EP2627783A2 - Markersequenzen für multiple sklerose und deren verwendung - Google Patents

Markersequenzen für multiple sklerose und deren verwendung

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Publication number
EP2627783A2
EP2627783A2 EP11784434.0A EP11784434A EP2627783A2 EP 2627783 A2 EP2627783 A2 EP 2627783A2 EP 11784434 A EP11784434 A EP 11784434A EP 2627783 A2 EP2627783 A2 EP 2627783A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
multiple sclerosis
marker sequences
case
marker
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11784434.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Angelika Lueking
Axel Kowald
Heike GÖHLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protagen GmbH
Original Assignee
Protagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Protagen GmbH filed Critical Protagen GmbH
Publication of EP2627783A2 publication Critical patent/EP2627783A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Definitions

  • the present invention relates to novel marker sequences for multiple sclerosis and their diagnostic use, including a method for screening potential drugs for multiple sclerosis disorders by means thereof
  • the invention relates to a
  • diagnostic device containing such marker sequences for multiple sclerosis, in particular a protein biochip and its use.
  • Protein biochips are gaining an increasing industrial
  • Protein biochips require the necessary proteins to be available. In particular,
  • GATEWAY recombinational cloning application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeems. Methods Enzymol, 328, 575-592).
  • ORFeems open reading frames
  • Methods Enzymol, 328, 575-592 are strongly related to the progress of genome sequencing projects and the annotation of these gene sequences.
  • determination of the expressed sequence is due
  • the cDNA of a particular tissue in a bacterial or a eukaryotic expression vector, such as yeast, is cloned.
  • the vectors used for the expression are generally characterized by the fact that they carry inducible promoters, with which the timing of protein expression can be controlled.
  • expression vectors have sequences for so-called
  • Affinity epitopes or proteins on the one hand for the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of a directed against the affinity epitope
  • Antibody on the other hand becomes the specific one
  • the object of the present invention is to provide improved marker sequences and their diagnostic
  • the invention relates to the use of
  • Marker sequences for the diagnosis of multiple sclerosis wherein at least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor or in each case a partial sequence or fragment thereof
  • marker sequences according to the invention to or from a patient to be examined.
  • an improved bioinformatic evaluation is strained and the samples are particularly preferably taken from the cerebrospinal fluid (CSF).
  • CSF cerebrospinal fluid
  • specially selected samples are used that meet the high sensitivity of a protein biochip.
  • multiple sclerosis (MS), also encephalomyelitis disseminata) refers to an autoimmune inflammatory /
  • demyelinating and degenerative disease of central nervous system disease (definition, for example, according to Pschyrembel, de Gruyter, 261st edition (2007), Berlin).
  • Essential to the invention is that the samples are not taken from conventional blood banks, but from MS patients
  • the complex sample selection method allows, for example, a sufficient advantageous delimitation of diseases such as MS symptom-like neuroborelliosis. Furthermore, false-positive results are excluded, on the one hand due to the strict bioinformatory evaluation (see examples) and by comparing the results on a protein biochip according to the invention with eg sera from Neuroborelliosis patients who do not have multiple sclerosis
  • the invention therefore also relates to such indication-specific protein biochips according to the invention for the diagnosis of
  • Sclerosis patients can be normalized and in this way false-positive proteins can be removed. Remaining non-false positive proteins can be reassembled on a protein biochip, called rearraying. This also allows the exclusion of autoantibodies that are positive for E. coli. This is another qualitative
  • the marker sequences according to the invention can also be combined, supplemented or extended with known biomarkers for this indication.
  • the determination of the marker sequences takes place outside the human body and the determination is made in an ex vivo / in vitro diagnosis.
  • the invention relates to the use of marker sequences as diagnostics, wherein at least one marker sequence of a cDNA is selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor or in each case a partial sequence or fragment thereof.
  • the invention relates to a method for the diagnosis of multiple sclerosis, wherein a.) At least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or a respective coding protein or a partial sequence or fragment thereof is applied to a solid support and b .) with body fluid or tissue extract one
  • the invention also relates to diagnostics for
  • the detection of such an interaction can, for example, by a probe, in particular by an antibody
  • the invention also relates to the task of providing a diagnostic device or an assay, in particular a protein biochip, which allows a diagnosis or examination for multiple sclerosis. Furthermore, the invention relates to a method for
  • Stratification in particular for the risk stratification and / or therapy control of a patient with multiple sclerosis, wherein at least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or a protein coding therefor is determined on a patient to be examined.
  • therapy control also includes the classification of patients into responders and non-responders with regard to a therapy or its course of therapy.
  • Diagnosis in the sense of this invention means the positive finding of multiple sclerosis by means of
  • Marker sequences of the invention and the assignment of patients to the disease of multiple sclerosis.
  • diagnosis includes medical diagnostics and
  • diagnosis also includes the
  • the term "stratification" includes in particular the
  • patient means any subject - human or mammal - with the proviso that the subject is being examined for multiple sclerosis.
  • marker sequences in the sense of this invention means that the cDNA or the respective polypeptide or protein obtainable therefrom are significant for multiple sclerosis
  • the cDNA or the respectively obtainable polypeptide or protein can interact with substances from the body fluid or tissue extract of a Patients with multiple sclerosis (eg antigen
  • At least one marker sequence of a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor or in each case a partial sequence or fragment thereof to or from a patient to be examined is determined" that an interaction between the Body fluid or tissue extract of a patient and the marker sequences of the invention is detected.
  • Such an interaction is for example a bond, in particular a binding substance on at least one invention
  • Marker sequence or, in the case of a cDNA, hybridization with a suitable substance under selected conditions, in particular stringent conditions (for example, as usual
  • Hybridization conditions are hybridization in 4 x SSC at 37 ° C followed by several washes in 1 x SSC at room temperature.
  • Body fluid in particular blood, whole blood, blood plasma, blood serum, patient serum, urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid or a tissue extract of the patient.
  • the marker sequences according to the invention may be present in a significantly higher or lower expression rate or concentration, which points to multiple sclerosis.
  • the relative expression rates ill / healthy of the invention may be present in a significantly higher or lower expression rate or concentration, which points to multiple sclerosis.
  • Marker sequences for multiple sclerosis are determined.
  • the marker sequences have a recognition signal which is addressed to the substance to be bound (for example antibodies,
  • the recognition signal is preferably an epitope and / or paratope and / or hapten and, for a cDNA, a hybridization or hybridization protein
  • the marker sequences of the invention are the subject of Table A and can by the respective cited
  • the invention also relates to the full-length sequences of the markers according to the invention and indeed as defined in Table A on the known database entry, hereinafter called SEQ -a 81a (cDNA) or SEQ ID-81b (protein).
  • SEQ 1-81 according to the invention again represent partial sequences, at least with high homology.
  • the specific ones are identical to
  • marker sequences SEQ 1-81 are in accordance with the invention.
  • the marker sequences also include such
  • Amino acid sequence such as chemical modification, such as
  • marker sequences In particular, those partial sequences which have an identity of 95%, 90%, in particular 80% or 70% with the marker sequences according to the invention.
  • Partial sequences are also those sequences having 50 to 81 nucleotides, 70-120 nucleotides of a sequence of SEQ 1-81, or peptides obtainable therefrom.
  • Marker sequences are functionally defined and include those sequences which have the same inventive diagnostic function.
  • Marker sequence can be represented in different amounts in one or more areas on a solid support. This allows a variation of the sensitivity.
  • the regions may each comprise a total of marker sequences, i. a sufficient number of different marker sequences, in particular 2 to 5 or 10 or more and optionally further nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers.
  • Biomarkers Further preferred are more than 2,500, more preferably 10,000 or more different or the same
  • Marker sequences and optionally other nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers are optionally other nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers.
  • Another object of the invention relates to an array of marker sequences containing at least one marker sequence a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor.
  • a cDNA selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor.
  • “arrangement” synonymously means “array” and insofar as this "array” is used to identify substances on marker sequences, this is to be understood as meaning an “assay” or a diagnostic device.
  • the arrangement is designed such that those represented on the assembly
  • Marker sequences are in the form of a grid on a solid support. Furthermore, such arrangements are preferred which include a high density array of protein binders
  • Such high density spotted assemblies are disclosed, for example, in WO 99/57311 and WO 99/57312, and may be advantageously used in a robotic automated high throughput method.
  • test or diagnostic device also includes such
  • Embodiments of a device such as ELISA, bead-based assay, line assay, Western blot, immunochromatographic
  • Invention is the systematic arrangement of proteins on a solid support.
  • the marker sequences of the assembly are fixed to a solid support, but preferably spotted or immobilized imprinted, ie applied reproducible.
  • One or more marker sequences can be present multiple times in the totality of all marker sequences and be present in different amounts relative to one spot.
  • the marker sequences can be standardized on the solid support (eg by serial dilution series of eg
  • the invention relates to an assay or protein biochip consisting of an array containing marker sequences according to the invention.
  • the marker sequences are present as clones.
  • Such clones can be obtained, for example, by means of a cDNA expression library according to the invention (Büssow et al., 1998 (supra)).
  • such expression libraries become
  • Obtained marker sequences are obtained. These expression vectors preferably contain inducible promoters. The induction of
  • Expression can e.g. by means of an inductor, such as IPTG.
  • IPTG inductor
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York Further preferred are such expression libraries
  • tissue specific eg human tissue, in particular human organs
  • expression libraries are also included according to the invention, which can be obtained by exon trapping. Instead of expression library can be spoken synonymously from an expression bank.
  • protein biochips or corresponding expression libraries which have no redundancy (so-called: Uniclone® library) and can be prepared, for example, according to the teachings of WO 99/57311 and WO 99/57312. These preferred Uniclone libraries have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library.
  • the clones may not be such as transformed bacteria, recombinant phage or transformed cells of mammals, insects, fungi, yeasts or plants.
  • the clones are fixed on a solid support, spotted or immobilized.
  • the invention relates to an arrangement, wherein the
  • Marker sequences are present as clones.
  • the marker sequences may be in the form of a fusion protein in the particular form
  • At least one affinity epipope or "tag” contains.
  • the tag may be one such as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or Strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag , Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose-binding one
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic or fluorophore-labeled bead
  • Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a mass spectrometric target or a matrix Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • a filter is preferred according to the invention.
  • the filter is PVDF, nitrocellulose or nylon (e.g., Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N + Amersham).
  • nitrocellulose e.g., Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N + Amersham.
  • this corresponds to a grid having the order of a microtiter plate (8-12 wells strips, 96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • the invention relates to an assay or protein biochip for identifying and
  • Characterizing a substance for multiple sclerosis characterized in that an arrangement or assay according to the invention is brought into contact with a.) At least one substance to be investigated and b.) A binding success is detected.
  • the invention relates to a method for identifying and characterizing a substance for multiple sclerosis, characterized in that an arrangement or assay according to the invention is brought into contact with a.) At least one substance to be investigated and b.) A binding success
  • the substance to be tested may be any native or non-native biomolecule, a synthetic chemical
  • Antigen / antibody or corresponding "means for detecting the binding success" can, for example, by means of
  • reporter enzymes such as alkaline
  • a readout is e.g. by means of a microarray laser scanner, a CCD camera or visually.
  • the invention relates to a drug / prodrug or prodrug developed for multiple sclerosis and obtainable through the use of the
  • the invention also relates to the use of an arrangement according to the invention or an assay for the screening of drugs for multiple sclerosis.
  • the invention also relates to a target for the treatment and therapy of multiple sclerosis, each selected from the group SEQ 1-81 or in each case a protein coding therefor.
  • the invention also relates to the use of the invention
  • Marker sequences preferably in the form of an arrangement, as
  • Affinity material for performing an apheresis or iwS. a blood wash wherein substances from body fluids of a patient with multiple sclerosis, such as blood or plasma, bind to the marker sequences of the invention and thus the body fluid can be selectively withdrawn.
  • Ten or more patient samples were individually screened against a cDNA expression library. Multiple sclerosis - specific expression clones were identified by comparison with ten or more healthy specimens. The identity of the marker sequences was determined by DNA sequencing.
  • FIG. 1 shows the differential screening between two protein biochips from in each case one cDNA expression bank of a patient and one healthy subject.
  • Differential clones are detected by fluorescence labeling and evaluated bioinformatorisch.
  • bioinformatic analyzes In the context of biomarker identification various bioinformatic analyzes are carried out. For each serum, microarray reactivities against about 2000 measured different antigens. These data are used for a ranking of the spotted antigens regarding their
  • Intensity data performed.
  • an internal standard is used, which is spotted on each chip. Since a p-value is calculated for each antigen, methods for correcting the multiple testing are used. As a very conservative approach, a Bonferroni correction is performed and, in addition, the less restrictive False Discovery Rate (FDR) is calculated according to Benjamini & Hochberg.
  • FDR False Discovery Rate
  • the data are used to classify the sera.
  • different multivariate methods are used. These are methods from the statistical
  • Threshold method which is suitable for both classification and visual representation of the data. To avoid overfitting, a 10-fold cross-validation of the data is performed.
  • mannosidase alpha
  • class 2A member 2 [Homo gi
  • mannosidase alpha
  • class 2A member 2 [Homo gi
  • gi 22027541 g 22027540 programmed cell death 7 [Homo sapiens] gi 5902122 g 15902121 spectrin, beta, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 5902122 g 5902121 spectrin, beta, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 5902122 g 5902121 spectrin, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 71361682 g 171361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] gi 71361682 g 71361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] gi 71361682 g 171361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] triple functional domain (PTPRF interacting) [Homo gi
  • gi 53759122 adenomatous polyposis coli Homo sapiens] gi 53759122 gi 53759121 adenomatous polyposis coli gi 53759122 gi
  • 53759121 adenomatous polyposis coli Homo sapiens] gi 40548332 gi 149363677 coiled-coil domain containing 137 [Homo sapiens]

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für Multiple Sklerose - Erkrankungen mittels dieser Markersequenzen. Ferner betrifft die Erfindung eine diagnostische Vorrichtung enthaltend solche Markersequenzen für Multiple Sklerose, insbesondere ein Proteinbiochip und dessen Verwendung.

Description

Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für Multiple Sklerose - Erkrankungen mittels dieser
MarkerSequenzen . Ferner betrifft die Erfindung eine
diagnostische Vorrichtung enthaltend solche Markersequenzen für Multiple Sklerose, insbesondere einen Proteinbiochip und dessen Verwendung.
Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle
Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der
Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als
Screeninginstrumente etabliert.
Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem
einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von
Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere
Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine
Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L . , Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,
Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using
topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392;
Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreut zberger , J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)
Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,
C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, N . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,
Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,
D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome ersion 1.1:
experimental verification of the genome annotation and
resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet , 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000)
GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol , 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund
differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-
Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G.
(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gut jähr, C, Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte
Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten
Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische
Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus
Expressionsbibliotheken konnten darüber hinaus im
Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human
proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654- 2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening.
Analytical Biochemistry, 21Q, 103-111) . Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind
insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312. Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264) .
Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis indikationsspezifische diagnostische Vorrichtungen, wie einen Proteinbiochip,
bereitzustellen .
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Markersequenzen und deren diagnostische
Verwendung zur Behandlung von Multiple Sklerose.
Die Bereitstellung von spezifischen MarkerSequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit Multiple Sklerose, insbesondere mittels eines Proteinbiochips. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von
MarkerSequenzen zur Diagnose von Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon
(nachstehend: erfindungsgemäße Markersequenzen) an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen konnten mittels
differentiellem Screenen von Proben und zwar gesunder Probanden mit Patientenproben mit Multiple Sklerose identifiziert werden.
Hierbei konnten erstmals mittels Proteinbiochips (siehe
Beispiele) diese erfindungsgemäßen Markersequenzen
identifiziert werden.
Im Stand der Technik konnten zwar bereits MarkerSequenzen für Multiple Sklerose mit Hilfe eines Proteinbiochip identifiziert werden, siehe WO2009030225. Vorliegend wird jedoch
erfindungsgemäß eine verbesserte bioinformatorische Auswertung angestrengt und die Proben werden besonders bevorzugt aus dem Liquor cerebrospinalis (CSF) entnommen. Ferner werden speziell ausgesuchte Proben verwendet, die der hohen Empfindlichkeit eines Proteinbiochips entgegenkommen.
Der Begriff „Multiple Sklerose ((MS), auch Encephalomyelitis disseminata) " betrifft eine autoimmun-entzündliche /
demyelinisierende und degenerative Erkrankung des Erkrankung des Zentralnervensystems (Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin).
Erfindungswesentlich ist, dass die Proben nicht aus üblichen Blutbanken entnommen werden, sondern von MS-Patienten
sorgfältig ausgewählt wurden, die z.B. HIV und HCV negativ sind und insbesondere auf Infektionskrankheiten getestet wurden. Das aufwändige Probeselektionsverfahren erlaubt z.B. eine hinreichende vorteilhafte Abgrenzung von Erkrankungen wie eine zur MS Symptom-ähnlichen Neuroborelliose . Weiterhin werden falsch-positive Ergebnisse ausgeschlossen, zum einen aufgrund der strengen bioinformatorischen Auswertung (siehe Beispiele) als auch durch den Vergleich der Ergebnisse auf einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip mit z.B. Seren von Neuroborelliose-Patienten, die keine Multiple Sklerose
aufweisen .
Weiterhin erfolgt im Unterschied zur WO2009030225 die
Herstellung der Proteinbiochips mittels Normalisierung von mindestens 1.000, vorzugsweise 2.000 verschiedenen oder mehr Autoantigenen des Menschen, die nicht indikationsspezifisch für Multiple Sklerose sind. Solche Autoantigene können z.B. aus anderen Körperflüssigkeiten von Patienten anderer
Krankheiten gewonnen werden (z.B. Pankreaskrebs , Rheumatoide Arthritis, Prostata etc.) .
Daher betrifft die Erfindung auch solche erfindungsgemäßen indikationsspezifischen Proteinbiochips zur Diagnose von
Multiple Sklerose, wobei in einem weiteren Schritt, die auf dem Proteinbiochip repräsentierte Proteine oder
MarkerSequenzen mit Autoantikörpern aus Nicht-Multiple
Sklerose Patienten normalisiert werden und auf diese Weise falsch-positive Proteine entfernt werden können. Verbleibende nicht-falsch-positive Proteine können auf einem Proteinbiochip neu zusammengestellt werden, so genanntes Rearraying. Dies erlaubt ebenfalls den Ausschluss von Autoantikörpern, die auf E. coli positiv sind. Dies ist eine weitere qualitative
Verbesserung, da Autoantikörper ausgeschlossen werden können, die z.B. gegen E. coli Darmbakterien im Menschen gerichtet sind. Infolge dessen können vorteilhaft bei einem verbesserten Signal/Rausch Verhältnis neue Markersequenzen identifiziert werden .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden daher mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50
MarkerSequenzen oder 50 bis 81 oder mehr MarkerSequenzen an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarkern für diese Indikation kombiniert, ergänzt oder erweitert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der MarkerSequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung von MarkerSequenzen als Diagnostika, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon ist .
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Multiple Sklerose, wobei a.) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und b.) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines
Patienten in Kontakt gebracht wird und c.) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den MarkerSequenzen aus a.) erfolgt.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Diagnostika zur
Diagnose von Multiple Sklerose jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon.
Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper
erfolgen . Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für die Multiple Sklerose eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Ferner umfasst ist die Stratifizierung der Patienten mit
Multiple Sklerose in neue oder etablierte Subgruppen der
Multiple Sklerose, sowie die sinnvolle Auswahl von
Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen
Therapeutika. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht-Responder bezüglich einer Therapie oder dessen Therapieverlauf.
„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung der Multiple Sklerose mittels der
erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zur Erkrankung an Multiple Sklerose. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und
diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und
Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur
Absicherung und zum Ausschluss anderer Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die
Differentialdiagnose von Multiple Sklerose mittels der
erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sowie die Prognose der
Multiple Sklerose. „Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des
Patienten erlaubt, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die
Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die
Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Multiple Sklerose untersucht wird.
Der Begriff „MarkerSequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für Multiple Sklerose sind. Beispielsweise können die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit Multiple Sklerose aufweisen (z.B. Antigen
(Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) . Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszuges eines Patienten und den erfindungsgemäßen MarkerSequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens einer erfindungsgemäßen
Markersequenz oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich
definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50%
Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren
Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente
Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschschritten in 1 x SSC bei Raumtemperatur.
Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer
Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können jedoch die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration vorliegen, dass auf die Multiple Sklerose hinweist. Hierbei kann mittels Proteomics oder Nukleinsäureblots die relativen Expressionsraten krank / gesund der erfindungsgemäßen
MarkerSequenzen für Multiple Sklerose bestimmt werden. Die MarkerSequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung über ein Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz adressiert ist (z.B. Antikörper,
Nukleinsäure) . Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder
Bindungsregion .
Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sind Gegenstand der Tabelle A und können durch den jeweilig zitierten
Datenbankeintrag (auch mittels Internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eindeutig identifiziert werden (siehe in Tabelle A: dort Accession No . ) , siehe ebenfalls das zugehörige Sequenzprotokoll.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Volllängesequenzen der erfindungsgemäßen Marker und zwar wie in Tabelle A über den bekannten Datenbankeintrag definiert, nachstehend SEQ la- 81a (cDNA) bzw. SEQ lb-81b (Protein) genannt.
Weiterhin umfasst sind daher ebenfalls analoge
Ausführungsformen von SEQ la-81a zu den MarkerSequenzen SEQ 1- 81, wie z.B. in den Ansprüchen dargelegt, da die
erfindungsgemäßen SEQ 1-81 wiederum Teilsequenzen, zumindest mit hoher Homologie, darstellen. Die spezifischen
MarkerSequenzen SEQ 1-81 sind jedoch erfindungsgemäß
bevorzugt . Erfindungsgemäß umfassen die MarkerSequenzen auch solche
Modifikationen der cDNA-Sequenz und der entsprechenden
Aminosäuresequenz, wie chemische Modifikation, wie
Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,
Glykosilierung oder polyA-Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind ebenfalls Teilsequenzen oder Fragmente der erfindungsgemäßen
MarkerSequenzen umfasst. Insbesondere solche Teilsequenzen, die eine Identität von 95%, 90 %, insbesondere 80% oder 70 % mit den erfindungsgemäßen MarkerSequenzen aufweisen.
Teilsequenzen sind ebenfalls solche Sequenzen, die 50 bis 81 Nukleotide, 70-120 Nukleotide einer Sequenz der SEQ 1-81 aufweisen, oder davon erhältliche Peptide.
„Teilsequenzen oder Fragmente" der erfindungsgemäßen
MarkerSequenzen sind funktionell definiert und umfassen solche Sequenzen, die die gleiche erfindungsgemäße diagnostische Funktion aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige
Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.
Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere
Biomarker. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche
MarkerSequenzen und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Anordnung von MarkerSequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein. Vorzugsweise enthält die
Anordnung mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 MarkerSequenzen oder 50 bis 81 oder mehr MarkerSequenzen .
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten
MarkerSequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Proteinbindern
erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichten gespotteten Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen.
Im Rahmen dieser Erfindung umfasst jedoch der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche
Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot, immunchromatographische
Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex- Nachweisverfahren . Ein Proteinbiochip im Sinne dieser
Erfindung ist die systematische Anordnung von Proteinen auf einem festen Träger.
Die MarkerSequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Eine oder mehrere MarkerSequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einem Spot vorliegen. Ferner können die MarkerSequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.
Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur
Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) .
Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung enthaltend erfindungsgemäße MarkerSequenzen .
In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken
enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer
exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA
MarkerSequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der
Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5) : 523-33) . Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die
gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden. Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.
Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.
Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die
MarkerSequenzen als Clone vorliegen. Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches
beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende
Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes
Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten. In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein
Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.
Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und
Charakterisieren einer Substanz für Multiple Sklerose, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird .
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für Multiple Sklerose, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg
nachgewiesen wird. Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein synthetisches chemisches
Molekül, eine Mischung oder eine Substanzbibliothek sein.
Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, wird die Auswertung des Bindungserfolges
durchgeführt, die beispielsweise unter Verwendung mit
handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgen kann. Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie
Antigen/Antikörper ) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels
Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären
Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen
markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer
Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den
entsprechenden colorimetrischen, fluores zenten oder
chemolumines zenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel / Wirkstoff oder Prodrug für Multiple Sklerose entwickelt und erhältlich durch den Einsatz des
erfindungsgemäßen Assays oder Proteinbiochip. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder einem Assay zum Screenen von Wirkstoffen für Multiple Sklerose.
Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ebenfalls ein Target zur Behandlung und Therapie von Multiple Sklerose, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen
Markersequenzen, vorzugsweise in Form einer Anordnung, als
Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese bzw. iwS . einer Blutwäsche, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Multiple Sklerose, wie Blut oder Plasma, an die erfindungsgemäßen Markersequenzen binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können.
Beispiele und Figuren:
Zehn oder mehr Patientenproben wurden individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent. Die Multiple Sklerose - spezifischen Expressionsklone wurden durch einen Vergleich mit zehn oder mehr gesunden Proben ermittelt. Die Identität der MarkerSequenzen wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt.
In Figur 1 wird das differentielle Screenen zwischen zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die
differentiellen Clone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet.
Im Rahmen der Biomarkeridentifizierung werden verschiedene bioinformatische Analysen durchgeführt. Für jedes Serum werden mittels Microarray Reaktivitäten gegen ca. 2000 unterschiedliche Antigene gemessen. Diese Daten werden für ein Ranking der gespotteten Antigene bzgl. ihrer
Differenzierungsfähigkeit zwischen gesunden und erkrankten Seren benutzt. Diese Auswertung wird mittels des nicht
parametrischen Mann-Whitney Tests auf normalisierten
Intensitätsdaten durchgeführt. Zur Normalisierung wird ein interner Standard benutzt, der auf jedem Chip mitgespottet wird. Da für jedes Antigen ein p-Wert berechnet wird, werden Methoden zur Korrektur des multiples Testens eingesetzt. Als sehr konservativer Ansatz wird eine Bonferroni Korrektur durchgeführt und zusätzlich wird die weniger restriktive False Discovery Rate (FDR) nach Benjamini & Hochberg berechnet.
Desweiteren werden die Daten zur Klassifikation der Seren benutzt. Hierbei kommen unterschiedliche multivariate Methoden zum Einsatz. Dies sind Methoden aus den statistischen
Lernverfahren wie Support Vector Machines (SVM), Neuronale Netze oder Klassifikationsbäume, sowie eine
Schwellenwertmethode, welche sowohl zur Klassifikation als auch zur visuellen Repräsentation der Daten geeignet ist. Zur Vermeidung von Overfitting wird eine lOfache Cross- Validierung der Daten durchgeführt.
Tabelle A: (gi Accession Nummer mit Geltung vom 1.10.2010)
SEQ 1 b-81 b SEQ 1 a-81 a
gi Acc Protein gi Acc cDNA NAME
gi 149363636 gi|149363635 plexin B2 [Homo sapiens]
gi 149363636 gi 149363635 plexin B2 [Homo sapiens]
gi 13259508 gi|13259507 dynactin 1 isoform 2 [Homo sapiens]
gi 13259508 gi 13259507 dynactin 1 isoform 2 [Homo sapiens]
DIS3 mitotic control homolog (S. cerevisiae)-like 2 gi|148596939
gi1134288890 [Homo sapiens]
transcription elongation factor B Polypeptide 3 gi|145199236
gi|145199237 binding protein 1 [Homo sapiens] transcription elongation factor B Polypeptide 3 gi|145199236
gi 145199237 binding protein 1 [Homo sapiens]
gi 145309326 gi|145309325 laminin, gamma 1 precursor [Homo sapiens] gi 145309326 gi 145309325 laminin, gamma 1 precursor [Homo sapiens] gi 157266266 gi|157266265 WD repeat domain 86 [Homo sapiens]
gi 16975484 gi|92091602 centaurin delta 2 isoform b [Homo sapiens] gi 16975484 gi 92091602 centaurin delta 2 isoform b [Homo sapiens] gi 20070228 gi|39725676 nucleobindin 1 [Homo sapiens]
hematological and neurological expressed 1 -like gi|46361989
gi|21700763 [Homo sapiens]
gi 21707902 gi 21707901 CTTN protein [Homo sapiens]
chromosome 20 open reading frame 3 [Homo gi|41327713
gi|24308201 sapiens]
gi 24797103 gi 24797102 RAS guanyl releasing protein 2 [Homo sapiens] gi 26051235 gi|26051234 nucleoporin 133kDa [Homo sapiens]
gi 26051235 gi 26051234 nucleoporin 133kDa [Homo sapiens]
gi 29788785 gi|34222261 tubulin, beta [Homo sapiens]
F-box only protein, helicase, 18 isoform 2 [Homo gi|307951 18
gi|307951 19 sapiens]
F-box only protein, helicase, 18 isoform 2 [Homo gi|307951 18
gi|307951 19 sapiens]
SR-related CTD-associated factor 1 [Homo gi|32698749
gi|32698750 sapiens]
SR-related CTD-associated factor 1 [Homo gi|32698749
gi|32698750 sapiens]
gi 33469964 gi|33469963 splicing factor 4 [Homo sapiens]
tubulin, gamma complex associated protein 4 gi|38454193
gi|38454194 [Homo sapiens]
mannosidase, alpha, class 2A, member 2 [Homo gi|51477715
gi|51477716 sapiens]
mannosidase, alpha, class 2A, member 2 [Homo gi|51477715
gi|51477716 sapiens]
gi 58331 179 gi 58331 178 KIAA1688 protein [Homo sapiens]
gi 58331 179 gi 58331 178 KIAA1688 protein [Homo sapiens]
gi 6005747 gi|54792140 ring finger protein 2 [Homo sapiens]
gi 7706359 gi 22027484 RAS, dexamethasone-induced 1 [Homo sapiens] gi 1 12382377 gi|1 12382376 ubiquitin-conjugating enzyme E2S [Homo sapiens] gi 4505677 gi 24431942 Phosphodiesterase 1 B [Homo sapiens]
gi 33636722 gi|45827807 plasticity related gene 1 [Homo sapiens] gi 19526471 gi|62739177 rhotekin isoform b [Homo sapiens]
gi 1 16812573 gi 148833501 CWC15 homolog [Homo sapiens]
pyrroline-5-carboxylate reductase 1 isoform 2 gi|24797094
gi|24797095 [Homo sapiens]
gi 83035136 gi|21362004 F-box protein 31 [Homo sapiens] zinc finger and BTB domain containing 5 [Homo gi|7662073
gi|7662074 sapiens]
cyclin D binding myb-like transcription factor 1 gi|48976050
gi|48976051 [Homo sapiens]
gi 17986283 gi|17986282 tubulin, alpha 1 a [Homo sapiens]
splicing factor, arginine/serine-rich 10 [Homo gi|215422394
gi|4759098 sapiens]
SWI/SNF related, matrix associated, actin gi|51477701 dependent regulator of chromatin, subfamily d, gi|51477702 member 3 isoform 2 [Homo sapiens]
IQ motif and WD repeats 1 isoform a [Homo gi|63252907
gi|63252908 sapiens]
poliovirus receptor related 2 isoform alpha gi|1 12789531
gi 11 12789532 precursor [Homo sapiens]
gi 22027541 g 22027540 programmed cell death 7 [Homo sapiens] gi 5902122 g 15902121 spectrin, beta, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 5902122 g 5902121 spectrin, beta, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 5902122 g 5902121 spectrin, beta, non-erythrocytic 2 [Homo sapiens] gi 71361682 g 171361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] gi 71361682 g 71361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] gi 71361682 g 171361681 nuclear mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] triple functional domain (PTPRF interacting) [Homo gi|45439358
gi|45439359 sapiens]
triple functional domain (PTPRF interacting) [Homo gi|45439358
gi|45439359 sapiens]
triple functional domain (PTPRF interacting) [Homo gi|45439358
gi|45439359 sapiens]
triple functional domain (PTPRF interacting) [Homo gi|45439358
gi|45439359 sapiens]
HECT, UBA and WWE domain containing 1 [Homo gi|61676187
gi|61676188 sapiens]
HECT, UBA and WWE domain containing 1 [Homo gi|61676187
gi|61676188 sapiens]
HECT, UBA and WWE domain containing 1 [Homo gi|61676187
gi|61676188 sapiens]
HECT, UBA and WWE domain containing 1 [Homo gi|61676187
gi|61676188 sapiens]
HECT, UBA and WWE domain containing 1 [Homo gi|61676187
gi|61676188 sapiens]
gi 95147333 gi 95147332 phospholipase C, beta 2 [Homo sapiens] gi 95147333 gi|95147332 phospholipase C, beta 2 [Homo sapiens] gi 450481 1 g 213972609 junction plakoglobin [Homo sapiens]
amyloid precursor-like protein 1 isoform 1 gi|67782337
gi|67782338 precursor [Homo sapiens]
gi 72534684 gi|166197669 phospholipase D3 [Homo sapiens] gi 13128862 gi|157266338 histone deacetylase 3 [Homo sapiens] gi 194018520 gi 194018519 G1 to S phase transition 1 [Homo sapiens]
spectrin, beta, non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homo gi|1 12382249
gi|1 12382250 sapiens]
spectrin, beta, non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homo gi|1 12382249
gi 11 12382250 sapiens]
spectrin, beta, non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homo gi|1 12382249
gi 11 12382250 sapiens]
gi 5031905 gi 187828416 MyoD family inhibitor [Homo sapiens]
gi 53759122 gi|53759121 adenomatous Polyposis coli [Homo sapiens] gi 53759122 gi 53759121 adenomatous Polyposis coli [Homo sapiens] gi 53759122 gi|53759121 adenomatous Polyposis coli [Homo sapiens] gi 40548332 gi 149363677 coiled-coil domain containing 137 [Homo sapiens]
Wiskott-Aldrich Syndrome protein family member 1 gi|68161503
gi|68161504 [Homo sapiens]
coenzyme Q10 homolog A isoform b [Homo gi|151 101385
gi|151 101386 sapiens]
gi 89903008 gi 237858673 Neurofascin
gi 89903008 gi|237858674 Neurofascin

Claims

Patentansprüche
Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
2. Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe von einem zu untersuchenden Patienten aus Liquor cerebrospinalis (CSF) gewonnen wird.
4. Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 81 oder mehr MarkerSequenzen an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt wird.
Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels in-vitro Diagnose erfolgt. Verwendung einer Markersequenz einer cDNA jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon als Diagnostikum . 7. Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von
Multiple Sklerose nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die
MarkerSequenzen auf einem festen Träger aufgebracht werden, insbesondere einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix.
8. Verfahren zur Diagnose von Multiple Sklerose, wobei
a. ) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und
b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines
Patienten in Kontakt gebracht wird und
c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der
Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den
MarkerSequenzen aus a.) erfolgt.
Verfahren zur Diagnose von Multiple Sklerose nach
Anspruch 8, wobei in einem weiteren Schritt
repräsentierte Markersequenzen, insbesondere Proteine, mit Autoantikörpern aus Nicht-Multiple Sklerose
Patienten normalisiert werden.
10. Verfahren zum Stratifizieren, insbesondere zur
Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür
kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Stratifizieren
oder die Therapiesteuerung Entscheidungen zur
Behandlung und Therapie des Patienten, insbesondere Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf, Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung samt Prognose umfasst .
12. Anordnung von MarkerSequenzen enthaltend mindestens
eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.
13. Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 MarkerSequenzen oder 50 bis 81 oder mehr
MarkerSequenzen enthalten sind.
14. Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenzen als Clone vorliegen.
15. Assay, Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung
nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die MarkerSequenzen auf einem festen Träger aufgebracht sind .
16. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder einem Assay nach Anspruch 15 zum
Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für Multiple Sklerose enthaltend Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird.
17. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder einem Assay nach Anspruch 15 zum Screenen von Wirkstoffen für Multiple Sklerose.
18. Diagnostika zur Diagnose von Multiple Sklerose, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon.
19. Target zur Behandlung und Therapie von Multiple
Sklerose, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon .
20. Verwendung einer Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 81 oder SEQ la - 81a jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer
Teilsequenz oder Fragment davon als Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese oder Blutwäsche für Patienten mit Multiple Sklerose.
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