EP2780019A1 - Composition a l'etat solide comprenant un sel d'hypothiocyanite - Google Patents

Composition a l'etat solide comprenant un sel d'hypothiocyanite

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EP2780019A1
EP2780019A1 EP12772108.2A EP12772108A EP2780019A1 EP 2780019 A1 EP2780019 A1 EP 2780019A1 EP 12772108 A EP12772108 A EP 12772108A EP 2780019 A1 EP2780019 A1 EP 2780019A1
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EP
European Patent Office
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solid composition
composition according
oscn
manufacturing
combination
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12772108.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Sandrine PERROTTO
Sébastien GLUSZOK
Philippe Bordeau
Catherine David
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Stragen Pharma SA
Alaxia SAS
Original Assignee
Stragen Pharma SA
Alaxia SAS
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Publication date
Application filed by Stragen Pharma SA, Alaxia SAS filed Critical Stragen Pharma SA
Publication of EP2780019A1 publication Critical patent/EP2780019A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide

Definitions

  • the present invention relates to a solid composition comprising at least one salt of hypothiocyanite OSCN "associated with a cation, said solid composition being in the form of an amorphous powder and / or crystalline form.
  • the invention relates to also the method of manufacturing the said composition and its use CONTEXT OF THE INVENTION
  • Figures 3A and 3B Representation of the 13 C NMR spectrum of the solid composition No.2. (Example 12)
  • Figure 3A shows the complete spectrum and
  • Figure 3B shows a magnification of the window containing the hypothiocyanite signal.
  • Figure 4 Measurement of the stability of the solid composition No.2 containing the hypothio cy anite. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the composition according to the invention is characterized in that it additionally contains a thiocyanate ion salt (SCN) at a mass percentage of between 0.01% and 40% and preferably of between 0.degree. , 01% and 10%.
  • the composition according to the invention further comprises gluconic acid at a mass percentage of between 0.01% and 20%.
  • aqueous solution containing at least hypothiocyanite ion OSCN "; b) adding to said aqueous solution, at least one alcohol or an organic solvent selected from azeotropes of water, at a percentage between 10 and 99, 9%;
  • the process according to the invention is characterized in that the organic solvent is chosen from the classically described water azeotropes, as well as their combination.
  • the process according to the invention is characterized in that said alcohol is selected from ethanol, propanol, isopropanol, tert-butanol, or mixtures thereof.
  • the process according to the invention is characterized in that the excipient of the polyol type is glycerol at a mass percentage of between 10% and 50%.
  • the method according to the invention is characterized in that the temperature in step d) is adjusted between 0 ° C and -100 ° C. Preferably the temperature is adjusted between -10 ° C and -80 ° C. In another preferred embodiment the temperature is adjusted to -20 ° C. In a particular embodiment, the temperature is adjusted to -80 ° C. In one embodiment, the process according to the invention is characterized in that the solvents are removed simultaneously.
  • the water is removed first.
  • the method according to the invention is characterized in that the evaporation is carried out at ambient temperature.
  • said alcohol or the organic solvent is removed by sublimation at low temperature and reduced pressure.
  • the process according to the invention is characterized in that said alcohol or the organic solvent is removed by lyophilization. In a particular embodiment, said alcohol or the organic solvent is removed by exclusion through the use of fluids in their supercritical state or sub critical used as antisolvents. In one embodiment of the invention, for example, the super-critical form of CO 2 is used . In one embodiment, the process according to the invention is characterized in that the solvents are removed at pressure / temperature pairs making it possible to obtain the supercritical or subcritical state. In one embodiment, the method according to the invention is characterized in that the supercritical or subcritical fluids are used in the GAS (gas anti-solvent) modality. In another embodiment, the method according to the invention is characterized in that the super critical or subcritical fluids are used in the SAS (Super critical anti solvent) modality.
  • GAS gas anti-solvent
  • SAS Super critical anti solvent
  • the method according to the invention is characterized in that the supercritical or subcritical fluids are used in the SEDS (Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids) modalities.
  • SEDS Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids
  • step a) comprises preparing the aqueous solution containing the OSCN " hypothiocyanite ion by contacting a peroxidase, a halogen and / or a pseudohalogen, and / or an oxygen donor.
  • the peroxidase is lactoperoxidase
  • pseudohalogen is the thiocyanate ion (SCN ").
  • the hydrogen peroxide is generated in situ by the glucose / glucose oxidase pair.
  • the aqueous solution is buffered and the pH is in the range [6; 11].
  • the aqueous solution is buffered with a phosphate buffer whose concentration is between 50 mM and 200 mM.
  • said membrane is a membrane whose cutoff threshold is 10 kDa.
  • the membrane has a cutoff threshold of 5 kDa.
  • the process according to the invention is characterized in that the aqueous solution which is available further contains the thiocyanate ion.
  • the process according to the invention is characterized in that the aqueous solution which is available is buffered.
  • the pH of the aqueous solution available is in the range [6; 11].
  • the aqueous solution available is buffered with a phosphate buffer ranging from 50 mM to 200 mM.
  • the aqueous solution which is available is buffered with a carbonate buffer ranging from 50 mM to 1M.
  • the process according to the invention is characterized in that the OSCN " ion is obtained at a temperature of between 0 ° C. and 40 ° C.
  • the method according to the invention is characterized in that the ion OSCN "of said aqueous solution is obtained by electrolysis.
  • the ion OSCN "of said aqueous solution is obtained by chemical synthesis.
  • the process according to the invention is characterized in that the composition in solid form obtained in step d) is a powder.
  • the resulting powder is amorphous.
  • the powder obtained is partially crystalline.
  • the invention also relates to the use of the solid composition according to the invention, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antifungal or antibiotic agents, or preservatives for the treatment of aerial infections, pathways lower pulmonary and / or upper pulmonary
  • the invention also relates to the use of said solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antifungal, antibiotic or preservative agents for the treatment of infections associated with cystic fibrosis, COPDs (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) and any pathology of the airways.
  • the solid composition according to the invention will be used alone or in combination with other active agents as a mucociliary clearance improving compound.
  • Mucociliary clearance is a critical inborn defense mechanism of the airways made of a coordinated set of epithelial transport of water and ions, secretion of mucins, ciliary function and cough. Failure of mucociliary clearance leads to obstruction and predisposes to chronic bacterial infection.
  • the invention also relates to the use of said solid composition of the invention, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment of infections, in particular but not exclusively gastric infections, wounds, mucous membranes and / or skin.
  • Another subject of the invention is the use of the solid composition alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antiparasitic, antibiotic, antifungal or preservative agents in the treatment of infections caused by bacteria and and / or yeasts and / or molds and / or viruses and / or prions and / or parasites and / or protozoa.
  • the treatment of viral infections caused by viruses of the genus Influenza virus will be mentioned.
  • the solid composition according to the invention is advantageously used alone or in commination for the prophylaxis of Influenza viruses.
  • the solid composition or its reconstituted solution is especially used as a prophylactic in sensitive areas for example by vaporization or application of said zones.
  • the solid composition is advantageously combined with proteins or peptides having antimicrobial activity.
  • the proteins or peptides of interest having an antimicrobial activity which are combined with the solid composition according to the invention are for example chosen from lactoferrin, lactoferricin and / or lysozyme.
  • the invention also relates to the use of said solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antifungal antibiotic agents, or preservatives by direct use of the powder or after
  • Another subject of the invention also relates to the use of the solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment and / or disinfection, sanitization of the care equipment and medical devices.
  • the solid composition according to the invention alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents is intended to be administered by inhalation, orally, topically or by injection.
  • the invention also relates to the use of the composition according to the invention, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment of air, by
  • the invention also relates to the use of the solid composition of the invention, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment of food or water of the invention. beverage, recreational water and water used for subsequent antimicrobial applications.
  • the invention also relates to the use of said solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the stabilization and / or preservation of cosmetics.
  • the invention also relates to the use of said solid composition according to the invention, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment and / or sanitization of materials and equipment.
  • the invention also relates to the use of the solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment of packaging.
  • Another subject of the invention concerns the use of said solid composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the treatment of textiles.
  • the invention also relates to the use of said composition, alone or in
  • the invention also relates to the use of said composition, alone or in
  • the invention also relates to the use of said composition, alone or in
  • Another subject of the invention relates to the use of said composition, alone or in combination with other anti-infective, antimicrobial, antiviral, antibiotic, antifungal or preservative agents for the removal of bacteria, yeasts, molds, viruses, parasites, protozoa.
  • the solid composition according to the invention is preferably used as an antimicrobial, antiviral or anti-parasitic agent and intended for administration by inhalation, orally, topically or by injection.
  • the solid composition according to the invention can also be used for the preparation of a sustained-release formulation.
  • said sustained-release solid composition is preferably encapsulated in combination with other antimicrobial agents, for the treatment of non-limiting selected infections among mucosal and / or skin infections, as well as infections. respiratory, oral, gastric, intestinal, vaginal, wounds and burns.
  • said sustained-release solid composition is preferably encapsulated in combination with other antiviral and / or antifungal agents and / or antiparasitics, for the treatment of infections selected in a non-limiting manner among infections or diseases of the mucous membranes, skin and superficial body growths.
  • GOD Glucose Oxidase
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • LP Lactoperoxidase
  • SCN- Thiocyanate
  • OSCN- hypothiocyanite ion
  • a dilute solution obtained according to example 1 having a concentration OSCN "520 ⁇ are added 20% by weight of absolute ethanol The temperature was then lowered to -.. 30 ° C The solution passes from the liquid phase the solid phase, the concentration of OSCN- ion is 510 ⁇ after a period of 1 month and 495 ⁇ after a period of 2 months. The difference observed is in the range of the accuracy error of the measurement method (spectrophotometry).
  • Example 2 To a diluted solution obtained according to Example 1, having an OSCN- concentration of 450 ⁇ , 20% by weight of absolute ethanol is added. The temperature is then lowered to -30 ° C. The solution freezes. An OSCN- ion concentration of 470 ⁇ is measured after a period of 1 month and 440 ⁇ after a period of 2 months. The observed difference is due to the accuracy of the measurement method (spectrophotometry).
  • a solution obtained according to Example 4, having a concentration of OSCN- 510 ⁇ is stored at a temperature of -80 ° C.
  • the solution freezes.
  • An OSCN- ion concentration of 520 ⁇ is measured after a period of 1 month and 490 ⁇ after a period of 2 months. The observed difference is due to the accuracy of the measurement method (spectrophotometry).
  • Example 4 50 -30 ° C 510,530,490
  • Example 6 50 -80 ° C 510 520 490
  • Example 7 NMR of two OSCN-solutions obtained in two different buffers (carbonate pH 9.2 and phosphate pH 7.4). ( Figures 1A and 1B)
  • 1A and 1B illustrate the spectrum 13 C NMR of the crude filtrate containing the OSCN "recorded in two different buffer requirements (carbonate, pH 9.2 and phosphate, pH 7.4) before addition of lactose and evaporation to dryness.
  • Each sample was prepared from 0.5 mL of the filtrate, 0.2 mL of D 2 0 and 20 ⁇ , [2- 1 C] -Gly (0.1 M).
  • the NaS 13 CN (Sigma-Aldrich) In both cases, the sample was analyzed within 15 min after the synthesis. The spectrum is calibrated on the [2- 13 C] -Gly used as an external reference (the doubling of the signal in the buffer carbonate is due to the pH effect.) The spectra were recorded for 3h on a Bruker AM-500WB type apparatus with a spectral window of 25000 Hz.
  • Example 9 Sodium salt of OSCN " solid obtained by evaporation of solvents
  • the product obtained is in the form of a white powder.
  • the content of OSCN- is controlled by TNB colorimetric test (Ellman's reagent).
  • Example 10 Sodium salt of OSCN-solid obtained by evaporation of solvents
  • the product obtained is in the form of a white powder.
  • the content of OSCN- is controlled by TNB colorimetric test (Ellman's reagent).
  • Example 11 NMR of a solution of OSCN- reconstituted from a solid composition containing carbonate. ( Figure 2)
  • Figure 2 illustrates the 13 C NMR spectrum of the solid composition containing the OSCN 1 ".
  • the sample was prepared from 0.1 g of solid composition of the filtrate, 0.5 mL of D 2 0 and 20 ⁇ of [2- 13 C] -Gly (0.1 M) NaS 1 CN (Sigma-Aldrich) was used as the substrate, in both cases the sample was analyzed within 15 min after synthesis.
  • spectrum is calibrated on the [2- 1 C] -Gly used as an external reference (the resolution of the signal in the carbonate buffer is due to the pH effect.)
  • Spectra were recorded for 3 hours on a Bruker AM-500WB device with a spectral window of 25000 Hz.
  • Example 12 NMR of a solution of OSCN- reconstituted from a solid composition containing the lactose excipient. ( Figure 3 A and 3B)
  • Figures 3A and 3B illustrate the 13 C NMR spectrum of solid composition 2 containing OSCN-.
  • the sample was prepared from 0.1 g of filtrate solid composition, 0.5 ml of D 2 0 and 20 ⁇ l of [2- 1 C] -Gly (0.1 M).
  • NaS 1 CN Sigma-Aldrich
  • the spectrum is calibrated on the [2- 1 C] -Gly used as an external reference (the resolution of the signal in the carbonate buffer is due to the pH effect).
  • the spectra were recorded for 3h on a Bruker AM-500WB apparatus with a spectral window of 25000 Hz.
  • Example 13 Sodium salt of OSCN-solid obtained by using CO 2 as an anti-solvent.
  • the solvent is then indroduit in the cell reaction pressure of 73 bar at 35 ° C using a capillary, the solution is disperséee form of a jet in the super-critical phase flowing co current. Precipitation makes it possible to obtain a product in the form of a white powder in the precipitation cell after depressurization.
  • the content of OSCN- is controlled by TNB colorimetric test (Ellman's reagent).
  • Example 14 Stability of solid composition No. 2 containing hypothiocyanite.
  • the samples were stored at -18 ° C and the amount of OSCN " was measured after storing the solid composition for different periods of time (0, 42, 66, 138, 234, 744 hours).
  • Hypothiocyanite by the TNB method was carried out as follows: the concentration of OSCN " was determined in samples after dilution in 1 ml of pure water, by the loss of absorbance at 412 nm of a TNB solution as previously . The measures were duplicated. The results show that the solid composition according to the present invention is stable over time. The stability is practically identical to zero time than at 42h or 744 h (Table 2, Figure 4).
  • Table 2 Quantity of OSCN " measured from two samples 1 and 2 of the solid composition of the invention after storage at -20 ° C for a variable time.

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Abstract

La présente invention a pour objet une composition solide comprenant au moins un sel d'hypothiocyanite OSCN- associé d'un cation, ladite composition solide étant sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline. L'invention concerne également le procédé de fabrication de ladite composition solide et son utilisation.

Description

Composition à l'état solide comprenant un sel d'hypothiocyanite
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une composition solide comprenant au moins un sel d'hypothiocyanite OSCN" associé d'un cation, ladite composition solide étant sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline. L'invention concerne également le procédé de fabrication de ladite composition et son utilisation. CONTEXTE DE L'INVENTION
L'industrie agroalimentaire et pharmaceutique montrent un fort intérêt pour l'hypothiocyanite en tant qu'ion bactéricide.
L'ion hypothiocyanite et/ou hypohalite est généré notamment in vivo en solution par le système lactoperoxydase selon l'équation ci-dessous : lactoperoxydase
H202 + SCN" (et/ou Γ) ^ OSCN" (et/ou 01") Les propriétés pharmaco logiques de l'ion hypothiocyanite sont connues notamment ses propriétés biocides et plus particulièrement microbiocides mais en raison de l'instabilité de cette espèce chimique dont la demi-vie est inférieure à 24 heures les utilisations sont délicates, compliquées et limitées et son stockage pour des durées prolongées ne s'avère pas possible (« Mechanism of Décomposition of the Human Défense Factor Hypothiocyanite Near Physiological pH » Jozsef Kalmar, elemu L. Woldegiorgis, Bernadett Biri, and Michael Thomas Ashby ; J. Am. Chem. Soc, 2011, 133 (49), pp 19911-19921).
En raison de cette instabilité, le système Lactoperoxydase était à l'origine souvent délivré complet sous forme d'une poudre qui permettait de générer in situ l'ion OSCN" par déclenchement de la réaction, par exemple par la mise en solution des composants de la réaction. Selon les usages, le donneur d'oxygène pouvait être un peroxyde d'hydrogène, un percarbonate de sodium, ou généré in situ par le système glucose/glucose oxydase. Le système lactoperoxydase est par exemple utilisé dans des produits cosmétiques comme des dentifrices commercialisés par la société Laclede sous la dénomination Biotene®. Plus récemment, on a vu apparaître des demandes de brevets vis-à-vis de l'usage du système lactoperoxydase en santé humaine. Par exemple, la demande WO2008/045696 traite d'une méthode d'utilisation de ces composés dans le traitement de désordres vaginaux. On citera aussi des méthodes et compositions pour traiter des problèmes pulmonaires (US 2004/0156917 et WO2007/134180).
Des variantes avec substitution possible du pseudohalogène thiocyanate par de l'iode (US 2009/0246146) combiné ou non avec une peroxidase ont également été proposées.
Toutes les applications décrites utilisent, soit la production in situ par administration du système complet, soit par l'apport d'une partie du système avec utilisation d'un des composants endogènes présents dans le site d'action. Une étape a été franchie en proposant un procédé permettant de produire les agents OSCN" et/ou ΟΓ avec séparation des précurseurs enzymatiques via l'utilisation d'agents coagulants (WO2002/097076) qui conduisait à la production d'OSCN" et/ou d'OT en solution et en grands volumes. Par ailleurs WO2010/086530 décrit des matériels permettant de produire, extemporanément, au besoin, une solution comprenant l'OSCN" ou ΟΓ.
POLLOCK J R et al: 'Lactoperoxidase-catalyzed oxidation of thiocyanate ion: a carbon-13 nuclear magnetic résonance study of the oxidation products", BIOCHEMICA ET BIOPHYSICA ACTA. PROTEIN STRUCTURE AND MOLECULAR ENZYMOLOGY, ELSEVIER, vol. 1159, no- 3, 20 octobre 1992, pages 279-285, XP023469659, SSN: 0167- 4838, divulgue la préparation d'une solution comprenant d'ion hypothiocyamte à partir de thiocyanate et de H2O2 catalysée par la lactoperoxydase. L'objet de la présente invention diffère de l'art antérieur connu en ce que la composition de l'invention contenant l'ion hypothiocyamte est solide. Par ailleurs, le problème que la présente invention se propose de résoudre peut être considéré comme la préparation d'une composition comprenant un sel d'hypothiocyanite que l'on peut stocker de façon prolongée. Aucun des documents de l'art antérieur ne mentionne une composition solide comprenant un sel d'hypothiocyanite. US 2006/018817 Al (ASHBY MICHAEL) propose la préparation d'ion hypothiocyamte à partir de thiocyanate et d'acide hypochloreux dans laquelle la composition est liquide. WO 2010/086530 Al (ALAXIA) décrit une composition comprenant des ions hypothiocyanites et de la lactoferrine administrée par un pulvérisateur, nébulisateur ou aéroliseur. Cependant, il n'existe pas de composition solide comprenant un sel d'hypothiocyanite que l'on peut stocker de façon prolongée.
Ainsi l'un des problèmes majeurs de l'utilisation de cet actif est son instabilité et de ce fait l'impossibilité de le stocker de façon prolongée en conformité avec les exigences de la réglementation pharmaceutique conduisant à sa production extemporanée.
RÉSUME DE L'INVENTION
L'invention concerne une composition solide comprenant au moins un sel d'hypothiocyanite OSCN" associé à un cation sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication de ladite composition, solide, ce procédé comprenant les étapes consistant à :
a) préparer une solution aqueuse contenant au moins l'ion hypothiocyanite OSCN" ; b) ajouter à ladite solution aqueuse, au moins un alcool ou un solvant organique pris parmi les azéotropes de l'eau, à un pourcentage compris entre 10 et 99,9 %;
c) ajouter à ladite solution un excipient de type osidique, polyosidique ou polyol. d) éliminer ledit alcool ou le solvant organique sous une pression comprise entre 1 mbar à 80 bars et température comprise entre -100°C à + 50°C afin d'obtenir une composition sous forme solide.
L'invention vise également l'utilisation de ladite composition seule ou en combinaison avec d'autres agents microbiocides, antimicrobiens, antiviraux, conservateurs ou antibiotiques pour le traitement des infections des voies aériennes, des voies pulmonaires inférieures, et/ou des voies pulmonaires hautes. Un autre objet de l'invention vise à l'utilisation de ladite composition solide seule ou en combinaison avec d'autres agents microbiocides, antimicrobiens, antiviraux, fongicides, conservateurs ou antibiotiques pour le traitement des infections choisies parmi le groupe comprenant les infections gastriques, des plaies, des muqueuses, et/ou de la peau.
L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition, seule ou en
combinaison avec d'autres agents antimicrobiens, antiviraux, antiparasites , fongicides, conservateurs ou antibiotiques pour le traitement des bactéries, levures, moisissures, virus, prions, parasites, protozoaires.
Par ailleurs, l'invention vise également l'utilisation de ladite composition, seule ou en combinaison avec d'autres agents pour le traitement des infections des virus du genre Influenzavirus. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ladite composition, seule ou en combinaison avec d'autres composés en tant que composé améliorant la clairance mucociliaire.
D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description et des exemples de réalisation.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figures 1 A et 1B: Représentation du spectre RMN 13C de filtrats bruts obtenus à partir de deux tampons différents (tampon carbonate ou tampon phosphate), avant l'addition de lactose et évaporation. (Exemple 7). La figure 1 A représente le spectre complet et la figure 1B le grossissement de la fenêtre contenant le signal hypothiocyanite.
Figure 2 : Représentation du spectre RMN 1 C de la composition solide No. l. (exemple 11)
Figures 3 A et 3B. Représentation du spectre RMN13C de la composition solide No.2. (exemple 12) La figure 3A représente le spectre complet et la figure 3B un grossissement de la fenêtre contenant le signal hypothiocyanite. Figure 4 : Mesure de la stabilité de la composition solide No.2 contenant 1 ' hypothio cy anite . DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention permet d'obtenir une composition comprenant au moins un sel d'hypothiocyanite OSCN" associé à un cation sous forme solide, ladite composition solide étant sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline.
La présente invention concerne également une composition solide, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un sel d'hypothiocyanite OSCN" associé à un cation, sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline en pourcentage massique compris entre 0,01% et 20% et de préférence compris entre 0,01% et 10%.
Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle contient en outre un sel d'ion thiocyanate (SCN ) à un pourcentage massique compris entre 0,01% et 40% et de préférence compris entre 0,01% et 10%. Dans un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend en outre de l'acide gluconique à un pourcentage massique compris entre 0,01%) et 20%.
Dans un mode de réalisation additionnel, la composition selon l'invention comprend en outre un sel de phosphate ou de carbonate associés à un cation alcalin à un pourcentage massique compris entre 10 et 99,999%).
Dans un mode de réalisation préféré, le cation selon l'invention est choisi parmi les cations alcalins, comme le sodium, et le potassium, ou dans le groupe constitué par le calcium et/ou le magnésium.
Dans un autre mode de réalisation, la composition solide selon l'invention comprend un excipient de type osidique, polyosidique ou polyol, et de manière préférée ladite composition solide comprend une association d'au moins deux des desdits excipients osidiques, polyosidiques et polyols.
Lesdits exipients sont par exemple avantageusement choisis parmi le glucose, du lactose, du tréhalose, du mannitol et/ou leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation, la composition contient du mannitol à un pourcentage massique compris entre 1 et 50%. Dans un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention est caractérisée en que du tréhalose est présent en proportion massique compris entre 1 et 45%.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition solide selon l'invention contient du lactose présent à un pourcentage massique compris entre 1 et 60%.
Dans la composition selon l'invention, l'ion hypothiocyanite OSCN" est stable sur une période minimum de 2 mois et jusqu'à 6 mois.
D'une manière préférée, l'ion hypothiocyanite OSCN" est stable sur une période minimum de 2 mois et jusqu'à 4 mois.
La composition selon l'invention sera de préférence conservée à une température comprise entre + 20°C et -80°C à l'abri de l'oxygène, de l'humidité et de la lumière. Un avantage important de la composition solide selon l'invention réside dans le fait qu'il est à présent possible d'augmenter la concentration d'hypothiocyanite OSCN" dans la solution reconstituée prête à l'emploi qui sera administrée au patient. Ainsi il est possible d'avoir une dose d'hypothiocyanite OSCN" plus importante et de ce fait d'injecter aux patients des volumes inférieurs de produit, ce qui s'avère plus rapide, plus rentable et moins douloureux pour le patient.
Par ailleurs, l'invention concerne une solution prête à l'emploi caractérisée en ce qu'elle comprend la composition solide selon l'invention, solubilisée dans un milieu acceptable au niveau physiologique. La composition solide sera par exemple solubilisée dans un solvant organique acceptable choisi parmi les solvants hydroalcoolique ou parmi des composés porteurs de fonctions hydroxyles ou tout autre solvant physio logiquement acceptable connu de l'homme du métier.
De préférence, le solvant hydroalcoolique comprend est un alcool représentant de 0,01% à 100% en masse dudit solvant.
L'invention concerne également un procédé de fabrication de ladite composition solide comprenant les étapes consistant à :
a) préparer une solution aqueuse contenant au moins l'ion hypothiocyanite OSCN" ; b) ajouter à ladite solution aqueuse, au moins un alcool ou un solvant organique pris parmi les azéotropes de l'eau, à un pourcentage compris entre 10 et 99,9 %;
c) ajouter à ladite solution un excipient de type osidique, polyosidique ou polyol; d) éliminer ledit alcool ou solvant organique sous une pression comprise entre 1 mbar et 80 bars et une température comprise entre -100°C et + 50°C afin d'obtenir une composition sous forme solide.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi les azéotropes classiquement décrits de l'eau, ainsi que leur association.
Un mélange azéotrope ou azéotropique est un mélange liquide qui bout à température fixe en gardant une composition fixe. Un mélange azéotropique est un mélange qui présente, pour une composition particulière, une phase vapeur ayant la même composition que la phase liquide avec laquelle elle est en équilibre.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce ledit l'alcool est choisi parmi Péthanol, le propanol, l'isopropanol, le tert-butanol, ou leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'une association d'au moins deux desdits alcools est ajouté à la solution aqueuse.
Dans un mode de réalisation particulier, les proportions d'alcool ou de solvant organique peuvent varier de 1 à 99% par rapport à la solution aqueuse contenant l'OSCN". Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'alcool est Péthanol, à un pourcentage compris entre 1% à 99%. Dans un mode de réalisation, l'excipient est de type osidique, polyosidique ou polyol.
De manière préférée, l'excipient est choisi parmi le groupe du mannitol, tréhalose, lactose, glycérol du PEG (polyéthylèneglycol) et/ou leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'excipient de type polyol est le glycérol à un pourcentage massique compris entre 10 à 50%.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'excipient de type polyol est le polyéthylèneglycol (PEG) à un pourcentage massique compris entre 10 à 50%.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'excipient de type polyol est le mannitol à un pourcentage massique compris entre 1 et 50%.
Dans un mode de réalisation complémentaire, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'excipient de type polyosidique est le tréhalose à un pourcentage massique compris entre 1 et 45%. Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que que l'excipient de type polyosidique est le lactose à un pourcentage massique compris entre 1 et 60%.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la température à l'étape d) est ajustée entre 0°C et -100°C. De préférence la température est ajustée entre -10°C et -80°C. Selon un autre mode de réalisation préféré la température est ajustée à -20°C. Dans un mode de réalisation particulier, la température est ajustée à -80°C. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les solvants sont éliminés simultanément.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé consécutivement.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'eau est éliminée en premier.
Dans un autre mode de réalisation, ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par évaporation sous forme d'azéotrope, sous pression réduite. De préférence, l'évaporation est réalisée à une température comprise entre 20 et 45°C.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'évaporation est réalisée à température ambiante.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'évaporation est réalisée à basse température, par exemple à une température inférieure à -80 °C. De préférence, l'évaporation est réalisée sous pression réduite.
Selon un autre mode de réalisation, ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par sublimation à basse température et pression réduite.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par lyophilisation. Dans un mode de réalisation particulier, ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par exclusion par l'utilisation de fluides dans leurs états super critiques ou sub critiques utilisés comme antisolvants. Dans un mode de réalisation selon l'invention, on utilise par example la forme super-critique du CO2. Dans un mode de réalisation le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les solvants sont éliminés à des couples pression/température permettant d'obtenir l'état super critiques ou sub critiques. Dans un mode de réalisation le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les fluides super critiques ou sub critiques sont utilisés dans la modalité GAS (Gas anti solvent). Dans un autre mode de réalisation le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les fluides super critiques ou sub critiques sont utilisés dans la modalité SAS ( Super critical anti solvent).
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les fluides super critiques ou sub critiques sont utilisés dans la modalités SEDS (Solution Enhanced Dispersion by supercritical fluids).
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé à une température comprise entre 4°C et 50°C.
Dans un mode de réalisation, l'étape a) comprend la préparation de la solution aqueuse contenant l'ion hypothiocyanite OSCN" par mise en contact d'une peroxydase, d'un halogène et/ou d'un pseudohalogène, et/ou d'un donneur d'oxygène. Dans ce mode de réalisation la peroxydase est la lactoperoxydase, le pseudohalogène est l'ion thiocyanate (SCN"). Dans ce mode de réalisation le peroxyde d'hydrogène est généré in situ par le couple glucose/glucose oxydase.
Dans un mode de réalisation le donneur d'oxygène est choisi dans le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène, ou le percarbonate de sodium.
Dans un mode de réalisation, la solution aqueuse est tamponnée et le pH est compris dans l'intervalle [6 ; 11]. Dans ce mode de réalisation la solution aqueuse est tamponnée par un tampon phosphate dont la concentration est comprise entre 50 mM et 200 mM.
Dans un autre mode de réalisation, la solution aqueuse est tamponnée par un tampon carbonate dont la concentration est comprise entre 50 mM et 1M. Selon l'invention, la solution aqueuse est obtenue par production enzymatique selon les deux réactions enzymatiques successives ci-dessous :
D-Glucose + ½ 02 — — >»- H202 + acide gluconique
H909 + SON" — OSCN- dans lesquelles GOD est la glucose oxydase ; H202 est le peroxyde d'hydrogène ; LP est la lactoperoxydase ; SCN" est l'ion thiocyanate et OSCN" est l'ion hypothiocyanite.
Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre entre les étapes a) et b) une étape de fïltration sur membrane dont le seuil de coupure est inférieur ou égal < 30 kDa permettant de retenir les enzymes.
Dans un mode de réalisation, ladite membrane est une membrane dont le seuil de coupure est de 10 kDa. De préférence la membrane a un seuil de coupure de 5 kDa.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la solution aqueuse dont on dispose (à l'étape b) contient en outre des carbohydrates tels que du glucose, de l'acide gluconique, des carbonates ou leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la solution aqueuse dont on dispose contient en outre l'ion thiocyanate.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la solution aqueuse dont on dispose est tamponnée. De préférence, le pH de la solution aqueuse dont on dispose est compris dans l'intervalle [6 ; 11].
Dans un mode de réalisation préféré, la solution aqueuse dont on dispose est tamponnée par un tampon phosphate allant de 50 mM à 200 mM. De manière préférée, la solution aqueuse dont on dispose est tamponnée par un tampon carbonate allant de 50 mM à 1M. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que que l'ion OSCN" est obtenu à une température comprise entre 0°C et 40°C. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que que l'ion OSCN" de ladite solution aqueuse est obtenu par électrolyse.
Dans un mode de réalisation, l'ion OSCN" de ladite solution aqueuse est obtenu par synthèse chimique.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la composition sous forme solide obtenu à l'étape d) est une poudre.
Dans un mode de réalisation, la poudre obtenue est amorphe.
Dans un mode de réalisation, la poudre obtenue est partiellement cristalline.
Dans un mode de réalisation, la poudre obtenue est cristalline.
L'invention concerne également l'utilisation de la composition solide selon l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antifongiques, ou antibiotiques, ou conservateurs pour le traitement des infections aériennes, des voies pulmonaires inférieures, et/ou des voies pulmonaires hautes.
En particulier, l'invention concerne également l'utilisation de ladite composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antifongiques, antibiotiques ou conservateurs pour le traitement des infections associées à la mucoviscidose, les COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) et toute pathologie des voies aériennes. De préférence, la composition solide selon l'invention sera utilisée seule ou en combinaison avec d'autre agents actifs en tant que composé améliorant la clairance mucociliaire. La clairance mucociliaire est un mécanisme de défense inné critique des voies aériennes fait d'un ensemble coordonné de transport épithélial d'eau et d'ions, de sécrétion de mucines, de fonctionnement ciliaire et de toux. L'échec de la clairance muco-ciliaire conduit à l'obstruction et prédispose à l'infection bactérienne chronique. L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition solide de l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des infections notamment mais pas exlusivement des infections gastriques, des plaies, des muqueuses et/ou de la peau.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation de la composition solide seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antiparasites, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs dans le traitement des infections provoquées par des bactéries et/ou levures et/ou moisissures et/ou virus et/ou prions et/ou parasites et/ou protozoaires. En particulier on citera le traitement des infections virales provoquées par des virus du genre Influenza virus. Par ailleurs, la composition solide selon l'invention est avantageusement utilisée seule ou en commination pour la prophylaxie des Influenza virus.
La composition solide ou sa solution reconstituée est notamment utilisée comme prophylactique dans des zones sensibles par exemple par vaporisation ou application des dites zones.
La composition solide est avantageusement combinée à des protéines ou des peptides possédant une activité antimicrobienne. Les protéines ou les peptides d'intérêt possédant une activité antimicrobienne qui sont combinés à la composition solide selon l'invention sont par exemple choisis parmi la lactoferrine, la lactoferricine et/ou le lysozyme.
L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques antifongiques, ou conservateurs par utilisation directe de la poudre ou après
resolubilisation de celle-ci dans un milieu physio lo iquement acceptable.
Un autre objet de l'invention, concerne également l'utilisation de la composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement et/ou désinfection, sanitisation du matériel de soin et des dispositifs médicaux.
La composition solide selon l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs est destinée à être administrée par inhalation, par voie orale, par voie topicale ou par injection.
L'invention concerne également l'utilisation de la composition selon l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement de l'air, par
décontamination de l'air (passif), décontamination ambiance (actif) et assainissement d'ambiance. L'invention concerne également l'utilisation de la composition solide de l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des aliments ou de l'eau de boisson, l'eau de loisirs et les eaux utilisées pour des applications antimicrobiennes ultérieures.
L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour la stabilisation et/ou la conservation des cosmétiques. L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition solide selon l'invention, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement et/ou la sanitisation des matériels et équipements. L'invention concerne également l'utilisation de la composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des emballages.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ladite composition solide, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des textiles. L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition, seule ou en
combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des plantes. L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition, seule ou en
combinaison avec d'autres agents anti-infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour le traitement des sols.
L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition, seule ou en
combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour sa co -utilisation avec des agents de nettoyage ou de désinfection.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ladite composition, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour l'élimination des bactéries, levures, moisissures, virus, parasites, protozoaires.
La composition solide selon l'invention est préférablement utilisée en tant qu'agent antimicrobien, antiviral ou anti-parasitaire et destinée à une administration par inhalation, par voie orale, par voie topicale ou par injection.
La composition solide selon l'invention est également utilisable en vue de l'élaboration d'une formulation à libération prolongée.
Dans un mode de réalisation ladite composition solide à libération prolongée est de préférence encapsulée en combinaison avec d'autres agents antimicrobiens, pour le traitement des infections sélectionnées de manière non limitatives parmi les infections des muqueuses et/ou de la peau, ainsi que les infections respiratoires, buccales, gastriques, intestinales, vaginales, des plaies et brûlures.
Dans un autre mode de réalisation ladite composition solide à libération prolongée est de préférence encapsulée en combinaison d'autres agents antiviraux, et/ou antifongiques et/ou antiparasitaires, pour le traitement des infections sélectionnées de manière non limitatives parmi les infections ou atteintes des muqueuses, de la peau et des phanères.
L'invention est décrite plus en détail par les exemples ci-après. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
EXEMPLES Exemple 1 : Production enzymatique d'OSCN" selon deux réactions enzymatique successives
Production enzymatique d'après les deux réactions enzymatiques successives ci-dessous :
D-Glucose + ½ 02 — — *· H202 + acide gluconique H202 + SCN" — OSCN" + H20
Avec GOD : Glucose Oxydase ; H202 : Peroxyde d'hydrogène ; LP : Lactoperoxydase ; SCN- : Thiocyanate ; OSCN- : ion hypothiocyanite
A une solution de tampon carbonate (100 mL, 50 mM, pH 9,2) sont ajoutés 0,4 g de D- glucose, 0,04 g de GOD, 0,12 g de LP et 1 mL d'une solution de thiocyanate de sodium (NaSCN) à 2M. La solution est agitée à température ambiante, à 200 rpm pendant 10 minutes. Après réaction la solution est filtrée sur une membrane d'ultrafïltration à 10 kDa. On obtient une solution contenant :
H20 + glucose + acide gluconique + OSCN" + SCN" + Na+ La concentration obtenue en OSCN" est de 1340 μΜ.
Exemple 2 : OSCN" en solution hydroalcoolique
A une solution diluée obtenue selon l'exemple 1 , ayant une concentration en OSCN" de 520 μΜ sont ajoutés 20 % en masse d'éthanol absolu. La température est alors abaissée à - 30°C. La solution passe de la phase liquide à la phase solide. La concentration en ion OSCN- est de de 510 μΜ après une période de 1 mois et de 495 μΜ après une période de 2 mois. La différence observée est dans l'intervalle de l'erreur de précision de la méthode de mesure (spectrophotométrie).
Exemple 3 : OSCN" en solution hydroalcoolique
A une solution diluée obtenue selon l'exemple 1, ayant une concentration en OSCN- de 450 μΜ sont ajoutés 20 % en masse d'éthanol absolu. La température est alors abaissée à - 30°C. La solution gèle. On mesure une concentration en ion OSCN- de 470 μΜ après une période de 1 mois ainsi que 440 μΜ après une période de 2 mois. La différence observée est due à la précision de la méthode de mesure (spectrophotométrie).
Exemple 4 : OSCN- en solution hydroalcoolique
A une solution obtenue selon l'exemple 1 , ayant une concentration en OSCN" de 510 μΜ sont ajoutés 50 % en masse d'éthanol absolu. La température est alors abaissée à -30°C. La solution ne gèle pas. On mesure une concentration en ion OSCN" de 530 μΜ après une période de 1 mois ainsi que 490 μΜ après une période de 2 mois. La différence observée est due à la précision de la méthode de mesure (spectrophotométrie).
Exemple 5 : OSCN- en solution hydroalcoolique
La même solution utilisée selon l'exemple 4, ayant une concentration en OSCN- de 510 μΜ est conservée à une température de -80°C. La solution gèle. On mesure une concentration en ion OSCN- de 480 μΜ après une période de 1 mois ainsi que 500 μΜ après une période de 2 mois. La différence observée est due à la précision de la méthode de mesure (spectrophotométrie). Exemple 6 : OSCN- en solution hydroalcoolique
Une solution obtenue selon l'exemple 4, ayant une concentration en OSCN- de 510 μΜ est conservée à une température de -80°C. La solution gèle. On mesure une concentration en ion OSCN- de 520 μΜ après une période de 1 mois ainsi que 490 μΜ après une période de 2 mois. La différence observée est due à la précision de la méthode de mesure (spectrophotométrie).
Les résultats observés aux exemples 2 à 7 sont rassemblés dans le tableau 1 : N° Quantité Température [OSCN-] à [OSCN-] à [OSCN-] à exemple d'alcool en % de t = 0 en μΜ t = 1 mois en t = 2 mois massique conservation μΜ en μΜ
Exemple 2 20 -30°C 520 510 495
Exemple 3 20 -30°C 450 470 440
Exemple 4 50 -30°C 510 530 490
Exemple 5 50 -80°C 510 480 500
Exemple 6 50 -80°C 510 520 490
Tableau 1 : OSCN en solution hydroalcoolique.
Exemple 7 : RMN de deux solutions d'OSCN- obtenues dans deux tampons différents (carbonate pH 9,2 et phosphate pH 7,4). (Figures 1A et 1B)
Les solutions ont été obtenues selon l'exemple 1 en tampon phosphate (100 mM, pH 8), ou carbonate (100 mM, pH 9,2). A 0,5 mL de solution filtrée est ajouté 0,5 mL de D20 et 20 μΐ, de [2-13C]-Gly utilisée comme référence externe.
Les figures 1A et 1B illustrent le spectre 13C RMN du filtrat brut contenant l'OSCN" enregistré dans deux conditions tampon différentes (carbonate, pH 9,2 et phosphate, pH 7,4) avant addition de lactose et évaporation à sec. Chaque échantillon a été préparé à partir de 0,5 mL de filtrat, 0,2 mL de D20 et 20 μΐ, de [2-1 C]-Gly (0.1 M). Le NaS13CN (Sigma- Aldrich) a été utilisé comme substrat. Dans les deux cas, l'échantillon a été analysé dans les 15 min suivant la synthèse. Le spectre est calibré sur la [2-13C]-Gly utilisée comme référence externe (le dédoublement du signal dans le tampon carbonate est dû à l'effet pH). Les spectres ont été enregistrés pendant 3h sur un appareil de type Bruker AM- 500WB avec une fenêtre spectrale de 25000 Hz.
Exemple 8 : Sel de sodium d'OSCN" solide obtenu par lyophilisation
A une solution diluée obtenue selon l'exemple 1, ayant une concentration en OSCN- de
450 μΜ sont ajoutés 20 % en masse d'éthanol absolu. La température est alors abaissée à - 30°C La solution hydroalcoolique congelée de l'exemple 3 est lyophilisée à une pression comprise entre 1 et 10 mbar pendant 24h. On obtient un rendement de 0,1% soit 0,4 μg de sel d'OSCN" de Na. Exemple 9 : Sel de sodium d'OSCN" solide obtenu par évaporation des solvants
Une solution obtenue selon l'exemple 1 ([OSCN-] = 617 μιηοϋ-Ι) est diluée avec de l'éthanol absolu (EtOH/H20 de 9:1) contenant Immole de Lactose. Le solvant est ensuite évaporé sous forme d'azéotrope sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif (température du bain 40°C) jusqu'à évaporation totale des solvants. Le produit obtenu se présente sous la forme d'une poudre blanche.
La teneur en OSCN- est contrôlée par test colorimétrique TNB (réactif d'Ellman).
On obtient 20 μg d'OSCN- soit un rendement de 21%. Exemple 10 : Sel de sodium d'OSCN- solide obtenu par évaporation des solvants
Une solution obtenue selon l'exemple 1 ([OSCN-] = 1340 μιηο 1.1-1) est diluée avec de l'éthanol absolu (EtOH/H20 de 9: 1) contenant Immole de Lactose. Le solvant est ensuite évaporé sous forme d'azéotrope sous pression réduite à l'aide d'un évaporateur rotatif (température du bain 40°C) jusqu'à évaporation totale des solvants. Le produit obtenu se présente sous la forme d'une poudre blanche.
La teneur en OSCN- est contrôlée par test colorimétrique TNB (réactif d'Ellman).
On obtient 100 μ d'OSCN- soit un rendement de 51%.
Exemple 11 : RMN d'une solution d'OSCN- reconstituée à partir d'une composition solide contenant du carbonate. (Figure 2)
L'hypothiocyanite a été généré par le système glucose-oxidase/lactoperoxidase selon l'exemple 1. ([OSCN ] = 1240 μιηοΙ.Γ1) Après ultra-fïltration, sont ajoutés le Na2C03 (1 mmol, 0.106 g) à 5 mL de filtrat. Après dissolution complète, la solution est diluée avec 95 mL d'éthanol et évaporée sous pression réduite (30 mbar) à 30°C. On obtient une poudre blanche qui est solubilisée dans 0,6 mL de D2O et 20 μί^ de [2-13C]-Gly utilisée comme référence externe.
La figure 2 illustre le spectre 13C RMN de la composition solide 1 contenant l'OSCN". L'échantillon a été préparé à partir de 0,1 g de composition solide de filtrat, 0,5 mL de D20 et 20 μΐ, de [2-13C]-Gly (0.1 M). Le NaS1 CN (Sigma- Aldrich) a été utilisé comme substrat. Dans les deux cas, l'échantillon a été analysé dans les 15 min suivant la synthèse. Le spectre est calibré sur la [2-1 C]-Gly utilisée comme référence externe (le dédoublement du signal dans le tampon carbonate est dû à l'effet pH). Les spectres ont été enregistrés pendant 3h sur un appareil de type Bruker AM-500WB avec une fenêtre spectrale de 25000 Hz. Déplacements chimiques: (a) 162,1 ppm = C03 2 (b) 134,7 ppm = SCN~ (c) 129,8 ppm = OCN" (d) 128,6 ppm = OSCN . (e) Signaux du glucose et de l'acide gluconique (f) 42,7 and 47,5 ppm = [2- 13C] -glycine (le dédoublement du signal dans le tampon carbonate est dû à l'effet pH).
Exemple 12 : RMN d'une solution d'OSCN- reconstituée à partir d'une composition solide contenant l'exipient lactose. (Figure 3 A et 3B)
L'hypothiocyanite a été généré par le système glucose-oxidase/lactoperoxidase selon l'exemple 1. ([OSCN-] = 1540 μιηοΙ.Γ1) Après ultra-filtration, sont ajoutés le Na2C03 (1 mmol, 0.106 g) et le lactose (0,5 mmol, 0,171 g) à 10 mL de filtrat. Après dissolution complète, la solution est diluée avec 190 mL d'éthanol et évaporée sous pression réduite (40 mbar) à 25°C. On obtient une poudre blanche qui est solubilisée dans 0,6 mL de D20 et 20 de [2-1 C]-Gly utilisée comme référence externe.
Les figures 3A et 3 B illustrent le spectre 13C RMN de la composition solide 2 contenant l'OSCN-. L'échantillon a été préparé à partir de 0,1 g de composition solide de filtrat, 0,5 mL de D20 et 20 μί de [2-1 C]-Gly (0.1 M). Le NaS1 CN (Sigma- Aldrich) a été utilisé comme substrat. Dans les deux cas, l'échantillon a été analysé dans les 15 min suivant la synthèse. Le spectre est calibré sur la [2-1 C]-Gly utilisée comme référence externe (le dédoublement du signal dans le tampon carbonate est dû à l'effet pH). Les spectres ont été enregistrés pendant 3h sur un appareil de type Bruker AM-500WB avec une fenêtre spectrale de 25000 Hz. Déplacements chimiques: (a) 162,1 ppm = CO3 2" (b) 134,7 ppm = SCN" (c) 129,8 ppm = OCN" (d) 128,6 ppm = OSCN". (e) Signaux du lactose, glucose et acide gluconique (f) 42,7 and 47,5 ppm = [2-13C]-glycine (le dédoublement du signal dans le tampon carbonate est dû à l'effet pH).
Exemple 13 : Sel de sodium d'OSCN- solide obtenu par utilsation du CO2 en tant qu 'anti-solvant.
Une solution obtenue selon l'exemple 1 ([OSCN-] = 1610 μηιο1.1-1) est diluée avec de l'éthanol absolu (EtOH/H20 de 9: 1) contenant 1 mmole de Lactose. Le solvant est ensuite indroduit dans la cellule de réaction sous pression de 73 bar à 35°C à l'aide d'un capilaire, la solution est disperséee sous forme d'un jet dans la phase super-critique circulant à co- courant . La précipitation permet d' obtenir un produit sous la forme d'une poudre blanche dans la cellule de précipitation après dépressurisation.
La teneur en OSCN- est contrôlée par test colorimétrique TNB (réactif d'Ellman).
On obtient 92 μg d'OSCN- soit un rendement de 39%.
Exemple 14 : Stabilité de la composition solide No. 2 contenant hypothiocyanite.
En vue d'étudier la stabilité de la composition solide de la présente invention, des stocks on été préparés. L'hypothiocyanite a été généré en solution par le système lactoperoxydase selon la procédure décrite précédement. A 10 ml du filtrat a été ajouté Na2CC>3 (1 mmol ; 0.106 g) et du lactose (2 mmol ; 0.7 g). Après dissolution complète, la solution a été diluée avec de l'éthanol (190 ml) et évaporée à sec sous pression réduite (40 mbar) à 25 °C. Trois lots ont été préparés selon la même procédure. Les poudres ont été recueillies et 0.1 g ont été préparés dans des flacons en plastique fermés. Les échantillons ont été conservés à -18 °C et la quantité de OSCN" a été mesurée après conservation de la composition solide pendant différents laps de temps (0, 42, 66, 138, 234, 744 heures). La mesure de la quantité d' hypothiocyanite par la méthode TNB a été effectuée comme suit : la concentration de OSCN" a été déterminée dans des échantillons après dilution dans 1 ml d'eau pure, par la perte d'absorbance à 412 nm d'une solution TNB comme précédemment. Les mesures ont été dupliquées. Les résultats montrent que la composition solide selon la présente invention est stable au cours du temps. La stabilité est pratiquement identique au temps zéro qu'au temps 42h ou 744 h (Tableau 2, figure 4).
Tableau 2 : Quantité d' OSCN" mesurée à partir de deux échantillons 1 et 2 de la composition solide de l'invention après conservation à -20°C pendant un temps variable.
Echantillon 1 Echantillon 2
0 0.434 0.01 1 0,445 0,009 0,439 0,010
42 0. j) S 1 0.01 0. 7(1 0.016 0.375 l 4.5S"c 0,016
66 0,350 0,014 0,354 0.014 0.352 19,85%, 0,014
138 0.3S0 0.010 O 7S O O P 1. « ~^ ~ \ 0 <j0.1 1.
234 0,433 0,01 1 0,420 0,010 0,426 2,96% 0,01 1 744 0.410 U.U 1 . 0.3(¾S 0. 13 0.3 > 1 l . ^ -» ( 0,013

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition solide comprenant au moins un sel d'hypothiocyamte OSCN" associé à un cation, ladite composition solide étant sous forme d'une poudre amorphe et/ou cristalline.
2. La composition solide selon la revendication l, caractérisée en ce que le pourcentage massique de sel d'hypothiocyamte OSCN" associé à un cation dans la composition est compris entre 0,01 et 20 %.
3. La composition solide selon la revendication 1, caractérisée en ce que le pourcentage massique de sel d'hypothiocyamte OSCN" associé à un cation dans ladite composition solide est compris entre 0,01 et 10 %.
4. La composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un sel d'ion thiocyanate SCN", en pourcentage massique compris entre 0,01 % et 40 %.
5. La composition solide selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de l'acide gluconique en pourcentage massique compris entre 0,01 % et 20 %.
6. La composition solide selon l'une quelconque de revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un sel de phosphate ou de carbonate
(associé à un cation alcalin) en pourcentage massique compris entre 10 % et 99,999 %.
7. La composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le cation est choisi parmi le groupe comprenant le sodium, le potassium, le calcium et/ou le magnésium.
8. La composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un excipient de type osidique, polyosidique ou polyol.
9. La composition solide selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend une association d'au moins deux des desdits excipients osidiques, polyosidiques et polyols.
10. La composition solide selon les revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle comprend du glucose.
11. La composition solide selon revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle comprend du lactose.
12. La composition solide selon revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle comprend du tréhalose.
13. La composition solide selon revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle comprend du mannitol.
14. Procédé de fabrication de la composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant les étapes consistant à :
a) préparer une solution aqueuse contenant au moins l'ion hypothiocyanite OSCN" ; b) ajouter à ladite solution aqueuse, au moins un alcool ou un solvant organique pris parmi les azéotropes de l'eau, à un pourcentage compris entre 10 et 99,9 %;
c) ajouter à ladite solution un excipient de type osidique, polyosidique ou polyol; d) éliminer ledit alcool ou solvant organique sous une pression comprise entre 1 mbar et 80 bars et une température comprise entre -100°C et + 50°C afin obtenir la composition sous forme solide.
15. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi les azéotropes de l'eau, ainsi que leur association.
16. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'alcool est choisi parmi l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le tert-butanol, ou leurs mélanges.
17. Le procédé de fabrication selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'une association d'au moins deux desdits alcools est ajouté à la solution aqueuse.
18. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que les proportions d'alcool ou de solvant organique peuvent varier de 1 à 99% par rapport à la solution aqueuse contenant l'OSCN".
19. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'alcool est l'éthanol, à un pourcentage compris entre 1% à 99%
20. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit excipient est un mélange d'au moins deux excipients de type osidique, polyosidique ou polyol.
21. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'excipient est choisi parmi le groupe du mannitol, tréhalose, lactose, glycérol, PEG et/ou leurs mélanges.
22. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que la température est ajustée entre -100°C et 0°C.
23. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé simultanément.
24. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé consécutivement.
25. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par évaporation sous forme d'azéotrope, sous pression réduite.
26. Le procédé de fabrication selon selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par sublimation à basse température et pression réduite.
27. Le procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit alcool ou le solvant organique est éliminé par exclusion du solvant par utilisation d'un fluide sous sa forme super-critique ou sub-critique.
28. Le procédé de fabrication selon la revendications 27, caractérisé en ce que ledit fluide sous sa forme super-critique est le CO2.
29. Le procédé de fabrication selon l'une quelconque de revendications 14 à 28, caractérisé en ce que l'étape a) comprend la préparation de la solution aqueuse contenant l'ion hypothiocyanite OSCN" par mise en contact d'une peroxydase, d'un pseudohalogène et/ou d'un halogène et d'un donneur d'oxygène.
30. Composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour son utilisation dans le traitement des infections des voies aériennes, des voies pulmonaires inférieures, et/ou des voies pulmonaires hautes.
31. La composition solide selon la revendication 30, pour son utilisation dans le traitement des infections pulmonaires associées à la mucoviscidose, et aux COPD (Chronic obstructive pulmonary disease).
32. La composition solide selon la revendication 30, seule ou en combinaison avec d'autres composés pour son utilisation en tant que composé améliorant la clairance mucociliaire.
33. Composition solide selon l'une des revendications 1 à 13, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour son utilisation dans le traitement des infections choisies parmi le groupe comprenant les infections gastriques, des plaies, des muqueuses, et/ou de la peau.
34. Composition solide selon l'une des revendications 1 à 13, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour son utilisation dans le traitement des infections provoquées par des bactéries et/ou levures et/ou moisissures et/ou virus et/ou parasites et/ou protozoaires.
35. Composition solide selon l'une des revendications 1 à 13, seule ou en combinaison avec d'autres agents anti- infectieux, antimicrobiens, antiviraux, antibiotiques, antifongiques ou conservateurs pour son utilisation dans le traitement des prions.
36. Composition solide selon l'une des revendications 1 à 13, seule ou en combinaison avec d'autres agents pour son utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections virales provoquées par des virus du genre Influenza virus.
37. Composition solide selon l'une des revendications 1 à 13, pour son utilisation en combinaison avec des protéines ou des peptides possédant une activité antimicrobienne.
38. La composition solide selon la revendication 37, caractérisée en ce que les protéines ou les peptides possédant une activité antimicrobienne sont choisis parmi la lactoferrine, la lactoferricine et/ou le lysozyme.
39. Composition solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour son utilisation en tant qu'agent antimicrobien, antiviral ou anti-parasitaire destinée à une administration par inhalation, par voie orale, par voie topicale ou par injection.
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