EP2941441A1 - Verfahren zur herstellung von sekretierbaren antikörpern durch expression in saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Verfahren zur herstellung von sekretierbaren antikörpern durch expression in saccharomyces cerevisiae

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EP2941441A1
EP2941441A1 EP13802890.7A EP13802890A EP2941441A1 EP 2941441 A1 EP2941441 A1 EP 2941441A1 EP 13802890 A EP13802890 A EP 13802890A EP 2941441 A1 EP2941441 A1 EP 2941441A1
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EP
European Patent Office
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protein
vhh
domain
cells
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13802890.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Guenther
Bjoern Hock
Stefan Becker
Laura RHIEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Priority to EP13802890.7A priority Critical patent/EP2941441A1/de
Publication of EP2941441A1 publication Critical patent/EP2941441A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)

Definitions

  • the invention also relates to methods for presenting antibodies or
  • Antibody libraries on the surface of yeast cells and screening these libraries for immunoglobulins with certain desired properties.
  • phage display The most common technique for generating and screening antibody libraries has been and still is, in part, still the "phage display" method whereby the particular protein of interest as a fusion polypeptide can be expressed on a bacteriophage coat protein and selected by binding to immobilized or soluble biotinylated ligands , A phage constructed in this way can be considered as a compact genetic entity, which is both phenotypic and genotypic
  • Antibody fragments, enzymes, DNA binding proteins, etc. have been used. Antibodies possessing desired binding properties are linked by binding to
  • phage display technology has some inherent shortcomings and difficulties that its Use limited, especially in the production of eukaryotic proteins. For example, very high-affinity antibodies are difficult to isolate by panning and continue to process. In addition, post-translational changes such as glycosylation, which may affect specificity and affinity of the antibody, with phage display
  • 6,699,658 describes a yeast cell surface presentation method that has made it possible to screen and generate combinatorial antibody libraries.
  • Said "yeast surface display” technology is based on the transfection of yeast cells with vectors expressing an immunoglobulin fused to a yeast cell wall protein using mutagenesis to generate a variety of immunoglobulin mutants and then sequencing these cells to select the desired phenotypic properties.
  • This technology was established in 1997 by Boder and Wittrup. For the first time, they were able to functionally present scFv fragments of a combinatorial library on the surface of yeast cells, to screen them by flow cytometry, and to isolate scFv fragments with increased affinity for the antigen. This was made possible by the stable coupling of genotype and phenotype, since the scFv fragment as
  • Fusion protein was presented with a yeast-own cell wall protein. Perhaps the most important achievement of using yeast-based display technology is the direct applicability of fluorescence-activated cell sorting (FACS), which is critical in the efficient screening of large variant libraries. Stable genotype-phenotype coupling is achieved by fusing a heterologous protein to proteins of the outer cell wall of S. cerevisiae. The resulting exposure of the protein is the prerequisite for interaction with antigens.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • WO 2010/005863 describes a corresponding Yeast-Surface Display system based on yeast cells of the genus Pichia pastoris, in which the immunoglobulin is non-covalently bound to the ZZ domain of protein A, wherein the fusion protein from the cell wall protein agglutinin or its subunits and the ZZ domain and that
  • Immunoglobulin is only simultaneously expressed in the yeast cell and secreted to be presented on the cell surface when corresponding different promoters for expression of said proteins are chronologically properly turned on or off.
  • the invention relates to the development of a non-covalent method
  • the non-covalent mode of surface presentation is intended to facilitate selection of specific variants by high throughput screening and subsequent switchable secretion of the selected binding molecule into the culture supernatant
  • VHH-Fc fusion proteins and more complex proteins, such as whole antibodies in their final application-specific format on the surface of yeast cells in order to be able to apply methods of protein engraftment. Subsequently, the selected clone can be used directly for the production of the protein.
  • the invention thus provides a method for producing a variety of IgG molecules, such as antibodies, biologically active antibody fragments or
  • Antibody domains having particular properties by expression, secretion and presentation thereof on the surface of yeast cells, the process according to the invention comprising the steps of:
  • Cell surface anchored fusion protein are bound in non-covalent form, on the surface of the yeast cells,
  • Fusion protein from the cell wall protein and the Fc binding domain are regulated, preferably by the GAL1 promoter, while the IgG olekül, for example, the VHH-Fc fusion protein is permanently constitutively expressed, regardless of the expression of the other protein comprising the Fc binding domain ,
  • aggiutinin in particular a-agglutinin is used as a cell wall anchor protein.
  • This binds with its subunit agalp directly to the cell wall.
  • the fusion protein of the invention which is expressed in the yeast cell and binds to agal p via disulfide bridges, comprises the second subunit of aggiutinin, aga2p, which is C-terminally linked to the ZZ domain from protein A.
  • the invention thus further relates to a corresponding method in which the cell surface anchor protein is a-agglutinin or alpha-agglutinin, and the fusion protein comprises aga2p and an Fc-binding domain, preferably the ZZ-domain of protein A from Staphylococcus aureus.
  • the invention thus relates in particular to a method in which the expression (and secretion) of the ZZ domain fusion protein and aga2p is regulated by the GAL1 promoter.
  • the invention furthermore relates, in particular, to a method in which the expression (and secretion) of the antibodies, antibody fragments or antibody domains is under the control of the GAPDH promoter, wherein the expression is constitutive of the expression of the fusion protein from ZZ domain and aga2p subunit.
  • the invention further relates to a corresponding method in which PEG with a molecular weight> 5000, in particular> 7000-8000, preferably PEG8000 is used in the expression / secretion in the expression medium.
  • the invention is ultimately a corresponding method for generating an antibody library for the generation and selection of whole antibodies, Fab fragments or other biologically active antibody domains with selected phenotypic or binding properties.
  • Detailed description of the invention is ultimately a corresponding method for generating an antibody library for the generation and selection of whole antibodies, Fab fragments or other biologically active antibody domains with selected phenotypic or binding properties.
  • the immunoglobulins used in the method of the invention are IgG, IgA, IgE or IgM molecules, but preferably IgG molecules comprising IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the term "transfecting”, “transfection”, “transforming” or “transformation” is used synonymously and according to the invention means the introduction of heterologous nucleic acids (DNA / RNA) into a eukaryotic cell, in particular yeast cells.
  • Antibody fragments are according to the invention functional parts of preferably
  • corresponding biological active fragments are according to the invention to be understood to mean those parts of antibodies which are capable of binding to an antigen, such as Fab, Fab ', Fv, F (ab') 2, and scFv.
  • an Fc-binding domain is a molecule or part of a
  • Molecule preferably a protein or polypeptide, which is capable of covalently or noncovalently binding to an Fc portion of an antibody or portions thereof.
  • the Fc binding domain preferably binds non-covalently to the Fc portion of an antibody or immunogen
  • Methods are e.g. in screening libraries of IgG molecules or diverse Fc fusion proteins to identify proteins with desired ones
  • Cell wall proteins from S. cerevisiae are suitable for the surface presentation of heterologous proteins.
  • Another anchor protein allows the independent choice of the expression strain, since no longer necessarily a strain with chromosomal integration of the Aga1 expression cassette, such as EBY100, must be used. This additionally opens up the possibility of an expression strain suitable for specific requirements of the heterologous protein
  • FIGS. 36 to 39 The plasmid constructions according to the invention are shown in FIGS. 36 to 39. They give only examples, or preferred examples of plasmids and
  • yeast genome To integrate yeast genome to allow more flexible marker selection for soluble secretion and easier generation of molecule libraries. To increase the
  • Staphylococcus aureus Protein A Proteins on the surface of bacteria include proteins that bind to immunoglobulins with high affinity 61 . They differ in their specificity with respect to the host species and the immunoglobulin classes that they can bind. The bacteria are predominantly pathogenic members of the genera Staphylococcus and Streptococcus. The biological function of surface proteins is to mask the bacterial cell with host-specific proteins in order to escape the host's immune system 62 .
  • One of the best-known immunoglobulin-binding bacterial surface proteins is the Staphylococcus aureus protein A, called SpA.
  • domains E, D, A, B and E can also individually mediate binding to Fc moieties and Fab fragments. This results in advantages in particular with regard to the biotechnological use of these domains. Due to the smaller size compared to SpA, the recombinant production of the individual domains is simplified compared to SpA.
  • Domain B is derived from an artificial domain generated in 1987 by an amino acid substitution at position 29 by Nilsson and co-workers 67 . It is called Z domain and shows increased chemical stability. In addition, by the mentioned amino acid substitution, a loss of binding of the Z domain to Fab fragments was achieved.
  • the Z domain exclusively binds the IgG molecules 68 via the Fc part.
  • the Z domain also assumes a structure of three ⁇ helices 69, 70 .
  • the use of a duplicated Z sequence (ZZ domain) results in a stronger binding of the ZZ domain compared to the Z domain for Fc parts.
  • the ZZ domain is a divalent molecule, which enhances Fc binding through an avidity effect compared to the monovalent Z domain 71 .
  • yeast Surface Display The exposure of protein and peptide libraries to the surface of yeast cells is used as a technique for the directed evolution of proteins and is referred to in the literature as "Yeast Surface Display.” This technology was established in 1997 by Boder and
  • Variant libraries is crucial.
  • a stable genotype-phenotype coupling is achieved by fusing a heterologous protein with proteins of the outer cell wall of S. reached cerevisiae. The resulting exposure of the protein is the prerequisite for interaction with antigens.
  • many different cell wall proteins are capable of exposing heterologous proteins and peptides as fusion partners, eg ⁇ -agglutinin and ⁇ -agglutinin, Cwpl p and Flol p 93, 94 .
  • the a-agglutinin system has become particularly established. Currently this system is used in the selection of
  • Antibody fragments could be successfully demonstrated by the surface presentation of Fab fragments on yeast cells 96 .
  • a-aaalutinin system Agglutinins are mating type-specific adhesion proteins of the outer cell wall of S. cerevisiae and mediate cell-cell attachment between haploid yeast cells
  • Yeast cells of mating type a express ⁇ -agglutinin and yeast cells of mating type ⁇ express ⁇ -agglutinin 97 .
  • the cell wall protein a-agglutinin is composed of the subunits Agal p and Aga2p.
  • the subunit Agal p has a GPI anchor signal and mediates attachment of the protein in the extracellular matrix of the cell wall by the covalent attachment of ⁇ -glucan 98 .
  • the subunit Aga2p is also secreted by the cell and is connected to Agal p via two disulfide bridges.
  • the protein to be presented is usually cloned as a C-terminal fusion with the subunit Aga2p into a corresponding expression vector 92 .
  • the recombinant construct translated after the induction of gene expression and presented on the surface is shown schematically in FIG. AGA 1 (agal p) is expressed by a chromosomally integrated galactose-inducible expression cassette.
  • AGA 1 agal p
  • Aga2p the heterologous protein is covalently exposed on the surface of the yeast cell and can be detected by flow cytometry by its binding properties or by affinity epitopes ( Figure 2).
  • the "pYD1 Yeast Display Vector Kit” Invitrogen was commercially available during the present work. Saccharomyces cerevisiae as an expression system
  • Recombinant proteins have long been successfully produced in various host organisms. These include prokaryotic expression systems such as E. coli 00 as well as eukaryotic expression systems such as mammalian cells 101 . Saccharomyces cerevisiae is also suitable for the expression of heterologous proteins, also because it is the best characterized eukaryotic host organism, especially since the
  • Cell functions is used 102, 103 .
  • Host organism is favored for the production of heterologous proteins 106 .
  • the importance of the yeast S. cerevisiae as host for the expression of heterologous antibody molecules is shown in the following section.
  • BiP endoplasmic reticulum
  • Quality control in ER is one of the most critical bottlenecks during soluble secretion of heterologous proteins in yeast cells 117 .
  • the overexpession of folding helpers such as PDI and BiP showed that the secretion of an scFv fragment in S.
  • Overexpession of PDI and BiP is highly dependent on the properties of the specific protein, and that there are proteins that do not benefit from overexpression of PDI and BiP 106, 119 .
  • yeast As a eukaryote, yeast is well suited for the production of heterologous human proteins since processing and secretion follow the eukaryotic mechanisms of protein expression. These mechanisms include posttranslational processings such as folding, glycosylation and phosphorylation 115th Expression, folding in the ER, and secretion of the protein are subject to stringent quality control, which causes properly folded and functional protein to be isolated from yeast expression cultures.
  • the aim of this work was to establish and test a method for the non-covalent surface presentation of Fc fusion proteins and IgG molecules on yeast cells.
  • the protein to be presented in the method presented here is anchored via its Fc portion of the Fc-binding ZZ domain on the cell surface.
  • the ZZ domain is anchored covalently on the cell surface as an Aga2p fusion protein for this purpose.
  • the protein A (SpA) from S. aureus binds high affinity to Fc parts of various IgG molecules.
  • SpA consists of five domains (A, B, C, D, and E) that can also individually bind Fc parts 63 .
  • the folding of domain B is exemplary for all SpA domains. It consists of two antiparallel a-helices and a slightly rotated third a-helix.
  • the Fc-binding domain used in the present work is the domain B-derived Z domain, which is also known to bind Fc portions of human antibody molecules with high affinity 149 .
  • the Z domain was generated by Nilsson and coworkers in 1987 by an artificial amino acid substitution in domain B, glycine to alanine at position 29, and shows improved stability compared to domain B 67 . Additionally, in the
  • both the Z and ZZ domains could be covalently presented to yeast cells by fusion with the cell wall protein Aga2p.
  • the correct folding of both domains was detected by the binding of an IgG molecule (cetuximab) and the subsequent addition of fluorescence-labeled antigen (b-hsEGFR) and SA-PE in the FACS.
  • the results showed, as expected, a higher affinity of the ZZ than the Z domain for Fc parts, as the ZZ-presenting cells could be more strongly fluorescently labeled under the same conditions.
  • the Z domain can be used for the immobilization of antibodies on E. coli cells 154, 155 and viruses 156, 157 .
  • ZZ-presenting yeast cells also served as immunoadsorbents for the detection of antibodies from serum samples 158 .
  • the ZZ domain was able to act as an ⁇ -agglutinin fusion on the surface of
  • Yeast cells are presented and fluorescently labeled by cocultivation with cells that secrete Fc-EGFP 159 .
  • the ZZ-presenting cells could in addition to the label by the external addition of an IgG molecule (cetuximab) even with an endogenously secreted VHH-Fc
  • VHH-Fc and ZZ were co-expressed in a cell for this purpose. Binding of the Fc portion to the ZZ domain entailed capture of the solubilized VHH-Fc fusion protein on the cell and labeling via the addition of antigen. In this case, significantly lower fluorescence intensities were detected in the FACS compared to labeling with cetuximab indicating a more inefficient labeling of the ZZ domain with endogenously secreted VHH-Fc. This finding also suggests that on the cell surface
  • yeast-specific genes are expressed more strongly than foreign genes 41 using the same promoter.
  • the ZZ domain is a small protein compared to the VHH-Fc fusion protein, which effectively folds and secretes functionally without disulfide bridges. Due to their good secretion and folding properties, the ZZ domain is often produced as a fusion with proteins that show poor secretion160 , 161 .
  • folding of the VHH-Fc fusion protein requires the correct formation of at least three disulfide bridges located in the hinge region.
  • the importance of correct disulfide bridging for successful soluble secretion of the VHH-Fc fusion protein is explained in the following section. For this purpose, the
  • PDI protein disulfide / ' soAT7erase
  • APO-E yeast strain
  • VHH-Fc fusion proteins Two yeast strains were prepared to enhance the secretion of VHH-Fc fusion proteins. Genetic manipulation has been observed in these strains (APO-E and APO-B) compared to the yeast strains from which they are derived (EBY100 and
  • Rakestraw and co-workers demonstrated a 180-fold increase in the secretion of a complete IgG molecule through the use of a PDI-overexpressing yeast strain and the app8 111 secretory sequence. This secretion efficiency was not achieved in the present work in combination with the secretory sequence app8. Presumably, the improved secretion by the overexpression of PDI depends on the secreted protein 117 and it would be useful to clarify whether the
  • VHH-Fc fusion protein was secreted much more efficiently by the addition of PEG8000 as significantly higher protein concentrations were detected in the culture medium.
  • Secretion of the VHH-Fc fusion protein into the culture medium requires intracellular transport of the protein across the cell membrane.
  • the classic secretory pathway of proteins leads in S. cerevisiae co- and / or post-translationally into the endoplasmic reticulum, from there into the Golgi apparatus and from there via transport vesicles to the cell membrane 165 .
  • the extracellular secretion is then carried out by means of exocytosis by the fusion of the transport vesicles with the cell membrane and the release of the vesicle contents into the culture supernatant.
  • PEG8000 facilitates vesicle fusion with the cell membrane and thus enhances the secretion of the VHH-Fc fusion protein.
  • PEG alters to an increase in membrane permeability and fluidity properties of membrane components 166 . This may be due to the direct interaction of PEG with the lipid bilayer and its resulting
  • PEG is also routinely used for cell fusion during hybridoma production and is commonly referred to as "fusogen" 167.
  • the influence of PEG can also be indirect in affecting the polar properties of the surrounding aqueous medium and thereby reducing membrane stability This effect can be explained by a dehydrogenation of the polar head groups of the lipid bilayer by the highly hydrophilic PEG in the surrounding medium 168.
  • the exact mechanism of PEG-enhanced VHH-Fc secretion can only be speculated here
  • Molecular weight of the PEG used was significantly higher in PEG8000 than in PEG 1500. The molecular weight of the PEG used is likely to correlate directly with the possible interaction of PEG with the cell membrane.
  • the presence of PEG8000, in addition to the increased secretion already described, and the consequent higher rate of ZZ cell surface cell occupancy, may also be explained by decreased dissociation of the Fc portion from the ZZ domain by the increased viscosity of the medium.
  • the diffusion of dissociated VHH-Fc fusion proteins is reduced by the high viscosity of the medium and facilitates the association of ZZ and Fe.
  • the achieved cell densities during cultivation in PEG8000-containing medium indicate that PEG had no significant influence on the growth behavior of the culture, although a reduced oxygen input was expected due to the high viscosity of the medium. Nevertheless, comparably high cell densities were achieved during cultivation with and without PEG (data not shown).
  • the VHH-Fc gene dose within the yeast cell depends, among other things, on the copy number of the plasmid. By increasing the plasmid copy number, an increased rate of synthesis of the VHH-Fc fusion protein was expected. As in the previously discussed
  • Transcript levels and resulting larger amounts of protein limited the correct processing of the protein.
  • Two intracellular proteases are responsible for removing the pre-pro signal peptide.
  • the first 19 amino acids of the pre-region are cut by an ER-localized signal peptidase.
  • the protease Kex2p is responsible for the removal of the pro-region 141 .
  • the pro-region includes another 64 amino acids. It has been suggested that the protease Kex2p was the limiting step in the processing of the protein as it removes the much larger pro-region of the signal peptide.
  • VHH-Fc fusion protein The functionality of the VHH-Fc fusion protein was examined both on the cell during surface presentation and as soluble in the culture supernatant. Successful use of the noncovalent method of selection and characterization of VHH-Fc fusion proteins required that the protein be functional on both the cell and the culture supernatant. The functionality is generally determined by the correct glycosylation and folding of the protein. About the binding of the
  • VHH-Fc fusion protein could be labeled on the cell by binding to the antigen hsEGFR and successfully detected in the FACS.
  • Z ⁇ and ZZ domains bind IgG molecules only via Fc portion 64 .
  • IgG molecules have another possible binding site, which is located in the Fab fragment. Most of this binding occurs via hydrophilic amino acid residues of the Fab fragment. It has also been shown that protein A binds framework regions of VHH domains 171 .
  • the use of the ZZ domain for surface presentation ensures that the binding of VHH-Fc fusion proteins and IgG molecules occurs exclusively through the Fc portion and thus does not hinder the binding to the antigen.
  • the binding of the Fc portion allows favorable orientation and exposure of the surface-presented proteins.
  • the yeast cell has an approximately 200 nm cell wall outside the plasma membrane that is densely populated with yeast cell wall proteins 172 .
  • short anchor proteins such as truncated forms of the protein Flolp, do not sufficiently extend into the extracellular environment of the cell and
  • Antigen binding of the VHH domain occurs through the N-terminal regions of the domain. There, the three CDRs are located, which form the paratope and thus mediate the binding to the antigen 173 .
  • the 5 ' region of the VHH gene was fused to the sequence for the Fc part. It is possible that this resulted in a reduction of the affinity for the antigen, which was shown by a lower K D value in the biolayer interferometry measurement.
  • the VHH domain is linked via its C-terminus via the hinge region to the Fc part. Since, as mentioned, antigen binding is mediated via the N-terminus of the VHH domain and the CDRs located there, these are not impaired and freely accessible by the Fc fusion for interaction with the antigen.
  • VHH-Fc fusion ART621 (Arana Therapeutic Ltd.) that is currently in clinical trials for the treatment of psoriasis 174 .
  • Western blot analysis revealed that dimerization of the VHH-Fc fusion protein was successful. The dimerization is made possible by the correct folding of the heavy chains of the Fc part and the formation of disulfide bridges. This was probably facilitated by the mutagenesis of the N-glycosylation site of the Fc portion at the beginning of this work. For this purpose, the codon for the
  • Plasmids were transformed. In addition to the plasmid for expression of Aga2p-ZZ fusion, two other plasmids for the soluble secretion of lighter and heavier
  • Antibody chain needed. Consequently, for the surface presentation of the complete antibody, the yeast cell had to enable the stable maintenance of all three plasmids during cultivation.
  • the selection of the Aga2p-ZZ plasmid (pYD-ZZ) via a G418 resistance marker and G418-containing medium to the auxotrophic markers of the EBY100 strain was used to select the plasmids for the heavy and light antibody chain.
  • the successful capture of the antibody by the ZZ domain was demonstrated by the labeling and detection of the Fe part on the cell.
  • the functionality of the IgG molecule could be demonstrated by the binding of the specific antigen.
  • the signal peptide app8 used for the secretion of the light chain is specifically designed for the efficient secretion of
  • Proteins were selected by an evolutionary approach based on the MFal pp signal peptide 111 .
  • This signal peptide is an 83-amino acid pre-pro sequence which, in contrast to other signal peptides, is processed both by a signal peptidase for translocation into the ER and by the membrane-resistant protease Kex2p in the Golgi apparatus.
  • the heavy chain was secreted as a fusion with the protein Aga2p, which is linked to the cell wall protein agal p via two disulfide bridges. The processing of the mature fusion protein is presumably carried out only via the ER-localized signal peptidase.
  • both the heavy and the heavy light chain expressed with the secretory sequence app8.
  • both antibody chains were subject to the same processing mechanism, which probably allowed for functional assembly as well as binding to the antigen.
  • Rakestraw and co-workers demonstrated in 2009 the surface presentation of a complete antibody on yeast cells using SECANT TM Display Technology 126 .
  • the heavy chain was expressed as a fusion with the biotin-acceptor peptide.
  • Biotinylation of the biotin acceptor peptide was by the co-expressed biotin ligase BirA. After chemical biotinylation of the cell surface and incubation with avidin, the presentation of the secreted biotinylated antibody takes place via the avidin-biotin interaction on the cell. In this approach, both antibody chains were expressed with the same secretory sequence (app8). They showed the secretion of a complete IgG molecule from S. cerevisiae and the non-covalent surface presentation of the IgG molecule via the biotin-avidin interaction. Another example of the surface presentation of complete IgG molecules to yeast cells was demonstrated by Sazinsky and co-workers in 2008.
  • IgG molecules are presented in the present work without further modifications, but in the process protein-specific structures of the IgG molecule to
  • Genotype-phenotype coupling The successful application of non-covalent surface presentation for the selection of variants with altered properties can only succeed if there is a stable link between the presented protein variant on the cell and the intracellular genetic information for this variant. If this link is not given, the
  • Protein variants can be bound by dissociation and association of the binding of ZZ domain and Fc portion on a "wrong" cell and thus the selection of false-positive clones can occur.
  • the central part of the present work was the study of the stability of the ZZ: Fc Interaction
  • this interaction was experimentally studied.In the first mixing experiment, cells expressing the ZZ domain (target cells) were enriched by the binding of IgG molecules from a large excess of control cells, resulting in target cells in a large population The test cells were diluted in control cells and enriched within three rounds of selection from initially 0.001% or 0.0001% to 100% and 90%, respectively.
  • the labeling of the target cells was carried out by the sequential binding of cetuximab and the fluorescence-labeled antigen (b-hsEGFR).
  • the high rate of enrichment of 00% and 90%, respectively, shows the stable interaction between n ZZ domain and IgG molecule.
  • the successful application of common selection methods such as MACS and FACS was demonstrated. Undoubtedly the strong one had a positive influence on the marking and selection of the target cells
  • both target and control cells presented the ZZ domain.
  • the target cells additionally secreted the hsEGFR-specific VHH-Fc fusion protein, while the control cells additionally secreted a non-EGFR-specific VHH-Fc fusion protein. Both VHH-Fc fusion proteins should only be presented on the respective cell population.
  • VHH-Fc fusion proteins of the target and control cells had an identical sequence of the Fc portion, it was hypothesized that the VHH-Fc fusion proteins on the control cells dissociated from the ZZ domain in the same manner as the VHH-Fc fusion proteins of the target cells . There is a possibility that some of the hsEGFR-specific VHH-Fc fusion proteins (target cells) will be captured by unoccupied ZZ domains on neighboring cells. These can be located on both target and control cells. However, the proportion of false-captured VHH-Fc fusion proteins should be very low due to the high-affinity binding between ZZ domain and Fc part.
  • VHH-Fc fusion proteins would be distributed throughout the mixture and greatly dilute. By fluorescence labeling with the antigen, these signals would then be below the detection limit in the FACS and fall within the range of fluorescence intensity of the negative control. This can cause a selection of false-positive cells
  • VHH-Fc fusion protein was cultured double transformants in galactose-containing SG medium.
  • the ZZ domain was presented on the cell surface as Aga2p fusion via interaction with Agal p, and the VHH-Fc fusion protein could be captured on the cell. This was successfully demonstrated by the labeling and detection of the ZZ domain with a specific detection antibody and antigen binding of the VHH domain in the FACS.
  • the cells were transferred to glucose-containing SD medium. The glucose-containing medium repressed the Gal1 promoter and thereby repressed the expression of the ZZ domain 141 .
  • the VHH-Fc fusion protein could no longer be captured on the cell surface and was secreted into the culture medium.
  • the remaining ZZ domains already presented on the cell before the medium change were also presented after transfer to SD medium (data not shown).
  • the cells were re-passaged and a new culture was inoculated with a very low cell density. The passage greatly diluted the cells that still displayed the ZZ domain.
  • Fig. 1 Schematic representation of S. aureus SpA and SpA-derived domains.
  • (A) the domain structure of protein A (SpA) is shown. It consists of five IgG-binding domains (E, D, A, B, E), one signal sequence (SP) and two domains (X and M) for anchoring SpA in the bacterial cell wall.
  • (B) shows domain B derived and recombinant DNA technology-derived artificial Z domain. The ZZ domain is made by duplicating the Z sequence. (Modified after Boström T., Nilvebrant, J., Honer, p. 2012 61 )
  • Fig. 2 Surface presentation on yeast cells after Boder and Wittrup.
  • Fig. 3 Schematic representation of the process for non-covalent
  • Green represents the Fc-binding domain covalently anchored on the cell.
  • B The solubilized VHH-Fc fusion protein is captured by the Fc binding domain on the cell surface.
  • C By repressing the expression of the Fc binding domain, the VHH-Fc fusion protein is secreted into the culture medium and no longer secreted on the culture medium
  • Fig. 4 Schematic comparison between IgG molecule and VHH-Fc fusion protein.
  • Antibody chains is constructed, while the VHH-Fc fusion protein is composed of only two identical chains.
  • Fig. 5 Western blot analysis of episomal PDI expression in yeast cells.
  • Fig. 6 Western blot analysis of chromosomal PDI expression in yeast cells Western blot analysis under reducing conditions of cell lysates (2 x 10 7 cells) of EBY100 (lane 1) and APO-E (lane 2-4) cultures the four Days were cultivated in galactose-containing SD medium. Detection was via a PDI-specific
  • FIG. 7 Analysis of soluble VHH-Fc secretion.
  • Expression plasmid was used an ARS4 / CEN6 plasmid (lane 3) and a 2-micron plasmid (lanes 4 and 6).
  • C shows the cell lysates correlated to (B). The detection was carried out via an Fc-specific primary antibody (rabbit) and a POD-conjugated rabbit-specific secondary antibody (goat).
  • ZL cell lysate
  • KÜ culture supernatant.
  • Fig. 8 Processing of the VHH-Fc fusion protein.
  • the unprocessed protein (A) is intracellular in larger size (48.4 kD) because the signal peptide app8 (8.7 kD) was not cleaved while the mature protein (B) did
  • Fig. 9 Influence of polyethylene glycol on the secretion of VHH-Fc fusion proteins VHH-Fc secretion after 48 hours. Western blot analysis of EBY100 and APO-E
  • Fig. 10 VHH-Fc secretion exploits from APO-E and EBY100 expression cultures.
  • Fig. 1 1 Exemplary Biolaver interferometric measurement profiles with and without PEG addition.
  • Fig. 12 VHH-Fc secretory yields from APO-E and APO-B expector cultures
  • Fig. 13 LDS-PAGE and Western blot analysis of culture supernatants from APO-E and APO-B VHH-Fc expression cultures.
  • FIG. 14 Purification of VHH-Fc fusion proteins by protein A affinity chromatography.
  • A Chromatogram of affinity chromatographic purification by means of protein A HiTrap column of VHH-Fc from APO-E (red) and APO-B (black) 200 ml of expression cultures after dialysis against PBS. The 1 ml fractions of elution pea / s from (A) were pooled and rebuffered by means of PD-10 columns in PBS. Solid lines represent the
  • Fig. 15 Analysis for the purification of the VHH-Fc fusion protein.
  • Fig. 16 Analysis of the interaction of VHH-Fc and hsEGFR - Biolaver interferometry
  • Measuring profile (raw data).
  • (1) Loading of the protein A biosensors with the VHH-Fc for 600 s. (A 2 to 3): washing step, (B 2 to 4): washing step, (A 4, B 5) association, (A 5, B 6):
  • Fig. 7 Binding analysis of VHH-Fc and hsEGFR (processed data).
  • FIG. 19 Cloning scheme for the surface presentation of the Fc binding domains
  • Fig. 20 Aqa2p-mediated surface presentation of Z and ZZ domains.
  • Agal p is chromosomally encoded and AGA 1 expression is regulated by the galactose-inducible Gal1 promoter (pGall).
  • the Aga2p fusions are episomally encoded (pYD-Z or pYD-ZZ). Their expression is also regulated by the GaM promoter.
  • Z domain and ZZ domain are linked via a glycine serine anchor (Gly / Ser) to the C terminus of the subunit Aga2p.
  • Fig. 21 Flow cytometry and surface presentation of Z and ZZ domains on EBY100 cells Flow cytometric analysis of EBY 00 cells presenting Aga2p, Aga2p-Z and Aga2p-ZZ on their surface. Fluorescent labeling was performed by protein A-specific FITC-conjugated goat detection antibody after 24 hours
  • Fig. 23 IqG binding by Z and ZZ pomade and flow cytometry.
  • Fig. 24 Surface presentation of VHH-Fc fusion proteins. The surface presentation was mediated by the covalently anchored ZZ domain on the cell surface.
  • the cells were labeled in (A) and (B) with b-hsEGFR / SA-PE.
  • (A) the result of the FACS analysis is shown without (-PEG) and with PEG8000 additive (+ PEG) after 24 hours, in (B) after 72 hours.
  • the labeling was carried out by means of b-hsEGFR and SA-PE.
  • C shows the detection of the ZZ domain of both cultures after 24 hours by labeling with a goat protein A-specific FITC-conjugated antibody.
  • Fig. 25 transmitted light u. Fluorescence microscopic analysis of VHH-Fc presenting cells.
  • Fluorescence microscopy images of EBY100 cells which, mediated by the ZZ domain, displayed the VHH-Fc fusion protein on their surface.
  • the cells were labeled on the one hand with b-hsEGFR / SA-PE (row: hsEGFR) and on the other with b-rFcRn (Rattus norvegicus) ISA-PE (row: ratFcRn) (column: PE).
  • b-rFcRn Ratus norvegicus
  • ISA-PE row: ratFcRn
  • Another labeling was carried out with an Fc-specific antibody (column: Alexa 647). The superposition of both fluorescence signals is shown in the column PE + Alexa 647.
  • Fig. 26 Non-covalent surface presentation of IqG molecules Two-color labeling and flow cytometry after (A) 24 and (B) 48 hours.
  • the yellow fluorescence shows the signal for phycoerythrin and thus the binding of b-hsEGFR; the red fluorescence (relative fluorescence red) shows the signal for AlexaFluor 647 TM (Fc signal).
  • 24 hours 36.4% of the cells within marker region M1
  • 48 hours 43.4% of cells within marker region M1.
  • Control cells from (A) labeled with SA-PE. 0.2% of the cells within marker region M1.
  • (D) shows greatly simplified the surface presentation of the IgG molecule by the over Aga2p (light blue) and Agal (dark blue) covalently anchored ZZ domain (green).
  • the gray arrow indicates the soluble secretion of light and heavy IgG chain.
  • the yellow fluorescence shows the signal for SA-PE and thus the binding of the biotinylated antigen (b-hsEGFR); the red fluorescence (rel.
  • Fluorescence red shows the signal for AlexaFluor TM 647 (Fc-specific antibody).
  • C shows, in a very simplified manner, the theoretically assumed surface presentation of the IgG molecule as a covalent Aga2p fusion in the case of a successful assembly of light and heavy IgG chain.
  • Fig. 28 FACS analysis of the stability of VHH-Fc: ZZ-interaction.
  • VHH-Fc marked red
  • VHH-Fc unmarked black
  • B Initial 1: 1 mixture at time T 0 .
  • C 1: 1 mixture after 32 hours. Detection of the VHH-Fc fusion protein via b-hsEGFR and SA-PE
  • Fig. 29 VHH-Fc: ZZ interaction over a period of 32 hours.
  • FIG. 30 Octet and FACS analyzes of the binding of VHH-Fc fusion proteins and hsEGFR
  • VHH-A, VHH-B, VHH-C The biomolecular interactions of the three VHH domains (VHH-A, VHH-B, VHH-C) with the antigen (hsEGFR) were analyzed by biolayer interferometry and FACS.
  • Mean FL yellow relative fluorescence yellow
  • FACS FACS measurement
  • Fig. 31 Graphical representation of the FACS analysis of the binding of various VHH-Fc fusion proteins (AB C) to the antigen hsEGFR.
  • Fig. 32 FACS analysis for switchable surface presentation.
  • Fusion protein via a Fcs-specific F (ab ' ) 2 fragment (AlexaFluor TM 647 conjugate).
  • Fig. 33 Selective change between surface presentation and soluble production.
  • VHH-Fc fusion proteins Due to the transfer of the cells into glucose-containing medium (+ PEG8000) (B), the ZZ domain and the VHH-Fc fusion protein are no longer detectable on the cell surface (compare M1 A and M1 B).
  • Fig. 34 Analysis of the switchable secretion of VHH-Fc fusion proteins.
  • VHH-Fc fusion proteins in galactose- and glucose-containing medium.
  • the detection of the VHH-Fc fusion proteins on the PVDF membrane was via a Fc fragment specific
  • Fig. 35 Cloning strategy of the VHH libraries. Schematic representation of the cloning strategy for the production of VHH libraries. The mutated variants of the VHH sequence (red) are incorporated via homologous regions (overlap) at the ends of the PCR products into the linearized target vector. The mechanism of homologous recombination in yeast cells is exploited.
  • Fig. 36 Plasmids for the surface presentation of the Fc binding domain
  • FIG. 1 Schematic representation of the plasmid pYD1 for the surface presentation of Aga2p fusion proteins on the surface of EBY100 cells (Invitrogen) and the plasmids for the surface presentation of the Z domain pYD-Z (B) and the ZZ domain pYD-ZZ (C) as Aga2p fusion.
  • pYD-ZZ existed with a G418 resistance cassette in place of the auxotrophic marker Trp1 and is referred to as pYD-ZZ-G418 (plasmid map not shown).
  • Fig. 37 Plasmids for soluble secretion
  • Fig. 38 Plasmids for the soluble secretion of IqG molecules
  • Fig. 39 Plasmids for chromosomal PDI integration.
  • A pESC-URA vector from Agilent Technologies Inc ..
  • B pESC-URA vector with PDI sequence.
  • C pESC-URA vector with PDI sequence and GAPDH promoter (PDI expression cassette).
  • D pRS306 integration vector for chromosomal integration of the PDI expression cassette and overexpression of oxidoreductase PDI.
  • EBY100 MATa URA3-52 trp leu2M his3A200 pep4 :: HIS3 prb1M .BR can ⁇ GAL
  • BJ5464 MATa URA3-52 trpl teu2A1h / s3A200 pep4: .HIS3 prMA1.6R can ⁇ GAL
  • APO-B BJ5464-URA and integration of vector pRS306-PDI
  • YPD medium 20 g dextrose
  • the components were dissolved in sterile water, mixed with 10 ml of PenStrep Mix and made up to 1 L with sterile water. After sterile filtration, storage was at 4 ° C for a maximum of two months. For agar plates, the medium was treated with 1, 5% agar and autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.
  • galactose-containing SD medium For induction of the Gal1 promoter, instead of 26.7 g / L base mix (minimal SD base), 37 g of galactose-containing base mix (minimal SD base Gal / Raf) (Clontech Laboratories Inc.) was used. The base mix was dissolved in 890 ml of sterile water and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. Separately, the desired DO mix with 5.4 g of Na 2 HP0 4 and 8.56 g NaH 2 P0 4 x H 2 0 was dissolved in 100 ml of sterile water and also autoclaved for 15 minutes at 21 ° C. After cooling both solutions, the base and DO mix were combined and mixed with 10 ml of PenStrep Mix. The medium was stored at room temperature for a maximum of four weeks.
  • the galactose-containing SD medium + PEG8000 was mixed with 150 mg / L of genetecin.
  • Example 1 Preparation of a process for non-covalent surface presentation on yeast cells
  • the aim of the present work was the development of a method for non-covalent surface presentation of IgG molecules and Fc fusion proteins on yeast cells, the associated selection and the subsequent switchable secretion of the selected protein into the medium of an expression culture for its biochemical characterization.
  • the process of non-covalent surface presentation on yeast cells was realized by the interaction of the cell surface covalently anchored protein A-derived Fc binding domain and the co-expression of a VHH-Fc fusion protein or an IgG molecule.
  • the first section of the results presented here demonstrates the generation of a PDI (protein disulfide isomerase) overexpressing yeast strain, from which an improved soluble secretion of VHH-Fc fusion proteins was expected and could be demonstrated. Subsequently, the secretion of VHH-Fc fusion proteins, the secretion optimization and the
  • VHH-based libraries generated VHH-based libraries and screened one of these libraries for VHH variants with a new property.
  • Example 2 Generation of a PDI overexpressing yeast strain
  • the oxidoreductase PDI protein disulfide isomerase
  • PDI protein disulfide isomerase
  • Increasing the secretion of heterologous proteins is preferable 111 .
  • the results of the generation of S. cerevisiae strain APO-E are shown below. In the run-up was suggests that PDI overexpression increases the secretory capacity of the yeast strain for VHH-Fc fusion proteins.
  • This yeast strain was generated by the chromosomal integration of a PDI expression cassette into the genome of EBY100. The production of the
  • S. cerevisiae strain APO-B was performed in a similar manner (data not shown).
  • the PDI expression cassette was similarly integrated chromosomally into strain BJ5464.
  • chromosomal DNA was extracted from a stationary growing EBY100 culture. Using Gap-Repair PCR and using the oligodeoxyribonucleotides PDI-GR-up and
  • PDI-GR-rp was subsequently used to sequence the PDI with homologous regions
  • Target vector pESC-URA amplified The template used for the PCR was 1 ⁇ l of the chromosomal DNA preparation. The gene sequence was then cloned by homologous recombination into the target vector. To initiate homologous recombination, the target vector was previously linearized with the restriction endonuclease Xho. Electro-competent ⁇ 10 ⁇ URA ⁇ cells were transformed with the target vector and the PCR product of the PDI gene sequence. The yeast strain EBY100 URA ⁇ was kindly provided by Stefan Zielonka (Biochemistry, TU Darmstadt, AK Prof. Kolmar). In this strain, the auxotrophic marker URA3 was previously mutated by 5-fluoroorotic acid selection 138 . After checking the cloning by means of sequencing, in a second cloning step the inducible promoter Gal1 / 10 of the generated vector pESC-URA-PDI became constitutive
  • the DNA sequence of the GAPDH promoter from plasmid pGAPZA (Life Technologies Corp.) was amplified using the oligodeoxyribonucleotides GAPDH-up and GAPDH-rp, and the vector pESC-URA-PDI was linearized using the restriction endonuclease ⁇ s / API and cleaned. Following was the
  • Target vector and the GAPDH PCR product for cloning by homologous recombination in yeast cells. After selection and re-sequencing electrocompetent EBY100 URA ⁇ cells were transformed with the plasmid pESC-URA-pGAPDH-PDI.
  • Detection was carried out with a PDI-specific antibody from the mouse.
  • the detection on the PVDF membrane was then carried out with a mouse-specific antibody (POD conjugate) from the goat.
  • the Western blot analysis shown in FIG. 5 made it clear that the episomally encoded PDI was expressed both in glucose (FIG. 5 lane 2) and in galactose-containing medium (FIG. 5 lanes 3 to 7) and via the PDI -specific
  • the PDI expression cassette consisting of the sequence for the GAPDH promoter and the sequence for the PDI, was integrated into the yeast genome of EBY100.
  • the sequence of the PDI expression cassette was cloned into the integration vector pRS306 (ATCC).
  • the recognition sites of the restriction endonucleases Xho ⁇ and Xba ⁇ were added by PCR to the expression cassette.
  • Oligodeoxyribonucleotides used Xbal-PDI-up and Xhol-PDI-rp. Following purification of the PCR product, the endonucleolytic restriction of the PCR product and the target vector pRS306 was performed. This was followed by ligation of the target vector pRS306 with the cleaved expression cassette (pGAPDH-PDI) using T4 DNA ligase and the transformation of chemically competent E. coli TOP10 cells. By growing five clones, their plasmid isolation and sequencing, a clone with the correct sequence ⁇ pRS306-PDI) could be identified. This was used for the integration of the PDI expression cassette into the genome of EBY100.
  • chromosomal integration To prepare the chromosomal integration, preparative plasmid isolation of the vector pRS306-PDI was performed as described. This was followed by linearization of the plasmid using the restriction endonuclease 8sfBI 2.5 of the linearized vector were then used to transform EBY100 URA ' cells, thereby allowing specific integration of the PDI expression cassette into the yeast genome. After selection on SD-URA agar plates, the chromosomal integration of the vector pRS306-PDI was investigated experimentally by Western blot analysis. For this purpose, six clones were cultured in YPD medium and then transferred to suitable galactose-containing SD medium.
  • the URA3 marker used for selection was finally mutated by means of 5-fluororotic acid.
  • the following is the direct applicability of the strain APO-E with respect to the secretion of the VHH-Fc
  • VHH-Fc fusion proteins expressed to confirm the secretion performance of S. cerevisiae strains ⁇ 10 ⁇ and APO-E for VHH-Fc fusion proteins. Since the VHH is a single chain domain, the complexity of the VHH is a single chain domain, the complexity of the VHH is a single chain domain, the complexity of the VHH is a single chain domain, the complexity of the VHH is a single chain domain, the complexity of the
  • Oligodesoxyribonucleotides from the plasmid pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc amplified and cloned into the linearized vector pESC-Leu.
  • a plasmid with the Ori CEN6 / ARS4 is characterized by a low, a plasmid with the Ori 2-micron by a high copy number within 139.
  • suitable galactose-containing SD media with 1 1% (w / v) PEG8000 additive and without PEG8000 additive were used to additionally determine the influence of PEG8000 on the secreted amount of VHH-Fc fusion protein in the culture supernatant. It has been suggested in advance that the addition of PEG8000 may have beneficial effects on the secretion of heterologous proteins, since it has already been suggested in the literature that PEG may have a positive influence on the secretion of heterologous proteins 140 . At given times (24, 48, 96 hours), samples of the Obtained culture supernatant and the proteins contained in the supernatant precipitated by trichloroacetic acid. The sample preparation of the cell lysates was carried out accordingly.
  • VHH-Fc Fustons proteins were labeled on the PVDF Mernbran using a rabbit Fc-specific primary antibody and a rabbit-specific rabbit-specific secondary antibody derived from the goat.
  • the results are shown in Fig. 7.
  • the glycosylation site in the Fc portion at position 297 was previously mutated by site-directed mutagenesis to prevent yeast-known hypermannosylation during N-glycosylation.
  • the mutagenesis of this position was carried out by means of PCR and using the oligodeoxyribonucleotide NQ-HC-mut. This was facilitated and improved secretion of the
  • FIG. 7 A shows the successful expression of the VHH-Fc construct and its soluble secretion by culturing EBY100 transformants without PEG8000 addition.
  • the proteins were specifically detected in the cell lysate (lane 1) after 24 hours and in the culture supernatant (lane 2) after 96 hours. That analyzed
  • volume of the supernatant corresponded to the equivalent volume of 5 ⁇ 10 7 cells.
  • the VHH-Fc protein in monomeric ( ⁇ 40 kD) and also in dimerized form (-90 kD) only after an expression period of 96 hours found (non-reduced).
  • Two VHH-Fc-specific bands were also detected in the cell lysate ( Figure 7 lane 1).
  • the smaller molecular weight band could be assigned to the monomeric VHH-Fc protein ( ⁇ 40 kD) because it had a size between 38 kD and 49 kD.
  • Lasergene ® DNASTAR Inc.
  • FIG. 8 the schematic representation of the non-processed (Fig. 8A) and the processed (Fig. 8B) form of the protein is shown.
  • Figure 7 B shows the results of western blot analysis of culture supernatants after 24 and 48 hours of APO-E transformants.
  • the applied culture volumes were volumes equivalent to 1 ⁇ 10 7 cells. In this case, the supernatant of a five-fold smaller amount of cells in the
  • FIG. 7B additionally shows the comparison between the secretion of the VHH-Fc fusion protein in the culture supernatant of one
  • the band signal had a molecular weight corresponding to the size of the unprocessed form ( Figure 8A).
  • the assayed sample of the cell lysate from the CEN6 / ARS4 culture did not show a VHH-Fc specific signal at either 24 hours or 48 hours. Intracellularly, the VHH-Fc protein could no longer be detected here, which indicates an effective secretion of the protein. It was found that the expression and soluble secretion of VHH-Fc fusion proteins in the presence of 11% (w / v) PEG8000 yielded significantly higher protein yields than those in PEG-free medium.
  • Fusion protein was suitable in the culture supernatant, as the addition of PEG having a molecular weight of 1500 Da.
  • PEG8000 for the secretion of VHH-Fc fusion proteins, the addition of PEG8000 to the culture medium was used in all further experiments on the basis of the results described above. A more precise quantification of the amount of secreted protein from APO-E and EBY100 expression cultures and, accordingly, the influence of PDI overexpression on the soluble protein yield in the culture supernatant is shown below.
  • oxidoreductase PDI has a positive influence on the soluble secretion of VHH-Fc fusion proteins.
  • electrocompetent EBY100 and APO-E cells were transformed with the plasmid pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc
  • FIG. 11 shows two measurement profiles for the quantification of IgG molecules in the presence of PEG8000 and without PEG8000. Noticeable were the lower layer thicknesses achieved in the presence of PEG8000 of the loading of the protein A biosensors ( Figure 11 A) in contrast to the use of IgG molecules that were available for loading in PBS ( Figure 1 1 B).
  • Fig. 11 illustrates the influence of PEG8000 on the biolayer interferometry measurement.
  • the addition of PEG8000 greatly increased the viscosity of the medium. Significant interference was observed during loading of the biosensors with the IgG molecule, which was due to the delayed and uneven increase of the
  • the two PDI-overexpressing S. cerevisiae strains APO-E and APO-B were used for the soluble secretion of VHH-Fc proteins and the protein concentrations in the culture supernatants were determined by biolayer interferometry at given times. By comparing with a previously prepared calibration series, the protein concentrations were calculated from the raw values. The measurements were carried out after 48, 72, 96 and 120 hours. The concentrations determined are shown graphically in FIG. 1, showing that the VHH-Fc fusion protein could be detected in all expression cultures via interaction with protein A biosensors and the protein concentration of each culture determined from an expression period of 48 hours. to
  • the culture volume of each culture was calculated after 120 hours containing a theoretical protein amount of 2 g. These samples were subsequently analyzed by Western blot. Should the signal of the octet measurement be caused by measurement errors, which could occur, for example, by the use of highly viscous PEG8000-containing medium, this circumstance should be reflected in the Western blot analysis.
  • the calculated amount of culture supernatant was separated from the yeast cells, the proteins precipitated by TCA and then prepared for analysis by LDS-PAGE and Western Blot.
  • FIG. 13 shows that the VHH-Fc fusion protein was successfully detected in all samples by LDS-PAGE and Western blot analysis.
  • detection was by Fc-specific detection antibody. Since the signal strengths of the bands on the membrane were visually estimated to be nearly uniform, it was considered that an approximately identical amount of protein from each expression culture was used for LDS-PAGE and Western blot analysis. Since the amount of protein used for LDS-PAGE and Western blot analysis from the previously performed biolayer interferometry Measurement was calculated, could thus be the signals of biolayer interferometry
  • VHH-Fc fusion protein was produced on a larger scale and then by means of protein A affinity chromatography from the
  • FIG. 14A After completion of the purification and inspection of the chromatogram (FIG. 14A), the respectively relevant elution fractions were combined.
  • the buffer exchange against PBS was carried out using PD-10 columns. In connection each 20 ⁇ were analyzed by LDS-PAGE. The results are shown in (Fig. 14 B and C).
  • the results shown in FIG. 14 show the successful purification of the VHH-Fc fusion protein by means of protein A affinity chromatography from the supernatants of APO-E and APO-B expression cultures.
  • the analysis of the purified protein by means of LDS-PAGE showed a sufficient degree of purity (FIGS. 14 B and C). in the
  • VHH-Fc fusion port was isolated from a 200 ml APO-E expression culture and 0.1 mg from a 200 ml APO-B expression culture by protein A affinity chromatography. The analysis of the functionality of the APO-E expressed protein is shown below.
  • Example 6 Functionality Analysis of Yeast-Produced VHH-Fc Fusion Proteins Following purification of the VHH-Fc fusion protein from the supernatant of the APO-E culture, the functionality of the protein was checked. Since it is known from the literature that S. cerevisiae hyperglycosylates certain peptide sequences 141 and may affect the stability, secretion and biochemical properties of the protein, the
  • VHH-Fc protein Binding properties of the VHH-Fc protein to the antigen hsEGFR experimentally investigated. For this purpose, kinetic measurements of hsEGFR interaction were performed by biolayer interferometry using protein A biosensors. Prior to the experiment, it was known that the VHH domain had high specificity and affinity for the antigen hsEGFR. For this purpose, the purified VHH-Fc
  • Fusion protein immobilized on the surface of protein A biosensors (Fig. 16 A, step 1). This was previously purified by protein A affinity chromatography Protein used.
  • the culture supernatant of a VHH-Fc expression culture was used to load the protein A biosensors. Following a washing step (Fig. 16 A, step 2), the baseline was measured in PBS (Fig. 16 A, step 3).
  • Figure 16B, steps 2 and 3 When the culture supernatant was used, two washes were performed ( Figure 16B, steps 2 and 3) as it contained PEG8000. Subsequently, it was associated with soluble antigen hsEGFR in PBS (250 nM, 125 nM, 62.5 nM and 15.6 nM) (Fig. 16 A, step 4, Fig.
  • step 4 Fig. 16 A
  • Step 5 Fig. 6 B
  • Table 4.1 Kinetic constants of binding between VHH-Fc and hsEGFR. k a (1 / s) k a error k d (1 / s) k d error K D (M)
  • Fig. 7 showed in both cases a specific, concentration-dependent interaction between immobilized VHH-Fc at the sensor surface and hsEGFR. There was no interaction between VHH-Fc and the control proteins mmEGFR and cMet. Analysis of the binding of VHH-Fc and hsEGFR by biolayer interferometry clearly demonstrated the affinity of the VHH domain for the antigen. The association between VHH domain and hsEGFR is indicated in Fig. 17 by the characteristic increase in the colorful curves. The dissociation of hsEGFR was then carried out in PBS and was shown by the continuous slow decay of the colorful curves. By analysis of association and dissociation, the equilibrium dissociation constant (K D ) of the
  • EndoH specifically cleaves mannose-rich oligosaccharides of N-glycosylation of proteins. It is known from the literature that heterologous expression in yeast cells leads to N-glycosylation with a high number of terminal mannose residues 141 . This so-called
  • Hypermannosylation may affect the secretion, solubility and folding of the protein 142 .
  • yeast-secreted protein is incubated with EndoH and the molecular weight and running behavior of the protein in the polyacrylamide gel analyzed by LDS-PAGE.
  • 2 ⁇ g of the proteins hsEGFR and thioredoxin were also incubated with EndoH and analyzed.
  • the results are shown in Fig. 18. Incubation with EndoH and subsequent analysis by LDS-PAGE revealed no difference in the running behavior of the treated VHH-Fc fusion protein (Fig. 18 lanes 1 and 2).
  • VHH-Fc fusion proteins The surface presentation of VHH-Fc fusion proteins was mediated by co-expression of an Fc-binding domain. This was expressed for surface presentation on yeast cells as a fusion protein with the yeast's own cell wall protein Aga2p and thus served as a direct mediator of the surface presentation of VHH-Fc fusion proteins. For this purpose, the Fc-binding domain was in the beginning of the experimental work
  • Z domain 67 was expressed in monovalent and divalent form as Aga2p fusion and exposed on the surface of EBY100 cells.
  • the Z domain is derived from S. aureus protein A, binds to the Fc portion of several IgG subtypes 143, and consists of an a-helical structure 69 .
  • the ZZ domain is a duplication of the sequence of the Z Domain.
  • the divalent ZZ domain is assigned a significantly higher affinity for Fc parts of human IgG molecules than the monovalent Z domain. This higher affinity is largely realized by a much lower K off 144 .
  • Constants of the biomolecular interaction of Fe with Z and ZZ domains listed 144 Constants of the biomolecular interaction of Fe with Z and ZZ domains listed 144 .
  • the amino acid sequence of the Z domain was determined 67 by means of literature search and the corresponding DNA sequence was cloned into the vector pYD1 in the reading frame of Aga2p. Between Aga2p and Fc binding domain, the flexible GS-linker contained in the pVDi vector was obtained.
  • the sequence of the Z domain was cloned C-terminal into the reading frame of Aga2p two times in succession. For this purpose, the sequence of the ZZ domain was synthesized (Geneart AG) and cloned into the vector pYD1 (Geneart AG).
  • the Z domain was amplified from an internally supplied pET13-based plasmid and cloned by conventional cloning techniques by restriction of DNA and ligation of DNA fragments via the interfaces Bam ⁇ and Nhe ⁇ in the vector pYD1. Both vectors (pYD-Z and pYD-ZZ) were generated without the affinity epitopes contained in the pYD1 vector ( Figure 9), leaving the Z and ZZ domains without further modification and only via a GS linker with the cell wall protein Aga2p on the cell surface anchored.
  • Example 10 Surface Presentation of the Fc Binding Domain
  • EBY100 cells were transformed on the one hand with the plasmid pYD-Z and on the other hand with the plasmid pYD-ZZ.
  • EBY100 cells were transformed with the plasmid pYD1 (Invitrogen).
  • the receptor a-agglutinin from S. cerevisiae was used as a membrane anchor for the surface presentation of the Fc-binding domain.
  • This surface receptor on yeast cells is divided into two proteins, Aga 1p and Aga2p, which are linked via disulphide bridges, thereby ensuring the covalent anchoring of the Fc-binding domain on the cell surface.
  • the method of surface presentation on yeast cells established by Boder and Wittrup was used 92 .
  • agal p is chromosomally encoded in the genome of EBY100 and, like the episomally encoded Aga2p, is under the control of the galactose-inducible Gal1 promoter.
  • AGA1 agal p
  • AGA2 Aga2p
  • AGA2 expression was fused with the Z or ZZ domain ( Figure 20). The expression of
  • the percentage of cells presenting the Fc binding domain was determined by the definition of an anchor region M1.
  • the marker region was chosen so that as few cells as possible
  • Negative controls were EBY100 transformants presenting only the anchor protein Aga2p.
  • Fig. 21 shows the histograms of the measurements.
  • both Z and ZZ domains could be labeled with the protein A-specific antibody over a period of 72 hours and detected by flow cytometry.
  • Aga2p fusion proteins By expression as Aga2p fusion proteins, they were presented on the cell surface via the interaction of Aga p and Aga2p.
  • both variants showed a relative to the negative control (Aga2p) strength rel. Fluorescent signal.
  • Cells presenting the divalent ZZ domain showed nearly twice as much signal as cells with the monovalent Z domain (compare 370.7 and 636.3).
  • Negative control was equivalent (Aga2p).
  • the signals of the larger cell populations had significantly higher intensities. This allowed them to be clearly differentiated from the negative control. It was concluded that the cells located within M1 could present the Fc-binding domain on their surface and thus be specifically labeled. Fluorescence microscopic images were taken to visualize the surface presentation of the ZZ domain. For this purpose, 1 ⁇ 10 7 cells were EBY100 (PYD ZZ transformants) labeled after a cultivation period of 48 hours in Gaiaktose-containing SD medium with a protein A-specific antibody (FITC conjugate) from the goat.
  • FITC conjugate protein A-specific antibody
  • the fluorescence micrograph (Fig. 22 B) shows in comparison with the
  • VHH-Fc fusion proteins were labeled with the antibody cetuximab (1 ⁇ ), which was bound via the Fc portion of the Z or ZZ domain.
  • the fluorescence labeling was then carried out via the interaction of cetuximab with the biotinylated antigen hsEGFR (1 ⁇ ) and the conjugate SA-PE (streptavidin-R-phycoerythrin).
  • SA-PE streptavidin-R-phycoerythrin
  • the surface-presented divalent ZZ domain was significantly more strongly labeled with the protein A-specific antibody and with the antibody cetuximab than the monovalent Z-domain. Accordingly, the ZZ domain was chosen as the Fc binding domain for all further experiments. The next
  • Sections address the results of experimental non-covalent surface presentation of VHH-Fc fusion proteins and IgG molecules.
  • VHH-Fc fusion proteins were transformed into electrocompetent EBY100 cells with plasmids pYD-ZZ (presentation of Fc binding domain) and pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc (secretion of VHH-Fc fusion protein).
  • the simultaneous expression of both constructs was induced by culturing the cells in galactose-containing medium.
  • various expression cultures were prepared which differed in their PEG8000 content (without PEG8000 (-PEG), 11% (w / v) (+ PEG)).
  • Figure 24 shows that the VHH-Fc fusion protein could be labeled by interacting with the biotinylated antigen hsEGFR on the surface of EBY100 cells. This finding was valid for cells cultured in medium without PEG8000 (-PEG) as well as for cells cultured in medium with PEG8000 (+ PEG). A difference between the samples of both cultures was in the intensity of the detected mean relative
  • FIG. 25 column: PE + Alexa 647.
  • FIG. 25 A summary of the photographic representation is shown in Fig. 25 below. From those shown in Fig. 25
  • results show that the VHH-Fc fusion proteins, mediated by the ZZ domain, were successfully presented on the surface of EBY100 cells.
  • the specificity of VHH domains could be demonstrated by binding to b-hsEGFR. No fluorescence signal from the cells was detected for binding to b-rFcRn.
  • the surface Presentation of complete IgG molecules studied The presentation of IgG molecules requires the functional assembly of four protein chains and the correct formation of disulfide bridges within each protein chain and among each other.
  • Example 12 Surface Presentation of IgG Molecules Up to this point, VHH-Fc fusion proteins could be successfully presented via interaction with the ZZ domain on the surface of EBY100 cells. This led to the question of whether it was also possible to present more complex molecules such as complete IgG molecules via the ZZ domain. In the run-up it was assumed that the
  • electrocompetent EBY100 cells were transformed with the plasmids pYD-gGal1-app8-HC, pYD-gGal1-app8-LC and pYD-ZZ-G418 and selected on suitable selective agar plates. Since the S. cerevisiae strain EBY100 only had two free auxotrophic markers (Trp / Leu) for transformation, the
  • the auxotrophic marker of the plasmid was substituted by homologous recombination with the resistance cassette kanMX4.
  • the kanMX4 cassette from the plasmid pFA6a-kanMX4 (Biochemistry, TU Darmstadt, AK Prof. Kolmar) with the
  • the amino acid asparagine located at position 297 had been mutated to glutamine to avoid the yeast-known hypermannosylation during N-glycosylation.
  • heavy and light IgG chains were secreted via the signal peptide app8.
  • the expression culture had a volume of 3 ml and was carried out in suitable galactose-containing SD medium + PEG8000. Expression was for 48 hours in the well of a 6-well plate at 20 ° C. After 24 and 48 hours, the cell density of the culture was determined and 1 ⁇ 10 7 cells were removed. The cells were labeled with biotinylated antigen hsEGFR and SA-PE. The Fc portion was tagged with a goat Fc-specific F (ab ' ) 2 fragment (AlexaFluor647 TM conjugate). The prepared cells were then placed in the Guava easyCyte HT 2L
  • Fig. 26 shows that the antibody matuzumab (IgG molecule) could be successfully displayed on the surface of EBY100 cells mediated by the ZZ domain because the specificity of the antibody was demonstrated by binding to the antigen (hsEGFR) could be. Both after 24 hours (Fig. 26 A) and after 48 hours (Fig. 26 B), a significantly higher relative fluorescence signal (M1) was detected compared to the negative control (Fig. 26 C).
  • the percentage of IgG-presenting cells had increased by seven percent compared to the 24-hour measurement. It was assumed that the binding of hsEGFR on the cell occurred only in the presence of heavy and light IgG chain, which is why a complete surface presentation of the IgG molecule was assumed.
  • the surface presentation of the antibody matuzumab was analyzed in a different approach. For this purpose, electrocompetent cells were transformed with the plasmids pYD-Aga2p-HC and pYD-pGal1-app8-LC and selected on suitable selective agar plates. In this experiment, the heavy IgG chain was expressed as Aga2p fusion, while the light chain was secreted secretly using the app8 signal peptide.
  • a 50 ml expression culture with galactose-containing SD medium + PEG8000 was subsequently prepared and the cells were cultured for 72 hours under the usual conditions. After 24 and 72 hours, 1 ⁇ 10 7 cells were labeled with 1 ⁇ b-hsEGFR and SA-PE and an Fc-specific F (ab ' ) 2 fragment AlexaFluor TM 647 and analyzed by flow cytometry in the flow cytometer Guava easyCyte HT 2L. The results are shown in Fig. 27.
  • the FACS analysis (Fig. 27) of the cells showed that although the Fc part of the IgG molecule could be specifically detected (relative fluorescence red), the binding of biotinylated antigen hsEGFR (relative fluorescence yellow) was not detected.
  • the IgG molecule was presented non-functional on the surface. Although it was possible to detect an approximately 28% larger cell population after 72 hours compared to 24 hours with the Fc-specific antibody, despite this no specific antigen binding could be detected by a prolonged expression period. Compared with the ZZ-mediated presentation, the surface presentation of matuzumab was unsuccessful in this approach as a heavy chain covalent Aga2p fusion.
  • VHH-Fc fusion proteins through interaction with the ZZ domain was the Surface presentation of VHH-Fc fusion proteins analyzed by flow cytometry over a period of 32 hours.
  • electrocompetent EBY100 cells were transformed with the plasmids pYD-ZZ and pYD-pGal1-app8-VHH1 ⁇ Fc and selected on selective agar plates.
  • the expression of the surface presentation of the VHH-Fc fusion protein was for 48 hours.
  • 2 ⁇ 10 7 cells were removed and resuspended in 200 ⁇ l PBS and 100 ⁇ l of the cell suspension were transferred to a separate reaction vessel. Both samples were pelleted and resuspended in 20 ⁇ M PBS.
  • One sample was labeled with b-hsEGFR (1 ⁇ ) and SA-PE. The other sample was not labeled. Both samples were
  • FIG. 28 A shows the fluorescence signals of fluorescence-labeled EBY100 cells (red) and unlabeled (black) EBY100 cells.
  • the two samples showed distinctly different mean relative fluorescence intensities (black: 23.9, red: 260.3).
  • the labeled sample (Fig. 28A, red) showed a fraction of 30.1% cells, which corresponded to the relative fluorescence signal of the unlabelled sample. These cells were not located within the M1 marker region and did not display the VHH-Fc protein. By mixing both samples, the percentage of these cells was increased (Figure 28 B).
  • 56.4% of the cells showed a relative fluorescence intensity corresponding to the unlabelled sample (FIG. 28A, black).
  • the decrease in signal strength was mainly determined by the dissociation of the VHH-Fc fusion proteins from the ZZ domain and the dissociation of the VHH: hsEGFR complex. It can be stated that the stability of the binding between the ZZ domain and the VHH-Fc fusion protein was sufficient for the requirements of the method since it could be stably detected over a sufficient period of time. To further study the stability of genotype-phenotype coupling, further mixing experiments were performed.
  • VHH-Fc protein A VHH-A
  • VHH-B VHH-Fc protein B
  • VHH-C VHH-Fc protein C
  • VHH domain A (pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc) substituted by homologous recombination in each case with the sequences of the VHH domains VHH-B and VHH-C.
  • the domains were constructed using specific oligodexy ribonucleotides
  • electrocompetent EBY100 cells were treated with the plasmids for soluble secretion of the various VHH-Fc fusion proteins (pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc, pYD-pGal1-app8-VHHB-Fc and pYD-pGal1-app8-VHHC-Fc) and the Transformed plasmid for the ZZ domain and prepared three separate expression cultures. The expression was for 48 hours carried out under the usual conditions. Subsequently, 1 ⁇ 10 7 cells of each culture were taken and labeled with different concentrations of b-hsEGFR.
  • b-hsEGFR was used at concentrations of 200 nM, 150 nM, 100 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM and 0.1 nM for labeling the cells.
  • the cells were labeled with SA-PE and an Fc-specific F (ab ' ) 2 fragment (AlexaFluor TM 647 conjugate).
  • Fig. 30 shows examples of the results of the measurements of the surface presentation of the
  • VHH-Fc fusion proteins labeled with 100 nM b-hsEGFR and SA-PE.
  • the marker region M1 was defined and the mean relative fluorescence intensity of these populations was plotted against the hsEGFR concentrations used.
  • Fig. 31 shows these results.
  • Fig. 30 additionally shows the previously performed biolayer interferometry measurements to determine the K D value.
  • Table 4.3 shows the calculated kinetic constants of VHH: hsEGFR interaction.
  • VHH-A 55 x 10 b 1, 02 x 10 3 1, 83 10 "3 7,29 x 10 " 6 1, 18 10 "8
  • VHH-C 1 48 x 10 5 4.18 10 2 6.98 x 10 "4 2.73 x 10 " 6 4.74 x 10 -9
  • Example 16 Change between surface presentation and soluble secretion
  • non-covalent surface presentation method selected proteins can be made soluble for further characterization. This is possible with the method presented here, in contrast to the conventional method without time-consuming intermediate steps.
  • comparable surface presentation methods such as e.g. using covalent surface presentation on yeast cells as the Aga2p fusion, it has heretofore been necessary to clone the selected clones into a suitable vector for soluble production of the protein.
  • the process presented here provides a key innovation by presenting the VHH-Fc fusion proteins noncovalently through interaction with the ZZ domain. Immanent is the procedure
  • the DNA sequence of the GAPDH promoter was amplified by PCR with the oligodeoxyribonucleotides gapdh-pYD-up and gapdh-pYD-rp and the plasmid pGAPZ (Life Technologies Corp.). By using the above-mentioned oligodeoxyribonucleotides, a PCR product was generated which had homologous sequence regions at its ends to the plasmid pYD-pGal-app8-VHH1-Fc. To initiate homologous recombination in yeast cells, the plasmid was linearized with the restriction endonuclease Kpn. The restriction was checked by agarose gel electrophoresis (data not shown). In advance, the
  • the plasmid pYD-pGal-app8-VHH1-Fc with the plasmid pYD-ZZ was also used to transform EBY100 cells.
  • the soluble VHH-Fc secretion like the surface presentation of the ZZ domain, is regulated by the Gal1 promoter, whereby the soluble secretion of the VHH-Fc fusion proteins is not possible via the transfer of the cells into glucose-containing medium. After selection on suitable selective agar plates, one clone each was used to prepare a glucose-containing SD culture + PEG8000.
  • Fc-specific F (ab ' ) 2 fragment AlexaFluor TM 647 conjugate
  • FITC conjugate protein A-specific antibody
  • Fig. 32 demonstrate the consistent behavior of both promoter pairs with respect to the surface presentation of VHH-Fc fusion proteins under different culture conditions. Neither the ZZ domain (gray Fig. 32 A and B) nor the VHH-Fc fusion protein (gray, Fig. 32 C and D) were presented on the cell surface by culturing in glucose-containing medium.
  • the behavior of the promoter pair pGAPDH / pGall was analyzed in more detail.
  • cells of the glucose-containing culture were transferred to galactose-containing medium + PEG8000 to induce surface presentation and cultured for 48 hours at 20 ° C and 250 rpm.
  • the detection of gene expression of ZZ domain and VHH-Fc construct was achieved by fluorescence labeling of the surface-presented proteins and analysis of the cells in the flow cytometer.
  • the ZZ domain was expressed via a protein A-specific FITC-labeled antibody from the goat (relative fluorescence green), the VHH-Fc fusion protein via an Fc fragment-specific F (ab ' ) 2 fragment (AlexaFluor TM 647 conjugate) from the goat (relative fluorescence red) marked.
  • the results of this measurement are shown in Fig. 33 A.
  • glucose-containing medium was inoculated with cells from the galactose-containing culture. The cell density used to make this culture was 0.5 * 10 7 cells / ml. The cells were then cultured for 48 hours at 30 ° C and 250 rpm. It was followed by another transfer of the cells.
  • Fig. 33 illustrates the successful repression of the surface presentation of the ZZ domain by the transfer of the lines in glucose-containing medium (Fig. 33 B). This also prevented the surface presentation of the VHH-Fc fusion proteins, as they could no longer be captured on the cell, but were further secreted.
  • Fusion protein into the culture supernatant was prepared Western blot analyzes of the culture supernatants. After determining the cell density of the previously described glucose and
  • Galactose-containing cultures were sampled from the culture supernatants of one volume, corresponding to 1 x 10 7 cells and precipitated by TCA and processed for LDS-PAGE and Western Blot analysis. One sample was taken after cultivation in
  • results of the Western blot analysis are shown below.
  • the VHH-Fc fusion protein could not be detected during culture in galactose-containing medium in both promoter pairs in the culture supernatant (lanes 1 and 2).
  • an Fc-specific signal was detected in the Western blot (lane 4) and thus the VHH-Fc protein was detectable in the culture supernatant.
  • the further cultivation increased the strength of the signal and demonstrated the ongoing gene expression and subsequent accumulation of the proteins in the culture medium (lane 6). From this it could be concluded that the longer expression duration led to an increased VHH-Fc concentration in the culture supernatant.
  • the Gal1 / Gal1 When using the Gal1 / Gal1
  • VHH-Fc fusion protein Localization of the VHH-Fc fusion protein by changing the culturing conditions of surface presentation to soluble secretion switch to the culture supernatant.
  • VHH-Fc fusion proteins have been achieved by the generation of various VHH libraries and their surface presentation is tested on yeast cells.
  • the preparation of the VHH libraries was done using different technologies known in the literature.
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung und nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von Antikörpern und abgeleiteten Fragmenten sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von S. cerevisiae Zellen. Die nicht- kovalente Weise der Oberflächenpräsentation ermöglicht die Selektion von spezifischen Varianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung und die nachfolgende schaltbare Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur biochemischen Charakterisierung.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON SEKRETIERBAREN ANTIKÖRPERN DURCH EXPRESSION IN SACCHARO YCES CEREVISIAE
Gegenstand der Erfindung: Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung und nicht-kovalenten
Oberflächenpräsentation von Antikörpern und abgeleiteten Fragmenten sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von S. cerevisiae Zellen. Die nicht- kovalente Weise der Oberflächenpräsentation ermöglicht die Selektion von spezifischen Varianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung und die nachfolgende schaltbare Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur biochemischen Charakterisierung.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Präsentieren von Antikörpern oder
Antikörperbibliotheken auf der Oberfläche von Hefezellen und Screenen dieser Bibliotheken nach Immunglobulinen mit bestimmten gewünschten Eigenschaften.
Hintergrund der Erfindung Die Entdeckung monoklonaler Antikörper hat die Hybridomatechnologie hervorgebracht, mit deren Hilfe Antikörper von bestimmter Spezifität und Affinität gezielt hergestellt werden können. Daraus entwickelte kombinatorische Bibliotheken inklusive Screening- und
Auswahlmethoden haben sich zu gängigen Werkzeugen entwickelt, um
Bindungseigenschaften von Proteinen generell zu ändern.
Die weitverbreitetste Technik zum Generieren und Screenen von Antikörperbibliotheken war und ist teilweise immer noch die "Phage Display"- Methode, bei der das jeweilige Protein von Interesse als Fusionspolypeptid auf einem Bakteriophagen-Hüllprotein exprimiert und durch Bindung an immobilisierten oder löslichen biotinylierten Liganden selektiert werden kann. Ein Phage , der auf diese Weise konstruiert wurde, kann als kompakte genetische Einheit betrachtet werden, welche sowohl die phänotypischen als auch die genotypischen
Eigenschaften in sich vereint hat. Phage Display ist sehr erfolgreich auf Antikörper,
Antikörperfragmente, Enzyme, DNA-Bindungsproteine usw. angewendet worden. Antikörper, die gewünschte Bindungs-Eigenschaften besitzen, werden durch Bindung an ein
immobilisierten Antigen in einem Prozess selektiert, den man "Panning" bezeichnet. Phagen, welche, nicht spezifische Antikörper aufweisen, werden ausgewaschen, und die gebundenen Phagen werden abgelöst und in E. coli amplifiziert. Dieser Ansatz wurde eingesetzt, um eine Vielzahl von antigen-spezifischen Antikörpern zu generieren. Nichtsdestoweniger weist die Phage Display-Technologie einige prinzipielle Mängel und Schwierigkeiten, welche ihren Einsatz limitiert, insbesondere bei der Herstellung eukaryotischer Proteine. So sind beispielsweise sehr hoch-affine Antikörper nur schwer durch "Panning" zu isolieren und weiter zu verarbeiten. Zudem sind posttranslationale Änderungen wie z.B. Glycosylierung, welche Spezifität und Affinität des Antikörpers beeinflussen kann, mit Phage Display
Methoden nicht möglich.
Eine Alternative besteht im Einsatz von niederen eukaryotischen Systemen, wie Hefe. Die strukturelle Ähnlichkeit zwischen B-Zell-präsentierenden Antikörpern und Hefe-Zellpräsentierenden Antikörpern liefern eine nähere Analogie zu in-vivo "Affinity Maturation" als bei fitamentösen Phagen. Insbesondere weil eukaryotische Zellen, wie Hefe, befähigt sind, glycosylierte Proteine zu produzieren, wohingegen filamentöse Phagen dies nicht können, sollten monoklonale Antikörper aus eukaryotischen Wirtszellen Eigenschaften aufweisen, die humanen oder Säugetier-Antikörpern mehr ähneln als Antikörper aus Phagen. Überdies hat sich die Klonierung, Expression und Modifizierung von Antikörpern insbesondere in Hefe methodisch und praktisch als effektiv und einfach erwiesen. US 6,699,658 beschreibt zum Beispiel ein Hefezellen-Oberflächen-Präsentations-Verfahren, mit dessen Hilfe ein Screenen und Erzeugen von kombinatorischen Antikörperbibliotheken möglich wurde. Die besagte "Yeast-Surface-Display" -Technologie basiert auf der Transfektion von Hefezellen mit Vektoren, welche ein Immunglobulin exprimieren, das an ein Hefezellwandprotein fusioniert ist, unter Einsatz von Mutagenese, um eine Vielfalt von Immunglobulinmutanten zu erzeugen und um dann diese Zellen nach den gewünschten phänotypischen Eigenschaften zu selektieren. Etabliert wurde diese Technologie 1997 von Boder und Wittrup. Ihnen gelang es zum ersten Mal, scFv-Fragmente einer kombinatorischen Bibliothek funktionell auf der Oberfläche von Hefezellen zu präsentieren und durchflusszytometrisch zu durchmustern und scFv-Fragmente mit gesteigerter Affinität für das Antigen zu isolieren. Ermöglicht wurde dies durch die stabile Kopplung von Geno- und Phänotyp, da das scFv-Fragment als
Fusionsprotein mit einem Hefe-eigenen Zellwandprotein präsentiert wurde. Die vermutlich wichtigste Errungenschaft, die durch die Verwendung der Hefe-basierten Display- Technologie erfolgte, ist die direkte Anwendbarkeit von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), die bei der effizienten Durchmusterung von großen Varianten-Bibliotheken entscheidend ist. Eine stabile Genotyp-Phänotyp Kopplung wird durch die Fusionierung eines heterologen Proteins mit Proteinen der äußeren Zellwand von S. cerevisiae erreicht. Die dadurch erreichte Exponierung des Proteins ist die Voraussetzung für die Interaktion mit Antigenen.
Doch auch die eben beschriebene Yeast Surface Display - Technologie, wie von Wittrup und Boder entwickelt, besitzt einige insbesondere praktische Nachteile. Ein Nachteil ist beispielsweise, dass das die verschiedenen exprimierten Proteine nicht oder nur unbefriedigend mit der selben Hefezelle erhalten werden können. Ferner ist gemäß der Methode von Wittrup das gewünschte Immunglobulin kovalent an das Zellwandprotein gebunden und muss durch zusätzliche Verfahrensschritte isoliert werden. Die WO 2010/005863 beschreibt ein entsprechendes Yeast-Surface Display - System auf Grundlage von Hefezellen der Gattung Pichia pastoris, bei dem das Immunglobulin nicht- kovalent an die ZZ-Domäne von Protein A gebunden ist, wobei das Fusionsprotein aus dem Zellwandprotein Agglutinin bzw. seiner Untereinheiten und der ZZ-Domäne und das
Immunglobulin nur dann gleichzeitig in der Hefezelle exprimiert und sekretiert wird, um an der Zelloberfläche präsentiert zu werden, wenn entsprechende unterschiedliche Promotoren zur Expression der besagten Proteine chronologisch richtig ein- oder abgeschaltet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Entwicklung einer Methode zur nicht-kovalenten
Oberflächenpräsentation von Antikörpern und abgeleiteten Fragmenten sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von Zellen der Hefespezies S.
cerevisiae. Die nicht-kovalente Weise der Oberflächenpräsentation soll die Selektion von spezifischen Varianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung und die nachfolgende schaltbare Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur
biochemischen Charakterisierung ermöglichen. Im Mittelpunkt steht die erfolgreiche Kombination von Selektion und Produktion mit dem zeitersparenden Verzicht von Subklonierungen und Reformatierungsschritten, wie dies bei den bekannten vergleichbaren Methoden wie z.B. der Oberflächenpräsentation von Proteinen auf Phagen notwendig ist . Durch diese Kombination kommt es zur Vereinfachung und Beschleunigung von sich anschließenden Prozessen in der Wirkstofffindung von Antikörpern. Durch die an sich bekannte Verwendung einer Fc-Bindedomäne, vorzugsweise der ZZ- Domäne aus Staphylococcus aureus Protein A als Vermittler der Oberflächenpräsentation können Antikörper, biologisch aktive Antikörperfragmente und Antikörperdomänen, wie beispielsweise VHH-Fc Fusionsproteine (bestehend aus zwei Proteinketten) erfolgreich auf Hefezellen präsentiert werden. Überraschenderweise wird durch die Verwendung der Hefe S. cerevisiae als
Wirtsorganismus bereits während der Oberflächenpräsentation auf korrekte Faltung,
Sekretion und Stabilität des Proteins selektiert, da diese Hefe als Eukaryot über
Mechanismen zur Qualitätskontrolle bei der Proteinsynthese verfügt. Durch das hier dargestellte Verfahren ist es möglich, VHH-Fc Fusionsproteine und komplexere Proteine, wie ganze Antikörper, in ihrem finalen anwendungsspezifischen Format auf der Oberfläche von Hefezellen zu präsentieren, und so Methoden des Protein-Eng/neer/ngs anwenden zu können. Im Anschluss kann der selektierte Klon direkt zur Produktion des Proteins verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Erzeugung einer Vielfalt von IgG Molekülen, wie Antikörpern, biologisch aktiven Antikörperfragmenten oder
Antikörperdomänen mit bestimmten Eigenschaften durch Exprimierung, Sekretierung und Präsentation derselben an der Oberfläche von Hefezellen, wobei das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellung von Wirtszellen der Hefe-Spezies Saccharomyces cervisiae, die mit einem ersten und einem zweiten Nukleinsäuremolekül in Form geeigneter Plasmide transfiziert wurde, wobei das erste Nukleinsäuremolekül für ein Fusionsprotein kodiert, das im wesentlichen ein Zelloberflächenankerprotein, eine Fc-Bindungs-Domäne sowie einen regulierbaren Promoter umfasst, der die Expression des Fusionsprotein steuert in
Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen, und das zweite Nukleinsäuremolekül für besagte Population von Antikörpern, besagtes Antikörperfragmenten oder
Antikörperdomänen in Form ihrer leichten und schweren Ketten kodiert und unter der
Kontrolle eines permanent aktiven Promoters steht,
(b) Exprimieren des Fusionsproteins unter gleichzeitiger Co-Exprimierung der Vielfalt von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperdomänen in den Hefezellen in Gegenwart von Polyethylenglycol (PEG) mit einem Molekulargewicht > 5000 im Kultivierungsmedium, wobei die besagten IgG Moleküle als auch das Fusionsprotein in löslicher Form aus der Hefezelle sekretiert werden,
(c) Präsentieren der Vielfalt von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder
Antikörperdomänen, welche an die Fc-Bindungsdomäne des exprimierten und an der
Zelloberfläche verankerten Fusionsproteins in nicht kovalenter Form gebunden sind, an der Oberfläche der Hefezellen,
(d) Selektieren und Isolieren von Hefezellen nach gewünschten unterschiedlichen phänotypischen oder Bindungseigenschaften der Vielfalt von Antikörpern, biologisch aktiven Antikörperfragmenten oder Antikörperdomänen, welche an die Fc-Bindungsdomäne gebunden sind, mit Hilfe von Detektionsmarkern, die mit dem Fusionprotein oder dem Ig- Molekül verbunden sind oder in ihnen enthalten sind,
(e) Exprimierung der Vielfalt von Antikörpern, biologisch aktiven Antikörperfragmenten oder der Antikörperdomänen in der jeweilig selektierten Hefezellpopulation unter
Kultivierungsbedingungen, die keine oder keine wesentliche weitere Exprimierung des Fusionsprotein ermöglichen, und
(f) Isolierung der Vielfalt von Antikörpern mit den ausgewählten phänotypischen oder Bindungseigenschaften aus dem Kulturmedium.
Im Unterschied hierzu läuft bei dem Verfahren nach der WO 2010/0058863 die Expression des an sich identischen Fusionsproteins und des Immunglobulins in Pichia pastoris nicht gleichzeitig ab: vielmehr arbeitet das System nur dann einigermaßen effektiv, wenn zunächst die Expression des Zelloberflächen-"Capture"-Moleküls durch Aktivierung des zuständigen Promoters induziert und betrieben wird, ohne dass gleichzeitig eine nennenswerte
Expression der leichten und schweren Ketten des Immunglobulins erfolgt. Dies wird erst in einem zweiten Schritt erreicht, nachdem die Expression des Capture- oleküls durch
Inhibierung über den regulierbaren Promoter zum Stillstand gekommen ist.
Dies ist beim erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise nicht notwendig. Während der Promoter für die Fc-Bindedomäne zunächst aktiviert wird, kann bereits die Expression des Ig- Moleküls gleichzeitig erfolgen. Nachdem ausreichend Fc-Bindungsdomäne in der Hefezelle unter gleichzeitiger Co-Expression und Co-Sekretion von Ig exprimiert und sekretiert wurde, um schließlich an der Zelloberfläche gebunden zu werden, erfolgt nach Abschaltung des Promoters für die Fc-Bindungsdomäne weiter die Expression der Ig
Moleküle, welche nach ihrer Sekretion an freie Fc-Bindungsdomänen nicht-kovalent gebunden werden. Dies ist um so überraschender, da in der WO 2010/0058863 prinzipiell das gleiche oder sehr ähnliche Zellwandoberflächenprotein als Ankerprotein und die gleiche Fc-Bindungsdomäne (ZZ Domäne) eingesetzt werden. So mit scheint der Unterschied beim erfindungsgemäßen Verfahren in der anderen Hefespezies (S. cerevisiae gegenüber P.
pastoris) und in der Verwendung von höher molekularen Polyethylenglykol zu liegen. Es hat sich gezeigt, dass der Einsatz von PEG mit einem Molekulargewicht von > 5000,
insbesondere > 6000, insbesondere > 7000 und vorzugsweise > 8000 zu einer deutlichen Steigerung der auf der Zelloberfläche anzutreffenden Ig-Moleküle führt, was vermutlich mit einer gesteigerten Sekretion durch PEG einhergeht. Überraschenderweise wurde bei Weglassen von PEG oder Einsatz von PEG mit niedrigerem Molekulargewicht (< 5000, insbesondere < 7000, insbesondere < 8000) eine unzureichende Anzahl von gebundenen Ig- Molekülen auf der Zelloberfläche beobachtet, was vielleicht auch den Unterschied zu dem Verfahren der WO 2010/005863 erklärt. Generell hat sich bislang die Sekretion und
Oberflächenpräsentation von insbesondere vollständigen Ig-Molekülen auf S. cerevisiae als kompliziert erwiesen. Im Gegensatz zu dem Verfahren aus der WO 2010/005863 muss in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren lediglich die Expression eines Proteins, nämlich des
Fusionsproteins aus dem Zellwandprotein und der Fc-Bindungsdomäne reguliert werden, vorzugsweise durch den GAL1 Promoter, während das IgG- olekül, beispielsweise das VHH-Fc Fusionsprotein permanent also konstitutiv exprimiert wird, unabhängig von der Expression des anderen Proteins, welche die Fc-Bindungsdomäne umfasst.
Gemäß der Erfindung wird als Zellwandankerprotein aggiutinin, insbesondere a-agglutinin eingesetzt. Dieses bindet mit seiner Untereinheit agalp direkt an die Zellwand. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein, welches in der Hefezelle exprimiert wird, und an agal p über Disulfidbrücken bindet, umfasst die zweite Untereinheit von aggiutinin, aga2p, welches C-terminal an die ZZ-Domäne aus Protein A gebunden ist.
Gegenstand der Erfindung ist somit weiter ein entsprechendes Verfahren, bei dem das Zelloberflächenankerprotein a-agglutinin oder alpha-agglutinin ist, und das Fusionsprotein aga2p und eine Fc-Bindungsdomäne, vorzugsweise die ZZ-Domäne des Protein A aus Staphylococcus aureus umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist somit insbesondere ein Verfahren, bei dem die Expression (und Sekretion) des Fusionproteins aus ZZ-Domäne und aga2p durch den GAL1 Promoter reguliert wird.
Gegenstand der Erfindung ist weiter insbesondere ein Verfahren, bei dem die Expression (und Sekretion) der Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperdomänen unter der Kontrolle des GAPDH Promoter ist, wobei die Expression konstitutiv zur Expression des Fusionsproteins aus ZZ-Domäne und aga2p Untereinheit erfolgt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein entsprechendes Verfahren, bei dem bei der Expression/Sekretion im Expressionmedium PEG mit einem Molekulargewicht > 5000, insbesondere > 7000 - 8000, vorzugsweise PEG8000 eingesetzt wird.
Gegenstand der Erfindung ist letztlich ein entsprechendes Verfahren zur Erzeugung einer Antikörper-Bibliothek zur Generierung und Selektierung von ganzen Antikörpern, Fab- Fragmenten oder anderer biologisch aktiver Antikörperdomänen mit ausgewählten phänotypischen oder Bindungseigenschaften. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im allgemeinen sind die Immunglobuline, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, IgG, IgA, IgE oder IgM Moleküle, vorzugsweise jedoch IgG Moleküle, die lgG1 , lgG2, lgG3 und lgG4 umfassen. Der Ausdruck "transfizieren", "Transfection", "transformieren" oder "Transformation" wird synonym eingesetzt und bedeutet gemäß der Erfindung das Einbringen von heterologer Nukleinsäre (DNA/RNA) in eine eukaryotische Zelle, insbesondere Hefezellen.
Antikörperfragmente sind erfindungsgemäß funktionelle Teile von vorzugsweise
monoklonalen Antikörpern, wie Fe, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, scFv verstanden. Unter
entsprechenden biologische aktiven Fragmenten sind erfindungsgemäß, solche Teilevon Antikörpern zu verstehen, welche zur Bindung an ein Antigen befähigt sind, wie Fab, Fab', Fv, F(ab')2, und scFv.
Unter einer Fc-Bindungsdomäne wird erfindungsgemäß, ein Molekül oder Teil eines
Moleküls, vorzugsweise ein Protein oder Polypeptid, verstanden, welches befähigt ist, an einen Fc-Teil eines Antikörpers oder Bereichen davon kovalent oder nicht-kovalent zu binden. Erfindungsgemäß bindet die Fc-Bindungsdomäne vorzugsweise nicht-kovalent an den Fc-Teil eines Antikörpers oder Imunglo
Das in dieser Anmeldung vorgestellte Verfahren zur nicht-kovalenten
Oberflächenpräsentation auf Hefezellen wurde erfolgreich zur Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Proteinen und IgG-Molekülen angewendet. Die Stabilität der nicht- ovaienten
Interaktion zwischen ZZ-Domäne und Fc-Teil garantierte eine ausreichend stabile Genotyp- Phänotyp-Kopplung und ermöglichte so die Anwendung des Verfahrens bei der Anreicherung von Zielzellen innerhalb verschiedener Mischungen. Zukünftige Anwendungen des
Verfahrens liegen z.B. in der Durchmusterung von Bibliotheken von IgG-Molekülen oder diversen Fc-Fusionsproteinen zur Identifizierung von Proteinen mit gewünschten
Eigenschaften im Bereich des Protein-Engr/'neer/'ng. Hier ist die Verwendung einer Bibliothek von Vorteil, von welcher bekannt ist, dass sie Varianten enthält, die den erwünschten
Fuktionsansprüchen genügen. Da sogar kleinste Unterschiede in den Affinitäten von VHH- Domänen während der Oberflächenpräsentation innerhalb des Verfahrens abgebildet werden konnten, eignet sich dieses Vefahren besonders gut zur Affinitätsmaturierung von Antikörpern mit anschließender löslicher Produktion und biophysikalischer Charakterisierung. Zur Vereinfachung des Verfahrens kann die Verwendung alternativer Ankerproteine für die Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne erprobt werden, da dadurch die Anwendung nicht mehr auf die Verwendung des Hefestamms EBY100 limitiert ist. Prinzipiell sind viele
Zellwandproteine aus S. cerevisiae zur Oberflächenpräsentation von heterologen Proteinen tauglich. In der Literatur sind hierzu etliche Beispiele beschrieben93, Die Verwendung eines anderen Ankerproteins ermöglicht die unabhängige Wahl des Expressionsstamms, da nicht mehr zwangsweise ein Stamm mit chromosomaler Integration der Aga1-Expressionskassette, wie EBY100, verwendet werden muss. Das eröffnet zusätzlich die Möglichkeit, einen für spezifische Ansprüche des heterologen Proteins geeigneten Expressionsstamm zu
generieren und zu verwenden.
Die erfindungsgemäßen Plasmidkonstruktionen sind in den Abbildungen 36 bis 39 dargestellt. Sie geben generell nur Beipiele, oder bevorzugte Beispiele von Plasmiden und
Plasmidkonstruktionen wieder und können vom Fachmann jederzeit durch andere oder Varianten davon ausgestauscht werden, solange die entsprechenden
erfindungswesentlichen DNA Sequenzen eingesetzt werden und die gewünschten
Funktionen initiieren.
Des Weiteren könnte es sich als vorteilhaft erweisen, die ZZ-Domäne stabil in das
Hefegenom zu integrieren, um eine flexiblere Markerwahl für die lösliche Sekretion und eine erleichterte Generierung von Molekül-Bibliotheken zu ermöglichen. Zur Erhöhung der
Sekretionseffizienz ist eine weitere Stamm-Manipulation zu empfehlen, da die alleinige
Überexpression der Oxidoreduktase PDI nicht zu den gewünschten Proteinausbeuten geführt hat. Eventuell ist die Überexpression weiterer, an der Sekretion beteiligter ER-Iokalisierter Proteine, wie z.B. Erol p erforderlich, um die gewünschten Proteinausbeuten zu erzielen.
Staphylococcus aureus Protein A Auf der Oberfläche von Bakterien befinden sich unter anderem Proteine, die hoch-affin an Immunglobuline binden können61. Sie unterscheiden sich in ihrer Spezifität bezüglich der Wirtsspezies und der Immunglobulinklassen, die sie binden können. Bei den Bakterien handelt es sich vorwiegend um pathogene Vertreter der Gattungen Staphylococcus und Streptococcus. Die biologische Funktion der Oberflächenproteine besteht in der Maskierung der bakteriellen Zelle mit Wirts-eigenen Proteinen, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen62. Eines der bekanntesten Immunglobulin-bindenden bakteriellen Oberflächenproteine ist das Staphylococcus aureus Protein A, SpA genannt. Es findet biotechnologisch Anwendung zur Affinitätsreinigung von IgG-Molekülen und Fc-Fusionsproteinen und setzt sich aus fünf Domänen zusammen, die alle zur IgG-Bindung beitragen und auch einzeln noch IgG-bindende Eigenschaften besitzen Die Bindung von IgG-Molekülen findet hauptsächlich über den Fc-Teil statt. Des Weiteren ist die Bindung von SpA an Fab-Fragmenten gezeigt worden64. Die Domänenstruktur von SpA ist in Abb. 1 gezeigt65. Zusätzlich zu den fünf stark sequenzhomologen Domänen (E, D, A, B und E) finden sich noch zwei weitere Domänen (X und M), die die Verankerung von SpA in der bakteriellen Zellwand vermitteln, und ein N- terminales Signalpeptid (SP), das SpA zur Zellwand navigiert. Die Bindung von SpA an Fc- Teile ist pH-abhängig61. Die stärkste Bindung liegt bei einem pH-Wert von 8 vor66. Wie bereits erwähnt können die Domänen E, D, A, B und E auch einzeln die Bindung an Fc-Teile und Fab-Fragmente vermitteln. Dadurch ergeben sich Vorteile insbesondere bezüglich der biotechnologischen Verwendung dieser Domänen. Auf Grund der im Vergleich zu SpA geringeren Größe ist die rekombinante Herstellung der einzelnen Domänen gegenüber SpA vereinfacht. Von Domäne B leitet sich eine artifizielle Domäne ab, die 1987 durch eine Aminosäuresubstitution an Position 29 von Nilsson und Mitarbeitern generiert wurde67. Sie wird Z-Domäne genannt und zeigt eine erhöhte chemische Stabilität. Zusätzlich wurde durch die erwähnte Aminosäuresubstitution ein Verlust der Bindung der Z-Domäne an Fab- Fragmente erreicht. Dadurch bindet die Z-Domäne ausschließlich über den Fc-Teil das IgG- Moleküle68. Wie Domäne B nimmt auch die Z-Domäne eine Struktur aus drei α-Helices ein69, 70. Durch die Verwendung einer duplizierten Z-Sequenz (ZZ-Domäne) wird eine stärkere Bindung der ZZ-Domäne im Vergleich zur Z-Domäne für Fc-Teile erreicht. Die ZZ-Domäne ist ein divalentes Molekül wodurch die Fc-Bindung durch einen Aviditätseffekt im Vergleich zur monovalenten Z-Domäne verstärkt wird71.
Oberflächenpräsentation auf Hefezellen
Die Exponierung von Protein- und Peptidbibliotheken auf der Oberfläche von Hefezellen wird als Technik zur gerichteten Evolution von Proteinen verwendet und in der Literatur als„Yeast Surface Display" bezeichnet. Etabliert wurde diese Technologie 1997 von Boder und
Wittrup92. Ihnen gelang es zum ersten Mal, scFv-Fragmente einer kombinatorischen
Bibliothek funktionell auf der Oberfläche von Hefezellen zu präsentieren und
durchflusszytometrisch zu durchmustern und scFv-Fragmente mit gesteigerter Affinität für das Antigen zu isolieren92. Ermöglicht wurde dies durch die stabile Kopplung von Geno- und Phänotyp, da das scFv-Fragment als Fusionsprotein mit einem Hefe-eigenen Zellwandprotein präsentiert wurde. Die vermutlich wichtigste Errungenschaft, die durch die Verwendung der Hefe-basierten D/sp/ay-Technologie erfolgte, ist die direkte Anwendbarkeit von Fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), die bei der effizienten Durchmusterung von großen
Varianten-Bibliotheken entscheidend ist. Eine stabile Genotyp-Phänotyp Kopplung wird durch die Fusionierung eines heterologen Proteins mit Proteinen der äußeren Zellwand von S. cerevisiae erreicht. Die dadurch erreichte Exponierung des Proteins ist die Voraussetzung für die Interaktion mit Antigenen. Prinzipiell sind viele verschiedene Zellwandproteine imstande, heterologe Proteine und Peptide als Fusionspartner zu exponieren, z.B. α-Agglutinin und a- Agglutinin, Cwpl p und Flol p93, 94. Unter all diesen Proteinen hat sich das a-Agglutinin System besonders etabliert. Zur Zeit findet dieses System Anwendung in der Selektion von
Antikörpern aus naiven, immunisierten und synthetischen Antikörper-Bibliotheken. Feldhaus und Mitarbeiter zeigten im Jahr 2003 die Selektion hoch-affiner scFv- arianten aus einer nicht-immunisierten humanen Variantenbibliothek, die auf der Oberfläche von
Saccharomyces cerevisiae präsentiert wurde95. Auch die Affinitätsmaturierung von
Antikörper-Fragmenten konnte erfolgreich durch die Oberflächenpräsentation von Fab- Fragementen auf Hefezellen gezeigt werden96. Im folgenden Abschnitt ist das 1997 von Boder und Wittrup etablierte System zur Oberflächen-präsentation auf Hefezellen mittels a- Agglutinin näher erläutert. a-Aaalutinin System Agglutinine sind Paarungstyp-spezifische Adhäsionsproteine der äußeren Zellwand von S. cerevisiae und vermitteln die Zell-Zell-Anhaftung zwischen haploiden Hefezellen
komplementären Paarungstyps während der Verschmelzung dieser Zellen zur dipoliden Zygote. Dieser Prozess wird in der Literatur als Mating bezeichnet. Hefezellen mit dem Paarungstyp a exprimieren a-Agglutinin und Hefezellen mit dem Paarungstyp α exprimieren α-Agglutinin97. Das Zellwandprotein a-Agglutinin baut sich aus den Untereinheiten Agal p und Aga2p auf. Die Untereinheit Agal p besitzt ein GPI-Ankersignal und vermittelt die Befestigung des Proteins in der extrazellulären Matrix der Zellwand durch die kovalente Bindung von ß- Glucan98. Die Untereinheit Aga2p wird ebenfalls von der Zelle sekretiert und ist mit Agal p über zwei Disulfidbrücken verbunden. Für die Exponierung von heterologen Proteinen unter Verwendung des a-Agglutinin Systems wird das zu präsentierende Protein in der Regel als C- terminale Fusion mit der Untereinheit Aga2p in einen entsprechenden Expressionsvektor kloniert92. Das nach der Induktion der Genexpression translatierte und auf der Oberfläche präsentierte rekombinante Konstrukt ist schematisch in Abb. 2 dargestellt. AGA 1 (Agal p) wird von einer chromosomal integrierten Galaktose-induzierbaren Expressionskassette exprimiert. Durch die Assoziation von Agal p und Aga2p wird das heterologe Protein kovalent auf der Oberfläche der Hefezelle exponiert und kann anhand seiner Bindungseigenschaften oder mittels Affinitätsepitopen durchflusszytometrisch detektiert werden (Abb. 2). Für die Expression, Sekretion und Oberflächenpräsentation diverser Proteine war während der vorliegenden Arbeit das„pYD1 Yeast Display Vector Kit" (Invitrogen) kommerziell erhältlich. Saccharomyces cerevisiae als Expressionssystem
Rekombinante Proteine werden schon lange erfolgreich in verschiedenen Wirtsorganismen hergestellt. Hierzu zählen prokaryotische Expressionssysteme wie E. coli00 aber auch eukaryotische Expressionssysteme wie Säugerzellen101. Saccharomyces cerevisiae eignet sich ebenfalls zur Expression heterologer Proteine, auch deshalb, weil es der am besten charakterisierte eukaryotische Wirtsorganismus ist, der besonders seit der
Genomsequenzierung 1996 als Modellorganismus zur Untersuchung eukaryotischer
Zellfunktionen verwendet wird102, 103. Als einzelliger Organismus ist er weniger komplex als andere eukaryotische Systeme und seine Kultivierung ist in definiertem Medium möglich, wodurch eine gute Kontrolle der Wachstumsbedingungen und eine deutliche Reduzierung der Kultivierungskosten möglich ist104. Der vergleichsweise kurze Lebenszyklus mit einer
Generationszeit von ca. 90 Minuten ist ein weiterer Grund für die bevorzugte Verwendung der Hefe S. cerevisiae102. Als Einzeller kombiniert die Hefe sowohl die Vorteile mikrobiologischer Expressionssysteme durch die einfache Kultivierung und die Anwendung industrieller
Fermentationsmethoden als auch die Vorteile eukaryotischer Expressionssysteme durch das Vorhandensein eukaryotischer Expressions- und Sekretionswege in der Zelle. Darüber hinaus ist eine große Auswahl an Hefevektoren vorhanden, die die genetische Manipulation ermöglicht105. Im Vergleich zu anderen Hefen wie z.B. Pichia pastoris wird S. cerevisiae oft eine geringere Sekretionseffizienz zugeschrieben, weshalb sie industriell oft nicht als
Wirtsorganismus für die Produktion heterologer Proteine favorisiert wird106. Die Bedeutung der Hefe S. cerevisiae als Wirtsoganismus für die Expression heterologer Antikörpermoleküle ist im folgenden Abschnitt dargestellt.
Antikörperexpression in Saccharomyces cerevisiae
Für eine biochemische und biophysikalische Charakterisierung z.B. mittels Immuno- präzipitation, ELISA oder Biolayer-Interferometrie ist es notwendig, die rekombinanten
Proteine in ausreichendem Maße zu produzieren. Derzeit exisiert bereits eine Vielzahl von Produktionssystemen, die eine ausreichende Ausbeute eines löslichen Antikörpers oder Antikörper-Fragments erzielen. Bei diesen Expressionsystemen handelt es sich z. B. um Säugerzellen, die Spalthefe Pichia pastoris, Insektenzellen oder E. co//107' 09. Die Expression von Antikörpern in S. cerevisiae erwies sich lange Zeit als weniger geeignet, da die
Ausbeuten oft zu gering für weitere Anwendungen waren. Für IgG-Moleküle wurden lediglich Ausbeuten von 50 pg/L erzielt110. Durch einen evolutiven Ansatz gelang es Rakestraw und Mitarbeitern 2009, die Sekretion von scFv-Fragmenten und IgG-Molekülen aus S. cerevisiae deutlich zu steigern. Mittels Durchmusterung einer Variantenbibliothek für das Signalpeptid MFal p wurden Mutanten identifiziert, die die Sekretion von scFv-Fragmenten aus S.
cerevisiae um das 16fache gegenüber der Wildtypsequenz erhöhten1 1. Mit dem gleichen Ansatz in Kombination mit der Manipulation des Hefestamms konnte die Sekretion eines funktionellen IgG-Moleküls sogar um das 180fache erhöht werden111. Dieser Befund demonstriert die Relevanz des verwendeten Signalpeptids für die Sekretion heterologer Proteine in Hefezellen. Besondere Bedeutung findet dieser Umstand in industriellen
Prozessen, in welchen eine ausreichende Sekretion wichtig für die Vereinfachung von nachfolgenden Prozessschritten ist10. Ebenso entscheidend ist auch die Wahl des geeigneten Hefestamms. Durch die genetische Manipulation von Expressionstämmen ist es möglich, die Sekretionsleistung eines Stamms für die Expression heterologer Antikörper-Moleküle zu erhöhen. In diesem Zusammenhang sind Proteine wichtig, die mit dem Sekretionsweg der Hefe assoziiert sind. Dabei handelt es sich z.B. um Enzyme wie die Oxidoreduktase PDI {Proteine disulfide isomerase), welche an der Reduktion und Oxidation von Disulfidbrücken beteiligt ist und HSP70 Chaperone wie BiP (Binding Immunoglobulin protein), die an der Faltung von sekretorischen Proteinen beteiligt sind112. Es wird vermutet, dass BiP unreifes Protein im endoplasmatischen Reticulum (ER) bindet und so die Bildung von Aggregaten verhindert. Durch Mutantenanalysen konnte gezeigt werden, dass eine Depletion von BiP zur Aggregation des unreifen Proteins und zum Verbleib desselben im ER führt113. Daraus folgt dann im Allgemeinen die Induktion der UPR (Unfolded protein response)114 und die proteolytische Degradation des Proteins mittels ERAD (ER associated protein
degradation)^" ', die Blockade der Proteinsynthese und die Aktivierung von Chaperon- kodierenden Genen116. Es lässt sich der Schluss ziehen, dass der Mechanismus der
Qualitätskontrolle im ER einer der kritischsten Engpässe während der löslichen Sekretion von heterologen Proteinen in Hefezellen ist117. Durch die Überexpession von Faltungshelfern wie PDI und BiP konnte gezeigt werden, dass die Sekretion eines scFv-Fragments in S.
cereivisiae um das Zehnfache gesteigert werden konnte106, 118. Allerdings wird in der Literatur darauf hingewiesen, dass das Profitieren eines zu sekretierenden Proteins von der
Überexpession von PDI und BiP stark von den Eigenschaften des spezifischen Proteins abhängig ist, und dass es Proteine gibt, die von der Überexpression von PDI und BiP nicht profitieren106, 119. Als Eukaryot eignet sich Hefe gut zur Produktion von heterologen humanen Proteinen, da die Prozessierung und Sekretion den eukaryotischen Mechanismen der Proteinexpression folgt. Diese Mechanismen beinhalten posttranslationale Prozessierungen wie Faltung, Glykosylierung und Phosphorylierung115. Die Expression, Faltung im ER und Sekretion des Proteins unterliegen einer strengen Qualitätskontrolle, die bewirkt, dass korrekt gefaltetes und funktionelles Protein aus Hefe-Expressionskulturen isoliert werden kann. Qberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung und Erprobung eines Verfahrens zur nicht- kovalenten Oberflächenpräsentation von Fc-Fusionsproteinen und IgG-Molekülen auf Hefezellen. Im Gegensatz zur kovalenten Oberflächenpräsentation92 auf Hefezellen wird das zu präsentierende Protein in dem hier vorgestellten Verfahren über seinen Fc-Teil von der Fc- bindenden ZZ-Domäne auf der Zelleoberfläche verankert. Die ZZ-Domäne ist zu diesem Zweck als Aga2p-Fusionsprotein kovalent auf der Zelloberfläche verankert. Durch die
Regulation der Expression der ZZ-Domäne besteht die Möglichkeit, zwischen
Oberflächenpräsentation und löslicher Sekretion selektiv zu schalten. Da die Interaktion zwischen ZZ-Domäne und Fc-Teil reversibel und pH-abhängig67 ist, muss das System dem Anspruch einer stabilen Genotyp-Phänotyp-Kopplung genügen, welche die Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung des Systems als Methode zur Selektion ist. Das Protein A (SpA) aus S. aureus bindet hoch-affin an Fc-Teile diverser IgG-Moleküle. SpA besteht aus fünf Domänen (A, B, C, D und E), die auch einzeln Fc-Teile binden können63. Die Faltung von Domäne B ist exemplarisch für alle SpA-Domänen. Sie besteht aus zwei antiparallelen a- Helices und einer leicht gedrehten dritten a-Helix. Wie Co-Kristallisationsexperimente zeigten, ist Helix 3 aber nicht direkt an der Fc-Bindung beteiligt64. Als Fc-Bindedomäne wurde in der vorliegenden Arbeit die von Domäne B abgeleitete Z-Domäne verwendet, von welcher bekannt ist, dass auch sie Fc-Teile von humanen Antikörpermolekülen mit hoher Affinität bindet149. Die Z-Domäne wurde von Nilsson und Mitarbeitern 1987 durch eine artifizielle Aminosäuresubstitution in Domäne B, Glycin zu Alanin an Position 29, generiert und zeigt eine verbesserte Stabilität im Vergleich zur Domäne B67. Zusätzlich wurde in der
vorliegenden Arbeit die ZZ-Domäne verwendet, bei welcher es sich um eine duplizierte Z- Sequenz handelt. Ihr wird laut Literatur eine im Vergleich zur Z-Domäne deutlich erhöhte Affinität für Fc-Teile zugeschrieben144, 50 In der vorliegenden Arbeit konnten sowohl Z- als auch ZZ-Domäne durch die Fusion mit dem Zellwandprotein Aga2p kovalent auf Hefezellen präsentiert werden. Die korrekte Faltung beider Domänen wurde durch die Bindung eines IgG-Moleküls (Cetuximab) und der anschließenden Zugabe von Fluoreszenz-markiertem Antigen (b-hsEGFR) und SA-PE im FACS nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten wie erwartet eine höhere Affinität der ZZ als der Z-Domäne für Fc-Teile, da die ZZ- präsentierenden Zellen unter gleichen Bedingungen stärker Fluoreszenz-markiert werden konnten. Dieser Befund kann mit einem Aviditätseffekt erklärt werden, da die ZZ-Domäne ein divalentes Moleküle ist, während die Z-Domäne monovalent ist67. Im Fc-Teil sind zwei potentielle Bindestellen für SpA vorhanden, je eine pro schwerer Kette. Das ist auch der Grund dafür, dass das stöchiometrische Bindungsverhältnis von SpA zu IgG im Verhältnis 1 :2 vorliegt63. Protein A hat eine fünf-Domänenstruktur, die aber funktionell divalent ist151"153. Die simultane Bindung der vier für Fe hoch-affinen SpA-Domänen erklärt den Anstieg der apparenten Affinität bei der Kombination mehrerer einzelner SpA Domänen68, 144. Es wird angenommen, dass die ZZ-Domäne beide Bindestellen am Fc-Teil erreicht, was auch den Befund der stärkeren Bindung der ZZ-Domäne an Fe gegenüber der Z-Domäne erklären würde144, 150. Allerdings gibt es Hinweise, dass die simultane Bindung beider Bindestellen am Fc-Teil eine Zerstörung der α-helikalen Struktur der Domäne voraussetzen würde, wodurch keine Fc-Bindung mehr möglich wäre70 Deshalb wird vielmehr davon ausgegangen, dass eine Z-Domäne des divalenten Konstrukts die Bindung an Fe vermittelt, während die nicht an der Bindung beteiligte Z-Domäne durch eine schwache Interaktion mit der gebundenen Z- Domäne oder der zweiten Bindestelle einen Aviditätseffekt vermittelt und zu einer
verringerten Koff führt7 , 144, denn durch die Dissoziation einer Z-Domäne ist die Bindung der anderen Z-Domäne ermöglicht. Das erklärt auch die Tatsache, dass Z- und ZZ-Domäne ähnliche Affinitätskonstanten für die Bindung von Fe haben144. In der vorliegenden Arbeit wurde für die divalente ZZ-Dömane ein im Vergleich zur monovalenten Z-Domäne stärkeres Fluoreszenzsignal durch die Markierung mit einem IgG-Molekül gemessen. Dieser Befund wird vermutlich nicht durch das Einfangen einer größeren Anzahl an IgG-Molekülen auf der Zelle hervorgerufen, da eine ZZ-Domäne wie auch eine Z-Domäne lediglich ein IgG-Molekül bindet. In beiden Fällen liegt folglich ein Verhältnis von 1 :1 vor. Aus diesem Grund wird vermutet, dass allein die stärkere Bindung der ZZ-Domäne an Fe zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität führte. Im Zusammenhang mit dem Thema der hier vorgestellten Arbeit ist bereits gezeigt worden, dass die Z-Domäne zur Immobilisierung von Antikörpern auf E. coli Zellen154, 155 und Viren156, 157 eingesetzt werden kann. Auch dienten ZZ-präsentierende Hefezellen bereits als Immunadsorbent zur Detektion von Antikörpern aus Serumproben158. Des Weiteren konnte die ZZ-Domäne als α-Agglutinin-Fusion auf der Oberfläche von
Hefezellen präsentiert und durch die Co-Kultivierung mit Zellen, die Fc-EGFP sekretierten, Fluoreszenz-markiert werden159.
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen
Die ZZ-präsentierenden Zellen konnten zusätzlich zur Markierung durch die externe Zugabe eines IgG-Moleküls (Cetuximab) auch noch mit einem endogen sekretierten VHH-Fc
Fusionsprotein markiert werden. Dadurch wurde die Fähigkeit des Verfahrens zur nicht- kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen gezeigt. VHH-Fc und ZZ wurden zu diesem Zweck in einer Zelle co-exprimiert. Durch die Bindung des Fc-Teils an die ZZ-Domäne erfolgte das Einfangen des löslich sekretierten VHH-Fc Fusionsproteins auf der Zelle und die Markierung über die Zugabe von Antigen. In diesem Fall wurden im Vergleich zur Markierung mit Cetuximab deutlich geringere Fluoreszenzintensitäten im FACS detektiert was auf eine ineffizientere Markierung der ZZ-Domäne mit endogen sekretiertem VHH-Fc hindeutet. Dieser Befund deutet auch darauf hin, dass die auf der Zelloberfläche
präsentierten ZZ-Domänen nicht mit VHH-Fc abgesättigt und dass noch freie ZZ-Domänen vorhanden waren. Eine Begründung könnte eine ineffizientere Sekretion des VHH-Fc
Proteins im Gegensatz zur ZZ-Domäne oder ein Ungleichgewicht der Sekretion beider
Proteine sein. Die Expression beider Gene (ZZ und VHH-Fc) wurde durch den Gal1 -Promotor reguliert. Deshalb könnte für beide Gene ein ähnlich hohes Expressionslevel erwartet werden. Allerdings sind limitierende Schritte bei der Expression von Fremd-Genen in S.
cerevisiae bekannt. Hier sei beispielhaft darauf verwiesen, dass unter Verwendung des gleichen Promotors Hefe-eigene Gene stärker exprimiert werden als Fremd-Gene 41.
Begründet ist dieser Umstand mit dem Effekt der Codon Usage auf die translationale
Elongation. Trotz der Redundanz des genetischen Kodes werden bestimmte Kodone während der Translation bevorzugt, da nicht alle tRNAs und Aminoacyl-tRNAs in gleicher Weise vorhanden sind. Zudem unterscheidet sich die Codon Usage stark zwischen
verschiedenen Organismen141. Die Sequenz der VHH-Fc Fusion wurde in der vorliegenden Arbeit nicht bezüglich der Codon Usage von S. cerevisiae optimiert und stellt demnach ein mögliches Problem während der Translation dar. Dadurch könnte erklärt werden, warum die VHH-Fc Sekretion vermindert war. Ein weiterer Grund für die unterschiedliche Sekretion beider Proteine kann post-translational vermutet werden. Die ZZ-Domäne ist im Vergleich zum VHH-Fc Fusionsprotein ein kleines Protein, was ohne Disuifidbrücken effektiv funktionell faltet und sekretiert wird. Aufgrund ihrer guten Sekretions- und Faltungseigenschaften wird die ZZ-Domäne häufig als Fusion mit Proteinen hergestellt, die eine schlechte Sekretion zeigen160, 161. Die Faltung des VHH-Fc Fusionsproteins hingegen erfordert die korrekte Ausbildung von mindestens drei Disuifidbrücken, die in der H/nge-Region lokalisiert sind. Die Bedeutung der korrekten Disulfidverbrückung für die erfolgreiche lösliche Sekretion des VHH- Fc Fusionsproteins ist im folgenden Abschnitt erläutert. Zu diesem Zweck wurde die
Sekretionsleistung des PDI (protein disulfide /'soAT7erase)-überexprimierenden Hefestammes (APO-E) mit dem Stamm EBY100 verglichen, der die PDI nicht überexprimiert.
Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen Zur Verbesserung der Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen wurden zwei Hefestämme hergestellt. Durch genetische Manipulation wurde bei diesen Stämmen (APO-E und APO-B) im Vergleich zu den Hefestämmen, aus denen sie hervorgegangen sind (EBY100 und
BJ5464), die konstitutive Überexpression der ER-Iokalisierten Oxidoreduktase PDI erreicht. Für den Stamm APO-E wurde im Vergleich zum Ausgangsstamm EBY100 eine doppelt so hohe Proteinkonzentration im Überstand von VHH-Fc Expressionskulturen gemessen. Dieser Befund untermauert bereits publizierte Ergebnisse, dass sich die PDI-Überexpression vorteilhaft auf die lösliche Sekretion des Proteins auswirkt162. Die PDI katalysiert
bekanntermaßen die Oxidation und Reduktion von Disulfidbrücken während der Faltung von Proteinen im ER der Hefezelle. Das ist ein entscheidender Schritt im Sekretionsweg der Zelle, da die korrekte Ausbildung von Disulfidbrücken ausschlaggebend für die strukturelle Stabilität von Proteinen, wie z.B. des hier verwendeten VHH-Fc Fusionsproteins, ist. Durch den intrazeliulären Quaiitätskontrollmechanismus wird sichergestellt, dass nur korrekt gefaltete Proteine sekretiert werden. Falsch gefaltete Proteine exponieren z.B. hydrophobe Aminosäurebereiche und führen dadurch zur Induktion der UPR (Unfolded Protein
Response). Diese Proteine werden dann von weiteren ER-Iokalisierten Chaperonen, wie z.B. BiP gebunden, was im Anschluss nicht zur Sekretion, sondern unter anderem zum Abbau der Proteine mittels ERAD {ER-associated Degradation) führt115. In der vorliegenden Arbeit wurde vermutlich die korrekte Faltung der VHH-Fc Proteine durch die Überexpression der PDI erleichtert, wodurch eine größere Proteinmenge sekretiert werden konnte, da intrazellulär ein größerer Anteil an richtig gefaltetem Protein vorlag. Allerdings sind aus der Literatur deutlich größere und effizientere Sekretionssteigerungen durch die Überexpression der PDI gezeigt worden111. Rakestraw und Mitarbeiter zeigten z.B. eine 180-fache Steigerung der Sekretion eines vollständigen IgG-Moleküls durch die Verwendung eines PDI-überexprimierenden Hefestammes und der sekretorischen Sequenz app8111. Diese Sekretionseffizienz wurden in der vorliegenden Arbeit auch in Kombination mit der sekretorischen Sequenz app8 nicht erzielt. Vermutlich ist die verbesserte Sekretion durch die Überexpression der PDI abhängig vom jeweils sekretierten Protein117 und es wäre zweckmäßig zu klären, ob die
Überexpression anderer Chaperone zu einer weiteren Steigerung der VHH-Fc Sekretion führen könnte. Des Weiteren ist bekannt, dass die PDI de novo Disulfidbrücken von dem ebenfalls ER-Iokaiisierten Enzym Erol p erhält, welche sie im Anschluss direkt zur Oxidation von Disulfidbrücken im Substratprotein verwendet163. So gesehen ist Erolp für das Recycling der PDI zuständig, indem es die PDI vom reduzierten in den oxidierten Zustand überführt. Aus diesem Grund wäre es vermutlich vorteilhaft, Erol p in gleichem Maße wie die PDI überzuexprimieren. Durch ein ausbalanciertes Expressionslevel von Erolp und PDI können reduzierte PDI-Moleküle schneller wieder oxidiert werden, um neue Disulfidbrücken im
Substratprotein zu oxidieren.
Optimierung der Oberflächenpräsentation und Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen
Zusätzlich zur Überexpression der PDI zeigten auch weitere Faktoren einen Einfluss auf die Verbesserung der löslichen Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen und deren Oberflächen- Präsentation. Im Folgenden ist deshalb der Einfluss der Expressionsbedingungen auf Oberflächenpräsentation und Sekretion und der Einfluss der Gendosis auf die Sekretion diskutiert. Zu Beginn der experimentellen Arbeiten wurden kommerziell erhältliche
synthetische Minimalmedien (Clontech) zur Kultivierung und Oberflächenpräsentation verwendet. Diese Medien wiesen einen leicht sauren pH-Wert auf (pH 5,8) und lagen ungepuffert vor. Während der Kultivierung von Hefezellen in synthetischem Minimalmedium wurde eine weitere Ansäuerung beobachtet, was vermutlich durch ausgeschiedene
Stoffwechselprodukte der Hefe verursacht wurde. Analog dazu wurde bei Übernachtkulturen ein pH-Wert von ca. 3 gemessen (Daten nicht gezeigt). Die Verwendung dieser Medien erwies sich, vor dem Hintergrund der pH-abhängigen ZZ:Fc-lnteraktion als unvorteilhaft, denn durch die Erniedrigung des pH-Wertes wird die Bindung von der ZZ-Domäne zum Fc-Teil schwächer164. Unter Verwendung dieser Medien konnte die Oberflächenpräsentation des VHH-Fc nicht nachgewiesen werden, da die Interaktion von Z-Domäne und Fc-Teil laut Literatur ab pH 3,3 nicht mehr besteht67. Durch den anschließenden Gebrauch von gepuffertem Minimalmedium Medium (pH 7,0) wurde der pH-Wert über einen ausreichend langen Kultivierungszeitraum stabilisiert und die Ausbildung der Bindung zwischen ZZ- Domäne und VHH-Fc ermöglicht. In diesem Fall konnte das VHH-Fc Fusionsprotein auf der Zelle über die Interaktion mit dem Antigen markiert und dadurch im FACS detektiert werden. Allerdings wurde eine im Vergleich zur Negativkontrolle nur gering erhöhte
Fluoreszenzintensität gemessen. Außerdem waren die Fluoreszenzintensitäten 40-fach geringer als bei der Markierung von ZZ-präsentierenden Zellen mit extern zugegebenem IgG. Das deutet, wie bereits erwähnt, auf eine weniger effiziente Expression der VHH-Fc Fusion oder Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins hin. Gestützt wurde diese Vermutung durch den Umstand, dass die ZZ-Domäne zur gleichen Zeit mit deutlich höherer Effizienz auf der Zelloberfläche präsentiert wurde und so viele ZZ-Domänen unbesetzt waren, denn die ZZ- Domäne konnte mit einem Protein A-spezifischen Nachweisantikörper auf der Zelloberfläche deutlich stärker markiert werden. Eine signifikante Verstärkung des Fluoreszenzsignals für die Oberflächenpräsentation des VHH-Fc Fusionsproteins wurde erst durch den Zusatz von 11% (w/v) PEG8000 zum Kulturmedium erreicht. Das Fluoreszenzsignal für die ZZ-Domäne war jedoch mit und ohne PEG-Zusatz gleichbleibend stark. Daraus lässt sich schließen, dass PEG8000 einen positiven Einfluss auf die Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins hatte.
Diese Vermutung wurde durch weitere Experimente bestätigt, die im Folgenden diskutiert werden. Die Analyse des Überstandes von VHH-Fc Expressionskulturen mit und ohne PEG8000 zeigte, dass das VHH-Fc Fusionsprotein durch den Zusatz von PEG8000 sehr viel effizienter sekretiert wurde, da im Kulturmedium signifikant höhere Proteinkonzentrationen detektiert wurden. Die Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in das Kulturmedium erfordert einen intra-zellulären Transport des Proteins über die Zellmembran. Der klassische sekretorische Weg von Proteinen führt bei S. cerevisiae co- und/oder post-translational in das endoplasmatische Retikulum, von dort in den Golgi-Apparat und ausgehend von diesem über Transportvesikel zur Zellmembran165. Die extrazelluläre Sekretion erfolgt im Anschluss mittels Exocytose durch die Fusion der Transportvesikel mit der Zellmembran und das Entlassen des Vesikelinhaltes in den Kulturüberstand. Es ist möglich, dass PEG8000 die Vesikelfusion mit der Zellmembran erleichtert und so die Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins verbessert. Es wurde bereits gezeigt, dass PEG zu einer Erhöhung der Membranpermeabilität und die Fluiditätseigenschaften von Membrankomponenten verändert166. Das kann aus der direkten Interaktion von PEG mit der Lipiddoppelschicht und deren daraus resultierender
Destabilisierung erfolgen. Aus diesem Grund wird PEG auch routinemäßig zur Zellfusion während der Hybridomproduktion verwendet und allgemein als„Fusogen" bezeichnet167. Der Einfluss von PEG kann aber auch indirekter Natur sein, indem es die polaren Eigenschaften des umgebenden wässrigen Mediums beeinflusst und dadurch zu einer Verminderung der Membranstabilität führt. Dieser Effekt kann über eine Dehydrierung der polaren Kopfgruppen der Lipiddoppelschicht durch das stark hydrophile PEG im umgebenden Medium erklärt werden168. Über den genauen Mechanismus der durch PEG verbesserten VHH-Fc Sekretion kann hier nur spekuliert werden. Interessanterweise war die Sekretionseffizienz stark abhängig vom Molekulargewicht des verwendeten PEGs. Mit hoch-molekularem PEG8000 wurde eine signifikant größere Proteinmenge im Kulturmedium detektiert als mit PEG1500. Vermutlich korreliert das Molekulargewicht des verwendeten PEGs direkt mit der möglichen Interaktion von PEG mit der Zellmembran. Uma Maheswar Rao und Satyanarayana verdeutlichen ebenfalls den Einfluss des Molekulargewichts von PEG auf die Sekretion. Sie zeigten eine verbesserte Sekretion von α-Amylase aus Geobacillus t ermoleovorans in Gegenwart von PEG8000 im Vergleich zu PEGs mit geringeren Molekulargewichten140. Das stärkere Fluoreszenzsignal für Oberflächen-präsentierte VHH-Fc Fusionsproteine in
Gegenwart von PEG8000 kann zusätzlich zur bereits beschriebenen gesteigerten Sekretion und der dadurch verursachten höheren Besetzungsrate der ZZ-Domänen auf der Zelloberfläche auch noch durch eine verminderte Dissoziation des Fc-Teils von der ZZ-Domäne durch die erhöhte Viskosität des Mediums erklärt werden. In diesem Fall ist die Diffusion dissoziierter VHH-Fc Fusionsproteine durch die hohe Viskosität des Mediums vermindert und die Assoziation von ZZ und Fe erleichtert. Die erreichten Zelldichten während der Kultivierung in PEG8000-haltigem Medium deuten darauf hin, dass PEG keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Kultur hatte, obwohl mit einem verminderten Sauerstoffeintrag durch die hohe Viskosität des Mediums gerechnet wurde. Dennoch wurden mit und ohne PEG vergleichbar hohe Zelldichten während der Kultivierung erreicht wurden (Daten nicht gezeigt). Die VHH-Fc Gendosis innerhalb der Hefezelle ist u.a. abhängig von der Kopienzahl des Plasmids. Durch eine Steigerung der Plasmidkopienzahl wurde eine erhöhte Syntheserate des VHH-Fc Fusionsproteins erwartet. Da in den bisher diskutierten
Ergebnissen CEN6/ARS4-basierte Plasmide, die sich durch eine geringe Kopienzahl in der Zelle auszeichnen, verwendet wurden, wurde vermutet, dass die Verwendung eines 2- micron-basierten Plasmids zu einer erhöhten Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins führen könnte. Diese Plasmide zeichnen sich durch eine bis zu 100fach erhöhte Kopienzahl in der Zelle aus139. Zu diesem Zweck wurden VHH-Fc Expressionskulturen zur löslichen Sekretion hergestellt, die sich bezüglich ihrer Plasmidkopienzahl unterschieden. Interessanterweise wurde gegen alle Erwartungen eine geringere Proteinsekretion vom 2-micron-basierten Plasmid gemessen und die Expression der VHH-Fc Gensequenz von dem CEN6/ARS4- basierten Plasmids resultierte in einer effizienteren Sekretion des Proteins in den
Kulturüberstand. Des Weiteren war zu beobachten, dass unter Verwendung des 2-micron Plasmids eine im Vergleich zum CEN6/ARS4 Plasmid erhöhte intrazelluläre Konzentration des nicht-prozessierten VHH-Fc Fusionsproteins vorhanden war. Da das verwendete pre-pro Signalpeptid app8 ein Molekulargewicht von 8,7 kD hat, ließen sich die intrazellulären Formen (prozessiert und nicht-prozessiert) des VHH-Fc Fusions-proteins in Western-Blot Analysen unterscheiden. Das reife VHH-Fc Fusionsprotein war nach Entfernung des
Signalpeptids durch sein geringeres Molekulargewicht gut von der unprozessierten Form zu unterscheiden und beide Proteinformen konnten im Zelllysat immunologisch detektiert werden. Lediglich bei der Verwendung des 2-micron Plasmids wurde die unprozessierte Proteinform nachgewiesen. Dieser Befund deutet auf eine weniger effiziente Entfernung des Signalpeptids durch die intrazellulären Proteasen hin. Es ist möglich, dass erhöhte
Transkriptlevel und daraus resultierende größere Proteinmengen die korrekte Prozessierung des Proteins limitierten. Für das Entfernen des pre-pro Signalpeptids sind zwei intrazelluläre Proteasen zuständig. Die ersten 19 Aminosäuren der pre-Region werden von einer ER- lokalisierten Signalpeptidase geschnitten. Nach der Passage des Proteins im ER und dessen Transport zum Golgi-Apparat ist in späten Golgi-Kompartimenten die Protease Kex2p für die Entfernung der pro-Region zuständig141. Die pro-Region umfasst weitere 64 Aminosäuren. Es kann vermutet werden, dass die Protease Kex2p der limitierende Schritt in der Prozessierung des Proteins war, da sie die deutlich größere pro-Region des Signalpeptids entfernt.
Allgemein kann gesagt werden, dass die Überexpression und Sekretion heterologer Proteine immer eine Stresssituation für die Hefezelle darstellt117. Vermutlich führte die hohe
Kopienzahl zu einem erhöhten Transkriptlevel und so zu einer Stressantwort der Hefezelle. Dadurch könnte die Sekretion behindert werden, da durch die Akkumulierung von
Intermediaten und falsch gefalteten Proteinen stressbedingt der Mechanismus der UPR induziert werden könnte. Dieser würde anstatt zur Sekretion zum proteolytischen Abbau des Proteins führen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit der Limitierung von Energie und Ressourcen zur Proteinsynthese, die bei hohen Transkriptleveln vor allem bei E. coli zu beobachten sind169, 7°. Ferner kann aber auch die Translokation des Proteins, wie erwähnt die Prozessierung des Signalpeptids und die Faltung des Proteins im ER limitierend auf die Sekretion wirken. Obwohl der Befund der reduzierten Sekretion durch eine Erhöhung der Gendosis nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde zur weiteren Sekretion das
CEN6/ARS4-basierte Piasmiö verwendet.
Funktionalität von Hefe-produzierten VHH-Fc Fusionsproteinen
Die Funktionalität des VHH-Fc Fusionsproteins wurde sowohl auf der Zelle während der Oberflächenpräsentation, als auch löslich im Kulturüberstand untersucht. Für die erfolgreiche Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens zur Selektion und zur Charakterisierung von VHH-Fc Fusionsproteinen war es erforderlich, dass das Protein sowohl auf der Zelle als auch im Kulturüberstand funktionell vorlag. Die Funktionalität wird im Allgemeinen durch die korrekte Glykosylierung und Faltung des Proteins bestimmt. Über die Bindung des
spezifischen Antigens wurde die Funktionalität des Oberflächen-präsentierten Proteins nachgewiesen. Über einen Zeitraum von 72 Stunden konnte das VHH-Fc Fusionsprotein auf der Zelle durch die Bindung an das Antigen hsEGFR markiert und im FACS erfolgreich detektiert werden. Im Vergleich zu den SpA-Domänen A bis E binden Z~ und ZZ-Domäne IgG-Moleküle nur über den Fc-Teil64. Für die Domänen A bis E hingegen weisen IgG- Moleküle eine weitere mögliche Bindestelle auf, die im Fab-Fragment lokalisiert ist. Diese Bindung erfolgt größtenteils über hydrophile Aminosäurereste des Fab-Fragments. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Protein A Framework-Bereiche von VHH-Domänen bindet171. Durch die Interaktion von SpA oder dessen Domänen mit dem Fab-Fragment eines Antikörpers oder der VHH-Domäne könnte es zu einer zum Antigen konkurrierenden Bindung kommen, wodurch die Antigenbindung beeinträchtigt werden könnte. Durch die Verwendung der ZZ- Domäne zur Oberflächenpräsentation ist sichergestellt, dass die Bindung von VHH-Fc Fusionsproteinen und IgG-Molekülen ausschließlich über den Fc-Teil erfolgt und so nicht die Bindung an das Antigen behindert wird. Durch die Bindung des Fc-Teils ist darüber hinaus eine günstige Ausrichtung und Exponierung der Oberflächen-präsentierten Proteine möglich. Die Hefezelle hat eine ca. 200 nm starke Zellwand außerhalb der Plasmamembran, die dicht mit Hefe-eigenen Zellwandproteinen besetzt ist172. Durch die Verwendung des Aga1 p-Aga2p Protein-komplexes zur Oberflächenverankerung der ZZ-Domäne wird diese ausreichend weit in der extrazellulären Umgebung exponiert, um die Bindung an z.B. VHH-Fc Fusionsproteine zu ermöglichen. Des Weiteren werden durch die Bindung des Fc-Teils, wie erwähnt, die beiden VHH-Domänen des homodimeren VHH-Fc Fusionsproteins weiter von der Zelle entfernt präsentiert und so exponiert, dass eine ungehinderte Interaktion mit dem Antigen möglich ist. Es ist bekannt, dass kurze Ankerproteine, wie z.B. verkürzte Formen des Proteins Flolp, nicht ausreichend in die extrazelluläre Umgebung der Zelle hineinreichen und
Oberflächen-präsentierte Proteine aus diesem Grund nicht in gewünschter Weise detektiert werden können, da die Interaktion mit dem Antigen oder mit Nachweisantikörpern sterisch durch die Zellwand behindert ist94. Die Verwendung einer verlängerten Flo1p-Form ermöglicht hingegen die Detektion. Im Hinblick auf die weitere Untersuchung der Funktionalität des VHH-Fc Fusionsprotein innerhalb des nicht-kovalenten Systems wurden Expressionskulturen zur löslichen Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand hergestellt. Die Bewertung der Funktionalität erfolgte über die Bestimmung der kinetischen Konstanten der biomolekularen Interaktion des Proteins und des Antigens hsEGFR. Zu diesem Zweck wurde das Protein aus dem Kulturüberstand mittels Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt und zur Bindungs-analyse mittels Biolayer-Interferometrie verwendet. Durch zuvor
durchgeführte Messungen mit dem VHH-Fc Fusionsprotein aus einer HEK293- Expressionskultur waren die kinetischen Konstanten der Bindung zu hsEGFR bekannt (Daten nicht gezeigt). Sowohl für das Hefe- als auch für das HEK293-produzierte Protein wurden vergleichbare Messwerte erzielt, die in einem KD-Bereich von 9 nM bis 90 nM lagen. Da zur HEK293-Expression im Gegensatz zur Hefeexpression eine N-terminale Fc-Fusion der VHH- Domäne (C-Terminus des Fc-Teils am N-Terminus der VHH-Domäne) verwendet wurde, können die unterschiedlichen KD-Werte durch die Art der Fc-Fusion erklärt werden. Die
Antigenbindung der VHH-Domäne erfolgt über die N-terminalen Bereiche der Domäne. Dort sind die drei CDRs lokalisiert, die das Paratop bilden und so die Bindung an das Antigen vermitteln173. In der zur HEK293-Expression verwendeten Gensequenz war der 5'-Bereich des VHH-Gens mit der Sequenz für den Fc-Teil fusioniert. Es ist möglich, dass dadurch eine Reduzierung der Affinität für das Antigen hervorgerufen wurde, was sich in der Biolayer- Interferometrie-Messung durch einen geringeren KD-Wert zeigte. Es wurde vermutet, dass die C-terminale Fusion der VHH-Domäne mit dem Fc-Teil (N-Terminus des Fc-Teils am C- Terminus der VHH-Domäne) nicht zu einer Beeinträchtigung der Bindung des Antigens führte, da im Vergleich zur N-terminalen Fc-Fusion ein höherer KD-Wet für die
Antigenbindung gemessen wurde. Dieser Befund ist plausibel, da auch in natürlich
auftretenden Heavy-c/?a/n-Antikörpern die VHH-Domäne über ihren C-Terminus über die H/nge-Region mit dem Fc-Teil verbunden ist. Da die Antigenbindung, wie erwähnt, über den N-Terminus der VHH-Domäne und den dort lokalisierten CDRs vermittelt wird, sind diese für die Interaktion mit dem Antigen durch die Fc-Fusion nicht beeinträchtigt und frei zugänglich. Hier sei beispielhaft auf die VHH-Fc Fusion ART621 (Arana Therapeutic Ltd.) verwiesen, dass sich momentan in der klinischen Erprobung zur Behandlung der Psoriasis befindet174. Des Weiteren konnte in Western-Blot Analysen festgestellt werden, dass die Dimerisierung des VHH-Fc Fusionsproteins erfolgreich war. Die Dimerisierung wird durch die korrekte Faltung der schweren Ketten des Fc-Teils und die Ausbildung von Disulfidbrücken ermöglicht. Dies wurde vermutlich durch die Mutagenese der N-Glykosilierungsstelle des Fc-Teils zu Beginn der vorliegenden Arbeit erleichtert. Zu diesem Zweck wurde das Kodon für die
Aminosäure Asparagin (N) an Position 297 gegen das Kodon für die Aminosäure Glutamin (Q) substituiert und so die von S. cerevisiae bekannte ypermannosylierung^75 während der N- Glykosylierung von Proteinen verhindert. Die hohe Anzahl an Mannoseresten könnten andernfalls die Fc-Dimerisierung sterisch behindern wodurch hydrophobe Kontaktflächen zwischen den Ketten im ER exponiert würden. Das würde eine Stressantwort der Zelle induzieren und eine Beeinträchtigung der Sekretion des Proteins zu Folge haben. Die
Funktionalität des Fc-Teils konnte weiterhin während der Biolayer-Interferometrie gezeigt werden, da Protein A-Sensoren erfolgreich mit dem VHH-Fc Fusionsprotein beladen werden konnten. Unter natürlichen Bedingungen sind humane IgG- oleküle an Positon 297 glykosyliert. Es wurde beobachtet, dass die humane Glykosylierung dieser Position zur Stabilisierung der CH2-Domäne beiträgt und sich deshalb positiv auf die Dimerisierung des Fc-Teils von IgG-Molekülen auswirkt176.
Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen
Die vielseitige Anwendung des in dieser Arbeit etablierten Verfahrens wurde auch durch die erfolgreiche Oberflächenpräsentation von vollständigen IgG-Molekülen gezeigt. Dies macht deutlich, dass verschiedene Antikörper-Formate erfolgreich präsentiert werden konnten. Die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen war im Vergleich zu VHH-Fc Fusionsproteinen allerdings komplexer gestaltet, da die Hefezellen im Gegensatz zur
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen, mit drei anstatt mit nur zwei
Plasmiden transformiert wurden. Neben dem Plasmid zur Expression der Aga2p-ZZ Fusion wurden zwei weitere Plasmide für die lösliche Sekretion von leichter und schwerer
Antikörperkette benötigt. Für die Oberflächenpräsentation des vollständigen Antikörpers musste die Hefezelle folglich während der Kultivierung den stabilen Erhalt aller drei Plasmide ermöglichen. Zu diesem Zweck erfolgte die Selektion des Aga2p-ZZ Plasmids (pYD-ZZ) über einen G418-Resistenzmarker und G418-haltiges Medium um die Auxotrophiemarker des EBY100-Stammes zur Selektion der Plasmide für die schwere und leichte Antikörperkette zu verwenden. Das erfolgreiche Einfangen des Antikörpers durch die ZZ-Domäne wurde durch die Markierung und Detektion des Fe- Teils auf der Zelle gezeigt. Die Funktionalität des IgG- Moleküls konnte über die Bindung des spezifischen Antigens nachgewiesen werden. Es konnte allerdings nicht sicher nachgewiesen werden, ob zusätzlich zur schweren Kette auch die leichte Kette präsentiert wurde, da zu diesem Zeitpunkt kein geeigneter spezifischer Nachweisantikörper für die leichte Kette zur Verfügung stand. Es ist möglich, dass die schweren Antikörperketten auch ohne Assemblierung der leichten Ketten die Bindung an das Antigen vermitteln, da der Hauptteil der Bindung durch die schweren Ketten des IgG-Moleküls erfolgt177. Allerdings ist anzunehmen, dass die Assemblierung von leichter und schwerer IgG- Kette erfolgreich war, da sonst vermutlich die Oberflächenpräsentation durch eine
verschlechterte Sekretion des Antikörpers vermindert wäre. Da die Zusammenlagerung von leichter und schwerer Kette zusätzlich zur Disulfidbrücke zwischen CH1 und CL über hydrophobe Interaktion erfolgt, wären die hydrophoben Aminosäurereste der schweren Kette im ER exponiert und würden den Mechanismus der UPR induzieren. Interessanterweise konnte die Oberflächenpräsentation eines vollständigen IgG-Moleküls auf Hefezellen nur unter Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens mit der ZZ-Domäne gezeigt werden. Dieser Befund ergab sich durch ein weiteres Experiment, in welchem die schwere IgG-Kette als Aga2p-Fusion kovalent auf der Oberfläche präsentiert wurde, während die leichte Kette löslich sekretiert wurde. In diesem Experiment konnte die schwere Kette über die Markierung des Fc-Teils auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Darüber hinaus war die Detektion der Antigenbindung aber erfolglos. Zur löslichen Sekretion der leichten Kette wurde die von Rakestraw und Mitarbeitern selektierte sekretorische Sequenz app8111 verwendet, während die schwere Kette als Fusion mit AGA2 exprimiert wurde. Die Wahl des Signalpeptids hat bekanntermaßen einen großen Einfluss auf die Sekretion von heterologen Proteinen aus S. cerevisiae, denn das Signalpeptid bestimmt, ob ein Protein sekretiert wird, einen
Bestimmungsort in der Zelle hat oder Bestandteil der Zellmembran wird. Hashimoto und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Verwendung verschiedener Signalpeptide einen signifikanten Unterschied in der Sekretionsausbeute zur Folge hat178. Das zur Sekretion der leichten Kette verwendete Signalpeptid app8 ist speziell für die effiziente Sekretion von
Proteinen durch einen evolutiven Ansatz selektiert worden, der auf dem MFal pp Signalpeptid basierte111. Bei diesem Signalpeptid handelt es sich um eine 83-Aminosäure pre-pro- Sequenz, die im Gegensatz zu anderen Signalpeptiden sowohl von einer Signalpeptidase zur Translokation ins ER als auch von der Membran-ständigen Protease Kex2p im Golgi-Apparat prozessiert wird. Die schwere Kette hingegen wurde als Fusion mit dem Protein Aga2p sekretiert, welches über zwei Disulfidbrücken mit dem Zellwandprotein Agal p verbunden ist. Die Prozessierung des reifen Fusionsproteins erfolgt hier vermutlich nur über die ER- lokalisierte Signalpeptidase. Die unterschiedlichen Prozessierungsmechanismen von leichter und schwerer Kette könnten die Zusammenlagerung beider Ketten derart erschweren, dass keine Antigenbindung detektiert werden konnte. Im Falle der oben diskutierten nicht- kovalenten Oberflächenpräsentation des Antikörpers wurden sowohl die schwere als auch die leichte Kette mit der sekretorischen Sequenz app8 exprimiert. In diesem Fall unterlagen beide Antikörperketten demselben Prozessierungsmechanismus, was vermutlich eine funktionelle Zusammenlagerung sowie die Bindung an das Antigen ermöglichte. Rakestraw und Mitarbeiter zeigten 2009 die Oberflächenpräsentation eines vollständigen Antikörpers auf Hefezellen mit der SECANT™ Display Technologie126. Zur Oberflächen-präsentation wurde dazu die schwere Kette als Fusion mit dem Biotin-Akzeptor Peptid exprimiert. Die
Biotinylierung des Biotin-Akzeptor Peptids erfolgte durch die co-exprimierte Biotin-Ligase BirA. Nach chemischer Biotinylierung der Zelloberfläche und Inkubation mit Avidin erfolgt die Präsentation des sekretierten biotinylierten Antikörpers über die Avidin-Biotin Interaktion auf der Zelle. In diesem Ansatz wurden beide Antikörperketten mit der gleichen sekretorischen Sequenz (app8) exprimiert. Sie zeigten die Sekretion eines vollständigen IgG-Moleküls aus S. cerevisiae und die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation des IgG-Moleküls über die Biotin- Avidin Interaktion. Ein weiteres Beispiel für die Oberflächenpräsentation von vollständigen IgG-Molekülen auf Hefezellen zeigten Sazinsky und Mitarbeiter 2008. Sie präsentierten ein Fluorescein-spezifisches IgG-Molekül über die Bindung an chemisch konjugiertes Fluorescein auf der Zelloberfläche179. Diese Art der Oberflächenpräsentation hat allerdings, im Gegensatz zur nicht-kovalenten Oberflächen-präsentation über die ZZ-Domäne, den Nachteil, dass IgG- Moleküle über die Bindung zu ihrem Antigen auf der Oberfläche eingefangen werden.
Folglich können nur Proteine mit bekannter und ausreichender Affinität präsentiert werden. Des Weiteren muss für jede Selektion eine individuell konjugierte Zellenoberfläche generiert werden. Im Gegensatz zu den beiden erwähnten Systemen zur Oberflächenpräsentation, werden IgG-Moleküle in der vorliegenden Arbeit ohne weitere Modifikationen präsentiert, vielmehr werden in dem Verfahren Protein-eigene Strukturen des IgG-Moleküls zur
Oberflächenpräsentation genutzt. Dadurch ist garantiert, dass die Antigen-bindenden Fab- Fragmente des Antikörpers frei exponiert sind. Zusätzlich ermöglicht das nicht-kovalente Verfahren die direkte Verwendung des selektierten Klons zur löslichen Sekretion ohne weitere Subklonierungen. Allerdings ist die zur Oberflächenpräsentation verwendete Bindung (ZZ:Fc Interaktion) weniger stabil als die Bindung zwischen Avidin und Biotin.
Genotyp-Phänotyp-Kopplung Die erfolgreiche Anwendung der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation zur Selektion von Varianten mit veränderten Eigenschaften kann nur gelingen, wenn eine stabile Verknüpfung zwischen der präsentierten Proteinvariante auf der Zelle und der intrazellulären genetischen Information für diese Variante besteht. Ist diese Verknüpfung nicht gegeben, ist die
Identifizierung von Varianten während der Selektion nicht möglich. Im Vergleich zur
kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen92 erfordert dieser Aspekt in dem hier vorgestellten System besondere Beachtung, da die Oberflächenpräsentation pH-abhängig und reversibel ist. Es wurde gezeigt, dass die Ansäuerung des Kulturmediums zu einer verschlechterten Bindung zwischen ZZ-Domäne und Fc-Teil führt und dass diese Bindung unter pH 3,3 nicht mehr ausgebildet wird. Ferner besteht die Möglichkeit, dass
Proteinvarianten durch Dissoziation und Assoziation der Bindung von ZZ-Domäne und Fc- Teil auf einer„falschen" Zelle gebunden werden und so die Selektion falsch-positiver Klone auftreten kann. Zentraler Bestandteil der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung der Stabilität der ZZ:Fc-lnteraktion. In zwei verschiedenen Mischungsexperimenten wurde diese Interaktion experimentell untersucht. Im ersten Mischungsexperiment wurden Zellen, die die ZZ-Domäne präsentierten (Zielzellen) über die Bindung von IgG-Molekülen aus einem hohen Überschuss an Kontrollzellen angereichert. Dazu wurden die Zielzellen in einer großen Population an Kontrollzellen verdünnt und innerhalb von drei Selektionsrunden von initial 0,001 % bzw. 0,0001 % auf 100% bzw. 90% angereichert. Die Markierung der Zielzellen erfolgte durch die sequentielle Bindung von Cetuximab und dem Fluoreszenz-markierten Antigen (b-hsEGFR). Die hohe Rate der Anreicherung von 00% bzw. 90% zeigt die stabile Interaktion zwischen ZZ-Domäne und IgG-Molekül. Des Weiteren wurde die erfolgreiche Anwendung gängiger Selektionsmethoden wie MACS und FACS gezeigt. Einen positiven Einfluss auf die Markierung und Selektion der Zielzellen hatte zweifelsohne die starke
Expressionsrate der ZZ-Domäne. Da die Expression der ZZ-Domäne durch den starken GaN -Promotor reguliert wurde, wurden nach Induktion in Galaktose-haltigem Medium eine große Anzahl ZZ-Domänen auf den Zelloberfläche präsentiert. Ferner wurde eine hohe Konzentration von Cetuximab und hsEGFR zur Markierung der Zellen verwendet, um eine vollständige Absättigung der ZZ-Domänen auf den Zielzellen zu ermöglichen. Dadurch konnten die Zielzellen stark Fluoreszenz-markiert werden und ließen sich im FACS eindeutig von den Kontrollzellen unterscheiden, die eine signifikant geringere rel. Fluoreszenzintensität zeigten. Selbst durch die Dissoziation von IgG-Molekülen von der Zelloberfläche und der Verteilung dieser innerhalb der Zellmischung konnten Kontrollzellen nicht mit verfügbaren freien IgG-Molekülen markiert werden, da diese keine ZZ-Domänen präsentierten. In diesem Fall war lediglich eine schwache unspezifische Interaktion mit der Zelloberfläche zu erwarten, die nicht zur Selektion falsch-positiver Kontrollzellen führte. Im zweiten Mischungsexperiment präsentierten sowohl Ziel- als auch Kontrollzellen die ZZ-Domäne. Die Zielzellen sekretierten zusätzlich das hsEGFR-spezifische VHH-Fc Fusionsprotein, während die Kontrollzellen zusätzlich ein nicht-EGFR-spezifisches VHH-Fc Fusionsprotein sekretierten. Beide VHH-Fc Fusionsproteine sollten nur auf der jeweiligen Zellpopulation präsentiert werden. Die
Markierung der Zielzellen erfolgte über die Bindung des präsentierten VHH-Fc
Fusionsproteins an das Fluoreszenz-markierte Antigen (b-hsEGFR) und SA-PE. Die Bestimmung der Rate der Oberflächenpräsentation beider VHH-Fc Fusionsproteine wurde durch die Markierung des jeweiligen Fc-Teils ermöglicht und erlaubte die
Expressionskontrolle der VHH-Fc Fusionsproteine. Dadurch wurde vermieden, dass
Expressionsunterschiede zu einer Verfälschung der Selektionsbedingungen führten. Initiale Verdünnungen von 0,001 % und 0,0001% wurden hergestellt. Durch drei aufeinanderfolgende Selektionsrunden konnten die Zielzellen innerhalb der Mischungen auf 40% bzw. 80% angereichert werden. In diesem Mischungsexperiment wurden im Gegensatz zum ersten Mischungsexperiment geringere Anreicherungsraten der Zielzellen erreicht. Zusätzlich wurde aus der initial höheren Verdünnung (0,0001%) eine größere Anreicherung der Zielzellen erzielt als aus der initial niedrigeren Verdünnung (0,001%). Dieser Befund ist widersinnig und lässt sich vermutlich mit Fehlern während der Herstellung der Mischungen oder während der Sortierung erklären, da bei der höheren Verdünnung ein deutlich größerer Anspruch an die Sortierung bestand, da weniger Zielzellen initial vorhanden waren. Dieses
Mischungsexperiment zeigte, dass der Hauptteil der sekretierten VHH-Fc Proteine auf der eigenen Zelle eingefangen wurde und nicht durch Dissoziation und Diffusion zu einer benachbarten Zelle gelangte und dort gebunden wurde. Da allerdings ein gewisser Anteil des VHH-Fc Fusionsproteins trotzdem durch die kinetischen Eigenschaften der ZZ:Fc-lnteraktion von der eigenen ZZ-Domäne dissoziierte, wurde die Diffusion der dissoziierten VHH-Fc Fusionsproteine durch eine statische Kultur und die erhöhte Viskosität durch den Zusatz von 1 1 % (w/v) PEG8000 zum Mediums minimiert. Da die VHH-Fc Fusionsproteine der Ziel- und der Kontrollzellen eine identische Sequenz des Fc-Teils besaßen, wurde vermutet, dass die VHH-Fc Fusionsproteine auf den Kontrollzellen in gleicher Weise von der ZZ-Domäne dissoziierten wie die VHH-Fc Fusionsproteine der Zielzellen. Es besteht die Möglichkeit, dass ein gewisser Teil der hsEGFR-spezifischen VHH-Fc Fusionsproteine (Zielzellen) durch unbesetzte ZZ-Domänen auf Nachbarzellen eingefangen werden. Diese können sowohl auf Ziel- als auch auf Kontrollzellen lokalisiert sein. Der Anteil an falsch-eingefangenen VHH-Fc Fusionsproteinen dürfte auf Grund der hoch-affinen Bindung zwischen ZZ-Domäne und Fc- Teil allerdings sehr gering sein. Darüber hinaus würden sich falsch-eingefangene VHH-Fc Fusionsproteine innerhalb der gesamten Mischung verteilen und stark verdünnen. Durch die Fluoreszenzmarkierung mit dem Antigen würden diese Signale anschließend im FACS unterhalb des Detektionslimits liegen und in den Bereich der Fluoreszenzintensität der Negativkontrolle fallen. Dadurch kann eine Selektion von falsch-positiven Zellen
ausgeschlossen werden. Zur Steigerung der Komplexität des Mischungsexperimentes wurden Ziel- und Kontrollzellen zuerst gemischt und anschließend die
Oberflächenpräsentation der gesamten Zellmischung induziert. Aus diesem Grund kann vermutet werden, dass während der Kultivierung zur Induktion der Oberflächenpräsentation eine stabile Bindung zwischen ZZ-Domäne und VHH-Fc Fusionsprotein bestand. Dieses Vorgehen repräsentiert im Detail das Vorgehen zur Durchmusterung von Molekülbibliotheken. Folglich scheint das Verfahren der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen als Methode zur Selektion gut geeignet zu sein. Schaltbare Oberflächenpräsentation
Ein wesentlicher Vorteil des nicht-kovalenten Verfahrens gegenüber dem kovalenten System zur Oberflächenpräsentation auf Hefezellen besteht darin, dass das nicht-kovalente
Verfahren die Möglichkeit eröffnet, zwischen den Modi Oberflächenpräsentation und löslicher Sekretion selektiv zu schalten. Erreicht wurde diese schaltbare Funktion, indem
unterschiedliche Promotoren für die Expression der ZZ-Domäne und der VHH-Fc Fusion verwendet wurden. Die Expression der ZZ-Domäne wurde zu diesem Zweck durch den Galaktose-induzierbaren und Glukose-reprimierbaren Gah -Promotor reguliert, während die Expression der VHH-Fc Fusion konstitutiv durch den GAPDH Promotor erfolgte. Zur
Oberflächenpräsentation des VHH-Fc Fusionsproteins wurden Doppeltransformanten in Galaktose-haltigem SG-Medium kultiviert. In diesem Fall wurde die ZZ-Domäne auf der Zelloberfläche als Aga2p-Fusion über die Interaktion mit Agal p präsentiert und das VHH-Fc Fusionsprotein konnte auf der Zelle eingefangen werden. Das wurde erfolgreich durch die Markierung und Detektion der ZZ-Domäne mit einem spezifischen Nachweisantikörper und durch die Antigenbindung der VHH-Domäne im FACS nachgewiesen. Zur löslichen Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand wurden die Zellen in Glukose-haltiges SD-Medium überführt. Durch das Glukose-haltige Medium erfolgte die Reprimierung des Gal1 -Promotors und dadurch die Reprimierung der Expression der ZZ-Domäne141. Dadurch konnte das VHH-Fc Fusionsprotein nicht mehr auf der Zelloberfläche eingefangen werden und wurde in das Kulturmedium sekretiert. Es wurde allerdings beobachtet, dass die verbleibenden ZZ-Domänen, die bereits vor dem Mediumswechsel auf der Zelle präsentiert wurden, auch noch nach dem Transfer in SD-Medium präsentiert wurden (Daten nicht gezeigt). Zu diesem Zweck wurden die Zellen erneut passagiert und eine neue Kultur mit einer sehr niedrigen Zelldichte inokuliert. Durch die Passage wurden die Zellen stark verdünnt, die noch die ZZ-Domäne präsentierten. Die Zellen der nachfolgenden
Generationen zeigten aufgrund der reprimierten Expression der ZZ-Domäne keine
Oberflächenpräsentation mehr. Mit der von Rakestraw und Mitarbeitern etablierten
SECANT™ Display Technologie ist es bereits möglich, selektiv zwischen
Oberflächenpräsentation und löslicher Produktion zu schalten. Dieses Verfahren ist im
Gegensatz zur Oberflächenpräsentation über die ZZ-Domäne nicht auf das Vorhandensein eines Fc-Teils des zu präsentierenden Proteins beschränkt. Vielmehr wird über die in vivo- Biotinylierung des Proteins und der chemischen Konjugation der Zelloberfläche mit Biotin und Avidin die Oberflächenpräsentation ermöglicht. Zur löslichen Produktion wird lediglich auf die chemische Konjugation der Zelle verzichtet. Dieses System erfordert allerdings die
Modifikation des Proteins, was bei der Oberflächen-präsentation mit der ZZ-Domäne nicht erforderlich ist. Vor dem Hintergrund der Oberflächen-präsentation von IgG-Molekülen ist demnach mit dem in dieser Arbeit vorgestellten nicht-kovalenten Verfahren die
Oberfiächenpräsentation des Antikörpers im finalen Format möglich. Dadurch können strukturell bedingte Beeinträchtigungen der Antikörper-Eigenschaften durch artifizielle Modifikationen des Proteins ausgeschlossen werden. Beschreibung der Abbildungen:
Abb. 1 : Schematische Darstellung von S. aureus SpA und SpA-ab eleiteten Domänen.
In (A) ist die Domänenstruktur von Protein A (SpA) gezeigt. Diese baut sich aus fünf IgG- bindenden Domänen (E, D, A, B, E), einer Signalsequenz (SP) und zwei Domänen (X und M) zur Verankerung von SpA in der bakteriellen Zellwand auf. (B) zeigt die von Domäne B abgeleitete und durch rekombinante DNA-Technologie gewonnene artifizielle Z-Domäne. Die ZZ-Domäne wird durch Duplizierung der Z-Sequenz hergestellt. (Modifiziert nach Boström.T., Nilvebrant,J., Honer,S. 201261)
Abb. 2: Oberflächenpräsentation auf Hefezellen nach Boder und Wittrup.
Abb. 3: Schematische Darstellung des Verfahrens zur nicht-kovalenten
Oberflächenpräsentation auf Hefezellen und löslicher Produktion.
(A) Grün dargestellt ist die auf der Zelle kovalent verankerte Fc-Bindedomäne. (B) Das löslich sekretierte VHH-Fc Fusionsprotein wird durch die Fc-Bindedomäne auf der Zelloberfläche eingefangen. (C) Durch die Reprimierung der Expression der Fc-Bindedomäne wird das VHH-Fc Fusionsprotein löslich in das Kulturmedium sekretiert und nicht mehr auf der
Zelloberfläche eingefangen.
Abb. 4: Schematischer Vergleich zwischen IgG-Molekül und VHH-Fc Fusionsprotein.
Schematischer Strukturvergleich zwischen einem vollständigen IgG-Molekül (links) und einem VHH-Fc Fusionsprotein (rechts). Bei beiden Proteinen handelt es sich um Homodimere, wobei ein IgG-Molekül aus zwei identischen leichten und zwei identischen schweren
Antikörperketten aufgebaut ist, während das VHH-Fc Fusionsprotein nur aus zwei identischen Ketten aufgebaut ist. Abb. 5: Western-Blot Analyse der episomalen PDI Expression in Hefezellen.
Western-Blot Analyse von 2 * 107 EBY100 URA Zellen (pESC-URA-pGAPDH-PDI
Transformanten). Die Detektion erfolgte über eine PDI-spezifischen Primärantikörper aus der Maus und einen Maus-spezifischen Sekundärantikörper aus der Ziege (POD-Konjugat). Spur 1 zeigt den intrazellulären PDI-Anteil in EBY100 URA' (Negativkontrolle). Spuren 2 bis 7 zeigen den intrazellulären PDI-Anteil durch zusätzliche Überexpression der episomal kodierten PDI-Sequenz reguliert durch den GAPDH-Promotor zu verschiedenen Zeitpunkten (s. Legende).
Abb. 6: Western-Blot Analyse der chromosomalen PDI-Expression in Hefezellen Western-Blot Analyse unter reduzierenden Bedingungen von Zelllysaten (2 χ 107 Zellen) von EBY100 (Spur 1 ) und APO-E (Spur 2-4) Kulturen die vier Tage in Galaktose-haltigem SD- Medium kultiviert wurden. Die Detektion erfolgte über einen PDI-spezifischen
Primärantikörper aus der Maus und einen Maus-spezifischen Sekundärantikörper aus der Ziege (POD-Konjugat). Abb. 7: Analyse der löslichen VHH-Fc Sekretion.
Western-Blot Analyse von Kulturüberständen und Zelllysaten aus EBY100 und APO-E Kulturen mit unterschiedlichen Expressionsbedingungen. (A) Analyse von Zelllysat (1 χ 107 Zellen, Spur 1 ) und Kulturüberstand (5 107 Zellen, Spur 2) einer VHH-Fc (CEN6/ARS4) Expression nach 96 Stunden ohne PEG8000 Zusatz. (B) Analyse von Kulturüberständen von VHH-Fc Expressionen mit PEG8000 Zusatz nach 24 Stunden und 48 Stunden. Als
Expressionplasmid wurde ein ARS4/CEN6 Plasmid (Spur 3) und ein 2-micron Plasmid (Spur 4 und 6) verwendet. (C) zeigt die zu (B) korrelierenden Zelllysate. Die Detektion erfolgte über einen Fc-spezifischen Primärantikörper (Kaninchen) und einen POD-konjugierten Kaninchenspezifischen Sekundärantikörper (Ziege). ZL: Zelllysat, KÜ: Kulturüberstand. Abb. 8: Prozessierung des VHH-Fc Fusionsproteins.
Schematische Darstellung der intrazellulären Zustandsformen des VHH-Fc Fusionsproteins. Das nicht prozessierte Protein (A) liegt intrazellulär als größere Form (48,4 kD) vor, da das Signalpeptid app8 (8,7 kD)nicht abgespalten wurde, während das reife Protein (B) ein
Molekulargewicht von 39,6 kD aufwies. Der Pfeil markiert die Erkennungsstelle der intrazellulären Signalpeptidase.
Abb. 9: Einfluss von Polyethylenglykol auf die Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen VHH-Fc Sekretion nach 48 Stunden. Western-Blot Analyse von EBY100 und APO-E
Kulturüberständen zur Analyse des Einflusses von Polyethylenglykol (PEG) auf die im
Kulturüberstand detektierbaren Proteinmengen. Expressionsmedien mit unterschiedlicher Zusammensetzung. Spur 1 und 4: kein PEG-Zusatz, Spur 2 und 5: 11 % (w/v) PEG8000, Spur 3 und 6: 1 1 % (w/v) PEG 500.
Abb. 10: VHH-Fc Sekretions-ausbeuten aus APO-E und EBY100 Expressionskulturen.
Biolayer-Interferometrie Messung zur Bestimmung der Konzentration des VHH-Fc
Fusionsproteins im Überstand von EBY 00 und APO-E Expressions-kulturen über einen Zeitraum von 120 Stunden. Fehlerbalken repräsentieren drei unabhängige Messungen. Abb. 1 1 : Exemplarische Biolaver-lnterferometrie-Messprofile mit und ohne PEG-Zusatz.
Exemplarische Biolayer-Interferometrie Messprofile der Beladung von Protein A Biosensoren mit IgG-Molekülen unter Verwendung von löslichem Protein in SD-Medium + 1 % (w/v) PEG8000 (A) und in PBS (ohne PEG8000) (B). Die bunten Kurven repräsentieren
verschiedene zur Beladung der Protein A-Biosensoren verwendete IgG-Konzentrationen. In absteigender Reihenfolge 25, 10, 5, 2, 1 , 0.5, 0.1 , 0 mg/L
Abb. 12: VHH-Fc Sekretionsausbeuten aus APO-E und APO-B Expessionskulturen
Biolayer-interferometrische Bestimmung der Konzentration des VHH-Fc Fusionsproteins im Überstand von APO-E und APO-B Expressionskulturen über einen Zeitraum von 120
Stunden mittels Protein A-Biosensoren. Die Fehlerbalken repräsentieren drei unabhängige Klone.
Abb. 13: LDS-PAGE und Western-Blot Analyse von Kulturüberständen aus APO-E und APO- B VHH-Fc Expressionskulturen.
(A) LDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen von VHH-Fc Fusionsproteinen
(Kulturüberstände) aus drei unabhängigen Expressionskulturen, Coomassie gefärbt. Als Kontrolle (+) wurden 2 μg des Antikörpers Cetuximab verwendet. (B) Western-Blot Analyse der Proben aus (A). Detektion über einen Fc-spezifischen Primärantikörper (Kaninchen) und einem Kaninchen-spezifischen POD-konjugiert Sekundärantikörper (Ziege). Als Kontrolle (+) wurden 1 [ig Cetuximab verwendet.
Abb. 14: Reinigung von VHH-Fc Fusionsproteinen mittels Protein A- Affinitätschromatographie. (A) Chromatogramm der affinitätschromatographischen Reinigung mittels Protein A HiTrap Säule von VHH-Fc aus APO-E (rot) und APO-B (schwarz) 200 ml Expressionskulturen nach Dialyse gegen PBS. Die 1 ml Fraktionen der Elutions-Pea/ s aus (A) wurden vereinigt und mittels PD-10 Säulen in PBS umgepuffert. Durchgehende Linien repräsentieren die
Absorption (mAu), unterbrochene Linien repräsentieren die Leitfähigkeit (mS/cm). (B) und (C) zeigen die Elutionsfraktionen der PD-10 Säule (je 500 μΙ), die mittels LDS-PAGE (nichtreduziert) analysiert wurden.
Abb. 15: Analytik zur Reinigung des VHH-Fc Fusionsproteins.
Western-Blot Analyse (reduziert) von Expression und Reinigung des VHH-Fc Proteins aus dem Überstand einer 200 ml APO-E Kultur. Als Positivkontrolle wurde HEK293-produzierten VHH-Fc Fusionsprotein verwendet. Analysiert wurden Proben des Fusionsproteins zu verschiedenen Zeitpunkten des Reinigungsprozesses (s. Legende).
Abb. 16: Analyse der Interaktion von VHH-Fc und hsEGFR - Biolaver-Interferometrie
Messprofil (Rohdaten). Rohdaten des Biolayer-Interferometrie Messprofils von gereinigtem VHH-Fc Fusionsprotein (A) und VHH-Fc aus dem Überstand (B) an hsEGFR. Gezeigt sind die Messprofile von acht Protein A-Biosensoren. (1) Beladung der Protein A-Biosensoren mit dem VHH-Fc für 600 s. (A 2 bis 3): Waschschritt, (B 2 bis 4): Waschschritt, (A 4, B 5) Assoziation, (A 5, B 6):
Dissoziation. Abb. 7: Bindunqsanalvse von VHH-Fc und hsEGFR (prozessierte Daten).
Kinetische Charakterisierung der biomolekularen Interaktion von VHH-Fc und hsEGFR.
Gezeigt sind die prozessierten Sensorgramme. Assoziation (1 ) und Dissoziation (2) von hsEGFR an das auf der Sensoroberfläche immobilisierte VHH-Fc Fusionsprotein. Gereinigtes VHH-Fc Protein in PBS (A) und VHH-Fc in Kulturüberstand (B). Negativkontrollen: (A) mmEGFR, (B) hs-cMet. Protein-konzentrationen sind einzeln aufgeführt. Bunte Kurven zeigen die experimentell ermittelten Daten, rote Kurven zeigen das statistische Fitting dieser Daten. Abb. 18: VHH-Fc Glvkosylierungsanalyse.
LDS-PAGE des Hefe-sekretierten VHH-Fc Proteins mit (+) und ohne (-)EndoH. Als Kontrollen wurden jeweils 2 pg folgender Proteine unter gleichen Bedingungen mit EndoH behandelt: hsEGFR (aus CHO) und Thioredoxin (aus E. coli) Abb. 19: Klonierungsschema zur Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomänen
Schematische Darstellung Vektors pYD1 für die Oberflächenpräsentation der Fc- Bindedomäne (Z- und ZZ-Domäne) als Aga2p-Fusionsprotein. (A) zeigt die einzelnen
Komponenten der Aga2p-Kassette. Die Klonierung der Z-Domäne erfolgte über die in (A) gezeigten Restriktionsschnittstellen Nhe\ und ßamHI. (B) zeigt das Konstrukt Aga2p-Z- Domäne. (C) zeigt das Konstrukt Aga2p-ZZ-Domäne.
Abb. 20: Aqa2p-vermittelte Oberflächenpräsentation von Z- und ZZ-Domäne.
Oberflächenpräsentation der monovalenten Z-Domäne (A) und der divalenten ZZ-Domäne (B) jeweils als Aga2p-Fusion. Agal p ist chromosomal kodiert und die AGA 1 Expression wird durch den Galaktose-induzierbaren Gal1 -Promotor (pGall ) reguliert. Die Aga2p-Fusionen sind episomal kodiert (pYD-Z bzw. pYD-ZZ). Ihre Expression ist ebenfalls durch den GaM- Promotor reguliert. Z-Domäne und ZZ-Domäne sind über einen Glycin-Serin-Unker (Gly/Ser) mit dem C-Terminus von der Untereinheit Aga2p verbunden.
Abb. 21 : Durchflusszvtometrie und Oberflächenpräsentation von Z- und ZZ-Domäne auf EBY100 Zellen Durchflusszytometrische Analysen von EBY 00 Zellen die Aga2p, Aga2p-Z und Aga2p-ZZ auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte mittels Protein A- spezifischen FITC-konjugiertem Nachweisantikörper aus der Ziege nach 24 Stunden
Expression (A) und 72 Stunden Expression (B). Zusätzlich ist die mittlere rel.
Fluoreszenzintensität der Konstrukte und der prozentuale Anteil an Zellen innerhalb der Markerregion M1 angegeben.
Abb. 22 Durchlicht u. Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von ZZ-präsentierenden Zellen
Durchlicht (A) und Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme (B) von Aga2p-ZZ
präsentierenden EBY100 Zellen und Aga2p präsentierenden EBY100 Zellen (C) gezeigt. Die Detektion erfolgte in (B) und (C) mit einem Protein A-spezifischen FITC-konjugierten
Antikörper aus der Ziege
Abb. 23: IqG-Bindung durch Z- und ZZ-Pomäne und Durchflusszvtometrie.
Durchflusszytometrische Analyse von Z- und ZZ-Domänen präsentierenden EBY100 Zellen (pVD-Z und pYD-ZZ Transformanten) nach 24 Stunden Expression. Die Markierung erfolgte mit dem Antikörper Cetuximab (1 μΜ), b-hsEGFR (1 μΜ) und dem SA-PE. Gezeigt ist zusätzlich die mittlere rel. Fluoreszenz sowie der prozentuale Anteil an Zellen innerhalb der Markerregion M1. Negativkontrolle: Aga2p (pYDf-Transformanten).
Abb. 24: Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen. Die Oberflächenpräsentation wurde durch die auf der Zelloberfläche kovalent-verankerte ZZ- Domäne vermittelt. Die Zellen wurden in (A) und (B) mit b-hsEGFR/SA-PE markiert. In (A) ist das Ergebnis der FACS-Analyse ohne (-PEG) und mit PEG8000 Zusatz (+PEG) nach 24 Stunden, in (B) nach 72 Stunden dargestellt. Die Markierung erfolgte mittels b-hsEGFR und SA-PE. (C) zeigt die Detektion der ZZ-Domäne beider Kulturen nach 24 Stunden durch die Markierung mit einem Protein A-spezifischen FITC-konjugierten Antikörper aus der Ziege.
Abb. 25: Durchlicht u. Fluoreszenz-mikroskopische Analyse von VHH-Fc präsentierenden Zellen.
Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von EBY100 Zellen, die, vermittelt durch die ZZ- Domäne, das VHH-Fc Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche präsentierten. Die Zellen wurden zum einen mit b-hsEGFR/SA-PE (Reihe: hsEGFR) und zum anderen mit b-rFcRn (Rattus norvegicus)ISA-PE (Reihe: ratFcRn) markiert (Spalte: PE). Zusätzlich erfolgte eine weitere Markierung mit einem Fc-spezifischen Antikörper (Spalte: Alexa 647). Die Überlagerung beider Fluoreszenzsignale ist in der Spalte PE + Alexa 647 gezeigt.
Abb. 26: Nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von IqG-Molekülen Zwei-Farben-Markierung und Durchflusszytometrie nach (A) 24 und (B) 48 Stunden. Die gelbe Fluoreszenz (rel. Fluoreszenz gelb) zeigt das Signal für Phycoerythrin und damit die Bindung von b-hsEGFR; die rote Fluoreszenz (rel. Fluoreszenz rot) zeigt das Signal für AlexaFluor 647™ (Fc-Signal). 24 Stunden: 36,4% der Zellen innerhalb der Markerregion M1 , 48 Stunden: 43,4% der Zellen innerhalb der Markerregion M1. (C) Kontrolle: Zellen aus (A) markiert mit SA-PE. 0,2% der Zellen innerhalb der Markerregion M1. (D) zeigt stark vereinfacht die Oberflächenpräsentation des IgG-Moleküls durch die über Aga2p (hellblau) und Agal (dunkelblau) kovalent-verankerte ZZ-Domäne (grün). Der graue Pfeil deutet auf die lösliche Sekretion von leichter und schwerer IgG-Kette hin.
Abb. 27: Kovalente Oberflächenpräsentation von IqG-Molekülen
Zwei-Farben-Markierung von IgG präsentierenden EBY100 Zellen nach (A) 24 Stunden und (B) 72 Stunden. Die gelbe Fluoreszenz (rel. Fluoreszenz gelb) zeigt das Signal für SA-PE und damit die Bindung des biotinylierten Antigens (b-hsEGFR); die rote Fluoreszenz (rel.
Fluoreszenz rot) zeigt das Signal für AlexaFluor™ 647 (Fc-spezifischer Antikörper). (C) zeigt stark vereinfacht die theoretisch angenommene Oberflächenpräsentation des IgG-Moleküls als kovalente Aga2p-Fusion im Falle einer erfolgreichen Assemblierung von leichter und schwerer IgG-Kette.
Abb. 28: FACS-Analvse der Stabilität der VHH-Fc:ZZ-lnteraktion.
FACS-Histogramme von VHH-Fc präsentierenden ΕΒΥ10Ό Zellen. (A)
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc markiert (rot) und Oberflächenpräsentation von VHH- Fc nicht-markiert (schwarz). (B) Initiale 1 :1 Mischung zum Zeitpunkt T0. (C) 1 : 1 Mischung nach 32 Stunden. Detektion des VHH-Fc Fusionsproteins über b-hsEGFR und SA-PE
Abb. 29: VHH-Fc:ZZ Interaktion über einen Zeitraum von 32 Stunden.
Graphische Darstellung der mittleren relativen Fluoreszenz der M1-Population nach verschiedenen Zeitpunkten (·) und dem daraus resultierenden prozentualen Bindungsanteil zwischen ZZ-Domäne und VHH-Fc (=) im Vergleich zur initialen Messung (Abb. 26 B). Abb. 30: Octet- und FACS-Analysen der Bindung versch. VHH-Fc Fusionsproteine und hsEGFR
Analysiert wurden die biomolekularen Interaktionen der drei VHH-Domänen (VHH-A, VHH-B, VHH-C) mit dem Antigen (hsEGFR) mittels Biolayer-Interferometrie und FACS. Mean FL gelb (rel. Fluoreszenz gelb) gibt die mittlere relative Fluoreszenzintensität der in M1 lokalisierten Zellen der FACS-Messung (FACS) wieder. In der Spalte Biolayer-Interferometrie sind die prozessierten Messwerte von Assoziation und Dissoziation der Interaktion der VHH-Domänen mit löslichem Antigen (250 nM, 125 nM und 62,5 nM hsEGFR) gezeigt.
Abb. 31 : Graphische Darstellung der FACS-Analvse der Bindung verschiedener VHH-Fc Fusions-proteine (A. B. C) an das Antigen hsEGFR. Mittlere rel. Fluoreszenzsignale für die Bindung von hsEGFR von drei VHH-Domänen (VHH- A, VHH-B, VHH-C), die als Fc-Fusion auf EBY100 Zellen über die Interaktion mit der ZZ- Domäne präsentiert wurden. Jeweils gleiche Zellzahlen wurden mit verschiedenen hsEGFR- Konzentrationen (200 nM bis 0 nM) und SA-PE markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Nach Normalisierung des Signals der Oberflächenpräsentation wurden die
Fluoreszenzsignale gegen die Konzentrationen aufgetragen. Fehlerbalken repräsentieren drei unabhängige Messungen.
Abb. 32: FACS-Analvse zur schaltbaren Oberflächenpräsentation.
FACS-Histogramme zur Untersuchung der schaltbaren Sekretion von VHH-Fc
Fusionsproteinen. (A) und (C) pYD-pGal-app8-VHH1-Fc/pYD-ZZ. (B) und (D) pYD-pGAPDH- app8-VHH1-FclpYD-ZZ. Die Detektion der ZZ-Domäne erfolgte über einen Protein A- spezifischen Antikörper aus der Ziege (FITC-Konjugat). Die Detektion des VHH-Fc
Fusionsproteins über ein Fcspezifisches F(ab')2 Fragment (AlexaFluor™ 647 Konjugat).
Grau: Kultivierung in Glukose-haltigem Medium, rot: Kultivierung in Galaktose-haltigem
Medium.
Abb. 33: Selektiver Wechsel zwischen Oberflächenpräsentation und löslicher Produktion.
Zwei-Farben-Markierung und Durchflusszytometrie von EBY100. In (A) ist die Kultivierung von Zellen in Galaktose-haltigem Medium (+PEG8000) gezeigt. Die rel. Fluoreszenz grün zeigt die Oberflächen-präsentation der ZZ-Domäne. Die rel. Fluoreszenz rot zeigt die
Oberflächenpräsentation der nicht-kovalent präsentierten VHH-Fc Fusionsproteine. Durch den Transfer der Zellen in Glukose-haltiges Medium (+PEG8000) (B) sind ZZ-Domäne und VHH-Fc Fusionsprotein nicht mehr auf der Zelloberfläche detektierbar (vgl. M1 A und M1 B).
Abb. 34: Analyse zur schaltbaren Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen.
Western-Blot Analyse der mittels TCA präzipitierten Proteinfraktionen im Überstand von VHH- Fe Expressionskulturen. Untersucht wurde das Verhalten des Gal1 -Promotors und des
GAPDH-Promotors in Galaktose- und Glukose-haltigem Medium. Die Detektion der VHH-Fc Fusionsproteine auf der PVDF-Membran erfolgte über einen Fc-Fragment spezifischen
Primärantikörper (Kaninchen) und einem Kaninchen-spezifischen POD-konjugierten
Sekundärantikörper (Ziege). Abb. 35: Klonierunqsstrategie der VHH-Bibliotheken. Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie zur Herstellung der VHH-Bibliotheken. Die mutierten Varianten der VHH-Sequenz (rot) werden über homologe Bereiche (Overlap) an den Enden der PCR-Produkte in den linearisierten Zielvektor eingebaut. Hierbei wird sich der Mechanismus der homologen Rekombination in Hefezellen zunutze gemacht Abb. 36: Plasmide zur Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne
(A)Schematische Darstellung des Plasmids pYD1 zur Oberflächenpräsentation von Aga2p- Fusionsproteinen auf der Oberfläche von EBY100 Zellen (Invitrogen) und der Plasmide für die Oberflächenpräsentation der Z-Domäne pYD-Z (B) und der ZZ-Domäne pYD-ZZ (C) als Aga2p-Fusion. pYD-ZZ existierte zusätzlich noch mit einer G418-Resistenzkassette anstelle des Auxotrophiemarkers Trp1 und wird als pYD-ZZ-G418 bezeichnet (Plasmidkarte nicht gezeigt).
Abb. 37: Plasmide zur löslichen Sekretion
Schematische Darstellung der Plasmide zur löslichen Sekretion. Alle Plasmide kodieren für das Signalpeptid app8 für die lösliche Sekretion. (A-C) Sekretionsplasmide für die hsEGFR- spezifische VHH-Domäne; exprimiert als Fc-Fusionsprotein. (D) Sekretionsplasmid für die Trx-spezifische VHH-Domäne, exprimiert als Fc-Fusionsprotein. (E) Sekretionsplasmid für die VHH-Domäne B. (F) Sekretionsplasmid für die VHH-Domäne C.
Abb. 38: Plasmide zur löslichen Sekretion von IqG-Molekülen
Plasmide zur löslichen Sekretion von (A) schwerer und (B) leichter Kette des IgG-Moleküls Matuzumab vermittelt durch das Signalpeptid app8. (C) Plasmid zur Expression der schweren Kette von Matuzumab als Aga2p-Fusion.
Abb. 39: Plasmide zur chromosomalen PDI-Inteqration.
(A) pESC-URA Vektor von Agilent Technologies Inc.. (B) pESC-URA Vektor mit PDI- Sequenz. (C) pESC-URA Vektor mit PDI-Sequenz und GAPDH-Promotor (PDI- Expressionskassette). (D) pRS306-lntegrationsvektor zur chromosomalen Integration der PDI-Expressionskassette und Überexpression der Oxidoreduktase PDI. Die folgende Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Insbesondere können einzelne bestimmte Ausführungsformen, physikalische, biologische oder chemische Parameter oder Materialien verallgemeinert werden, sofern dem Fachmann dies ohne weiteres möglich ist, Beispiele
(A) Verwendete Materialien, Zellen und Medien
(i) Verwendete Hefestämme:
EBY100: MATa URA3-52 trpl leu2M his3A200 pep4::HIS3 prb1M .BR can\ GAL
(plU211 :URA3). Teil des„Yeast Display Vector Kit, Invitrogen, Deutschland
BJ5464: MATa URA3-52 trpl teu2A1 h/s3A200 pep4:.HIS3 prMA1.6R can\ GAL
(ATCC Nr. 208288)
EBY100 URA': Generiert durch 5-FOA Selektion. Biochemie, AK Prof. Kolmar, TU Darmstadt, Deutschland
BJ5464-Cf? : Generiert durch 5-FOA Selektion, Merck Serono, Merck KGaA, Deutschland APO-E: EBY100- URA ' und Integration des Vektors pRS306-PDI
APO-B: BJ5464- URA und Integration des Vektors pRS306-PDI
(ii) Nährmedien für die Kultivierung von Hefezellen
YPD-Medium: 20 g Dextrose
20 g Pepton
10 g Hefeextrakt
Die Komponenten wurden in sterilem Wasser gelöst, mit 10 ml PenStrep Mix versetzt und auf 1 L mit sterilem Wasser aufgefüllt. Nach der Sterilfiltration erfolgte die Lagerung bei 4 °C für maximal zwei Monate. Für Agarpiatten wurde das Medium mit 1 ,5% Agar versetzt und 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert.
(iü) Glukose-haltiges SD-Medium +PEG8000:
26,7 g Basismix (Minimal SD-Base) wurden in 490 ml sterilem Wasser gelöst und 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Separat wurde der gewünschte DO-Mix mit 5,4 g Na2HP04 und 8,56 g NaH2P04 x H20 in 100 ml sterilem Wasser gelöst und ebenfalls für 5 Minuten bei 121 °C autoklaviert. In einem weiteren Ansatz wurden 0 g PEG8000 in 400 ml sterilem Wasser unter Rühren gelöst. Alle Komponenten wurden gemischt, mit 10 ml PenStrep Mix versetzt und sterilfiltriert. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur für maximal vier Wochen.
(iv Galaktose-haltiqes SD Medium: Zur Induktion des Gal1 -Promotors wurde an Stelle von 26,7 g/L Basismix (Minimal SD-Base) 37 g Galaktose-haltiger Basismix (Minimal SD-Base Gal/Raf) (Clontech Laboratories Inc.) verwendet. Der Basismix wurde in 890 ml sterilem Wasser gelöst und 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Separat wurde der gewünschte DO-Mix mit 5,4 g Na2HP04 und 8,56 g NaH2P04 x H20 in 100 ml sterilem Wasser gelöst und ebenfalls für 15 Minuten bei 21 °C autoklaviert. Nach Abkühlen beider Lösungen wurden Basis- und DO-Mix vereinigt und mit 10 ml PenStrep Mix versetzt. Das Medium wurde bei Raumtemperatur maximal vier Wochen gelagert.
(v) Galaktose-haltiaes SD Medien +PEG8000:
37 g Basismix (Minimal SD-Base Gal/Raf) wurden in 490 ml sterilem Wasser gelöst und 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Separat wurde der gewünschte DO-Mix mit 5,4 g Na2HP04 und 8,56 g NaH2P0 * H20 in 100 ml sterilem Wasser gelöst und ebenfalls für 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. In einem weiteren Ansatz wurden 110 g PEG8O0O in 400 ml sterilem Wasser unter Rühren gelöst und dem autoklavierten Medium zugeführt. Nach vollständiger Vermischung aller Komponenten wurde der Ansatz sterilfiltriert und mit 10 ml PenStrep Mix versetzt. Das Medium wurde bei Raumtemperatur maximal vier Wochen gelagert.
Für die Selektion von Transform anten mit episomal kodierter G418-Resistenz wurde das Galaktose-haltige SD-Medium +PEG8000 mit 150 mg/L Genetecin versetzt.
Beispiel 1 : Herstellung eines Verfahrens zur nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens zur nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen und Fc-Fusionsproteinen auf Hefezellen, der damit verbundenen Selektion und der anschließenden schaltbaren Sekretion des selektierten Proteins in das Medium einer Expressionskultur zu dessen biochemischer Charakterisierung. Das Verfahren der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen wurde durch die Interaktion der auf der Zelloberfläche kovalent verankerten, von Protein A abgeleiteten Fc- Bindedomäne und der Co-Expression eines VHH-Fc Fusionsproteins oder eines IgG- Moleküls verwirklicht. Die lösliche Sekretion der VHH-Fc Fusionsproteine in den
Kulturüberstand wurde durch Änderung der Expressionsbedingungen erreicht. Dadurch wurden zeitaufwändige Reformatierungsschritte des Expressionsplasmids, die z.B. bei vergleichbaren Selektionsmethoden wie der Oberflächenpräsentation auf Phagen136 oder der Oberflächen-präsentation als kovalente Aga2p-Fusion92 zur löslichen Produktion des selektierten Klons nötig sind, entbehrlich. Zur Validierung des Verfahrens wurden VHH-Fc Fusionsproteine verwendet, um die Komplexität der Experimente im Vergleich zur Verwendung von vollständigen IgG-Molekülen zu reduzieren, da es sich bei der VHH-Fc Fusion um ein Protein handelt, das im Gegensatz zu einem IgG-Molekül nicht aus vier, sondern lediglich aus zwei Ketten aufgebaut ist (Abb. 4). Im ersten Abschnitt der hier dargestellten Ergebnisse ist die Generierung eines PDI (Protein disulfide isomerase) überexprimierenden Hefestammes gezeigt, von welchem eine verbesserte lösliche Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen erwartet wurde und gezeigt werden konnte. Anschließend wird die Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen, die Sekretionsoptimierung und die
Charakterisierung der Hefe-sekretierten VHH-Fc Fusionsproteine gezeigt, um ihre
Funktionalität zu überprüfen. Im folgenden wird die Oberflächenpräsentation einer Fc- bindenden, von Protein A abgeleiteten Domäne auf Hefezellen sowie die Co-Expression mit löslich sekretierten VHH-Fc Fusionsproteinen und deren Oberflächen-präsentation gezeigt. In diesem Fall diente die Fc-Bindedomäne als Vermittlermolekül der nicht-kovalenten
Oberflächenpräsentation der VHH-Fc Fusionsproteine durch die Wechselwirkung mit dem Fc- Teil. Dazu wurde das Präsentationsverhalten der Fc-Bindedomäne auf der Oberfläche von Hefezellen und deren Funktionalität im Hinblick auf die Bindung von humanen IgG-Molekülen analysiert. Um mittels Hochdurchsatz-Verfahren die Isolierung von Klonen mit der
gewünschten Eigenschaft aus generierten Varianten-bibliotheken unter Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens zu ermöglichen, wurde die Stabilität der Genotyp-Phänotyp- Kopplung im Vorfeld mit Hilfe von Mischungsexperimenten validiert. Zur experimentellen Erprobung und zur Untersuchung der Genotyp-Phänotyp-Kopplung dieser nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen werden anschließen die Ergebnisse zweier Mischungsexperimente und die Herstellung und Charakterisierung von drei
generierten VHH-basierten Bibliotheken und die Durchmusterung einer dieser Bibliotheken nach VHH-Varianten mit einer neuen Eigenschaft gezeigt.
Beispiel 2: Generierung eines PDI-überexprimierenden Hefestammes
Die Oxidoreduktase PDI {Protein disulfide isomerase) ist ein ER-Iokalisiertes Enzym, das die Oxidation und Reduktion von Disulfidbrücken in Substratproteinen katalysiert137. Es wurde in einer bereits veröffentlichten Studie gezeigt, dass die Überexpression dieses Enzyms zu einer gesteigerten Sekretion von scFv-Fragmenten aus der Hefe führt118. Rakestraw und Mitarbeiter zeigten 2009, dass die Überexpression von PDI zu einer signifikanten Erhöhung der sekretierten IgG-Menge aus Hefezellen führte und dass die Integration einer
PDI-Expressionskassette ins Hefegenom einer episomalen Expression der PDI zur
Steigerung der Sekretion von heterolgen Proteinen vorzuziehen ist111. Im Folgenden sind die Ergebnisse der Generierung des S. cerevisiae Stammes APO-E dargestellt. Im Vorfeld wurde vermutet, dass die PDI-Überexpression die Sekretionsleistung des Hefestammes für VHH-Fc Fusionsproteine erhöht. Dieser Hefestamm wurde durch die chromosomale Integration einer PDI-Expressionskassette in das Genom von EBY100 generiert. Die Herstellung des
S. cerevisiae Stammes APO-B erfolgte in vergleichbarer Weise (Daten nicht gezeigt). In diesem Fall wurde die PDI-Expressionskassette in gleicher Weise chromosomal in den Stamm BJ5464 integriert. Zur Amplifizierung der Hefe-eigenen Oxidoreduktase PDI wurde chromosomale DNA aus einer stationär wachsenden EBY100 Kultur extrahiert. Mittels Gap- Repair PCR und unter Verwendung der Oligodesoxyribonukleotide PDI-GR-up und
PDI-GR-rp wurde im Anschluss die Sequenz der PDI mit homologen Bereichen zum
Zielvektor pESC-URA amplifiziert. Als Matrize für die PCR diente 1 pl der chromosomalen DNA-Präparation. Die Gensequenz wurde anschließend mittels homologer Rekombination in den Zielvektor kloniert. Zur Initiierung der homologen Rekombination wurde der Zielvektor zuvor mit der Restriktionsendonuklease Xho\ linearisiert. Elektrokompetente ΕΒΥ10Ό URA~ Zellen wurden mit dem Zielvektor und dem PCR-Produkt der PDI-Gensequenz transformiert. Der Hefestamm EBY100 URA~ wurde freundlicherweise von Stefan Zielonka (Biochemie, TU Darmstadt, AK Prof. Kolmar) zu Verfügung gestellt. Bei diesem Stamm wurde zuvor der Auxotrophiemarker URA3 durch 5-Fluororotsäure Selektion138 mutiert. Nach Überprüfung der Klonierung mittels Sequenzierung wurde in einem zweiten Klonierungsschritt der induzierbare Promotor Gal1/10 des generierten Vektors pESC-URA-PDI gegen den konstitutiv
exprimierenden Promotor GAPDH substituiert, um den Vektor pESC-pGAPDH-PDI herzustellen. Zu diesem Zweck wurde die DNA-Sequenz des GAPDH-Promotors aus dem Plasmid pGAPZA (Life Technologies Corp.) unter Verwendung der Oligodesoxyribonukleotide GAPDH-up und GAPDH-rp amplifiziert und der Vektor pESC-URA-PDI unter Verwendung der Restriktionsendonuklease ßs/API linearisiert und gereinigt. Im Anschluss erfolgte die
Transformation von elektrokompetenten EBY100 URA~ Zellen mit dem linearisierten
Zielvektor und dem GAPDH-PCR-Produkt zur Klonierung mittels homologer Rekombination in Hefezellen. Nach erfolgter Selektion und erneuter Sequenzierung wurden elektrokompetente EBY100 URA~ Zellen mit dem Plasmid pESC-URA-pGAPDH-PDI transformiert. Die
episomale Expression der PDI wurde im Anschluss mittels Western-Blot Analyse überprüft (Abb. 4). Zu diesem Zweck wurde eine 50 ml Kultur in geeignetem Glukose-haltigen SD- Medium angezogen. Die initiale Zelldichte betrug 3 χ 106 Zellen/ml. Ausgehend von dieser Kultur wurde anschließend eine weitere Kultur (50 ml) in Galaktose-haltigem Medium hergestellt, um die Genexpression zusätzlich in Galaktose-haltigem Medium zu überprüfen. Beide Kulturen wurden bis zu einer Zelldichte von 3 χ 107 Zeilen/ml bei 30 °C kultiviert und im Anschluss zu definierten Zeitpunkten 2 χ 107 Zellen entnommen und für die Analyse mittels Western-Blot aufgearbeitet . Die Darstellung der Western-Blot Analyse ist in Abb. 5 gezeigt und repräsentiert den intrazellulären Anteil der Oxidoreduktase PDI. Der spezifische
Nachweis erfolgte mit einem PDI-spezifischen Antikörper aus der Maus. Die Detektion auf der PVDF-Membran erfolgte im Anschluss mit einem Maus-spezifischen Antikörper (POD- Konjugat) aus der Ziege. Die in Abb. 5 gezeigte Western-Blot Analyse verdeutlichte, dass die episomal kodierte PDI sowohl in Glukose- (Abb. 5 Spur 2) als auch in Galaktose-haltigem Medium (Abb. 5 Spur 3 bis 7) exprimiert wurde und über den PDI-spezifischen
Nachweisantikörper im Zelllysat detektiert werden konnte. Dieser Befund ist auf die
Regulation der PDI-Expression durch den konstitutiv-exprimierenden GAPDH-Promotor zurückzuführen. Im Vergleich mit der Negativkontrolle (EBY100 URA' Zellen, Abb. 5 Spur 1) war ein signifikant stärkeres Signal im Western-Blot zu verzeichnen. Im nächsten Schritt ist die Generierung des PDI-überexprimierenden Stammes APO-E gezeigt. Zur Herstellung von APO-E wurde die PDI-Expressionskassette, bestehend aus der Sequenz für den GAPDH- Promotor und der Sequenz für die PDI, in das Hefegenom von EBY100 integriert. Zu diesem Zweck wurde die Sequenz der PDI-Expressionskassette in den Integrationsvektor pRS306 (ATCC) kloniert. Dazu wurden die Erkennungsstellen der Restriktionsendonukleasen Xho\ und Xba\ mittels PCR an die Expressionskassette angefügt. Es wurden die
Oligodesoxyribonukleotiden Xbal-PDI-up und Xhol-PDI-rp verwendet. Im Anschluss an die Reinigung des PCR-Produkts erfolgte die endonukleolytische Restriktion des PCR-Produkts und des Zielvektors pRS306. Es folgte die Ligation des Zielvektors pRS306 mit der geschnittenen Expressionskassette (pGAPDH-PDI) unter Verwendung der T4-DNA Ligase und die Transformation von chemisch kompetenten E. coli TOP 10 Zellen. Durch die Anzucht von fünf Klonen, deren Plasmidisolierung und Sequenzierung konnte ein Klon mit der korrekten Sequenz {pRS306-PDI) identifiziert werden. Dieser wurde für die Integration der PDI-Expressionskassette in das Genom von EBY100 genutzt. Zur Vorbereitung der chromosomalen Integration wurde eine präparative Plasmidisolierung des Vektors pRS306- PDI wie beschrieben durchgeführt. Im Anschluss erfolgte die Linearisierung des Plasmids unter Verwendung der Restriktionsendonuklease 8sfBI 2,5 des linearisierten Vektors wurden anschließend zur Transformation von EBY100 URA' Zellen verwendet und dadurch die spezifische Integration der PDI-Expressionskassette in das Hefegenom ermöglicht. Nach erfolgter Selektion auf SD-URA Agarplatten wurde die chromosomale Integration des Vektors pRS306-PDI mittels Western-Blot Analyse experimentell untersucht. Zu diesem Zweck wurden sechs Klone in YPD-Medium kultiviert und anschließend in geeignetes Galaktose- haltiges SD-Medium überführt. Nach vier Tagen wurden jeweils 2 χ 107 Zellen entnommen und unter den üblichen Bedingungen für die Analyse der PDI-Expression mittels Western-Blot vorbereitet. Die Ergebnisse hierzu sind in Abb. 6 dargestellt. Durch die spezifische Detektion der Oxidoreduktase PDI in den Zelllysaten der sechs Hefekulturen (Abb. 6) konnte die erfolgreiche Überexpression der PDI festgestellt werden (Abb. 6 Spur 2-4). Im Vergleich zu den APO-E Klonen zeigte die Probe des EBY100 Stamms ein signifikant schwächeres Signal im Western-Blot (Abb. 6 Spur 1). Dieser Befund deutete auf die erfolgreiche Integration des Vektors pRS306-PDI in das Genom des Stammes EBY100 UR hin und zeigte, dass die Oxidoreduktase PDI in diesem Stamm stärker exprimiert wurde als im Stamm EBY100. Zur stabilen chromosomalen Integration der PDI-Expressionskassette wurde abschließend der zur Selektion verwendete URA3 Marker mittels 5-Fluororotsäure mutiert. Im folgenden ist die direkte Anwendbarkeit des Stammes APO-E in Bezug auf die Sekretion des VHH-Fc
Fusionsproteins gezeigt. Beispiel 3: Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen
Im diesem Abschnitt sind die Ergebnisse der löslichen Sekretion von VHH-Fc
Fusionsproteinen aus Hefezellen dargestellt um die Sekretionsleistung der S. cerevisiae Stämme ΕΒΥ10Ό und APO-E für VHH-Fc Fusionsproteine zu überprüfen. Da es sich bei dem VHH um eine einkettige Domäne handelt, wurde somit die Komplexität des
Versuchsansatzes im Vergleich zur Verwendung von vollständigen, mehrkettigen IgG- olekülen reduziert. Untersucht wurde neben der Sekretionsleistung der einzelnen Stämme auch der Einfluss der Gendosis auf die sekretierte Proteinmenge. Zu diesem Zweck wurden Expressionsplasmide mit unterschiedlichen Replikationsursprüngen (Oris) verwendet, die zuvor über homologe Rekombination in Hefezellen generiert wurden. Zu diesem Zweck wurde die DNA-Sequenz des VHH-Fc Konstrukts mit spezifischen
Oligodesoxyribonukleotiden aus dem Plasmid pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc amplifiziert und in den linearisierten Vektor pESC-Leu kloniert. Dadurch wurde der Vektor pESC-pGa(1-app8- VHH1-Fc mit dem Ori 2-micron generiert. Ein Plasmid mit dem Ori CEN6/ARS4 zeichnet sich durch eine geringe, ein Plasmid mit dem Ori 2-micron durch eine hohe Kopienzahl innerhalb einer Zelle aus139. Zu Beginn wurden elektrokompetente APO-E und EBY100 Zellen mit den Plasmiden pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc und pESC-pGal1-app8-VHH1-Fc far die lösliche Sekretion des hsEGFR-spezifischen VHH-Fc Fusionsproteins transformiert. Beide Plasmide kodierten neben der VHH-Gensequenz auch für das Signalpeptid app8 zur löslichen
Sekretion. Für die Expression wurden geeignete Galaktose-haltige SD-Medien mit 1 1 % (w/v) PEG8000 Zusatz und ohne PEG8000 Zusatz verwendet, um zusätzlich den Einfluss von PEG8000 auf die sekretierte Menge des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand zu ermitteln. Im Vorfeld wurde vermutet, dass sich der Zusatz von PEG8000 vorteilhaft auf die Sekretion von heterologen Proteinen auswirken kann, da bereits in der Literatur darauf hingewiesen wurde, dass PEG einen positiven Einfluss auf die Sekretion heterologer Proteine haben kann140. Zu gegebenen Zeitpunkten (24, 48, 96 Std.) wurden Proben des Kulturüberstandes entnommen und die im Überstand enthaltenen Proteine mittels Trichloressigsäure präzipitiert. Die Probenaufarbeitung der Zelllysate erfolgte entsprechend. Die Markierung der VHH-Fc Fustonsproteine erfolgte auf der PVDF-Mernbran über einen Fc- spezifischen Primärantikörper aus dem Kaninchen und einen POD-konjugierten Kaninchen- spezifischen Sekundärantikörper aus der Ziege. Die Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt. In beiden Konstrukten wurde zuvor die Glykosylierungsstelle im Fc-Teil an Position 297 mittels ortsspezifischer Mutagenese mutiert um die aus Hefe bekannte Hypermannosylierung während der N-Glykosylierung zu verhindern. Zu diesem Zweck wurde die Mutagenese dieser Position mittels PCR und unter Verwendung des Oligodesoxyribonukleotids N-Q-HC- mut durchgeführt. Hiervon wurde sich eine erleichterte und verbesserte Sekretion des
Proteins durch die Hefe erhofft. Abb. 7 A zeigt die erfolgreiche Expression des VHH-Fc Konstrukts und dessen löslicher Sekretion durch Kultivierung von EBY100 Transformanten ohne PEG8000-Zusatz. Die Proteine wurden im Zelllysat (Spur 1) nach 24 Stunden und im Kulturüberstand (Spur 2) nach 96 Stunden spezifisch nachgewiesen. Das analysierte
Volumen des Überstandes (Spur 2) entsprach dem äquivalenten Volumen von 5 χ 107 Zellen. In diesem wurde das VHH-Fc Protein in monomerer (~40 kD) und auch in dimerisierter Form (-90 kD) erst nach einer Expressionsdauer von 96 Std. vorgefunden (nicht-reduziert). Im Zelllysat wurden ebenfalls zwei VHH-Fc-spezifische Banden detektiert (Abb. 7 Spur 1 ). Die Bande mit dem kleineren Molekulargewicht konnte dem monomeren VHH-Fc Protein (~40 kD) zugeordnet werden, da sie eine Größe zwischen 38 kD und 49 kD aufwies. Mit Hilfe des Sequenzanalyse-Programms Lasergene® (DNASTAR Inc.) wurde im Vorfeld ein
Molekulargewicht von 39,6 kD für das monomere VHH-Fc Fusionsprotein ermittelt. Die zweite Bande wies ein leicht höheres Molekulargewicht auf (Abb. 7 Spur 1). Diese größere
Proteinform war im Falle der nicht erfolgten Prozessierung des VHH-Fc Fusionsproteins zu erwarten, da das Signalpeptid app8 eine Größe von 8,7 kD aufweist und im Falle der Nicht- Prozessierung durch die zelluläre Signalpeptidase die Molekülgröße des VHH-Fc
Fusionsproteins im Western-Blot sichtbar erhöht. In der nachfolgenden Abb. 8 ist die schematische Darstellung der nicht-prozessierten (Abb. 8 A) und der prozessierten (Abb. 8 B) Form des Proteins gezeigt. In Abb. 7 B sind die Ergebnisse der Western-Blot Analyse der Kulturüberstände nach 24 und 48 Stunden von APO-E Transformanten gezeigt. Bei den aufgetragenen Kulturvolumina handelte es sich um Volumina, die äquivalent zu 1 χ 107 Zellen waren. In diesem Fall wurde der Überstand einer fünf-fach geringeren Zellmenge im
Vergleich zu Abb. 7 A Spur 2 analysiert. Abb. 7 B zeigt zusätzlich den Vergleich zwischen der Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand von einem
CEN6/ARS4-P|asmid (Spur 3 und 5) und von einem 2-micron Plasmid (Spur 4 und 6). Die Genexpression von beiden Plasmiden wurde unter identischen Bedingungen durchgeführt. Im Unterschied zu Abb. 7 A erfolgte die Kultivierung der Zellen während der Genexpression in Gegenwart von 1 1% (w/v) PEG8000. In Abb. 4.5 C sind die zu B korrelierenden Zelllysate mittels Western-Blot analysiert worden. Wie zu erkennen ist, konnte sowohl das
CEN6/ARS4-Plasmid kodierte (Abb. 7 B, Spur 3) als auch das 2-micron Plasmid kodierte VHH-Fc Fusionsprotein (Abb. 6 B, Spur 4) erfolgreich im Kulturüberstand detektiert werden. Bereits nach 24 Stunden war, anders als bei der Kultivierung ohne PEG8000 (Daten nicht gezeigt), ein deutliches Signal erkennbar. Das deutete auf eine stärkere Sekretion des Proteins in Gegenwart von PEG8000 hin. Zusätzlich zeigte sich bei der Kultur mit dem 2-micron Plasmid eine deutlich geringere Proteinmenge in einem äquivalenten
Kulturvolumen, da schwächere Bandensignale detektiert wurden (vgl. Abb. 7 B Spur 3 und 5 mit Spur 4 und 6). Bei der Analyse der Zelllysate (Abb. 7 C) wurde deutlich, dass lediglich im Zelllysat der 2-micron Kultur (Spur 8) ein VHH-Fc spezifisches Signal detektiert werden konnte. Dieser Befund deutete trotz der höheren Gendosis auf eine weniger effiziente Sekretion des Proteins unter Verwendung eines 2-micron Plasmids hin als bei der
Verwendung eines CEN6/ARS4-Plasmid. Das Bandensignal wies ein Molekulargewicht auf, das der Größe der nicht-prozessierten Form (Abb. 8 A) entsprach. Die untersuchte Probe des Zelllysats aus der CEN6/ARS4-Kultur zeigte weder bei 24 Stunden noch bei 48 Stunden ein VHH-Fc spezifisches Signal. Intrazellulär konnte das VHH-Fc Protein hier nicht mehr nachgewiesen werden, was auf eine effektive Sekretion des Proteins hindeutet. Es ließ sich feststellen, dass die Expression und lösliche Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen in Gegenwart von 11 % (w/v) PEG8000 deutlich höhere Proteinausbeuten lieferte als die in PEG-freiem Medium. Ebenfalls konnte unter Verwendung eines CEN6/ARS4-Plasmids eine signifikant größere Proteinmenge sekretiert und detektiert werden als bei Verwendung des 2-micron Plasmids. Bei der Expression ohne PEG8000 ließen sich intrazellulär zwei verschieden große Formen des Proteins detektieren; eine größere nicht-prozessierte und eine kleinere prozessierte Form. Bei Analyse des Zelllysats aus der PEG8000-haltigen Expressionskultur mit dem CEN6/ARS4-Plasmid ließ sich keine der beiden intrazellulären Proteinformen detektieren, während im Zelllysat der PEG8000-haltigen Expressionskultur mit dem 2-micron-Plasmid das Auftreten der nicht-prozessierten Proteinform beobachtet wurde. Zur weiteren Analyse des Einflusses von Polyethylenglykol (speziell PEG8000) auf die lösliche Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen wurden ausgehend von pYD-pGal1-app8- VHH1-Fc APO-E und ΕΒΥ10Ό Transformanten jeweils drei unterschiedliche
Expressionskulturen hergestellt, die sich ausschließlich in ihrem PEG-Gehalt unterschieden (ohne PEG, 11% (w/v) PEG8000 und 1 1 % (w/v) PEG1500). Es galt experimentell zu untersuchen, ob das Molekulargewicht des verwendeten PEGs Einfluss auf die sekretierte Porteinmenge hatte. Nach Abschluss der Expression in Galaktose-haltigem SD-Medium wurde ein Kulturvolumen entsprechend 1 * 107 Zellen entnommen und nach Zentrifugation der zellfreie Überstand für die Western-Blot Analyse vorbereitet. Dies erfolgte unter reduzierenden Bedingungen. Die Detektion von VHH-Fc Proteinen auf der Membran erfolgte wie zuvor beschrieben über einen Fc-spezifischen Nachweisantikörper. Das Ergebnis der Western-Blot Analyse ist in Abb. 9 dargestellt. Abb. 9 verdeutlicht, dass der Zusatz von Polyethylengiykoi entscheidend für eine erfolgreiche Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand war. Dies galt sowohl für EBY100 als auch für APO-E
Expressionskulturen. Ohne Zusatz von PEG konnte bei beiden Stämmen kein Protein im Kulturüberstand detektiert werden (Spur 1 und 4). Die erfolgreiche Sekretion des Proteins im analysierten Volumen des Kulturüberstands war in diesem Experiment innerhalb von 48 Stunden nur in Gegenwart von PEG8000 oder PEG1500 möglich. Ferner hatte das
Molekulargewicht des verwendeten PEGs einen signifikanten Einfluss auf die im Überstand lokalisierten Proteinmengen. Weniger entscheidend war hingegen die Verwendung eines PDI-überexprimierenden Hefestammes. Die Ergebnisse aus Abb. 9 ließen den Schluss zu, dass hochmolekulares PEG8000 besser für die lösliche Sekretion des VHH-Fc
Fusionsproteins in den Kulturüberstand geeignet war, als der Zusatz von PEG mit einem Molekulargewicht von 1500 Da. Für die Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen wurde auf Grund der oben beschriebenen Ergebnisse in allen weiteren Experimenten der Zusatz von PEG8000 zum Kulturmedium verwendet. Eine genauere Quantifizierung der sekretierten Proteinmenge aus APO-E und EBY100 Expressionskulturen und dementsprechend der Einfluss der PDI-Überexpression auf die lösliche Proteinausbeute im Kulturüberstand ist im folgenden dargestellt.
Beispiel 4: Quantifizierung von VHH-Fc Proteinen in Kulturüberständen
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen die experimentelle Analyse der Sekretionsleistung der Hefestämme APO-E und EBY100. Wie bereits erwähnt, wurde vermutet, dass die
Überexpression der Oxidoreduktase PDI einen positiven Einfluss auf die lösliche Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen hat. Zu diesem Zweck wurden elektrokompetente EBY100 und APO-E Zellen mit dem Plasmid pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc transformiert und auf
Selektivagarplatten selektiert. Es wurden 50 ml Expressionskulturen in Galaktose-haltigem Medium +PEG8000 hergestellt. Die initiale Zelldichte betrug 1 107 Zellen/ml. Über einen Zeitraum von 120 Stunden wurden die Proteinkonzentrationen im Kulturüberstand bestimmt. Die Analyse des Überstandes erfolgte mittels Biolayer-Interferometrie unter Verwendung von Protein A-Biosensoren wie beschrieben. Die über diesen Zeitraum ermittelten
Konzentrationen sind in Abb. 10 graphisch dargestellt. Als Negativkontrolle wurde Galaktose- haltiges SD-Medium +PEG8000 mit 2% BSA versetzt, als Positivkontrolle wurde ein VHH-Fc Fusionsprotein bekannter Konzentration einer HEK293-Expression verwendet. Zur
Berechnung der Proteinkonzentrationen wurde im Vorfeld eine Kalibrierreihe mit diesem Protein erstellt. Das VHH-Fc Fusionsprotein konnte in beiden Kulturen über einen Zeitraum von 120 Stunden detektiert werden (Abb. 10). Tendenziell war zu beobachten, dass im Überstand der APO-E Expressionskultur über die Zeit eine höhere Proteinkonzentration gemessen wurde, als im Überstand der EBY100 Kultur. Die größte Proteinkonzentration wurde nach 96 Stunden in der APO-E Kultur (1 ,9 ± 0,2 mg/L) gemessen. Bis zu diesem Zeitpunkt stieg die Proteinkonzentration kontinuierlich an und fiel danach auf 0,7 ± 0, 1 mg/L (120 Std.) ab. In der EBY100-Expressionskultur wurden im Vergleich zur APO-E
Expressionskultur, über die Zeit deutlich niedrigere Messwerte erzielt. Hier konnte die höchste Proteinkonzentration zwar bereits nach 72 Stunden, aber mit einem deutlich niedrigeren Wert (1 ,2 + 0,2 mg/L) im Vegleich zu APO-E bestimmt werden. Diese lag dennoch unter der Proteinkonzentration der APO-E Kultur bei 72 Stunden (vgl. 1 ,8 ± 0,2 mg/L). Bereits nach 72 Stunden begann die Proteinkonzentration wieder abzusinken. Nach 120 Stunden wurde eine Konzentration von 0,5 ± 0,1 mg/L gemessen. Ein Vergleich der Proteinkonzentration der EBY100 mit der der APO-E Expressionskultur nach 96 Stunden macht deutlich, dass die VHH-Fc Protein-konzentration im Überstand der APO-E
Expressionskultur nahezu doppelt so hoch war als die VHH-Fc Konzentration im Überstand der EBY100 Expressionskultur. Des Weiteren war zu beobachten, dass die
Proteinkonzentration im EBY100-Überstand nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden den Maximalwert erreicht hatte. Als Kontrolle für die Quantifizierung der VHH-Fc
Proteinkonzentrationen in Überständen von Hefekulturen wurde ein weiteres Experiment durchgeführt. Es sollte verifiziert werden, ob es sich bei den mittels Biolayer-Interferometrie (Octet RED) detektierten Signalen aus Abb. 10 um VHH-Fc-spezifische Signale handelte, da während der Analyse der Rohwerte beobachtet wurde, dass sich PEG8000 störend auf die Messung auswirkte. In Abb. 1 1 sind beispielhaft zwei Messprofile zur Quantifizierung von IgG-Molekülen in Gegenwart von PEG8000 und ohne PEG8000 gezeigt. Auffällig waren die in Gegenwart von PEG8000 niedrigeren erreichten Schichtdicken der Beladung der Protein A-Biosensoren (Abb. 11 A) im Gegensatz zur Verwendung von IgG-Molekülen, die zur Beladung in PBS vorlagen (Abb. 1 1 B). Zusätzlich war in Gegenwart von PEG8000 ein deutliches Rauschen der Messwerte und ein verzögerter Anstieg der Signale zu beobachten. Abb. 11 verdeutlicht den Einfluss von PEG8000 auf die Biolayer-Interferometrie Messung. Durch den Zusatz von PEG8000 war die Viskosität des Mediums stark erhöht. Es waren deutliche Interferenzen während der Beladung der Biosensoren mit dem IgG-Molekül zu beobachten, was sich durch den verzögerten und ungleichmäßigen Anstieg der
Sensorsignale in Abb. 1 1 A gegenüber Abb. 1 B zeigt. Zum Zweck der Überprüfung der Biolayer-Interferometrie Messwerte wurden drei unabhängige Expressionskulturen mit einem Volumen von 20 ml hergestellt und die Proteinkonzentrationen in den Kulturüberständen mittels Biolayer-Interferometrie bestimmt (). Zur Überprüfung der Spezifität der Signale wurde basierend auf diesen Werten ein Kulturvolumen errechnet, welches einer definierten VHH-Fc Proteinkonzentration entsprach. Dieses Kulturvolumen wurde anschließend, nach TCA- Präzipitation der Proteine im Überstand im Western-Blot über den spezifischen Nachweis mit einem Fc-spezifischen Antikörper untersucht. Für die Biolayer-Interferometrie Messung erfolgte die Kultivierung erneut für 120 Stunden. Die Zelldichte zu Beginn des Experimentes betrug 5 * 106 Zellen/ml. Diesmal wurden die beiden PDI-überexprimierenden S. cerevisiae Stämme APO-E und APO-B zur löslichen Sekretion der VHH-Fc Proteinen verwendet und die Proteinkonzentrationen in den Kulturüberständen zu gegebenen Zeitpunkten mittels Biolayer- Interferometrie bestimmt. Durch den Vergleich mit einer zuvor erstellten Kalibrierreihe wurden die Proteinkonzentrationen aus den Rohwerten errechnet. Die Messungen wurden nach 48, 72, 96 und 120 Stunden durchgeführt. Die ermittelten Konzentrationen sind graphisch in dargestellt, zeigt, dass das VHH-Fc Fusionsprotein ab einer Expressionsdauer von 48 Stunden in allen Expressionskulturen über die Interaktion mit Protein A-Biosensoren detektiert und die Proteinkonzentration jeder Kultur bestimmt werden konnte. Zur
Verifizierung der Messungen wurde das Kulturvolumen jeder Kultur nach 120 Stunden berechnet, welches eine theoretische Proteinmenge von 2 g enthielt. Diese Proben wurden anschließend mittels Western-Blot analysiert. Sollte das Signal der Octet-Messung durch Messfehler zustande gekommen sein, die zum Beispiel durch die Verwendung von hochviskosem PEG8000-haltigem Medium auftreten könnten, sollte sich dieser Umstand in der Western-Blot Analyse widerspiegeln. Durch Zentrifugation wurde die berechnete Menge Kulturüberstand von den Hefezellen abgetrennt, die Proteine mittels TCA präzipitiert und anschließend für die Analyse mittels LDS-PAGE und Western-Blot vorbereitet. Die
Markierung der VHH-Fc Proteine auf der PVDF-Membran erfolgte durch die Interaktion mit einem Fc-spezifischen Primärantikörper aus dem Kaninchen und einem Kaninchenspezifischen Sekundärantikörper (POD-konjugiert) aus der Ziege. Die Ergebnisse der LDS- PAGE und der Western-Blot Analyse sind in 13 dargestellt. Aus 13 geht hervor, dass das VHH-Fc Fusionsprotein erfolgreich in allen Proben mittels LDS-PAGE und Western-Blot Analyse nachgewiesen wurde. Im Falle der Western-Blot-Analyse erfolgte der Nachweis durch einen Fc-spezifischen Nachweisantikörper. Da die Signalstärken der Banden auf der Membran optisch abgeschätzt nahezu einheitlich waren, wurde davon ausgegangen, dass von jeder Expressionskultur eine annähernd identische Menge an Protein für die LDS-PAGE und die Western-Blot Analyse verwendet wurde. Da die für LDS-PAGE und Western-Blot Analyse eingesetzte Proteinmenge aus der zuvor durchgeführten Biolayer-Interferometrie Messung berechnet wurde, ließen sich damit die Signale der Biolayer-Interferometrie
Messung bestätigen. Es wurde davon ausgegangen, dass die mittels Biolayer-Interferometrie erzielten Messwerte durch die spezifische Interaktion des VHH-Fc Fusionsproteins mit Protein A der Biosensor-Oberfläche zustande kamen und dass PEG8000 keinen störenden Einfluss auf die Messergebnisse hatte.
Beispiel 5: Lösliche VHH-Fc Sekretion und Affinitätschromatoqraphie
In einem weiteren Experiment wurde das VHH-Fc Fusionsprotein in einem größeren Maßstab produziert und im Anschluss mittels Protein A-Affinitätschromatographie aus dem
Kulturüberstand gereinigt. Es wurde zusätzlich ein weiterer Vergleich der
Sekretionsleistungen der Stämme APO-E und APO-B durchgeführt. Im Anschluss wurde die Funktionalität des gereinigten Proteins in Bezug auf die Interaktion mit dem spezifischen Antigen (hsEGFR) untersucht, da aus der Literatur bekannt ist, dass Hefe-exprimierte Proteine oft hyperglykosyliert sind141. Hierzu wurden elektrokompetente APO-E und APO-B Zellen mit dem Plasmid zur löslichen Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins (pYD-pGal- app8-VHH1-Fc) transformiert und auf Selektivagarplatten selektiert. Ausgehend von einer Vorkultur wurde eine Expressionskultur mit einem Volumen von 200 ml inokuliert. Die
Sekretion der VHH-Fc Fusionsproteinen erfolgte in Gegenwart von 1 1 % (w/v) PEG8000 für 96 Stunden, da bereits gezeigt wurde, dass diese Kultivierungsdauer günstig für die
Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteine war. Nach Abschluss der Expression verblieben ca. 185 ml Kulturvolumen. Durch Zentrifugation wurden die Hefezellen vom Kulturüberstand getrennt. Der Überstand wurde anschließend mit Protease-lnhibitor (PIC III) (1 :1000) versetzt, um die Degradation des Proteins durch Proteasen im Kulturmedium zu verringern und in Snakeskin™-Dialyseschläuche (MW 10 kD) (Thermo Scientific GmbH) überführt. Die Dialyse des Kulturüberstandes wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Nach Abschluss der Dialyse wurde der Inhalt der einzelnen Dialyseschläuche vereinigt und zur
affinitätschromatographischen Reinigung des VHH-Fc Fusionsproteins mittels Protein A HiTrap 1 ml Säule (GE Healthcare Europe GmbH) verwendet . Das Volumen nach Abschluss der Dialyse betrug ca. 400 ml. Aufgrund der starken Volumenzunahme wurde eine
Verringerung der Viskosität des Kulturüberstandes beobachtet. Da immer noch eine gewisse Restviskosität vorlag, konnte jedoch davon ausgegangen werden, dass das PEG8000 nicht vollständig aus dem Überstand entfernt worden war. Die Verringerung der Viskosität war demnach eher auf die Verdünnung des Kulturüberstandes als auf den Austausch des
PEG8000-haltigen Mediums gegen PBS zurückzuführen. Nach Abschluss der Reinigung und Sichtung des Chromatogramms (Abb. 14 A) wurden die jeweils relevanten Elutionsfraktionen vereinigt. Der Pufferaustausch gegen PBS erfolgte mit Hilfe von PD-10 Säulen. Im Anschluss wurden je 20 μΙ mittels LDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse sind in (Abb. 14 B und C) dargestellt. Die in Abb. 14 dargestellten Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Reinigung des VHH-Fc Fusionsproteins mittels Protein A-Affinitätschromatographie aus den Überständen von APO-E und APO-B Expressionskulturen. Die Analyse des gereinigten Proteins mittels LDS-PAGE ergab einen ausreichenden Reinheitsgrad (Abb. 14 B und C). Im
Chromatogramm (Abb. 14 A) war bei beiden Proben ein Anstieg der Absorption während des Probenauftrags erkennbar. Für APO-E wurde eine maximale Absorption bei von 1 13, 1 mAu und bei APO-B von 42,2 mAu detektiert. Die Absorption stieg im Falle des APO-E
Überstandes auf einen fast doppelt so hohen Wert an, als beim APO-B Überstand erreicht wurde. Während des Probenauftrags wurde weder bei der APO-E (Abb. 15 Spur 4) noch der APO-B Probe (Daten nicht gezeigt) im Durchbruch mittels Western-Blot Analyse VHH-Fc Protein nachgewiesen. Somit konnte von einer vollständigen Bindung des VHH-Fc Proteins an die Säule ausgegangen werden. Während der Elution des Proteins von der Säule wurde bei beiden Proben ein deutlich abgegrenzter Peak detektiert, der sich über 7 ml (APO-E) bzw. 17 ml (APO-B) erstreckte. Die Analyse der Fraktionen des Pufferaustausches erfolgte mittels LDS-PAGE. Durch den optischen Vergleich der Signalstärken von APO-E und APO-B (vgl. Abb. 12 B und C) konnte eine signifikant größere Proteinmenge in den Fraktionen von APO-E gegenüber APO-B festgestellt werden. Mittels Nanodrop wurde die Proteinkonzentration bei einer Wellenlänge von 280 nm unter Einbeziehung des Molekulargewichts und des
Extinktionskoeffizienten in den vereinigten Fraktionen bestimmt. Final wurden 0,34 mg des VHH-Fc Fusionsporteins aus einer 200 ml APO-E Expressionskultur und 0,1 mg aus einer 200 ml APO-B Expressionskultur mittels Protein A-Affinitätschromatographie isoliert. Die Analyse der Funktionalität des APO-E exprimierten Proteins ist im folgenden dargestellt.
Beispiel 6: Funktionalitätsanalyse von Hefe-produzierten VHH-Fc Fusionsproteinen Im Anschluss an die Reinigung des VHH-Fc Fusionsproteins aus dem Überstand der APO-E Kultur wurde die Funktionalität des Proteins überprüft. Da aus der Literatur bekannt ist, dass S. cerevisiae bestimmte Peptidsequenzen hyperglykosyliert141 und das Einfluss auf Stabilität, Sekretion und biochemische Eigenschaften des Proteins haben kann, wurden die
Bindungseigenschaften des VHH-Fc Proteins an das Antigen hsEGFR experimentell untersucht. Zu diesem Zweck wurden kinetische Messungen der hsEGFR-Interaktion mittels Biolayer-Interferometrie unter Verwendung von Protein A-Biosensoren durchgeführt. Im Vorfeld des Versuchs war bekannt, dass die VHH-Domäne eine hohe Spezifität und Affinität für das Antigen hsEGFR aufwies. Zu diesem Zweck wurde das gereinigte VHH-Fc
Fusionsprotein auf der Oberfläche von Protein A-Biosensoren immobilisiert (Abb. 16 A, Schritt 1 ). Dafür wurde das zuvor mittels Protein A-Affinitätschromatographie gereinigte Protein verwendet. In einem weiteren Ansatz wurde der Kulturüberstand einer VHH-Fc Expressionskultur zur Beladung der Protein A-Biosensoren verwendet. Im Anschluss an einen Waschschritt (Abb. 16 A, Schritt 2) erfolgte die Messung der Basislinie in PBS (Abb. 16 A, Schritt 3). Bei der Verwendung des Kulturüberstandes wurden zwei Waschschritte durchgeführt (Abb. 16 B, Schritt 2 und 3), da dieser PEG8000 enthielt. Anschließend erfolgte die Assoziation mit löslichem Antigen hsEGFR in PBS (250 nM, 125 nM, 62,5 nM und 15,6 nM) (Abb. 16 A, Schritt 4; Abb. 16 B Schritt 5). Die Dissoziation von VHH-Fc Fusionsprotein und hsEGFR erfolgte in PBS (Abb. 6 A, Schritt 5; Abb. 16 B Schritt 6). Als Kontrolle wurde die Bindung der hsEGFR-spezifischen VHH-Domäne an mmEGFR und hs-cMet analysiert, für welches die VHH-Domäne keine Spezifität aufwies. In diesem Fall wurde keine biomolekulare Interaktion mit den Antigenen mmEGFR und hs-cMet erwartet. Die Ergebnisse der Messungen sind in Abb. 16 dargestellt. Eine erfolgreiche Beladung der Protein A- Biosensoren war sowohl mit dem gereinigten Protein als auch mit dem Protein-haltigen Kulturüberstand möglich. Die Beladung war durch einen kontinuierlichen Signalanstieg in den ersten 600 Sekunden zu erkennen (Abb. 16 A und B, Schritt 1). Da das gereinigte Protein in einer sehr viel höheren Konzentration zur Beladung der Biosensoren eingesetzt werden konnte als das im Kulturüberstand vorhandene Protein, stiegen die Sensorsignale in diesem Fall mit einer deutlich größeren Steigung an und die Sensoren konnten stärker beladen werden. Es wurde eine Schichtdicke von 3,1 bis 3,5 nm erreicht. Die Beladung der Sensoren mit Kulturüberstand erreichte eine geringere Schichtdicke von durchschnittlich 0,2 nm (Abb. 6 B). Der horizontale Verlauf der Sensorsignale während der nachfolgenden Waschschritte deutet auf eine stabile Beladung hin (Abb. 16 A Schritt 2 bis 3 B Schritt 2 bis 4). In Abb. 16 B ist ein deutlicher Sprung der Signale zwischen Beladung und erstem Waschschritt zu erkennen. Dieser Befund ist auf den Pufferwechsel zurückzuführen, der durch das
Eintauchen der Sensoren von Kulturmedium (+PEG8000) in PBS hervorgerufen wurde. Dieser Sprung war in Abb. 16 A nicht zu sehen, da das Protein zur Beladung bereits in PBS gelöst vorlag. Die Assoziation von löslichem hsEGFR an die mit VHH-Fc beladenen
Sensoren ist in Schritt 4 (Abb. 16 A) und Schritt 5 (Abb. 6 B) gezeigt. Während der
Assoziation kam es in beiden Fällen zu einem deutlichen Anstieg der Sensorsignale. Dieser Anstieg repräsentierte die spezifische Bindung von hsEGFR an die mit VHH-Fc beladene Sensoroberfläche. Zur Analyse der kinetischen Konstanten der Interaktion zwischen VHH-Fc und hsEGFR wurde ein statistisches Fitting der experimentellen Daten durchgeführt (Abb. 17). Die kinetischen Konstanten sind in Tab. 4.1 angegeben.
Tab. 4.1 : Kinetische Konstanten der Bindung zwischen VHH-Fc und hsEGFR. ka (1/ s) ka error kd (1/s) kd error KD (M)
PBS 1 ,06 x 10b 8,13 * 102 9,47 10"4 4,56 x 10'6 8,91 10"9
Überstand 1 ,55 x 105 1 ,12 103 1 ,86 x 10"3 8,03 10-6 1 ,20 x 10"8
Abb. 7 zeigte in beiden Fällen eine spezifische, konzentrationsabhängige Interaktion zwischen immobilisiertem VHH-Fc an der Sensoroberfläche und hsEGFR. Es kam nicht zu einer Interaktion zwischen VHH-Fc und den Kontrollproteinen mmEGFR und cMet. Die Analyse der Bindung von VHH-Fc und hsEGFR mittels Biolayer-Interferometrie zeigte deutlich die Affinität der VHH-Domäne für das Antigen. Die Assoziation zwischen VHH- Domäne und hsEGFR ist in Abb. 17 durch den charakteristischen Anstieg der bunten Kurven gekennzeichnet. Die Dissoziation von hsEGFR erfolgte im Anschluss in PBS und war durch den kontinuierlichen langsamen Abfall der bunten Kurven gezeigt. Durch die Analyse von Assoziation und Dissoziation wurde die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) der
Protein-Protein-Interaktion berechnet. Unter Verwendung von gereinigtem Protein wurde ein Ko-Wert von 0,9 χ 10"8 M gemessen (Abb. 17 A). Die Verwendung von Kulturüberstand ergab ein KD-Wert von 1 ,2 * 10"8 (Abb. 17 B). In einer zuvor durchgeführten Messung des VHH-Fc Proteins aus dem Mediumüberstand einer HEK293-Expressionskultur wurde ein KoWert von 8,4 χ 10"8 M ermittelt. Bei dem HEK293-exprimierten Protein handelte es sich um eine N-terminale Fc-Fusion der hsEGFR-spezifischen VHH-Domäne.
Beispiel 7: Glykosylierung des VHH-Fc Proteins
Die Analyse der Glykosylierung des Hefe-sekretierten Proteins erfolgte mittels LDS-PAGE und vorheriger Inkubation des Proteins mit dem Enzym Endoglykosidase H (EndoH). EndoH spaltet spezifisch Mannose-reiche Oligosaccharide der N-Glykosylierung von Proteinen. Aus der Literatur ist bekannt, dass die heterologe Expression in Hefezellen zur N-Glykosylierung mit einer hohen Anzahl an terminalen Mannoseresten führt141. Diese sogenannte
Hypermannosylierung kann einen Einfluss auf Sekretion, Löslichkeit und Faltung des Proteins haben142. Es wurden 2 des aus der Hefe sekretierten Proteins mit EndoH inkubiert und das Molekulargewicht und das Laufverhalten des Proteins im Polyacrylamidgel mittels LDS- PAGE analysiert. Zur Kontrolle wurden zusätzlich 2 pg der Proteine hsEGFR und Thioredoxin ebenfalls mit EndoH inkubiert und analysiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 18 dargestellt Durch die Inkubation mit EndoH und die anschließende Analyse mittels LDS-PAGE konnte kein Unterschied im Laufverhalten des behandelten VHH-Fc Fusionsproteins festgestellt werden (Abb. 18 Spur 1 und 2). Durch Inkubation von hsEGFR mit EndoH wurde eine Verringerung des Molekulargewichts durch ein unterschiedliches Laufverhalten des Proteins im Polyacrylamidgel festgestellt (Spur 3 und 4). Thioredoxin zeigte aufgrund der fehlenden Glykosylierung keine Veränderung im Molekulargewicht (Spur 5 und 6). Dies deutete darauf hin, dass keine detektierbare Hypermannosylierung des sekretierten VHH-Fc Proteins vorlag. In den bis hier dargestellten Ergebnissen wurde die lösliche Sekretion von VHH-Fc
Fusionsproteinen gezeigt. Es konnte gezeigt werden, dass durch die genetische Manipulation des Stammes EBY100 die chromosomale Überexpression der Oxidoreduktase PDI erreicht wurde. Durch die Integration der PDI-Expressionskassette in das Genom von EBY100 wurde der S. cerevisiae Stamm APO-E generiert. Unter Verwendung dieses Expressionsstammes konnte eine für biochemische Analysen ausreichende Menge des VHH-Fc Fusionsproteins produziert werden. Des Weiteren wurde festgestellt, dass das APO-E-produzierte VHH-Fc Fusionsprotein die erwartete Spezifität und Affinität für das Antigen hsEGFR zeigte. Durch den Vergleich der Gleichgewichtsdissoziationskonstanten des Hefe-produzierten Proteins und des HEK293-produzierten Proteins wurden vergleichbare Werte ermittelt, was auf eine reproduzierbare Funktionaliät des Hefe-produzierten Proteins hindeutete. Da der Aspekt der löslichen VHH-Fc Produktion jedoch nur einen Teil des hier vorgestellten schaltbaren nicht- kovalenten Verfahrens zur Oberflächenpräsentation darstellt, sind in den nachfolgenden Beispielen die Ergebnisse zur Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne und von VHH- Fe Fusionsproteinen und IgG-Molekülen gezeigt.
Beispiel 8: Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne
Die Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen wurde durch die Co-Expression einer Fc-Bindedomäne vermittelt. Diese wurde zur Oberflächenpräsentation auf Hefezellen als Fusionsprotein mit dem Hefe-eigenen Zellwandprotein Aga2p exprimiert und diente so als direkter Vermittler der Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen. Zu diesem Zweck wurde die Fc-Bindedomäne in den zu Beginn der experimentellen Arbeiten
kommerziell erhältlichen Vektor zur Oberflächenpräsentation von Proteinen auf Hefezellen pYD1 (Invitrogen) kloniert. Es wurden zwei verschiedene Varianten der Fc-Bindedomäne hergestellt und bezüglich ihres Expressionsverhaltens und ihrer Funktionalität miteinander verglichen. In diesem Zusammenhang bezieht sich die Funktionalität auf das
Bindungsvermögen der Domänen für Fc-Teile von humanen IgG-Molekülen. Hierfür wurde die Z-Domäne67 in monovalenter und in divalenter Form als Aga2p-Fusion exprimiert und auf der Oberfläche von EBY100 Zellen exponiert. Die Z-Domäne leitet sich vom S. aureus Protein A ab, bindet den Fc-Teil diverser IgG Subtypen143 und besteht aus einer a-helikalen Struktur69. Bei der ZZ-Domäne handelt es sich um eine Duplizierung der Sequenz der Z- Domäne. In der Literatur wird der divalenten ZZ-Domäne eine deutlich höhere Affinität für Fc- Teile von humanen IgG- olekülen zugesprochen als der monovalenten Z-Domäne. Diese höhere Affinität wird größtenteils durch eine deutlich niedrigere Koff realisiert144. Zur
Verdeutlichung sind in der nachfolgenden Tabelle (Tab. 4.2) die 1995 von Jendeberg und Mitarbeitern mittels Plasmon Resonanz Detektion (BIAcore™) ermittelten kinetischen
Konstanten der biomolekularen Interaktion von Fe mit Z- und ZZ-Domäne aufgelistet144.
Tab. 4.2: Kinetische Konstanten der Interaktion der Fc-Bindedomänen mit IgG-Fc.
Fc-Bindedomäne kon ( /s KT5) koff (M/s x 103)
Z-Domäne (monovalent) 1 ,9 ± 0,6 3,2 ± 1
ZZ-Domäne (divalent) 3,5 ± 1 ,0 0,51 ± 0,2
Beispiel 9: Klonierungsstrategie der Fc-Bindedomäne
Für die Konstruktion der Plasmide zur Oberflächenpräsentation der zwei Varianten der Fc- Bindedomäne wurde mittels Literaturrecherche die Aminosäuresequenz der Z-Domäne ermittelt67 und die entsprechende DNA-Sequenz in den Vektor pYD1 in den Leserahmen von Aga2p kloniert. Zwischen Aga2p und Fc-Bindedomäne wurde der im pVDi-Vektor enthaltene flexible GS-Linker erhalten. Zur Konstruktion der ZZ-Domäne wurde die Sequenz der Z- Domäne zweimal hintereinander C-terminal in den Leserahmen von Aga2p kloniert. Dazu wurde die Sequenz der ZZ-Domäne synthetisiert (Geneart AG) und in den Vektor pYD1 kloniert (Geneart AG). Die Z-Domäne wurde aus einem intern zu Verfügung gestellten pET13-basierten Plasmid amplifiziert und mittels konventioneller Klonierungstechniken durch Restriktion von DNA und Ligation von DNA-Fragmenten über die Schnittstellen Bam \ und Nhe\ in den Vektor pYD1 kloniert. Beide Vektoren (pYD-Z und pYD-ZZ) wurden ohne die im pYD1 Vektor enthaltenen Affinitätsepitope generiert (Abb. 9), sodass Z- und ZZ-Domäne ohne weitere Modifikationen und nur über einen GS-Linker mit dem Zellwandprotein Aga2p auf der Zelloberfläche verankert wurden.
Beispiel 10: Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne Um zu überprüfen, welche Variante der Fc-Bindedomäne am besten für die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von Fc-Fusionsproteinen geeignet war, wurden EBY100 Zellen einerseits mit dem Plasmid pYD-Z und andererseits mit dem Plasmid pYD-ZZ transformiert. Als Kontrolle wurden EBY100 Zellen mit dem Plasmid pYD1 (Invitrogen) transformiert. Als Membrananker für die Oberflächenpräsentation der Fc-Bindedomäne wurde der Rezeptor a- Agglutinin aus S. cerevisiae verwendet. Dieser Oberflächenrezeptor auf Hefezellen unterteilt sich in zwei Proteine, Aga 1 p und Aga2p, die über Disulfidbrücken verknüpft sind, und gewährleistet so die kovalente Verankerung der Fc-Bindedomäne auf der Zelloberfläche. Hier wurde das von Boder und Wittrup etablierte Verfahren der Oberflächenpräsentation auf Hefezellen verwendet92. Agal p ist zu diesem Zweck chromosomal im Genom von EBY100 kodiert und steht, wie das episomal kodierte Aga2p unter Kontrolle des Galaktose- induzierbaren Gal1 -Promotors. In Gegenwart von Galaktose wird die Expression von AGA1 (Agal p) und AGA2 (Aga2p) initiiert. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die AGA2 Expression als Fusion mit der Z- bzw. ZZ-Domäne (Abb. 20). Die Expression der
Oberflächenpräsentation erfolgte bei 20 °C für 72 Stunden. Nach Bestimmung der Zelldichte wurden 1 χ 107 Zellen entnommen und die Varianten der Fc-Bindedomäne auf der
Zelloberfläche markiert. Die Markierung erfolgte durch Bindung eines FITC-konjugierten Protein A-spezifischen Antikörpers aus der Ziege. Dieser Antikörper wurde auf Grund seiner Spezies-Herkunft nicht über seinen Fc-Teil gebunden145. Stattdessen erfolgte die Bindung über Epitope auf den Fc-Bindedomänen, die von dem Antikörper erkannt wurden. Die so vorbereiteten Zellen wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie im
Durchflusszytometer Guava easyCyte HT 2L analysiert. Der prozentuale Anteil an Zellen, die die Fc-Bindedomäne präsentierten wurde über die Definition einer arkerregion M1 bestimmt. Die Markerregion wurde so gewählt, dass möglichst wenige Zellen der
Negativkontrolle (Abb. 21 , Aga2p) innerhalb dieser Region lokalisiert waren. Bei der
Negativkontrolle handelte es sich um EBY100 Transformanten, die nur das Ankerprotein Aga2p präsentierten. In Abb. 21 sind die Histogramme der Messungen dargestellt. Wie in Abbildung 19 A und B zu erkennen ist, konnten sowohl Z- als auch ZZ-Domäne mit dem Protein A-spezifischen Antikörper über einen Zeitraum von 72 Stunden markiert und durchflusszytometrisch detektiert werden. Durch die Expression als Aga2p-Fusionsproteine wurden sie auf der Zelloberfläche über die Interaktion von Aga p und Aga2p präsentiert. Bereits nach 24 Stunden zeigten beide Varianten ein im Vergleich zur Negativkontrolle (Aga2p) stärkes rel. Fluoreszenzsignal. Zellen, die die divalente ZZ-Domäne präsentierten, zeigten ein fast doppelt so starkes Signal als Zellen mit der monovalenten Z-Domäne (vgl. 370,7 und 636,3). Dieser Befund ist durch das Vorhandensein einer doppelten Anzahl von spezifischen Epitopen durch die Sequenzduplizierung zu erklären. Dieser Zustand zeigte sich auch noch nach 72 Stunden, wobei zu diesem Zeitpunkt die Signalstärken beider Varianten um ca. 30% abnahmen (vgl. 253,0 und 445, 1). Für beide Varianten wurden jeweils zwei verschieden große Zellpopulationen mit unterschiedlichen relativen Signalintensitäten detektiert. Die kleineren Zellpopulationen zeigten eine Signalintensität, die der
Negativkontrolle entsprach (Aga2p). Die Signale der größeren Zellpopulationen wiesen signifikant höhere Intensitäten auf. Dadurch konnten sie deutlich von der Negativkontrolle unterschieden werden. Daraus wurde geschlossen, dass die innerhalb von M1 lokalisierten Zellen die Fc-Bindedomäne auf ihrer Oberfläche präsentierten und so spezifisch markiert werden konnten. Zur Visualisierung der Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne wurden Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen angefertigt. Zu diesem Zweck wurden 1 χ 107 EBY100 Zellen (pYD-ZZ Transformanten) nach einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden in Gaiaktose-haltigem SD-Medium mit einem Protein A-spezifischen Antikörper (FITC-Konjugat) aus der Ziege markiert. Als Kontrolle dienten EBY100 Zellen, die mit dem Plasmid pYD1 (Invitrogen) transformiert wurden und die ebenfalls mit dem Protein A-spezifischen Antikörper (FITC-Konjugat) aus der Ziege inkubiert wurden (Abb. 22 C). In der Fluoreszenzmikroskopischen Analyse zeigten nur Zellen ein positives Fluoreszenzsignal, die die ZZ- Domäne auf ihrer Oberfläche präsentierten. Die fotographische Darstellung der
mikroskopischen Aufnahmen ist in Abbildung 4.20 gezeigt.
Die Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme (Abb. 22 B) zeigt im Vergleich mit der
Negativkontrolle (Abb. 22 C), dass die Oberflächen-präsentierte ZZ-Domäne mit dem FITC- konjugierten Antikörper spezifisch markiert wurde. Im Vergleich mit der Durchlicht-Aufnahme (Abb. 22) wurde festgestellt, dass nicht alle Zellen der Probe markiert werden konnten. Dieser Befund bestätigte erneut die in Abb. 21 gezeigten FACS-Histogramme, die zeigten, dass in jeder Expressionskultur eine separate Zellpopulation detektiert wurde, die die relative
Fluoreszenzintensität der Negativkontrolle aufwies und die somit aus unbekannten Gründen nicht die ZZ-Domäne präsentierte. Zusätzlich zur Markierung mit dem Protein A-spezifischen Nachweisantikörper wurde die Oberflächenpräsentation beider Varianten auf funktioneller Basis experimentell untersucht. Darunter wurde die Bindung eines IgG-Mo/ekü/s verstanden. Mit diesem Experiment wurde die Variante identifiziert, die für die nicht-kovalente
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen am besten geeignet war, da innerhalb des nicht-kovalenten Verfahrens die löslich sekretierten VHH-Fc Fusionsproteine von der auf der Zellwand verankerten Fc-Bindedomäne eingefangen werden sollten. Beide Varianten wurden mit dem Antikörper Cetuximab (1 μΜ) markiert, der über den Fc-Anteil von der Z- bzw. ZZ-Domäne gebunden wurde. Die Fluoreszenzmarkierung wurde anschließend über die Interaktion von Cetuximab mit dem biotinylierten Antigen hsEGFR (1 μΜ) und dem Konjugat SA-PE (Streptavidin-R-Phycoerythrin) durchgeführt . Die Detektion der Fluoreszenz- markierten Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie im Guava easycCyte HT. Die
Ergebnisse hierzu sind in Abb. 23 dargestellt. Grundsätzlich waren sowohl Z- als auch ZZ- Domäne über die Bindung von Cetuximab (Erbitux) detektierbar. Daraus wurde geschlossen, dass sowohl Z- als auch ZZ-Domäne funktionell auf der Oberfläche von EBY100 Zellen präsentiert wurden. Im FACS-Histogramm (Abb. 23) ließen sich erneut zwei Zellpopulationen verschiedener Fluoreszenzintesität unterscheiden. Die kleinere Population (Aga2p-Z: 31 ,4%, Aga2p-ZZ: 39,3%) zeigte ein schwächeres Signal, welches der der Negativkontrolle (Abb. 23, Aga2p) entsprach. Die größere Population (Aga2p-Z: 68,6%, Aga2p-ZZ: 60,7%) zeigte ein deutlich stärkeres Signal. Bei dieser handelte es sich vermutlich um die Zellen, die Aga2p-Z und Aga2p-ZZ auf der Oberfläche präsentierten und die über die Bindung von Cetuximab spezifisch markiert wurden. Durch den Einsatz einer größeren Menge von Cetuximab konnte der prozentuale Anteil an Zellen in M1 nicht erhöht werden (Daten nicht gezeigt). Insofern lag eine vollständige Sättigung der Fc-Bindedomänen mit Cetuximab vor. Wie schon zuvor wurde auch durch die Bindung eines IgG-Moleküls sichtbar, dass die divalente ZZ-Domäne unter gleichen Bedingungen ein deutlich stärkeres relatives Fluoreszenzsignal zeigte als die monovalente Z-Domäne.
Abschließend kann festgehalten werden, dass die Oberflächen-präsentierte divalente ZZ- Domäne signifikant stärker mit dem Protein A-spezifischen Antikörper und mit dem Antikörper Cetuximab markiert wurde als die monovalente Z-Domäne. Dementsprechend wurde die ZZ- Domäne als Fc-Bindedomäne für alle weiteren Experimente gewählt. Die nächsten
Abschnitte befassen sich mit den Ergebnissen der experimentellen Untersuchung zur nicht- kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen und IgG-Molekülen.
Beispiel 1 1 : Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen
In den vorangegangenen Beispielen wurde die erfolgreiche Präsentation der ZZ-Domäne auf EBY100 Zellen gezeigt. Diese zeigte zusätzlich eine hinreichende Funktionalität in Bezug auf die Bindung von humanen IgG-Molekülen. Durch die Verwendung des Stammes APO-E wurde gezeigt, dass VHH-Fc Fusionsproteine in einem ausreichenden Maßstab für die Reinigung und die Charakterisierung des Proteins hergestellt werden konnten. Durch die Verwendung des Mediumzusatzes PEG8000 wurde ebenfalls gezeigt, dass im Vergleich zur Sekretion ohne den Mediumzusatz PEG8000 die Sekretion von VHH-Fc Fusionsproteinen signifikant erhöht wurde. Die nachfolgenden Beispiele stellen die Ergebnisse der
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsprotein, vermittelt durch die ZZ-Domäne auf EBY100 Zellen sowie die experimentellen Analyse der Genotyp-Phänotyp-Kopplung dar. Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Zusammenführung der löslichen Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins und der Präsentation der ZZ-Domäne zum nicht-kovalenten
Verfahren der Oberflächenpräsentation von Antikörpern auf Hefezellen. Für die
Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen wurden elektro ompetente EBY100 Zellen mit den Plasmiden pYD-ZZ (Präsentation der Fc-Bindedomäne) und pYD-pGal1-app8- VHH1-Fc (Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins) transformiert. Die simultane Expression beider Konstrukte wurde über die Kultivierung der Zellen in Galaktose-haltigem Medium induziert. Zur Analyse des Einflusses von PEG8000 auf die Oberflächenpräsentation des VHH-Fc-Proteins wurden verschiedene Expressionskulturen hergestellt, die sich in ihrem PEG8000-Gehalt unterschieden (ohne PEG8000 (-PEG), 1 1 % (w/v) (+PEG)). Die
Kultivierung der Zellen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Im Anschluss wurden die Zellen mittels Fluoreszenzmarkierung und Durchflusszytometrie im Guava easyCyte HT 2L analysiert. Die Markierung der VHH-Domäne auf der Zelle erfolgte über die spezifische Interaktion mit dem biotinylierten Antigen hsEGFR (1 μΜ) und SA-PE (Abb. 24 A und B). Die Markierung der ZZ-Domäne auf der Zelle wurde mit einem Protein A-spezifischen FITC- konjugierten Antikörper aus der Ziege (Abb. 24 C) durchgeführt.
Abb. 24 zeigt, dass das VHH-Fc Fusionsprotein durch die Interaktion mit dem biotinyliertem Antigen hsEGFR auf der Oberfläche von EBY100 Zellen markiert werden konnte. Dieser Befund galt sowohl für Zellen, die in Medium ohne PEG8000 (-PEG) als auch für Zellen, die in Medium mit PEG8000 (+PEG) kultiviert wurden. Ein Unterschied zwischen den Proben beider Kulturen bestand in der Intensität des detektierten mittleren relativen
Fluoreszenzsignals für die markierte VHH-Domäne. Am deutlichsten war dieser Unterschied nach 24 Stunden zu erkennen (Abb. 24, A: -PEG: 26,9; +PEG: 231 ,6). Zu diesem Zeitpunkt konnten innerhalb der +PEG Zellen mehr als dreimal so viele Zellen markiert werden als innerhalb der analysierten -PEG Zellen (Abb. 24 A). Nach weiteren 48 Stunden glichen sich sowohl die Fluoreszenzintensitäten als auch der prozentuale Anteil an VHH-Fc
präsentierenden Zellen bei +PEG und -PEG Zellen an. Nach 72 Stunden präsentierten 60,8% der -PEG Zellen und 66,8% der +PEG Zellen das VHH-Fc Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche (Abb. 24 B). Zur genaueren Untersuchung des Befunds, dass nach 24 Stunden lediglich 20,3% der -PEG Zellen das VHH-Fc Protein präsentierten, wurden die Zellen aus Abb. 24 A zusätzlich zur Markierung mit hsEGFR noch mit dem Protein A-spezifischen
Antikörper-FITC Konjugat aus der Ziege markiert. Es wurde vermutet, dass die im Vergleich zu den +PEG Zellen suboptimale Oberflächenpräsentation des VHH-Fc Fusionsproteins auf eine ebenfalls suboptimale Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne zurückzuführen sei. Diese Annahme wurde durch die Markierung mit einem Protein A-spezifischen Antikörper widerlegt. Nach 24 Stunden war die ZZ-Domäne sowohl auf der Oberfläche von +PEG Zellen als auch von -PEG Zellen ausreichend präsentiert (Abb. 24 C). Das geringere VHH-Fc Signal in Abb. 24 A war demnach nicht auf eine ungenügende Oberflächenpräsentation der ZZ- Domäne zum Einfangen der VHH-Fc Fusionsproteine zurückzuführen. Dieses Experiment zeigte die Möglichkeit der erfolgreichen nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH- Fc Fusionsproteinen durch die Interaktion mit der ZZ-Domäne und verdeutlichte den positiven Effekt von PEG8000 im Kulturmedium auf die Präsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen. Aus diesem Grund wurde für alle folgenden Experimente ausschließlich PEG8000-haltiges Medium für die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen verwendet. Zur Visualisierung der Oberflächenpräsentation des VHH-Fc Fusionsproteins wurden Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen der +PEG Zellen angefertigt. Zu diesem Zweck wurden EBY100 Zellen mit den Plasmiden pYD-ZZ (Oberflächenpräsentation der ZZ- Domäne) und pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc (lösliche Sekretion des VHH-Fc Proteins) transformiert. Die Genexpression erfolgte unter den üblichen Bedingungen für 48 Stunden. Im Anschluss wurden 1 * 107 Zellen mit 1 μΜ b-hsEGFR, SA-PE und einem Fc-spezifischen F(ab')2 Fragment (AlexaFluor™ 647-Konjugat) sequentiell markiert. Als Kontrolle erfolgte die Markierung der Zellen mit biotinylierten rFcRn (Rattus norvegicus) (b-rFcRn) , für welches die VHH-Domäne keine Spezifität zeigte. Die Markierung der Oberflächen-präsentierten VHH-Fc Fusionsproteine auf der Hefezelle vermittelt durch die Aga2p-fusionierte ZZ-Domäne ist durch die Interaktion mit b-hsEGFR und SA-PE sichtbar. Diese Zellen erschienen in der
fotographischen Aufnahme der Fluoreszenz-mikroskopischen Untersuchung gelblich (Abb. 25, Spalte PE). Zusätzlich wurde die Oberflächenpräsentation über die Bindung eines Fc- spezifischen F(ab')2 AlexaFluor™ 647-Konjugats delektiert. Diese Zellen erschienen in der fotographischen Aufnahme der Fluoreszenz-mikroskopischen Untersuchung rötlich und repräsentieren die Markierung des Fc-Teils des Fusionsproteins (Abb. 25, Spalte: Alexa 647). Die Überlagerung beider Fluoreszenzsignale zeigte das Vorhandensein des VHH-Fc
Fusionsproteins und dessen Funktionalität vermittelt durch die spezifische Bindung des Antigens. Diese Zellen sind in der Fluoreszenz-mikroskopischen Aufnahme orange
dargestellt . (Abb. 25, Spalte: PE + Alexa 647). Eine Zusammenfassung der fotographischen Darstellung ist in der folgenden Abb. 25 gezeigt. Aus den in Abb. 25 dargestellten
Ergebnissen wird deutlich, dass die VHH-Fc Fusionsproteine, vermittelt durch die ZZ- Domäne, auf der Oberfläche von EBY100 Zellen erfolgreich präsentiert wurden. Die Spezifität der VHH-Domänen konnte durch die Bindung an b-hsEGFR nachgewiesen werden. Es wurde kein Fluoreszenzsignal der Zellen für die Bindung an b-rFcRn detektiert. Das unterstützt die in Abb. 24 gezeigten Ergebnisse der FACS-Analysen und zeigt, dass die präsentierten VHH- Domänen als Fc-Fusion auf der Oberfläche von Hefezellen ihre Funktionalität beibehielten. Um die Vielseitigkeit des Verfahrens der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen zu demonstrieren, wurde in einem weiteren Experiment die Oberflächen- Präsentation von vollständigen IgG-Molekülen untersucht. Die Präsentation von IgG- Molekülen erfordert die funktionelle Assemblierung von vier Proteinketten und die korrekte Ausbildung von Disulfidbrücken innerhalb der einzelnen Proteinketten und untereinander.
Beispiel 12: Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen Bis zu diesem Punkt konnten VHH-Fc Fusionsproteine erfolgreich über die Interaktion mit der ZZ-Domäne auf der Oberfläche von EBY100 Zellen präsentiert werden. Daraus ergab sich die Fragestellung, ob es auch möglich war, komplexere Moleküle wie vollständige IgG- Moleküle über die ZZ-Domäne zu präsentieren. Im Vorfeld wurde vermutet, dass die
Assemblierung von leichter und schwerer IgG-Kette zu einer verschlechterten
Oberflächenpräsentation des Antikörpers im Vergleich zu VHH-Fc Fusionsproteinen führen könnte, da die Oberiiächen-präsentati'on von VHH-Fc Fusionsproteinen lediglich die
Assemblierung von zwei identischen Proteinketten erfordert. Zur Analyse der
Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen wurden elektrokompetente EBY100 Zellen mit den Plasmiden pYD-gGal1-app8-HC, pYD-gGal1-app8-LC und pYD-ZZ-G418 transformiert und auf geeigneten Selektivagarplatten selektiert. Da der S. cerevisiae Stamm EBY100 nur über zwei freie Auxotrophiemarker (Trp/Leu) zur Transformation verfügte, erfolgte die
Selektion des Plasmids pYD-ZZ-G418 über den Resistenzmarker G418. Zu diesem Zweck wurde der Auxotrophiemarker des Plasmids mittels homologer Rekombination mit der Resistenzkassette kanMX4 substituiert. Hierzu wurde die kanMX4-Kassette aus dem Plasmid pFA6a-kanMX4 (Biochemie, TU Darmstadt, AK Prof. Kolmar) mit den
Oligodesoxyribonukleotiden GR-kanMX4-up und GR-kanMX4-rp amplifiziert und in den mittels Bsu36i linearisierten Vektor pVü-ZZ kloniert. Die Sequenzbereiche des Fab- Fragments kodierten für den hsEGFR-spezifischen Antikörper Matuzumab (Merck Serono); die für den Fc-Teil kodierende Sequenz wurde von dem Antikörper Cetuximab übernommen. Im Fc-Teil war die an Position 297 lokalisierte Aminosäure Asparagin zu Glutamin mutiert worden um die von der Hefe bekannte Hypermannosylierung während der N-Glykosylierung zu vermeiden. Des Weiteren wurden schwere und leichte IgG-Kette über das Signalpeptid app8 sekretiert. Die Expressionskultur fasste ein Volumen von 3 ml und wurde in geeignetem Galaktose-haltigem SD-Medium +PEG8000 durchgeführt. Die Expression erfolgte für 48 Stunden in der Vertiefung einer 6-well Platte bei 20 °C. Nach 24 und 48 Stunden wurden die Zelldichte der Kultur bestimmt und 1 χ 107 Zellen entnommen. Die Markierung der Zellen erfolgte mit biotinyliertem Antigen hsEGFR und SA-PE. Die Markierung des Fc-Teils erfolgte mit einem Fc-spezifischen F(ab')2 Fragment (AlexaFluor647™-Konjugat) aus der Ziege. Die so vorbereiteten Zellen wurden im Anschluss im Guava easyCyte HT 2L
durchflusszytometrisch analysiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 26 dargestellt. Als Kontrolle wurde die Markierung ohne das spezifische Antigen durchgeführt. Die Markerregion (M1 ) wurde so definiert, dass für die Messung der Kontrolle kein Signal innerhalb von M1 detektiert wurden (Abb. 26 C). Aus Abb. 26 geht hervor, dass der Antikörper Matuzumab (IgG-Molekül) erfolgreich auf der Oberfläche von EBY100 Zellen, vermittelt durch die ZZ-Domäne, präsentiert werden konnte, da die Spezifität des Antikörpers über die Bindung an das Antigen (hsEGFR) nachgewiesen werden konnte. Sowohl nach 24 Stunden (Abb. 26 A) als auch nach 48 Stunden (Abb. 26 B) wurde ein im Vergleich zur Negativkontrolle (Abb. 26 C) deutlich stärkeres relatives Fluoreszenzsignal (M1) detektiert. Nach 48 Stunden hatte sich der prozentuale Anteil an IgG-präsentierenden Zellen im Vergleich zur 24 Stunden Messung um sieben Prozent erhöht. Es wurde angenommen, dass die Bindung von hsEGFR auf der Zelle nur bei Vorhandensein von schwerer und leichter IgG-Kette erfolgte, weshalb von einer vollständigen Oberflächen-präsentation des IgG-Moleküls ausgegangen wurde. In einem weiteren Experiment wurde die Oberflächenpräsentation des Antikörpers Matuzumab in einem anderen Ansatz analysiert. Zu diesem Zweck wurden elektrokompetente Zellen mit den Plasmiden pYD-Aga2p-HC und pYD-pGal1-app8-LC transformiert und auf geeigneten Selektivagarplatten selektiert. In diesem Experiment wurde die schwere IgG-Kette als Aga2p- Fusion exprimiert, während die leichte Kette löslich mithilfe des app8 Signalpeptids sekretiert wurde. Aus einer stationären Vorkultur wurde im Anschluss eine 50 ml Expressionskultur mit Galaktose-haltigem SD-Medium +PEG8000 hergestellt und die Zellen 72 Stunden unter den üblichen Bedingungen kultiviert. Nach 24 und 72 Stunden wurden 1 χ 107 Zellen mit 1 μΜ b- hsEGFR und SA-PE und einem Fc-spezifischen F(ab')2 Fragment AlexaFluor™ 647 markiert und durchflusszytometrisch im Durchflusszytometer Guava easyCyte HT 2L untersucht. Die Ergebnisse hierzu sind in Abb. 27 gezeigt. Die FACS-Analyse (Abb. 27) der Zellen zeigte, dass zwar der Fc-Teil des IgG-Moleküls spezifisch detektiert werden konnte (rel. Fluoreszenz rot), nicht aber die Bindung von biotinyliertem Antigen hsEGFR (rel. Fluoreszenz gelb).
Daraus ließ sich schließen, dass das IgG-Molekül nicht-funktionell auf der Oberfläche präsentiert wurde. Zwar konnte nach 72 Stunden eine ca. 28% größere Zellpopulation im Vergleich zu 24 Stunden mit dem Fc-spezifischen Antikörper detektiert werden, trotz allem konnte aber auch durch eine verlängerte Expressionsdauer keine spezifische Antigen- Bindung nachgewiesen werden. Im Vergleich mit der ZZ-vermittelten Präsentation, war die Oberflächenpräsentation von Matuzumab in diesem Ansatz als kovalente Aga2p-Fusion der schweren Kette nicht erfolgreich.
Beispiel 13: Stabilitätsanalyse der VHH-Fc.ZZ-Interaktion
Zur Analyse der Stabilität der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH-Fc
Fusionsproteinen durch die Interaktion mit der ZZ-Domäne wurde die Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen über einen Zeitraum von 32 Stunden durchflusszytometrisch untersucht. Zu diesem Zweck wurden elektrokompetente EBY100 Zellen mit den Plasmiden pYD-ZZ und pYD-pGal1-app8-VHH1~Fc transformiert und auf Selektivagarplatten selektiert. Die Expression der Oberflächenpräsentation der VHH-Fc Fusionsprotein erfolgte für 48 Stunden. Nach Abschiuss der Expression und Bestimmung der Zelldichte der Kultur wurden 2 * 107 Zellen entnommen und in 200 μΙ PBS resuspendiert und 100 μΙ der Zellsuspension in ein separates Reaktionsgefäß überführt. Beide Proben wurden pelletiert und in 20 μΙ PBS resuspendiert. Eine Probe wurde mit b-hsEGFR (1 μ ) und SA-PE markiert. Die andere Probe wurde nicht markiert. Beide Proben wurden
durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 28 A) und anschließend zu gleichen Teilen gemischt. Die Zellmischung wurde mit PBS auf 1 ml aufgefüllt und bei 4 °C im Dunkeln für 32 Stunden gelagert. Zu definierten Zeitpunkten (Abb. 29) wurden Zellen der Mischung entnommen und durchflusszytometrisch untersucht und die mittlere relative Fluoreszenz bestimmt. Direkt nach dem Mischen der Zellen wurde ebenfalls eine Messung durchgeführt, um die initiale mittlere relative Fluoreszenzintensität der Mischung zu bestimmen (Abb. 28 B). Diese mittlere relative Fluoreszenzintensität wurde hypothetisch als 100%-Wert definiert. Die FACS-Histogramme der Proben vor dem Mischen, 1 : 1 gemischt und nach 32 Stunden, sind in Abb. 28 dargestellt. In Abb. 28 A sind die Fluoreszenzsignale der Fluoreszenz-markierten EBY100 Zellen (rot) und der nicht-markierten (schwarz) EBY100 Zellen gezeigt. Die beiden Proben zeigten deutlich unterschiedliche mittlere relative Fluoreszenzintensitäten (schwarz: 23,9, rot: 260,3). Die markierte Probe (Abb. 28 A, rot) zeigte einen Anteil von 30, 1 % Zellen, die dem relativen Fluoreszenzsignal der nicht-markierten Probe entsprach. Diese Zellen waren nicht innerhalb der Markerregion M1 lokalisiert und präsentierten nicht das VHH-Fc Protein. Durch das Mischen beider Proben wurde der prozentuale Anteil dieser Zellen erhöht (Abb. 28 B). Hier zeigten 56,4% der Zellen eine relative Fluoreszenzintensität entsprechend der nichtmarkierten Probe (Abb. 28 A, schwarz). Nach 32 Stunden Lagerung der Mischung bei 4 °C und unter Lichtausschluß sind die prozentualen Verhältnisse annähernd gleich geblieben, allerdings haben sich die Pea/ -Formen im FACS-Histogramm verändert. Die Peaks sind im Vergleich zur initialen Messung (Abb. 28 B) weniger deutlich voneinander abgegrenzt (Abb. 28 C). In der Abb. 29 sind die gemessenen mittleren relativen Fluoreszenzintensitäten zu den definierten Zeitpunkten gegen die Zeit aufgetragen. Aus Abb. 29 wird deutlich, dass über den analysierten Zeitraum die mittlere rel. Fluoreszenz der Mischung abnimmt. Zum initialen Zeitpunkt der Mischung betrug die mittlere relative Fluoreszenzintensität 152,2. Nach 32 Stunden Lagerung bei 4 °C im Dunkeln wurde ein Wert von 1 1 1,3 ermittelt. Das entsprach einer Abnahme der Signalstärke von 26,9%. Dieser Verlust wurde entweder durch die
Dissoziation des VHH-Fc Fusionsproteins von der ZZ-Domäne, der Dissoziation des biotinylierten Antigens hsEGFR von der VHH-Domäne oder durch das Ausbleichen des Fluorophors verursacht. Da es sich bei der Bindung zwischen Avidin und Biotin um eine der stärksten nicht-kovalenten Bindungen handelt146, konnte dieser Umstand jedoch
ausgeschlossen werden und da die Proben unter Lichtausschluss gelagert wurden, wurde davon ausgegangen, dass ein Ausbleichen des Fluorophors zu vernachlässigen war.
Dementsprechend wurde die Abnahme der Signalstärke hauptsächlich durch die Dissoziation der VHH-Fc Fusionsproteine von der ZZ-Domäne und der Dissoziation des VHH:hsEGFR Komplexes bestimmt. Es kann festgehalten werden, dass die Stabilität der Bindung zwischen der ZZ-Domäne und dem VHH-Fc Fusionsprotein für die Anforderungen an das Verfahren ausreichend war, da sie über einen ausreichenden Zeitraum stabil nachgewiesen werden konnte. Zur weiteren Untersuchung der Stabilität der Genotyp-Phänotyp-Kopplung wurden weitere Mischungsexperimente durchgeführt.
Beispiel 14: Oberflächenpräsentation verschiedener VHH-Fc Fusionsproteine
Zur weiteren experimentellen Untersuchung der Leistungsfähigkeit des Verfahrens zur nicht- kovalenten Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen wurde im folgenden Experiment untersucht, ob drei verschiedene für hsEGFR-spezifische VHH-Domänen auf Hefezellen präsentiert werden konnten und ob die ermittelten Signalstärken für die Antigen- Bindung mit zuvor ermittelten KD-Werten der biomolekularen Interaktion zwischen VHH und hsEGFR korrelierten. Die Bestimmung Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) der einzelnen VHH-Domänen erfolgte mittels Biolayer-Interferometrie. Zu diesem Zweck wurden die verschiedenen VHH-Domänen löslich in Hefe-Expressionskulturen produziert und die jeweiligen Überstände der Expressionskulturen für die Bestimmung der KD verwendet. Für das VHH-Fc Protein A (VHH-A) wurde ein KD-Wert von 11 nM, für VHH-Fc Protein B (VHH- B) ein KD-Wert von 23 nM und für das VHH-Fc Protein C (VHH-C) ein KD-Wert von 5 nM gemessen (Abb. 30). Zur Herstellung der verschiedenen Expressionsvektoren wurde die
Sequenz der VHH-Domäne A (pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc) mittels homologer Rekombination jeweils mit den Sequenzen der VHH-Domänen VHH-B und VHH-C substituiert. Dazu wurden die Domänen unter Verwendung von spezifischen Oligodesxy-ribonukleotiden
(pYD VHHB up/rp und pYD VHHC up/rp) aus intern zu Verfügung gestellten pTT5-basierten Expressionsplasmiden amplifiziert und in das mittels EcoRI und Sacll linearisiertes Plasmid pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc Moniert. Die Klonierung erfolgte wie oben erläutert. Anschließend wurden elektrokompetente EBY100 Zellen mit den Plasmiden zur löslichen Sekretion der verschiedenen VHH-Fc Fusionsproteine (pYD-pGal1-app8-VHH1-Fc, pYD-pGal1-app8- VHHB-Fc und pYD-pGal1-app8-VHHC-Fc) und dem Plasmid für die ZZ-Domäne transformiert und drei separate Expressionskulturen hergestellt. Die Expression wurde für 48 Stunden unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Im Anschluss wurden 1 χ 107 Zellen jeder Kultur entnommen und mit verschiedenen Konzentrationen von b-hsEGFR markiert. Hierzu wurde b-hsEGFR in den Konzentrationen 200 nM, 150 nM, 100 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM und 0,1 nM zur Markierung der Zellen verwendet. Zusätzlich wurden die Zellen mit SA-PE und einem Fc-spezifischen F(ab')2 Fragment (AlexaFluor™ 647-Konjugat) markiert. Als
Negativkontrollen wurden die Proben ohne b-hsEGFR markiert. Die Proben wurden anschließend im Durchflusszytometer Guava easyCyte HT 2L analysiert. In Abb. 30 sind exemplarisch die Ergebnisse der Messungen der Oberflächen-präsentation der
verschiedenen VHH-Fc Fusionsproteine gezeigt, die mit 100 nM b-hsEGFR und SA-PE markiert wurden. Zur Normalisierung der Oberflächenpräsentation wurde die Markerregion M1 definiert und die mittlere relative Fluoreszenzintensität dieser Populationen gegen die verwendeten hsEGFR Konzentrationen aufgetragen. In Abb. 31 sind diese Ergebnisse dargestellt. In Abb. 30 sind zusätzlich die zuvor durchgeführten Biolayer-Interferometrie Messungen zur Bestimmung der KD-Wert gezeigt. Tab. 4.3 zeigt die ermittelten kinetischen Konstanten der VHH:hsEGFR-lnteraktion.
Tab. 4.3: Kinetische Konstanten der Bindung der VHH-Fc Fusionsproteine (A, B, C) an hsEGFR. ka (1/ s) ka error kd (1/s) kd error KD (M)
VHH-A 1 ,55 x 10b 1 ,02 x 103 1 ,83 10"3 7,29 x 10"6 1 , 18 10"8
VHH-B 6,51 10" 4,62 x 102 1 ,50 10"3 7,06 x 10-6 2,31 x 10"8
VHH-C 1 ,48 x 105 4,18 102 6,98 x 10"4 2,73 x 10"6 4,74 x 10-9
Die Unterschiede der KD-Werte der verschiedenen VHH-Domänen für das Antigen hsEGFR spiegelten sich auch im Falle der Oberflächenpräsentation der VHH-Domänen als Fc-Fusion, vermittelt durch die ZZ-Domäne, wider (Abb. 31 ). In einem Konzentrationsbereich von 200 bis 20 nM ließen sich bei den Oberflächen-präsentierten Proteinen unterschiedliche mittlere relative Fluoreszenzintensitäten detektieren. VHH-C zeigte, markiert mit der gleichen Menge Antigen, ein stärkeres relatives Fluoreszenzsignal als VHH-A und VHH-B. Dieser Befund ließ sich durch den Vergleich mit den zuvor ermittelten KD-Werten bestätigen. Dieses Experiment verdeutlichte die Leistungsfähigkeit des Systems, denn selbst geringe KD-Unterschiede (5 nM und 1 1 nM) ließen sich in der FACS-Analyse reproduzieren.
Beispiel 15: Phenotyp-Phänotyp-Kopplunq
Zur experimentellen Untersuchung der Stabilität der Genotyp-Phänotyp-Kopplung des
Systems der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation wurden verschiedene Mischungs- experimente durchgeführt147. Zu diesem Zweck wurden Zielzellen in einem hohen
Überschuss an Kontrollzellen verdünnt und diese anschließend in aufeinander folgenden Zyklen magnetischer (MACS) und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) angereichert. Der Mechanismus der Anreicherung basierte auf der Detektion biomolekularer Interaktionen. Durch das Mischen von Ziel- und Kontrollzellen wurde eine Art Modell-Bibliothek generiert, die eine gewisse Diversität durch die hohe Verdünnung einer spezifischen Zellpopulation widerspiegelte. Es wurden zwei verschiedene Mischungsexperimente durchgeführt, die im Folgenden erläutert werden. Zur Herstellung der Mischungen erfolgte die Berechnung der Zellzahlen unter der Annahme, dass die optische Dichte (Λ600) einer Hefekultur von 1 = 1 χ 107 Zellen entsprachen137. Es kann festgehalten werden, dass die Ergebnisse beider
Mischungsexperimente einen starken Beleg dafür lieferten, dass die Interaktion zwischen ZZ- Domäne und VHH-Fc Fusionsprotein stabil genug war, um Zielzellen aus einem großen Überschuss an Kontrollzellen durch die spezifische Bindungseigenschaft der präsentierten VHH-Domäne mittels gängiger HTS-Methoden wie MACS und FACS anzureichern und zu isolieren
Beispiel 16: Wechsel zwischen Oberflächenpräsentation und löslicher Sekretion
Mit Hilfe des Verfahrens zur nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation können selektierte Proteine zur weiteren Charakterisierung löslich hergestellt werden. Dies ist mit dem hier vorgestellten Verfahren im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren ohne zeitaufwändige Zwischenschritte möglich. Bei vergleichbaren Methoden zur Oberflächenpräsentation, wie z.B. unter Verwendung der kovalenten Oberflächenpräsentation auf Hefezellen als Aga2p- Fusion, war es bisher notwendig, die selektierten Klone in einen geeigneten Vektor zur löslichen Produktion des Proteins umzuklonieren. Das hier vorgestellte Verfahren liefert eine entscheidende Neuerung, indem die VHH-Fc Fusionsproteine über die Interaktion mit der ZZ- Domäne in nicht-kovalenter Weise präsentiert werden. Immanent ist dem Verfahren
allerdings die Notwendigkeit der Verwendung von zwei Vektoren: ein Vektor zur Expression und kovalenten Oberflächenverankerung der ZZ-Domäne über Aga2p, ein zweiter zur löslichen Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins. Um die Vereinzelung des Plasmids für die lösliche Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins mittels Plasmidisolierung und erneuter Transformation von Hefezellen zu umgehen, wurde ein weiteres Plasmid für die schaltbare Expression und lösliche Sekretion des VHH-Fc Fusionsproteins in den Kulturüberstand hergestellt. Zu diesem Zweck wurde der induzierbare Gal1 -Promotor in dem Plasmid pYD- pGal~app8-VHH1 -Fe durch den konstitutiv exprimierenden Promotor GAPDH mittels homologer Rekombination in Hefezellen ersetzt. Die DNA-Sequenz des GAPDH-Promotors wurde mit den Oligodesoxyribonukleotiden gapdh-pYD-up und gapdh-pYD-rp und dem Plasmid pGAPZ (Life Technologies Corp.) mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung der oben genannten Oligodesoxyribonukleotide wurde ein PCR-Produkt generiert, das an seinen Enden zum Plasmid pYD-pGal-app8-VHH1-Fc homologe Sequenzbereiche aufwies. Zur Initiierung der homologen Rekombination in Hefezellen wurde das Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Kpn\ linearisiert. Die Überprüfung der Restriktion wurde mittels Agarosegelelektrophorese durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Im Vorfeld wurde die
Erkennungssequenz für Kpn\ im Bereich der DNA-Sequenz des Gal1-Promotors im Plasmid pYD-pGal-app8-VHH1-Fc mittels ortsspezifischer M utagenese eingeführt. Hierfür wurden die Oligodesoxyribonukleotiden pGal-Kpnl-up und pGal-Kpnl-rp verwendet. Mittels
Sequenzierung mit flankierenden Oligodesoxyribonukleotiden (pYD pex up/rp) wurde die Mutagense überprüft und bestätigt. Für die homologe Rekombination in Hefezellen wurden das mittels Kpn\ linearisierte Plasmid und das PCR-Produkt für die Sequenz des GAPDH- Promotors zur Transformation von EBY100 Zellen verwendet . Nach Selektion, E. coli Transformation, Plasmidisolierung und anschließender Sequenzierung wurde der Klon mit der gewünschten Plasmidsequenz identifiziert. Das Plasmid pYD-pGAPDH-app8-VHH1-Fc mit erfolgreicher Promotorsubstitution wurde anschließend mit dem Plasmid pYD-ZZ zur Transformation von elektrokompetenten EBY100 Zellen verwendet. Die schaltbare
Expression wird bei diesen Doppeltransformanten über den Transfer der Zellen von
Galaktose-haltigem SD-Medium in Glukose-haltiges SD-Medium erreicht, wodurch die
Reprimierung des GaM -Promotors erfolgt und die ZZ-Domäne nicht mehr exprimiert wird. Zur Kontrolle wurde das Plasmid pYD-pGal-app8-VHH1-Fc mit dem Plasmid pYD-ZZ ebenfalls zur Transformation von EBY100 Zellen verwendet. Die lösliche VHH-Fc Sekretion ist wie die Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne durch den Gal1-Promotor reguliert, wodurch die lösliche Sekretion der VHH-Fc Fusionsproteine nicht über den Transfer der Zellen in Glukose- haltiges Medium möglich ist. Nach erfolgter Selektion auf geeigneten Selektivagarplatten wurde je ein Klon zur Herstellung einer Glukose-haltigen SD-Kultur +PEG8000 verwendet. Im Anschluss an die Kultivierung wurden Kulturen mit geeignetem Galaktose-haltigem SD- Medium +PEG8000 hergestellt. Das Verhalten beider Promotorpaare (pGaIVpGall und pGaH/pGAPDH) in Bezug auf die Oberflächenpräsentation der ZZ-Domänen und der VHH-Fc Fusionsproteine ist in Abb. 32 gezeigt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Glukose- haltigen Kulturen und die Zellen der Galaktose-haltigen Kulturen mit einem Fc-spezifischen F(ab')2 Fragment (AlexaFluor™ 647-Konjugat) und einem Protein A-spezifischen Antikörper (FITC-Konjugat) markiert und im Durchfiusszytometer Guava easyCyte HT 2L analysiert. Durch die Zwei-Farben-Markierung der Zellen mit dem Fc-spezifischen Antikörper und dem Protein A-spezifischen Antikörper konnte die Oberflächenpräsentation des VHH-Fc
Fusionsproteins und der ZZ-Domäne simultan detektiert werden. Dadurch wurde die
Überprüfung der Funktionsweisen der Promotoren im Durchfiusszytometer ermöglicht. Durch die in Abb. 32 dargestellten FACS-Histogramme wird das einheitliche Verhalten beider Promotorpaare in Bezug auf die Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen deutlich. Durch die Kultivierung in Glukose- haltigem Medium war weder die ZZ-Domäne (grau Abb. 32 A und B), noch das VHH-Fc Fusionsprotein (grau, Abb. 32 C und D) auf der Zelloberfläche präsentiert. Durch die
Kultivierung der Zellen in Galaktose-haltigem Medium konnte unter Verwendung beider Promotorpaare sowohl die ZZ-Domäne (rot, Abb. 32 A und B) als auch das VHH-Fc Protein (rot, Abb. 32 C und D) auf der Zelloberfläche durch Interaktion mit dem Fc-spezifischen Nachweisantikörper markiert und durchflusszytometrisch detektiert werden.
Im nächsten Schritt wurde das Verhalten des Promotorpaares pGAPDH/pGall genauer analysiert. Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Glukose-haltigen Kultur zur Induktion der Oberflächenpräsentation in Galaktose-haltiges Medium +PEG8000 überführt und 48 Stunden bei 20 °C und 250 Upm kultiviert. Der Nachweis der Genexpression von ZZ-Domäne und VHH-Fc Konstrukt erfolgte über die Fluoreszenzmarkierung der Oberfläc en-präsentierten Proteine und die Analyse der Zellen im Durchfiusszytometer. Die ZZ-Domäne wurde über einen Protein A-spezifischen FITC-markierten Antikörper aus der Ziege (rel. Fluoreszenz grün), das VHH-Fc Fusionsprotein über ein Fc-Fragment spezifisches F(ab')2 Fragment (AlexaFluor™ 647-Konjugat) aus der Ziege (rel. Fluoreszenz rot) markiert. Die Ergebnisse dieser Messung ist in Abb. 33 A dargestellt. Anschließend wurde Glukose-haltiges Medium mit Zellen aus der Galaktose-haltigen Kultur inokuliert. Die zur Herstellung dieser Kultur verwendete Zelldichte betrug 0,5 * 107 Zellen/ml. Die Zellen wurden anschließend 48 Stunden bei 30 °C und 250 Upm kultiviert. Es schloss sich ein erneuter Transfer der Zellen an. Zu diesem Zweck wurde frisches Glukose-haltiges Medium +PEG8000 mit einer äußerst geringen Zelldichte der vorausgegangenen Kultur inokuliert. Diese Kultur wurde für 48 Stunden bei 20 °C und 250 Upm zur löslichen Produktion des VHH-Fc Fusionsproteins kultiviert. Anschließend wurde die Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne und des VHH-Fc Fusionsproteins wieder mittels Fluoreszenzmarkierung (s.o.) und Durchfluss-zytometrie analysiert. Das Ergebnis dieser Messung ist in Abb. 33 B gezeigt. Abb. 33 verdeutlicht die erfolgreiche Reprimierung der Oberflächenpräsentation der ZZ-Domäne durch den Transfer der Zeilen in Glukose-haltiges Medium (Abb. 33 B). Dadurch wurde ebenfalls die Oberflächenpräsentation der VHH-Fc Fusionsproteine unterbunden, da diese nicht mehr auf der Zelle eingefangen werden konnten, jedoch weiter sekretiert wurden. Zur Analyse des Verhaltens beider Promotorpaare in Bezug auf die lösliche Sekretion des VHH-Fc
Fusionsproteins in den Kulturüberstand wurden Western-Blot Analysen der Kulturüberstände angefertigt. Nach Bestimmung der Zelldichte der zuvor beschriebenen Glukose- und
Galaktose-haltigen Kulturen wurden Proben der Kulturüberstände eines Volumens, entsprechend 1 * 107 Zellen entnommen und mittels TCA präzipitiert und für die LDS-PAGE und Western-Blot Analyse aufgearbeitet. Je eine Probe wurde nach Kultivierung in
Galaktose-haltigem Medium (Abb. 34 Spur 1 und 2) und je eine Probe nach 48-stündiger Kultivierung (Abb. 34 Spur 3 und 4) in Glukose-haltigem Medium entnommen. Zusätzlich wurden die Glukose-haltigen Kulturen weitere 48 Stunden 96 Std.) kultiviert, da die optimale Expressionsdauer des VHH-Fc Fusionsproteins unter Verwendung des GAPDH- Promotors nicht bekannt war und so experimetell überprüft wurde. Als Positivkontrolle wurde ein HEK293-exprimiertes VHH-Fc Fusionsprotein verwendet (Abb. 34 Spur 7). Die
Ergebnisse der Western-Blot Analyse sind im Folgenden dargestellt. Wie aus Abb. 34 zu erkennen ist, konnte das VHH-Fc Fusionsprotein während der Kultivierung in Galaktose- haltigem Medium bei beiden Promotorpaaren im Kulturüberstand nicht detektiert werden (Spur 1 und 2). Durch den Transfer in Glukose-haltiges Medium war unter Verwendung des Gal1/GAPDH Promotorpaares ein Fc-spezifisches Signal im Western-Blot erkennbar (Spur 4) und demnach das VHH-Fc Protein im Kulturüberstand nachweisbar. Durch die weitere Kultivierung konnte die Stärke des Signals erhöht und die andauernde Genexpression und die nachfolgende Akkumulierung der Proteine im Kulturmedium nachgewiesen werden (Spur 6). Daraus ließ sich schließen, dass die längere Expressionsdauer zu einer erhöhten VHH-Fc Konzentration im Kulturüberstand geführt hat. Bei Verwendung des Gal1/Gal1
Promotorpaares wurde weder nach 48 Stunden noch nach 96 Stunden ein Fc-spezifisches Signal im Kulturüberstand detektiert (Abb. 34 Spur 3 und 5), da die Expression des Gal1- Promotors durch die im Medium vorhandene Glukose reprimiert war und die Genexpression für die VHH-Fc Fusion nicht erfolgte. Aufgrund dieser Ergebnisse ließ sich der Schluss ziehen, dass es durch Verwendung des Gal1/GAPDH Promotorpaares möglich war, die
Lokalisation des VHH-Fc Fusionsproteins durch Änderung der Kultivierungsbedingungen von Oberflächenpräsentation zu löslicher Sekretion in den Kulturüberstand umzuschalten.
Beispiel 16: Herstellung verschiedener VHH-Bibliotheken
Die Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens zur Oberflächenpräsentation von VHH-Fc Fusionsproteinen wurde durch die Generierung von verschiednen VHH-Bibliotheken und deren Oberflächenpräsentation auf Hefezellen erprobt. Die Herstellung der VHH-Bibliotheken erfolgte unter Verwendung unterschiedlicher in der Literatur bekannter Technologien.
Dadurch wurden Bibliotheken mit unterschiedlichen Sequenzdiversitäten generiert.
Für die Erfindung relevante oben zitierte und unzitierte Literatur.
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Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Vielfalt von Antikörpern, biologisch aktiven
Antikörperfragmenten oder Antikörperdomänen mit bestimmten Eigenschaften durch Exprimierung, Sekretierung und Präsentation derselben an der Oberfläche von
Hefezellen, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellung von Wirtszellen der Hefe-Spezies Saccharomyces cervisiae, die mit einem ersten und einem zweiten Nukleinsäuremolekül in Form geeigneter Plasmide transfiziert wurde, wobei das erste Nukleinsäuremolekül für ein Fusionsprotein kodiert, das im wesentlichen ein Zelloberflächenankerprotein, eine Fc-Bindungs-Domäne sowie einen regulierbaren Promoter umfasst, der die Expression des Fusionsprotein steuert in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen, und das zweite Nukleinsäuremolekül für besagte Population von Antikörpern, besagtes Antikörperfragmenten oder
Antikörperdomänen in Form ihrer leichten und schweren Ketten kodiert und unter der Kontrolle eines permanent aktiven Promoters steht,
(b) Exprimieren des Fusionsproteins unter gleichzeitiger Co-Exprimierung der Vielfalt von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperdomänen in den
Hefezellen in Gegenwart von Polyethylenglycol (PEG) mit einem Molekulargewicht > 5000 im Kultivierungsmedium, wobei die besagten Immunglobulinmoleküle als auch das Fusionsprotein in löslicher Form aus der Hefezelle sekretiert werden,
(c) Präsentieren der Vielfalt von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder
Antikörperdomänen, welche an die Fc-Bindungsdomäne des exprimierten und an der Zelloberfläche verankerten Fusionsproteins in nicht kovalenter Form gebunden sind, an der Oberfläche der Hefezellen,
(d) Selektieren und Isolieren von Hefezellen nach gewünschten unterschiedlichen phänotypischen oder Bindungseigenschaften der Vielfalt von Antikörpern, biologisch aktiven Antikörperfragmenten oder Antikörperdomänen, welche an die Fc- Bindungsdomäne gebunden sind, mit Hilfe von Detektionsmarkern, die mit dem
Fusionprotein oder dem Immunglobulinmolekül verbunden sind oder in ihnen enthalten sind,
(e) Exprimierung der Vielfalt von Antikörpern, biologisch aktiven
Antikörperfragmenten oder der Antikörperdomänen in der jeweilig selektierten
Hefezellpopulation unter Kultivierungsbedingungen, die keine oder keine wesentliche weitere Exprimierung des Fusionsprotein ermöglichen, und
(f) Isolierung der Vielfalt von Antikörpern mit den ausgewählten phänotypischen oder Bindungseigenschaften aus dem Kulturmedium.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Zelloberflächenankerprotein a-agglutinin oder alpha-agglutinin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fusionprotein aga2p und eine Fc- Bindungsdomäne umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Fc-Bindungsdomäne die Protein A ZZ-Domäne ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Fusionsprotein, welches exprimiert und an die Zelloberfläche sekretiert wird aga2p und die Protein A ZZ-Domäne umfasst, und an der Zelloberfläche gebundenen und präsentierten agal p Untereinheit gebunden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei für die Expression des Fusionproteins aus ZZ- Domäne und aga2p der GAL1 Promoter eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei für die Expression der Antikörper,
Antikörperfragmente oder Antikörperdomänen der GAPDH Promoter konstitutiv eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei PEG8000 oder ein höher molekulares PEG eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei das Antikörperfragmente oder die Antikörperdomäne ein Fab-Fragment oder ein VHH Domäne umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die VHH Domäne ein VHH-Fc Fusionsprotein ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, wobei der Hefestamm EBY100 eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11 , wobei für das erste und zweite
Nukleinsäuremolekül separate Plasmide eingesetzt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei als Ausgangsplasmid pYD1 eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 zur Erzeugung einer Antikörper-Bibliothek zur Generierung und Selektierung von ganzen Antikörpern, Fab-Fragmenten oder anderer biologisch aktiver Antikörperdomänen mit ausgewählten phänotypischen oder Bindungseigenschaften.
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