JPWO2006035515A1 - Pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, and use thereof - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, and use thereof Download PDF

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Abstract

ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを内包してなるリポソームは、膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物として有用である。特に、配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ及び配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。この膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に投与することにより、癌細胞の増殖を抑制し、又は癌への進行を抑制することができる。The liposome containing the siRNA that suppresses the expression of the human PLK-1 gene is useful as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer. In particular, siRNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and siRNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 are preferable. This pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer suppresses the proliferation of cancer cells by transurethral administration into the bladder of a human having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder. Alternatively, the progression to cancer can be suppressed.

Description

本発明は、膀胱表在性癌の治療、特に膀胱表在性癌の摘出後に残存する微小癌病変の治療や、膀胱組織の前癌病変の癌への進行の予防などに有効なｓｉＲＮＡ、このｓｉＲＮＡを用いた膀胱表在性癌の治療又は予用医薬組成物、及び、この医薬組成物を用いた膀胱表在性癌の治療又は予防方法に関する。  The present invention provides a siRNA effective for the treatment of superficial bladder cancer, in particular, the treatment of microcancer lesions remaining after removal of superficial bladder cancer, the prevention of progression of precancerous lesions of bladder tissue to cancer, and the like. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a therapeutic or prophylactic pharmaceutical composition for superficial bladder cancer using siRNA, and a method for treating or preventing superficial bladder cancer using the pharmaceutical composition.

膀胱癌の初診断時にはその７０％を膀胱表在性癌が占める。膀胱表在性癌は経尿道的に切除可能であるが、術後に癌細胞が僅かに残存する場合がある。また、周囲に前癌状態の細胞が存在する場合もある。このような細胞の増殖により膀胱癌が再発することを予防するために、現在の臨床では、結核菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）や抗癌剤のマイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）などの膀胱内注入療法がされており、この治療法は１９８０年代からほとんど改善されていない。
しかし、これらの薬剤は再発予防効果は認めるものの十分とは言いがたく約半数は再発し、その内２０％−３０％は浸潤癌となる。このような進行期膀胱癌では膀胱全摘手術を施行せざるをえず、術後に排尿および性機能に関しＱＯＬを著しく損なう。また、ＢＣＧは生細菌であるため、ＢＣＧの使用により膀胱炎や菌血症になる恐れがある。また、マイトマイシンＣやアドリアマイシン等の抗癌剤は、癌細胞に対する選択性が十分ではなく正常細胞にも傷害を与える恐れがある。Superficial bladder cancer accounts for 70% of the initial diagnosis of bladder cancer. Superficial bladder cancer can be resected transurethrally, but some cancer cells may remain after surgery. In addition, there are cases where pre-cancerous cells are present around the cell. In order to prevent the recurrence of bladder cancer due to the proliferation of such cells, the current clinical practice is to use Bacillus Calmette Guerin (BCG) which is a tuberculosis bacterium, mitomycin C (mitomycin C), an anticancer agent, and adriamycin (adriamycin). Intravesical infusion therapy has been used, and this treatment method has hardly improved since the 1980s.
However, although these drugs have a recurrence-preventing effect, they are not sufficient, but about half of them relapse, and 20% to 30% of them have invasive cancer. In such advanced-stage bladder cancer, it is unavoidable to perform total cystectomy, and postoperatively significantly impairs QOL regarding urination and sexual function. Since BCG is a live bacterium, use of BCG may cause cystitis or bacteremia. Further, anticancer agents such as mitomycin C and adriamycin have insufficient selectivity for cancer cells and may damage normal cells.

本発明は、癌細胞に対する選択性が高い表在性膀胱癌の治療又は予防剤、及び治療又は予防方法を提供することを課題とする。
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
（ｉ） 細胞の分裂及び増殖に重要な役割を担っているＰＬＫ−１（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ−１）は、癌細胞の中でも膀胱癌細胞において特に強く発現している。
（ｉｉ） ＰＬＫ−１の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを封入したリポソームを表在性膀胱癌モデルマウスに経尿道的に投与すると癌細胞に浸透し、癌細胞の増殖が効果的に抑制される。
（ｉｉｉ） 配列番号１及び２の塩基配列からなる各ｓｉＲＮＡを封入したリポソームは、膀胱癌細胞の増殖を特に効果的に抑制できる。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のｓｉＲＮＡ、表在性膀胱癌治療又は予防用医薬組成物、及び表在性膀胱癌の治療又は予防方法を提供する。
項１． 以下の（ａ）又は（ｂ）のｓｉＲＮＡ
（ａ） 配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｂ） 配列番号１において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
項２． 以下の（ｃ）又は（ｄ）のｓｉＲＮＡ
（ｃ） 配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｄ） 配列番号２において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
項３． 項１に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
項４． 項２に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
項５． 項３に記載のリポソームを含む医薬組成物。
項６． 項４に記載のリポソームを含む医薬組成物。
項７． 項３に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項８． 項４に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項９． ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項１０． ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである項９に記載の組成物。
項１１． リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである項９に記載の組成物。
項１２． 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、項３に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１３． 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、項４に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１４． 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１５． 膀胱表在性癌の治療又は予防剤の１回投与量が、ｓｉＲＮＡを１２μｇ〜１２０ｍｇ投与できる量である項１４に記載の治療又は予防方法。
項１６． 膀胱表在性癌の治療又は予防剤を１〜７日間間隔で５〜１０回投与する項１４に記載の治療又は予防方法。
項１７． 膀胱表在性癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトに対して行われるものである項１４に記載の治療又は予防方法。
項１８． 項３に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項１９． 項４に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項２０． ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項２１． ｓｉＲＮＡの濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである項２０に記載の使用。
項２２． リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである項２０に記載の使用。
本発明の治療又は予防方法によれば、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを封入したリポソームを尿道を経由して膀胱内に投与することにより、膀胱表在性癌細胞や膀胱の前癌組織に浸透し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制する。
ｓｉＲＮＡを始めとする各種治療剤を封入したリポソームの投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などの方法が試みられているが、膀胱内へのリポソームの投与により内包された治療剤を膀胱表在性の細胞に導入できるか否かは全く予測できないことである。
また、本発明によれば、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を特に効果的に抑制する配列番号１及び２の塩基配列からなる各ｓｉＲＮＡが提供された。設計したｓｉＲＮＡが実際に標的遺伝子の発現を抑制する確率は低く、このように効果的なｓｉＲＮＡを見出すことは一般に困難である。このような状況の下で、配列番号１及び２のｓｉＲＮＡはリポソームに封入して膀胱内に投与することにより実際に膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制した。
また、従来膀胱癌の治療に使用されている抗癌剤（マイトマイシンＣ、アドリアマイシン等）は活発に増殖する癌細胞に選択性を示すが、その作用機序はタンパク質合成や核酸合成の阻害であることから、ある程度正常細胞に対しても作用し、副作用を引き起こす。これに対して本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用組成物は、癌細胞、中でも膀胱癌細胞に特異的に強く発現しているＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とするため、癌細胞に対する選択性が極めて高い。
また、上記の公知の膀胱癌治療剤は、有効投与量と最大耐容量との差がせいぜい１０倍程度と小さく、使用可能な用量範囲が狭い。これに対して本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、副作用が認められない又は殆ど認められないため、有効投与量と最大耐容量との差が大きく、使用し易い。An object of the present invention is to provide a therapeutic or preventive agent for superficial bladder cancer having high selectivity for cancer cells, and a therapeutic or preventive method.
The present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and have obtained the following findings.
(I) PLK-1 (polo-like kinase-1), which plays an important role in cell division and proliferation, is particularly strongly expressed in bladder cancer cells among cancer cells.
(Ii) When a liposome encapsulating siRNA that specifically inhibits the expression of PLK-1 is transurethrally administered to a superficial bladder cancer model mouse, it penetrates into cancer cells and the growth of cancer cells is effectively suppressed. It
(Iii) The liposome encapsulating each siRNA consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 can suppress the proliferation of bladder cancer cells particularly effectively.
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following siRNA, a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, and a method for treating or preventing superficial bladder cancer.
Item 1. SiRNA of the following (a) or (b)
(A) siRNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
(B) A siRNA that contains a base sequence in which 1 to 3 bases are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 1 and that specifically suppresses expression of the human PLK-1 gene.
Item 2. SiRNA of the following (c) or (d)
(C) siRNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
(D) A siRNA which comprises a base sequence in which 1 to 3 bases are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 2 and which specifically suppresses the expression of the human PLK-1 gene.
Item 3. A liposome encapsulating the siRNA according to Item 1.
Item 4. A liposome encapsulating the siRNA according to Item 2.
Item 5. Item 4. A pharmaceutical composition comprising the liposome according to Item 3.
Item 6. Item 5. A pharmaceutical composition comprising the liposome according to Item 4.
Item 7. Item 4. A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises the liposome according to Item 3.
Item 8. Item 5. A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises the liposome according to Item 4.
Item 9. A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises a liposome encapsulating an siRNA that inhibits expression of human PLK-1.
Item 10. Item 10. The composition according to Item 9, wherein the siRNA concentration is 100 nM to 1 mM.
Item 11. Item 10. The composition according to Item 9, wherein 80% by weight or more of the liposomes have a particle size of 50 to 300 µm.
Item 12. A method for treating or preventing a superficial bladder cancer, which comprises transurethrally administering the liposome according to Item 3 into the bladder of a human having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder.
Item 13. A method for treating or preventing a superficial bladder cancer, which comprises transurethrally administering the liposome according to Item 4 into the bladder of a human having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder.
Item 14. Treatment of superficial bladder cancer in which a liposome encapsulating siRNA that inhibits expression of human PLK-1 is transurethrally administered into the bladder of a human having superficial bladder cancer or precancerous lesion of bladder or Prevention method.
Item 15. Item 15. The treatment or prevention method according to Item 14, wherein the single dose of the agent for treating or preventing superficial bladder cancer is an amount capable of administering 12 µg to 120 mg of siRNA.
Item 16. Item 15. The method for treatment or prevention according to Item 14, wherein the agent for treating or preventing superficial bladder cancer is administered 5 to 10 times at intervals of 1 to 7 days.
Item 17. Item 15. The method for treatment or prevention according to Item 14, which is performed on a human having a minimal residual cancer lesion after excision of superficial bladder cancer.
Item 18. Item 4. Use of the liposome according to Item 3 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer.
Item 19. Item 5. Use of the liposome according to Item 4 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer.
Item 20. Use of a liposome encapsulating siRNA that inhibits the expression of human PLK-1 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer.
Item 21. Item 21. The use according to Item 20, wherein the concentration of siRNA is 100 nM to 1 mM.
Item 22. Item 20. The use according to Item 20, wherein 80% by weight or more of the liposomes have a particle size of 50 to 300 µm.
According to the treatment or prevention method of the present invention, by administering a liposome encapsulating siRNA capable of suppressing the expression of PLK-1 gene into the bladder via the urethra, superficial bladder cancer cells and precancerous bladder. Penetrates tissues and effectively suppresses the growth of bladder cancer cells.
As a method for administering liposomes encapsulating various therapeutic agents such as siRNA, methods such as intravenous administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration have been tried, but the treatment encapsulated by administration of liposomes into the bladder Whether or not the drug can be introduced into superficial bladder cells is completely unpredictable.
Further, according to the present invention, each siRNA comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 that suppresses the expression of PLK-1 gene particularly effectively was provided. The probability that the designed siRNA actually suppresses the expression of the target gene is low, and it is generally difficult to find such an effective siRNA. Under these circumstances, the siRNAs of SEQ ID NOs: 1 and 2 are encapsulated in liposomes and administered into the bladder to actually suppress the expression of PLK-1 gene in bladder cancer cells and to cause proliferation of bladder cancer cells. Effectively suppressed.
In addition, anti-cancer agents (mitomycin C, adriamycin, etc.) conventionally used for the treatment of bladder cancer show selectivity for actively proliferating cancer cells, but its mechanism of action is inhibition of protein synthesis and nucleic acid synthesis. , It also acts on normal cells to some extent and causes side effects. On the other hand, the composition for treating or preventing superficial bladder cancer of the present invention contains siRNA as an active ingredient that suppresses the expression of PLK-1 gene strongly expressed specifically in cancer cells, especially in bladder cancer cells. Therefore, the selectivity for cancer cells is extremely high.
In addition, the above-mentioned known therapeutic agents for bladder cancer have a small difference between the effective dose and the maximum tolerated dose, which is about 10 times at most, and the usable dose range is narrow. On the other hand, the pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer of the present invention has no side effects or almost no side effects, and therefore has a large difference between the effective dose and the maximum tolerated dose, and is easy to use. ..

図１は、膀胱癌患者から摘除された癌組織におけるＰＬＫ−１発現量を示す免疫組織染色図である。
図２は、膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を示すウェスタンブロッティングの結果である。
図３は、（Ａ）は、癌細胞株において本発明のｓｉＲＮＡがＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロティングの結果である。（Ｂ）は、本発明のｓｉＲＮＡが経時的にＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロッティングの結果である。（Ｃ）は、本発明のｓｉＲＮＡが用量依存的にＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロッティングの結果である。
図４は、本発明のｓｉＲＮＡが膀胱癌細胞において紡錐体形成を抑制することを示す図である。
図５は、（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームの接触により膀胱癌細胞のアポトーシスが誘導されることを示す図である。（Ｃ）は、１００ｎＭの本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームの接触により膀胱癌細胞の生存数が減少することを示す図である。
図６は、（Ａ）は膀胱癌細胞株がマウスの膀胱に生着し、増殖することを示す図である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、マウスの膀胱内に経尿道的に本発明のｓｉＲＮＡを投与した場合に癌細胞に浸透することを示す図である。（Ｄ）は、に本発明のｓｉＲＮＡを経尿道的に膀胱内投与した膀胱癌細胞移植マウスにおいて、膀胱癌細胞の増殖が抑制されることを示す図である。
発明の詳細な記述
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物
本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、ヒトＰＬＫ−１の発現を特異的に阻害ないしは抑制するｓｉＲＮＡがリポソームに内包されたものを含む。
ｓｉＲＮＡ
このｓｉＲＮＡは、ヒトＰＬＫ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００５０３０）の連続する１５〜３０塩基程度、特に１９〜２３塩基程度にハイブリダイズできる塩基配列を含むことが好ましい。ヒトＰＬＫ−１遺伝子にハイブリダイズできる塩基配列には、ヒトＰＬＫ−１遺伝子にハイブリダイズしない塩基領域が３塩基程度までなら含まれていてもよい。中でも、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の連続する１５〜３０塩基程度、特に１９〜２３塩基程度にハイブリダイズできる塩基配列からなるｓｉＲＮＡが好ましい。このようなｓｉＲＮＡの設計は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）Ｊｕｎ １８，３１９（１），２６４−２７４に記載の方法により行うことができる。選択した配列がＰＬＫ−１のｍＲＮＡのみ発現阻害するか否かは、例えばＢＬＡＳＴサーチで確認すればよい。
このようなｓｉＲＮＡとして、例えば配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を含むｓｉＲＮＡが挙げられる。本発明において、配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡとは、この塩基配列のＲＮＡとそれに相補的又は略相補的な塩基配列のＲＮＡとが対になった２本鎖ＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡを指す。
配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡは、配列番号１〜４の各塩基配列を含み、最大５０塩基程度のものである。特に、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現阻害作用が強い点で、配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。
ＰＬＫ−１の発現を抑制又は阻害するｓｉＲＮＡの中でも、特に配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ（好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ）、及び配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ（好ましくは、配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ）は、膀胱癌細胞又は膀胱の前癌状態の細胞に効率よく取り込まれて、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を効率的に抑制ないしは阻害する。
また、配列番号１の塩基配列、及び配列番号２の塩基配列において、ぞれぞれ１〜３個程、特に１〜２個程度のヌクレオチドが付加、欠失、又は置換された塩基配列を含むｓｉＲＮＡであっても、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に阻害又は抑制する限り使用することができる。
また、本発明のｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ−１の発現を阻害する限り、これらのヌクレオチドの誘導体であってもよい。
配列番号１及び２の各塩基配列において、１〜３個のヌクレオチドが欠失、付加、又は置換された塩基配列を含むｓｉＲＮＡがＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するか否かは、例えば後述する実施例３で説明するように、抗ＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングなどにより確かめればよい。
本発明のｓｉＲＮＡは、公知の化学合成法により製造できる。
リポソーム
リポソームの構成は特に限定されず、癌の遺伝子治療に使用される公知のリポソーム材料からなるものを使用すればよい。このような公知のリポソームとしては、例えば、カチオン化されたリポソームが挙げられる。カチオン化されたリポソームを用いることにより、細胞内での浸透性を向上させることができる。
リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然または合成のリン脂質、又はこれらを常法に従って水素添加したものが挙げられる。また、これらのリン脂質にはステロールを併用してもよい。脂質は、１種を単独で又は２種以上を混合して使用できる。
リポソームは、例えば、脂質をｔ−ブチルアルコールなどの溶媒に溶解させ、冷却後、凍結乾燥することにより作製することができる。また、作製したリポソームとｓｉＲＮＡ溶液とを接触させるだけでもｓｉＲＮＡを内包したリポソームが得られる。さらに、例えば、脂質にｓｉＲＮＡを溶解させた液体を加えて膨潤させ、超音波で分散させた後、分散体にポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミンを添加することにより直接ｓｉＲＮＡが封入されたリポソームを得ることができる。
リポソームの大きさは、その８０重量％以上が、粒径５０〜３００μｍ程度であることが好ましく、粒径７０〜２００μｍ程度の範囲であることがより好ましく、粒径７０〜１００μｍ程度の範囲であることがさらにより好ましい。上記の粒径範囲であれば、十分量のｓｉＲＮＡを封入できるとともに、リポソームによる毒性が生じない。
また、リポソーム内には、その形態及び機能を維持するために、通常、ｓｉＲＮＡの他にリン酸緩衝液−生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ＝７〜７．４程度）のような緩衝液、生理食塩水、ＲＰＭＩのような細胞用培養液、糖溶液などの液体成分が含まれていればよい。
リポソーム内のｓｉＲＮＡの濃度は、１００ｎＭ〜１ｍＭ程度であることが好ましく、１００ｎＭ〜６μＭ程度であることがより好ましい。上記のｓｉＲＮＡの封入量の範囲であれば治療効率が良い。また、現実にｓｉＲＮＡを封入できる範囲の量である。なお、ｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、ｓｉＲＮＡを懸濁した溶液とリポソームとの接触により行うことから、本発明に規定する「リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度」は、リポソーム作製の際にリポソームと接触させる溶液中のｓｉＲＮＡ濃度である。本発明においては、この濃度をリポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度とみなす。
（ＩＩ）膀胱表在性癌の治療又は予防方法
本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防方法は、膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、上記説明した本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソーム（本発明の膀胱癌の治療又は予防用医薬組成物）を投与する方法である。
本発明方法の対象となる患者は、未処置の膀胱表在性癌を有するヒト、膀胱表在性癌を摘除後のヒト、抗癌剤を投与したことにより膀胱癌が小さくなったヒト、膀胱内表面に前癌状態の病変を有するヒトなどである。膀胱癌細胞は複数層重なっているため、膀胱表在性癌を摘除しても、通常はわずかに癌細胞が残存する。このような微小残存病変を有するヒトも本発明方法の対象となる。このような状態の患者に本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームを投与することにより、癌細胞の増殖を抑制することができ、また前癌組織の癌への進行を抑制することができる。最も高い治療効果を期待できる対象は、膀胱癌を摘除後に、膀胱内表面に微小残存癌病変を有するヒトである。
ｓｉＲＮＡ内包リポソームは、例えばＰＢＳ、生理食塩水、細胞用培養液、糖溶液等に懸濁した状態で、尿道口から、通常カテーテルを用いて尿道を通して膀胱内に投与すればよい。これにより、膀胱癌細胞内にｓｉＲＮＡが導入される。
ｓｉＲＮＡ内包リポソームの１回投与量は、ｓｉＲＮＡ量に換算して１２μｇ〜１２０ｍｇ程度が好ましく、５０μｇ〜１０ｍｇ程度がより好ましい。上記の投与量の範囲であれば、十分に治療又は予防効果が得られるとともに、非特異的な作用が生じることもない。
また、この量を、３〜１０回程度に分けて投与することが好ましい。上記投与回数の範囲であれば、副作用の出るような１回投与量になることがなく、かつ患者の負担が小さい。
また、投与間隔は１〜７日間程度が好ましい。上記投与間隔であれば、感染症を誘発せず、患者の負担が小さい。また、上記投与間隔であれば、患者体内で有効ｓｉＲＮＡ濃度を保つことができる。
（ＩＩＩ）膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物としての使用
上記説明した本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームは、膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物として使用できる。使用の好ましい態様は、前述した通りである。FIG. 1 is an immunohistochemical staining diagram showing the PLK-1 expression level in a cancer tissue excised from a bladder cancer patient.
FIG. 2 shows the results of Western blotting showing the expression level of PLK-1 protein in bladder cancer cell lines.
FIG. 3(A) is the result of Western blotting showing that the siRNA of the present invention suppresses the expression of PLK-1 in cancer cell lines. (B) is a result of Western blotting showing that the siRNA of the present invention suppresses PLK-1 expression over time. (C) is a result of Western blotting showing that the siRNA of the present invention suppresses PLK-1 expression in a dose-dependent manner.
FIG. 4 is a diagram showing that the siRNA of the present invention suppresses spindle formation in bladder cancer cells.
FIG. 5(A) and (B) are diagrams showing that apoptosis of bladder cancer cells is induced by contact with the siRNA-encapsulating liposome of the present invention. (C) is a diagram showing that the number of surviving bladder cancer cells is reduced by contact with liposomes encapsulating 100 nM of the siRNA of the present invention.
FIG. 6(A) is a diagram showing that the bladder cancer cell line engrafts and proliferates in the bladder of mice. (B) and (C) are diagrams showing that when siRNA of the present invention is transurethrally administered into the bladder of a mouse, it penetrates into cancer cells. (D) is a diagram showing that the proliferation of bladder cancer cells is suppressed in a bladder cancer cell-transplanted mouse in which the siRNA of the present invention is intraurethrally administered into the bladder.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is described below in detail.
(I) Pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer In the pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer of the present invention, siRNA that specifically inhibits or suppresses the expression of human PLK-1 Including those encapsulated in liposomes.
siRNA
The siRNA preferably contains a base sequence capable of hybridizing with about 15 to 30 continuous bases of the human PLK-1 gene (GenBank accession no. NM — 005030), particularly about 19 to 23 bases. The base sequence that can hybridize to the human PLK-1 gene may include a base region that does not hybridize to the human PLK-1 gene up to about 3 bases. Among them, siRNA having a base sequence capable of hybridizing about 15 to 30 continuous bases of the human PLK-1 gene, particularly about 19 to 23 bases is preferable. Such siRNA designs are described, for example, in Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) Jun 18, 319(1), 264-274. Whether or not the selected sequence inhibits expression of only PLK-1 mRNA may be confirmed by, for example, BLAST search.
Examples of such siRNAs include siRNAs containing any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4. In the present invention, siRNA containing each of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 includes double-stranded RNA in which RNA of this base sequence and RNA of base sequence complementary or substantially complementary thereto are paired 2 Refers to double-stranded RNA.
The siRNA containing each of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 contains each of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 and has a maximum of about 50 bases. In particular, siRNAs containing the respective nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 are preferable because they have a strong inhibitory effect on human PLK-1 gene expression.
Among the siRNAs that suppress or inhibit the expression of PLK-1, in particular, siRNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 (preferably siRNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1) and siRNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 ( Preferably, the siRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is efficiently taken up by bladder cancer cells or precancerous cells of the bladder to efficiently suppress or inhibit the expression of PLK-1 gene.
In addition, the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2 each include a base sequence in which about 1 to 3 nucleotides, especially about 1 to 2 nucleotides are added, deleted or substituted Even siRNA can be used as long as it specifically inhibits or suppresses the expression of the human PLK-1 gene.
The siRNA of the present invention may be a derivative of these nucleotides as long as it inhibits the expression of PLK-1.
In each of the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2, whether or not siRNA containing a base sequence in which 1 to 3 nucleotides are deleted, added, or substituted suppresses the expression of PLK-1 gene will be described later, for example. As described in Example 3, it may be confirmed by Western blotting or the like using an anti-PLK-1 polyclonal antibody.
The siRNA of the present invention can be produced by a known chemical synthesis method.
Liposome The structure of the liposome is not particularly limited, and a known liposome material used for gene therapy of cancer may be used. Examples of such known liposomes include cationized liposomes. By using the cationized liposome, it is possible to improve the intracellular permeability.
Examples of the lipids constituting the liposomes include natural or synthetic phospholipids such as phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, and cardiolibin, or those obtained by hydrogenation according to a conventional method. Be done. In addition, sterols may be used in combination with these phospholipids. The lipids can be used alone or in combination of two or more.
The liposome can be prepared, for example, by dissolving the lipid in a solvent such as t-butyl alcohol, cooling, and freeze-drying. In addition, a liposome encapsulating siRNA can be obtained only by bringing the prepared liposome into contact with the siRNA solution. Furthermore, for example, a liquid in which siRNA is dissolved in a lipid is added to swell, and the mixture is ultrasonically dispersed, and then polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine is added to the dispersion to directly form a liposome in which siRNA is encapsulated. Obtainable.
Regarding the size of the liposome, 80% by weight or more thereof preferably has a particle size of about 50 to 300 μm, more preferably about 70 to 200 μm, and even more preferably about 70 to 100 μm. Is even more preferred. Within the above particle size range, a sufficient amount of siRNA can be encapsulated, and toxicity due to liposome does not occur.
In addition, in order to maintain the form and function of the liposome, a buffer such as phosphate buffer-physiological saline (PBS; pH=about 7 to 7.4) or physiological agent is usually used in addition to siRNA. Liquid components such as saline, cell culture medium such as RPMI, and sugar solution may be contained.
The concentration of siRNA in the liposome is preferably about 100 nM to 1 mM, more preferably about 100 nM to 6 μM. The therapeutic efficiency is good within the range of the above-mentioned siRNA encapsulation amount. In addition, the amount is within a range that can actually encapsulate siRNA. Since the liposome encapsulating the siRNA is carried out by contacting the liposome with a solution in which the siRNA is suspended, the “concentration of siRNA in the liposome” defined in the present invention is defined as siRNA concentration. In the present invention, this concentration is regarded as the siRNA concentration in the liposome.
(II) Method for Treating or Preventing Superficial Bladder Cancer The method for treating or preventing a superficial bladder cancer of the present invention comprises transurethral administration in a human bladder having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder. To a method of administering the above-described siRNA-encapsulated liposome of the present invention (the pharmaceutical composition for treating or preventing bladder cancer of the present invention).
The subject of the method of the present invention is a human with untreated superficial bladder cancer, a human after removal of the superficial bladder cancer, a human with reduced bladder cancer due to administration of an anti-cancer agent, bladder inner surface Humans with pre-cancerous lesions. Since the bladder cancer cells are multi-layered, even if the superficial bladder cancer is removed, a small amount of the cancer cells usually remain. A human having such a minimal residual lesion is also a target of the method of the present invention. By administering the siRNA-encapsulating liposome of the present invention to a patient in such a state, the growth of cancer cells can be suppressed and the progression of precancerous tissue to cancer can be suppressed. The subject expected to have the highest therapeutic effect is a human who has a minimal residual cancer lesion on the inner surface of the bladder after the bladder cancer is removed.
The siRNA-encapsulated liposome may be administered into the bladder through the urethra through the urethra through the urethra in a state of being suspended in, for example, PBS, physiological saline, cell culture medium, sugar solution, or the like. As a result, siRNA is introduced into the bladder cancer cells.
The single dose of the siRNA-encapsulating liposome is preferably about 12 μg to 120 mg, more preferably about 50 μg to 10 mg in terms of siRNA amount. Within the above dose range, a sufficient therapeutic or prophylactic effect can be obtained, and non-specific action does not occur.
It is also preferable to administer this amount in 3 to 10 divided doses. Within the range of the above-mentioned number of administrations, a single dose that causes side effects does not occur, and the burden on the patient is small.
The administration interval is preferably about 1 to 7 days. With the above administration interval, infection is not induced and the burden on the patient is small. Moreover, if it is the said administration interval, an effective siRNA concentration can be maintained in a patient's body.
(III) Use as a pharmaceutical composition for preventing or treating superficial bladder cancer The siRNA-encapsulating liposome of the present invention described above can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating superficial bladder cancer. The preferred mode of use is as described above.

以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１の発現
滋賀医科大学にて根治的膀胱全摘が施行されＨｅｌｓｉｎｋｉ宣言に基づいてインフォームドコンセントを得た５８例の膀胱癌患者から摘除された癌組織の標本を用意した。一次抗体として、１００倍希釈の抗ヒトＰＬＫ−１モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）を用い、周知のアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法（ ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９３，５２３−５３１）により免疫組織染色を行った。
結果を図１に示す。図１のＡ，Ｂ，Ｃは、グレードの高い未分化な筋層浸潤を認める膀胱癌である。Ｅ，Ｆはグレードの低い高分化で表在性の膀胱癌である。グレードの高い癌組織の方が、ＰＬＫ−１が高発現していることが分かる。また、Ｄはリンパ管浸潤が認められる組織であるが、この組織にもＰＬＫ−１は高発現していることが分かる。
また、５８標本について、膀胱癌の臨床病理学的特徴とＰＬＫ−１発現レベルとの関係を以下の表１に示す。

Figure 2006035515
表１から、腫瘍の筋層浸潤の有無、リンパ管浸潤の有無、及び悪性度とＰＬＫ−１の発現との間には正の相関性が認められた。即ち、グレードの高い膀胱癌組織ではグレードの低い膀胱癌組織よりＰＬＫ−１が高発現している。また、表在性の癌より侵襲性の癌の方がＰＬＫ−１が高発現している。さらに、リンパ管浸潤が認められる癌ではＰＬＫ−１が高発現している。
このように、ＰＬＫ−１は膀胱癌において特に高発現していることが分かる。
実施例２
膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１の発現
次に、膀胱癌の樹立細胞株におけるＰＬＫ−１の発現量を検討した。ヒト膀胱癌細胞株の２５３Ｊ，５６３７，ＨＴ１１９７，ＨＴ１３７６，Ｊ８２，ＲＴ４，ＲＴ１１２，ＳＣａＢＥＲ，ＴＣＣＳＵＰ，ＫＵ−７，及びＵＭ−ＵＣ−３；マウス膀胱癌細胞株のＭＢＴ−２；ヒト正常肝細胞Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ；並びにヒト正常線維芽細胞ＨＦ，ＮＨＤＦをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これらの細胞から調製したタンパク質について、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体（ｒａｂｂｉｔ；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。
結果を図２に示す。図２から、膀胱癌細胞株では正常細胞に比べてＰＬＫ−１が非常に強く発現していることが分かる。
実施例１及び２より、膀胱癌の浸潤・悪性化にＰＬＫ−１が重要な役割を果たしていることが示唆された。また、ＰＬＫ−１が膀胱癌の分子治療の標的として好適であることが分かる。
実施例３
本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームを用いた膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１発現の抑制
（Ａ） ＰＬＫ−１に対する配列番号１〜４の４種類のｓｉＲＮＡを化学合成した（Ｎｉｐｐｏｎ−Ｓｈｉｎｙａｋｕ Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）。これらのｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。
ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １３４５：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２：５’−ＣＣＵＵＧＡＵＧＡＡＧＡ ＡＧＡＵＣＡＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２）
ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １８３：５’−ＧＧＧＣＧＧＣＵＵＵＧＣＣＡＡＧＵＧＣｄＴｄＴ−３’（配列番号３）
ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１８：５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＵＣＡＣ ＣＣＵＣＣＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号４）
カチオン性脂質アナログを含むカチオン製リポソーム（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ Ｓｅｐ １；５９（１７）：４３２５−３３．に記載のリポソーム）に、それぞれ上記４種のｓｉＲＮＡを接触により封入した。このリポソームは、その８０重量％以上が粒径７０〜８０μｍである。これらのリポソーム内には、１０％マルトース水溶液が満たされており、ｓｉＲＮＡが１００ｎＭ含まれている。このｓｉＲＮＡ濃度は、ｓｉＲＮＡ封入リポソームの作製時に使用したｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度である。
ヒト膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６、マウス膀胱癌細胞株ＭＢＴ−２、及びヒト子宮頚癌細胞株ＨｅＬａにおけるＰＬＫ−１タンパク質の発現に与える上記４種のｓｉＲＮＡ内包リポソームの影響を以下のようにして調べた。即ち、上記各細胞培養に対して上記ｓｉＲＮＡ封入リポソームを添加することにより細胞にｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡ導入後の細胞からタンパク質を調製し、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロッティングを行った。
結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）中、非処理はｓｉＲＮＡ内包リポソームを作用させない細胞を示し、コントロールは、ナンセンス配列（５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号５））を有するｓｉＲＮＡを作用させた細胞を示す。図３から、４種のｓｉＲＮＡは癌細胞におけるＰＬＫ−１の発現を抑制しているが、中でもＰＬＫ−１ １４１２及びＰＬＫ−１ １４１８がＰＬＫ−１の発現を強く抑制し、特にＰＬＫ−１ １４１２が最も効果的にＰＬＫ−１の発現を抑制していることが分かる。
（Ｂ） また、ＰＬＫ−１ １４１２の膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３におけるｓｉＲＮＡ発現抑制を経時的に観察した。即ち、ｓｉＲＮＡ内包リポソームと細胞との接触時間を０、２、及び４時間として、各場合のＵＭ−ＵＣ−３細胞におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで調べた。結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）より、ＰＬＫ−１ １４１２はＰＬＫ−１の発現を時間依存的に抑制することが分かる。
（Ｃ） また、ＰＬＫ−１ １４１２の使用量と膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３及びＨＴ１３７６におけるｓｉＲＮＡ発現抑制効果との関係を同様にして調べた。即ち、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３については、リポソーム内のＰＬＫ−１ １４１２濃度（リポソームと接触させるｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度）を１ｎＭ、１０ｎＭ、及び１００ｎＭに変化させ、膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６については、リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度（リポソームと接触させるｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度）を３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭに変化させて、各場合の膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより調べた。
結果を図３（Ｃ）に示す。いずれの膀胱癌細胞を用いた場合も、ＰＬＫ−１１４１２は用量依存的にＰＬＫ−１の発現を抑制している。
以上より、本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、膀胱癌細胞に作用してＰＬＫ−１の発現を抑制することが分かる。
（Ｄ） ＰＬＫ−１タンパク質は細胞周期の制御に重要な役割を果たしており、サイクリンＢ１の分解に関与するとされている。サイクリンＢ１の分解に及ぼすＰＬＫ−１ １４１２の影響を調べるために、上記各濃度のｓｉＲＮＡを内包するリポソームを導入した膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３及びＨＴ１３７６について、サイクリンＢ１タンパク質の発現量を、ウサギ抗サイクリンＢ１ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いたウェスタンブロッティングにより調べた。
結果を図３（Ｃ）に示す。図３（Ｃ）から、ＰＬＫ−１ １４１２は濃度依存的にサイクリンＢ１の分解を抑制していることが分かる。
実施例４
本発明のｓｉＲＮＡによる紡錐体形成の抑制
ＰＬＫ−１タンパク質の重要な役割とされている紡錐体形成に及ぼすｓｉＲＮＡの影響を以下のようにして調べた。
膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３（ＡＴＣＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２内包リポソームを実施例３と同様にして上記細胞に作用させた。ｓｉＲＮＡを導入したが膀胱癌細胞及び導入しないコントロールの膀胱癌細胞について、β−チューブリン及びγ−チューブリンに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ ＤＮＡ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた免疫細胞染色を、これらに添付されたマニュアルに従って行った。
結果を図４に示す。β−チューブリン及びγ−チューブリン染色により、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入しないコントロール細胞では、正常に形成されたＭ−期の双極性の紡錐体が観察された。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ ＤＮＡ染色により、染色体ＤＮＡが細胞の中心に整列しているのが観察された。これに対して、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入した膀胱癌細胞では、Ｍ−期の円形の細胞が増加し、双極性の紡錐体の形成が強く抑制されている。 サイクリンＢ１の分解が抑制され、また紡錐体形成が抑制されることから、本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、膀胱癌細胞に作用してＰＬＫ−１の機能を効果的に抑制することが分かる。
実施例５
本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームのアポトーシス誘導に対する影響
ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームが膀胱癌細胞の細胞周期に及ぼす影響を以下のようにして調べた。
（Ａ） ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞株についてｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）の単染色を行い、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）で細胞周期を調べた。また、実施例３と同様にして１００ｎＭ濃度のＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームをＵＭ−ＵＣ−３細胞に作用させて２４時間培養した細胞についても、同様にしてＰＩの単染色を行い、ＦＡＣＳにより細胞周期を調べた。
結果を図５（Ａ）に示す。図５（Ａ）より、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入しないコントロール膀胱癌細胞ではアポトーシスは誘導されていないが、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入した膀胱癌細胞では、Ｇ２／Ｍ期にて細胞周期が停止され、アポトーシスが誘導されていることが分かる。
（Ｂ） 同様に、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入しないＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞株、コントロールｓｉＲＮＡ（配列番号５）を導入したＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞、及びＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を導入したＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞について、ＭＥＢＳＴＡＩＮ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ ＩＩ（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を行った。この場合、リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度は１００ｎＭ、細胞との接触時間は３６時間とした。
結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）のＡは染色写真であり、Ｂは生存細胞数である。図３（Ｂ）から、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を作用させたＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞ではＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブである細胞の比率が高く、アポトーシスの誘導が確認された。
（Ｃ） さらに、実施例３と同様にして、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３，２５３Ｊ，及びＫＵ−７に、１００ｎＭのＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームを１，３，６，及び７２時間作用させた後の生存細胞数をカウントした。ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２による上記各細胞に対する増殖抑制効果のＩＣ５０はそれぞれ、４６．１ｎＭ，９４．５ｎＭ，及び６０．４μＭであった。
後述する実施例６において、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームは、ｉｎ ｖｉｖｏで１５０ｎＭ〜６μＭの濃度範囲でがん細胞増殖抑制効果が認められたことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＣ５０の３〜１２０倍の濃度でｉｎ ｖｉｖｏ効果が認められたことになる。
なお、Ａ４３１膀胱癌細胞株（ＡＴＣＣ）を用い、ｓｉＲＮＡ内包リポソームとしてそれぞれＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ ２４６，１３４５，１４１２，及び２４６を内包するリポソームを用い、同様にしてＩＣ５０を求めたところ、それぞれ２２１ｎＭ、３５７ｎＭ、２ｎＭ、１３ｎＭであった。
また、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３，２５３Ｊ，及びＫＵ−７について、実施例３と同様にして、濃度１００ｎＭのＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームを作用させ、０時間、１時間、２時間、及び３時間後の生存細胞数をカウントした。ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を作用させた各細胞の相対細胞生存数は、コントロール細胞の当初生存細胞数を１．０とした場合、ＵＭ−ＵＣ−３細胞では０．１８７±０．０１９１及び０．０８９１±０．０２９０であり、２５３Ｊ細胞では０．７０５±０．０３４２及び０．３９９±０．０６９３であり、ＫＵ−７細胞では０．４６６±０．１０８及び０．２４３±０．０７１７であった。
結果を図５（Ｃ）に示す。図５（Ｃ）より、１００ｎＭという比較的高濃度のＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を内包するリポソームで膀胱癌細胞を処理した場合は、１〜３時間という短時間で生存細胞数が減少したことが分かる。
これは、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２によってＰＬＫ−１タンパク質の発現が阻害された結果、膀胱癌細胞の増殖が抑制されたものと考えられる。
実施例６
マウス正所性モデルを用いた膀胱癌増殖抑制効果
（Ａ） ｉｎ ｖｉｖｏにおいて膀胱癌に対するＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２の抗腫瘍効果を観察するために、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した膀胱癌細胞株を用いた正所性膀胱癌マウスモデルを確立した。
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、マウス膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３にｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びｐＳＶ２ネオベクター（ＡＴＣＣ）を導入した。このようにして得られたＬＵＣ−ラベルされた膀胱癌細胞１×１０６個を、マウス膀胱へ２４Ｇのアンギオ・カテーテルを用いて移植した。移植して１０分後、１日後、１週間後、３週間後、及び４週間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ社のｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いてマウスを観察した。
結果を図６（Ａ）に示す。Ａは１０分後、Ｂは１日後、Ｃは１週間後、Ｄは３週間後、Ｅは４週間後の様子を示す。膀胱癌細胞がマウス膀胱で増殖していることが観察される。
このことから、上記システムにより、非観血的に反復的に、さらに定量的に膀胱癌細胞の増殖を観察できることが分かる。
（Ｂ） 次いで、実施例３と同様にして、濃度１００ｎＭのｓｉＲＮＡを内包するリポソームを作製した。さらに、このリポソームをＦＩＴＣ（ピーク波長５３０ｎｍの蛍光を発する）でラベルした。ＬＵＣ−ラベルされた膀胱癌細胞を移植したマウスの膀胱からカテーテルを用いて排尿させた後、カテーテルを用いて尿道口から膀胱内に上記リポソームを２００μｌ注入した。
リポソーム注入の２４時間後に、マウスの膀胱を摘出し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）のＡ，Ｂはリポソームを投与した場合、Ｃ，Ｄはリポソームを投与しない場合、Ａ，Ｃは蛍光顕微鏡で観察した場合、Ｂ，Ｄは連続切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す。図６（Ｂ）Ａに示すように、リポソームを投与した場合は、膀胱部分に蛍光が観察される。このことから、経尿道的にｓｉＲＮＡ内包リポソームを投与することにより、膀胱癌組織に浸透することが分かる。
（Ｃ） 次いで、リポソームを投与したマウス及びリポソームを投与しないコントロールのマウスの膀胱癌組織を摘出し、実施例２と同様にして、但し、抗ＰＬＫ−１ポリクローナル抗体に代えて抗ＰＬＫ−１モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングによりＰＬＫ−１の発現量を調べた。
また、摘出した膀胱癌組織について、ＨＥ染色も行った。
結果を図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）のＡ，ＢはｓｉＲＮＡ内包リポソームで治療したマウスの組織であり、Ｃ，Ｄはこの治療を行わないマウスの組織である。また、Ａ，Ｃは抗ＰＬＫ−１モノクローナル抗体を用いた場合であり、Ｂ，ＤはＨＥ染色による場合である。図６（Ｃ）から、ｓｉＲＮＡ内包リポソームを経尿道的に投与することにより、ＰＬＫ−１の発現が抑制されていることが分かる。
（Ｄ） 次いで、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株を膀胱内に移植したマウスを４群（１群７匹）に分けて、２１日間にわたり飼育し、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２内包リポソーム又はコントロールｓｉＲＮＡ（配列番号５）を５日目から９日目にわたって投与した。投与は、１日に１回一度に膀胱内にリポソームを投与して尿道口を手術用糸で縛り、４時間後に開放する方法で行った。これら４群は、それぞれ非投与群、濃度６μｍのコントロールｓｉＲＮＡを内包するリポソームを投与した群、濃度２００ｎＭのＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を投与した群、濃度６μｍ（７）ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を投与した群である。
各群のマウスについて、膀胱癌細胞の増殖を測定した。結果を図６（Ｄ）に示す。図６（Ｄ）のグラフの横軸は飼育期間を示し、縦軸は光子のカウントを示す。
図６（Ｄ）中、・は濃度２００ｎＭのＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を投与した群、○は濃度６μｍのＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２を投与した群、□は無投与群、■はコントロールｓｉＲＮＡ投与群である。ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２内包リポソームを投与することにより、膀胱癌細胞の増殖が効果的に抑制されたことが分かる。
この４群間の末梢血中赤血球数、白血球数、血小板数および血清ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ），血清ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），血清ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ），血清ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ），血清ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（Ｃｒｅ），及び血清ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）を測定したところ、４群間に有意差を認めなかった。調べた範囲では、ＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２には副作用は認められなかった。
以上のことからＰＬＫ−１ ｓｉＲＮＡ １４１２は膀胱内に経尿道的に注入することで表在性膀胱癌の微小再発巣、微小残存病変の治療効果の可能性が示され、即ち再発予防的投与の理論的根拠となる十分な実験結果が得られた。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
Expression of PLK-1 in bladder cancer cells We prepared specimens of cancer tissue removed from 58 bladder cancer patients who underwent radical cystectomy at Shiga University of Medical Science and obtained informed consent based on Helsinki declaration. .. As a primary antibody, a 100-fold diluted anti-human PLK-1 monoclonal antibody (Transduction Laboratories, Lexington, KY) was used, and the well-known avidin-biotin-peroxidase complex method (ABC-Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA; Jpn). J. Cancer Res. 93, 523-531).
The results are shown in Figure 1. A, B, and C of FIG. 1 are bladder cancers with high grade undifferentiated muscle layer infiltration. E and F are low-grade, well-differentiated and superficial bladder cancers. It can be seen that PLK-1 is highly expressed in the higher grade cancer tissue. Further, D is a tissue in which lymphatic vessel infiltration is observed, and it can be seen that PLK-1 is highly expressed also in this tissue.
Table 1 below shows the relationship between the clinicopathologic characteristics of bladder cancer and the PLK-1 expression level for 58 specimens.
Figure 2006035515
 From Table 1, a positive correlation was observed between the presence or absence of muscle layer invasion of tumor, the presence or absence of lymphatic vessel invasion, and the degree of malignancy and PLK-1 expression. That is, PLK-1 is highly expressed in a high-grade bladder cancer tissue than in a low-grade bladder cancer tissue. In addition, PLK-1 is highly expressed in invasive cancers than in superficial cancers. Furthermore, PLK-1 is highly expressed in cancer in which lymphatic vessel infiltration is observed.
Thus, it can be seen that PLK-1 is highly expressed in bladder cancer.
Example 2
Expression of PLK-1 in bladder cancer cell line Next, the expression level of PLK-1 in the established cell line of bladder cancer was examined. Human bladder cancer cell lines 253J, 5637, HT1197, HT1376, J82, RT4, RT112, SCaBER, TCCSUP, KU-7, and UM-UC-3; mouse bladder cancer cell line MBT-2; human normal hepatocytes Hepatocyte. And human normal fibroblasts HF, NHDF were purchased from the American Type Culture collection (Rockville, MD). Western blotting was performed on the proteins prepared from these cells using an anti-human PLK-1 polyclonal antibody (rabbit; Upstate Biotechnology, Waltham, MA).
The results are shown in Figure 2. From FIG. 2, it can be seen that PLK-1 is extremely strongly expressed in the bladder cancer cell line as compared with normal cells.
From Examples 1 and 2, it was suggested that PLK-1 plays an important role in infiltration and malignant transformation of bladder cancer. Moreover, it turns out that PLK-1 is suitable as a target for molecular therapy of bladder cancer.
Example 3
Suppression of PLK-1 expression in bladder cancer cell line using the siRNA-encapsulated liposome of the present invention (A) 4 kinds of siRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 4 for PLK-1 were chemically synthesized (Nippon-Shinyaku Co., Kyoto, Japan). The base sequences of these siRNAs are as follows.
PLK-1 siRNA 1345:5'-GACAGCCUGCAGUACAUAGdTdT-3' (SEQ ID NO: 1)
PLK-1 siRNA 1412:5′-CCUUGAUGAGAGAGAGAUCACdTdT-3′ (SEQ ID NO: 2)
PLK-1 siRNA 183:5'-GGGCGGCUUUGCCAAGUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 3)
PLK-1 siRNA 1418:5′-GAAGAAGAUCAC CCUCUUdTdT-3′ (SEQ ID NO: 4)
Each of the above four types of siRNAs was contact-encapsulated in a cationic liposome containing a cationic lipid analog (a liposome described in Cancer Res. 1999 Sep 1; 59(17): 4325-33.). 80% by weight or more of this liposome has a particle size of 70 to 80 μm. These liposomes were filled with a 10% maltose aqueous solution and contained 100 nM of siRNA. This siRNA concentration is the siRNA concentration in the siRNA solution used when producing the siRNA-encapsulated liposome.
The effects of the above-mentioned four types of siRNA-encapsulating liposomes on the expression of PLK-1 protein in human bladder cancer cell line HT1376, mouse bladder cancer cell line MBT-2, and human cervical cancer cell line HeLa were examined as follows. .. That is, the siRNA was introduced into the cells by adding the siRNA-encapsulated liposome to each of the cell cultures. A protein was prepared from the cells after introduction of siRNA, and Western blotting using an anti-human PLK-1 polyclonal antibody was carried out in the same manner as in Example 2.
The results are shown in Fig. 3(A). In FIG. 3(A), untreated cells are cells that do not act on the siRNA-encapsulating liposome, and controls are cells that are acted on by the siRNA having the nonsense sequence (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′ (SEQ ID NO: 5)). From FIG. 3, four kinds of siRNAs suppress the expression of PLK-1 in cancer cells, but among them, PLK-1 1412 and PLK-1 1418 strongly suppress the expression of PLK-1, particularly PLK-1 1412. Shows that the expression of PLK-1 was most effectively suppressed.
(B) In addition, PLK-1 1412 was observed over time for siRNA expression suppression in the bladder cancer cell line UM-UC-3. That is, the expression time of PLK-1 protein in the UM-UC-3 cells in each case was set to 0, 2, and 4 hours for the contact time between the siRNA-encapsulated liposome and the cells, and the expression level of the PLK-1 protein in It was examined by Western blotting using PLK-1 polyclonal antibody. The results are shown in Fig. 3(B). From FIG. 3B, it is found that PLK-1 1412 suppresses PLK-1 expression in a time-dependent manner.
(C) In addition, the relationship between the amount of PLK-1 1412 used and the siRNA expression inhibitory effect in the bladder cancer cell lines UM-UC-3 and HT1376 was examined in the same manner. That is, for the bladder cancer cell line UM-UC-3, the PLK-1 1412 concentration in the liposome (siRNA concentration in the siRNA solution that contacts the liposome) was changed to 1 nM, 10 nM, and 100 nM, and the bladder cancer cell line HT1376 was used. For, regarding the siRNA concentration in the liposome (siRNA concentration in the siRNA solution to be brought into contact with the liposome) was changed to 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, and the expression level of PLK-1 protein in the bladder cancer cells in each case was determined. In the same manner as in 2, the examination was performed by Western blotting using an anti-human PLK-1 polyclonal antibody.
The results are shown in Fig. 3(C). PLK-11412 suppresses the expression of PLK-1 in a dose-dependent manner when any of the bladder cancer cells was used.
From the above, it can be seen that the liposome encapsulating the siRNA of the present invention acts on bladder cancer cells to suppress the expression of PLK-1.
(D) PLK-1 protein plays an important role in cell cycle regulation and is said to be involved in the degradation of cyclin B1. In order to investigate the effect of PLK-1 1412 on the degradation of cyclin B1, the expression level of cyclin B1 protein was measured for bladder cancer cell lines UM-UC-3 and HT1376 into which liposomes encapsulating the above-mentioned respective concentrations of siRNA were introduced. It was examined by Western blotting using a rabbit anti-cyclin B1 polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
The results are shown in Fig. 3(C). From FIG. 3C, it can be seen that PLK-1 1412 suppresses the degradation of cyclin B1 in a concentration-dependent manner.
Example 4
Suppression of Spindle Formation by siRNA of the Present Invention The effect of siRNA on spindle formation, which is considered to be an important role of PLK-1 protein, was examined as follows.
PLK-1 siRNA 1412-encapsulating liposomes were allowed to act on the bladder cancer cell line UM-UC-3 (ATCC; American Type Culture Collection) in the same manner as in Example 3. Antibodies specific for β-tubulin and γ-tubulin (Sigma, ST. Louis, MO) and Hoechst 33342 DNA stain (Molecular Probes, Eugene) of bladder cancer cells into which siRNA was introduced but not introduced. , OR) were used for immunocyte staining according to the manual attached to them.
The results are shown in Fig. 4. By β-tubulin and γ-tubulin staining, normally formed M-phase bipolar spindles were observed in control cells without PLK-1 siRNA 1412. In addition, by Hoechst33342 DNA staining, it was observed that the chromosomal DNA was aligned in the center of the cells. On the other hand, in bladder cancer cells into which PLK-1 siRNA 1412 was introduced, the number of M-phase circular cells increased, and the formation of bipolar spindles was strongly suppressed. Since the degradation of cyclin B1 is suppressed and the spindle formation is suppressed, the liposome containing the siRNA of the present invention acts on bladder cancer cells and effectively suppresses the function of PLK-1. I understand.
Example 5
Effect of the present invention's liposome encapsulating siRNA on the induction of apoptosis The effect of the liposome encapsulating PLK-1 siRNA 1412 on the cell cycle of bladder cancer cells was examined as follows.
(A) The UM-UC-3 bladder cancer cell line was subjected to simple staining with propriodium iodide (PI), and the cell cycle was examined by Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). Further, in the same manner as in Example 3, the liposomes encapsulating 100 nM concentration of PLK-1 siRNA 1412 were allowed to act on UM-UC-3 cells, and the cells cultured for 24 hours were also subjected to single PI staining in the same manner. The cell cycle was examined by FACS.
The results are shown in Fig. 5(A). From FIG. 5(A), apoptosis is not induced in the control bladder cancer cells that do not introduce PLK-1 siRNA 1412, but in the bladder cancer cells that introduce PLK-1 siRNA 1412, the cell cycle is in the G2/M phase. It can be seen that it is stopped and apoptosis is induced.
(B) Similarly, a UM-UC-3 bladder cancer cell line into which PLK-1 siRNA 1412 was not introduced, a UM-UC-3 bladder cancer cell into which a control siRNA (SEQ ID NO: 5) was introduced, and PLK-1 siRNA 1412 were prepared. Annexin V staining was performed on the introduced UM-UC-3 bladder cancer cells using MEBSTAIN apoptosis Kit II (MBL, Nagaya, Japan). In this case, the siRNA concentration in the liposome was 100 nM and the contact time with cells was 36 hours.
The results are shown in Fig. 3(B). In FIG. 3(B), A is a stained photograph and B is the number of viable cells. From FIG. 3(B), in the UM-UC-3 bladder cancer cells treated with PLK-1 siRNA 1412, the ratio of Annexin V positive cells was high, and the induction of apoptosis was confirmed.
(C) Further, in the same manner as in Example 3, bladder cancer cell lines UM-UC-3,253J, and KU-7 were loaded with liposomes containing 100 nM PLK-1 siRNA 1412 in 1, 3, 6, and. The number of surviving cells after 72 hours of action was counted. The IC 50 of the growth inhibitory effect of PLK-1 siRNA 1412 on each of the above cells was 46.1 nM, 94.5 nM, and 60.4 μM, respectively.
In Example 6 described below, liposome encapsulating a PLK-1 siRNA 1412, since the cancer cell growth inhibitory effect was observed in the concentration range of 150nM~6μM in in vivo,. 3 to the IC 50 of the in vitro This means that the in vivo effect was observed at a concentration of 120 times.
Incidentally, using the A431 bladder cancer cell line (ATCC), respectively using a liposome encapsulating a PLK-1 siRNA 246,1345,1412, and 246 as siRNA encapsulated liposomes, it was determined and IC 50 in the same manner, respectively 221 nm, It was 357 nM, 2 nM, 13 nM.
Further, with respect to the bladder cancer cell lines UM-UC-3, 253J, and KU-7, a liposome encapsulating PLK-1 siRNA 1412 at a concentration of 100 nM was allowed to act in the same manner as in Example 3 for 0 hours, 1 hour, The number of viable cells was counted after 2 hours and 3 hours. The relative cell viability of each cell treated with PLK-1 siRNA 1412 was 0.187±0.0191 and 0.0.1 in UM-UC-3 cells, where the initial viable cell number of control cells was 1.0. 0891±0.0290, 253J cells at 0.705±0.0342 and 0.399±0.0693, and KU-7 cells at 0.466±0.108 and 0.243±0.0717. there were.
The results are shown in Fig. 5(C). From FIG. 5(C), it was found that when bladder cancer cells were treated with liposomes encapsulating PLK-1 siRNA 1412 at a relatively high concentration of 100 nM, the number of viable cells decreased in a short time of 1 to 3 hours. ..
It is considered that this is because the PLK-1 siRNA 1412 inhibited the expression of the PLK-1 protein, resulting in suppression of the proliferation of bladder cancer cells.
Example 6
Bladder cancer growth inhibitory effect using mouse orthotopic model (A) In order to observe the antitumor effect of PLK-1 siRNA 1412 against bladder cancer in vivo, a bladder cancer cell line into which a luciferase gene was introduced was used. A mouse model of localized bladder cancer was established.
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) was used to introduce pGL3 (Promega, Madison, WI) and pSV2 neo vector (ATCC) into mouse bladder cancer cell line UM-UC-3. 1×10 6 LUC-labeled bladder cancer cells thus obtained were transplanted into a mouse bladder using a 24G angio catheter. Mice were observed 10 minutes, 1 day, 1 week, 3 weeks, and 4 weeks after transplantation, using the in vivo imaging system (Xenogen, Alameda, CA) from Xenogen.
The results are shown in Fig. 6(A). A shows after 10 minutes, B shows after 1 day, C shows after 1 week, D shows after 3 weeks, and E shows after 4 weeks. It is observed that bladder cancer cells are growing in the mouse bladder.
From this, it can be seen that the above-described system enables non-invasive, repetitive, and quantitative observation of bladder cancer cell proliferation.
(B) Next, in the same manner as in Example 3, liposomes encapsulating 100 nM concentration of siRNA were prepared. Furthermore, this liposome was labeled with FITC (fluoresces at a peak wavelength of 530 nm). After urinating from the bladder of a mouse transplanted with LUC-labeled bladder cancer cells using a catheter, 200 μl of the liposome was injected into the bladder from the urethral opening using the catheter.
Twenty-four hours after liposome injection, the bladder of the mouse was excised and observed using a fluorescence microscope. The results are shown in Fig. 6(B). In FIG. 6(B), A and B show the case where the liposome was administered, C and D show the case where the liposome was not administered, A and C show the case under a fluorescence microscope, and B and D show serial sections of hematoxylin-eosin (HE). The results of staining are shown. As shown in FIG. 6(B)A, when the liposome was administered, fluorescence was observed in the bladder part. From this, it can be seen that administration of the siRNA-encapsulating liposome transurethra penetrates into the bladder cancer tissue.
(C) Then, bladder cancer tissues of the liposome-administered mouse and the control mouse not administered with the liposome were excised and treated in the same manner as in Example 2, except that the anti-PLK-1 monoclonal antibody was replaced with the anti-PLK-1 monoclonal antibody. The expression level of PLK-1 was examined by Western blotting using the antibody.
Further, HE staining was also performed on the excised bladder cancer tissue.
The results are shown in Fig. 6(C). A and B in FIG. 6(C) are tissues of mice treated with siRNA-encapsulating liposomes, and C and D are tissues of mice not subjected to this treatment. In addition, A and C are for the case of using anti-PLK-1 monoclonal antibody, and B and D are for the case of HE staining. From FIG. 6(C), it is found that the expression of PLK-1 is suppressed by transurethral administration of the liposome encapsulating siRNA.
(D) Then, mice into which the UM-UC-3 cell line into which the luciferase gene was introduced were transplanted into the bladder were divided into 4 groups (7 mice per group), and the mice were bred for 21 days, and PLK-1 siRNA 1412-encapsulating liposome Alternatively, control siRNA (SEQ ID NO: 5) was administered over days 5-9. The administration was performed by a method in which liposomes were administered once a day into the bladder, the urethral opening was tied with a surgical thread, and the urethral orifice was opened 4 hours later. These 4 groups were respectively a non-administered group, a group administered with liposomes encapsulating control siRNA at a concentration of 6 μm, a group administered with PLN-1 siRNA 1412 at a concentration of 200 nM, and a concentration of 6 μm (7) PLK-1 siRNA 1412. It is a group.
Bladder cancer cell proliferation was measured for each group of mice. The results are shown in Fig. 6(D). The horizontal axis of the graph in FIG. 6D represents the breeding period, and the vertical axis represents the photon count.
In FIG. 6(D),-is a group administered with a concentration of 200 nM PLK-1 siRNA 1412, ◯ is a group administered with a concentration of 6 μm PLK-1 siRNA 1412, □ is a non-administration group, and ■ is a control siRNA administration group. is there. It can be seen that the administration of PLK-1 siRNA 1412-encapsulating liposomes effectively suppressed the growth of bladder cancer cells.
Peripheral blood red blood cell count, white blood cell count, platelet count and serum aspartate aminotransferase (AST), serum alanine aminotranferase (ALT), serum lactate dehydrogenase (LDH), serum total protein (TP), serum creat (crate). , And serum blood urea nitrogen (BUN) were measured, and no significant difference was observed between the 4 groups. No side effects were observed with PLK-1 siRNA 1412 in the investigated range.
From the above, PLK-1 siRNA 1412 is shown to have a therapeutic effect on micro-recurrent lesions and minimal residual lesions of superficial bladder cancer by transurethral injection into the bladder, that is, relapse preventive administration. Sufficient experimental results that provide a theoretical basis were obtained.

本発明の膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物は、膀胱内に投与することにより、膀胱表在性癌細胞や前癌組織に浸透し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制する。特に、膀胱癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトの治療用医薬組成物として好適に使用できる。  The pharmaceutical composition for preventing or treating superficial bladder cancer of the present invention, when administered into the bladder, penetrates into superficial bladder cancer cells and precancerous tissues and effectively suppresses the growth of bladder cancer cells. To do. In particular, it can be suitably used as a pharmaceutical composition for treating human having a minimal residual cancer lesion after excision of bladder cancer.

Claims (22)

以下の（ａ）又は（ｂ）のｓｉＲＮＡ
（ａ） 配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｂ） 配列番号１において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。SiRNA of the following (a) or (b)
(A) siRNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
(B) A siRNA that contains a base sequence in which 1 to 3 bases are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 1 and that specifically suppresses expression of the human PLK-1 gene. 以下の（ｃ）又は（ｄ）のｓｉＲＮＡ
（ｃ） 配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｄ） 配列番号２において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。SiRNA of the following (c) or (d)
(C) siRNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
(D) A siRNA that comprises a base sequence in which 1 to 3 bases are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 2 and specifically suppresses the expression of the human PLK-1 gene. 請求項１に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。  A liposome encapsulating the siRNA of claim 1. 請求項２に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。  A liposome encapsulating the siRNA of claim 2. 請求項３に記載のリポソームを含む医薬組成物。  A pharmaceutical composition comprising the liposome according to claim 3. 請求項４に記載のリポソームを含む医薬組成物。  A pharmaceutical composition comprising the liposome according to claim 4. 請求項３に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。  A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises the liposome according to claim 3. 請求項４に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。  A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises the liposome according to claim 4. ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。  A pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, comprising a liposome encapsulating siRNA that inhibits expression of human PLK-1. ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項９に記載の組成物。  The composition according to claim 9, wherein the siRNA concentration is 100 nM to 1 mM. リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項９に記載の組成物。  The composition according to claim 9, wherein 80% by weight or more of the liposomes have a particle size of 50 to 300 µm. 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項３に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。  A method for treating or preventing a superficial bladder cancer, which comprises transurethrally administering the liposome according to claim 3 into the bladder of a human having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder. 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項４に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。  A method for treating or preventing superficial bladder cancer, which comprises transurethrally administering the liposome according to claim 4 into the bladder of a human having a superficial bladder cancer or a precancerous lesion of the bladder. 膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。  Treatment of superficial bladder cancer in which a liposome encapsulating siRNA that inhibits expression of human PLK-1 is transurethrally administered into the bladder of a human having superficial bladder cancer or precancerous lesion of bladder Prevention method. 膀胱表在性癌の治療又は予防剤の１回投与量が、ｓｉＲＮＡを１２μｇ〜１２０ｍｇ投与できる量である請求項１４に記載の治療又は予防方法。  The therapeutic or preventive method according to claim 14, wherein the single dose of the therapeutic or prophylactic agent for superficial bladder cancer is 12 μg to 120 mg of siRNA. 膀胱表在性癌の治療又は予防剤を１〜７日間間隔で５〜１０回投与する請求項１４に記載の治療又は予防方法。  The treatment or prevention method according to claim 14, wherein the agent for treating or preventing superficial bladder cancer is administered 5 to 10 times at intervals of 1 to 7 days. 膀胱表在性癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトに対して行われるものである請求項１４に記載の治療又は予防方法。  The treatment or prevention method according to claim 14, which is performed on a human having a minimal residual cancer lesion after excision of superficial bladder cancer. 請求項３に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。  Use of the liposome according to claim 3 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer. 請求項４に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。  Use of the liposome according to claim 4 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer. ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。  Use of a liposome encapsulating siRNA that inhibits the expression of human PLK-1 as a pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer. ｓｉＲＮＡの濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項２０に記載の使用。  The use according to claim 20, wherein the concentration of siRNA is 100 nM-1 mM. リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項２０に記載の使用。  The use according to claim 20, wherein 80% by weight or more of the liposomes have a particle size of 50 to 300 µm.
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