EP2948235A1 - Membrane étanche aux liquides et perméable aux gaz, procédé de fabrication et utilisation d'une telle membrane pour l'élevage d'arthropodes in vitro - Google Patents

Membrane étanche aux liquides et perméable aux gaz, procédé de fabrication et utilisation d'une telle membrane pour l'élevage d'arthropodes in vitro

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Publication number
EP2948235A1
EP2948235A1 EP13811406.1A EP13811406A EP2948235A1 EP 2948235 A1 EP2948235 A1 EP 2948235A1 EP 13811406 A EP13811406 A EP 13811406A EP 2948235 A1 EP2948235 A1 EP 2948235A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chitosan
membrane
film
arthropod
polymer film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP13811406.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Angélique VETILLARD
Jérémy TABART-DOUZOU
Marc-Edouard COLIN
Nathan TENE
Jean-Luc CARAYON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre Universitaire Jean Francois Champollion
Centre International dEtudes Superieures en Sciences Agronomiques Montpellier Sup Agro
Original Assignee
Centre Universitaire Jean Francois Champollion
Centre International dEtudes Superieures en Sciences Agronomiques Montpellier Sup Agro
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Universitaire Jean Francois Champollion, Centre International dEtudes Superieures en Sciences Agronomiques Montpellier Sup Agro filed Critical Centre Universitaire Jean Francois Champollion
Publication of EP2948235A1 publication Critical patent/EP2948235A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0081—After-treatment of organic or inorganic membranes
    • B01D67/0088—Physical treatment with compounds, e.g. swelling, coating or impregnation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/02—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor characterised by their properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/08—Polysaccharides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2323/00—Details relating to membrane preparation
    • B01D2323/04—Hydrophobization
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/38—Hydrophobic membranes

Definitions

  • the present invention is in the field of liquid-tight and gas-permeable type membranes. More particularly, it relates to a membrane with such characteristics, as well as a method of manufacturing such a membrane. The invention also relates to the use of this membrane for the in vitro rearing of arthropods, in particular insects and arachnids, in particular so-called biting-sucking insects, as well as a system for this breeding, incorporating a such membrane.
  • the membrane according to the invention finds application in all the fields in which it is necessary to form a liquid barrier while allowing the transfer of gaseous phases, in particular molecules of interest in the gaseous state.
  • a particularly preferred field of application of this membrane is that of in vitro breeding of arthropods, in particular so-called biting-sucking, entomophagous or parasitoid, in particular for the use of insects in the control of insect pests of crops and / or vectors of human and animal diseases.
  • auxiliary parasitic insects therefore represents a considerable potential.
  • the treatments are also carried out by flood releases consisting of dispersing massively (at the rate of several hundreds of thousands of individuals per hectare) and regularly auxiliaries in the larval or adult state in the culture to be protected.
  • flood releases therefore require a large number of individuals, making the mass rearing of parasitoids a prerequisite for the development of their use.
  • Such synthetic hosts proposed by the prior art consist mainly of capsules containing a nutrient medium in a Parafilm ® membrane or in gangues constituted by a hydrophobic mixture including various materials such as wax, Paraplast ® , petrolatum , alkenes or polyethylene.
  • a nutrient medium in a Parafilm ® membrane or in gangues constituted by a hydrophobic mixture including various materials such as wax, Paraplast ® , petrolatum , alkenes or polyethylene.
  • the present invention aims at providing a liquid-tight and gas-permeable membrane, which furthermore makes it possible, in a synthetic system for breeding arthropods, in particular insects or arachnids, to separate a nutrient medium from the external environment in which arthropods are found, to overcome the disadvantages of synthetic hosts proposed by the prior art, including those described above.
  • the present invention aims that this membrane allows oviposition and / or feeding arthropods, including species whose ovipositor apparatus and / or stinger-sucker is of low power and short length.
  • a further object of the invention is that this membrane has a low production cost, in particular so as to allow the production cost of a synthetic system for the in vitro breeding of arthropods in which it is implemented, less than that of a natural or substitution host.
  • a membrane impermeable to liquids in particular to aqueous solutions, and permeable to gases, which comprises a polymer film of chitosan of thickness less than 1 ⁇ impregnated, preferably substantially entirely, at least one hydrophobic compound, this impregnation preferably being substantially continuous, over the entire surface of the chitosan film.
  • the term "impregnated" means that the chitosan film has been impregnated with the hydrophobic compound. Impregnation is here defined in a conventional manner in itself, as the fact of making penetrate into a substance a product that spreads in a diffuse way.
  • the hydrophobic compound is distributed substantially homogeneously and diffuse in the thickness of the chitosan film, over the entire surface of the latter, thus conferring on this film properties of hydrophobicity and impermeability to liquids.
  • the impregnation rate of the polymer film of chitosan by the hydrophobic compound (s) is preferably between 5 and 10 ⁇ of hydrophobic compound (s) / mm 3 of film.
  • Chitosan a copolymer of N-acetylglucosamine and glucosamine, is a linear polysaccharide, a deacetylated derivative of chitin, a biopolymer present especially in crustacean shells such as crabs or crabs. shrimp.
  • This biopolymer has the advantages of being natural, non-toxic, biodegradable and harmless to the environment.
  • the membrane according to the invention for the breeding of insects it also has the advantage of a chemical composition similar to that of compounds involved in the constitution of cuticles of insects.
  • chitosan is used in the present description both to designate chitosan itself, and its derivatives such as esters, ethers, amines, amides or any other derivatives formed by interaction with the hydroxyl or amine groups of chitosan.
  • the chitosan used to obtain the polymer film according to the invention preferably has a high degree of deacetylation, in particular greater than or equal to 70%.
  • This impregnated chemical-free, chemically-grafted chitosan polymer film of the hydrophobic compound is advantageously impervious to aqueous solutions and permeable to gases, so that it is capable of permitting transfer therethrough of volatile molecules in the gaseous state.
  • the chitosan polymer film may also be impregnated with one or more compounds of interest, for example stimulating oviposition and / or appetizing, such as alkanes, fatty acids, products of insect metabolism, etc.
  • the hydrophobic compound is selected from styrenic polymers, in particular polystyrene, and alkanes, preferably C20 to C40 alkanes.
  • the polymer film of chitosan is impregnated with a mixture of C20 to C40 alkanes, for example beeswax, or a mixture of paraffins as marketed under the name Paraplast®.
  • the membrane according to the invention may be shaped in any desired form, both flat and curved.
  • the polymer film of chitosan is superimposed on a support layer of absorbent material capable of preventing its retraction, preferably based on cellulosic fibers. It preferably has a sufficiently loose mesh to allow the penetration of an ovipositor apparatus and / or piercing sucker of an arthropod.
  • a support layer which may for example be constituted by a sheet of paper marketed under the name Whatman®, makes it particularly advantageous to avoid shrinkage of the chitosan film under the effect of possible dehydration.
  • the membrane thus obtained is also easily manipulated, despite the very small thickness of the chitosan film.
  • the membrane according to the invention can advantageously be manufactured at low cost, and it has a good stability over time.
  • a further object of the invention is a method of manufacturing a membrane having one or more of the above features.
  • a membrane according to the invention is capable of being obtained by a manufacturing method comprising the steps of:
  • the aqueous solution for example a solution of acetic acid, comprises a concentration of between 2 and 30 mg / ml, preferably substantially equal to 2.5 mg / ml, of chitosan. It preferably has a low viscosity, preferably less than 200 mPa.s.
  • the surfactant or the mixture of surfactants, is advantageously used in a concentration capable of allowing a reduction of the surface tension of the aqueous solution sufficient to ensure that when the solution is spread on a surface, and dried to form the chitosan film, the amount of chitosan deposited per unit area is sufficiently small that the film has the very small thickness according to the invention. It is within the competence of a person skilled in the art to determine such a concentration, theoretically or experimentally, as a function of the concentration of chitosan in the acidic aqueous solution and of the particular characteristics of the surfactant (s) put (s) implemented.
  • the surfactant is of the nonionic type. It may especially consist of an octylphenol ethoxylate, for example as marketed under the name Triton X-100®. This surfactant lowers the surface tension of water by 33 dynes / cm at a concentration of 1% at 25 ° C. Such a surfactant is preferably used in a concentration of between 50 and 100 ng / ml of solution, preferably about 60 ng / ml. The choice of such a particular surfactant is however not limited to the invention, and other surfactants or mixtures of surfactants can be implemented within the scope of the invention.
  • the surfactant (s) are (s) advantageously chosen to exhibit no trace toxicity for the arthropod to be raised.
  • the treatment under basic conditions can in particular be carried out with a solution of sodium hydroxide.
  • the solution containing the hydrophobic compound (s) contains a total concentration of said compounds of between 1 and 10 mg / ml.
  • the impregnation which constitutes a mass treatment of the chitosan film, can in particular be carried out by immersing the chitosan film in a solution bath containing the hydrophobic compound (s), for a period of a few minutes, for example of about 2 minutes, long enough to ensure a homogeneous distribution of the hydrophobic compound (s) which diffuse throughout the thickness of the chitosan film, over the entire surface of the latter, and to confer to the chitosan film a liquid-tight character.
  • the placing in the presence of the chitosan film with this solution is preferably preceded by a step of gradual dehydration of this film, for example by soaking in successive baths of alcoholic solutions, and then in a bath of an apolar organic solvent, such as hexane.
  • the method of manufacturing the membrane further comprises subsequent steps of:
  • the immersion of the film in the aqueous solution is followed by the addition in the latter of a compound of a density lower than that of water, preferably less than at least 0.14.
  • a compound of a density lower than that of water preferably less than at least 0.14.
  • Such a characteristic advantageously has the effect of accelerating the deployment of the chitosan film impregnated with the hydrophobic compound (s).
  • a compound of lower density than water is preferably chosen to have good miscibility with water. he can for example, an alcohol, such as ethanol, in aqueous solution at 50 to 70% (v / v).
  • a water / alcohol interface is advantageously and transiently created in the solution, which has the effect of bringing the chitosan film very quickly to the solution surface, in a state which fully deployed, thus facilitating its deposition on the support layer.
  • Such a preparation method is advantageously simple and quick to perform, moreover in a very reproducible manner, and low cost.
  • the drying may optionally be followed by a heating step at a temperature between 70 and 75 ° C, for a period of between 30 seconds and 20 minutes or so, and in particular embodiments of the method. invention, a cooling step at room temperature, before storage protected from light.
  • the membrane according to the invention has a wide range of applications.
  • an object of the present invention is the use of a membrane corresponding to one or more of the above characteristics, in the field of separative chemistry, for the extraction of volatile molecules contained in a liquid.
  • Another subject of the invention is the use of a membrane corresponding to one or more of the above characteristics, for the in vitro rearing of an arthropod, in particular of an insect or an arachnid , in particular to produce a large amount of so-called auxiliary insects usable in the fight against insect pests of crops and / or vectors of human and animal diseases.
  • this breeding can for example be made for the study of the interactions between a parasite and its host, aimed in particular at developing means to make the parasite harmless vis-à-vis its natural host.
  • breeding means both the obtaining of larvae from a founder, that the feeding of this founders and / or larvae until they reach the desired stage of development, particularly at the adult stage.
  • the individuals thus raised can in particular be used for carrying out flood releases on cultivation areas and / or in which disease-carrying insects are likely to develop.
  • the membrane is then interposed between an arthropod containment chamber and a nutrient medium for this arthropod, so as to ensure a sealed containment of the nutrient medium. It thus acts as a water barrier and antimicrobial preserving the degree of hydration and sterility of the nutrient medium.
  • it advantageously allows the volatile molecules contained in this nutrient medium, particularly olfactory molecules stimulating oviposition and / or appetizing, to reach the arthropod contained in the compression chamber.
  • the mechanical characteristics and the great fineness of the chitosan film allow any arthropod contained in the compression chamber to pierce it to access the nutrient medium.
  • the nutrient medium can advantageously be complemented by any molecule of interest, in order to study its action with respect to the arthropod contained in the compression chamber.
  • the present invention thus relates to a system for the in vitro rearing of an arthropod, in particular an insect or an arachnid, comprising a membrane corresponding to one or more of the above characteristics, interposed between a chamber containment of the insect and a nutrient medium.
  • the nutrient medium is preferably gelled.
  • the chitosan film is disposed on the side of the compression chamber, that is to say vis-à-vis the arthropod, so that it can be easily pierced by the ovipositor apparatus or sucker-sucker of the latter.
  • the support layer is then arranged vis-à-vis the nutrient medium, preferably in direct contact with the latter. Its absorbent nature allows it to impregnate, by capillary effect, the liquid medium. When the arthropod is not able to completely pierce this support layer, it can then advantageously absorb the elements necessary for its good nourishment directly from this support layer.
  • the compression chamber is coated, on an inner face of a peripheral wall which delimits it, with a coating based on at least one hydrophobic compound, preferably based on a mixture of C20 to C40 alkanes, for example Paraplast®.
  • This coating advantageously contributes to recreate for arthropod an environment close to its natural environment.
  • the nutrient medium further contains a haemolymph extract of bee larvae.
  • the membrane and the system according to the invention can be used for breeding a large variety of arthropods, for example, but not limited to, parasitoids of the Trichogramma family (Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens).
  • parasitoids of the Trichogramma family Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens.
  • Trichogramma voegelei Trichogramma chilonis, (7), of the genus Toxorhynchites (Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis), Psyttalia lounsburyi, Venturia canescens, Lariophagus distinguendus, Torymus sinensis, Psyttalia fletcheri, Fopus arisanus, or ectoparasite mite Varroa destructor, the main parasite of the bee.
  • Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis
  • Psyttalia lounsburyi Venturia canescens
  • Lariophagus distinguendus Torymus sinensis
  • Psyttalia fletcheri Psyt
  • FIG. 1 represents a cross-sectional view of a chitosan polymer film forming part of a membrane according to a particular embodiment of the invention, said chitosan film being impregnated with Paraplast®, observed by a scanning electron microscope (SEM) at a magnification of 149,773 times;
  • FIG. 2 shows the chitosan film of FIG. 1 in plan view, surface layer side, observed at SEM at a magnification of 159 022 times;
  • FIG. 3 shows schematically, in section along a longitudinal plane, a system for in vitro culture of an arthropod according to one embodiment of the invention
  • FIG. 4 shows an adult female of the Varroa destructor species being fed through the film of FIG. 1 superimposed on a sheet of Whatman® paper, observed under a magnifying glass, with a magnification of 12 times;
  • FIG. 5 shows an adult female of the Varroa destructor species taken after 48 hours of incubation at 34 ° C. and 65% relative humidity in the compression chamber of a system for the in vitro rearing of a arthropod according to a particular embodiment of the invention, wherein the nutritive medium was added bright blue FCF, this female being observed magnifying, with a magnification of 12 times;
  • FIG. 6 shows the interior of a compression chamber of a system for the in vitro rearing of an arthropod according to a particular embodiment of the invention, in which the nutritive medium has been supplemented with brilliant blue. FCF, and wherein an adult female of the Varroa destructor species was incubated for 48 hours at 34 ° C and 65% relative humidity in the restraining chamber, said restraining chamber being magnified under magnification 12 times;
  • FIG. 7 is a bar graph illustrating the percentage of adult females of the Varroa destructor species having been fed after
  • a / Po the compression chamber is internally coated with no coating and the chitosan film is impregnated with polystyrene;
  • a / Po / H the nutrient medium is in addition of 25% (v / v) of a haemolymph extract of bee larvae;
  • C / C the compression chamber is internally coated with a beeswax coating and the chitosan film is impregnated with beeswax;
  • C / C / H the nutrient medium is further supplemented with 25% (v / v) of a haemolymph extract of bee larvae;
  • Pa / Pa the compression chamber is internally coated with a Paraplast® coating and the chitosan film is impregnated with Paraplast®;
  • Pa / Pa / H the nutrient medium
  • a chitosan film impregnated with hydrophobic compounds is formed in the following manner.
  • An acidic aqueous solution of chitosan comprises, in solution in ultrapure water:
  • Triton X100 ® 60 ng / ml of Triton X100 ® (Sigma).
  • this solution is poured into a petri dish 10 cm in diameter. The excess of solution is rejected so that it remains in the box that the liquid that wets it. The box is then held under a laminar flow hood for 45 minutes until completely dry.
  • a solution of 1M sodium hydroxide (NaOH) is then poured on the chitosan, and the film thus formed is then rinsed 3 times for 2 min with a large volume of distilled water and with rotary stirring (100 rpm) to remove excess sodium hydroxide and Triton X100 ® .
  • the chitosan polymer film is then dehydrated progressively by a series of soaks of 2 min each in 70% ethanol, then 95%, then pure ethanol baths.
  • the thus treated film is transferred to a hexane bath to remove the ethanol. It is then immersed either in a bath of hexane containing 10 g / l of beeswax (APIREM) or 10 g / l of Paraplast ® (Sigma) or chloroform in a bath containing 10 g / l of polystyrene.
  • the chitosan film thus impregnated with the hydrophobic compounds forming part of Paraplast® is observed under a scanning electron microscope, under reduced pressure, using an ESEM Quanta® 250 FEG microscope (FEI), after coating with platinum using JFC-1 100 ion spray (JEOL).
  • the images obtained are shown in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 in cross-sectional view obtained by MEB, white lines represent areas in which the thickness of the film has been measured. It is observed that the thickness of the film is always between 105.9 nm (bottom line in the figure) and 109.6 nm (top line in the figure).
  • FIG. 2 in a view from above, obtained by SEM and also for impregnation of the film with Paraplast®, it is observed that the film is devoid of pores and has on its surface crystalline structures characteristic of salts and alkanes.
  • the film is then transferred to a bath of distilled water.
  • a solution of 70% ethanol is poured onto the film in order to deploy it.
  • the film is then deposited, still immersed in the bath, on a support layer, for example formed by a sheet of Whatman ® paper, which is introduced into the bath and raised towards the film.
  • the film thus superimposed on the support layer is dried under a laminar flow hood and incubated at 70 ° C. for 15 min.
  • the membrane thus obtained is then sterilized, either by immersion for 5 min in 70% alcohol, or by exposure for 15 min to UVC radiation. It is then stored for about 12 hours at room temperature and in the dark to allow the evaporation of traces of residual solvents. It is then stored at room temperature, protected from light and dry, until use.
  • This system comprises a compression chamber 10 for receiving an arthropod 1 1.
  • This chamber may be formed of any material compatible with use for the breeding of insects, for example polystyrene.
  • This contention chamber 10 may in particular be formed by sections about 5 millimeters long and 2.5 mm internal diameter, cut into a pipette of 1 ml of polystyrene for cell culture. These sections are previously sanded at their longitudinal ends, to obtain planar and frosted ends.
  • the compression chamber On the inner face 102 of the peripheral wall 101, the compression chamber may be coated with a coating based on at least one hydrophobic compound, preferably based on a mixture of C20 to C40 alkanes, for example beeswax (APIREM) or Paraplast ® (Sigma). For this, the wall 101 is immersed in a bath heated to about 72 ° C and containing beeswax or Paraplast®, or any other desired hydrophobic compound.
  • the contention chamber 10 is closed by a membrane 12 according to a particular embodiment of the invention, especially as described above.
  • the membrane 12, as well as the peripheral wall 101 of the compression chamber have been represented with a certain thickness, which in no way reflects their real dimensions.
  • the membrane 12 is arranged with respect to the peripheral wall 101 so that the chitosan film impregnated with the hydrophobic compounds is disposed towards the inside of the compression chamber 10, while the paper sheet forming the support layer of the film is arranged at the opposite of the room.
  • Fixing the membrane 12 at the end of the compression chamber 10 may be made by gluing, for example by beeswax or Paraplast®. In general, these materials advantageously contribute to the contention chamber 1 0 reproducing for the arthropod, in particular of the species Varroa destructor, parasitic mite of the bee, conditions very close to its natural environment.
  • the compression chamber 10, closed at one end by the membrane 12, is preferably sterilized, for example by immersion in a bath of an alcohol solution, and dried in a laminar flow hood prior to its implementation.
  • an arthropod 11 for example of the species Varroa destructor
  • the chamber is closed at a second longitudinal end by any adequate means compatible with the breeding of the arthropod, in particular able to allow the gas exchanges between the internal volume of the chamber of contention and the external environment and to prohibit any leakage of the arthropod.
  • it is used for the closure of the contention chamber 10 a disc 13 of Whatman ® paper, for example 3 mm in diameter.
  • Fixing this paper disk 13 to the peripheral wall 101 may be made by gluing, by any conventional means in itself, for example by a disc 14 of suitable diameter, for example about 4 mm, of adhesive such as Scotch® crystal adhesive, drilled at its center through a hole about 2 mm in diameter.
  • this adhesive disk 14 has been shown in FIG. 3 slightly detached from the peripheral wall 101 and the paper disk 13. In reality, it is of course pressed against these.
  • a nutrient medium suitable for feeding the arthropod preferably agarose, is placed in a receptacle 16.
  • the compression chamber 10 closed at its two opposite longitudinal ends as described above, and containing an arthropod to be raised 1 , is deposited on this nutrient medium 15, so that the support layer is in contact with the medium, so that it absorbs the liquid contained therein by capillary effect.
  • An adult female of the Varroa destructor species is obtained from a breeding on bee colonies Apis mellifera, under conventional conditions in themselves. This female has a piercing-sucking device of about 10 ⁇ long and low power.
  • This female is placed in a system as described above with reference to FIG.
  • the nutrient medium is formed as follows. Culture medium developed by Hunter (Hunter, W.B.,
  • This medium contains 30% Schneider's medium, 30% CMRL 1066, 0.06 M histidine, 10% fetal calf serum, 1% Hank's salts and 4% insect supplement medium.
  • This medium is supplemented with 25% (v / v) of bee larvae haemolymph extract at stage L5, obtained by membrane centrifugal filtration with a porosity of 3000 Da, the centrifugation being carried out for 15 minutes at 12. 000 g, and recovery of the filtrate. Finally, the medium is incubated at 45 ° C. and added with 20% of a 20 g / l solution of agarose, containing 0.8% (v / v) brilliant blue FCF, preheated to 45 ° C.
  • agar medium 80 ⁇ l of this agar medium are placed in a receptacle 16, for example in a well of a 96-well plate, conventional in itself.
  • a contention chamber 10 in which the film forming part of the membrane is impregnated with Paraplast®, and containing the arthropod, is deposited on the nutrient agar medium.
  • the whole is incubated at 34 ° C. and 60% relative humidity, in the dark, inclined at 60 degrees to the horizontal.
  • the occurrence of the feeding is evaluated after 48 hours of incubation in the system according to the invention, at 34 ° C. and 65% relative humidity, by observation with a magnifying glass on the one hand of the digestive system of the insect, on the other hand feces contained in the containment chamber, for the purpose of detecting the presence or absence of brilliant blue FCF staining, as detailed in Experiment 1 above.
  • stimulating substances here the bee hemolymph extract
  • This system thus has a high performance in terms of feeding arthropods.
  • the membrane according to the invention effectively reproduces the parasite / host interface, including for the breeding of parasitic arthropods very demanding in terms of host specificity and membrane resistance, which are individuals of the species Varroa destructor.

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Abstract

L'invention concerne une membrane (12) étanche aux liquides et perméable aux gaz, comportant un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μm imprégné d'au moins un composé hydrophobe, notamment d'un mélange d'alcanes en C20 à C40. Un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode (11) comporte une telle membrane interposée entre une chambre de contention (10) dudit arthropode et un milieu nutritif (15) pour ledit arthropode.

Description

MEMBRANE ÉTANCHE AUX LIQUIDES ET PERMÉABLE AUX GAZ, PROCÉDÉ DE FABRICATION ET UTILISATION D'UNE TELLE MEMBRANE
POUR L'ÉLEVAGE D'ARTHROPODES IN VITRO
La présente invention s'inscrit dans le domaine des membranes de type étanches aux liquides et perméables aux gaz. Plus particulièrement, elle concerne une membrane répondant à de telles caractéristiques, ainsi qu'un procédé de fabrication d'une telle membrane. L'invention concerne également l'utilisation de cette membrane pour l'élevage in vitro d'arthropodes, en particulier d'insectes et d'arachnides, notamment des insectes dits piqueurs- suceurs, ainsi qu'un système pour cet élevage, intégrant une telle membrane.
La membrane selon l'invention trouve application dans tous les domaines dans lesquels il est nécessaire de former une barrière aux liquides tout en permettant le transfert de phases gazeuses, en particulier de molécules d'intérêt à l'état gazeux.
Un domaine d'application particulièrement préféré de cette membrane, qui sera plus particulièrement détaillé dans la présente description, bien que nullement limitatif, est celui de l'élevage in vitro d'arthropodes, notamment dits piqueurs-suceurs, entomophages ou parasitoïdes, en particulier en vue de l'utilisation d'insectes dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales.
A l'heure actuelle, le principal instrument de lutte contre les insectes ravageurs des cultures et les vecteurs de maladies humaines et animales est la mise en œuvre d'insecticides chimiques. Ces composés ont incontestablement participé à l'amélioration des rendements agricoles et au contrôle de plusieurs maladies vectorielles. Pour autant, leur utilisation massive et exclusive dans les champs est à l'origine de problèmes sanitaires et écologiques si préoccupants qu'ils ont conduit plusieurs pays à mener une politique de réduction des quantités d'insecticides utilisés. De même, l'emploi d'insecticide dans la lutte contre les maladies vectorielles montre des limites, en particulier à cause de l'apparition de résistances chez les insectes vecteurs. De telles maladies vectorielles, notamment le paludisme et la dengue, font plusieurs centaines de milliers de victimes chaque année, principalement en Afrique et en Inde. Les agents pathogènes responsables de ces maladies sont véhiculés et transmis à l'homme par des moustiques du genre Aedes, que des décennies de lutte chimique ont rendus résistants à la plupart des familles d'insecticides. Des alternatives aux insecticides ont ainsi été développées, reposant sur l'utilisation d'organismes prédateurs ou entomopathogènes, couramment appelés auxiliaires des cultures. L'utilisation de tels auxiliaires de culture dans les exploitations conduites en agriculture biologique offre plusieurs avantages. Ces auxiliaires de culture ont en effet une bonne capacité de dispersion, de découverte de l'hôte et d'établissement dans un nouvel habitat. De plus, ils sont d'une innocuité totale pour l'homme et ont une grande spécificité d'hôte, donc présentent peu de risques vis-à-vis des organismes non-cibles. Sur un plan sanitaire, des expérimentations ont montré que la lutte biologique à l'aide d'insectes parasitoïdes constituait également un moyen avantageux pour pallier l'apparition de résistances aux insecticides chez les insectes vecteurs de maladies.
L'utilisation des insectes parasitoïdes auxiliaires représente donc un potentiel considérable. Cependant, à l'heure actuelle, seules quelques dizaines d'espèces d'insectes parasitoïdes sont réellement utilisées à ces effets, car leur élevage s'avère difficile à réaliser. Dans la plupart des cas, les traitements sont en outre effectués par lâchers inondatifs consistant à disperser massivement (à raison de plusieurs centaines de milliers d'individus par hectare) et régulièrement des auxiliaires à l'état larvaire ou adulte dans la culture à protéger. Les lâchers inondatifs nécessitent par conséquent un grand nombre d'individus, faisant de l'élevage en masse de parasitoïdes un prérequis indispensable au développement de leur utilisation.
Des méthodes d'élevage en masse d'insectes parasitoïdes existent mais leur mise en œuvre implique des contraintes techniques ne permettant pas de les commercialiser à bas prix. En effet, ces méthodes de production prévoient l'élevage des insectes parasitoïdes en laboratoire sur leur hôte naturel ou sur un hôte de substitution. Or l'obtention et l'élevage des insectes hôtes présentent des difficultés techniques, qui exacerbent les coûts de production.
Pour pallier ces difficultés et diminuer les coûts de productions, il a été proposé par l'art antérieur d'élever des insectes parasitoïdes in vitro sur des hôtes synthétiques permettant l'oviposition et/ou le nourrissage des larves. De tels hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur consistent principalement en des capsules contenant un milieu nutritif dans une membrane de Parafilm® ou dans des gangues constituées par un mélange hydrophobe incluant divers matériaux tels que de la cire, du Paraplast®, de la vaseline, des alcènes ou du polyéthylène. On peut citer, à titre d'exemple, le système décrit dans le document de brevet WO 03/000047, qui se présente sous forme de billes biopolymères, notamment en chitosan, contenant une solution nutritive. Aucun de ces systèmes synthétiques reproduisant l'hôte naturel ne présente cependant de performance satisfaisante. En effet, aucun ne combine l'ensemble des caractéristiques nécessaires à la mise en place de conditions d'élevage optimales, c'est-à-dire ne permet à la fois : d'isoler de l'environnement extérieur, par une barrière étanche, le milieu nutritif adapté au nourrissage, de sorte à préserver son degré d'hydratation et sa stérilité ; d'autoriser le transfert à travers cette barrière de composés olfactifs, stimulateurs de l'oviposition pour la fondatrice et/ou appétants pour la larve, que doit contenir ce milieu, pour permettre que le système soit reconnu comme hôte potentiel ; d'autoriser la pénétration à travers cette barrière d'un appareil ovipositeur ou piqueur-suceur de faible puissance et de petite longueur, pouvant être aussi faible que 10 μιτι. Il a en particulier été constaté que des membranes présentant une épaisseur importante ne pouvaient être percées par les chélicères de certains arthropodes.
La présente invention vise à proposer une membrane étanche aux liquides et perméable aux gaz, qui permette en outre, mise en œuvre dans un système synthétique d'élevage des arthropodes, en particulier d'insectes ou d'arachnides, pour séparer un milieu nutritif de l'environnement extérieur dans lequel se trouve l'arthropodes, de remédier aux inconvénients des systèmes d'hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur, notamment à ceux exposés ci-avant. En particulier, la présente invention vise à ce que cette membrane permette l'oviposition et/ou le nourrissage d'arthropodes, y compris pour les espèces dont l'appareil ovipositeur et/ou piqueur-suceur est de faible puissance et de petite longueur.
Un objectif supplémentaire de l'invention est que cette membrane présente un coût de production faible, en particulier de sorte à permettre que le coût de production d'un système synthétique pour l'élevage in vitro des arthropodes dans lequel elle est mise en œuvre, soit inférieur à celui d'un hôte naturel ou de substitution.
A cet effet, il est proposé selon la présente invention une membrane étanche aux liquides, en particulier aux solutions aqueuses, et perméable aux gaz, qui comporte un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μιτι imprégné, de préférence sensiblement entièrement, d'au moins un composé hydrophobe, cette imprégnation étant de préférence sensiblement continue, sur toute la surface du film de chitosan.
On entend dans la présente description, par le terme « imprégné », le fait que le film de chitosan a été soumis à imprégnation par le composé hydrophobe. L'imprégnation est ici définie de manière classique en elle-même, comme le fait de faire pénétrer dans une substance un produit qui s'y répand de manière diffuse. Ainsi, selon l'invention, le composé hydrophobe est réparti de manière sensiblement homogène et diffuse dans l'épaisseur du film de chitosan, sur toute la surface de ce dernier, conférant ainsi à ce film des propriétés d'hydrophobie et d'imperméabilité aux liquides. Le taux d'imprégnation du film polymère de chitosan par le ou les composés hydrophobes est de préférence compris entre 5 et 10 μο de composé(s) hydrophobe(s) / mm3 de film.
Le chitosan, copolymère de N-acétylglucosamine et glucosamine, est un polysaccharide linéaire, dérivé désacétylé de la chitine, un biopolymère présent notamment dans les carapaces de crustacés tels que les crabes ou les crevettes. Ce biopolymère présente notamment les avantages d'être naturel, non-toxique, biodégradable et inoffensif pour l'environnement. Dans le contexte particulier de l'application préférentielle de la membrane selon l'invention pour l'élevage d'insectes, il présente en outre l'avantage d'une composition chimique proche de celle de composés entrant dans la constitution des cuticules des insectes. Le terme chitosan est utilisé dans la présente description aussi bien pour désigner le chitosan en lui-même, que ses dérivés tels que des esters, éthers, aminés, amides ou tous autres dérivés formés par interaction avec les groupements hydroxyle ou aminé du chitosan. Le chitosan mis en œuvre pour l'obtention du film polymère selon l'invention présente préférentiellement un degré de désacétylation élevé, notamment supérieur ou égal à 70 %.
Ce film polymère de chitosan, imprégné, sans greffage chimique, du composé hydrophobe, est avantageusement imperméable aux solutions aqueuses et perméable aux gaz, si bien qu'il est apte à permettre le transfert à son travers de molécules volatiles à l'état gazeux.
Sa faible épaisseur, inférieure à 1 μιτι, de préférence comprise entre 90 et 200 nm, de préférence encore comprise entre 90 et 130 nm, et préférentiellement sensiblement égale à 100 nm, associée aux propriétés mécaniques du film de chitosan, lui permet notamment de pouvoir être facilement transpercé par des chélicères peu puissants et de courte taille, aussi faible que 10 μιτι.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le film polymère de chitosan peut en outre être imprégné d'un ou plusieurs composés d'intérêt, par exemple stimulant l'oviposition et/ou appétants, tels que des alcanes, des acides gras, des produits du métabolisme des insectes, etc.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le composé hydrophobe est choisi parmi les polymères styréniques, en particulier le polystyrène, et les alcanes, de préférence les alcanes en C20 à C40. Préférentiellement, le film polymère de chitosan est imprégné d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de cire d'abeille, ou d'un mélange de paraffines tel que commercialisé sous le nom Paraplast®.
La membrane selon l'invention peut être conformée sous toute forme souhaitée, aussi bien plane que courbe. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le film polymère de chitosan est superposé sur une couche support en matériau absorbant apte à interdire sa rétraction, de préférence à base de fibres cellulosiques. Elle présente de préférence un maillage suffisamment lâche pour permettre la pénétration d'un appareil ovipositeur et/ou piqueur suceur d'un arthropode. Une telle couche support, qui peut par exemple être constituée par une feuille du papier commercialisé sous le nom Whatman®, permet notamment tout à fait avantageusement d'éviter une rétraction du film de chitosan sous l'effet d'une éventuelle déshydratation. La membrane ainsi obtenue est en outre facilement manipulable, et ce malgré la très faible épaisseur du film de chitosan.
La membrane selon l'invention peut avantageusement être fabriquée à bas coût, et elle présente une bonne stabilité dans le temps.
Un objet supplémentaire de l'invention est un procédé de fabrication d'une membrane présentant l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. Une membrane selon l'invention est susceptible d'être obtenue par un procédé de fabrication comprenant les étapes de :
- formation d'un film polymère de chitosan à partir d'une solution aqueuse acide de chitosan contenant un agent tensioactif, ou un mélange d'agents tensioactifs, dans une concentration suffisante pour obtenir, après traitement en conditions basiques, entraînant la déprotonation des groupements aminés du chitosan et conférant ainsi à ce dernier un caractère insoluble dans la solution aqueuse, un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μιτι,
- et imprégnation du film de chitosan ainsi obtenu par une solution, de préférence une solution liquide, contenant ledit/lesdits composé(s) hydrophobe(s).
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la solution aqueuse, par exemple une solution d'acide acétique, comprend une concentration comprise entre 2 et 30 mg/ml, de préférence sensiblement égale à 2,5 mg/ml, de chitosan. Elle présente de préférence une faible viscosité, préférentiellement inférieure à 200 mPa.s.
L'agent tensioactif, ou le mélange d'agents tensioactifs, est avantageusement mis en œuvre dans une concentration apte à permettre une diminution de la tension de surface de la solution aqueuse suffisante pour assurer que lorsque la solution est étalée sur une surface, et séchée pour former le film de chitosan, la quantité de chitosan déposée par unité de surface soit suffisamment faible pour que le film présente la très faible épaisseur conforme à l'invention. Il est du ressort de l'homme du métier de déterminer une telle concentration, de manière théorique ou expérimentale, en fonction de la concentration en chitosan dans la solution aqueuse acide et des caractéristiques particulières du ou des agent(s) tensioactif(s) mis en œuvre.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'agent tensioactif est de type non-ionique. Il peut notamment consister en un éthoxylate d'octylphénol, par exemple tel que commercialisé sous le nom Triton X-100®. Cet agent tensioactif abaisse la tension superficielle de l'eau de 33 dynes/cm à une concentration de 1 % à 25 °C. Un tel agent tensioactif est préférentiellement mis en œuvre dans une concentration comprise entre 50 et 100 ng/ml de solution, de préférence d'environ 60 ng/ml. Le choix d'un tel agent tensioactif particulier n'est cependant nullement limitatif de l'invention, et d'autres agents tensioactifs ou mélanges d'agents tensioactifs peuvent être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. Pour l'application préférentielle de la membrane pour l'élevage d'arthropodes, le ou les agent(s) tensioactif(s) sont avantageusement choisis pour ne présenter aucune toxicité, à l'état de traces, pour l'arthropode à élever. Le traitement en conditions basiques peut notamment être réalisé par une solution d'hydroxyde de sodium. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la solution contenant le ou les composé(s) hydrophobes contient une concentration totale en lesdits composés comprise entre 1 et 10 mg/ml. L'imprégnation, qui constitue un traitement en masse du film de chitosan, peut notamment être réalisée par immersion du film de chitosan dans un bain de solution contenant le ou les composé(s) hydrophobe(s), pendant une durée de quelques minutes, par exemple d'environ 2 minutes, suffisamment longue pour assurer une répartition homogène du ou des composé(s) hydrophobe(s) qui se diffusent dans toute l'épaisseur du film de chitosan, sur toute la surface de ce dernier, et pour conférer au film de chitosan un caractère étanche aux liquides.
La mise en présence du film de chitosan avec cette solution est préférentiellement précédée d'une étape de déshydratation progressive de ce film, par exemple par trempage dans des bains successifs de solutions alcooliques, puis dans un bain d'un solvant organique apolaire, tel que l'hexane.
Dans des modes de mise en œuvre particulièrement avantageux de l'invention, le procédé de fabrication de la membrane comporte en outre des étapes ultérieures de :
- déploiement du film de chitosan imprégné par le/les composé(s) hydrophobe(s), par immersion dans une solution aqueuse ;
- dépôt du film ainsi déployé sur la couche support, cette étape étant réalisée en immersion dans la solution aqueuse,
- et séchage de la membrane ainsi obtenue.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'immersion du film dans la solution aqueuse est suivie par l'addition dans cette dernière d'un composé de densité inférieure à celle de l'eau, de préférence inférieure d'au moins 0,14. Une telle caractéristique a avantageusement pour effet d'accélérer le déploiement du film de chitosan imprégné du/des composé(s) hydrophobe(s). Un tel composé de plus basse densité que l'eau est de préférence choisi pour présenter une bonne miscibilité avec l'eau. Il peut par exemple s'agir d'un alcool, tel que l'éthanol, en solution aqueuse à 50 à 70 % (v/v). Lors de son addition dans la solution aqueuse, il se crée avantageusement, et de manière transitoire, une interface eau/alcool dans la solution, qui a pour effet d'amener très rapidement le film de chitosan à la surface de solution, dans un état totalement déployé, facilitant ainsi son dépôt sur la couche support.
Un tel procédé de préparation est avantageusement simple et rapide à réaliser, qui plus est de manière bien reproductible, et à faible coût.
Le séchage peut le cas échéant être suivi d'une étape de chauffage à une température comprise entre 70 et 75 °C, pendant une durée comprise entre 30 secondes et 20 minutes environ, puis, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, d'une étape de refroidissement à la température ambiante, avant son stockage à l'abri de la lumière.
La membrane conforme à l'invention présente un large champ d'applications.
Ainsi, un objet de la présente invention est l'utilisation d'une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, dans le domaine de la chimie séparative, pour l'extraction de molécules volatiles contenues dans un liquide. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, pour l'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, en vue notamment de produire une grande quantité d'insectes dits auxiliaires utilisables dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales. Autrement, cet élevage peut par exemple être réalisé pour l'étude des interactions entre un parasite et son hôte, visant notamment à développer des moyens pour rendre le parasite inoffensif vis-à- vis de son hôte naturel.
On entend dans la présente description, par le terme élevage, aussi bien l'obtention de larves à partir d'une fondatrice, que le nourrissage de cette fondatrice et/ou des larves, jusqu'à les amener au stade de développement souhaité, notamment au stade adulte. Les individus ainsi élevés peuvent notamment être utilisés pour la réalisation de lâchers inondatifs sur des zones de culture et/ou dans lesquelles sont susceptibles de se développer des insectes vecteurs de maladies.
Selon l'invention, la membrane est alors interposée entre une chambre de contention de l'arthropode et un milieu nutritif pour cet arthropode, de sorte à assurer un confinement étanche du milieu nutritif. Elle joue ainsi un rôle de barrière hydrique et antimicrobienne préservant le degré d'hydratation et la stérilité du milieu nutritif. Elle permet toutefois avantageusement aux molécules volatiles contenues dans ce milieu nutritif, notamment aux molécules olfactives stimulantes de l'oviposition et/ou appétantes, de parvenir à l'arthropode contenu dans la chambre de contention. Enfin, les caractéristiques mécaniques et la grande finesse du film de chitosan permettent à tout arthropode contenu dans la chambre de contention de le transpercer pour accéder au milieu nutritif.
Le milieu nutritif peut avantageusement être complémenté par toute molécule d'intérêt, en vue d'étudier son action vis-à-vis de l'arthropode contenu dans la chambre de contention.
La présente invention concerne ainsi un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, comportant une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, interposée entre une chambre de contention de l'insecte et un milieu nutritif.
Le milieu nutritif est de préférence gélifié.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le film de chitosan est disposé du côté de la chambre de contention, c'est-à-dire en vis-à- vis de l'arthropode, de sorte à pouvoir être facilement transpercé par l'appareil ovipositeur ou piqueur-suceur de ce dernier. La couche support est alors quant à elle disposée en vis-à-vis du milieu nutritif, de préférence en contact direct avec ce dernier. Son caractère absorbant lui permet alors de s'imprégner, par effet de capillarité, du milieu liquide. Lorsque l'arthropode n'est pas capable de transpercer entièrement cette couche support, il peut alors avantageusement absorber les éléments nécessaires à son bon nourrissage directement depuis cette couche support.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la chambre de contention est enduite, sur une face interne d'une paroi périphérique qui la délimite, d'un revêtement à base d'au moins un composé hydrophobe, de préférence à base d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de Paraplast®. Ce revêtement participe avantageusement à recréer pour l'arthropode un environnement proche de son environnement naturel. Dans des modes de réalisation particuliers du système selon l'invention, le milieu nutritif contient en outre un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille.
La membrane et le système selon l'invention peuvent être mis en œuvre pour l'élevage d'une grande variété d'arthropodes, par exemple, mais non limitativement, de parasitoïdes de la famille des Trichogrammes ( Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens, Trichogramma voegelei, Trichogramma chilonis,...), du genre des Toxorhynchites (Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis), des Psyttalia lounsburyi, Venturia canescens, Lariophagus distinguendus, Torymus sinensis, Psyttalia fletcheri, Fopus arisanus, ou encore de l'acarien ectoparasite Varroa destructor, principal parasite de l'abeille.
Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 7, dans lesquelles :
- la figure 1 représente une vue en section transversale d'un film polymère de chitosan entrant dans la constitution d'une membrane conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit film de chitosan étant imprégné de Paraplast®, observé par un microscope électronique à balayage (MEB), à un grossissement de 149 773 fois ; - la figure 2 montre le film de chitosan de la figure 1 en vue de dessus, côté couche de surface, observé au MEB à un grossissement de 159 022 fois ;
- la figure 3 représente de manière schématique, en coupe selon un plan longitudinal, un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode conforme à un mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 4 montre une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor en cours de nourrissage à travers le film de la figure 1 superposé sur une feuille de papier Whatman®, observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;
- la figure 5 montre une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor prélevée après 48 heures d'incubation à 34 °C et 65 % d'humidité relative dans la chambre de contention d'un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans lequel le milieu nutritif a été additionné de bleu brillant FCF, cette femelle étant observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;
- la figure 6 montre l'intérieur d'une chambre de contention d'un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans lequel le milieu nutritif a été additionné de bleu brillant FCF, et dans lequel une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor a été incubée pendant 48 heures à 34 °C et 65 % d'humidité relative dans la chambre de contention, ladite chambre de contention étant observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;
- et la figure 7 est un graphe en barres illustrant le pourcentage de femelles adultes de l'espèce Varroa destructor ayant été nourries après
48 heures d'incubation, à 34 °C et 65 % d'humidité relative, dans des systèmes pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon différents modes de réalisation particuliers de l'invention, plus particulièrement dans lesquels : A/Po, la chambre de contention n'est intérieurement enduite d'aucun revêtement et le film de chitosan est imprégné de polystyrène ; A/Po/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille ; C/C, la chambre de contention est intérieurement enduite d'un revêtement de cire d'abeille et le film de chitosan est imprégné de cire d'abeille ; C/C/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille ; Pa/Pa, la chambre de contention est intérieurement enduite d'un revêtement de Paraplast® et le film de chitosan est imprégné de Paraplast® ; Pa/Pa/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille.
1 / Préparation de la membrane Un film de chitosan imprégné de composés hydrophobes, conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, est formé de la façon suivante.
Une solution aqueuse acide de chitosan comprend, en solution dans de l'eau ultra-pure :
- 2,5 mg/ml d'une solution de chitosan extrait de carapaces de crevettes dans l'acide acétique, de viscosité inférieure à 200 mPa.s
(20 °C) (Sigma Aldrich),
- 60 ng/ml de Triton X100® (Sigma).
Après dégazage sous pression réduite, cette solution est coulée dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre. L'excédent de solution est rejeté de sorte à ce qu'il ne subsiste dans la boîte que le liquide qui la mouille. La boîte est ensuite maintenue sous une hotte à flux laminaire, pendant 45 min, jusqu'à séchage complet.
Une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M est ensuite versée sur le chitosan, puis le film ainsi formé est rincé 3 fois pendant 2 min avec un grand volume d'eau distillée et sous agitation rotative (100 tr/min) afin d'éliminer l'excédent de soude et de Triton X100®.
Le film polymère de chitosan est ensuite déshydraté progressivement par une série de trempages de 2 min chacun dans des bains d'éthanol à 70 %, puis à 95 %, puis pur. Le film ainsi traité est transféré dans un bain d'hexane afin d'éliminer l'éthanol. Il est ensuite plongé soit dans un bain d'hexane contenant 10 g/l de cire d'abeille (APIREM) ou 10 g/l de Paraplast® (Sigma), soit dans un bain de chloroforme contenant 10 g/l de polystyrène. Le film de chitosan ainsi imprégné des composés hydrophobes entrant dans la constitution du Paraplast® est observé au microscope électronique à balayage, sous pression réduite, au moyen d'un microscope ESEM Quanta® 250 FEG (FEI), après revêtement par du platine au moyen d'un pulvérisateur d'ions JFC-1 100 (JEOL). Les images obtenues sont montrées sur les figures 1 et 2. Sur la figure 1 , en vue en section transversale obtenue par MEB, il est représenté par des traits blancs les zones dans lesquelles l'épaisseur du film a été mesurée. On observe que l'épaisseur du film est toujours comprise entre 105,9 nm (trait du bas sur la figure) et 109,6 nm (trait du haut sur la figure). Sur la figure 2, en vue de dessus, obtenue par MEB et également pour une imprégnation du film par du Paraplast®, on observe que le film est dépourvu de pores et présente à sa surface des structures cristallines caractéristiques de sels et d'alcanes.
Le film est ensuite transféré dans un bain d'eau distillée. Une solution d'éthanol à 70 % est versée sur le film afin de le déployer. Le film est alors déposé, toujours en immersion dans le bain, sur une couche support, par exemple formée par une feuille de papier Whatman®, qui est introduite dans le bain et remontée en direction du film. Le film ainsi superposé sur la couche support est séché sous hotte à flux laminaire et incubé à 70 °C pendant 15 min. La membrane ainsi obtenue est ensuite stérilisée, soit par immersion pendant 5 min dans de l'alcool à 70 %, soit par exposition pendant 15 min aux rayons UVC. Elle est ensuite stockée pendant environ 12 h à température ambiante et à l'obscurité, pour permettre l'évaporation des traces de solvants résiduelles. Elle est ensuite stockée à température ambiante, à l'abri de la lumière et au sec, jusqu'à utilisation. 21 Système d'élevage in vitro d'un arthropode piqueur-suceur Un exemple de système pour l'élevage in vitro d'un arthropode piqueur-suceur, conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, est illustré de façon schématique sur la figure 3.
Ce système comporte une chambre de contention 10 destinée à recevoir un arthropode 1 1 .
Cette chambre peut être formée en tout matériau compatible avec une utilisation pour l'élevage d'insectes, par exemple en polystyrène.
Elle est de préférence délimitée par une paroi périphérique 101 , de section par exemple circulaire, et ouverte à ses extrémités longitudinales opposées. Cette chambre de contention 10 peut notamment être formée par des sections de 5 millimètres de long environ et de 2,5 mm de diamètre interne, coupées dans une pipette de 1 ml en polystyrène pour culture cellulaire. Ces sections sont préalablement poncées à leurs extrémités longitudinales, pour obtenir des extrémités planes et dépolies. Sur la face interne 102 de la paroi périphérique 101 , la chambre de contention peut être enduite d'un revêtement à base d'au moins un composé hydrophobe, de préférence à base d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de cire d'abeille (APIREM) ou de Paraplast® (Sigma). Pour cela, la paroi 101 est immergée dans un bain chauffé à environ 72 °C et contenant la cire d'abeille ou le Paraplast®, ou tout autre composé hydrophobe souhaité.
Après retrait du bain, elle est placée sur du papier absorbant et chauffée à environ 72 °C pendant 5 minutes afin de permettre l'écoulement de l'excès de cire d'abeille, Paraplast® ou autre composé(s) mis en œuvre pour la formation du revêtement. A une première extrémité longitudinale, la chambre de contention 10 est fermée par une membrane 12 conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, notamment telle que décrite ci-avant. Pour une meilleure lisibilité de la figure, la membrane 12, de même que la paroi périphérique 101 de la chambre de contention, y ont été représentées avec une certaine épaisseur, qui ne reflète nullement leurs dimensions réelles. La membrane 12 est disposée par rapport à la paroi périphérique 101 de telle sorte que le film de chitosan imprégné des composés hydrophobes soit disposé vers l'intérieur de la chambre de contention 10, alors que la feuille de papier formant la couche support du film est disposée à l'opposé de la chambre. La fixation de la membrane 12 à l'extrémité de la chambre de contention 10 peut être réalisée par collage, par exemple par de la cire d'abeille ou du Paraplast®. De manière générale, ces matériaux participent avantageusement à ce que la chambre de contention 1 0 reproduise pour l'arthropode, en particulier de l'espèce Varroa destructor, acarien parasite de l'abeille, des conditions très proches de son environnement naturel.
La chambre de contention 10, fermée à une extrémité par la membrane 12, est de préférence stérilisée, par exemple par immersion dans un bain d'une solution d'alcool, et séchée sous hotte à flux laminaire préalablement à sa mise en œuvre. Après introduction d'un arthropode 1 1 , par exemple de l'espèce Varroa destructor, dans la chambre de contention 10, en prenant garde de ne pas contaminer la surface extérieure de cette dernière, la chambre est fermée à une deuxième extrémité longitudinale par tout moyen adéquat compatible avec l'élevage de l'arthropode, notamment apte à permettre les échanges gazeux entre le volume interne de la chambre de contention et l'environnement extérieur et à interdire toute fuite de l'arthropode. A titre d'exemple, il est utilisé pour la fermeture de la chambre de contention 10 un disque 13 de papier Whatman®, par exemple de 3 mm de diamètre. La fixation de ce disque de papier 13 à la paroi périphérique 101 peut être réalisée par collage, par tout moyen classique en lui-même, par exemple par un disque 14 de diamètre adéquat, par exemple d'environ 4 mm, d'adhésif tel que l'adhésif Scotch® crystal, percé en son centre par un trou d'environ 2 mm de diamètre. Pour des raisons de clarté, ce disque d'adhésif 14 a été représenté sur la figure 3 légèrement décollé de la paroi périphérique 101 et du disque de papier 13. Dans la réalité il est bien entendu plaqué contre ces derniers. Un milieu nutritif 15 adapté au nourrissage de l'arthropode, de préférence gélosé, est placé dans un réceptacle 16. La chambre de contention 10, fermée à ses deux extrémités longitudinales opposées comme décrit ci- avant, et contenant un arthropode à élever 1 1 , est déposée sur ce milieu nutritif 15, de telle sorte que la couche support soit en contact avec le milieu, si bien qu'elle absorbe le liquide qui y est contenu par effet de capillarité.
3/ Expérience 1 - Nourrissage d'une femelle Varroa destructor adulte
Une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor est obtenue à partir d'un élevage sur des colonies d'abeilles Apis mellifera, dans des conditions classiques en elles-mêmes. Cette femelle présente un appareil piqueur-suceur d'environ 10 μιτι de long et de faible puissance.
Cette femelle est placée dans un système tel que décrit ci-avant en référence à la figure 3.
Le milieu nutritif est formé de la façon suivante. On utilise du milieu de culture développé par Hunter (Hunter, W.B.,
2010. In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal, 46, 83-6) pour cultiver des cellules d'abeilles. Ce milieu contient 30 % de milieu de Schneider, 30 % de CMRL 1066, 0,06 M d'histidine, 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de sels de Hank et 4 % d'insect médium supplément. Ce milieu est supplémenté par 25 % (v/v) d'extrait d'hémolymphe de larve d'abeille au stade L5, obtenu par filtration centrifuge sur membrane d'une porosité de 3000 Da, la centrifugation étant réalisée pendant 15 min à 12 000 g, et récupération du filtrat. Enfin, le milieu est incubé à 45 °C et additionné de 20 % d'une solution d'agarose à 20 g/l, contenant 0,8 % (v/v) de bleu brillant FCF, préchauffée à 45 °C.
80 μΙ de ce milieu gélosé sont placés dans un réceptacle 16, par exemple dans un puits d'une plaque à 96 puits, classique en elle-même. Une chambre de contention 10, dans laquelle le film entrant dans la constitution de la membrane est imprégné à base de Paraplast®, et contenant l'arthropode, est déposée sur le milieu nutritif gélosé.
L'ensemble est incubé à 34 °C et 60 % d'humidité relative, dans l'obscurité, incliné à 60 degrés par rapport à l'horizontale.
On observe qu'il ne se produit aucun transfert de liquide du milieu nutritif vers la chambre de contention, à travers la membrane. Ceci s'avère d'autant plus avantageux que les individus de l'espèce Varroa destructor présentent un tropisme négatif vis-à-vis des surfaces humides, et se noient en quelques minutes en présence d'un environnement humide.
A l'observation à la loupe, on observe que la femelle se nourrit en piquant à travers le film de chitosan, comme montré sur la figure 4. On voit parfaitement sur cette figure que ses pédipalpes sont en position physiologique, perpendiculaire à l'axe de l'appareil piqueur-suceur. Ceci démontre notamment que la membrane conforme l'invention permet le transfert des odeurs stimulant le nourrissage en provenance du milieu nutritif. Après perçage du film de chitosan, la femelle se nourrit pendant 1 à 5 minutes, ce qui est conforme à un nourrissage normal.
Après 48 heures d'incubation, la chambre de contention est ouverte. On observe que sa partie supérieure est recouverte de nombreuses fèces provenant de l'acarien, dont la plupart sont colorées au bleu brillant FCF, initialement contenu dans le milieu nutritif, comme montré sur la figure 6. Sur cette figure, les parties colorées au bleu brillant FCF, visibles en sombre, sont mises en évidence par une flèche blanche. Une image obtenue par observation à la loupe de l'insecte lui-même, montrée sur la figure 5, met également en évidence la coloration par le bleu brillant FCF (en sombre sur la figure, comme indiqué par la flèche blanche) du tube digestif de l'insecte. Ces résultats démontrent que du milieu nutritif a bien été absorbé par l'arthropode placé dans le système d'élevage in vitro conforme à l'invention. 4/ Expérience 2 - Effets de l'imprégnation du film de chitosan par des composés hydrophobes, du revêtement interne de la chambre de contention et de la composition du milieu nutritif
Cette expérience est menée sur plusieurs femelles de l'espèce Varroa destructor, selon les conditions décrites ci-avant dans l'Expérience 1 , mais en utilisant des systèmes d'élevage conformes à différents modes de réalisation particuliers de l'invention. Plus particulièrement, les différentes conditions indiquées dans le Tableau 1 ci-après sont appliquées.
Tableau 1 - Conditions d'élevage mises en œuvre - EH représente l'extrait d'hémolymphe de larve d'abeille décrit ci-avant
Pour chaque individu, l'occurrence du nourrissage est évaluée après 48 h d'incubation dans le système selon l'invention, à 34 °C et 65 % d'humidité relative, par observation à la loupe d'une part du système digestif de l'insecte, d'autre part des fèces contenues dans la chambre de contention, en vue d'y détecter la présence ou l'absence de coloration au bleu brillant FCF, comme détaillé dans l'Expérience 1 ci-avant.
Les résultats obtenus, en termes de pourcentage d'individus nourris, par rapport aux individus testés pour chaque condition, sont montrés sur la figure 7. Une étude statistique est en outre réalisée, et les différences entre les groupes d'individus testés, constitués en utilisant la procédure G-test, sont évaluées en utilisant le test du Khi-carré avec correction de Yates.
Les résultats sont montrés dans le tableau 2 ci-après.
Tableau 2 - Résultats des analyses statistiques - G-test et test du Khi carré avec correction de Yates
Ces résultats montrent une hétérogénéité importante entre les 6 différentes conditions expérimentales (Chi2 = 60,39, 5df, p<0,001 ). En suivant la procédure G-test, 3 groupes sont distingués à p=0,05 : {A/Po}; {C/C, Pa/Pa}; {Pa/Pa/H, A/Po/H, C/C/H}. On observe qu'en présence de milieu de culture seul, le pourcentage d'acariens nourris est largement plus faible qu'en présence dans le milieu nutritif d'extrait d'hémolymphe d'abeille. De même, la présence d'un revêtement interne à base d'alcanes dans la chambre de contention augmente de manière significative le pourcentage d'individus nourris. Ces résultats montrent notamment que des substances stimulantes, ici l'extrait d'hémolymphe d'abeille, peuvent être incluses dans le système d'élevage selon l'invention. Ce système présente ainsi une performance élevée en terme de nourrissage des arthropodes. En particulier, la membrane selon l'invention reproduit efficacement l'interface parasite/hôte, y compris pour l'élevage d'arthropodes parasites très exigeants en termes de spécificité d'hôte et de résistance de la membrane, que sont les individus de l'espèce Varroa destructor. La description ci-avant illustre clairement que par ses différentes caractéristiques et leurs avantages, la présente invention atteint les objectifs qu'elle s'était fixés. En particulier, elle fournit une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz, facile et rapide à fabriquer et à bas coût, et qui est notamment tout à fait adaptée pour une mise en œuvre dans un système artificiel d'élevage in vitro d'arthropodes piqueurs-suceurs, en séparation de l'arthropode et de son milieu nutritif.

Claims

REVENDICATIONS
1. Membrane étanche aux liquides et perméable aux gaz, caractérisée en ce qu'elle comporte un film polymère de chitosan, d'épaisseur inférieure à 1 μιτι, imprégné d'au moins un composé hydrophobe.
2. Membrane selon la revendication 1 , dans laquelle ledit composé hydrophobe est choisi parmi les polymères styréniques et les alcanes, de préférence les alcanes en C20 à C40.
3. Membrane selon l'une des revendications 1 à 2, dans laquelle le film polymère de chitosan est imprégné d'un mélange d'alcanes en C20 à C40.
4. Membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le film polymère de chitosan est superposé sur une couche support en matériau absorbant apte à interdire la rétraction dudit film de chitosan, de préférence à base de fibres cellulosiques.
5. Membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le film polymère de chitosan présente une épaisseur comprise entre 90 et 200 nm.
6. Membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le film polymère de chitosan présente une épaisseur comprise entre 90 et 130 nm.
7. Procédé de fabrication d'une membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant les étapes de :
- formation d'un film polymère de chitosan à partir d'une solution aqueuse acide de chitosan contenant un agent tensioactif dans une concentration suffisante pour obtenir, après traitement en conditions basiques, un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μιτι, - et imprégnation du film de chitosan ainsi obtenu par une solution contenant ledit/lesdits composé(s) hydrophobe(s).
8. Procédé selon la revendication 7, selon lequel ledit agent tensioactif est de type non-ionique, et consiste de préférence en un éthoxylate d'octylphénol.
9. Procédé selon l'une des revendications 7 à 8, comportant en outre des étapes ultérieures de :
- déploiement du film de chitosan imprégné par ledit/lesdits composé(s) hydrophobe(s) par immersion dans une solution aqueuse, de préférence suivie par l'addition dans ladite solution aqueuse d'un composé de densité inférieure à celle de l'eau,
- dépôt dudit film ainsi déployé sur ladite couche support, en immersion dans ladite solution aqueuse,
- et séchage de la membrane ainsi obtenue.
10. Utilisation d'une membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour l'élevage in vitro d'un arthropode, selon laquelle ladite membrane (12) est interposée entre une chambre de contention (10) dudit arthropode (1 1 ) et un milieu nutritif (15).
11. Système pour l'élevage in vitro d'un arthropode, comportant une membrane (12) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 interposée entre une chambre de contention (10) dudit arthropode (1 1 ) et un milieu nutritif (15), de préférence gélifié.
12. Système selon la revendication 10, dans lequel ladite chambre de contention (10) est enduite, sur une face interne (102) d'une paroi périphérique (101 ) qui la délimite, d'un revêtement à base d'au moins un composé hydrophobe, de préférence à base d'un mélange d'alcanes en C20 à C40.
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