EP2961842A2 - Method for the targeted killing of cells by nucleotide molecules directed for mrna binding, and also nucleotide molecules and application kit for such a use - Google Patents
Method for the targeted killing of cells by nucleotide molecules directed for mrna binding, and also nucleotide molecules and application kit for such a useInfo
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- EP2961842A2 EP2961842A2 EP14711693.3A EP14711693A EP2961842A2 EP 2961842 A2 EP2961842 A2 EP 2961842A2 EP 14711693 A EP14711693 A EP 14711693A EP 2961842 A2 EP2961842 A2 EP 2961842A2
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Definitions
- RNA-induced silencing complex RNA-induced silencing complex
- the invention is based on the object even in the case of genome mutations to kill cells in a wide range of applications, effectively, reliably and as effectively as possible in the organism, without the aforementioned disadvantages and side effects per se known chemical, physical, biochemical, but especially molecular biology, methods occur.
- the selected regions of a nucleotide sequence which are statistically rarely or very rarely mutagenic, even in the case of mutation in other regions of the genome, can be identified according to the invention by means of sequence analyzes.
- sequence analyzes for example, in suitable cell lines suitable for the problem, possible (previously identified) target regions of siRNA target sequences can be sequenced at a given point in time (time t 0 ). The cell lines can then be subjected to selection pressure and cultured (for example by the addition of chemotherapeutic agents). For comparison, the same cell line is cultivated without selection pressure as a control. Both cell lines are analyzed for genome stability after a given time by means of sequence analyzes.
- Stable regions are those regions of the MCF-7 cells which, without selection pressure, have no mutation (s) after 40 or more cell generations, whereas corresponding cells cultivated under selection pressure show no mutation after 30 or more cell generations ( en).
- siRNA sequences for the target genes PLK, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP and AGAP are to be disclosed for this purpose.
- Using specially-designed siRNA sequences for these genes see nucleotide sequences of the nucleotide molecules listed in the subclaims), it has been found that switching off expression leads to toxic effects without cells being resistant to the same siRNA sequence even after prolonged use treatment with the corresponding siRNAs.
- a nucleotide molecule which is characterized in that it contains, for the purpose of inhibiting expression of PDCD, the nucleotide sequence (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C completely or partially.
- a nucleotide molecule which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of AGAP, the nucleotide sequence (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACCACACAAU UCC CAC U or (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G wholly or partly included.
- nucleotide molecule characterized in that it contains, in whole or in part, the nucleotide sequence (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C for the purpose of inhibiting the expression of RFWD;
- nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of Inhibition of expression of RCHY contains the nucleotide sequence (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C completely or partially.
- ampoule A which contains the biologically active molecule and may further contain:
- Fig. 1 exemplifies the survival rate of breast cancer cells transfected with conventionally-designed siRNA sequences (without application of the invention). It is striking that in these cells, the survival rate is hardly changed, although the siRNAs are each homologous to the specific mRNA of the disclosed genes. After a three-fold administration of siRNA, the nucleotide molecules no longer have any influence on the survival rate of the cells.
- siRNAs shown here act on the same mRNAs as in the known ones
Abstract
The object was to kill cells, even in the case of genome mutations, in a broad field of application, efficiently, reliably and as effectively as possible in the organism, without the occurrence of disadvantages and side effects of chemical, physical, biochemical, but in particular molecular-biological, methods that are known per se. According to the invention, for the targeted killing of cells, nucleotide molecules are used which bind by a nucleotide sequence to a single region of the mRNA, which, on the basis of sequencing analyses, is subjected very rarely to a mutation, and therefore, even in the case of increased mutation rates in the entire genome, reliably kill the cell without a required further mRNA binding or other cell activity.
Description
Beschreibung der Erfindung Description of the invention
Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur m NA-Anbindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle sowie Nukleotid-Moleküle und Applikationskit für solche Verwendung Method for targeted killing of cells by nucleotide molecules aligned with the m NA binding and nucleotide molecules and application kit for such use
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA- Anbindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle sowie beispielhafte Nukleotid-Moleküle und einen Applikationskit für eine solche Verwendung. The invention relates to a method for the targeted killing of cells by mRNA binding aligned nucleotide molecules and exemplary nucleotide molecules and an application kit for such use.
Verfahren, mit denen biologische Zellen gezielt abgetötet werden sollen, benutzen klassischer Weise physikalische Mittel, wie UV-Strahlung, Hitze, u. a., (Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct;l(4):383-9.; Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec;75(3):475-87.) oder chemische Substanzen, beispielsweise Säuren, Laugen, Formaldehyde, (National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan;(l 0-598 l):i-512.) welche die Struktur der Zelle an sich zerstören. Diese Mittel sind häufig umweltschädlich und kaum im Organismus anwendbar. Um in einem Organismus Zellen abzutöten, werden biochemische Mittel (Proteininhibitoren, Antagonisten, Zytostatika, u. a.) verwendet (Tanaka S, Arii S. Current Status of molecularly targeted therapy for hepatocellular Carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun;15(3):235-41. Epub 2010 May 27.), welche Zellen massiv in ihrer Physiologie beeinflussen und so ebenfalls zu einem Absterben der Zelle führen können. Allerdings können durch keines dieser Verfahren spezifische Zellarten im Organismus gezielt abgetötet werden, da diese Substanzen auf alle Zellen gleichermaßen wirken. Methods to selectively kill biological cells traditionally use physical means such as UV radiation, heat, and the like. (Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG) The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 4): 383-9, Gillespie EH, Gibbons SA, Autoclaves and their dangers and safety in laboratories, J Hyg (Lond), 1975 Dec; 75 (3): 475-87.) Or chemical substances, for example, acids, alkalis , Formaldehyde, (National Toxicology Program, Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde, Rep. Carcinog Backgr Doc., 2010 Jan; (l 0-598 l): i-512.) Which destroy the structure of the cell itself. These agents are often harmful to the environment and hardly applicable in the organism. In order to kill cells in an organism, biochemical means (protein inhibitors, antagonists, cytostatics, etc.) are used (Tanaka S, Arii S. Current Status of Molecularly-Directed Therapy for Hepatocellular Carcinoma: Basic Science., Int J Clin Oncol., 2010 Jun; 3): 235-41, Epub 2010 May 27.), which influence cells massively in their physiology and thus also lead to a dying of the cell. However, none of these methods can specifically kill specific cell types in the organism, since these substances act equally on all cells.
Ein molekularbiologischer Ansatz, Zellen gezielt zu beeinflussen ist der Einsatz kurzer, doppelsträngiger RNA. Diese so genannten siRNA (short interfering RNA) Moleküle können klassischer Weise nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens interagieren und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung„RISC" (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an
die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt. A molecular biology approach to specifically target cells is the use of short, double-stranded RNA. Classically, these so-called siRNA (short interfering RNA) molecules interact with the mRNA of the target gene after activation and together with specific endoribonucleases form an RNA-protein complex called "RISC" (RNA-induced silencing complex) .The RISC complex binds the target mRNA, where endonucleases cut the target mRNA. In this way, gene expression is prevented and thus the emergence of target proteins is inhibited.
Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19-23bp), doppelsträngi- gen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494-8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921-7; US 5,898,031 A; US 7,056,704 B2). The inhibition of gene expression by introducing short (19-23 bp) double-stranded RNA molecules (siRNA) into eukaryotic cells which is specific for a sequence section of the mRNA of a target gene has already been described (Elbashir SM et al .: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411 (6836), 494-8; Liu Y et al .: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acid, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43 (7), 1921-7, US 5,898,031 A, US 7,056,704 B2).
Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie beschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing). With the help of such molecules, the reading of a gene and the production of an mRNA is not prevented, but it is initiated by the siRNA, a cell-specific mechanism that degrades the target mRNA. Finally, as described, the formation of a specific protein is suppressed without affecting the expression of other genes (post-transcriptional gene silencing).
Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.:„Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006) oder durch Bindung kurzer Peptide, welche zellspezifisch abgespalten werden, eine definierte Zellspezifität zu erreichen (WO 2008/098569 A2). Durch den Einsatz dieser modifizierten siRNA Moleküle kann erreicht werden, dass selektiv in bestimmten Zellen die Expression von Genen reduziert bzw. unterbunden wird. Also, methods have been developed to transfect cells of a target tissue with siRNA in vivo (Ikeda et al.: "Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol 23, No. 8, August 2006) or by binding short Peptides, which are cleaved cell-specific, to achieve a defined cell specificity (WO 2008/098569 A2). By using these modified siRNA molecules can be achieved that selectively in certain cells, the expression of genes is reduced or prevented.
Ist die verwendete siRNA Sequenz spezifisch für überlebenswichtige Gene der Zelle, kann dadurch das Absterben der Zelle bewirkt werden (z. B. WO 2012/098234 AI). Dieser Prozess kann durch die genannten Mechanismen ggf. auch zellspezifisch angewandt werden. If the siRNA sequence used is specific for survival-important genes of the cell, this can cause the death of the cell (eg WO 2012/098234 A1). If necessary, this process can also be applied cell-specifically by the mechanisms mentioned.
Fig. 1 zeigt zur Belegung des bekannten Standes der Technik eine Übersichtsdarstellung der Überlebensrate von Brustkrebszellen (MCF7) nach dreifacher Transfektion von siRNA-Molekülen, designed nach den etablierten und standardisierten Blast-Methoden. Es ist unschwer zu erkennen, dass sich die Verwendung von siRNA Molakülen, designed nach herkömmlichen Blast-Methoden nicht zur zielgerichteten Abtötung der Zellen eignet, da die Zellen Wege finden, die Herunterregulierung eines einzelnen Genes zu kompensieren; ggf. können Mutationen im Bindungsbereich der siRNA auftreten, wodurch die siRNA unwirksam wird (Escape-Mutation). Figure 1 shows a prior art overview of the survival rate of breast cancer cells (MCF7) after threefold transfection of siRNA molecules designed according to the established and standardized blast methods. It is not difficult to see that the use of siRNA molecules designed according to conventional blast methods is not suitable for the targeted killing of cells, as the cells find ways to compensate for the downregulation of a single gene; if necessary, mutations may occur in the binding region of the siRNA, whereby the siRNA is ineffective (escape mutation).
Nachteilig ist allerdings, dass das Abschalten eines einzigen Genes bzw. weniger Gene nicht zwangsläufig zum Absterben dieser Zelle führt (genannte Kompensation oder Escape-Mutation); daher werden häufig mehrere, für die Zellen essenzielle Gene gleichzeitig abgeschaltet, um den gewünschten Effekt zu erreichen.
Im Stand der Technik sind beispielsweise siRNAs beschrieben, die das Wachstum von Polio-like- inase (PLK)-Überexpression assoziierten Tumorzellen hemmen (DE 100 11 530 AI). Auch sind siRNAs beschrieben, die in der Lage sind, die Expression des humanen Gens PLK-1 zu inhibieren (WO 2006/035 515 AI, WO 2009/044 793 AI). The disadvantage, however, is that switching off a single gene or fewer genes does not necessarily lead to the death of this cell (called compensation or escape mutation); therefore, several genes that are essential to the cells are often turned off at the same time to achieve the desired effect. The prior art describes, for example, siRNAs which inhibit the growth of polio-like-inase (PLK) over-expression of associated tumor cells (DE 100 11 530 A1). Also described are siRNAs which are able to inhibit the expression of the human gene PLK-1 (WO 2006/035 515 Al, WO 2009/044 793 Al).
Bei der Verwendung von Nukleotid-Molekülen, welche gleichzeitig mehrere Gene abschalten, werden bei der Verwendung in vivo allerdings oft unspezifische Effekte ausgelöst, vor allem, wenn diese Nukleotid-Moleküle zellspezifisch in einer bestimmten Zellart wirksam sein sollen. Im Alltag hat sich gezeigt, dass es unter Verwendung von Nukleotid-Molekülen zur Abschaltung von mehreren für die Zelle essenziellen Genen zu starken Nebenwirkungen kommt. When using nucleotide molecules which simultaneously shut down several genes, however, unspecific effects are often triggered when used in vivo, especially if these nucleotide molecules are to be cell-specific in a specific cell type. In everyday life, it has been shown that the use of nucleotide molecules to shut down several essential for the cell genes to strong side effects.
Darüber hinaus besteht das Problem, dass in dem Genom vom Tumor- oder Virusinfizierten Zellen häufig Mutationen auftreten. Dies ist besonders deshalb relevant, weil bei der Verwendung von nur einer siRNA-Sequenz, spezifisch für ein Zielgen, die siRNA- Moleküle durch eine Mutation an der für die siRNA-relevanten Stelle unwirksam werden können und somit die beabsichtigte Zellbeeinflussung versagt oder zumindest nicht effektiv eingesetzt werden kann. Dieses Problem wird dadurch verstärkt, dass unter Benutzung von Nukleotid-Molekülen, welche das Absterben von Zellen verursachen, ein Selektionsdruck ausgeübt wird. In addition, there is the problem that mutations often occur in the genome of tumor or virus-infected cells. This is particularly relevant because when only one siRNA sequence is used, specifically for a target gene, the siRNA molecules can become ineffective by a mutation at the siRNA-relevant site, thus failing, or at least not effectively, the intended cell manipulation can be used. This problem is exacerbated by the selection pressure applied using nucleotide molecules that cause the death of cells.
Um dennoch den Zelltod zuverlässig herbeizuführen bleibt nur, auf vorgenannte Abschaltung gleich mehrerer Gene mit den besagten Nebenwirkungen oder auf andere toxische Maßnahmen mit ebenfalls in der Praxis bekannten Nachteilen und Nebenwirkungen der Zellbehandlung zurückzugreifen. Nevertheless, in order to reliably induce cell death, it is only necessary to resort to the abovementioned shutdown of several genes with the said side effects or to other toxic measures with disadvantages and side effects of cell treatment which are likewise known in practice.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, selbst für den Fall von Genom-Mutationen Zellen in einem breiten Anwendungsgebiet, wirksam, zuverlässig und möglichst effektiv im Organismus abzutöten, ohne dass die vorgenannten Nachteile und Nebenwirkungen an sich bekannter chemischer, physikalischer, biochemischer, insbesondere aber molekularbiologischer, Methoden auftreten. The invention is based on the object even in the case of genome mutations to kill cells in a wide range of applications, effectively, reliably and as effectively as possible in the organism, without the aforementioned disadvantages and side effects per se known chemical, physical, biochemical, but especially molecular biology, methods occur.
Überraschend wurde gefunden, dass mit Nukleotid-Molekülen, welche zur Beeinflussung lediglich eines einzigen Zielgens einer Zelle dienen und nur eine Homologie zur mRNA des Zielgens aufweisen, in einem ausgewählten Bereich, der - wie sich anhand von Sequenzierungsanalysen ebenfalls überraschend gezeigt hat - statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt, selbst im Fall von Mutation in anderen Bereichen des Genoms, die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA-Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig
abgetötet werden kann. Surprisingly, it has been found that with nucleotide molecules which serve to influence only a single target gene of a cell and have only a homology to the mRNA of the target gene, in a selected region, which - as has also surprisingly been found by sequencing analyzes - statistically very rare a mutation, even in the case of mutation in other regions of the genome, is reliably subject to the cell without the need for further mRNA binding or other cell action can be killed.
Die ausgewählten Bereiche einer Nukleotidsequenz, die statistisch selten oder sehr selten einer Mutation unterliegen, selbst im Fall von Mutation in anderen Bereichen des Genoms, können erfindungsgemäß mittels Sequenzanalysen identifiziert werden. Dazu können beispielsweise in entsprechenden, für die Fragestellung geeigneten Zelllinien, mögliche (vorab identifizierte) Zielregionen von siRNA-Zielsequenzen zu einem gegebenen Zeitpunkt (Zeitpunkt t0) sequenziert werden. Die Zelllinien können dann einem Selektionsdruck ausgesetzt und kultiviert werden (beispielsweise durch die Zugabe von Chemotherapeutika). Zum Vergleich wird dieselbe Zelllinie ohne Selektionsdruck als Kontrolle kultiviert. Beide Zelllinien werden nach einer gegebenen Zeit mittels Sequenzanalysen hinsichtlich der Genomstabilität analysiert. Nukleotidsequenzregionen, die sich in der Zelllinie, die unter Selektionsdruck steht, gegenüber der Situation zum Zeitpunkt t0 nicht oder nur wenig ändern, werden als genetisch stabil bezeichnet und sind selten Mutationsereignissen unterlegen. Diese Regionen, Bereiche oder Abschnitte werden als die Bereiche der Nukleotidsequenz identifiziert, die statistisch selten oder sehr selten einer Mutation unterliegen, selbst im Fall von Mutation in anderen Bereichen des Genoms. Beispielsweise können MCF-7 Zellen mit und ohne subtoxischen Konzentrationen Gemcitabine für 4 Wochen kultiviert und regelmäßig passagiert werden. Am Ende der Zellkultur werden erneut die anvisierten Zielregionen möglicher siRNA-Sequenzen sequenziert und mit der Ausgangssituation (Zeitpunkt 0) verglichen. Dabei können Regionen detektiert werden, die häufiger von Mutationen betroffen sind als andere Regionen. Genetisch stabilere Regionen (=Regionen mit seltenen Mutationsereignissen) sind für die Auswahl der siRNA-Zielregionen zu bevorzugen. Als Mutation oder Mutationsereignis werden konkret Deletionen, Insertionen, DNA-Brüche, sowie weitere Modifikationen an der DNA oder der Struktur der DNA, beispielsweise Methylierungen verstanden. Auch die Fusion von Chromosomen oder der Chromosomenbruch fallt unter diese Definition, genau so wie der Verlust ganzer Chromosomen. Als stabile Regionen werden solche Regionen der MCF-7 Zellen gewertet, die ohne Selektionsdruck nach 40 oder mehr Zell-Generationen keine Mutation(en) aufweisen, während entsprechende Zellen, die unter Selektionsdruck kultiviert wurden, nach 30 oder mehr Zell-Generationen keine Mutation(en) aufweisen. The selected regions of a nucleotide sequence which are statistically rarely or very rarely mutagenic, even in the case of mutation in other regions of the genome, can be identified according to the invention by means of sequence analyzes. For this purpose, for example, in suitable cell lines suitable for the problem, possible (previously identified) target regions of siRNA target sequences can be sequenced at a given point in time (time t 0 ). The cell lines can then be subjected to selection pressure and cultured (for example by the addition of chemotherapeutic agents). For comparison, the same cell line is cultivated without selection pressure as a control. Both cell lines are analyzed for genome stability after a given time by means of sequence analyzes. Nucleotide sequence regions that do not or only slightly change in the cell line that is under selection pressure compared with the situation at time t 0 are said to be genetically stable and are rarely inferior to mutational events. These regions, regions or sections are identified as the regions of the nucleotide sequence that are statistically seldom or very rarely mutagenic, even in the case of mutation in other regions of the genome. For example, MCF-7 cells can be cultured with and without subtoxic concentrations of gemcitabine for 4 weeks and passaged regularly. At the end of the cell culture, the targeted target regions of possible siRNA sequences are again sequenced and compared with the starting situation (time 0). Regions can be detected that are more frequently affected by mutations than other regions. Genetically more stable regions (= regions with rare mutational events) are to be preferred for the selection of the siRNA target regions. Specifically, deletions, insertions, DNA breaks, as well as further modifications to the DNA or the structure of the DNA, for example methylations, are understood as mutation or mutation event. Also, the fusion of chromosomes or the chromosomal break falls under this definition, as well as the loss of whole chromosomes. Stable regions are those regions of the MCF-7 cells which, without selection pressure, have no mutation (s) after 40 or more cell generations, whereas corresponding cells cultivated under selection pressure show no mutation after 30 or more cell generations ( en).
Somit werden im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung Regionen als „stabil" bezeichnet (oder als Bereiche, die anhand von Sequenzanalysen statistisch selten oder sehr selten einer Mutation unterliegen), die ohne Selektionsdruck nach 40 oder mehr Zell- Generationen keine Mutation(en) aufweisen, während entsprechende Zellen, die unter Selektionsdruck kultiviert werden, nach 30 oder mehr Zell-Generationen keine Mutation(en) aufweisen. Diese stabilen Bereiche eignen sich erfindungsgemäß als Ziel der
erfindungsgemäßen Nukleotid-Moleküle. Hingegen gelten Bereiche als nicht stabil (oder als Bereiche, die anhand von Sequenzanalysen statistisch häufiger einer Mutation unterliegen), wenn sie ohne Selektionsdruck nach weniger als 40 Zell-Generationen eine oder mehrere Mutation(en) aufweisen, während entsprechende Zellen, die unter Selektionsdruck kultiviert werden, nach weniger als 30 Zell-Generationen eine oder mehrere Mutation(en) aufweisen. Thus, in the context of the present invention, regions are referred to as "stable" (or as regions statistically rare or very rarely mutationally susceptible to sequence analysis) that have no mutation (s) without selection pressure after 40 or more cell generations corresponding cells, which are cultivated under selection pressure, have no mutation (s) after 30 or more cell generations.These stable regions are suitable according to the invention as the aim of nucleotide molecules according to the invention. By contrast, areas that are statistically more likely to undergo mutation by sequence analysis are considered to be unstable if they have one or more mutations without selection pressure after less than 40 cell generations, while corresponding cells that cultured under selection pressure will have one or more mutations after less than 30 cell generations.
Dabei kann das Genom der Zelle in anderen Bereichen als für die Bindung der Nukleotidsequenz ausgewählt sogar stark mutieren oder mutiert sein und dadurch die Raumstruktur der mRNA stark verändert sein, dennoch wird auch in diesen Fällen allein durch die erfindungsgemäße Maßnahme (und ohne alternative oder zusätzliche Zellbehandlung) der sichere Zelltod herbeigeführt. In this case, the genome of the cell selected in other areas than for the binding of the nucleotide sequence even mutate strongly or mutated and thereby the spatial structure of the mRNA can be greatly changed, yet in these cases alone by the inventive measure (and without alternative or additional cell treatment ) caused the safe cell death.
Infolge der vorgeschlagenen Zellabtötung unter zielgerichteter Expressionshemmung nur eines Zielgens sind eventuelle Nebenwirkungen dieser Expression auf ein Minimum reduziert; dennoch wird die Zelle zuverlässig abgetötet. As a result of the proposed cell killing with targeted inhibition of expression of only one target gene, any side effects of this expression are minimized; nevertheless, the cell is reliably killed.
Unter anderem sollen hierfür ausgewählte siRNA- Sequenzen für die Zielgene PLK, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP und AGAP offenbart werden. Unter Benutzung von speziell-designten siRNA- Sequenzen für diese Gene (vgl. in den Unteransprüchen aufgeführte Nukleotidsequenzen der Nukleotid-Moleküle) hat sich gezeigt, dass das Abschalten der Expression zu toxischen Effekten führt ohne dass Zellen auch bei längerer Verwendung derselben siRNA Sequenz resistent gegenüber der Behandlung mit den entsprechenden siRNAs wurden. Among other things, selected siRNA sequences for the target genes PLK, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP and AGAP are to be disclosed for this purpose. Using specially-designed siRNA sequences for these genes (see nucleotide sequences of the nucleotide molecules listed in the subclaims), it has been found that switching off expression leads to toxic effects without cells being resistant to the same siRNA sequence even after prolonged use treatment with the corresponding siRNAs.
Dies ist besonders deshalb von Nutzen, weil beispielsweise bei der Beeinflussung von Tumorzellen mittels siRNA Mutationen auftreten können, wodurch eine bestimmte siRNA unwirksam wird und dadurch diese Zellen einen Wachstumsvorteil haben und verstärkt Zellteilung auftritt. Dies wurde unter Benutzung bestimmter Sequenzen für die genannten Gene überraschender Weise nicht beobachtet. This is particularly useful because, for example, in the influencing of tumor cells by siRNA mutations may occur, whereby a particular siRNA is ineffective and thus these cells have a growth advantage and increased cell division occurs. Surprisingly, this was not observed using certain sequences for the genes mentioned.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird also durch ein Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA-Bindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleotid-Moleküle mit einer Nukleotidsequenz an einen einzigen ausgewählten Bereich der mRNA anbinden, der anhand von Sequenzierungsanalysen statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt, und damit auch im Fall erhöhter Mutationsraten im Gesamt-Genom die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA-Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig abtöten.
Außerdem werden erfindungsgemäß Nukleotid-Moleküle bereitgestellt, die aus mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA oder vollständig oder teilweise chemisch modifizierten Nukleotiden bestehen, insbesondere einer Größe von 10-300 bp oder im Fall von Einzelsträngen von 10-300 Basen, für die Anbindung an eine mRNA zur gezielten Abtötung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu einem ausgewählten Bereich der mRNA komplementär ausgebildet ist, welcher anhand von Sequenzierungsanalysen sehr selten einer Mutation unterliegt. The object of the present invention is therefore achieved by a method for the targeted killing of cells by mRNA binding-aligned nucleotide molecules, which is characterized in that the nucleotide molecules bind with a nucleotide sequence to a single selected region of the mRNA, which reference statistically very rarely undergoes a mutation of sequencing analyzes, and thus even in the case of increased mutation rates in the entire genome reliably killing the cell without further mRNA binding or other cell impact. In addition, nucleotide molecules are provided according to the invention, which consist of mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA or fully or partially chemically modified nucleotides, in particular a size of 10-300 bp or in the case of single strands of 10-300 bases the connection to a mRNA for the targeted killing of cells, characterized in that the nucleotide molecules have a nucleotide sequence which is complementary to a selected region of the mRNA, which is very rarely subject to a mutation on the basis of sequencing analyzes.
Es sind nicht nur Nukleotid-Moleküle umfasst, die eine Größe von 10-300 bp oder im Fall von Einzelsträngen von 10-300 Basen haben. Insbesondere sind auch solche Nukleotid- Moleküle umfasst, die eine Länge von mehr als 18, von mehr als 10 oder von mehr als 20, oder bevorzugt von mehr als 21 Basen haben. Bevorzugt sind solche Nukleotid-Moleküle, die eine Länge von mehr als 25 Basen haben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Nukleotid-Moleküle im Sinne der Erfindung eine Länge von mehr als 30, 40, 50 oder mehr Basen. Erfindungsgemäß werden auch Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von Zellen bereitgestellt, die eine Länge im Bereich von 21 bis 10.000 Basen haben. Besonders bevorzugt sind Längen der erfindungsgemäßen Nukleotid- Moleküle oder Nukleinsäuremoleküle, die im Bereich von 18, 19, 20, 21, 22 23, 25 30, 40 oder 50 bis 100 liegen oder die im Bereich von 18, 19, 20, 21, 22 23, 25 30, 40 oder 50 bis 200 liegen oder die im Bereich von 18, 19, 20, 21, 22 23, 25 30, 40 oder 50 bis 300 Basen liegen, insbesondere im Bereich von 23 bis 100 Basen. Diese Längen findet man typischerweise bei Nukleotid-Molekülen aus der Gruppe der miRNAs, sind aber nicht auf diese beschränkt. Not only are nucleotide molecules ranging in size from 10-300 bp or in the case of single strands from 10-300 bases. In particular, those nucleotide molecules are also included which have a length of more than 18, more than 10 or more than 20, or preferably more than 21 bases. Preference is given to those nucleotide molecules which have a length of more than 25 bases. In a further preferred embodiment, the nucleotide molecules according to the invention have a length of more than 30, 40, 50 or more bases. According to the invention, nucleotide molecules are also provided for the targeted killing of cells which have a length in the range from 21 to 10,000 bases. Particular preference is given to lengths of the nucleotide molecules or nucleic acid molecules according to the invention which are in the range of 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 40 or 50 to 100 or in the range of 18, 19, 20, 21, 22 23, 25 are 30, 40 or 50 to 200 or in the range of 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 40 or 50 to 300 bases, in particular in the range of 23 to 100 bases. These lengths are typically found in, but not limited to, nucleotide molecules from the group of miRNAs.
Wie bereits oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße Nukeotid- Moleküle bereit, bestehend aus mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA oder vollständig oder teilweise chemisch modifizierten Nukleotiden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid-Moleküle mit einer Nukleotidsequenz an einen einzigen ausgewählten Bereich der mRNA anbinden, der anhand von Sequenzierungsanalysen statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt, und damit auch im Fall erhöhter Mutationsraten im Gesamt-Genom die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA-Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig abtöten, wobei besonders bevorzugt solche Nukleotid-Moleküle sind, die Nukleotid-Moleküle siRNA-Sequenzen enthalten, die für die Zielgene PLK, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP und AGAP spezifisch sind, um deren Expression zu hemmen. Diese besonders bevorzugten Nukleotid-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind im Folgenden näher beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von Polo-like Kinase (PLK) die Nukleotidsequenz (5-3) UCA UAU UCG ACU UUG GUU GCC vollständig oder teilweise enthalten. As already mentioned above, the present invention provides nukeotide molecules according to the invention consisting of mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA or fully or partially chemically modified nucleotides, which are characterized in that the nucleotide molecules have a nucleotide sequence connect a single selected region of the mRNA which is statistically very rarely subject to a mutation on the basis of sequencing analyzes, and thus reliably kill the cell without further mRNA binding or other cell action, even in the case of increased mutation rates in the entire genome, particularly preferably such nucleotide Molecules are nucleotide molecules containing siRNA sequences specific for the target genes PLK, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP and AGAP to inhibit their expression. These particularly preferred nucleotide molecules of the present invention are described in more detail below. In a preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided, which comprises, for the purpose of inhibiting expression of polo-like kinase (PLK), the nucleotide sequence (5-3) UCA UAU UCG ACU UUG GUU GCC completely or partially.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von CHMP die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAC UCC AUC AUG AUC U oder (5-3) UCC AUC AUG AUC UUC UGG A vollständig oder teilweise enthalten. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided, which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of CHMP, the nucleotide sequence (5-3) is UCA AAC UCC AUC AUG AUC U or (5-3) UCC AUC AUG AUC UUC UGG A contained in full or in part.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von PDCD die Nukleotidsequenz (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C vollständig oder teilweise enthalten. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided which is characterized in that it contains, for the purpose of inhibiting expression of PDCD, the nucleotide sequence (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C completely or partially.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von RFWD die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C vollständig oder teilweise enthalten. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided which is characterized in that it contains the nucleotide sequence (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C completely or partially for the purpose of inhibiting the expression of RFWD.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von ATAP die Nukleotidsequenz (5-3) UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC A oder (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U vollständig oder teilweise enthalten. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided, which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of ATAP, the nucleotide sequence (5-3) is UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC A or (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U contained in full or in part.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von AGAP die Nukleotidsequenz (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U oder (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G vollständig oder teilweise enthalten. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided, which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of AGAP, the nucleotide sequence (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACCACACAAU UCC CAC U or (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G wholly or partly included.
In einer weiteren bevorzugten Ausfülirungsforai wird ein Nukleotid-Molekül bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von RCHY die Nukleotidsequenz (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C vollständig oder teilweise enthalten.
Die bevorzugten Ausfuhrungsformen der Nukleotid-Moleküle, die für die Zielgene PL , CHMP, PDCD, RFWD, ATAP und AGAP aufgeführt sind, treffen in gleicher Weise für das oben offenbarte Verfahren der vorliegenden Erfindung zu. In a further preferred embodiment, a nucleotide molecule is provided, which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of RCHY, it completely or partially contains the nucleotide sequence (5-3) UAU UCU CCA AAC AUG GUG C. The preferred embodiments of the nucleotide molecules listed for the target genes PL, CHMP, PDCD, RFWD, ATAP and AGAP apply equally to the method of the present invention disclosed above.
In einer weiteren Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße Nukeotid-Moleküle bereit, wobei die Nukleotid-Moleküle dadurch gekennzeichnet sind, dass diese aus mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA oder vollständig oder teilweise chemisch modifizierten Nukleotiden bestehen, insbesondere einer Größe von 10-300 bp oder im Fall von Einzelsträngen von 10-300 Basen, für die Anbindung an eine mRNA zur gezielten Abtötung von Zellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid- Moleküle eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu einem ausgewählten Bereich der mRNA komplementär ausgebildet ist, welcher anhand von Sequenzierungsanalysen sehr selten einer Mutation unterliegt und damit auch im Fall erhöhter Mutationsraten im Gesamt-Genom die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig abtöten, wobei die Nukleotid-Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: In a further embodiment, the present invention provides Nukeotid molecules according to the invention, wherein the nucleotide molecules are characterized in that they consist of mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA or fully or partially chemically modified nucleotides, in particular a size 10-300 bp or, in the case of single strands of 10-300 bases, for attachment to a mRNA for targeted killing of cells, characterized in that the nucleotide molecules have a nucleotide sequence complementary to a selected region of the mRNA which is very rarely subject to a mutation on the basis of sequencing analyzes and thus reliably kill the cell even in the case of increased mutation rates in the entire genome without the need for further mRNA binding or other cell action, the nucleotide molecules being selected from the group consisting of:
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einera nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of
Expressionshemmung von Polo-like Kinase (PLK) die Nukleotidsequenz (5-3)Inhibition of expression of polo-like kinase (PLK) the nucleotide sequence (5-3)
UCA UAU UCG ACU UUG GUU GCC vollständig oder teilweise enthält; UCA UAU UCG ACU UUG GUU contains GCC in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einera nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of
Expressionshemmung von CHMP die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAC UCC AUCInhibition of expression of CHMP the nucleotide sequence (5-3) UCA AAC UCC AUC
AUG AUC U oder (5-3) UCC AUC AUG AUC UUC UGG A vollständig oder teilweise enthält; AUG AUC U or (5-3) UCC AUC AUG UC UGG A contains all or part of;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von PDCD die Nukleotidsequenz (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule characterized in that it contains, for the purpose of inhibiting expression of PDCD, the nucleotide sequence (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von RFWD die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule characterized in that it contains, in whole or in part, the nucleotide sequence (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C for the purpose of inhibiting the expression of RFWD;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von ATAP die Nukleotidsequenz (5-3) UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC A oder (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of ATAP, the nucleotide sequence (5-3) is UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUAACAC ACC CUU UGC CUC A or (5-3 ) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U contains in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von AGAP die Nukleotidsequenz (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U oder (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G vollständig oder teilweise enthält; und a nucleotide molecule which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of AGAP, the nucleotide sequence (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U or (5-3 ) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G contains all or part thereof; and
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer
Expressionshemmung von RCHY die Nukleotidsequenz (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C vollständig oder teilweise enthalten. a nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of Inhibition of expression of RCHY contains the nucleotide sequence (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C completely or partially.
Somit wird auch ein Verfahren der Erfindung bereitgestellt, zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA-Bindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleotid-Moleküle mit einer Nukleotidsequenz an einen einzigen ausgewählten Bereich der mRNA anbinden, der anhand von Sequenzierungsanalysen statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt, und damit auch im Fall erhöhter Mutationsraten im Gesamt-Genom die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA-Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig abtöten, wobei die Nukleotid- Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Thus, a method of the invention is also provided for targeted killing of cells by mRNA binding-targeted nucleotide molecules, characterized in that the nucleotide molecules having a nucleotide sequence bind to a single selected region of the mRNA, as described in U.S. Pat Sequencing analyzes statistically very rarely subject to a mutation, and thus even in the case of increased mutation rates in the entire genome reliably killing the cell without further mRNA binding or other cell impact, the nucleotide molecules are selected from the group consisting of:
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einera nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of
Expressionshemmung von Polo-like Kinase (PLK) die Nukleotidsequenz (5-3)Inhibition of expression of polo-like kinase (PLK) the nucleotide sequence (5-3)
UCA UAU UCG ACU UUG GUU GCC vollständig oder teilweise enthält; UCA UAU UCG ACU UUG GUU contains GCC in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einera nucleotide molecule characterized in that it is used for the purpose of
Expressionshemmung von CHMP die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAC UCC AUCInhibition of expression of CHMP the nucleotide sequence (5-3) UCA AAC UCC AUC
AUG AUC U oder (5-3) UCC AUC AUG AUC UUC UGG A vollständig oder teilweise enthält; AUG AUC U or (5-3) UCC AUC AUG UC UGG A contains all or part of;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von PDCD die Nukleotidsequenz (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule characterized in that it contains, for the purpose of inhibiting expression of PDCD, the nucleotide sequence (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von RFWD die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule characterized in that it contains, in whole or in part, the nucleotide sequence (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C for the purpose of inhibiting the expression of RFWD;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von ATAP die Nukleotidsequenz (5-3) UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC A oder (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U vollständig oder teilweise enthält; a nucleotide molecule which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of ATAP, the nucleotide sequence (5-3) is UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUAACAC ACC CUU UGC CUC A or (5-3 ) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U contains in whole or in part;
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von AGAP die Nukleotidsequenz (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U oder (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G vollständig oder teilweise enthält; und a nucleotide molecule which is characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of AGAP, the nucleotide sequence (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U or (5-3 ) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G contains all or part thereof; and
einem Nukleotid-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses zum Zweck einer Expressionshemmung von RCHY die Nukleotidsequenz (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C vollständig oder teilweise enthalten. a nucleotide molecule characterized in that it contains, for the purpose of inhibiting expression of RCHY, the nucleotide sequence (5-3) UAU UCU CCA AAC AUG GUG C in whole or in part.
In einer weiteren Ausführungsforai der oben genannten Nukleotid-Moleküle sowie der beschriebenen Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA-Bindung
ausgerichtete Nukleotid-Moleküle sind die Nukleotid-Moleküle dadurch gekennzeichnet, dass diese, insbesondere zu deren Einbringung in Zellen und/oder zum Erreichen einer Zellspezifität der Nukleotide, an Moleküle, wie Zell-penetrierende Peptide und/oder Enzymsubstrate, und/oder in Reagenzien, wie Polyethylenimine, Nanocontainer, Nanopartikel oder Lipide, und/oder an Rezeptor-Liganden-Komplexe kovalent oder nicht- kovalent gebunden sind. In another Ausführungsforai the above-mentioned nucleotide molecules and the method described for targeted killing of cells by mRNA binding aligned nucleotide molecules, the nucleotide molecules are characterized in that these, in particular for their introduction into cells and / or for achieving a cell specificity of the nucleotides, to molecules, such as cell-penetrating peptides and / or enzyme substrates, and / or in reagents, such as polyethyleneimines, nanocontainers, nanoparticles or lipids, and / or covalently or noncovalently bound to receptor-ligand complexes.
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung der beschriebenen Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von eukaryontischen Zellen, insbesondere tierischen Zellen, sowie von Virus-, Bakterien- oder Parasiten-infizierten Zellen vorgesehen, wobei diese, in einer bevorzugten Ausführungsform, optional dadurch gekennzeichnet sind, dass diese in Kombination mit Proteaseinhbitoren eingesetzt werden. According to the invention, the use of the described nucleotide molecules for the targeted killing of eukaryotic cells, in particular animal cells, as well as virus-, bacteria- or parasite-infected cells is provided, these being, in a preferred embodiment, optionally characterized in that they be used in combination with Proteaseinhbitoren.
Angewandt werden können diese Sequenzen in Form von siRNA, shRNA, miRNA oder weiteren RNA-Formen, sowie in Form von DNA, PNA oder weiterer Nukleotid-Analoga in der herkömmlichen oder chemisch modifizierten Form. These sequences can be applied in the form of siRNA, shRNA, miRNA or other RNA forms, as well as in the form of DNA, PNA or other nucleotide analogs in the conventional or chemically modified form.
Des Weiteren können die genannten Sequenzen in an sich bekannter Weise spezifisch über Delivery Mechanismen in Zielzellen gebracht oder in Form von ebenfalls bekannten Prodrug-Anwendungen gezielt in Zielzellen aktiviert werden; beide Mechanismen zur Induktion von Zellspezifität können auch kombiniert zur Anwendung kommen. Furthermore, the sequences mentioned can be brought in specific manner via delivery mechanisms in target cells or activated in the form of well-known prodrug applications targeted in target cells in a conventional manner; Both mechanisms for inducing cell specificity can also be used in combination.
Durch ein geeignetes Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimin oder Liposomen, können die Wirkstoffmoleküle in gleichfalls an sich bekannter Weise in die Zellen eingebracht werden. By means of a suitable transfection system, for example nanoparticles, polyethyleneimine or liposomes, the active substance molecules can be introduced into the cells in a manner known per se.
Die Molekülkonstrukte können zum besseren Transport in bzw. an die Zellen sowie zu ihrer Stabilisierung oder zu ihrer Detektion außerdem an weitere Stoffe (beispielsweise Nanopartikel als Trägersystem oder Fluorochrome) gebunden werden. The molecular constructs can also be bound to further substances (for example nanoparticles as a carrier system or fluorochromes) for better transport into or onto the cells and for their stabilization or for their detection.
Die interferierenden Nukleotid-Moleküle sind geeignet zur gezielten Abtötung eukaryon- tischer Zellen, insbesondere tierischer, pflanzlicher oder Pilzzellen, sowie virus-infizierter und prokaryontischer Zellen. The interfering nucleotide molecules are suitable for the targeted killing of eukaryotic cells, in particular animal, plant or fungal cells, as well as virus-infected and prokaryotic cells.
Vorteilhaft ist die Verwendung der beschriebenen Nukleotid-Moleküle gebunden an inhibierende Peptide, welche spezifisch in Zielzellen geschnitten und dadurch die siRNA aktiviert werden kann. Dadurch lassen sich toxische Effekte spezifisch in bestimmten Zellen erzeugen. Advantageously, the use of the described nucleotide molecules bound to inhibiting peptides, which can be cut specifically into target cells and thereby the siRNA can be activated. As a result, toxic effects can be generated specifically in specific cells.
Bei Verwendung der interferierenden Nukleotid-Moleküle können diese auch in
Kombination mit Proteaseinlibitoren eingesetzt werden. When using the interfering nucleotide molecules, these can also be found in Combination with protease inhibitors are used.
Vorteilhaft ist ein Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der interferierenden Nukleotid-Moleküle, bestehend zumindest aus Advantageous is an application kit for the application and administration of the interfering nucleotide molecules, consisting at least of
- wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molekül enthält, und weiter enthalten kann: at least one ampoule (ampoule A) which contains the biologically active molecule and may further contain:
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide, at least one further ampoule (ampule B) with a transfection system, for example nanoparticles, polyethyleneimines or lipids,
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung der Nukleotid-Moleküle und/oder zur Bindung an ein Transfektionssystem enthält, at least one further ampoule (ampoule C) which contains further constituents for binding the nucleotide molecules and / or for binding to a transfection system,
- Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B und C - Dilution and reaction buffer for the contents of ampoules A, B and C
- eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie - One or more probes or syringes with cannula and other materials required for injection of the mixture of the ampoule contents in the medium containing the target cells and
- eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung. - a prescription for use and administration.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments illustrated in the drawing.
Es zeigen: Show it:
Fig. 1 : Darstellung der Überlebensrate von Mammakarzinomzellen (MCF7) nach dreifacher Transfektion von siRNA (herkömmliches Sequenzdesign; ohne Anwendung der Erfindung) 1 shows the survival rate of breast carcinoma cells (MCF7) after triple transfection of siRNA (conventional sequence design, without application of the invention)
Fig. 2: Darstellung der Überlebensrate von Mammakarzinomzellen (MCF7) nach dreifacher Transfektion von siRNA nach erfindungsgemäßem Sequenzdesign FIG. 2: Representation of the survival rate of breast carcinoma cells (MCF7) after triple transfection of siRNA according to the sequence design according to the invention
In Fig. 1 ist beispielhaft die Überlebensrate von Brustkrebszellen dargestellt, die mit herkömmlich-designten siRNA- Sequenzen (ohne Anwendung der Erfindung) transfiziert wurden. Auffällig ist dabei, dass bei diesen Zellen die Überlebensrate kaum verändert ist, obwohl die siRNAs jeweils homolog der spezifischen mRNA der offenbarten Gene sind. Nach dreifacher Gabe von siRNA haben die Nukleotid-Moleküle keinen Einfluss mehr auf die Überlebensrate der Zellen. Fig. 1 exemplifies the survival rate of breast cancer cells transfected with conventionally-designed siRNA sequences (without application of the invention). It is striking that in these cells, the survival rate is hardly changed, although the siRNAs are each homologous to the specific mRNA of the disclosed genes. After a three-fold administration of siRNA, the nucleotide molecules no longer have any influence on the survival rate of the cells.
Im Vergleich dazu zeigt Fig. 2 die Überlebensrate von Brastkrebszellen, welche durch Einwirkung der erfindungsgemäßen Nukleotid-Moleküle erzielt wurden. Die Nukleotid- Moleküle bestehen dabei ebenfalls, wie im Ausführungsbeispiel zu Fig. 1 aus siRNA, wobei die Nukleotid-Moleküle jeweils eine Nukleotidsequenz aufweisen, die lediglich zu einem einzigen Bereich der mRNA der betreffenden Zelle komplementär ausgebildet ist, welcher vorschlagsgemäß nach dem Kriterium ausgewählt wurde, dass dieser Bereich -
nach Auswertung von Sequenzierungsanalysen - ungeachtet zu befürchtender Mutationen sonstiger Bereiche des Zellgenoms statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt. In comparison, Fig. 2 shows the survival rate of Brastkrebszellen, which were achieved by the action of the nucleotide molecules of the invention. The nucleotide molecules likewise consist of siRNA, as in the exemplary embodiment of FIG. 1, the nucleotide molecules each having a nucleotide sequence which is complementary only to a single region of the mRNA of the cell in question, which was selected according to the criterion that this area - after evaluation of sequencing analyzes - regardless of feared mutations of other areas of the cell genome is statistically very rarely subject to a mutation.
Aus Fig. 2 ist ersichtlich, dass alle auf siRNA beruhenden Nukleotid-Moleküle nach dreifacher Gabe sicher zu einem verminderten Überleben der Zellen führen. From Fig. 2 it can be seen that all based on siRNA nucleotide molecules safely lead after three doses to a reduced survival of the cells.
Einige hier dargestellte siRNAs wirken auf dieselben mRNAs wie im bekannten Some siRNAs shown here act on the same mRNAs as in the known ones
Ausführungsbeispiel nach Fig. 1, sind aber aufgrund der spezifischen Nukleotidsequenz der transfizierten Moleküle wesentlich zuverlässiger wirksam. Embodiment of FIG. 1, but are much more effective due to the specific nucleotide sequence of the transfected molecules.
In der Zeichnung bedeuten: In the drawing mean:
Transfektionskontrolle: Leertransfektion ohne siRNA Transfection control: empty transfection without siRNA
Ctrl-siRNA: ontrolltransfektion mit einer Kontroll-(nonsense) siRNA Ctrl siRNA: on-line transfection with a control (nonsense) siRNA
CHMP (l-3): siRNA gegen CHMP CHMP (l-3): siRNA against CHMP
PDCD (l-3: siRNA gegen PDCD PDCD (l-3: siRNA against PDCD
RFWD (l-3): siRNA gegen RFWD RFWD (l-3): siRNA against RFWD
ATAP (1-3): siRNA gegen ATAP ATAP (1-3): siRNA against ATAP
AGAP (l-3): siRNA gegen AGAP AGAP (l-3): siRNA against AGAP
PLK (l -3): siRNA gegen PLK PLK (l -3): siRNA against PLK
RCHY: siRNA gegen RCHY RCHY: siRNA against RCHY
Allstars siRNA Cocktail: Mischung mehrerer siR As für die Induktion von Toxizität. Allstars siRNA cocktail: mixture of several siRAs for the induction of toxicity.
Für den Nachweis wurden die zu behandelnden Zellen in 98-well Zellkulturplatten kultiviert und drei aufeinander folgende siRNA-Transfektionen durchgeführt. Im Anschluss wurde die Toxizität mittels XTT-Test bestimmt. For detection, the cells to be treated were cultured in 98-well cell culture plates and three consecutive siRNA transfections were performed. Subsequently, the toxicity was determined by XTT test.
Mit der Einbringung toxischer siRNAs in die Zellen soll Zelltod induziert werden. Die Kontroll-siRNA stellt die Negativkontrolle dar. Allstars ist ein Cocktail mit verschiedenen toxischen siRNA-Sequenzen und bildet die Positivkontrolle. With the introduction of toxic siRNAs in the cells cell death is to be induced. The control siRNA represents the negative control. Allstars is a cocktail with various toxic siRNA sequences and forms the positive control.
Bei Verwendung der einzelnen siRNA-Sequenzen konnte, wie in Fig. 2 gezeigt, jeweils effektiv (und vergleichbar mit dem Allstars siRNA Cocktail) Zelltod erreicht werden. Durch die Verwendung des Allstars siRNA-Cocktails wird das Auftreten von Escape- Mutationen verhindert. Bei den speziell hierfür verwendeten Sequenzen verhielten sich die Zellen analog zu der Positivkontrolle. Es konnte jeweils sicher und effektiv durch das Ausschalten von nur einem einzigen Gen Zelltod herbeigeführt werden. When using the individual siRNA sequences, as shown in FIG. 2, cell death could be effectively achieved (and comparable to the Allstars siRNA cocktail). The use of the Allstars siRNA cocktail prevents the occurrence of escape mutations. In the sequences used specifically for this, the cells behaved analogously to the positive control. It could be safely and effectively induced by switching off only a single gene cell death.
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen sowie andere Dokumente, die hier zitiert sind, sind hiermit vollständig durch Verweis aufgenommen.
All publications, patents and patent applications and other documents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Claims
1. Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA-Bindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid- Moleküle mit einer Nukleotidsequenz an einen einzigen ausgewählten Bereich der mRNA anbinden, der anhand von Sequenzierungsanalysen statistisch sehr selten einer Mutation unterliegt, und damit auch im Fall erhöhter Mutationsraten im Gesamt-Genom die Zelle ohne erforderliche weitere mRNA-Bindung oder sonstige Zelleinwirkung zuverlässig abtöten. 1. A method for the targeted killing of cells by mRNA binding aligned nucleotide molecules, characterized in that connect the nucleotide molecules with a nucleotide sequence to a single selected region of the mRNA, which statistically very rarely undergoes a mutation based on sequencing analyzes, and Thus, even in the case of increased mutation rates in the entire genome reliably killing the cell without further required mRNA binding or other cell impact.
2. Nukleotid-Moleküle, bestehend aus mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA oder vollständig oder teilweise chemisch modifizierten Nukleotiden, insbesondere einer Größe von 10-300 bp oder im Fall von Einzelsträngen von 10-300 Basen, für die Anbindung an eine mRNA zur gezielten Abtötung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu einem ausgewählten Bereich der mRNA komplementär ausgebildet ist, welcher anhand von Sequenzierungsanalysen sehr selten einer Mutation unterliegt. 2. nucleotide molecules consisting of mRNA, siRNA, miRNA, PNA, DNA, LNA or completely or partially chemically modified nucleotides, in particular a size of 10-300 bp or in the case of single strands of 10-300 bases, for the attachment to a mRNA for the targeted killing of cells, characterized in that the nucleotide molecules have a nucleotide sequence which is complementary to a selected region of the mRNA, which is very rarely subject to a mutation based on sequencing analyzes.
3. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von AGAP die Nukleotidsequenz (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U oder (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G vollständig oder teilweise enthalten. 3. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that, for the purpose of inhibiting the expression of AGAP, the nucleotide sequence (5-3) CAC AAU UCC CAC UUU GAG C, (5-3) GUU ACC CAC AAU UCC CAC U or (5-3) UUU CUU CUC UUU GUC UGG G wholly or partially included.
4. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von CHMP die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAC UCC AUC AUG AUC U oder (5-3) UCC AUC AUG AUC UUC UGG A vollständig oder teilweise enthalten. 4. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that for the purpose of inhibiting the expression of CHMP, the nucleotide sequence (5-3) UCA AAC UCC AUC AUG AUC U or (5-3) UCC AUC AUG AUC UUCG A complete or partially included.
5. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von PDCD die Nukleotidsequenz (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C vollständig oder teilweise enthalten. 5. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that they contain the nucleotide sequence (5-3) UUC AUA AAC ACA GUU CUC C completely or partially for the purpose of inhibiting the expression of PDCD.
6. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
diese zum Zweck einer Expressionshemmung von RFWD die Nukleotidsequenz (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C vollständig oder teilweise enthalten. 6. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that these contain, in whole or in part, the nucleotide sequence (5-3) UCA AAU UGA GGC ACU GUG C for inhibition of RFWD expression.
7. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von AT AP die Nukleotidsequenz (5-3) UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC A oder (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U vollständig oder teilweise enthalten. 7. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that for the purpose of inhibiting the expression of AT AP, the nucleotide sequence (5-3) UUU CUU CAG AGC AGG AGC A, (5-3) AUA CAC ACC CUU UGC CUC CUC or (5-3) AUU UCA GGC UCA UAU UCC U in full or in part.
8. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese zum Zweck einer Expressionshemmung von RCHY die Nukleotidsequenz (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C vollständig oder teilweise enthalten. 8. Nucleotide molecules according to claim 1 or 2, characterized in that they contain the nucleotide sequence (5-3) UAU UCU CCA AAC AAU GUG C completely or partially for the purpose of inhibiting the expression of RCHY.
9. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese, insbesondere zu deren Einbringung in Zellen und/oder zum Erreichen einer Zellspezifität der Nukleotide, an Moleküle, wie Zell- penetrierende Peptide und/oder Enzymsubstrate, und/oder in Reagenzien, wie Polyethylenimine, Nanocontainer, Nanopartikel oder Lipide, und/oder an Rezeptor-Liganden-Komplexe kovalent oder nicht-kovalent gebunden sind. 9. nucleotide molecules according to one or more of claims 2 to 8, characterized in that these, in particular for their introduction into cells and / or for achieving a cell specificity of the nucleotides, to molecules such as cell penetrating peptides and / or enzyme substrates, and / or covalently or non-covalently bound in reagents such as polyethyleneimines, nanocontainers, nanoparticles or lipids, and / or on receptor-ligand complexes.
10. Verwendung der Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 2 bis 8 zur gezielten Abtötung von eukaryontischen Zellen, insbesondere tierischen Zellen, sowie von Virus-, Bakterien- oder Parasiten-infizierten Zellen. 10. Use of the nucleotide molecules according to one or more of claims 2 to 8 for the targeted killing of eukaryotic cells, in particular animal cells, as well as virus, bacteria or parasite-infected cells.
11. Verwendung der Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Kombination mit Proteaseinhbitoren eingesetzt werden. 11. Use of the nucleotide molecules according to one or more of claims 2 to 8, characterized in that they are used in combination with Proteaseinhbitoren.
12. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der Nukleotid-Moleküle 12. Application kit for application and administration of the nucleotide molecules
gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 2 bis 9, bestehend zumindest aus according to one or more of claims 2 to 9, consisting at least of
wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das Nukleotid-Molekül enthält, und weiter enthalten kann: at least one ampoule (ampoule A) which contains the nucleotide molecule and may further contain:
mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide, at least one further ampoule (ampoule B) with a transfection system, for example cell-penetrating peptides, nanoparticles, polyethyleneimines or lipids,
mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung der Nukleotid-Moleküle und/oder zur Bindung an ein
Transfektionssystem enthält, at least one further ampoule (ampoule C) which further constituents for binding the nucleotide molecules and / or for binding to a Contains transfection system,
Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B, eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Dilution and reaction buffer for the contents of ampoules A, B, one or more probes or syringes with cannula and others needed
Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das dieMaterials for injecting the mixture from the contents of the ampoules into the
Zielzellen enthaltende Medium sowie Target cell containing medium and
eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.
a prescription for use and administration.
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