dans l'étape (al),
(cl) On introduit simultanément dans le dispositif chromatographique, l'échantillon et le mélange R2 identique au mélange R2 ayant servi à la constitution de la collection de chromatogramme,
(dl) On élue les composés de l'échantillon et les sondes S par au moins une phase mobile,
(el) On enregistre le chromatogramme d'élution C des sondes S et des composés de l'échantillon,
(fl) On identifie le temps de rétention de chaque sonde S du mélange R2 sur le chromatogramme C obtenu à l'étape (el) afin d'obtenir l'empreinte E de l'échantillon,
(gl) On compare l'empreinte E de l'étape (fl) avec chaque empreinte E0, El s
E2 . .. Ei. .. En des chromatogrammes C0, Ci, C2 . .. Ci. .. Cn de la collection de chromatogramme,
(hl) On identifie le chromatogramme Cj dont l'empreinte Ej est sensiblement superposable à l'empreinte E de l'étape (gl),
(il) On compare le chromatogramme C au chromatogramme Cj.
Suivant des modes de réalisation préférés, l'invention comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- le mélange organique est une huile brute;
- le mélange de référence RI comprend au moins 2 marqueurs M choisis parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures cycliques, notamment les hydrocarbures aromatiques, comprenant de 5 à 50 atomes de carbone et leurs mélanges;
- le mélange R2 comprend au moins deux sondes S marquées au deutérium, chaque sonde S étant un composé hydrocarboné comprenant au moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, ledit composé étant saturé, insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote; - les étapes (gl) et (il) sont mises en œuvre à l'aide d'un moyen informatique, de préférence un logiciel.
La présente invention permet de surmonter les inconvénients des procédés de l'art antérieur. Elle fournit avantageusement une méthode simple, rapide, fiable et peu coûteuse d'analyse et d'identification d'un ou plusieurs composés d'un mélange organique, notamment complexe. L'invention permet de s'affranchir des étapes d'étalonnage et/ou de calibrage qu'il est nécessaire d'effectuer lors de l'utilisation d'une colonne chromatographique.
Avantageusement, la présente invention peut être utilisée sur des dispositifs de chromatographie fonctionnant avec une colonne ayant une phase stationnaire de même nature que celle ayant servi à constituer la collection de chromatogrammes de référence sans qu'il soit nécessaire à chaque changement de dispositif d'établir à nouveau une collection de chromatogrammes. Ainsi, la collection de données selon l'invention est représentative du vieillissement d'une phase stationnaire pour un mélange donné et pour un type de phase stationnaire donnée, à conditions opératoires proches (phase mobile, pression, température, débit...).
Par ailleurs, l'invention peut être mise en œuvre pour n'importe quel mélange organique, quelle que soit la nature chimique du mélange. Elle est avantageusement utilisable pour tout type de phase stationnaire utilisée dans une colonne de chromatographie.
En outre, la présente invention améliore la fiabilité des résultats d'une analyse chromatographique d'un mélange organique complexe. L'analyse des composés s'effectue par comparaison automatisée de chromatogrammes par rapport à une collection de chromatogrammes obtenue à partir d'un mélange organique de référence. L'intervention d'un spécialiste en analyse des chromatogrammes n'est plus obligatoire
Avantageusement, la présente invention peut être automatisable, rendant réalisable l'analyse de mélanges complexes en toute autonomie.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise œuvre des procédés décrits ci-dessus, le kit comprenant au moins :
- un mélange de référence RI comprenant au moins deux marqueurs M choisis parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures cycliques, notamment aromatiques comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les stéroïdes et leurs mélanges,
- un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées au deutérium, chaque S étant un composé hydrocarboné d'au moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, ledit composé étant saturé, insaturé, linéaire, ramifié, et/ou cyclique, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
Suivant un mode de réalisation préféré, le kit peut comprendre en outre une colonne de chromatographie.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre du procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique tel que décrit ci-dessus, ce kit comprenant :
- une collection de chromatogrammes telle que décrite ci-dessus,
une colonne de chromatographie identique à celle utilisée pour la constitution de la collection de chromatogramme,
- un mélange de sondes R2 identique à celui utilisé pour obtenir la collection de chromatogramme.
Brève description des figures
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante et d'un mode de réalisation particulier donné à titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des dessins annexés parmi lesquels :
La figure 1 représente les principales étapes du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes selon l'invention,
- La figure 2 représente les principales étapes du procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique selon l'invention,
La figure 3 représente un chromatogramme et des signaux obtenus par la mise en œuvre des procédés selon l'invention,
- La figure 4 représente un chromatogramme Co obtenu par la mise en œuvre des procédés selon l'invention,
La figure 5 représente un exemple de spectrogramme des signaux des sondes mis en œuvre dans le procédé selon l'invention.
La figure 6 représente un exemple de spectrogramme des signaux des marqueurs mis en œuvre dans le procédé selon l'invention. Description détaillée
L'invention s'applique au domaine de la chimie analytique.
Le but de la présente invention est de fournir :
- un procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes pour un mélange organique de référence, et
un procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique par chromatographie,
ces procédés palliant les inconvénients de l'art antérieur.
Par « mélange organique » au sens de la présente invention, on entend tout mélange comprenant au moins deux composés organiques d'origine naturelle ou synthétique. De préférence, ces composés sont des molécules organiques non polymériques. Par molécules organiques polymériques, on entend les molécules qui résultent de la polymérisation d'un monomère pour former un polymère tel que par exemples les protéines, l'ADN ou l'ARN. Les composés organiques formant le mélange organique selon l'invention ont un poids moléculaire inférieur ou égal à 1000 Daltons, de préférence un poids moléculaire allant de 16 à 1000 Daltons. De préférence, le mélange organique est un mélange organique complexe. Par « mélange organique complexe » ou « mélange complexe », on entend au sens de la présente invention, un mélange dont les composés sont présents en très grand nombre et ont des structures chimiques proches et des caractéristiques physicochimiques semblables. A titre d'exemple non limitatif, des mélanges organiques complexes peuvent comprendre des hydrocarbures aromatiques ou non-aromatiques, tel que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des hydrocarbures extraits d'une formation géologique, des molécules d'origine synthétique (principes actifs cosmétiques ou thérapeutiques), des extraits de végétaux ou d'animaux, des métabolites, etc. A titre d'exemple non limitatif, des mélanges organiques complexes au sens de la présente demande peuvent être :
un échantillon d'un prélèvement sanguin pour la recherche de la présence d'un médicament dans le sang, d'une toxine, d'une substance illicite, d'un métabolite ;
un échantillon d'eau provenant d'un milieu marin, d'un lac, d'une rivière ou d'une nappe phréatique ;
- un échantillon de sédiments ;
- un échantillon d'une atmosphère gazeuse ou issu d'un prélèvement dans une atmosphère gazeuse, un échantillon d'un produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique ; - un échantillon d'huile brute ou toute sous-fraction d'huile brute. Par huile brute, on entend des hydrocarbures échantillonnés en surface (du sol ou d'un plan d'eau), des extraits d'une formation géologique, tels que par exemple du pétrole, des huiles bitumineuses, des gaz ou huiles de schistes, etc. Par sous- fraction d'huile brute, on entend au sens de la présente invention, une huile brute ayant subi un traitement chimique ou physique afin d'isoler un sous-ensemble de ses constituants. Les techniques permettant d'obtenir une fraction d'une huile brute sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques sont généralement mises en œuvre par chromatographie en phase liquide. Par exemple, une sous-fraction d'une huile brute peut être constituée par l'ensemble des composés aromatiques ou saturés de l'huile brute.
Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes pour un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au moins deux marqueurs M et pour au moins un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) On constitue un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S, chaque sonde S étant caractérisée par un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée ;
(b) A un temps t0, on introduit simultanément les mélanges RI et R2, dans la colonne de chromatographie couplée au moyen de détection,
(c) On élue les marqueurs M et les sondes S avec au moins une phase mobile,
(d) On enregistre le chromatogramme d'élution du mélange RI et R2,
(e) On identifie le temps de rétention de chacune des sondes S sur le chromatogramme de l'étape d) de manière à obtenir une empreinte Eo,
(f) On identifie le temps de rétention de chacun des marqueurs M sur le chromatogramme d'élution de l'étape d),
(g) On obtient le chromatogramme Co associé à l'empreinte Eo,
(h) On répète les étapes b) à g) à des temps échelonnés tl s t2 ti tn pendant la durée de vie de la colonne de façon à constituer une collection de chromatogrammes Co, Ci, C2. ... Ci. ...Cn, associés respectivement à une empreinte E0, El s E2. ... Ei. ...En pour chaque temps t; avec i variant de 0 à n, n étant un entier n>0.
On présente maintenant, en relation avec la figure 1 , la figure 3 et la figure 4 les principales étapes du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes pour un mélange de référence RI de composés organiques.
- Constitution (10) du mélange de référence RI
Par marqueur au sens de la présente invention, on entend un composé ou un ensemble de composés qui permet d'identifier des caractéristiques d'un mélange. Un mélange complexe peut comprendre des composés qui sont spécifiques d'une origine géographique d'un mélange, de l'âge d'un mélange, d'un procédé de fabrication d'un mélange. .. Ces composés forment la signature chimique d'un mélange complexe et sont utilisés dans la présente invention comme marqueurs M.
Le ou les marqueurs M sont des composés choisis de manière à être représentatifs du type de mélange organique que l'on souhaite analyser. Les marqueurs peuvent être des composés d'un mélange que l'on trouve de manière statistique en abondance dans le mélange ou bien au contraire que l'on trouve rarement dans un mélange.
Par mélange de référence au sens de la présente invention, on entend un ensemble de marqueurs tels que définis précédemment et formant une signature artificielle du mélange à étudier.
Dans un mode de réalisation, le mélange de référence RI peut comprendre l'ensemble des signatures chimiques connues pour un mélange organique à étudier.
Dans un autre mode de réalisation, le mélange de référence RI comprend au moins deux marqueurs M tels que définis précédemment.
Le nombre et la variété des marqueurs constituant le mélange de référence sont adaptés en fonction de la complexité des échantillons que l'on doit ensuite étudier.
Dans un mode de mise en œuvre de l'invention, lorsque l'échantillon est une huile brute ou un échantillon d'une sous-fraction d'une huile brute, on utilise comme mélange de référence RI un mélange comprenant au moins deux marqueurs, notamment au moins deux biomarqueurs. Une huile brute est un mélange complexe qui peut contenir des milliers d'hydrocarbures différents, tous dans des concentrations variables. L'origine géologique, la composition chimique ou l'âge d'une huile brute peuvent être identifiés par la nature chimique de certains de ses hydrocarbures. Certains hydrocarbures sont spécifiques d'un type d'environnement de dépôt donné de la roche-mère, de son âge géologique et des altérations chimiques, microbiologiques, physiques et thermiques qui ont affecté les hydrocarbures durant leur histoire. Ces composés particuliers qui permettent de caractériser l'origine d'une huile brute sont appelés biomarqueurs.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisis parmi les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 100 atomes de carbone.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisis parmi les hydrocarbures saturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 100 atomes de carbone tels que les n-, iso- et les méthyl-alcanes, les isoprénoïdes, les diterpénoïdes, les polyprénoïdes et leurs mélanges.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisis parmi les hydrocarbures cycliques, notamment aromatiques comprenant de 5 à 100 atomes de carbones, tels que
• les triterpanes tri-, tétra, penta- et hexacy cliques, tel que l'oléanane, les hopanes et méthyl-hopanes, les bisnorhopanes, les 25-norhopanes, les 8,14 sécohopanes,
• les stéranes tels que les stéranes réguliers, les stéranes réarrangés, les méthyl- stéranes et les iso-stéranes, le cholestane, les diastéranes. Ces catégories diffèrent généralement les unes des autres par la configuration stéréochimique de certains atomes ou groupes d'atomes,
• les terpanes tels que le gammacérane,
• les mono- et les bi-cyclanes,
• et leurs mélanges.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisis parmi les hydrocarbures aromatiques non soufrés tels que le benzène, le toluène, le xylène, le naphtalène, le phénanthrène, l'anthracène, le chrysène (y compris les isomères et les composés dérivés de ces structures de base par l'ajout de groupement d'atomes tel qu'une chaîne alkyle, des groupements méthyles), les benzohopanes, les 8,14 secohopanoïdes et leurs mélanges.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les bio marqueurs, peuvent être choisis parmi les hydrocarbures aromatiques soufrés tels que le thiolane, le thiane, le thiophène, le benzothiophène, le dibenzothiophène, le naphtobenzothiophènes (y compris les isomères et les composés dérivés de ces structures de base par l'ajout de groupement d'atomes tels qu'une chaîne alkyle, groupements méthyles) et leurs mélanges.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisis parmi les stéroïdes réguliers, les stéroïdes réarrangés et iso- stéroïdes ; les méthyl-stéroïdes mono- et tri-aromatiques et leurs mélanges. Chacune de ces catégories diffèrent généralement les unes des autres par la configuration stéréochimique de certains atomes ou groupes d'atomes.
Avantageusement, les marqueurs M, notamment les biomarqueurs, peuvent être choisi parmi les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés, les hydrocarbures cycliques, notamment les hydrocarbures aromatiques, les stéroïdes tels que décrits ci-dessus et leurs mélanges.
Avantageusement, lorsque l'échantillon est une huile brute ou un échantillon d'une sous-fraction d'une huile brute, le mélange de référence RI comprend au moins un marqueur choisi parmi les n-, iso- et les méthyl-alcanes comprenant de 5 à 100 atomes de carbone, au moins un marqueur choisi parmi la famille des hopanes, au moins un marqueur choisi parmi les triterpanes tri-, tétra, penta- et hexacycliques, le marqueur gammacérane, le marqueur oléanane, au moins un marqueur choisi parmi les diahopanes, au moins un marqueur choisi parmi les stéranes réguliers, au moins un marqueur choisi parmi les 8,14 sécohopanes, au moins un marqueur choisi parmi les diastéranes.
- Dispositif chromatographique
Le dispositif chromatographique selon l'invention comprend au moins une colonne de chromatographie et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit moyen de détection étant couplé à la colonne de chromatographie .
Par « colonne de chromatographie » ou « colonne chromatographique » ou « colonne » au sens de la présente invention, on entend, un tube étroit comprenant une phase stationnaire et qui peut être traversée par au moins une phase mobile qui se déplace par gravité ou par différence de pression.
L'invention peut être mise en œuvre avec n'importe quelle phase stationnaire susceptible d'être altérée par un usage prolongé et pouvant potentiellement interagir avec les produits injectés. Le vieillissement de la phase stationnaire induit généralement une dérive de la ligne de base et une dérive des temps et indices de rétention des produits élués. Ces dérives sont des signes de vieillissement ou d'usure de la phase stationnaire, donc de la colonne chromatographique.
Le choix du type de colonne, de la phase mobile, de la phase stationnaire et des conditions opératoires de la colonne de chromatographie et du moyen de détection s'effectue en fonction de la nature du mélange de référence RI ou de la nature de l'échantillon du mélange organique à analyser. Ces choix et l'optimisation des conditions opératoires sont des étapes bien connues de l'homme du métier. La mise en œuvre du procédé selon l'invention n'est donc ni limitée à un type de phase stationnaire particulier ni à une phase mobile particulière. Avantageusement, la colonne est adaptée pour une utilisation en chromatographie gaz-liquide ou pour une utilisation en chromatographie en phase gazeuse.
Avantageusement, la séparation des constituants du mélange peut être réalisée par une colonne d'adsorption, une colonne de partage, une colonne d'affinité, une colonne échangeuse d'ions, une colonne d'exclusion stérique ou une colonne d'électrophorèse capillaire. De préférence, lorsque la phase stationnaire est solide, la colonne est une colonne d'adsorption, d'affinité, d'échange d'ions ou d'exclusion. De manière avantageuse, la colonne est une colonne de partage.
La phase stationnaire peut être liquide ou solide. Cet état dépend non seulement de la nature du produit constituant la phase stationnaire, mais aussi des conditions de pression et de température auxquelles le procédé de l'invention est mis en œuvre. La phase stationnaire peut être greffée chimiquement ou non au tube de la colonne. Avantageusement, parmi les phases stationnaires liquides, on peut choisir des phases polaires ou apolaires généralement constituées de silicones ou de polymères fluorés. Avantageusement parmi les phases stationnaires solides, on peut choisir des polymères poreux, des cristaux liquides, des dextrines, de l'alumine, du charbon actif et des hydrocarbures (par exemple : squalane, n-alcanes lourds).
La phase mobile est un fluide choisi parmi les liquides ou les gaz. Parmi les phases mobiles liquides on peut citer des solvants purs ou un mélange de solvants. Parmi les phases mobiles gazeuses, on peut citer l'hydrogène, l'hélium, l'azote, l'argon ou un mélange de ces gaz.
Les conditions de mise en œuvre du dispositif de chromatographie sont choisies pour permettre une résolution satisfaisante des composés du mélange de référence et du mélange des sondes. On cherche habituellement à optimiser ces conditions de façon à ce que chaque composé soit élué de façon individuelle avec de préférence un retour à la ligne de base du chromatogramme d'élution entre chaque pic.
Dans un mode de mise en œuvre de l'invention, lorsque l'échantillon est une huile brute, notamment un échantillon d'une sous-fraction de cette huile brute, la colonne chromatographique est adaptée pour une utilisation en chromatographie en phase gazeuse, notamment la phase stationnaire est choisie parmi les phases apolaires et la phase mobile est choisi parmi l'hélium, l'azote, l'argon ou l'hydrogène.
Le dispositif de chromatographie mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit moyen de détection étant couplé à la sortie de la colonne chromatographique. Le moyen de détection comprend au moins un détecteur et au moins un enregistreur, notamment un ordinateur. L'enregistreur fournit un tracé des signaux enregistrés, le tracé comprenant les pics chromatographiques, chaque pic pouvant correspondre à un ou plusieurs composé(s) élué (s). Le moyen de détection couplé à la colonne de chromatographie permet donc d'obtenir un chromatogramme d'élution (30). Le détecteur permet de détecter au moins un signal pour une grandeur physique mesurée.
La grandeur physique mesurée peut être une longueur d'onde, un rapport masse sur charge (m/z), une intensité, une tension, une résistance, un déplacement chimique.
Avantageusement, la grandeur physique mesurée est un rapport masse sur charge (m/z).
Le détecteur peut être choisi parmi les détecteurs enregistrant des signaux simples ou bien des signaux complexes. Par signal simple, on entend un signal unique pour une molécule donnée qui est enregistré pour une grandeur physique mesurée. Le moyen de détection enregistre un seul chromatogramme et la détection est appelée détection simple. Par signal complexe, on entend une multitude de signaux pour une molécule donnée qui sont enregistrés simultanément pour une grandeur physique mesurée. Le moyen de détection enregistre plusieurs chromatogrammes (un pour chaque grandeur physique de l'intervalle) et la détection est appelée détection complexe.
Par exemple, parmi les moyens de détection enregistrant des signaux simples, on peut citer :
les détecteurs à ionisation de flamme (FID),
les détecteurs à conductibilité thermique (TCD),
les détecteurs à capture d'électrons (ECD),
les détecteurs d'oxygène (O-FID),
les détecteurs à combustion catalytique (CCD),
les détecteurs de soufre (FPD, SCD et P-FPD),
les détecteurs d'azote (NPD) ou de phosphore, les détecteurs à photoionisation (PID),
les détecteurs à thermo-ionisation (TID),
les détecteurs nano systèmes électro mécaniques (NEMS)
les détecteurs à réfractométrie, les détecteurs à diffusion de la lumière, les détecteurs d'absorption UV- Visible,
les détecteurs de fluorescence,
les détecteurs électrochimiques.
Parmi les moyens de détection enregistrant des signaux complexes, on peut citer : les spectromètres dans la gamme de longueurs d'ondes du spectre UV, visible ou infra-rouge (IR),
les spectromètres de masse, quel qu'en soit leur principe,
les détecteurs à spectrométrie d'émission atomique (ICP : Induced Coupled Plasma en terminologie anglo-saxonne),
les détecteurs à spectrométrie infrarouge (IRTF : Infrarouge à transformé de Fournier), ou les détecteurs de résonance magnétique nucléaire (RMN),
les spectromètres dans les longueurs d'onde du spectre UV ou visible, - les spectromètres à fluorescence,
les détecteurs de résonance magnétique nucléaire (RMN).
Les moyens de détection fournissant des signaux complexes sont également capables d'enregistrer des signaux simples.
Le choix du moyen de détection s'effectue en fonction de la nature de l'échantillon à étudier, en fonction de la nature de la phase mobile mise en œuvre dans le dispositif de chromatographie et en fonction du type de sonde S et de son marquage éventuel.
De préférence, lorsque la phase mobile est liquide, le moyen de détection est choisi parmi le groupe formé par les réfractomètres, les détecteurs d'absorption UV- Visible, les détecteurs d'absorption infrarouge, les spectromètres de fluorescence, les détecteurs à diffusion de la lumière, les détecteurs à barrettes de diodes, les détecteurs électrochimiques, les réfractomètres différentiels, les détecteurs de résonance magnétique nucléaire (RMN) ou les spectromètres de masse (MS). Avantageusement, le moyen de détection est un spectromètre de masse.
De préférence, lorsque la phase mobile est gazeuse, le moyen de détection est choisi parmi le groupe formé par les détecteurs à ionisation de flamme (FID), les détecteurs à conductibilité thermique (TCD), les détecteurs à combustion catalytique (CCD), les spectromètres infra-rouge (IRTF : Infrarouge à transformé de Fournier), les spectromètres d'émission atomique (AED, ICP), les détecteurs à capture d'électrons (ECD), les détecteurs d'oxygène (O-FID), les détecteurs à combustion catalytique (CCD), les détecteurs nano systèmes électro mécaniques (NEMS), les détecteurs de soufre (FPD, SCD et P-FPD), les détecteurs d'azote (NPD) ou de phosphore, les détecteurs à photo-ionisation (PID), les spectromètres de masse (MS), les détecteurs à photo -ionisation (PID) ou les détecteurs à thermo- ionisation (TID). Avantageusement, le moyen de détection est un spectromètre de masse.
Avantageusement, lorsque la phase mobile est gazeuse et que l'échantillon à étudier est une huile brute, notamment un échantillon d'une sous- fraction de cette huile brute, le moyen de détection est un spectromètre de masse. Parmi les spectromètres de masse qui peuvent être mis en œuvre dans le cadre de l'invention, on peut citer de manière non limitative les spectromètres de masse quadrupolaires, les spectromètres de masse à secteur magnétique ou électrostatique, les spectromètres de masse à temps de vol, les spectromètres de masse à trappe d'ion ou bien à transformation de Fourier. Le mode d'ionisation peut être par impact d'électrons, par ionisation chimique, par rayonnement laser, par bombardement d'atomes rapides ou métastables, par photoionisation ou par ionisation de champ.
Bien entendu, le dispositif chromatographique utilisé dans le cadre de la présente invention comprend en outre des moyens d'injection d'un échantillon dans la colonne, des moyens d'introduction de la phase mobile dans la colonne, des moyens de contrôle des paramètres opératoires, des moyens de couplage entre la colonne et le moyen de détection et tous autres moyens nécessaires au fonctionnement d'un tel dispositif. - Constitution (11) du mélange R2
Le mélange R2 comprend au moins deux sondes S.
Par « sonde », on entend dans la présente invention, une molécule représentative d'au moins une classe chimique d'un marqueur M et caractérisée par au moins un signal univoque (32) par rapport aux signaux correspondant aux composés constituants les mélanges RI et R2, le signal univoque étant détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée.
Un signal univoque (32) est un signal qui permet d'identifier clairement et sans ambiguïté la sonde S par rapport aux composés du mélange RI et R2.
Le signal univoque (32) est facilement identifiable car il est détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée. La valeur VSsonde est la valeur de la grandeur physique mesurée par le détecteur à laquelle seule la sonde émet un signal univoque. Cette valeur VSsonde permet donc d'enregistrer uniquement le signal de la sonde.
Par exemple un signal univoque d'une sonde S peut être une seule raie d'absorption en infra-rouge spécifique de la sonde S et que l'on ne retrouve pas sur les spectres infra-rouge des marqueurs M. La valeur spécifique VSsonde est ici la valeur de la longueur d'onde à laquelle on observe la raie d'absorption en infra-rouge.
Dans un autre exemple, un signal univoque (32) d'une sonde S peut être un ion- fragment obtenu pour un rapport masse sur charge (m/z) donné (31) lorsque que la sonde est ionisée et fragmentée. Cet ion-fragment est spécifique de la sonde. Lorsque les marqueurs M sont ionisés et fragmentés, les ion-fragments des marqueurs ont des valeurs de rapport masse sur charge (m/z) différents de ceux des sondes (33). La valeur spécifique VSsonde est, dans ce cas, la valeur du rapport masse sur charge (m/z) à laquelle on observe l'ion-fragment spécifique de la sonde.
Ainsi, chaque sonde S selon l'invention est facilement identifiable car elle est éluée sous la forme d'un pic qui est identifiable grâce au signal univoque (32) enregistré par le moyen de détection à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée. Par exemple, le cholestane-d4 donne un signal spécifique masse/ charge m/z 221 lorsqu'un spectromètre de masse est utilisé comme détecteur.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la sonde S est une sonde marquée par un groupement marqueur. Le marquage de la sonde S par un groupement marqueur permet de faciliter la production du signal univoque.
Le groupement marqueur peut être un isotope, un chromophore qui absorbe les ultra-violets (UV), un chromophore qui absorbe les infra-rouges (IR) ou par un luminophore. L'isotope est généralement choisi parmi les isotopes stables, tels
2 13 18 34 que le deutérium ( H), le carbone 13 ( C), l'oxygène 18 ( O), le soufre ( S), l'azote 15 (15N). Un luminophore est une molécule ou un groupement chimique capable d'émettre de la lumière à une longueur d'onde donnée lorsque cette molécule ou ce groupement chimique est excité.
Le marquage de la sonde est une technique bien connue de l'homme du métier. Il consiste soit à greffer le groupement marqueur (par exemple greffage chimique d'un chromophore) sur la sonde soit à synthétiser une sonde dans laquelle le groupement marqueur est incorporé dans la sonde au cours de la synthèse (par exemple incorporation d'un ou plusieurs isotopes au cours de la synthèse chimique de la sonde).
De préférence, la sonde selon l'invention est marquée au deutérium et est choisie de manière à fournir un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée. L'utilisation en chromatographie en phase gazeuse de composés marqués au deutérium présente de nombreux avantages. Ces composés ne présentent pas le même encombrement stérique que les composés non marqués. Ils présentent donc des temps de rétention plus courts que leurs homologues protonnés, ce qui limite grandement les interférences sur le chromatogramme. Une sonde marquée au deutérium est facilement identifiable par spectrométrie de masse grâce à son signal univoque et son temps de rétention qui diffèrent de ceux d'une sonde comprenant des protons.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la valeur spécifique
VSsonde est différente pour chaque sonde S du mélange R2.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la valeur spécifique VSsonde est la même pour au moins deux sondes du mélange, ces sondes se différentiant l'une de l'autre par leurs temps de rétention. Ainsi les pics chromatographiques des sondes sont répartis le long du chromatogramme.
De préférence, lorsque l'échantillon à étudier est une huile brute, notamment un échantillon d'une sous-fraction de cette huile brute, les sondes S sont des composés hydrocarbonés comprenant au moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, lesdits composés étant saturés ou insaturés, linéaires, ramifiés ou cycliques, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
Avantageusement, les sondes S sont marquées avec au moins un isotope stable parmi choisi le deutérium (2H), le carbone 13 (13C), l'oxygène 18 (180), le soufre (34S), l'azote 15 (15N), de préférence le deutérium.
Avantageusement, les sondes S sont choisies parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone éventuellement marqués au deutérium, les hydrocarbures cycliques éventuellement marqués au deutérium comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures aromatiques éventuellement marqués au deutérium comprenant de 5 à 50 atomes de carbones, les stéroïdes éventuellement marqués au deutérium et leurs mélanges.
Parmi les hydrocarbures saturés linéaires ou ramifiés marqués au deutérium, on peut citer les n-alcanes comprenant de 5 à 50 atomes de carbone et 1 à 102 atomes de deutérium, notamment un alcane comprenant 24 atomes de carbone et 50 atomes de deutérium (nC24-d50), un alcane comprenant 36 atomes de carbone et 74 atomes de deutérium (nC36-d74).
Parmi les hydrocarbures cycliques marqués au deutérium, on peut citer le cholestane-d4.
Parmi les hydrocarbures insaturés marqués au deutérium, on peut citer le cholestène-d4.
Par les hydrocarbures aromatiques soufrés ou non soufrés marqués au deutérium, on peut citer le naphtalène-ds, le phénanthrène-dio, le dibenzothiophène-ds et le chrysène-di4.
- Introduction (12) dans une colonne et élution (13) des marqueurs et des sondes.
L'introduction simultanée des mélanges RI et R2 s'effectue par des moyens d'introduction bien connus de l'homme du métier, tel qu'une seringue, une vanne d'injection, etc.
Préalablement à leur introduction dans le dispositif de chromatographie, le mélange RI et/ou le mélange R2 peut subir au moins une étape de préparation telle que la fîltration, la dilution dans un solvant, etc. L'élution des composés des marqueurs M et des sondes S est effectuée par la phase mobile dans la colonne de chromatographie. Les moyens d'introduction de la phase mobile sont bien connus de l'homme du métier. - Chromatogramme d'élution (14)
On enregistre le chromatogramme (14) qui comprend :
- les pics chromatographiques de chaque sonde et le signal univoque de la sonde associé à chacun de ces pics, et
- les pics chromatographiques de chaque marqueur et le signal ou les signaux des marqueurs associés à chacun de ces pics.
Les pics et les signaux des sondes sont enregistrés au moins à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée.
Les pics et les signaux des marqueurs sont enregistrés à au moins une valeur de la grandeur physique mesurée (VSmarqueurs), cette valeur étant différente de la valeur spécifique VSsonde. La valeur de la grandeur physique mesurée à laquelle sont détectés les signaux des marqueurs VSmarqUeurs peut être fixe ou bien varier dans un intervalle donné de la grandeur physique mesurée.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la valeur spécifique VSmarqueurs est différente pour chaque marqueur M du mélange RI .
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la valeur spécifique VSmarqUeurs est la même pour au moins deux marqueurs du mélange RI .
Avantageusement lorsque le moyen de détection est un spectromètre de masse, la grandeur physique mesurée est le rapport masse/charge (m/z). Dans un mode de réalisation, l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs s'effectue en enregistrant la totalité des spectrogrammes des rapports masses/charges, c'est à dire pour une valeur VSmarqUeurs du rapport masse/charge (m/z) qui varie de 35 à 550, de préférence 50 à 450.
Dans un autre mode de réalisation, l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs est effectué pour des rapports masses/charges définis, c'est à dire la valeur VSmarqUeur est fixée pour certains rapports masse/charge (m/z). On enregistre dans ce cas des signaux correspondant aux ions-fragments spécifiques produits par l'ionisation et la fragmentation des marqueurs M. Avantageusement, lorsque la valeur VSmarqUeur est fixée, ces valeurs sont choisies parmi le groupe suivant : Famille de S marqueur (m/z) marqueurs
Saturés n-, iso-, méthyl-alcanes 85
Triperpanes tri-tétra, penta et 191
hexacyclique
Stéranes réguliers 217
monocycloalcanes 68 et 82
Triperpanes réguliers démethylés en 177
position 25
Méthyl-hopanes 205
bicyclanes 193
bicyclanes et 8,14 sécohopanes 123
méthylstéranes 231
iso-stéranes 218
stéranes réarrangés 259
gammacérane 191
oléanane 191
diahopanes et hopanes 191
Insaturés isoprènoïde réguliers 183
Aromatiques non Benzène / Toluène 78 / 92
soufrés
Alkylbenzènes 91, 92, 105, 106,
119, 120, 133, 134
Naphtalène 128
Méthyl, diméthyl et triméthyl 142 / 156 / 170 naphtalène
Phénanthrène 178
Méthyl, diméthyl et triméthyl 192 / 206 / 220 phénanthrène
Chrysène 228
Aromatiques soufrés Benzothiophene 134
Dibenzothiophène 184
Méthyl, diméthyl et triméthyl 198 / 212 / 226 dibenzothiophène
Naphtobenzothiophène 234
Méthyl, diméthyl et triméthyl 248 / 262 / 276 naphtobenzothiophène Tableau I
Les valeurs spécifiques VSsonde pour les sondes citées ci-dessus sont :
Tableau II: Valeurs spécifiques VSsonde de sondes S
- Identification de la position des sondes et des marqueurs sur le chromato gramme
On étudie les signaux des produits élués. On identifie les sondes S par leur signal univoque. On mesure le temps de rétention de chaque sonde S sur le chromatogramme d'élution (14). On mesure le temps de rétention de chaque marqueur M sur le chromatogramme d'élution (14). On enregistre le temps de rétention de chaque sonde S et de chaque marqueur M. Cet enregistrement peut être graphique et/ou numérique.
L'ensemble des temps de rétention de chaque sonde S sur le chromatogramme d'élution constitue l'empreinte Eo (15) du chromatogramme pour une introduction donnée à t=to.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on calcule pour chaque marqueur M et pour chaque sonde S les indices de rétention. L'indice de rétention d'un composé est le rapport entre le temps de rétention du composé et la différence entre le temps de rétention d'une première référence (sonde éluée en début d'analyse) et le temps de rétention d'une seconde référence (sonde éluée en fin d'analyse). Dans la suite de la présente demande, les termes « temps de rétention » et « indice de rétention » peuvent être substitués l'un par rapport à l'autre.
- Obtention du chromatogramme Co_(16)
Le chromatogramme Co (35) comprend la valeur du temps de rétention de chaque marqueur M et l'empreinte E0 (34) c'est à dire les valeurs du temps de rétention de chaque sonde S, pour une introduction simultanée du mélange R1+R2 à un temps t=to- Le chromatogramme Co peut être graphique ou numérique. L'enregistrement du chromatogramme Co (35) s'effectue par des moyens informatiques bien connus de l'homme du métier.
- Réitération pour un même dispositif de chromatographie
On renouvelle n fois à différents temps ti avec i variant de 0 à n les étapes b) à g) sur le même dispositif de chromatographie. Pour chaque temps ti, on détermine l'empreinte Ei (15) et on enregistre le chromatogramme Ci (16) correspondant et associé à l'empreinte Ei. Un temps ti correspond à un degré de vieillissement de la colonne dans le temps à l'instant i. Le temps ti correspond à un degré de vieillissement de la colonne dans le temps.
La période de temps allant de t0 à tn représente la durée pendant laquelle on constitue la collection de chromatogrammes Cn (17), n représentant le nombre d'introductions simultanées du mélange R1+R2. n est un entier supérieur à 0, de préférence compris entre 30 et 100. Avantageusement, lorsque que l'échantillon est une huile brute, notamment un échantillon d'une sous-fraction de cette huile brute, n va de 40 à 50.
Les introductions simultanées des mélanges R1+R2 dans le dispositif de chromatographie peuvent être faites selon une fréquence déterminée (par exemple toutes les semaines) ou aléatoire. De préférence, on procède à la constitution d'une collection de chromatogrammes Co, Ci, C2 ... Ci... Cn de façon régulièrement échelonnée dans le temps. Les temps ti avec i variant de 0 à n avec n>0 peuvent couvrir tout ou partie de la vie d'une colonne chromatographique. Une colonne chromatographique est en fin de vie lorsque sa résolution est estimée insuffisante et lorsque la phase mobile est chimiquement trop dégradée. Ces critères sont bien connus de l'homme du métier qui peut notamment se référer au Manuel pratique de chromatographie en phase gazeuse. Jean Tranchant, éditions Masson, Juin 1995.
Par même dispositif de chromatographie, on entend ici que les étapes b) à g) sont effectuées sans qu'il y ait eu un changement de colonne, de moyen de détection ou de conditions opératoires. Il est bien entendu que la colonne ne peut pas être strictement identique à la colonne utilisée en début de procédé, puisque entre chaque temps ti et ti+i le dispositif chromatographique a vieilli et s'use.
L'ensemble des chromatogrammes Ci avec i variant de 0 à n constitue la collection de chromatogrammes Co, Ci, C2 ... Ci... Cn pour un mélange de référence donné RI, pour un mélange de sondes R2 et pour une colonne de chromatographie donnée, chaque chromatogramme Co, Ci, C2 ... Ci... Cn étant associé respectivement à une empreinte E0, El s E2 ... Ei... En Un autre objet de la présente invention concerne une collection de chromatogrammes C0, Ci, C2. ... Ci. ... Cn résultant :
- de l'élution simultanée et répétée à des temps t0, tl s t2.... t;....t„, n étant un entier n>0, d'un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au deux marqueurs M et d'un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées, sur une colonne de chromatographie et de la détection des composants du mélange R1+R2 à l'aide d'au moins un moyen de détections mesurant au moins une grandeur physique, chaque sonde S étant caractérisée par au moins un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée, et
- de l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs, chaque chromatogramme Ci avec o<i <n comportant une empreinte Ei avec o<i <n correspondant aux temps de rétention des sondes du mélange R2.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(al) On fournit un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit moyen de détection étant couplé à la colonne chromatographique
(bl) On fournit au moins une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence RI et d'un mélange R2 de sondes S telle que définie précédemment, à l'aide d'une colonne chromatographique et d'un moyen de détection identiques à ceux mise en œuvre dans l'étape (al)
(cl) On introduit simultanément dans le dispositif chromatographique, l'échantillon et le mélange R2 identique au mélange R2 ayant servi à la constitution de la collection de chromatogramme,
(dl) On élue les composés de l'échantillon et les sondes S par au moins une phase mobile,
(el) On enregistre le chromatogramme d'élution C des sondes S et des composés de l'échantillon,
(fl) On identifie le temps de rétention de chaque sonde S du mélange
R2 sur le chromatogramme C obtenu à l'étape (el) afin d'obtenir l'empreinte E de l'échantillon,
(gl) On compare l'empreinte E de l'étape (fl) avec chaque empreinte
E0, Ei, E2 . .. Ei. .. En des chromatogrammes C0, Ci, C2 . .. Ci. .. Cn de la collection de chromatogramme, (hl) On identifie le chromatogramme Cj dont l'empreinte Ej est sensiblement superposable à l'empreinte E de l'étape (gl), (il) On compare le chromatogramme C au chromatogramme Cj.
On présente maintenant, en relation avec la figure 2, les principales étapes du procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique. Les objets communs aux deux figures sont désignés par la même référence.
Par « colonne chromatographique et moyen de détection identiques » on entend au sens de la présente invention, une colonne chromatographique et un moyen de détection constitués des mêmes éléments arrangés dans la même configuration que ceux utilisés dans le procédé de constitution de la collection de chromatogrammes tel que défini précédemment. La colonne a les mêmes dimensions et la même phase stationnaire que celle ayant servi à la mise en œuvre du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes défini précédemment et le moyen de détection est de même nature que celui utilisé lors de la mise en œuvre du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini ci-dessus. Les conditions opératoires du dispositif chromatographique ayant servi à la mise en œuvre de procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini précédemment et les conditions opératoires de fonctionnement du dispositif de chromatographie pour la mise en œuvre dans le procédé d'identification selon l'invention sont les mêmes, en particulier la phase mobile, la température, la pression ... Le vieillissement des phases stationnaires est un phénomène physico-chimique qui varie de façon aléatoire et non linéaire. Il ne peut pas être prédit et dépend d'un certain nombre de paramètres tels que la nature de la phase stationnaire, la nature et de la quantité des composés injectés. ..
Le mélange R2 (1 1) utilisé dans le procédé d'identification est identique au mélange R2 ayant servi à la constitution de la collection de chromatogrammes, c'est-à-dire qu'il est constitué des mêmes sondes que celles utilisées pour la mise en œuvre du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini précédemment.
L'introduction (19) simultanée de l'échantillon du mélange à analyser (18) et du mélange R2 (1 1) dans le dispositif de chromatographie s'effectue par des moyens d'introduction bien connus de l'homme du métier, tel qu'une seringue, une vanne d'injection, etc.
L'élution (20) des composés de l'échantillon du mélange à analyser et des sondes S s'effectue dans les mêmes conditions opératoires et avec la même phase mobile que ceux utilisées pour l'étape d'élution du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini précédemment. On enregistre le chromatogramme C (21) qui comprend :
- les pics chromatographiques de chaque sonde et le signal univoque de la sonde associé à chacun des pics, et
- les pics chromatographiques des composés de l'échantillon à analyser et le signal ou les signaux de ces composés associés à chacun de ces pics.
Les pics et les signaux des sondes sont enregistrés à au moins une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée.
Les pics et les signaux des composés de l'échantillon à analyser sont enregistrés à au moins deux valeurs de la grandeur physique mesurée (VSmarqueurs) des marqueurs du mélange RI .
L'identification de la position de chaque sonde S sur le chromatogramme C s'effectue de la même manière que celle qui a été mise en œuvre lors du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini précédemment. Brièvement on repère, grâce à son signal univoque, la sonde S dans les signaux de détection associés à chaque pic d'élution. On identifie le temps de rétention de la sonde S sur le chromatogramme C. On répète cette opération de manière à identifier la position de chaque sonde S sur le chromatogramme C. L'ensemble des temps de rétention des sondes S sur le chromatogramme constitue l'empreinte E (22) du chromatogramme C.
On compare (23) ensuite l'empreinte E (22) du chromatogramme C avec les empreintes chromatographiques E0, El s E2 ... Ei... En enregistrées dans la collection de chromatogrammes Cn (17) du mélange de référence RI . L'étape de comparaison s'effectue par des moyens informatiques à l'aide d'un logiciel, dont les principales étapes sont les suivantes :
1. Mesurer les temps de rétention de tous les pics du chromatogramme Cj de l'échantillon à analyser, à partir du signal ou des signaux enregistrés par le détecteur ou tous les détecteurs,
2. Repérer les sondes S du mélange R2 et mesurer leur temps de rétention,
3. Calculer la différence D entre les temps de rétention xt des sondes dans l'échantillon analysé et ceux des sondes yt des échantillons de la base de données (collection d'empreintes En de chromatogrammes Cn) : D = ∑ (xt— yt)2, où m est le nombre de sondes S et t le numéro d'ordre de la sonde,
4. Une fois D calculé, on choisit dans la base de données le chromatogramme Ci et les données associées, pour lesquels D est minimum, 5. Les indices de rétention des marqueurs M du chromatogramme Ci sont utilisés pour calculer les temps de rétention attendus des mêmes composés pour l'échantillon analysé,
6. Les pics des composés de l'échantillon analysé sont identifiés.
La comparaison permet d'identifier (24) un chromatogramme Cj
(24) dont l'empreinte chromato graphique Ej est sensiblement superposable à l'empreinte chromatographique E (22). Par « sensiblement superposable », on entend au sens de la présente invention l'obtention d'une seule image lorsqu'on superpose les chromatogrammes. Les temps de rétention de chaque sonde S sur le chromatogramme Cj est alors sensiblement identique au temps de rétention de la même sonde sur le chromatogramme C. Cette ressemblance est quantifiée en calculant la différence D entre les temps de rétention xt des sondes S dans l'échantillon analysé et ceux des sondes yt des échantillons de la base de données (collection d'empreintes En de chromatogrammes Cn) : D =∑ (xt— yt)2, où m est le nombre de sondes S et t le numéro d'ordre de la sonde. Une fois D calculé, on choisit dans la base de données le chromatogramme Cj pour lesquels D est minimum.
On analyse (25) ensuite le chromatogramme C par comparaison avec le chromatogramme Cj et on identifie ou non la présence d'un composé dans l'échantillon du mélange à analyser. L'identification du ou des composés de l'échantillon du mélange organique s'effectue en comparant chaque pic du chromatogramme de l'échantillon C (ou chaque temps de rétention) avec ceux du chromatogramme Cj. Les pics du chromatogramme Cj qui sont superposables aux pics du chromatogramme C de l'échantillon indiquent la présence de marqueurs M dans l'échantillon.
Avantageusement, l'invention décrite ci-dessus est mise en œuvre pour identifier au moins un composé d'un échantillon d'une huile brute, notamment au moins un composé d'un échantillon d'une sous-fraction d'une huile brute.
Un autre objet de la présente invention concerne un kit pour la mise en œuvre du procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes tel que défini précédemment et/ou pour la mise en œuvre du procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'une huile brute, ce kit comprenant au moins :
- un mélange de référence RI comprenant au moins deux marqueurs M choisis parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures cycliques, notamment les hydrocarbures aromatiques comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les stéroïdes et leurs mélanges,
- un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées au deutérium, chaque S étant un composé hydrocarboné comprenant moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, ledit composé étant saturé ou insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
Dans une variante, le kit comprend en outre au moins une colonne de chromatographie telle que définie ci-dessus. De préférence la colonne est une colonne de partage.
Un autre objet de la présente invention concerne un kit pour la mise en œuvre d'un procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique, ce kit comprenant :
- une collection de chromatogramme C0, Ci , C2. . .. Ci. . ..Cn résultant :
■S de l'élution simultanée et répétée à des temps t0, tl s t2. ... ti. ...tn , n étant un entier n>0, d'un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au deux marqueurs M et d'un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées, sur une colonne de chromatographie et de la détection des composants du mélange R1+R2 à l'aide d'au moins un moyen de détections mesurant au moins une grandeur physique, chaque sonde S étant caractérisée par au moins un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée, et
• de l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs, chaque chromatogramme Ci avec o<i <n comportant une empreinte Ei avec o<i <n correspondant aux temps de rétention des sondes du mélange R2.
- une colonne de chromatographie identique à celle utilisée pour la constitution de la collection de chromatogramme,
- un mélange de sondes R2 identique à celui utilisé pour obtenir la collection de chromatogramme.
L'invention s'applique au domaine de la chimie analytique. Elle peut être mise en œuvre pour identifier plusieurs constituants d'un mélange organique complexe.
L'invention permet avantageusement de déterminer la nature, l'origine et l'altération d'une huile brute extraite d'une formation géologique, de déterminer la nature des polluants dans un aquifère, d'identifier les constituants d'un parfum, etc.
Elle peut aussi être mise en œuvre pour identifier un composé au sein d'un mélange complexe, comme c'est le cas par exemple pour des études de toxicologie, des contrôles qualité dans le domaine alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique. Exemple de réalisation de l'invention
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit d'un mode de réalisation préféré de l'invention, donné à titre d'exemple et en référence aux figures annexées.
Le procédé selon l'invention est mis en œuvre pour déterminer la composition chimique d'un mélange d'hydrocarbures extraits d'une formation géologique (appelé huile brute dans la suite de la demande) par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Une huile brute est un mélange complexe qui peut contenir des milliers d'hydrocarbures différents, tous dans des concentrations variables.
A-l Constitution du mélange RI :
Ce mélange est choisi de telle façon qu'il contienne la plupart des biomarqueurs connus d'huiles brutes d'origine géologique différente (voir tableau III).
Comme les huiles brutes ont des compositions très variables (selon leur âge, leur degré d'altération naturelle, etc .), aucune huile ne contient tous les bio marqueurs connus. Par exemple, il est rare de rencontrer dans la même huile brute, le gammacérane et l'oléanane, molécules formées par des organismes ayant vécu dans des environnements complètement différents. En outre, certaines molécules apparaissent tardivement dans l'évolution de la vie. L'ensemble de ces biomarqueurs connus sont rarement présents simultanément dans une même huile brute. Le mélange de référence RI est donc une signature artificielle qui contient un ensemble de signatures individuelles d'huiles brutes.
Ainsi, le mélange RI est un mélange comprenant au moins composé appartenant à la famille 25-norhopanes, au moins un composé appartenant à la famille des terpanes tri-, tétra-, penta- et hexa-cycliques, le gammacérane, l'oléanane, au moins un composé appartenant à la famille des diahopanes, au moins un composé appartenant à la famille des stéranes, au moins un composé appartenant à la famille des 8,14 sécohopanes, et au moins un composé appartenant à la famille des diastéranes.
Tableau III : EXEMPLE DE MARQUEURS TYPIQUES SATURES (BIOMARQUEURS FOSSILES) PRESENTS DANS DES HUILES BRUTES, SELON LEUR ORIGINE GEOGRAPHIQUE
A-2 Constitution du mélange R2 pour les hydrocarbures saturés :
Dans une seconde étape, on constitue un mélange de référence R2 qui comprend 3 sondes marquées au deutérium :
- Sonde SI : nC24-d5o,
Sonde S2: nC36-d74,
Sonde S3: cholestane-d4
Les sondes SI et S2 sont représentatives des composés hydrocarbures saturés à chaîne linéaire contenus dans les huiles brutes et la sonde S3 est représentative des hydrocarbures cycliques saturés contenus dans les huiles brutes.
Ces sondes sont facilement identifiables sur le chromatogramme d'élution en se plaçant à une valeur du rapport masse/charge (m/z) spécifique pour chaque sonde.
En effet, chaque sonde a été choisie de manière à fournir un seul signal à une valeur du rapport masse/charge (m/z) donné. Comme illustré sur la figure 5, la sonde SI présente un signal unique, facilement identifiable lorsqu'on se place à une valeur m z=66. Il en est de même pour la sonde S2. La sonde S3 présente un signal unique, facilement identifiable lorsqu'on se place à une valeur m/z=221.
On identifie donc la position de chaque sonde S sur le chromatogramme d'élution et on calcule le temps de rétention de chaque sonde S.
A-3 : Matériel chromatographique et conditions opératoires : L'appareil utilisé est un chromatographe en phase gazeuse (GC)
(Agilent 7890) couplé à un spectromètre de masse (MS) simple quadripôle (Agilent 5975 C). Le logiciel d'acquisition et de traitement préliminaire des données est une Chemstation Agilent.
La colonne chromatographique est une colonne capillaire, de 60 mètres de long et dont le diamètre interne est de 0,25 mm et de phase apolaire de 0,1 μιη d'épaisseur.
On injecte simultanément à un temps t=to, le mélange de référence RI et le mélange R2, contenant les trois sondes SI, S2 et S3 dans le dispositif chromatographique décrit ci-dessus.
Les conditions opératoires sont résumées dans le tableau IV ci- dessous. Phase mobile hélium
Débit de la phase mobile 2ml/mn
Température de l'injecteur 50°C (injecteur « on column »)
Température de la colonne 50 à 350°C, 2°C / mn
Type de colonne Apolaire (OV-1, polydiméthysiloxane)
Volume d'échantillon injecté 1 micro litre dilué
Durée de l'analyse 3,5 heures
Détecteur Spectromètre de masse Agilent 5975 C
Interface GC/MS 350 degrés
Tableau IV : CONDITIONS OPERATOIRES
A-4 Constitution d'une collection de chromatogrammes :
On enregistre le chromatogramme d'élution du mélange R1+R2 en enregistrant les signaux des 3 sondes aux valeur VS sonde égales à m/z 66 et m/z 221 et en enregistrant les signaux des biomarqueurs aux valeurs VS marqueurs égales m/z 123, m/z 177, m/z 191, m/z 217, m/z 259.
On identifie la position de chaque sonde S sur le chromatogramme d'élution par l'étude du spectrogramme de masse enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 66 et de celui enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 221. On calcule le temps de rétention de chaque sonde S et on obtient l'empreinte Eo.
La figure 6 illustre le chromatogramme d'élution des marqueurs enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 191 et celui enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 217. On mesure ensuite le temps de rétention de chaque biomarqueur sur son spectrogramme de masse caractéristique. Ainsi pour les marqueurs appartenant à la famille des terpanes, on calcule le temps de rétention de chaque marqueur à partir du chromatogramme d'élution enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 191. Pour les marqueurs appartenant à la famille des stéranes, on calcule le temps de rétention de chaque marqueur à partir du chromatogramme d'élution enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 217.
On obtient ainsi un chromatogramme Co comprenant la position identifiée des trois sondes S et les biomarqueurs de la famille des terpanes et de la famille des stéranes. La position des trois sondes au temps t=t0 forme l'empreinte E0 du chromatogramme Co. On répète l'introduction simultanée du mélange (R1+R2) une semaine (ti) après la première introduction du mélange (t0) et dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites dans le tableau IV et on enregistre comme précédemment les signaux des sondes et des biomarqueurs. On établit le chromatogramme Ci et son empreinte El s comme décrit précédemment pour le chromatogramme Co; c'est-à-dire en identifiant la position des sondes SI, S2 et S3 par l'étude du spectrogramme de masse enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 66 et de celui enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 221 pour obtenir l'empreinte El . On identifie la position des biomarqueurs des familles des terpanes et des stéranes par l'étude du chromatogramme de masse enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égal à 191 et de celui enregistré à du rapport masse/charge (m/z) égal à 217 respectivement.
On répète l'introduction du mélange (RI et R2) au moins une quarantaine de fois et à une fréquence hebdomadaire, chaque introduction étant réalisée dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites dans le tableau IV. Pour chaque introduction, on obtient un chromatogramme Ci comprenant l'empreinte Ei et la position de chaque biomarqueur pour le temps t = t;. Or, la colonne vieillissant, on observe une dérive des temps de rétention et des indices de rétention des sondes SI, S2 et S3 et des biomarqueurs par rapport à ceux observés pour t = t0. On obtient ainsi une collection de chromatogrammes d'élution des biomarqueurs, chaque chromatogramme Cn étant représentatif d'un stade de vieillissement de la phase stationnaire de la colonne. A-5 Analyse d'un échantillon :
On procède ensuite à l'analyse des composés de l'échantillon d'huile brute.
On injecte simultanément dans le dispositif chromatographique ayant servi à établir les chromatogrammes du mélange de référence RI, l'échantillon d'huile brute et le mélange R2 comprenant les 3 sondes marquées au deutérium :
Sonde SI : nC24-d50,
Sonde S2: nC36-d74,
Sonde S3: cholestane-d4
L'échantillon d'huile brute peut éventuellement subir une étape de préparation préalablement à son mélange avec le mélange R2 et son introduction dans la colonne de chromatographie.
On enregistre le chromatogramme d'élution (chromatogramme C) du mélange échantillon d'huile brute et de sondes en enregistrant les signaux des 3 sondes aux valeur VS sonde égales à m/z 66 et m/z 221 et en enregistrant les signaux des composés de l'échantillon de l'huile brute aux valeurs VS marqueurs égales m/z 85, m/z 183, m/z 123, m/z 177, m/z 191, m/z 205, m/z 217, m/z 218, m/z 231, m/z 259, typiquement.
On identifie les sondes SI et S2 par leurs signaux uniques observables sur le spectrogramme de masse enregistré à la valeur du rapport masse/masse (m/z) égale à 66. La position de la sonde S3 est identifiée par son signal unique observable sur le spectrogramme de masse enregistré à la valeur du rapport masse/charge (m/z) égale à 221.
On mesure le temps de rétention de chaque sonde sur son spectrogramme de masse spécifique. Ces temps de rétention des trois sondes permettent de définir l'empreinte E de l'échantillon d'huile brute. Celle-ci est comparée, par des moyens informatiques, aux empreintes En des chromatogrammes Cn enregistrés dans la collection de chromatogrammes du mélange de référence RI .
On identifie le chromatogramme Cj pour lequel les temps de rétention des 3 sondes de l'empreinte Ej du temps tj sont sensiblement identiques aux trois temps de rétention de l'empreinte E. On identifie ainsi le chromatogramme Cj qui correspond à un stade de vieillissement t; de la colonne : le chromatogramme Cj fournit les temps de rétentions des marqueurs appartenant à la famille des terpanes et des stéaranes, ce qui permet de calculer précisément l'emplacement attendu des pics de ces composés sur le chromatogramme C de l'huile brute à analyser. On détermine l'origine géographique de l'huile brute en fonction de la présence ou non de certains marqueurs.
Ces résultats ont été obtenus quel que soit le degré de vieillissement de la colonne et sans qu'il y ait eu un besoin d'effectuer des étalonnages réguliers de la colonne de chromatographie. L'invention permet un gain de temps considérable et est plus fiable que les techniques actuelles qui permettent une identification d'une huile brute.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de constitution d'une collection de chromatogrammes pour un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au moins deux marqueurs M et pour au moins un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) On constitue un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S, chaque sonde S étant caractérisée par un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée ;
(b) A un temps t0, on introduit simultanément les mélanges RI et R2, dans la colonne de chromatographie couplée au moyen de détection,
(c) On élue les marqueurs M et les sondes S avec au moins une phase mobile,
(d) On enregistre le chromatogramme d'élution du mélange RI et R2,
(e) On identifie le temps de rétention de chacune des sondes S sur le chromatogramme de l'étape d) de manière à obtenir une empreinte Eo,
(f) On identifie le temps de rétention de chacun des marqueurs M sur le chromatogramme d'élution de l'étape d),
(g) On obtient le chromatogramme Co associé à l'empreinte Eo,
(h) On répète les étapes b) à g) à des temps échelonnés tl s t2 ti tn pendant la durée de vie de la colonne de façon à constituer une collection de chromatogrammes Co, Ci, C2. ... Ci. ...Cn, associés respectivement à une empreinte E0, El s E2. ... Ei. ...En pour chaque temps ti avec i variant de 0 à n, n étant un entier n>0.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la sonde S est une sonde marquée par au moins un groupement marqueur choisi parmi le groupe formé par un chromophore qui absorbe les ultra- violets, un chromophore qui absorbe les infrarouges, par un luminophore ou un isotope stable.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la colonne de chromatographie est choisie parmi le groupe formé, par une colonne d'adsorption, une colonne de partage, une colonne d'affinité, une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'exclusion stérique, de préférence une colonne de partage.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la grandeur physique mesurée est choisie parmi une longueur d'onde, un rapport masse sur charge m/z, une intensité, une tension, un déplacement chimique.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la grandeur physique mesurée est un rapport masse sur charge m/z et le moyen de détection est un spectromètre de masse.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'enregistrement du chromatogramme de l'étape (d) s'effectue en enregistrant la totalité des spectrogrammes des rapports masses/charges ou en enregistrant certains spectrogrammes à des rapports masses/charges définis.
7. Collection de chromatogramme C0, Cl s C2.... Ci. . . . Cn résultant :
- de l'élution simultanée et répétée à des temps t0, tl s t2.... t;....t„, n étant un entier n>0, d'un mélange de référence RI de composés organiques comprenant au moins deux marqueurs M et d'un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées, sur une colonne de chromatographie et de la détection des composants du mélange R1+R2 à l'aide d'au moins un moyen de détection mesurant au moins une grandeur physique, chaque sonde S étant caractérisée par au moins un signal univoque détectable à une valeur spécifique VSsonde de la grandeur physique mesurée, et
- de l'enregistrement du chromatogramme d'élution des marqueurs, chaque chromatogramme Ci avec o<i <n comportant une empreinte Ei avec o<i <n correspondant aux temps de rétention des sondes du mélange R2.
8. Procédé d'identification d'au moins un composé d'un échantillon d'un mélange organique, le procédé comprenant les étapes suivantes :
(al) On fournit un dispositif chromatographique comprenant au moins une colonne chromatographique et au moins un moyen de détection mesurant une grandeur physique, ledit moyen de détection étant couplé à la colonne chromatographique,
(bl) On fournit au moins une collection de chromatogrammes d'un mélange de référence RI et d'un mélange R2 de sondes S définie selon la revendication 7 ou obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à l'aide d'une colonne chromatographique et d'un moyen de détection identiques à ceux mis en œuvre dans l'étape (al), (cl) On introduit simultanément dans le dispositif chromatographique, l'échantillon et le mélange R2 identique au mélange R2 ayant servi à la constitution de la collection de chromatogramme,
(dl) On élue les composés de l'échantillon et les sondes S par au moins une phase mobile,
(el) On enregistre le chromatogramme d'élution C des sondes S et des composés de l'échantillon,
(fl) On identifie le temps de rétention de chaque sonde S du mélange
R2 sur le chromatogramme C obtenu à l'étape (el) afin d'obtenir l'empreinte E de l'échantillon,
(gl) On compare l'empreinte E de l'étape (fl) avec chaque empreinte
E0, Ei, E2 . .. Ei. .. En des chromatogrammes Co, Ci, C2 . .. Ci. .. Cn de la collection de chromatogramme,
(hl) On identifie le chromatogramme Cj dont l'empreinte Ej est sensiblement superposable à l'empreinte E de l'étape (gl), (il) On compare le chromatogramme C au chromatogramme Cj.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le mélange organique est une huile brute.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9 dans lequel le mélange de référence RI comprend au moins 2 marqueurs M choisis parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures cycliques, notamment les hydrocarbures aromatiques, comprenant de 5 à 50 atomes de carbone et leurs mélanges.
1 1. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel le mélange R2 comprend au moins deux sondes S marquées au deutérium, chaque sonde S étant un composé hydrocarboné comprenant au moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, ledit composé étant saturé ou insaturé, linéaire, ramifié ou cyclique, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 , dans lequel les étapes (gl) et (il) sont mises en œuvre à l'aide d'un moyen informatique, de préférence un logiciel.
13. Kit pour la mise œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou pour la mise œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12 comprenant au moins :
- un mélange de référence RI comprenant au moins deux marqueurs M choisis parmi le groupe formé par les hydrocarbures saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les hydrocarbures cycliques, notamment aromatiques comprenant de 5 à 50 atomes de carbone, les stéroïdes et leurs mélanges,
- un mélange R2 comprenant au moins deux sondes S marquées au deutérium, chaque S étant un composé hydrocarboné d'au moins 5 atomes de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, ledit composé étant saturé, insaturé, linéaire, ramifié, et/ou cyclique, notamment aromatique, et comprenant éventuellement au moins un hétéroatome de soufre, d'oxygène ou d'azote.
14. Kit selon la revendication 13 comprenant en outre une colonne de chromatographie.
15. Kit pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 8, ce kit comprenant :
une collection de chromatogrammes selon la revendication 7,
une colonne de chromatographie identique à celle utilisée pour la constitution de la collection de chromatogramme,
- un mélange de sondes R2 identique à celui utilisé pour obtenir la collection de chromatogramme.
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